JP2023501451A - FoxP3発現を阻害する修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、診断免疫学の分野に関する。対象の免疫状態のモニタリングの為に、及び/又は免疫調節処置の効果のモニタリングの為に、有利に使用されるマルチパラメータサイトメトリーに基づく白血球サブセット化の為の手段及び方法が提供される。とりわけ、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含む試薬組成物が提供され、該コンジュゲーションされた抗体は、以下のマーカーの組み合わせに対して向けられている:CD141、HLA-DR、CD16、CD33、CD300e、CD303及びCD14、ここで、CD300e及びCD303は、同じ標識にコンジュゲーションされうる。【選択図】図3A
Description
本発明は、診断学、特に診断免疫学、の分野に関する。対象の免疫状態のモニタリングの為に、及び/又は免疫調節処置の効果のモニタリングの為に、有利に使用されるマルチパラメータサイトメトリーに基づく白血球サブセット化の為の手段及び方法が提供される。
該免疫状態、及び免疫細胞に及ぼす革新的な免疫調節処置の効果、の詳細なモニタリングは、極めて重要である。これは、幾つかの理由によるものであり、例えば免疫系の複雑度が高く、誤った仮説を立てる関連リスクがあること、該免疫系が変更される又は関係している疾患の数が増えつつあること、新規免疫療法を前進させる為の規制当局からの必要条件の増加、該免疫系のベースライン状態の個体間不均一性、処置前の疾患カテゴリー及び疾患ステージの差、異なる処置応答を有する異なる患者における処置の異なる効果、その結果として、投薬量の増加であれ、投薬量の減少であれ、若しくは即時の処置中止であれ、処置を適合させる必要性、及び/又は将来の臨床試験における処置の正しい組み合わせを選択する必要性、である。
上記は、全ての免疫調節障害状態、及び免疫調節処置による介入を有する疾患にとって必須であり、ここで、該免疫調節処置は、古典的な免疫抑制処置(コルチコステロイド類、シクロスポリン、メトトレキサート等);細胞処置、例えば遺伝子療法;幹細胞移植;CAR-T細胞処置;チェックポイント阻害剤;多くの異なる抗体処置(多くの異なる抗体-エフェクター機能を有する);及び外部作用剤(微生物、昆虫毒素、アレルゲン等)又は腫瘍抗原に対するワクチン接種、を含む。
処置のモニタリングに加えて、同様に免疫調節障害状態を有する個体の古典的な「様子見」(wait-and-see)の経過観察においてまた、免疫モニタリングは、転帰(outcome)を予測する為にも、処置を適切に開始(install)、改変、又は中止する為にもますます重要となっている。
多くの白血球/免疫細胞サブセットが血液中で同定されているが、多くの他の免疫細胞サブセットは、それらが特定のタスク及びエフェクター機能を有する組織において排他的に又は主に検出可能であると推定される。それにもかかわらず、該免疫系は、全ての臓器又は臓器系への遊走を介して全身に到達する独自の能力を有する。該免疫細胞のそのような全身への遊走及びホーミングは、血流、及びその後リンパ系を介することによってのみ達成されることができる。これは、該血流が、標的化される免疫応答を探索する為の、全身を通しての移動、組織を破片のない状態に維持するスキャベンジャーのタスク、又は不適切な事象、例えば組織損傷、微生物の浸潤、若しくは初期の新生物形質転換に関する全身の走査、及び局所組織修復、を可能にする該免疫系の通り道(highway)として見なされることができることを意味する。
その結果、原則として、全て又は実質的に全ての免疫細胞又はそれらの前駆細胞(precursors)が、該血流において見出されうるが、該細胞は、低い又は非常に低い頻度で、独自の成熟段階として生じることがあり、部分的に該免疫細胞応答のタイミングに強く依存しうる。このことは、適切な時点で評価される為には、血中白血球の十分な数、最も可能性が高いのは少なくとも100万個、最大500万個~1000万個又はそれより多い、が必要であることを意味する。
全ての免疫細胞は、造血幹細胞区画に由来し、そこから該免疫細胞は、リンパ系及び骨髄系の発達が2つの主な経路である複数の系列の免疫細胞へと分化する。該リンパ系細胞は、多くの異なる抗原の非常に特異的な認識を可能にする、広く多様な抗原特異的受容体、すなわちB細胞の多くの異なる免疫グロブリン(Ig)分子の広いレパートリー、及びT細胞の多くの異なるT細胞受容体(TcR)の広いレパートリー、の産生を伴う適応免疫系の基礎を形成する。B細胞は、骨髄においてB細胞前駆細胞から未成熟B細胞へと発達し、未成熟B細胞及び主にナイーブB細胞として血流に達し、それらは抗原と接触すると、Ig分泌形質細胞及びメモリーB細胞へと更に分化することができる。該メモリーB細胞は、同じ抗原が再度遭遇される可能性があると、体内のいずれの場所でも効率よく且つ迅速に応答し、その後、更なるメモリーB細胞及び特には、増強されたIg産生の為の形質細胞、を形成し、これは、異なるクラスのIg分子、例えばIgM、IgD、IgG、IgA、及びIgE、並びにIgG及びIgAサブクラス、の産生を含む。全ての関連する未成熟及びナイーブB細胞サブセット、メモリーB細胞サブセット、及び形質芽球/形質細胞サブセットは、該体の中を循環して、有効な免疫応答を生成する為にそれらの標的組織へと到達する。それ故に、これらのサブセットは、該血流において検出可能であるが、一部のB細胞サブセットは、10個/μL以下の比較的低い頻度で生じる。十分な細胞(好ましくは、100万~500万個以上の血中白血球)が評価されている場合、該未成熟及びナイーブB細胞サブセット、クラススイッチされていない及びクラススイッチされた該メモリーB細胞サブセット、並びに形質芽球/形質細胞サブセットは、その全てが血液中で検出可能である完全なB細胞経路を形成する。
T細胞は胸腺において発達し、ここで、T細胞は、TcRγδ、並びにCD4+及びCD8+TcRαβ T細胞亜集団を伴うTcRαβ T細胞へと段階的に分化する。これらのT細胞集団は、該血流において主なT細胞集団を形成する。20年前に既に、該主なT細胞集団において、胸腺移出細胞及びナイーブT細胞から、セントラルメモリーT細胞、トランジショナルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、及びターミナルエフェクターT細胞への複数の成熟段階が発見された。加えて、CD4ヘルパーT(Th)細胞及びCD8細胞傷害性T細胞の機能的サブセット化がまた可能であるように思われた。
自然免疫細胞は又、異なる関連する系列:顆粒球細胞、例えば好中球、好塩基球及び好酸球;単球、例えば古典的単球、中間単球、非古典的単球及びFcERI+単球;樹状細胞(DC)、例えば骨髄系DC、形質細胞様DC;NK細胞及び他の自然リンパ球等、へと細分されることができる。
フローサイトメトリーによる血中白血球サブセット化に関して利用可能な、多くの提案が為されているが、本発明者等は、以下の問題がこれまで可能ではなかったことを認識した:
1:様々な単球サブセット及び他の骨髄系細胞にも関連付けて、1回の測定で血液中のDCを効率よく且つ同時にサブセット化する方法;
2:好ましくは、様々な細胞傷害性T細胞及びNK細胞のサブセット化と結びつけて、単一の抗体の組み合わせを使用して、多くの他のT細胞サブセット及び成熟段階にも関連付けて、CD4ヘルパーTサブセット、濾胞ヘルパーT(follicular helper T)(Tfh)細胞、及び制御性T細胞(Treg)を定義する為に複雑な細胞内サイトカインプロファイルを含まない、CD4+T細胞をサブセット化する方法。
3:様々なB細胞サブセット及びそれらのIgHサブクラス発現にも関連付けて、形質芽球/形質細胞区画内の成熟及び機能的サブセット化を区別する方法。
1:様々な単球サブセット及び他の骨髄系細胞にも関連付けて、1回の測定で血液中のDCを効率よく且つ同時にサブセット化する方法;
2:好ましくは、様々な細胞傷害性T細胞及びNK細胞のサブセット化と結びつけて、単一の抗体の組み合わせを使用して、多くの他のT細胞サブセット及び成熟段階にも関連付けて、CD4ヘルパーTサブセット、濾胞ヘルパーT(follicular helper T)(Tfh)細胞、及び制御性T細胞(Treg)を定義する為に複雑な細胞内サイトカインプロファイルを含まない、CD4+T細胞をサブセット化する方法。
3:様々なB細胞サブセット及びそれらのIgHサブクラス発現にも関連付けて、形質芽球/形質細胞区画内の成熟及び機能的サブセット化を区別する方法。
それ故に、本発明は、特にサイトメトリーによる血中白血球サブセット化を可能にする新規試薬組成物及び方法を提供することによって、上記の問題のうちの1以上に取り組むことを狙いとする。好ましくは、該試薬は、現在40色を超えて増加している、多くの異なる蛍光色素を使用して、古典的なマルチパラメータフローサイトメトリー技術において適用されることができる。代替的には、異なる40「色」(金属)を超えて現在増加している、金属にコンジュゲーションされた抗体は、マスサイトメトリーにおける分析の為に使用されることができる。
第1の観点において、本発明は、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該試薬組成物は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーの組み合わせ:CD141、HLA-DR、CD16、CD33、CD300e、CD303、及びCD14に対して向けられたものであり、該CD300e及びCD303に対して向けられた抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされうる、上記試薬組成物を提供する。そのような試薬組成物は、本明細書において、「DC-単球チューブ」とも云われる。
第2の観点において、本発明は、試薬組成物、すなわち白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物、であって、該試薬組成物は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーの組み合わせ:CD27、CD45RA又はCD45RO、CD62L、CD127、CD3、CD25、CCR10、CD183(CXCR3)、CD196(CCR6)、CD194(CCR4)、CD185(CXCR5)、及びCD4に対して向けられたものである、上記試薬組成物を提供する。そのような試薬組成物は、本明細書において「CD4 T細胞チューブ」とも云われる。
第3の観点において、本発明は、試薬組成物、すなわち白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該試薬組成物が、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、任意的にCD19と組み合わせられた、下記のマーカーの組み合わせ:CD20、CD38、CD62L、及びCD138に対して向けられたものである、上記試薬組成物を提供する。そのような試薬組成物はまた、本明細書において「形質細胞/B細胞チューブ」と云われる。
本発明はまた、本明細書に開示されている2以上の試薬組成物を含む試薬セットに関する。
更なる観点は、本発明に従う1以上の試薬組成物又は試薬組成物のセットを、任意的に使用の為の指示書、バッファ、及び/又は対照サンプルと一緒に含んでいてもよい、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の診断キットに関する。
本発明に従う診断キットの、例えば古典的な免疫抑制処置(コルチコステロイド類、シクロスポリン、メトトレキサート等);細胞処置、例えば遺伝子療法、幹細胞移植、CAR T細胞処置;チェックポイント阻害剤;多くの異なる抗体処置(多くの異なる抗体-エフェクター機能を有する);及び外部作用剤(external agents)(微生物、昆虫毒素、アレルゲン等)又は腫瘍抗原に対するワクチン接種からなる群から選択される、免疫調節処置の効果のモニタリングすることにおける使用がまた提供される。
更なる実施態様において、本発明は、対象の免疫状態及び/又は免疫調節処置の効果のモニタリングする為のサイトメトリー方法であって、
(a)該対象から得られた白血球を含む生物サンプルの1以上のアリコートを、本発明に従う試薬組成物と接触させること;
(b)(フロー又はマス)サイトメーターにおいて上記1以上のアリコート中の白血球を分析すること;及び
(c)得られたデータを保存し、且つ評価すること
の工程を含む、上記方法を提供する。
(a)該対象から得られた白血球を含む生物サンプルの1以上のアリコートを、本発明に従う試薬組成物と接触させること;
(b)(フロー又はマス)サイトメーターにおいて上記1以上のアリコート中の白血球を分析すること;及び
(c)得られたデータを保存し、且つ評価すること
の工程を含む、上記方法を提供する。
本発明は、一部の実施態様において、改善された有利な試薬組成物、並びにそれを含むキットに関する。語「試薬組成物」(又は「サイトメトリーパネル」)は、本明細書で使用される場合、検出可能な標識に(直接的に又は間接的に)コンジュゲーションされた抗体(又は他の特異的抗原結合剤)のカクテルに関する。
抗体又は免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって互いに連結された、2つの重鎖及び2つの軽鎖を含み、各軽鎖は「Y」字形状の構成でジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に連結されている。軽鎖及び重鎖の各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成している。該重鎖のアイソタイプ(ガンマ、アルファ、デルタ、イプシロン又はミュー)は、免疫グロブリンのクラス(それぞれ、IgG、IgA、IgD、IgE又はIgM)を決定する。語「抗体」又は「複数の抗体」が使用されている場合、これは、インタクト抗体、例えばポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体(mAb)、並びにそのタンパク質分解断片、例えばFab又はF(ab’)2 断片、を含むと意図されることが理解されるべきである。更に、キメラ抗体、組み換え抗体及び操作された抗体、並びにその断片、並びに抗体の少なくとも抗原結合部位を含む(抗原結合能を保持している)他の分子が、本発明の範囲内にある。好ましい実施態様において、該組成物は、コンジュゲートモノクローナル抗体のパネルを含む。表記されたマーカーに対する(モノクローナル)抗体は、Becton/Dickinson(BD)Biosciences、Biolegend、Dako、Beckman Coulter、CYTOGNOS、Caltag、Myltenyi、Pharmingen、Exbio、Sanquin、Invitrogen等、を含む、様々な企業から購入することによって得られることができる。
本発明において使用する為の抗体は、サイトメトリー、例えばフロー又はマスサイトメトリー、によって検出可能である標識にコンジュゲーションされている。検出可能な標識の好適なタイプは、蛍光色素(フルオロフォア)、量子ドット、及び金属同位体標識を含む。理解されるように、同時の検出を容易にする為に、本発明の試薬組成物に存在する全ての抗体は、同じタイプの検出可能な標識にコンジュゲーションされており、例えば、全てが蛍光色素にコンジュゲーションされているか、又は全てが同位体標識されている。加えて、フローサイトメトリーは、物理的特性の同定又は定量的測定の為に細胞又は粒子から散乱された光の特性を使用している。
一つの実施態様において、該抗体は、蛍光色素にコンジュゲーションされている。蛍光色素(又は「フルオロフォア」)は、励起源(レーザービーム)からのエネルギーを吸収して、より長い波長(蛍光)で光子を放出することができる化学物質であり、該光子がフローサイトメーターの光学的検出器によって捕捉される。抗体をコンジュゲーションする為に好適な蛍光色素は、当技術分野で既知である。各フルオロフォアは、特徴的なピーク励起波長及び放出波長を有し、該放出スペクトルは重複することが多い。その結果、使用されることができる標識の組み合わせは、該蛍光色素を励起する為に使用される1以上の光源又は1以上のレーザーの波長及び利用可能な検出器に依存する。該蛍光色素は好ましくは、輝度、スペクトルの重複が限定的であること、及び補正の必要が限定的であること、安定性等、に関して選択される。
広範囲の蛍光色素が、フローサイトメトリーにおける標識として使用されることができる。本発明に従う試薬組成物において特に有用な蛍光色素は、ブリリアントバイオレット(Brilliant Violet)(BV)シリーズの蛍光色素、例えばBV421又はその機能的等価物、BV510又はその機能的等価物、BV605又はその機能的等価物、BV650又はその機能的等価物、BV711又はその機能的等価物、BV786又はその機能的等価物;フルオレセインイソチオシアネート(FITC)又はその機能的等価物(例えば、BB515)、PerCP Cy5.5又はその機能的等価物、フィコエリスリン(PE)又はその機能的等価物、フィコエリスリン/CF594(PE CF594)又はその機能的等価物、フィコエリスリン/シアニン5(PE-Cy5)又はその機能的等価物 フィコエリスリン/シアニン7(PE-Cy7)又はその機能的等価物、アロフィコシアニン(APC)又はその機能的等価物(Alexa647)、AF700又はその機能的等価物、及びアロフィコシアニン/H7(APC-H7)又はその機能的等価物、を含む。
下記のパネルの蛍光色素は、本発明に従う12色の試薬組成物において特に有用である:(1)BV421又はその機能的等価物、(2)BV510又はその機能的等価物、(3)BV605又はその機能的等価物;(4)BV711又はその機能的等価物、(5)BV786又はその機能的等価物、(6)フルオレセインイソチオシアネート(FITC)又はその機能的等価物(例えば、BB515)、(7)PerCP Cy5.5又はその機能的等価物、(8)フィコエリスリン(PE)又はその機能的等価物、(9)フィコエリスリン/シアニン7(PE-Cy7)又はその機能的等価物、(10)アロフィコシアニン(APC)又はその機能的等価物(Alexa647)、(11)AF700又はその機能的等価物、例えば、APC-R700、(12)アロフィコシアニン/H7(APC-H7)又はその機能的等価物、例えば、APC-Cy7。
下記のパネルの蛍光色素は、本発明に従う14色の試薬組成物において特に有用である:(1)BV421又はその機能的等価物、(2)BV510又はその機能的等価物、(3)BV605又はその機能的等価物;(4)BV650又はその機能的等価物、(5)BV711又はその機能的等価物、(6)BV786又はその機能的等価物、(7)フルオレセインイソチオシアネート(FITC)又はその機能的等価物(BB515)、(8)PerCP Cy5.5又はその機能的等価物、(9)フィコエリスリン(PE)又はその機能的等価物、(10)フィコエリスリン/CF594(PE CF594)又はその機能的等価物、(11)フィコエリスリン/シアニン5(PE-Cy5)又はその機能的等価物(12)フィコエリスリン/シアニン7(PE-Cy7)又はその機能的等価物、(13)アロフィコシアニン(APC)又はその機能的等価物(Alexa647)、(14)AF700又はその機能的等価物、(15)アロフィコシアニン/H7(APC-H7)又はその機能的等価物。
別の実施態様において、該抗体は、量子ドットにコンジュゲーションされている。時に、量子ドットが、それらの狭い放出ピークの為に従来の蛍光色素の代わりに使用されている。
なお別の実施態様において、該抗体はまた、金属同位体にコンジュゲーションされており、飛行時間型サイトメトリー(cytometry by time-of-flight)(CyTOF)と呼ばれる、マスサイトメトリーによる検出を可能にする。単細胞マスサイトメトリーにおける進歩は、免疫細胞の不均一性の高度に多次元の特徴付けをますます改善している。イムノアッセイの多重化能は、安定な重金属同位体によって標識されたモノクローナル抗体に依存する。
マスサイトメトリーは、抗体に結合したランタニド同位体を利用することによって、該蛍光標識の限界を克服する。この方法は、理論的には、40~60の識別可能な標識又はそれより多くの標識の使用を可能にすることができる。マスサイトメトリーは、フローサイトメトリーとは根本的に異なり、細胞は、プラズマに導入され、電離され、関連する同位体が、飛行時間型質量分析法を介して定量される。この方法は、多数の標識の使用を可能にするが、現在のところ、フローサイトメトリーより低いスループット能力を有する。該方法は又、分析された細胞を破壊し、選別によってそれらを回収することができない。最後に、細胞の主要な分画は、測定の為のコーンに到達する前に失われる。
今日まで、多様な希土類元素及び貴金属及び貧金属が、マスサイトメトリーにおいて使用されている。例えば、Han et al.(2018,Nature Protocols volume 13,pages 2121-2148)は、モノクローナルIgG抗体を48個の高純度重金属同位体、すなわち(i)ランタニドの38個の同位体、インジウムの2つの同位体、及びイットリウムの1つの同位体;(ii)パラジウムの6つの同位体;並びに(iii)ビスマスの1つの同位体、にコンジュゲーションさせる為のプロトコールを開示している。
一つの実施態様において、本発明の試薬組成物は、異なる質量の金属、特に金属の同位体、好ましくは、Pr、Bi、Y、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Rh、Cd、In、Ir、Pt及びPdからなる群から選択される、金属の同位体にコンジュゲーションされている、抗体のパネルを含む。特定の例は、103Rh、106Cd、110Cd、111Cd、112Cd、113Cd、114Cd、115In、116Cd、141Pr、142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、147Sm、148Nd、149Sm、150Nd、151Eu、152Sm、153Eu、154Sm、155Gd、156Gd、158Gd、159Tb、160Gd、161Dy、162Dy、163Dy、164Dy、165Ho、166Er、167Er、168Er、169Tm、170Er、171Yb、172Yb、173Yb、174Yb、175Lu、176Yb、191Ir、193Ir、194Pt、198Pt及び209Biを包含する。
細胞のマスサイトメトリー分析の為のサンプル調製の、典型的な方法において、細胞は、目的の抗原(マーカー)を標的とする金属をタグ付けされた抗体のパネルと共にインキュベート(又は「染色」)される。DNAインターカレート剤は、該パネルに組み込まれることができ、それによって有核細胞を非有核細胞から決定することを可能にする。細胞は、休止条件又は刺激条件の下で染色され、固定された後に解析される。該サンプルは、洗浄されて非結合抗体及び塩が除去され、適切な細胞濃度に希釈される。次に、細胞は、単細胞懸濁物中でネブライザーまで通過され、該ネブライザーは、該細胞を、該マスサイトメーターに導入する為の液滴へとエアロゾル化する。該機器に入ると、細胞は、7000°Kのアルゴンプラズマの中を移動し、該アルゴンプラズマは、該細胞及び該結合された抗体を、単一原子イオンのクラウドの中で完全に蒸気にしてイオン化する。該クラウドのサイズは、ガス膨張速度論によって主に促進され、該細胞サイズとは比較的無関係である。該イオンクラウドは、四極子によって濾過され、約75Da未満の質量を有する一般的な生物学的要素が除去され、目的のマーカーセットに対する該染色抗体に結合された重金属イオンのみが残される。該クラウド内の該イオンは、飛行時間型(TOF)質量分析器において、その質量と電荷との比によって分離される。イオンシグナルは、細胞毎に積分され、分析の為の単細胞測定をもたらす。
本明細書に提供されている試薬組成物における該抗体のパネルは、一部の実施態様において、細胞含有生物サンプル(懸濁物中)を同時に標識する為に使用されうる。言い換えれば、該サンプルは、典型的に及び有利に、本明細書に開示されている全サイトメトリーパネルと共にインキュベートされており、このように、該サンプルからの単細胞における抗原同時発現パターンのマルチパラメトリック解析(「多重化」)を使用して、単一の測定工程において複数の細胞集団の特徴付けを可能にする。従って、パネル内での分離が望ましい別個の細胞標的(「マーカー」)に対して向けられた抗体は、別個の(非等価物の)検出可能な標識によって標識され、これらは、本明細書において別個のコンジュゲーションされた抗体と云われる。該マーカーは、細胞表面上(細胞表面マーカー)又は細胞質(細胞質マーカー;cyマーカー)において発現されるタンパク質であることができる。典型的に、本発明のマーカーは、ヒトマーカーである。「CD」は、クラスターの名称を意味し、モノクローナル抗体によって定義される特定の(ヒト)細胞表面抗原の同定の為の命名法である。
一部の実施態様において、試薬組成物は、異なるマーカーに対して向けられた抗体を含むが、サブセット、例えばこれらの抗体の2つ又は3つが、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされている。例えば、各々が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされている、CD300e及びCD303に対して向けられた抗体を含む、表1の試薬を参照されたい。該試薬組成物は、そのような抗体対の2以上を含みうるが、ここで、該対のいずれか1つにおける抗体は、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされているが、該標識は異なる対の間では識別可能である。例えば、第1の対の両方の抗体が、蛍光色素Aにコンジュゲーションされており、第2の対の両方の抗体が、蛍光色素Bにコンジュゲーションされている。このように、各対において、該蛍光色素は同じである。例えば、各々が蛍光色素「F9」にコンジュゲーションされている、SLAN及びFcERIに対して向けられた抗体、並びに各々が蛍光色素「F12」にコンジュゲーションされている、CD300e及びCD303に対して向けられた抗体を含む試薬を開示している、表1を参照されたい。
該試薬組成物はまた、同じ標的(マーカー)に対する複数のコンジュゲーションされた抗体を含むことが可能であり、各抗体は、別個の検出可能な標識にコンジュゲーションされている。例えば、第1の抗体が蛍光色素「F8」にコンジュゲーションされており、第2の抗体が蛍光色素「F12」にコンジュゲーションされている、IgA1に対する2つの抗体;第1の抗体が蛍光色素「F7」にコンジュゲーションされており、第2の抗体が、蛍光色素「F9」にコンジュゲーションされている、IgG2に対する2つの抗体;及び第1の抗体が、蛍光色素「F7」にコンジュゲーションされており、第2の抗体が蛍光色素「F12」にコンジュゲーションされている、IgDに対する2つの抗体、を含む試薬を開示している、表7を参照されたい。
語「キット」は、本明細書で使用される場合、少なくとも1つの、典型的に複数の本発明の試薬組成物を含み、任意的に更なる試薬、例えば細胞の解離、精製、透過処理の為の試薬、対照サンプル若しくは抗体、又はフローサイトメトリーにおいて使用する為の他の試薬、を含む、製品に関する。該キットは更に、本発明の方法における該少なくとも1つの試薬組成物を使用する為の説明書、例えば、本明細書で詳述されているマルチパラメトリック解析を使用して測定される結果を解析する為の説明書を含有しうる。一つの実施態様において、本発明は、本明細書に開示されている1以上の12色試薬組成物を含む12色診断キットを提供する。
対象の該免疫状態、及び/又は該免疫調節処置の効果をモニタリングする為のサイトメトリー方法は、典型的に(a)該対象から得られた白血球を含む生物サンプルのアリコートを、本明細書に開示されている試薬組成物と接触させること;(b)検出可能な標識のタイプ、フローサイトメーター又はマスサイトメーターに応じて、上記アリコート中の白血球を分析すること;及び(c)得られたデータを保存し、且つ評価することの工程を含む。
白血球を含有することが既知であるか又は疑われる任意のタイプのサンプルは、直接、又は非有核赤血球の溶解後、若しくは密度勾配遠心分離後、若しくは細胞選別手順後に使用されうる。例えば、該サンプルは、末梢血、骨髄、組織サンプル、例えばリンパ節、アデノイド、脾臓、若しくは肝臓、又は他のタイプの体液、例えば脳脊髄液、硝子体液、滑液、胸膜滲出液、若しくは腹水、である。末梢血(Peripheral blood)(PB)又は骨髄(bone marrow)(BM)が好ましい。
好ましくは、本明細書に提供されている方法の工程(c)は、サンプルの1つのアリコートからの個々の細胞が、それらのマーカー及び散乱プロファイルに従って、同じサンプルの別のアリコートからの対応する個々の細胞と一致する、いわゆる最近傍法の計算に従って、複数のチューブからの2以上の選択された細胞集団の免疫表現型情報を組み合わせることを含む。有利には、該方法は、フローサイトメトリーファイルのデータ統合及び多次元解析の為にソフトウェアの使用を含み、好ましくは、上記ソフトウェアはINFINICYT(商標)である。
下記のA~Eの節において、本発明の特に好ましい実施態様が表されている。これらの実施態様のいずれも、単独で、又は互いに組み合わせて使用されることができる。示されている該実施態様は、検出可能な標識として蛍光色素にコンジュゲーションされている抗体に関するが、他のタイプの検出可能な標識、例えば金属同位体、を含む変形形態の実施態様がまた、包含されることが理解され且つ認識される。本明細書で使用される場合、試薬組成物に関連付けて考察される表現「マーカーの組み合わせ」は、該組成物が、上記マーカーの組み合わせの各マーカーに対するコンジュゲーションされた抗体を含むことを意味する。
A.血液及びBM試験の為のDC-単球チューブ
樹状細胞(DC)が最初に発見されて以降、複数のサブセットが段階的に同定されている。一部のDCサブセットは、組織において排他的に見出されているが、他のDCサブセットがまた血液中で見出されている。これらの血中DCは、古典的に定義された形質細胞様DC(pDC)及び骨髄系DC(myDC)、並びにそれらのサブセット、myDC CD1c+/CD14low、myDC CD1c+/CD14-/CD5-、myDC CD1c+/CD14-/CD5+及びmyDC CD141+、それに加えて、最近記載されたAxl+DC及びCD100+DC前駆細胞(pre-DC)(Villani,Satija et al.2017、Yin,Yu et al.2017、Collin and Bigley 2018)を含む。一部の樹状細胞集団に関して、幾つかの代替的なマーカーが、その正確な同定の為に使用されることができ、例えば、pDCの同定の為にCD123high、CD303及びCD304、myDCの為にCD11c及びCD33、並びにCD141+myDCの為にCD141又はCLEC9A、が使用されることができる(Bachem,Guttler et al.2010、Heinze,Elze et al.2013、Fromm,Kupresanin et al.2016、Alcantara-Hernandez,Leylek et al.2017、Dutertre et al.2017、Villani,Satija et al.2017、Collin and Bigley 2018を参照)。これに対し、他のサブセットは、文献において単一のマーカーに基づいて定義されており、例えばAxl+DCは、Axlの発現(SIGLEC6も組み合わせて)に基づいて、CD100+myDC前駆細胞は、CD100とCD34の組み合わせに基づいて、CD1c+myDCは、CD1cに基づいて同定されている(Villani,Satija et al.2017、Collin and Bigley 2018)。
樹状細胞(DC)が最初に発見されて以降、複数のサブセットが段階的に同定されている。一部のDCサブセットは、組織において排他的に見出されているが、他のDCサブセットがまた血液中で見出されている。これらの血中DCは、古典的に定義された形質細胞様DC(pDC)及び骨髄系DC(myDC)、並びにそれらのサブセット、myDC CD1c+/CD14low、myDC CD1c+/CD14-/CD5-、myDC CD1c+/CD14-/CD5+及びmyDC CD141+、それに加えて、最近記載されたAxl+DC及びCD100+DC前駆細胞(pre-DC)(Villani,Satija et al.2017、Yin,Yu et al.2017、Collin and Bigley 2018)を含む。一部の樹状細胞集団に関して、幾つかの代替的なマーカーが、その正確な同定の為に使用されることができ、例えば、pDCの同定の為にCD123high、CD303及びCD304、myDCの為にCD11c及びCD33、並びにCD141+myDCの為にCD141又はCLEC9A、が使用されることができる(Bachem,Guttler et al.2010、Heinze,Elze et al.2013、Fromm,Kupresanin et al.2016、Alcantara-Hernandez,Leylek et al.2017、Dutertre et al.2017、Villani,Satija et al.2017、Collin and Bigley 2018を参照)。これに対し、他のサブセットは、文献において単一のマーカーに基づいて定義されており、例えばAxl+DCは、Axlの発現(SIGLEC6も組み合わせて)に基づいて、CD100+myDC前駆細胞は、CD100とCD34の組み合わせに基づいて、CD1c+myDCは、CD1cに基づいて同定されている(Villani,Satija et al.2017、Collin and Bigley 2018)。
DC集団を同定する為のフローサイトメトリーパネルを設計する為の、幾つかの試みが行われているが(Autissier,Soulas et al.2010,Hasan,Beitz et al.2015,Fromm,Kupresanin et al.2016,Draxler,Madondo et al.2017)、現在まで、他の自然細胞、例えば単球サブセット、顆粒球サブセット及び骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)、に加えて、限定数のマーカーによって、単一チューブアプローチで血液中の上記DC集団(新たに記載されたサブセットを含む)の全てを同時に同定する方法を、当業者は教示又は示唆していない。
本発明者等は、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含む該試薬組成物を提供することによって、この問題を解決し、該コンジュゲーションされた抗体は、下記のマーカー:CD141、HLA-DR、CD16、CD33、CD300e、CD303及びCD14の組み合わせに対して向けられたものであり、該CD300e及びCD303に対して向けられた抗体は、同じ標識にコンジュゲーションされうる。
A.1 血液分析の為のDC-単球チューブ
新規DC/単球試薬は、6又は7つの別個の標識にコンジュゲーションされた7つの「バックボーン」マーカー(CD14、CD16、CD33、CD141、CD300e、CD303、HLA-DR)の革新的パネルに対するコンジュゲーションされた抗体を含む(CD300e及びCD303は、同じ標識付けで組み合わせられることができる;表1、チューブBB1)。この7種のマーカーの組み合わせにおいて、該マーカーCD300eは、その発現プロファイルが単球と別個のDC(それぞれ、陽性/high対陰性/low)とを識別することから、極めて重要である。該マーカーCD141及びCD303に対して向けられた抗体はそれぞれ、CD141+myDC及びpDCの認識にとって必須である。これにより、本発明の抗体パネルは、中でもCD33、HLA-DR、CD14、CD16、CD303及びCD141に対して向けられた抗体を含むが、必須の抗CD300e抗体を欠如する、サイトメトリーパネルを開示する、国際公開第2017/094008号パンフレットを含む、当技術分野で既知の試薬組成物と比較して予想外の利点を提供する。
新規DC/単球試薬は、6又は7つの別個の標識にコンジュゲーションされた7つの「バックボーン」マーカー(CD14、CD16、CD33、CD141、CD300e、CD303、HLA-DR)の革新的パネルに対するコンジュゲーションされた抗体を含む(CD300e及びCD303は、同じ標識付けで組み合わせられることができる;表1、チューブBB1)。この7種のマーカーの組み合わせにおいて、該マーカーCD300eは、その発現プロファイルが単球と別個のDC(それぞれ、陽性/high対陰性/low)とを識別することから、極めて重要である。該マーカーCD141及びCD303に対して向けられた抗体はそれぞれ、CD141+myDC及びpDCの認識にとって必須である。これにより、本発明の抗体パネルは、中でもCD33、HLA-DR、CD14、CD16、CD303及びCD141に対して向けられた抗体を含むが、必須の抗CD300e抗体を欠如する、サイトメトリーパネルを開示する、国際公開第2017/094008号パンフレットを含む、当技術分野で既知の試薬組成物と比較して予想外の利点を提供する。
一つの実施態様において、標識を効率的に使用するという理由から、本発明の抗体パネルにおけるCD300e及びCD303に対する該抗体は、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされている。これは、該CD300e及びCD303マーカーが相互に排他的マーカーであり、すなわち、それらが同じ単球及びDCサブセット上には存在しないことから、可能である。CD300eは、CD300eが陰性であるか、又は僅かに発現されている一部のDCサブセット上より高い強度で、全ての血中単球サブセット上で発現されるが、CD303は、典型的にpDC及びAxl+DCにおいて発現される。
単独で、本明細書に提供されている7種のマーカーのバックボーン試薬組成物は、下記を含む、全体で10個の自然細胞サブセットに関して、5つのDCサブセットの同定(図1;図2A)、及び3つの単球サブセットの同定(図1;図2B)、それに加えて好中球及び好酸球(図1;図2C)の同定を既に可能にしている(完全なゲート設定戦略による図1):
pDC:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33-/low、CD141+、CD300e-、CD303+、SSClow
myDC CD141+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD141++、CD300e-、CD303-、SSClow
myDC CD1c+CD14-:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD141low、CD300e-/low、CD303-、SSClow
myDC CD1c+CD14low:HLA-DR++、CD14low、CD16-、CD33++、CD141low、CD300e-/low、CD303-、SSClow
Axl+DC:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33+、CD141+、CD300e-、CD303low/+、SSClow
古典的単球(cMo):HLA-DR+、CD14+、CD16-、CD33++、CD141low、CD300e+、CD303-、SSCint
中間単球(iMo):HLA-DR++、CD14+、CD16+、CD33++、CD141low、CD300e++、CD303-、SSCint
非古典的単球(ncMo):HLA-DR+、CD14-/low、CD16+、CD33+、CD141low、CD300e++、CD303-、SSCint
好中球:HLA-DR-、CD14-、CD16++、CD33+、CD141-、CD300e-、CD303-、SSChigh
好酸球:HLA-DR-、CD14-、CD16-、CD33low、CD141-、CD300e-、CD303-、SSChigh
pDC:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33-/low、CD141+、CD300e-、CD303+、SSClow
myDC CD141+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD141++、CD300e-、CD303-、SSClow
myDC CD1c+CD14-:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD141low、CD300e-/low、CD303-、SSClow
myDC CD1c+CD14low:HLA-DR++、CD14low、CD16-、CD33++、CD141low、CD300e-/low、CD303-、SSClow
Axl+DC:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33+、CD141+、CD300e-、CD303low/+、SSClow
古典的単球(cMo):HLA-DR+、CD14+、CD16-、CD33++、CD141low、CD300e+、CD303-、SSCint
中間単球(iMo):HLA-DR++、CD14+、CD16+、CD33++、CD141low、CD300e++、CD303-、SSCint
非古典的単球(ncMo):HLA-DR+、CD14-/low、CD16+、CD33+、CD141low、CD300e++、CD303-、SSCint
好中球:HLA-DR-、CD14-、CD16++、CD33+、CD141-、CD300e-、CD303-、SSChigh
好酸球:HLA-DR-、CD14-、CD16-、CD33low、CD141-、CD300e-、CD303-、SSChigh
CD5に対して向けられた抗体を、上記バックボーンの組み合わせ(7つの標識付けと組み合わされた、全体で8種のマーカー;表1、チューブBB2A)に加えることは、CD1c+myDCの、CD5-及びCD5+サブセットへの更なるサブセット化を可能にする(図2D;図3A)。同様に、CD34を、6つの標識付けと組み合わされた7種のマーカーのバックボーン組み合わせ(表1、チューブBB2B)に加えることも、造血前駆細胞(HLA-DR+/++、CD14-、CD16-、CD33+、CD141-/+、CD300e-、CD303-/+、CD34low/+、SSClow)並びにCD100+DC前駆細胞(preDC、HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33+、CD141-、CD300e-、CD303-、CD34low、SSClowとして定義される)の明確な同定を提供する(図2D;図3A)。CD5及びCD34に対して向けられた抗体を、CD45の非存在下で上記のバックボーンに同時に加えることは、myDC CD1c+/CD14-/CD5-をmyDC CD1c+/CD14-/CD5+並びにCD100+DC前駆細胞及びCD34+造血前駆細胞から判別することを可能にし、それ故に、全体で13個の細胞サブセットの同定を可能にする(図2D;図3A)。CD45に対して向けられた抗体を加えることは、好塩基球(HLA-DR-、CD14-、CD16-/+、CD33+、CD141-、CD300e-、CD303-、CD34-、CD5-、CD45low、SSClow)(14個の自然細胞サブセット)の同定を更に可能にする。
単球を更にサブセット化する為に、マーカーのCD36プラスSLAN対及び/又はCD62LプラスFcERI対は、cMo及びncMoのサブセットの更なる同定の為に、上記の組み合わせのいずれかに加えられることができ、ここで、該対は、ncMo CD36+/SLAN-、ncMo CD36+/SLAN+、ncMo CD36-/SLAN-、ncMo CD36-/SLAN+(図2E;図3A)、並びにcMo CD62L+/FcERI-、cMo CD62L+/FcERI+、cMo CD62L-/FcERI-、cMo CD62L-/FcERI+(図2F;図3A)を含む。これらの後者の4種のマーカーが共に加えられると、SLAN及びFcERIに対して向けられた抗体はいずれも、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができるが、CD62L及びCD36に対して向けられた抗体は、各々が異なる標識付けによってコンジュゲーションされる(表1を参照)。注目すべきは、FcERI及びCD62L抗体を上記で言及されたバックボーン抗体に加えることがまた、好塩基球(HLA-DR-、CD14-、CD16-/+、CD33+、CD141-、CD300e-、CD303-、CD62Lhigh、FcεRI+、SSClow)の更なる同定を可能にする(表1、チューブBB3B;図3A)。
別の実施態様において、抗CD45抗体のみが上記の7種のマーカーのバックボーンの組み合わせに加えられ、これは全体で12個の自然細胞集団に関して、血液中の好塩基球(HLA-DR-、CD14-、CD16-/+、CD33+、CD141-、CD300e-、CD303-、CD45low、SSClow;表1、チューブBB2C)及び造血前駆細胞(HLA-DR+/++、CD14-、CD16-、CD33+、CD141-/+、CD300e-、CD303-、CD45low、SSClow)の同定を更に可能にする(図2G;図3A)。
CD36プラスCD192及び/又はCD62LプラスCD45抗体を、6又は7つの標識付けと組み合わされた、7種マーカーのバックボーン又はマーカーの上記の組み合わせのいずれかに加えることは、単球性(M)-MDSC(図2F;図3A)、及び/又は未成熟好中球の2つの集団[多形核(PMN)-MDSCと表現型が適合性である]の同定をそれぞれ、可能にする(図2G;図3A):
M-MDSC:HLA-DR-、CD14+、CD16-、CD33++、CD36-/low、CD45+、CD62L+、CD141-、CD192(CCR2)-/low、CD300e-、CD303-、SSCint
未成熟好中球CD62L-:HLA-DR-、CD14-、CD16-、CD33++、CD36-、CD45low、CD62L-、CD141-、CD192(CCR2)-、CD300e-、CD303+、SSChi
未成熟好中球CD62L+:HLA-DR-、CD14-、CD16low、CD33++、CD36-、CD45low、CD62L+、CD141-、CD192(CCR2)-、CD300e-、SSChi
M-MDSC:HLA-DR-、CD14+、CD16-、CD33++、CD36-/low、CD45+、CD62L+、CD141-、CD192(CCR2)-/low、CD300e-、CD303-、SSCint
未成熟好中球CD62L-:HLA-DR-、CD14-、CD16-、CD33++、CD36-、CD45low、CD62L-、CD141-、CD192(CCR2)-、CD300e-、CD303+、SSChi
未成熟好中球CD62L+:HLA-DR-、CD14-、CD16low、CD33++、CD36-、CD45low、CD62L+、CD141-、CD192(CCR2)-、CD300e-、SSChi
ここで、提唱される15抗体の組み合わせ(表1A)は、血液1mL中に少なくとも23個の別個の自然細胞サブセットの同時同定を可能にし、ここで、該サブセットはpDC、myDC CD1c+/CD14low、myDC CD1c+/CD14-/CD5-、myDC CD1c+/CD14-/CD5+、myDC CD141+、Axl+DC、pre-DC(CD100+)、古典的単球(cMo)の4つのサブセット[CD62L+/FcεRI-、CD62L+/FcεRI+、CD62L-/FcεRI-及びCD62L-/FcεRI+]、中間単球(iMo)、非古典的単球(ncMo)の4つの集団[CD36+/Slan-、CD36-/Slan-、CD36+/Slan+、CD36-/Slan+]、並びに好塩基球、好中球の3つの集団(成熟好中球、未成熟好中球CD62L-及びCD62L+)、好酸球、単球、骨髄由来サプレッサー細胞(M-MDSC)、及び造血前駆細胞(HPC)(図1及び2;図3A)を含む。CD1c、Axl及び/又はCD100抗体を16番目、17番目及び/又は18番目の抗体として加えることは、上記自然細胞サブセットの定義を更に確認する(表1A)。3種全てのマーカーに対して向けられた抗体が加えられる場合、CD14及びCD34抗体は、これらの2種のマーカーがDC単球経路において同じ細胞上で同時発現されないことから、同じ標識にコンジュゲーションされることができる(表1A)。
A.2 骨髄(BM)解析の為のDC-単球チューブ
別の実施態様において、6又は7つの標識付けと組み合わされた7種のマーカー(CD14、CD16、CD33、CD141、CD300e、CD303、HLA-DR)の上記DC-単球バックボーンの組み合わせは、4種のマーカー、すなわちCD34、CD45、CD64及びCD117、を補充されることができ(表1B)、これは骨髄の試験、特に単球性前駆細胞及び成熟細胞(単芽球CD34+/CD117+、単芽球CD34-/CD117+、前単球CD14-、前単球CD14+、cMo、iMo及びncMo)、myDC CD141+、pDC、成熟好塩基球及び肥満細胞、の同定及び基本的サブセット化を可能にする(図3B):
単芽球CD34+/CD117+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33+、CD34+、CD45+、CD64+、CD117+、CD141-、CD300e-、CD303-
単芽球CD34-/CD117+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117+、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球CD14-/low:HLA-DR++、CD14-/low、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球CD14+:HLA-DR++、CD14+、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
cMo:HLA-DR++、CD14+、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e+、CD303-
iMo:HLA-DR++、CD14+、CD16+、CD33+,CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e+、CD303-
ncMo:HLA-DR++、CD14+、CD16+、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e+、CD303-
myDC CD141+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64-、CD117-/low、CD141++、CD300e-、CD303-
pDC:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33-/low、CD34-、CD45+、CD64-、CD117-、CD141+、CD300e-、CD303+
成熟好塩基球:HLA-DR-、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD45low、CD64-、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
肥満細胞:HLA-DR-、CD14-、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64-/+、CD117++、CD141-、CD300e-、CD303-
別の実施態様において、6又は7つの標識付けと組み合わされた7種のマーカー(CD14、CD16、CD33、CD141、CD300e、CD303、HLA-DR)の上記DC-単球バックボーンの組み合わせは、4種のマーカー、すなわちCD34、CD45、CD64及びCD117、を補充されることができ(表1B)、これは骨髄の試験、特に単球性前駆細胞及び成熟細胞(単芽球CD34+/CD117+、単芽球CD34-/CD117+、前単球CD14-、前単球CD14+、cMo、iMo及びncMo)、myDC CD141+、pDC、成熟好塩基球及び肥満細胞、の同定及び基本的サブセット化を可能にする(図3B):
単芽球CD34+/CD117+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33+、CD34+、CD45+、CD64+、CD117+、CD141-、CD300e-、CD303-
単芽球CD34-/CD117+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117+、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球CD14-/low:HLA-DR++、CD14-/low、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球CD14+:HLA-DR++、CD14+、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
cMo:HLA-DR++、CD14+、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e+、CD303-
iMo:HLA-DR++、CD14+、CD16+、CD33+,CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e+、CD303-
ncMo:HLA-DR++、CD14+、CD16+、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e+、CD303-
myDC CD141+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64-、CD117-/low、CD141++、CD300e-、CD303-
pDC:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33-/low、CD34-、CD45+、CD64-、CD117-、CD141+、CD300e-、CD303+
成熟好塩基球:HLA-DR-、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD45low、CD64-、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
肥満細胞:HLA-DR-、CD14-、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64-/+、CD117++、CD141-、CD300e-、CD303-
CD36を、10又は11個の標識付けと組み合わされた11種のマーカーの組み合わせに加えることは、pDC前駆細胞(HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-/+、CD36+、CD45+、CD64-、CD117-/+、CD141-/+、CD300e-、CD303-/+)、myDC前駆細胞(HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD34-/+、CD36low、CD45+、CD64-/+、CD117-/+、CD141+、CD300e-、CD303-)、有核赤血球前駆細胞(nucleated erythroid precursors)(HLA-DR-/low、CD11b-、CD13-、CD14-、CD16-、CD33-、CD34-/+、CD35-、CD36+、CD45-/low、CD64-、CD117-/+、CD141-、CD163-、CD300e-、CD303-)の評価、並びに前単球の、前単球CD14-/lowCD36-及び前単球CD14-/lowCD36+への更なるサブセット化(表1B;図3B)を更に可能にする。
上記の組み合わせ(11又は12個の標識付けと組み合わされた12種のマーカー)を、CD11b、CD13及びCD35を含めることによって拡大することは(表1B、図3B)、前単球の更に詳細なサブセット化、並びに間葉幹細胞、好酸球、及び好中球-顆粒球系列の異なる成熟段階の同定を可能にする:
前単球(Promonocytes)CD14-/CD11b-/CD36-/CD35-:HLA-DR++、CD11b-、CD13+、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD35-、CD36-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球(Promonocytes)CD14-/CD11b+/CD36+/CD35-:HLA-DR++、CD11b+、CD13+、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD35-、CD36+、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球(Promonocytes)CD14low/CD11b+/CD36+/CD35+:HLA-DR++、CD11b+、CD13+、CD14low、CD16-、CD33+、CD34-、CD35+、CD36+、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
間葉幹細胞(Mesenchymal stem cells):HLA-DR-/+、CD11b-、CD13+++、CD14-、CD16-、CD33-、CD34-、CD35-、CD36-、CD45-、CD64-、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
好酸球(Eosinophils):HLA-DR-、CD11b+、CD13-/+、CD14-、CD16-、CD33low、CD34-、CD35-/+、CD36-、CD45++、CD64-、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
単芽球(Myeloblast):HLA-DR+、CD11b-、CD13++、CD14-、CD16-、CD33+、CD34+、CD35-、CD36-、CD45+、CD64-、CD117+、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球(Promyelocyte):HLA-DR-、CD11b-、CD13++、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD35-、CD36-、CD45+、CD64+、CD117+/low、CD141-、CD300e-、CD303-
単球(Myelocyte):HLA-DR-、CD11b-、CD13-、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD35-、CD36-、CD45+、CD64++、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
後骨髄球(Metamyelocyte):HLA-DR-、CD11b+、CD13-、CD14-、CD16low、CD33+、CD34-、CD35-/low、CD36-、CD45+、CD64++、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
桿状核/分葉核好中球(Band/segmented neutrophils):HLA-DR-、CD11b+、CD13++、CD14-、CD16++、CD33+、CD34-、CD35+、CD36-、CD45+、CD64low、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球(Promonocytes)CD14-/CD11b-/CD36-/CD35-:HLA-DR++、CD11b-、CD13+、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD35-、CD36-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球(Promonocytes)CD14-/CD11b+/CD36+/CD35-:HLA-DR++、CD11b+、CD13+、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD35-、CD36+、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球(Promonocytes)CD14low/CD11b+/CD36+/CD35+:HLA-DR++、CD11b+、CD13+、CD14low、CD16-、CD33+、CD34-、CD35+、CD36+、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
間葉幹細胞(Mesenchymal stem cells):HLA-DR-/+、CD11b-、CD13+++、CD14-、CD16-、CD33-、CD34-、CD35-、CD36-、CD45-、CD64-、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
好酸球(Eosinophils):HLA-DR-、CD11b+、CD13-/+、CD14-、CD16-、CD33low、CD34-、CD35-/+、CD36-、CD45++、CD64-、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
単芽球(Myeloblast):HLA-DR+、CD11b-、CD13++、CD14-、CD16-、CD33+、CD34+、CD35-、CD36-、CD45+、CD64-、CD117+、CD141-、CD300e-、CD303-
前単球(Promyelocyte):HLA-DR-、CD11b-、CD13++、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD35-、CD36-、CD45+、CD64+、CD117+/low、CD141-、CD300e-、CD303-
単球(Myelocyte):HLA-DR-、CD11b-、CD13-、CD14-、CD16-、CD33+、CD34-、CD35-、CD36-、CD45+、CD64++、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
後骨髄球(Metamyelocyte):HLA-DR-、CD11b+、CD13-、CD14-、CD16low、CD33+、CD34-、CD35-/low、CD36-、CD45+、CD64++、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
桿状核/分葉核好中球(Band/segmented neutrophils):HLA-DR-、CD11b+、CD13++、CD14-、CD16++、CD33+、CD34-、CD35+、CD36-、CD45+、CD64low、CD117-、CD141-、CD300e-、CD303-
別の実施態様において、前単球CD14+の、前単球CD14+CD163-及び前単球CD14+CD163-への更なる分割を可能にする為に、CD163のみが11種のマーカーの組み合わせに加えられる。
CD34、CD45、CD64及びCD117(10又は11個の標識付けと組み合わされた11種のマーカー)を補充されたバックボーンの組み合わせ(6又は7つの標識付けと組み合わされた7種のマーカー)は、FcεRI及びCD163を含めることによって更に延長されることができる。この組み合わせは、上記で記載されている前単球CD14+のサブセット化、並びに成熟myDC CD1c+及び好塩基球前駆細胞の同定及びサブセット化を可能にする(図3B):
前単球CD14+/CD163-:HLA-DR++、CD14+、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD163-、CD300e-、CD303-、FcεRI-
前単球CD14+/CD163+:HLA-DR++、CD14+、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD163+、CD300e-、CD303-、FcεRI-
myDC CD1c+CD14low:HLA-DR++、CD14low、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64low/+、CD117-、CD141-、CD163+、CD300e-、CD303-、FcεRI+
myDC CD1c+CD14-CD163+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64low/+、CD117-、CD141-、CD163+、CD300e-、CD303-、FcεRI+
myDC CD1c+CD14-CD163-:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64low/+、CD117-、CD141-、CD163-、CD300e-、CD303-、FcεRI+
好塩基球前駆細胞:HLA-DR-/low、CD14-、CD16-、CD33+、CD34+、CD45low、CD64-、CD117+、CD141-、CD163-、CD300e-、CD303-、FcεRIlow
前単球CD14+/CD163-:HLA-DR++、CD14+、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD163-、CD300e-、CD303-、FcεRI-
前単球CD14+/CD163+:HLA-DR++、CD14+、CD16-、CD33+、CD34-、CD45+、CD64+、CD117-、CD141-、CD163+、CD300e-、CD303-、FcεRI-
myDC CD1c+CD14low:HLA-DR++、CD14low、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64low/+、CD117-、CD141-、CD163+、CD300e-、CD303-、FcεRI+
myDC CD1c+CD14-CD163+:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64low/+、CD117-、CD141-、CD163+、CD300e-、CD303-、FcεRI+
myDC CD1c+CD14-CD163-:HLA-DR++、CD14-、CD16-、CD33++、CD34-、CD45+、CD64low/+、CD117-、CD141-、CD163-、CD300e-、CD303-、FcεRI+
好塩基球前駆細胞:HLA-DR-/low、CD14-、CD16-、CD33+、CD34+、CD45low、CD64-、CD117+、CD141-、CD163-、CD300e-、CD303-、FcεRIlow
全体として、骨髄系前駆細胞及び成熟パターンを評価することを狙いとする試験に関して、7種のマーカー(CD14、CD16、CD33、CD141、CD300e、CD303、HLA-DR)で構成されるDC-単球バックボーンは、10種の更なるマーカー(CD11b、CD13、CD34、CD35、CD36、CD45、CD64、CD117、CD163及びFcεRI)を補充されることができ、組み合わせにおいてCD14及びCD34は、該マーカーCD300e及びCD303と同様に、同じ標識によって評価されることができる(表1B)。15~17個の別個の検出可能な標識にコンジュゲーションされたこの17個の抗体のパネルは、骨髄に存在する28個の細胞集団の同定を可能にし(図3B)、ここで、該細胞集団は、成熟及び未成熟pDC、myDC前駆細胞及び成熟myDC CD141+及びmyDC CD1c+(myDC CD1c+CD14low、myDC CD1c+CD14-CD163+及びmyDC CD1c+CD14-CD163-サブセットを含む)、成熟単球(cMo、iMo及びncMo)、並びにその前駆細胞(単芽球CD34+/CD117+及びCD34-/CD117+、前単球CD14-/CD11b-/CD36-/CD35-、CD14-/CD11b+/CD36+/CD35-、CD14low/CD11b+/CD36+/CD35+、-CD14+/CD163-及びCD14+/CD163+)を含む。更に、成熟及び未成熟好中球(骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、及び桿状核/分葉核好中球)、成熟好塩基球及びその前駆細胞、好酸球、肥満細胞、有核赤血球前駆細胞及び間葉幹細胞の5つの集団がまた、上記で言及された組み合わせを使用して同定されることができる。
A.3 単球性及び樹状細胞急性白血病の診断、(細)分類及びモニタリング
血液及びBM試験の為の上記DC-単球チューブの組成物は、成熟(例えば、末梢血)及び未成熟骨髄系細胞集団(例えば、骨髄)の同定、並びにこれらの細胞、特には単球及び樹状細胞系列、の成熟経路の評価を可能にする。
血液及びBM試験の為の上記DC-単球チューブの組成物は、成熟(例えば、末梢血)及び未成熟骨髄系細胞集団(例えば、骨髄)の同定、並びにこれらの細胞、特には単球及び樹状細胞系列、の成熟経路の評価を可能にする。
これらの独自の抗体の組み合わせによって提供される情報は、例えば、感染症、ワクチン接種又は免疫療法に対する応答、の免疫モニタリングの為に使用されることができるのみならず、それらが、対応する正常な造血経路並びにこれらの正常な経路からの白血病による逸脱を精査することから、単球及びDC起源の急性白血病の診断及び(細)分類の為に、特に好適でもある。その上、これらのチューブは又、処置の有効性を評価する為に、処置の間及び処置後に小さい単球性及びDC白血病性細胞集団のモニタリングも可能にする。
B.1 CD4 T細胞チューブ
以前の試験は、これらの細胞の一部のサブセットを含む、濾胞性ヘルパーT(Tfh)細胞を認識する為のマーカーの組み合わせを提唱している。これと平行して、他の研究者等は、細胞内染色を行わずにTregを同定する方法、並びに細胞内サイトカイン発現及び表面膜マーカーの両方に基づいて、Th1、Th2、Th17、Th22、Th1/17、ヘルパーT細胞サブセットを定義する可能性を教示している(Streitz et al.,2013;Mahnke et al.,2013a;Wingender et al.,2015;Finak et al.,2016)。しかしながら、特には特異的CD4+T細胞サブセット、例えばTh1及びTh2細胞、の最適な同定にとって極めて重要である膜マーカーに関して得られた抗原発現プロファイルに影響を及ぼしうる細胞内染色手順を行うことなく、単一の抗体パネルチューブにおいて、その成熟段階に関連して、Treg、Tfh及び他のCD4+ヘルパーT細胞内の上記ヘルパーT細胞サブセットを同時に同定することを当業者はできていない。それ故に、本発明に従って、CD4+T細胞サブセット化の為の細胞内マーカーを染色する必要はない。
以前の試験は、これらの細胞の一部のサブセットを含む、濾胞性ヘルパーT(Tfh)細胞を認識する為のマーカーの組み合わせを提唱している。これと平行して、他の研究者等は、細胞内染色を行わずにTregを同定する方法、並びに細胞内サイトカイン発現及び表面膜マーカーの両方に基づいて、Th1、Th2、Th17、Th22、Th1/17、ヘルパーT細胞サブセットを定義する可能性を教示している(Streitz et al.,2013;Mahnke et al.,2013a;Wingender et al.,2015;Finak et al.,2016)。しかしながら、特には特異的CD4+T細胞サブセット、例えばTh1及びTh2細胞、の最適な同定にとって極めて重要である膜マーカーに関して得られた抗原発現プロファイルに影響を及ぼしうる細胞内染色手順を行うことなく、単一の抗体パネルチューブにおいて、その成熟段階に関連して、Treg、Tfh及び他のCD4+ヘルパーT細胞内の上記ヘルパーT細胞サブセットを同時に同定することを当業者はできていない。それ故に、本発明に従って、CD4+T細胞サブセット化の為の細胞内マーカーを染色する必要はない。
血中Tfh細胞は、CD185(CXCR5)及びCD4の同時発現によって定義されている。加えて、これらの細胞の更なる特徴付けは、特には血液とは異なる組織中のTfh細胞の場合、CD10、CD84、CD272、CD278及び/又はCD279の組み合わせに基づいている(Tangye et al.,2013)。
文献における血中Tregの初期の定義は、CD25high、CD4及び細胞内FoxP3の同時発現に基づいていた。その後の研究は、CD127の低レベルの非存在又は存在下でのCD25highの同時発現が、CD4陽性の血中Tregに関する代用表現型であると定義した(Miyara et al.,2009)。CD15s及びCD39に基づくTregの更なるサブセット化は、以前に提唱されている。
これと平行して、代用細胞表面表現型がまた、下記の同定の為に提唱されている:
1.インターフェロンガンマ産生Th1細胞;
2.IL4及びIL5産生Th2細胞;
3.IL17産生Th17細胞;
4.IL22産生Th22細胞;
5.インターフェロンガンマプラスIL17産生Th1/Th17細胞
1.インターフェロンガンマ産生Th1細胞;
2.IL4及びIL5産生Th2細胞;
3.IL17産生Th17細胞;
4.IL22産生Th22細胞;
5.インターフェロンガンマプラスIL17産生Th1/Th17細胞
これらの細胞の代用表現型は、4種のマーカー:CD183(CXCR3)、CD194(CCR4)、CD196(CCR6)及びCCR10の組み合わせに基づいている:
1.Th1に関してCD183+CD194-CD196-CCR10-;
2.Th2に関してCD183-CD194+CD196-CCR10-;
3.Th17に関してCD183-CD194+CD196+CCR10-;
4.Th1/Th17に関してCD183+CD194-CD196+CCR10-;
5.Th22に関してCD183-CD194+CD196+CCR10+
1.Th1に関してCD183+CD194-CD196-CCR10-;
2.Th2に関してCD183-CD194+CD196-CCR10-;
3.Th17に関してCD183-CD194+CD196+CCR10-;
4.Th1/Th17に関してCD183+CD194-CD196+CCR10-;
5.Th22に関してCD183-CD194+CD196+CCR10+
Wingender et al.(2015)のみが、上記細胞集団において従来型のCD4陽性Th1、Th2、Th17、Th22、Th1/Th17 T細胞と、CD4陽性Th1様、Th2様、Th17様、Th22様、Th1/Th17様Treg及びTfh T細胞とを識別する方法を教示している。しかしながら、彼は、これらの機能的CD4 T細胞集団を成熟段階、特にはトランジショナルメモリー細胞及びエフェクターメモリー細胞、へと正確に分類することができなかった。
本発明者等は、マーカーCD27及びCD62LをCD45RA又はCD45ROと組み合わせて含めることによって、この問題の克服に成功し、これは以前に提唱されたCD45RA及びCD197のマーカーの組み合わせより適切であるように思われた(Mahnke et al.,2013a;Wingender et al.,2015)。
従って、本発明は、一つの実施態様において、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含む、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーの組み合わせ:CD27、CD45RA又はCD45RO、CD62L、CD127、CD3、CD25、CCR10、CD183(CXCR3)、CD196(CCR6)、CD194(CCR4)、CD185(CXCR5)及びCD4に対して向けられたものである、上記試薬組成物を提供する。この試薬組成物は、Treg、Tfh及び他のCD4+ヘルパーT細胞の以前に定義された全てのサブセットの同定を可能にする。加えて、これらの集団の新規サブセットは、提唱される該抗体の組み合わせによって同定されている。
** 該提唱されるチューブは、活性化マーカーCD278(ICOS)、CD279(PD1)及び/又はHLA-DRによって更に拡大されることができ、該マーカーは活性化されたCD4+T細胞区画のより良好な定義に寄与することができる。
*** 該提唱されるチューブは、TcR-Vβ及び/又はTcR-Vαドメインに対して向けられた抗体(表6)プラス抗TcRγδ抗体;又はTcR-Vδ及び/又はTcR-Vγドメインに対して向けられた抗体プラス抗TcRαβ抗体によって更に拡大されることができる。
**** 該提唱されるチューブ1B、1C、2B及び2C、は、細胞傷害性関連マーカー(例えば、CD28、CD57及び/又はグランザイムB)と共に、CD8+T細胞以外(すなわち、CD16、CD56及び/又はTCRγδ)の細胞傷害性細胞集団に対して向けられた抗体によって更に拡大されることができる。
#6 ***** 該提唱されるチューブは、TcRαβ+T細胞区画、特にはTcR-Vβ及び/又はTcR-Vαドメインに対して向けられた抗体によって認識されないTcRαβ+T細胞における、多様性を検出する為に、相互に排他的なTcR-Cβ1及びTcR-Cβ2エピトープ、例えばJOVI-1抗体(BD Biosciences)によって認識されるエピトープ、に対する該抗体によって更に拡大されることができる(表6)。
本明細書において、CD8及び/又はCD45に対するコンジュゲーションされた抗体が加えられうる、12種の細胞表面マーカー(CD3、CD4、CD25、CD27、CD62L、CD127、CD183、CD185、CD194、CD196、CCR10、及びCD45RA又はCD45RO)に対するコンジュゲーションされた抗体の独自の組み合わせが提供される(表2)。この試薬は、通常の血液200μL中に、前例がないほど多数のCD4陽性T細胞の少なくとも89個の十分に定義されたサブセットを同定し(表3)、該サブセットは全て、従来型のTh1、Th2、Th17、Th22、Th1/Th17 T細胞及びCD4陽性Th1-様、Th2-様、Th17-様、Th22-様、Th1/Th17-様 Treg及びTfh T細胞の以前に定義された機能的サブセットを含み、該サブセットは、ナイーブ(naive)、セントラルメモリー(central memory)、トランジショナルメモリー(transitional memory)、エフェクターメモリー(effector memory)及びターミナルエフェクター(terminal effector)CD4 T細胞、の5つの成熟段階に再分類されている。
図4は、CD4+T細胞サブセットの認識戦略を例証する。89個のCD4陽性T細胞サブセット並びにその機能的相関物の各々を定義する為の特定の免疫表現型決定基準、及び血中CD4陽性T細胞区画内のその相対頻度が、表3に要約されている。加えて、図5における「集団ツリー」は、これらのCD4+T細胞サブセットがどのように連鎖されているかを示している。注目すべきは、上記の12種のマーカーの組み合わせは、血液100~200μL中に少なくとも89個のサブセットを再現よく同定する。分析される血液量が更に増加されると、より多数の161個のCD4陽性T細胞サブセットが同定される(頻度0.1個/μL未満)(表4)。
上記の12種のマーカーの組み合わせ(CD45及び/又はCD8の存在下又は非存在下)は、胸腺移出細胞(RTE)をより正確に検出する為にCD31(Kohler et al.,2009)、及び/又はCD95high幹細胞メモリーCD4+T細胞をより正確に検出する為にCD95(Gattinoni et al.,2011)、によって更に拡大されることができる。従って、該試薬組成物は、CD31及び/又はCD95に対するコンジュゲーションされた抗体を更に含みうる。
更に、上記のマーカーの組み合わせは、CD69、CD278(ICOS)、CD279(PD1)及び/又はHLA-DR活性化マーカー(Mahnke et al.,2013b;McAdam et al.,2001)によって更に拡大されることができ、該マーカーは感染性疾患、ワクチン接種試験及び活性化されたCD4+T細胞区画を有する他の状況における活性化されたCD4+T細胞区画の、より良好な定義に寄与することができる。
細胞傷害性集団及びそれらの異なる成熟関連細胞サブセットを同時に試験する場合、更なる細胞傷害性サブセットを同定することを狙いとする抗体のパネルは好ましくは、細胞傷害性関連マーカー(すなわち、CD28、CD57及び/又はグランザイムBに対して向けられた抗体)と共に、TCRγδを同定する抗体(抗TCRγδ)及びNK細胞を同定する抗体(すなわち、CD16、CD56及び/又はCD335抗体)で構成されている。
CD4及び細胞傷害性T細胞に関する上記の抗体パネルは、抗原特異的染色を可能にする試薬を補充されることができる。例えば、CD4 T細胞試薬組成物は、1以上の抗原特異的ペプチド又はペプチドプールを含み、該ペプチドは、微生物、アレルゲン、自己抗原、ワクチン、又は免疫療法成分に由来しうる。該抗原特異的T細胞を染色する為の、そのようなペプチド又はペプチドプールは好ましくは、MHC分子を介して、例えば四量体システム若しくは当技術分野で既知である他のシステムを介して、提示されているか、又はそれらは、1以上のレポーター化合物を有する標識に結合されうる。本発明に従う試薬組成物は、抗原特異的T細胞の検出及び計数の為に、MHC分子において1以上の抗原特異的ペプチドを含みうるが、該MHC分子は、検出可能な標識に直接又は間接的にコンジュゲーションされうる多量体構築物に含まれる。一つの実施態様において、該組成物は、Klickmer又はDextramerシステム(Immudex,Copenhagen,Denmark)を介して該適切なMHC分子において提示されている、少なくとも1つのペプチドを含む。
一つの実施態様において、表2に示されているマーカーセットに対して向けられた抗体を含む試薬組成物のいずれも、TcRαβ+T細胞区画、特にはTcR-Vβ及び/又はTcR-Vαドメインに対する該抗体によって認識されないTcRαβ+T細胞における多様性を検出する為に、相互に排他的なTcR-Cβ1及びTcR-Cβ2エピトープ、例えばJOVI-1抗体(BD Biosciences)、によって認識されるエピトープ、に対して向けられた抗体によって更に拡大されることができる(表6を参照)。従って、同様に本明細書において、TcRαβ+T細胞における、多様性対クローン性を検出する為の試薬組成物であって、CD8及び/又はCD45に対するコンジュゲーションされた抗体が加えられうる、CD3、CD4、CD25、CD27、CD62L、CD127、CD183、CD185、CD194、CD196、CCR10、及びCD45RA又はCD45ROに対するコンジュゲーションされた抗体を含み、相互に排他的なTcR-Cβ1及び/又はTcR-Cβ2エピトープに対するコンジュゲーションされた抗体を更に含む、上記試薬組成物が提供される。
特定の実施態様において、好ましくは、CD8及びCD45を補充された該CD4 T細胞チューブ(CD3、CD4、CD25、CD27、CD62L、CD127、CD183、CD185、CD194、CD196、CCR10、及びCD45RA又はCD45RO;表2、チューブ1C又は2Cを参照)の結果は、典型的に、バックボーンマーカーセット(表2における太字)として、該7種のマーカー、すなわちCD3、CD4、CD8、CD27、CD45、CD62L、及びCD45RA又はCD45RO、を使用して、EuroFlowガイドライン(Kalina et al.2012)(www.EuroFlow.org)に従って、細胞傷害性T及びNK細胞に関する、対応する「姉妹チューブ」の結果と統合及び計算されることができる。この細胞傷害性T及びNK細胞チューブは、CD8、CD16、CD28、CD56、CD57、CD335、TcRγδ及び/又はグランザイムBを更に含む(表2のチューブ1D又は2Dを参照)。
従って、本発明は又、(i)本明細書において上記で言及されているCD4 T細胞試薬組成物のいずれか;及び(ii)任意的にマーカーCD335及び/又はグランザイムBに対するコンジュゲーションされた抗体を補充された、CD3、CD4、CD8、CD27、CD45、CD62L、CD45RA又はCD45RO、CD16、CD28、CD56、CD57、TCRγδに対するコンジュゲーションされた抗体を含む試薬組成物、を含む試薬組成物のセットも提供する。例示的な試薬セットは、表2に示されているように、チューブ1C及び1D、又はチューブ2C及び2Dを含む。
** 該提唱されるチューブは、TcRαβ+T細胞悪性疾患のクローン性を評価する為に、相互に排他的なTcR-Cβ1及びTcR-Cβ2エピトープ、例えばJOVI-1抗体(BD Biosciences)によって認識されるエピトープ、に対して向けられた抗体によって更に拡大されることができる。
B.2 成熟T細胞悪性疾患の診断及び分類の為の基礎としてのCD4 T細胞チューブ
別の実施態様において、上記の12種のマーカーの組み合わせ(CD45RO及びCD45RAの両方の存在下、並びにCD45及び/又はCD8の存在下若しくは非存在下)は、CD4陽性成熟T細胞悪性疾患の診断及び分類の為に、任意的にHLA-DR及び/又はcyTCL1と組み合わされた、CD2、CD7、CD26、CD28、CD279の古典的なEuroFlow抗体の組み合わせを補充されることができる(Van Dongen et al. 2012)(表5)。それ故に、本発明は又、CD27、CD45RA又はCD45RO、CD62L、CD127、CD3、CD25、CCR10、CD183、CD196、CD194、CD185、CD4、CD2、CD279、CD7、CD26及びCD28、に対するコンジュゲーションされた抗体を含み、任意的にCD8、CD45、HLA-DR、及び/又はcyTCL1に対するコンジュゲーションされた抗体を更に含む、試薬組成物も提供する。
別の実施態様において、上記の12種のマーカーの組み合わせ(CD45RO及びCD45RAの両方の存在下、並びにCD45及び/又はCD8の存在下若しくは非存在下)は、CD4陽性成熟T細胞悪性疾患の診断及び分類の為に、任意的にHLA-DR及び/又はcyTCL1と組み合わされた、CD2、CD7、CD26、CD28、CD279の古典的なEuroFlow抗体の組み合わせを補充されることができる(Van Dongen et al. 2012)(表5)。それ故に、本発明は又、CD27、CD45RA又はCD45RO、CD62L、CD127、CD3、CD25、CCR10、CD183、CD196、CD194、CD185、CD4、CD2、CD279、CD7、CD26及びCD28、に対するコンジュゲーションされた抗体を含み、任意的にCD8、CD45、HLA-DR、及び/又はcyTCL1に対するコンジュゲーションされた抗体を更に含む、試薬組成物も提供する。
この抗体パネルは、従来型のTh1、Th2、Th17、Th22、Th1/Th17 T細胞及びCD4陽性Th1-様、Th2-様、Th17-様、Th22-様、Th1/Th17-様 Treg及びTfh T細胞の、そのT細胞機能的サブセットに従う、CD4陽性T細胞悪性疾患の異なるタイプの細分類を、ナイーブ、セントラルメモリー、トランジショナルメモリー、エフェクターメモリー及びターミナルエフェクターCD4 T細胞の5つの成熟段階への更なる細分類と共に可能にする。
このCD4+T細胞悪性疾患チューブの結果は、典型的に、バックボーンマーカーセット(表5における太字)として、細胞傷害性T及びNK細胞マーカーCD5、CD11c、CD16、CD56、CD57、TcRγδ、並びに任意的にグランザイムB及び/又はパーフォリン、(表5)を補充された、マーカーCD27、CD45RA、CD45RO、CD8、CD62L、CD127、CD3、CD25、CD7、HLA-DR、CD45及び/又はCD4、を使用して、EuroFlowガイドライン(Kalina et al.,2012)に従って、細胞傷害性T及びNK細胞悪性疾患の診断及び分類に関する、対応する「姉妹チューブ」の結果と統合及び計算されることができる。従って、(i)CD27、CD45RA又はCD45RO、CD62L、CD127、CD3、CD25、CCR10、CD183、CD196、CD194、CD185、CD4、CD2、CD279、CD7、CD26及びCD28に対するコンジュゲーションされた抗体を含み、任意的にCD8、CD45、HLA-DR及び/又はcyTCL1に対するコンジュゲーションされた抗体を更に含む、試薬組成物;並びに(ii)マーカーCD27、CD45RA、CD45RO、CD8、CD62L、CD127、CD3、CD25、CD7、HLA-DR、CD45、CD4、CD11c、CD16、CD30、CD56、CD57、CD94、CD5、TcRγδに対するコンジュゲーションされた抗体を含み、任意的にグランザイムB及び/又はパーフォリンに対するコンジュゲーションされた抗体を補充された、試薬組成物(表5を参照)、を含む、試薬組成物のセットも提供される。好ましくは、試薬のセットにおいて、両方の試薬組成物に存在する該抗体は、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされている。
B.3 TcRαβ細胞集団及びTcRγδ細胞集団におけるTcRレパートリー試験
TcRαβ細胞におけるTcR分子の多様性レパートリーを試験する為に、上記のマーカーの組み合わせ(節B.1を参照)は、TcR-Vβドメインの様々なファミリー及び/又はTcR-Vαドメインの幾つかのファミリーに対するコンジュゲーションされた抗体、プラス非TcRαβ細胞を認識する為の抗TcRγδ抗体、によって更に拡大されることができる。
TcRαβ細胞におけるTcR分子の多様性レパートリーを試験する為に、上記のマーカーの組み合わせ(節B.1を参照)は、TcR-Vβドメインの様々なファミリー及び/又はTcR-Vαドメインの幾つかのファミリーに対するコンジュゲーションされた抗体、プラス非TcRαβ細胞を認識する為の抗TcRγδ抗体、によって更に拡大されることができる。
同様に、TcRγδ細胞におけるTcR分子の多様性を試験する為に、上記のマーカーの組み合わせは、TcR-Vδ及び/又はTcR-Vγドメインに対するコンジュゲーションされた抗体、プラス非TcRγδ細胞を認識する抗TcRαβ抗体によって更に拡大されることができる。TcR-Vβドメインの様々なファミリー及び/又はTcR-Vαドメインの幾つかのファミリー、該TcRγδ、該TcR-Vδ及び/又はTcR-Vγドメインに対するコンジュゲーションされた抗体、プラス抗TcRαβ抗体を含む抗体カクテルを使用することがまた、想像される。
TcR-Vβ及びTcRαドメインに対して最も必要とされる抗体は、市販されており、例えばVβファミリードメインに対する24個の抗体を有するIOTest Beta Mark Kit(Beckman Coulter)、である(表6をまた参照されたい)。ごく少数の抗Vα抗体が、利用可能であり、例えば抗TcR-Vα2(B20.1)、TcR-Vα3.2(RR3-16)、TcR-Vα7.2(3C10)、TcR-Vα11(RR8-1)、TcR-Vα12.1(6D6.6)及びTcR-Vα24-Jα18(6b11)(ThermoFischer Scientific;及びAbcam)である(表6)。
TcR-Vδ及び/又はTcR-Vγドメインの発現を調べる為に、コンジュゲーションされた抗体のパネルは、Vδ1(R912及びdTCS1)、Vδ2(IMMU389及びBB3)、Vδ3(P11.5B)、及び非Vδ1(IMMU515)に対する特異性、並びにVγ2/3/4(23D12)、Vγ4(4A11)、Vγ3/5(56.3;この抗体は、Vγ5ドメイン及び一部のVγ3ドメインを認識する)、Vγ8(R4.5)、及びVγ9(IMMU360及びTi-gA)に対する特異性で構成されることができる。Mab 4A11は、T Cell Diagnostics(Woburn,MA)から入手可能であり、dTCS1はT Cell Sciences(Cambridge,MA)から入手可能であり;Mab 23D12、R4.5、IMMU360、R912、IMMU389、P11.5B、及びIMMU515は、Beckman Coulter/Immunotechから得られた。Ti-gA、BB3、及び56.3 Mabはそれぞれ、Dr.T Hercend(Villejuif,France)、Dr.L Moretta(Genova,Italy)、及びDr.D Kabelitz(Kiel,Germany)からの寄贈であった。
上記の実施態様において、該異なるTcR-Vβ、TcR-Vα、TcR-Vγ、及びTcR-Vδファミリードメインに対する各抗体は、濃縮された数の蛍光又は金属同位体検出器において、全てのTcr-V特異性の測定を可能にする為に、単一の検出可能な標識(すなわち、蛍光色素又は金属同位体)又は2以上(最大9)の別個の標識(すなわち、互いに個別の放出を有する、蛍光色素又は金属同位体)にコンジュゲーションされえ、例えば30個の抗体は、表6に例示されているように、全体で、TcR-Vβ抗体に関して別個の放出を有する少なくとも5個の検出可能な標識及びTcR-Vα抗体に関する3個の標識と組み合わされた。
成熟T細胞悪性疾患の診断及び分類の為に、上記の抗TcR-V抗体を上記で言及された試薬組成物に加えることは、関係するT細胞悪性疾患のクローン性の評価を可能にする(Langerak et al.,1999;Langerak et al.,2001;Lima et al.2001;Almeida et al.2003、Sandberg et al.2006)。そのようなクローン性マーカーは、処置の有効性を評価する為に、処置の間及び処置後にT細胞悪性疾患のモニタリングを更に支持することができる。
B.4 T細胞集団におけるクローン性に関する代用マーカーとしての、TcR-Cβ1対TcR-Cβ2発現パターン
何十年もの間、個々のB細胞による、Igκ及びIgλタンパク質の排他的発現は、B細胞集団におけるクローン性を検出する為の代用マーカーとして使用されており、それによってクローン性のB細胞増大を同定し、その後、骨髄腫を含む成熟B細胞悪性疾患の診断を支持している。B細胞が、Igκタンパク質(2番染色体上の機能的に再構成されたIGK座に由来する)又はIgλタンパク質(22番染色体上の機能的に再構成されたIGL遺伝子に由来する)のいずれかと会合することができる抗体を産生している場合、T細胞は、2つの異なる遺伝子のそのような相互に排他的な使用を有しない。
何十年もの間、個々のB細胞による、Igκ及びIgλタンパク質の排他的発現は、B細胞集団におけるクローン性を検出する為の代用マーカーとして使用されており、それによってクローン性のB細胞増大を同定し、その後、骨髄腫を含む成熟B細胞悪性疾患の診断を支持している。B細胞が、Igκタンパク質(2番染色体上の機能的に再構成されたIGK座に由来する)又はIgλタンパク質(22番染色体上の機能的に再構成されたIGL遺伝子に由来する)のいずれかと会合することができる抗体を産生している場合、T細胞は、2つの異なる遺伝子のそのような相互に排他的な使用を有しない。
しかしながら、TcR-Cβドメイン(TcRβ鎖の定常ドメイン)は、発現されたTCRB再構成がJβ1遺伝子セグメント又はJβ2遺伝子セグメントを伴うかに応じて、TCRBC1エクソン又はTCRBC2エクソンに由来することができる。TcR-Cβ1対TcR-Cβ2タンパク質ドメインのこの代替的な(相互に排他的な)使用は、実際に、正常及び悪性T細胞集団の両方において同定されているが、この代替的なTcR-Cβ1対TcR-Cβ2発現が、T細胞集団レベルで全く安定であり、40%~60%に変化するにもかかわらず、クローン性試験の為の潜在的供給源としては決して見なされてこなかった。
興味深いことに、TCRB座における2つのD-J-C遺伝子セットは進化的複製であり、それ故に高度に相同性であるが、少数の明確な差が、該TCRBC1エクソン対該TCRBC2エクソンにおいて同定されている。アミノ酸位置4及び5では、TcR-Cβ1ドメインのN及びKアミノ酸が、TcR-Cβ2ドメインにおけるK及びNアミノ酸に置換されており、該TcR-Cβ1ドメインにおける37位のFアミノ酸が、該TcR-Cβ2ドメインにおけるYアミノ酸に置換されている。更なるアミノ酸の差は、膜近位配列に存在し、ここでは該TcR-Cβ2ドメインにおいて、Vアミノ酸がEアミノ酸に置換され、Fアミノ酸がSアミノ酸に置換されている。最初の2つのアミノ酸の差(4~5位及び37位)は、フォールディングされたTcRβ鎖にしっかりと連結され、それによってそれらは、抗体による示差的認識にとっておそらく好適な独自のエピトープを形成する。これまで、そのような異なるTcR-Cβ1及びTcR-Cβ2エピトープの両方に対する特異的抗体は設計されていない。しかしながら、組み合わせられた、再構成された、ヒトTCR-Vβ3-Cβ1鎖に対するJOVI-1抗体(BD Biosciences)の反応性は、TcR-Cβ1ドメインを発現するT細胞に、主に限定されているように思われる。それ故に、本発明は、JOVI-1陽性とJOVI-1陰性T細胞との比が、代替的なTcR-Cβ1対TcR-Cβ2ドメイン発現の為の代用マーカーとして有利に使用され、それによってTcRαβ+T細胞におけるクローン性の検出の為の代用マーカーとして有利に使用される、という洞察を提供する。その結果、そのような代替的なTcR-Cβ1対TcR-Cβ2ドメイン発現は、クローン性のTcRαβ+T細胞増大を同定する為に、及びその後、成熟TcRαβ+T細胞悪性疾患の診断を支持する為に、使用されることができる。この代替的なTcR-Cβ1対TcR-Cβ2ドメイン発現は、TcRαβ+T細胞区画、特にはTcR-Vβ及び/又はTcR-Vαドメインに対して向けられた抗体によって認識されないTcRαβ+T細胞における、多様性(例えば、「正常な」TcR-Cβ1/TcR-Cβ2比)を定義する為に適用されることができる。
C.1 形質芽球/形質細胞及びB細胞チューブ
循環している形質芽球は現在、マーカーCD38単独、又はCD19及び/若しくはCD27との組み合わせに基づいて定義されている(Medina et al,2002;Odendahl et al,2005;Clutterbuck et al,Immunology 2006;Mei et al,2009;Caraux et al,2010;Perez-Andres et al,2010;Quian et al,2010;Maecker et al,2012;Roederer et al.,2015;Blanco,2017;Blanco et al,2018;Blanco et al,2019;Liechti et al,2019)。
循環している形質芽球は現在、マーカーCD38単独、又はCD19及び/若しくはCD27との組み合わせに基づいて定義されている(Medina et al,2002;Odendahl et al,2005;Clutterbuck et al,Immunology 2006;Mei et al,2009;Caraux et al,2010;Perez-Andres et al,2010;Quian et al,2010;Maecker et al,2012;Roederer et al.,2015;Blanco,2017;Blanco et al,2018;Blanco et al,2019;Liechti et al,2019)。
しかしながら、これらのマーカーの組み合わせは共に、子供において全ての血中形質芽球の同定を可能にしない。血中形質芽球は、CD20、CD62L及びCD138の不均一な発現を有し、これらのマーカーの陰性及び陽性の両方が存在することが示されている。CD20とCD138との組み合わせは、血中形質芽球の3つの成熟サブセット:CD20+/CD138-、CD20-、CD138-、及びCD20-/CD138+、を定義している(Perez-Andres et al,2010)。加えて、CD62Lは又、血中形質芽球の2つの成熟サブセットも明らかにした(Mei et al,2009)。しかしながら、CD20、CD62L、及びCD138によって定義されているこれらの形質芽球サブセットの関係を確立する為に、3つのマーカーを当業者は組み合わせたことがない。
該マーカーCD20、CD38、CD62L及びCD138を、任意的にCD19と組み合わせることによって(表7)、本発明者等は、上記で言及された形質芽球サブセットが、不連続なサブセットではなく、CD19+CD20+CD38+CD62L-CD138-から成熟形質細胞(CD19+CD20-CD38++CD62L+CD138+)への完全な連続する成熟経路を共に形成することを初めて観察した(図6)。これは、全ての異なるアイソタイプに対して同一の分布であると推定される。
従って、一つの実施態様において、本発明は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含む、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該コンジュゲーションされた抗体が、任意的にCD19と組み合わせられた、下記のマーカーの組み合わせ:CD20、CD38、CD62L、及びCD138に対して向けられたものである、上記試薬組成物を提供する。
最近、本発明者等は、B系列細胞が、Igカッパ/Igラムダ(Igκ及びIgλ)軽鎖と組み合わせられた、又は組み合わせられていない、IgHクラス及びサブクラス(アイソタイプ)の発現に従って細分類されることができることを示している(Blanco,2017;Blanco et al,2018;Blanco et al,2019)。血液中又は他の組織における形質芽球/形質細胞成熟経路全体を通しての、個々のIgHアイソタイプの分布の差を調べる方法を、当業者は教示したことがない(表7;図7における集団ツリーをまた参照されたい)。
IgHクラス及びサブクラスの評価と組み合わされた該4マーカーに基づく(CD19の存在下又は非存在下)形質芽球/形質細胞経路の試薬組成物は、体全体の組織における、進行中のB細胞応答を血中モニタリングする為の新規ツールであり、成人及び子供の両方の血液中の、全ての形質芽球/形質細胞の正確で明確な同定を初めて可能にする。図6B及びDに例示されているように、これは、個々の微生物叢、進行中の感染症、アレルギー応答、自己免疫、ワクチン及び免疫療法に対するB細胞応答の詳細な精査を更に可能にする。
一つの実施態様において、形質芽球/形質細胞及びB細胞に関する上記の抗体パネルのいずれも、抗原特異的形質芽球/形質細胞及びB細胞、例えば、微生物特異的、アレルゲン特異的、自己抗原特異的、及びワクチン特異的形質芽球/形質細胞及びB細胞、並びに免疫療法の状況においては、抗原特異的形質芽球/形質細胞及びB細胞の検出を可能にする試薬を補充される。抗原特異的形質芽球/形質細胞及びB細胞を染色する為のそのような抗原は、標識と直接コンジュゲーションされることができ、第2の工程の標識された試薬によって間接的に検出されることができ、又は当技術分野で既知である標識された多量体システム、例えばKlickmer及びDextramerシステム(Immudex、Copenhagen、Denmark)に連結されることができる。
IgH区画あたりの形質芽球/形質細胞成熟経路解析の為のマーカーの組み合わせは、CD38、CD62L、CD20、CD138、プラスIgM、CD19の存在下又は非存在下の組み合わせからなる。加えて、同じ標識付けを有する、又は2つの異なる標識付け、すなわち1つはIgAの為であり、他方はIgGの為である標識付けを有するIgAプラスIgGが加えられることができる。
別の実施態様において、IgG及びIgAに対して向けられた抗体と同じ標識付けを有する、又はIgA及びIgGの両方の抗体に異なる標識付けを有する、IgDに対するコンジュゲーションされた抗体が加えられることができる。代替的には、IgD、IgG及びIgAに対して向けられた抗体は、3つの試薬のうちの1つが2つの標識付けによって同時にコンジュゲーションされ、他の2つの試薬は、それらの2つの標識付けそれぞれのうちの1つのみと組み合わせられる。
上記で引用された、該抗体の組み合わせの別のバージョンにおいて、IgA及びIgG及びIgD抗体は、いずれも同じ標識又は各々に個別の標識にコンジュゲーションされている、Igκ及びIgλ試薬に置換されている。
別の実施態様において、IgMの存在下又は非存在下及びCD19の存在下又は非存在下での該CD38、CD62L、CD20、CD138バックボーン抗体は、Igκ及びIgλに関する細胞表面染色及び細胞内染色の両方と組み合わせられることができ、好ましくは、異なる標識付けは、細胞表面膜及び細胞内試薬の為に使用され、特には子供における、血中形質芽球/形質細胞の正確な同定を可能にする為に、Igκ及びIgδ試薬に関して同じ標識付け又は異なる標識付けが使用される(表7)。加えて、上記で言及された抗体の組み合わせは、BB0バックボーンに関して上記のように、異なるIgHアイソタイプ及びIgA及び/又はIgGサブクラスに対して向けられた抗体を補充されることができる(表7の脚注を参照)。別の実施態様において、1つ又は同時に2つの標識付けによってコンジュゲーションされたIgE抗体は、上記の抗体の組み合わせの各々に加えられうる(表7)。
これらのマーカーの組み合わせのいずれも、直接又は間接的に標識された微生物抗原、自己抗原、ワクチン抗原、アレルゲン、又は免疫療法関連成分を補充されることができる。
** 全ての以前のチューブの免疫グロブリン染色は、細胞内のみ、表面膜のみ、又は細胞内と表面膜の両方で行われることができる。後者は、同じ標識付け位置又は個別の標識付け位置上で該マーカーについて行われることができる。
D:DC-単球、CD4+T細胞サブセット、及び/又は形質芽球/形質細胞及びB細胞の組み合わせられた検出の為の、抗体の混合物
本発明は又、細胞系列及び成熟区画あたりの主な亜集団を定義する、本発明の2つ又は3つのバックボーン(BB)マーカーの組み合わせの混合物(すなわち、カクテル)を使用して、進歩した白血球/免疫細胞サブセット化の為の手段及び方法も提供する。
本発明は又、細胞系列及び成熟区画あたりの主な亜集団を定義する、本発明の2つ又は3つのバックボーン(BB)マーカーの組み合わせの混合物(すなわち、カクテル)を使用して、進歩した白血球/免疫細胞サブセット化の為の手段及び方法も提供する。
例えば、40個より多くの異なる(蛍光色素の)色によるフローサイトメトリー、及び40個より多くの異なる(金属の)色によるマスサイトメトリー、の進歩に基づいて、今では、DC-単球チューブの上記で言及された15個のBBマーカーの組み合わせと、CD4 T細胞チューブの12個のBBマーカー及び/又は形質芽球/形質細胞及びB細胞チューブの5つのBBマーカーとの組み合わせを含む単一の試薬組成物を使用することが可能となった:
DC-単球BB(15種のマーカー):CD5、CD14、CD16、CD33、CD34、CD36、CD45、CD62L、CD141、CD192、CD300e、CD303、FcER1、HLA-DR、及びSLAN;
CD4+T細胞BB(12種のマーカー):CD3、CD4、CD25、CD27、CD45RA、CD62L、CD127、CD183、CD185、CD194、CD196、及びCCR10(CD45の存在下又は非存在下)
形質芽球/形質細胞及びB細胞BB(5種のマーカー):CD20、CD38、CD62L、CD138、及びIgM又はIgkプラスIgλ(CD19の存在下又は非存在下)。
DC-単球BB(15種のマーカー):CD5、CD14、CD16、CD33、CD34、CD36、CD45、CD62L、CD141、CD192、CD300e、CD303、FcER1、HLA-DR、及びSLAN;
CD4+T細胞BB(12種のマーカー):CD3、CD4、CD25、CD27、CD45RA、CD62L、CD127、CD183、CD185、CD194、CD196、及びCCR10(CD45の存在下又は非存在下)
形質芽球/形質細胞及びB細胞BB(5種のマーカー):CD20、CD38、CD62L、CD138、及びIgM又はIgkプラスIgλ(CD19の存在下又は非存在下)。
これら3つのBBマーカーセットは、それらの重複が非常に限定的(CD62L及びCD45のみ)で非常に相補的であることから新規であるのみならず、独自でもあり、2つ(DC-単球BB及びCD4+T細胞BB、又はDC-単球BB及び形質芽球/形質細胞及びB細胞BB、又はCD4+T細胞BB及び形質芽球/形質細胞及びB細胞BB)又は更には3つ(DC-単球BB及びCD4+T細胞BB及び形質芽球/形質細胞及びB細胞BB)のBBマーカーセットは、組み合わせられて、新規の独自の(拡張性の)マーカーの組み合わせを作製することができることを意味している。
該3つのBBセットは、非常に情報に富む新規抗体組み合わせを提供し、これは進歩した多系列の白血球/免疫細胞サブセット化を可能にする。そのような30種のマーカー(28色)抗体の組み合わせ(CD19の存在下又は非存在下)を使用するデータ収集は、現在幾つかのタイプのサイトメーター、例えばSymphony-A5(≧35色/蛍光色素;BD Biosciences、San Jose、CA)、Aurora-5L(≧35色/蛍光色素;Cytek、Freemont、CA)、及びCyTOF Helios(≧40色/金属;Fluidigm、South San Francisco、CA)について実現可能である。
これらのBB抗体混合物は、個々の白血球/免疫細胞系列の更なる精査の為に、上記で定義された余分のマーカーによって更に拡大されることができる。例えば、CD8、CD19、CD56、TCRγδに対して向けられた抗体、及びIgHアイソタイプ(IgHクラス又はサブクラス)を加えることは、単一のチューブにおいて血中白血球の350個より多くのサブセットを検出及び定量する可能性をもたらす。
別の実施態様において、該バックボーンマーカーのセット又はバックボーンマーカーの組み合わせのいずれも、悪性疾患及び他のタイプのがんの両方における血液中の循環している腫瘍細胞又は骨髄における最小残留疾患を検出する為の専用マーカー、並びに/又は遺伝子改変免疫細胞、例えばCAR-T若しくはCAR NK細胞、例えばCAR-CD19、CAR-BCMA、CAR-CD30、CAR-CD20、CAR-EGFR等、を含む、CAR-T及びCAR-NK細胞をモニターする為の専用マーカー、と組み合わせられる。
D. 該抗体パネルのDC-単球、CD4+T細胞、及び形質芽球/形質細胞及びB細胞を解析する為の12色チューブへの濃縮
進歩した≧25色のフローサイトメーターは、多くの研究及び臨床検査室でますます利用されているが、多くの診断検査室はなおも、ルーチンの診断患者ケアに8~12色の染色を使用している。それ故に、上記で提示された試薬組成物は、好ましくは、世界中で患者のケアの為に利用可能ともなるべきである。そのような世界全体での施与性を達成する為に、上記の抗体パネルの幾つかは、12色試薬組成物へと適合されている。そのようにする為に、相互に排他的である、すなわち同じ細胞において決して発現されず、それによって該対応する抗体が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができる、マーカー(細胞標的)の組み合わせが同定されている。
進歩した≧25色のフローサイトメーターは、多くの研究及び臨床検査室でますます利用されているが、多くの診断検査室はなおも、ルーチンの診断患者ケアに8~12色の染色を使用している。それ故に、上記で提示された試薬組成物は、好ましくは、世界中で患者のケアの為に利用可能ともなるべきである。そのような世界全体での施与性を達成する為に、上記の抗体パネルの幾つかは、12色試薬組成物へと適合されている。そのようにする為に、相互に排他的である、すなわち同じ細胞において決して発現されず、それによって該対応する抗体が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができる、マーカー(細胞標的)の組み合わせが同定されている。
例えば、CD34及びCD14は、同じ正常なDC-単球細胞集団において決して同時に発現されていない。それ故に、CD34及びCD14に対して向けられた抗体は、同じ蛍光色素にコンジュゲーションされることができ、このことは該CD5、CD14、CD16、CD33、CD34、CD36、CD45、CD62L、CD141、CD192、CD300e、CD303、FcER1、HLA-DR、及びSLAN抗体の組み合わせが、12色、15抗体のDC-単球チューブに「濃縮」されることができることを意味する(表8)。
それ故に、本発明は、CD141、HLA-DR、CD16、CD33、CD300e、CD303、CD14、CD45、CD5、CD34、CD36、SLAN、CD62L、FcERI及びCD192(CCR2)、に対するコンジュゲーションされた抗体を含む12色試薬組成物であって、該マーカーセットSLAN/FcERI、CD300e/CD303、及びCD14/CD34内の該抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされ、ここで、異なるマーカーセットの間で、該標識が識別可能である、上記試薬組成物を提供する。
代替的には、明らかに異なる発現レベル及び異なる染色パターンを有するマーカーは、組み合わせられることができ、該対応する抗体は、同じ標識にコンジュゲーションされることができる。例えば、CD4及びCD45は発現パターン及び発現レベルが有意に異なり、それ故に、CD4 T細胞チューブにおいて、同じ標識位置で組み合わせられることができ、これは該CD3、CD4、CD25、CD27、CD45、CD62L、CD127、CD183、CD185、CD194、CD196、CCR10、及びCD45RA又はCD45ROマーカーが、12色、13抗体の組み合わせをもたらすことを意味する(表8)。
それ故に、本発明は、CD27、CD62L、CD127、CD3、CD25、CCR10、CD183(CXCR3)、CD196(CCR6)、CD194(CCR4)、CD185(CXCR5)、CD4、CD45、及びCD45RA又はCD45ROに対するコンジュゲーションされた抗体を含む12色試薬組成物であって、該CD4及びCD45に対して向けられた抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされている(12色CD4 T細胞チューブ)、上記試薬組成物を提供する。
この12色CD4 T細胞チューブの結果は、典型的に、バックボーンマーカーセット(表8における太字)として、該6種のマーカーCD3、CD4、CD27、CD45、CD62L、及びCD45RA又はCD45ROを使用して、EuroFlowガイドライン(Kalina et al.,2012)(www.EuroFlow.org)に従って、細胞傷害性T及びNK細胞に関する、対応する「姉妹チューブ」の結果と統合及び計算されることができる。この細胞傷害性T及びNK細胞チューブは、CD8、CD16、CD28、CD56、CD57、TcRγδ、及びグランザイムB(表8)に対して向けられた抗体を更に含む。従って、(i)該12色CD4 T細胞チューブに関して定義された該試薬組成物;並びに(ii)該マーカーCD27、CD62L、CD3、CD45、CD4、CD45RO又はCD45RA、CD8、CD16、CD28、CD56、CD57、TcRγδ、及びグランザイムBに対するコンジュゲーションされた抗体を含む、12色試薬組成物、を含む、12色試薬組成物のセットであって、該CD4及びCD45に対して向けられた抗体が同じ標識にコンジュゲーションされている、上記試薬組成物のセットがまた提供される。試薬セットにおいて、各組成物は、CD45RO又はCD45RAのいずれかに対して向けられた抗体を含有しなければならない。
最後に、本発明は、該バックボーンマーカーCD19、CD20、CD38、CD62L及びCD138で構成され、CD27、CD21、CD45、IgM及びIgDを補充された、形質芽球/形質細胞及びB細胞チューブを提供する。この抗体組成物は、Igκ及びIgλに対して向けられた抗体、又はIgG及びIgAに対して向けられた抗体、を更に補充され得、それは、該成熟B系列区画の詳細な免疫モニタリングを可能にする12色試薬組成物をもたらす(表8)。
IgM及びIgDを除き、全ての他のIgHアイソタイプは、同じB系列の細胞によって同時に発現されず、このことは、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされた対応する抗体の、幾つかの組み合わせが作製されることができることを意味する。その結果、別の実施態様において、形質芽球/形質細胞及びB細胞試薬組成物は、14個の異なる抗体を含有し、そのうちの1つは、2つの異なる蛍光色素コンジュゲーション(抗IgD、抗IgG、又は抗IgA)の形態で存在するが、Igκ及び抗Igλは、同じ蛍光色素に配置され、このことは、15個の異なる抗体コンジュゲーションがこの12色チューブに存在することを意味する。なお別の実施態様において、12色の形質芽球/形質細胞及びB細胞チューブは、16個の異なる抗体で構成され、そのうちの3つは2つの異なる蛍光色素コンジュゲーション(例えば、抗IgG1、抗IgG2、及び抗IgA1)に存在するが、別の抗IgH抗体(例えば、抗IgD)は、3つの異なるコンジュゲーションの形態で存在し、このことは、21個の異なる抗体コンジュゲーションがこの12色チューブに存在することを意味している(表8)。
[実施例]
上記の本明細書に記載されている試薬組成物の各々は、サンプル調製及びサイトメトリー分析の為の、ルーチンの手順及びプロトコールで適用されることができることは、当業者によって認識されるであろう。
上記の本明細書に記載されている試薬組成物の各々は、サンプル調製及びサイトメトリー分析の為の、ルーチンの手順及びプロトコールで適用されることができることは、当業者によって認識されるであろう。
本実施例は単に、例示的な試薬組成物が、生物サンプル中の細胞の別個の集団の解析の為に、どのように使用されることができるかを例証する。
全てのマルチパラメータフローサイトメトリーによる免疫表現型決定試験に関して、新鮮なサンプル、例えば新鮮な血液、骨髄(BM)、リンパ節、及び脾臓標本が使用された。これらのサンプルは、収集後24時間以内に染色及び処理された。血液及びBMサンプルに関して、直接免疫蛍光染色及びその後の溶解技術が使用される(Kalina et al.2012)、CD4 T細胞免疫染色チューブを除き、染色前に非有核赤血球を溶解する為に、NH4Clに基づくEuroFlowバルク溶解標準操作手順書(SOP)が使用された(Flores Montero et al 2017)。リンパ節及び脾臓サンプルは、染色前に単細胞懸濁物へと機械的に解離された。その後、少なくとも5×106個の白血球/サンプルアリコート(又は、該CD4 T細胞免疫染色チューブに関しては、少なくとも細胞3×105個/チューブ)が、適切なシリーズの(モノクローナル)抗体試薬によって染色された。
該染色されたサンプルの獲得は、免疫染色後、LSR Fortessa X-20フローサイトメーター(BD)において、FACSDiva(商標)ソフトウェア(BD)を使用して、直ちに実施された。機器の設定、較正、及びモニタリングに関して、14色測定に関するEuroFlow機器の設定及び補正プロトコールが使用された。データ解析に関して、Infinicyt(商標)ソフトウェア(Cytognos S.L)が使用された。各血液サンプルに関して、目的の主要細胞集団及び各特定の細胞サブセットに関して、相対的及び絶対(二重プラットフォーム)細胞数が計算され、記録された。BM、リンパ節、及び脾臓サンプルにおいて、相対的細胞数のみが誘導された。
図1を参照して、樹状細胞(DC)-単球免疫染色チューブのうちの1つにおいて、下記の15個のMab試薬が使用された:CD141(1A4)-ブリリアントバイオレット(BV)421(BD Biosciences)、CD5(UCHT2)-BV510(BD Biosciences)、CD192(LS132.1D9)-BV605(BD Biosciences)、CD62L(DREG-56)-BV650(BioLegend)、抗HLA-DR(G46-6)-BV711(BD Biosciences)、CD16(3G8)-BV786(BD Biosciences)、CD36(CLB-IVC7)-ペリジニンクロロフィルタンパク質-シアニン5.5(PerCPCy5.5)(Immunostep)、抗SLAN(DD-1)-フィコエリスリン(PE)(Miltenyi)、抗FcεRI(AER-37)-PE(Thermo Fisher)、CD34(581)-PECF594(BD Biosciences)、CD33(P67.6)-PECy7(BD Biosciences)、CD300e(UP-H2)-アロフィコシアニン(APC)(Immunostep)、CD303(AC144)-APC(Miltenyi)、CD45(HI30)-AF700(BD Biosciences)、及びCD14(MφP9)-APCH7(BD Biosciences)。該抗SLAN及び抗FcER1抗体は、単球サブセットにおける該SLAN及びFcER1の発現が相互に排他的であることから、いずれもPEにコンジュゲーションされることができる。CD300e及びCD303の発現が相互に排他的であることから、APCにコンジュゲーションされたCD300e(IREM2)及びAPCにコンジュゲーションされたCD303抗体についても同じことが当てはまる。これは、14個の異なる検出可能な標識を使用して、16個の異なる抗体の適用を可能にする。図4を参照して、及び別個の例として、該CD4 T細胞免疫染色チューブのうちの1つにおいて、下記の14個のMab試薬が使用された:CD27(M-T271)-BV421(BD Biosciences)、CD45RA(HI100)BV510(BD Biosciences)、CD8(SK1)-BV605(BD Biosciences)、CD62L(DREG-56)-BV650(BioLegend)、CD127(HIL7RM21)-BV711)BD Biosciences)、CD3(SK7)-BV786(BD Biosciences)、CD25(4E3)-VioBrightフルオレセインイソチオシアネート(FITC)(Miltenyi)、CCR10(1B5)-PerCPCy5.5(BD Biosciences)、CD183-CXCR3(1C6/CXCR3)-PE(BD Biosciences)、CD196-CCR6(11A9)-PECF594)(BD Biosciences)、CD194-CCR4(L291H4)-PECy7(BioLegend)、CD185-CXCR5(REA103)-APC(Miltenyi)、CD45(HI30)-AF700、及びCD4(SK3)-APCH7(BD Biosciences)。
** 該形質芽球/形質細胞及びB細胞チューブは、16個の異なる抗体を含有することができ、そのうちの3つは、2つの異なる蛍光色素コンジュゲート(抗IgG1、抗IgG2、及び抗IgA1)に存在し、抗IgDは、3つの異なるコンジュゲートの形態で存在し、21個の異なる抗体コンジュゲートが、この12色チューブに存在することを意味している。
Claims (53)
- 白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該試薬組成物は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーの組み合わせ:CD141、HLA-DR、CD16、CD33、CD300e、CD303、及びCD14に対して向けられたものであり、該CD300e及びCD303に対して向けられた抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされうる、前記試薬組成物。
- CD5、CD34及びCD45の1以上に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項1に記載の試薬組成物。
- マーカーセットCD36及びSLAN、及び/又はマーカーセットCD62L及びFcERIに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項1又は2に記載の試薬組成物。
- マーカーセットCD36及びCD192(CCR2)、及び/又はマーカーセットCD62L及びCD45に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項1に記載の試薬組成物。
- CD141、HLA-DR、CD16、CD33、CD300e、CD303、CD14、CD45、CD5、CD34、CD36、SLAN、CD62L、FcERI、及びCD192(CCR2)に対するコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、マーカーセットSLAN/FcERI及びマーカーセットCD300e/CD303内の前記抗体が同じ標識にコンジュゲーションされることができ、ここで、異なるマーカーセットの間で、該標識が識別可能である、請求項1~4のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- マーカーCD1c及び/又はCD100及び/又はAx1に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- CD34、CD45、CD64及びCD117に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、ここで、マーカーセットCD34及びCD14についての抗体が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができる、請求項1に記載の試薬組成物。
- CD36に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項7に記載の試薬組成物。
- CD11b、CD13及びCD35に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項1、7又は8に記載の試薬組成物。
- CD163に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- CD163及びFcεRIに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、ここで、マーカーセットCD34及びCD14についての抗体が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができる、請求項1~7のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- CD36、CD11b、CD13、CD35、CD163、FcεRIからなるマーカーの群からの少なくとも2つに対してコンジュゲーションされた抗体で補充されており、ここで、存在すれば、マーカーセットCD34及びCD14が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができる、請求項7に記載の試薬組成物。
- 急性白血病、より特には単球性又はDC起源の白血病、の診断、分類及び/又はモニタリングの為の、請求項1~12のいずれか1項に記載の試薬組成物の使用方法。
- 白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該試薬組成物は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーの組み合わせ:CD27、CD45RA若しくはCD45RO、CD62L、CD127、CD3、CD25、CCR10、CD183(CXCR3)、CD196(CCR6)、CD194(CCR4)、CD185(CXCR5)、及びCD4に対して向けられたものである、前記試薬組成物。
- CD8及び/又はCD45に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項14に記載の試薬組成物。
- CD31及び/又はCD95に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項14又は15に記載の試薬組成物。
- (i)CD278(ICOS)、CD279(PD1)及びHLA-DRの1以上に対するコンジュゲーションされた抗体、及び/又は(ii)相互に排他的なTcR-Cβ1及び/又はTcR-Cβ2エピトープに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項14~16のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- (i)TCRγδ;(ii)NK細胞を同定する為の、CD16、CD56及び/又はCD335;及び、(iii)細胞傷害性関連マーカー、好ましくは、CD28、CD57及び/又はグランザイムB、に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項14~17のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- マーカーCD2、CD279、CD7、CD26及びCD28に対するコンジュゲーションされた抗体、任意的に、さらにHLA-DR及び/又はcyTCL1に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項14~17のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- (i)TcR-Vβ及び/又はTcR-Vαドメイン、及び(ii)TcRγδに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項14~19のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- (i)TcR-Vδ及び/又はTcR-Vγドメイン、及び(ii)TcRαβに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項14~19のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- 抗原特異的T細胞の検出及び計数の為に、MHC分子中に1以上の抗原特異的ペプチドをさらに含み、ここで、該MHC分子は、検出可能な標識に直接又は間接的にコンジュゲーションされうる多量体構築物に含まれる、請求項14~21のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- 試薬組成物のセットであって、(i)請求項14~22のいずれか1項に記載の試薬組成物、及び(ii)CD3、CD4、CD8、CD27、CD45、CD62L、CD45RA若しくはCD45RO、CD16、CD28、CD56、CD57、TCRγδに対するコンジュゲーションされた抗体を含む試薬組成物を含み、任意的に、マーカーCD335及び/又はグランザイムBに対するコンジュゲーションされた抗体で補充された、前記セット。
- 試薬組成物のセットであって、(i)請求項19~22のいずれか1項に記載の試薬組成物、及び(ii)マーカーCD27、CD45RA、CD45RO、CD8、CD62L、CD127、CD3、CD25、CD7、HLA-DR、CD45、CD4、CD11c、CD16、CD30、CD56、CD57、CD94、CD5、TcRγδに対して向けられたコンジュゲーションされた抗体を含む試薬組成物を含み、任意的に、グランザイムB及び/又はパーフォリンに対して向けられたコンジュゲーションされた抗体で補充された、前記セット。
- 白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の試薬組成物であって、該試薬組成物は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーの組み合わせ:CD20、CD38、CD62L及びCD138、並び任意的に、CD19と一緒の組み合わせに対して向けられている、前記試薬組成物。
- Igカッパ及びIgラムダに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、ここで、Igカッパ及びIgラムダに対する前記抗体が、同じ標識に又は異なる標識にコンジュゲーションされうる、請求項25に記載の試薬組成物。
- IgMに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項25又は26に記載の試薬組成物。
- IgA及びIgGに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、ここで、IgA及びIgGに対して向けられた前記抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされうる、請求項25~27のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- IgDに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、好ましくはIgM及びCD45に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項25~28のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- CD27及びCD5に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、ここで、CD5及びCD138に対する前記抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされうる、請求項29に記載の試薬組成物。
- IgD,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2サブクラスに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、ここで、これらのIgD,IgG及びIgAサブクラスに対して向けられた該抗体が、同じ標識に部分的にコンジュゲーションされうる、請求項25~27のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- IgEに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項28又は31に記載の試薬組成物。
- CD27及びCD5に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、ここで、CD5及びCD138に対する前記抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされうる、請求項31又は32に記載の試薬組成物。
- 抗原特異的又はアレルゲン特異的な血漿細胞及びB細胞の検出及び計数の為に1以上の抗原又は又は1以上のアレルゲンをさらに含み、ここで、1以上の抗原又は1以上のアレルゲンが、検出可能な標識に直接的又は間接的にコンジュゲーションされうる、請求項25~33のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- 前記抗体が、蛍光色素にコンジュゲーションされている、請求項1~34のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- 前記抗体が、金属同位体にコンジュゲーションされている、請求項1~34のいずれか1項に記載の試薬組成物。
- (i)請求項1~12のいずれか1項に記載の試薬組成物、(ii)請求項14~22のいずれか1項に記載の試薬組成物、及び(iii)請求項24~34のいずれか1項に記載の試薬組成物のうちの2以上において定義されたコンジュゲーションされた抗体の混合物を含む試薬組成物。
- (i)請求項5に記載の試薬組成物、(ii)請求項14又は15に記載の試薬組成物、及び(iii)請求項25、26又は27に記載の試薬組成物のうちの2以上において定義されたコンジュゲーションされた抗体の混合物を含む、請求項37に記載の試薬組成物。
- (i)請求項1~12のいずれか1項に記載の試薬組成物、(ii)請求項14~22のいずれか1項に記載の試薬組成物、及び(iii)請求項25~34のいずれか1項に記載の試薬組成物のうちの2以上の組み合わせを含む、試薬組成物のセット。
- 白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の診断キットであって、該診断キットは、請求項1~39のいずれか1項に記載の試薬組成物又は試薬組成物のキットを含み、任意的に、使用の為の指示書、バッファ、及び/又は対照サンプルを一緒に含んでいてもよい、前記診断キット。
- 白血球のマルチカラーフローサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の診断キットであって、該診断キットは、請求項35に記載の試薬組成物を含み、任意的に、使用の為の指示書、バッファ、及び/又は対照サンプルを一緒に含んでいてもよい、前記診断キット。
- 白血球のマスサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の診断キットであって、請求項36に記載の試薬組成物を含み、任意的に、使用の為の指示書、バッファ、及び/又は対照サンプルを一緒に含んでいてもよい、前記診断キット。
- 免疫状態及び/又は免疫調節処置の効果のマルチパラメータサイトメトリーベースのモニタリングにおいて使用する為の、請求項40~42のいずれか一項に記載の診断キット。
- 請求項5に記載の試薬組成物であって、該試薬組成物は12色の試薬組成物であり、該12色の試薬組成物は、CD141、HLA-DR、CD16、CD33、CD300e、CD303、CD14、CD45、CD5、CD34、CD36、SLAN、CD62L、FcERI、及びCD192(CCR2)に対するコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、マーカーセットSLAN/FcERI、マーカーセットCD300e/CD303、及びマーカーセットCD14/CD34内の抗体は、同じ標識にコンジュゲーションされており、ここで、異なる標識セットの間で、該標識が識別可能である、前記試薬組成物。
- 請求項15に記載の試薬組成物であって、該試薬組成物は12色の試薬組成物であり、該12色の試薬組成物は、CD27、CD62L、CD127、CD3、CD25、CCR10、CD183(CXCR3)、CD196(CCR6)、CD194(CCR4)、CD185(CXCR5)、CD4、CD45、及びCD45RA又はCD45ROに対するコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、CD4及びCD45に対する抗体は、同じ標識でコンジュゲーションされる、前記試薬組成物。
- 12色の試薬組成物のセットであって、(i)請求項45に記載の試薬組成物、及び(ii)マーカーCD27、CD62L、CD3、CD45、CD4、CD45RO又はCD45RA、CD8、CD16、CD28、CD56、CD57、TcRγδ及びグランザイムBに対して向けられたコンジュゲーションされた抗体を含む12色の試薬組成物含み、ここで、CD4及びCD45に対する抗体は、同じ標識にコンジュゲーションされる、前記試薬組成物。
- 請求項29に記載の試薬組成物であって、該試薬組成物は12色の試薬組成物であり、該12色の試薬組成物は、マーカーCD19、CD20、CD38、CD62L、CD138、CD21、CD27、CD45、IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2に対して向けられたコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、IgD、IgG及びIgAサブクラス抗体のうちの3つは、2つの異なるコンジュゲートの形で存在し、各コンジュゲートは別個の検出可能な標識を保持し、一方、それらのうちの1つは、3つの異なるコンジュゲートの形で存在し、各コンジュゲートは別個の検出可能な標識を保持する、前記試薬組成物。
- 請求項44、45又は47に記載の12色の試薬組成物の1以上、又は請求項46に記載の12色の試薬組成物のセットを含む診断キット。
- 古典的な免疫抑制処置(コルチコステロイド類、シクロスポリン、メトトレキサート等);細胞処置、例えば遺伝子療法、幹細胞移植、CAR T細胞処置;チェックポイント阻害剤;多くの異なる抗体処置(多くの異なる抗体エフェクター機能を有する);及び外部作用剤(微生物、昆虫毒素、アレルゲン等)、又は腫瘍抗原に対するワクチン接種からなる群から選択される免疫調節処置の効果をモニタリングする為の方法において、請求項40~42又は48のいずれか1項に記載の診断キットを使用する方法。
- 対象の免疫状態及び/又は免疫調節処置の効果のモニタリングする為のサイトメトリー方法であって、
(a)該対象から得られた白血球を含む生物サンプルのアリコートを、請求項1~39及び44~47のいずれか1項に従う試薬組成物又は試薬組成物のセットと接触させること;
(b)フローサイトメーター又はマスサイトメーターにおいて前記アリコート中の白血球を分析すること;及び
(c)得られたデータを保存し、且つ評価すること
の工程を含む、前記方法。 - 前記サンプルが、末梢血、骨髄、臍帯血、組織サンプル、例えばリンパ節、アデノイド、脾臓、若しくは肝臓、又は他のタイプの体液、例えば脳脊髄液、硝子体液、滑膜液、細針吸引液、胸膜滲出液、若しくは腹水、である、請求項50に記載の方法。
- 工程(c)は、サンプルの1つのアリコートからの個々の細胞が、それらのマーカー及び散乱プロファイルに従って、同じサンプルの別のアリコートからの対応する個々の細胞と一致する、いわゆる最近傍法の計算に従って、複数のチューブからの選択された細胞集団の免疫表現型情報を組み合わせることを含む、請求項50又は51に記載の方法。
- フローサイトメトリーファイルのデータ統合及び多次元分析の為のソフトウェアを使用することを含み、好ましくは前記ソフトウェアがINFINICYT(商標)である、請求項50~52のいずれか1項に記載の方法。
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