JP5725693B2 - シグレック−9シアル酸結合剤 - Google Patents
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Description
a) 試験エージェントを細胞発現シグレック−9と接触させるステップと;
b)試験エージェントとシグレック−9との相互作用を検出するステップと、から成る。
a)試験エージェントを細胞発現シグレック−9と接触させるステップと;
b)ステップ(a)による細胞の増殖及び/又は分化を対照細胞のそれと比較するステップと、から成る。
a) 患者から試料を採取するステップと;
b)試料を、シグレック−9を結合可能なエージェントと接触させるステップと;
c)結合エージェントとシグレック−9との相互作用を検出するステップと、から成る。
a) 支持体基質(a support substrate)上にシグレック−9結合剤を固定化するステップと;
b)固定化したシグレック−9結合剤を細胞試料と接触させるステップと、から成る。
A) 試料II(図2参照)の単核AML骨髄細胞を、以下のmAbの何れか1つと組み合わせた抗シグレック−9−FITCmAbで染色した:抗CD38ビオチン、抗CD123ビオチン(ストレプトアビジンAPCが続く)、抗CD117−PE、抗CD14−PE。
B) 単核AML骨髄細胞を、抗CD34分類II−ビオチンと組み合わせた抗CD33FITCmAbまたは抗シグレック−9−FITCmAbで染色し、続いて、ストレプトアビジンAPCに晒した。図2に3個のAML試料を示す(上のパネル:試料I、29%CD34+;真ん中のパネル:試料II、2.5%CD34+;下のパネル:試料XIX、31%CD34+)。
それぞれのドット・プロットについて、ダブル陽性細胞の百分率を示す。
A) 前方散乱(FSC)と側方散乱(SSC)を比較したプロットが、3個の集団:R2、SSClow;R3、SSCmedium;R4、SSChighの定義を容認する。
B) 灰色のヒストグラムは、上記のように定義した細胞の3個の部分集団上で、指示mAbを使ったCD33関連シグレックの発現を示す。白色のヒストグラムは、イソタイプ対照による染色を示す。
A) 骨髄細胞を、抗シグレック−5ビオチン又は抗シグレック−7ビオチンの何れかと共に抗CD33−APCおよび抗シグレック−9−FITCで標識し、続いて、ストレプトアビジンPEに晒した。2個のシグレック−9陽性集団を以下のように定義する:ゲート1、CD33high、シグレック−9+;ゲート2、CD33medium、シグレック−9+。ヒストグラムは、各ゲート・サブ集団におけるシグレック−5とシグレック−7の発現を示す。
B) 骨髄細胞を、抗CD38ビオチン又は抗CD123ビオチンの何れかと共に抗シグレック−9−FITCで標識し、続いて、ストレプトアビジンAPCまたは抗CD14−PEに晒した。シングル及びダブル陽性細胞の百分率を示す。
C) 骨髄細胞を、CD33−FITC、抗シグレック−5−FITC、抗シグレック−7−FITC又は抗シグレック−9−FITCの何れかと共に抗CD34ビオチンで標識し、続いて、ストレプトアビジンAPCに晒した。CD34+細胞をゲートし(M1、灰色のヒストグラム、左側パネル)、CD33と、シグレック−5、シグレック−7、シグレック−9の発現についてそれぞれ分析した(灰色のヒストグラム、右側パネル)。イソタイプ整合対照(isotype matched control)によるCD34+細胞の標識を白色ヒストグラムに示す。
A) シグレック−9の野生型(WT)、(Y1F)または(Y2F)変異体(右側パネル)で安定して感染(transfected)させた試料XVI、XIX、及びXXI(左側パネル)またはRBL細胞から採取した単核AML骨髄細胞を氷の上で45分間抗シグレック−9−アレクサ−488mAbで標識し、洗浄後に37℃で40分または240分培養した。やぎ抗マウスAPCを使って、表面の残余抗シグレック−9mAbを検出した。表面に残った抗シグレック−9mAb発現を値Bで始まる百分率でグラフに示す。
(A)で説明したように内在化分析を行い、抗シグレック−9−アレクサ−488関連の全細胞レベルを各時点で評価した。右側パネルに見られる上昇は、FL−1チャンネルで検出したRBL細胞の自動蛍光における時間依存ゲインを表す。残余抗シグレック−9mAb発現を開始値の百分率としてグラフに示す。
[AML患者と正常骨髄及び血液ドナー]
AML患者から骨髄を採取し、説明後の承諾をもらって、人工股関節置換手術を行う健康な患者から骨髄試料を採取した。AML試料は、テイサイド癌組織バンク(Tayside Cancer Tissue Bank)に貯蔵した。研究は、貯蔵組織に関する研究の医学研究倫理の面からテイサイド癌組織委員会(Tayside Cancer Tissue Committee)を代表する同委員会によって承認された(承認番号04/S1401/85)。フィコール・パーク・プラスTM(Ficoll−Paque TM Plus)(Amersham Biosciences, Bucks, UK)密度勾配遠心で単核細胞(MNC)を浄化した。AML細胞アリコットを液体窒素に保存し、正常MNCを、直接、実験に用いた。低温保存した試料を解凍し、実験前に、FCS20%、ペニシリン/ストレプトマイシン1%、HEPES緩衝液10mMで補足したRPMI1640(Lグルタミンと共に)培地で90分間、CO25%、37℃で培養した(試薬は全てInvitrogen Gibco, Paisley, UKから入手)。凝固防止措置した全骨髄吸引物を遠心分離して、骨髄血漿を調整し、−80℃で保存した。血清調合用の血液試料は、地域の倫理ガイドラインに沿って研究所の有志から採取した。
以下のCD33関連シグレックに特有のモノクローナル抗体(mAbs)を我々の研究所で生成した:CD33(6C5)、シグレック−5(1A5)6、シグレック−7(S75a)7、シグレック−8(7C9)9、シグレック−9(KALLI)11、シグレック−10(5G6)12、とシグレック−11(4C4)13。IgG2cである4C4を除いて、全てマウスIgGlである。プロテインGセファロース(Sigma, dorset, UK)を使って、組織培養上澄み液からIgGsを浄化し、フルオレセイン5イソチオシアネート(異性体1)(FITC)(Invitrogen, Dorset, UK)で標識した。抗シグレック−5と抗シグレック−7IgGsをEZリンクビオチン(Pierce, Rockford)で標識し、抗CD33、抗シグレック−8、抗シグレック−9IgGsをアレクサ・フルオール488(Invitrogen)で標識した。以下の商用Absも使用した:。抗CD33ビオチン(WM53, Serotec, Oxford, UK)、抗CD33APC(WM53, Serotec)、抗シグレック−6(E20-1232, BD Pharmingen, Oxford, UK)、抗CD34ビオチン(QBEND, Serotec)、抗CD14PE(Caltag-Medsystems, Buckingham, UK)、抗CD38ビオチン(HIT2, Caltag-Medsystems)、抗CD123ビオチン(6H6, eBioscience, San Diego, USA)、抗CD117(104D2, Caltag-Medsystems)、抗マウス免疫グロブリンFITC(DAKO, Ely, UK)。
氷の上で、45分間、3−4×105細胞を指示mAb飽和濃度で染色した。洗浄後、氷の上で、30分間、ストレプトアビジンAPCまたはPEで培養し、さらなる洗浄工程を経て、0.25%ウシ血清アルブミン、10mM窒化ナトリウム、7アミノ・アクチノマイシンD(7−AAD)を含むPBSで再懸濁した。シグレック−6染色について、細胞を飽和レベル浄化シグレック−6mAbで培養し、続いて、抗マウスIgG−FITCで培養した。フローサイメトリ分析は全て、FACSキャリバーまたはLSRフローサイメトリ(BD Biosciences)とCellQuestソフトウエアを使って実行した。全ての例において、イソタイプ対照標識細胞を99%以上含むように負の象限を設定し、生育不可能な7−AAD陽性細胞は全てのFACS分析から規定通りに除外した。
AML細胞と正常骨髄細胞を抗シグレック−9IgG−FITCで標識し、続いて、抗FITC結合常磁性マイクロビーズに晒し、AutoMACSシステム(Miltenyi Biotech, Bisley, UK)を使って、製造者の指示に従って、磁気的に陽性断片と陰性断片に分類した。分離した細胞断片の純度は、フローサイメトリによると概ね90%と評価された。サイトプシンを調整し、メイ・グリュンワルド・ギムザで染色した。無作為に選択した領域からの画像を、63×1.25のオイルレンズ(Zeiss, Jena, Germany) とアキシオビジョン(Axiovision)3.0ソフトウエアを使ってアキシオスコップ(Axioskop)(Zeiss)顕微鏡で撮影した。製造者の指示に従って、白黒基準を設定し、露出時間は1273msとした。
AML細胞と正常骨髄細胞を抗シグレック−9FITCで標識し、FACSVantageSE(FACS Vantage SE)(BD Biosciences)を使って、製造者の指示に従って、陽性断片と陰性断片に分類した。陽性断片の純度は、常時、95%を越えていた。コロニー形成能力における抗シグレック−9mAbの潜在的効果を制御するために、培養または抗シグレック−9FITCで培養していない非分類細胞を全ての実験に含めた。FACS分類細胞と対照Ab培養細胞をメチルセルロース培地(HSC-CFU complete with erythropoietin, Miltenyi Biotech)で14日間、37℃、5%Co2で培養し、製造者の指示に従って、CFU−E、BFU−E、CFU−G、CFU−M、CFU−GM、CFU−GEMMの数を調べた。正常な骨髄細胞についても同じ培養条件を使って、記載(参考文献19)通りにCFU−ブラストアッセイを実施した。
細胞を氷の上で、抗シグレック−9−アレクサ−488mAbで45分間標識した。細胞を洗浄し、60分または240分間、氷の上、もしくは、37℃で5%Co2の完全培地で培養した。各時点で、チューブを氷に置いて内在化を停止させた。全ての培養が終了した時点で、細胞表面に残留する抗シグレック−9−アレクサ−488mAbのレベルを、やぎ抗マウスIgG−APCを使ってFL−4チャンネルで3通り検出した。細胞関連アレクサ−488標識抗シグレック−9mAb(表面および内在化)の全量をFL−1チャンネルで測定した。抗シグレック−8−アレクサ−488mAbをイソタイプ対照として用いた。抗シグレック−9で獲得したFL−4中央値蛍光度(MFI)を抗シグレック−8で獲得したFL−4MFIから差し引くことで、内在化を定量化した。実験の間中、氷の上に保存した細胞のFL−4MFIの数値を100%とした。対応するFL−1MFI値を使って、同様に、細胞関連抗シグレック−9mAbを計算した。
野生型またはチロシンからフェニルアラニンへの突然変異体のシグレック−9(参考文献15)を発現するラット好塩基球性白血病(RBL)粘着細胞を8−ウエル・チャンバ・スライド(NalgeNunc International, VWR, Leics, UK)で培養し、氷の上で1時間、抗シグレック−9−アレクサ−488mAbで培養した。洗浄後、細胞を氷の上の完全培地または37℃で指示時間、5%Co2で培養した。細胞を氷の上に置いて内在化を停止させ、原形質膜を5μg/mlコレラトキシンBサブユニット−アレクサ−594(Invitrogen)で標識した。洗浄後、細胞を室温にて10分間、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、ベクタシールド・マウント培地(Vectashield Mounting Medium)DAPI(Vector Laboratories, Peterborough, UK)に乗せた。63×1.4オイルレンズを備えたレイカSP2AOBS焦点顕微鏡(Leica, Heidelberg, Germany)でスライドを検査した。異なる蛍光レベルの励起/放出は以下の通りである:アレクサ−488、励起:488nm/検出放出:503−585nm;アレクサ−594、励起:594nm/検出放出:611−689nm;DAPI励起:405nm/検出放出:410−527nm。全ての画像は、アドフォトショップCS(Adobe Photoshop CS)を使って処理した。
酵素結合免疫吸着検査(ELISA)キットを使って、製造者(R & D Systems, Abingdon, UK)の指示に従い、可溶性シグレック−5とシグレック−9のレベルを測定した。当研究所内(in house)でELISAを開発して、CD33を測定した。pH9.6の炭酸緩衝液中の4μg/mlの精製6C5抗CD33mAbを、4℃で、一晩イミュロン4ELIZAプレート(Immulon 4 ELIZA plates)(Dynatech, Chantilly, VA)に塗布し、続いて、緑色蛍光タンパクを高めるのに溶融したCD33細胞外領域を備えるCD33スタンダードもしくは検査試料に晒した。室温で1時間後、ウェル(wells)を洗浄し、親和性精製したラビット抗CD33で培養し、ヤギ抗ラビット・ホースラディッシュペルオキシダーゼに晒した。450nmで測定した吸光度とO−フェニルアミン・ジアミンを使って、ELISAを開発した。2つの独立した検定法において2つの異なる希釈度で3回にわたり、全試料を分析した。
[AMIにおけるCD33関連シグレックの発現パターンの特性付け]
21個の低温保存したAML細胞試料についてCD33関連シグレックの発現を検査するのに、当研究所内で生成した抗シグレックmAbをFITCで標識し、正常白血球の着色で決定したように飽和濃度で使用した。抗シグレックmAbの各々について、ストレプトアビジンAPCで検出したビオチン化商業用抗CD33mAb(biotinylated commercial anti-CD33 mAb)を使って2色着色を施し、フローサイメトリで試料の分析を行った(表2)。予想したように、FITC標識1抗CD33mAbによる1ステップ着色は直接標識mAbの全般的な低感度を反映して、2ステップ着色と比べて、低レベルの標識をもたらした(表2)。シグレック陽性細胞の百分率に大きなばらつきが観察されたが、各シグレックは、AML細胞のCD33+部分集合内で一定して発現した(図1)。FITC標識mAbを使って、5%カットオフを行ったところ、21個の試料中、17個がCD33を発現し(中央値%が37;中央値MFIが25)、12個がシグレック−5を発現し(中央値%が13.5;中央値MFIが27.5)、11個がシグレック−9を発現し(中央値%が25;中央値MFIが37)、5個がシグレック−7を発現し(中央値%が28.5;中央値MFIが22.5)、2個がシグレック−10を発現した(中央値%が10.4;中央値MFIが21)。分析した試料の何れでもシグレック−8とシグレック−11は見つからず、僅かなレベルのシグレック−6の発現が1例認められた(表2)。CD33を除いて、CD33関連シグレックでは、陽性細胞の比率と陽性部分集合のMFI数値の両方の観点からシグレック−9の発現が最も顕著であった。分析の結果、7つの事例で、CD33と近い、あるいは、これより高比率のAML細胞の発現が認められた(表2)。AML細胞に複数のCD33関連シグレックが明確に検出された代表例(XXI、表2)を図1に示す。
複数のAML細胞で比較的高いシグレック−9の発現が見られた。これは、ある種のAMLの亜型では、このシグレックが有効なマーカおよび潜在的な治療標的となり得ることを示唆する。シグレック−9のAML部分集合をさらに特性付けするために、付加的な形質分析を行ったところ、シグレック−9+細胞の大部分は、CD38−,CD123+/−,CD117+,CD14+であった(図3A)。さらに、白血性幹細胞(LSC)で発現することが知られる(参考文献20)CD34[分類II]の発現について、CD33+とシグレック−9+細胞を比較した。その結果によると、分析した10個の試料のうち8個で、ごく僅かなシグレック−9+細胞がCD34を発現した。これは、高い確率でCD34+細胞を検出したCD33とは相違する(図3B)。これらを組み合わせてみると、シグレック−9+細胞の免疫形質が、単球細胞と一致することが分かった。この発見を、分類したシグレック−9+とシグレック−9−AML細胞のメイ・グリュンワルド・ギムザ染色によって確認した(図4A)。
CD33とシグレック−5を除いて、正常骨髄細胞でのCD33関連シグレック系統群の発現プロファイルに関する詳細な報告はなかった。これは、細胞障害効果から正常な始原細胞を守るのに望ましいAML細胞のAb媒介性標識の状況において、とても重要である。それぞれ、SSClow(図5、R2)、SSCmedium(図5、R3)、SSChigh(図5、R4)の側方散乱(SSC)特性(参考文献21)に従って、フローサイメトリにより正常な骨髄細胞の3つの系統群を定義した。分析した4個の正常骨髄試料中、CD33関連シグレックの発現は、SSCmediumとSSChigh集団にほぼ限定されていた。代表的な例を図5に示す。SSCmedium細胞の大部分は、CD33とシグレック−9について強い陽性を示し、シグレック−5とシグレック−7について弱い陽性を示した。対照的に、SSChigh細胞は、CD33とシグレック−5について弱い陽性を示し、シグレック−9については、大部分が陰性を示した(図5)。多色標識の結果、SSCmedium、CD33high、シグレック−9+系統群(図6A,ゲート1)もシグレック−5とシグレック−7を共発現することが分かった。対照的に、SSChigh、CD33low、シグレック−9+(図6A,ゲート2)細胞は、シグレック−5だけ陽性で、シグレック−7については陰性だった。CD38−,CD123+/−,CD14+,CD34−(図6B,6C)についてグレック−9+系統群をさらに定義した。精製したグレック−9+系統群のメイ・グリュンワルド・ギムザ染色(図4B)と併せて考慮すると、正常骨髄におけるシグレック−9+細胞は、単球系統の未熟細胞が支配的であることを示唆する。CD34+細胞の実験結果は、シグレック−9と同様で、シグレック−7はほぼ認められず、シグレック−5は、CD34+細胞の5%以下で検出され、CD33は、14%以下で検出された(図6C)。骨髄性始原細胞は、特質的に、CD34とCD33を発現する。正常骨髄におけるシグレック−9+細胞の大部分は、CD34−とCD33+であったが、CD34+細胞の小断片(1%以下)は、シグレック−9+であった(図6C)。始原細胞の部分集合がシグレック−9を発現したかどうかを調査するために、フローサイメトリによって、正常骨髄細胞をシグレック−9+とシグレック−9―細胞断片とに分類し、標準メチルセルロースベースのクローン化アッセイ(standard methylcellulose-based clonogenic assay)を使って、コロニー形成能力を計測した。2つの独立した実験の結果、シグレック−9陽性細胞断片は、コロニー化能力を持たなかったが、シグレック−9陰性細胞断片は、予想したレベルのBFU−E,CFU−E,CFU−G,CFU−GMを有していた(表3)。
シグレック−9の単球AML細胞における比較的高い発現と骨髄始原細胞での不在は、シグレック−9を、芽細胞の除去及び毒素デリバリによる患者の白血性細胞負荷の軽減を目指すmAbに基づく治療の新たな潜在的候補とする。これを効果的にするために、細胞表面への結合により抗シグレック−9mAbを内在化させることが重要である。mAb内在化を分析するのに、フローサイメトリを開発し、細胞を氷の上でアレクサ488標識抗シグレック−9mAbで標識し、37℃で、時間を変えて培養した。結合したmAbの残余量を、APC標識抗マウスIgと、続いて、フローサイメトリを使って測定した。原始AML試料を使った3つの独立した実験の結果、37℃で40分以内に結合した抗シグレック−9mAbの30〜50%が内在化し、90%が240分以内に内在化した(図7A,左側のパネル)。細胞関連アレクサ488標識抗シグレック−9mAbの量は、実験期間を通じて一定であったため、表面の抗シグレック−9mAbの損失は、落下ではなく内在化によるものであった(図7B,左側パネル)。シグレック−9が抗シグレック−9mAbの内在化を仲介することを直接証明し、2個の細胞質チロシン系信号モチーフ(cytoplasmic tyrosine-based signaling motifs)(Y1とY2)の役割(参考文献15)を調査するために、フローサイメトリと共焦点顕微鏡を使って、シグレック−9安定感染RBL細胞における抗シグレック−9mAbの内在化を調べた。上述したAML細胞のアッセイと同様の検定法を使って、野性型またはY2F(膜遠位エンイチロシンのフェニルアラニンへの変化:membrane distal tyrosine changed to phenylalanine)突然変異シグレック−9を発現するRBL細胞は、似たような割合のエンドサイトーシスを示し、40分で40〜50%のシグレック−9の内在化が確認された(図7A,右側のパネル)。比較するために、シグレック−9Y1F(膜近位チロシンのフェニルアラニンへの変化:membrane proximal tyrosine changed to phenylalanine)変異体をよりゆっくりと内在化させた(図7A,右側のパネル)。実験期間を通じて、自動蛍光(autofluoresence)のゲインにより、細胞関連抗シグレック−9アレクサ488の全体量が若干増加した(図7B,右側パネル)。共焦点顕微鏡を使ってRBLによる内在化を確認した。1時間の培養後、野生型またはY2F型のシグレック−9については高レベルの内在化が見られたが、シグレック−9Y1F変異型は大部分が細胞表面に留まった(データ付加図)。実験結果は、シグレック−9の膜近位ITIMに最適エンドサイトーシスが必要で、CD33に関する過去の研究(参考文献16)と一致することを示す。
抗シグレック−9mAbがインビボの標的AML細胞で効果的に機能するには、高レベルの抗シグレック−9が血漿中に存在しないことが重要であり、これは、注入されたAbを中和させて、治療効果が下がるのを防ぐためである。実際、血液中のCD33の抗原負荷が高いと、マイロターグ治療に続く臨床的成果に顕著な影響を及ぼす可能性がある(参考文献22)。そこで、我々は、M4/M5FAB状態を呈する数人と高レベルのシグレック−9+AML細胞(表2の試料XIII)を有する1人(表4、AP3)を含む8人のAML患者から採取した骨髄血漿中の可溶シグレック−9のレベルを調べた。また、比較できるように可溶CD33とシグレック−5も測定した。6人の患者の血漿中に、検出不可能なレベルの可溶シグレック−9が存在し(検出限界1.25ng/ml)、2人の患者からは、低レベル(−4ng/ml)の可溶シグレック−9を検出した(表4)。一方、低レベルから中程度の(4〜30ng/ml)の可溶CD33を8人の患者全員で確認し、うち7人の患者から、500ng/ml以内のレベルのシグレック−5が容易に検出された(表4)。正常な骨髄血漿または血清試料では、シグレック−9は検出できなかったが、シグレック−5は、1例を除いて全検体から検出された。CD33は、3個の正常骨髄血漿試料のうち1つの試料と、全ての正常血清試料とで検出された。全般的に、AML試料におけるシグレック−5とCD33のレベルは、比較グループのそれより高く、これは、各患者の循環血液の白血球の数とある程度の相関性があった(表4)。
本明細書は、AMLにおけるCD33関連シグレックの発現を初めて総合的に分析したものである。この検査の目的は、疾病を監視するマーカまたは治療用標的として臨床的に使用可能な付加的なCD33関連シグレックがあるかどうかを決定することにあった。CD33は別として、シグレック−9は興味深い新候補として際立ち、21個のAML検体中7例でCD33と同等のレベルで存在した。CD33関連シグレックについて、正常骨髄細胞における発現プロフィールを比較したところ、シグレック−9はCD33とは対照的に、骨髄性始原細胞には存在しないが、単球系統の未熟細胞ではCD33と等しいレベルで存在した。この実験結果は、抗シグレック−9がAML細胞によって急速に内在化し、血漿中には有意なレベルで存在しないことを証明した。この発見は、抗シグレック−9が単独もしくは抗CD33mAbに基づく療法を含むその他の治療と組み合わせてAMLの治療目的に使用できる可能性を示唆する。
Claims (8)
- 急性骨髄性白血病(AML)の治療薬剤製造のための、シグレック−9と特異的に結合し、薬剤の担体である抗シグレック−9抗体の使用。
- 請求項1に記載の使用であって,
前記抗シグレック−9抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である使用。 - 請求項2に記載の使用であって,
前記抗体が、補体媒介性細胞傷害活性又は抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)を誘発しない使用。 - 請求項2に記載の使用であって,
前記抗体がヒト化抗体である使用。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の使用であって,
前記抗体が、
(i) F(ab)2フラグメント;
(ii) Fabフラグメント;及び
(iii) 領域抗体(ナノボディ)、
からなる群から選ばれる抗体断片である使用。 - 請求項1〜5のいずれかに記載の使用であって,
前記抗シグレック−9抗体が、一旦結合すると細胞の内部に内在化するか、細胞内の区画または小胞に送られて内在化する使用。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の使用であって,
前記抗シグレック−9抗体は、カリケアマイシン-γ1と接合する使用。 - シグレック−9と特異的に結合し、薬剤の担体である抗シグレック−9抗体を含む、
急性骨髄性白血病(AML)の治療剤。
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