JP5725693B2 - シグレック−９シアル酸結合剤 - Google Patents

Description

本発明は、細胞表面マーカであるシグレック−９に結合する試薬と、当該試薬を細胞増殖性障害の治療と検定に使用することに関する。

シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（以下、これをシグレックと略す）は、造血系細胞を含む多数の細胞によって発現されるI型レクチンである。シグレックは、多数の分子群を含み、個々の分子群には、シアン酸結合を仲介してから免疫グロブリン様領域のＣ２−セット数を変えるところの、Ｎ末端Ｖ−セット免疫グロブリン様領域が存在している特徴がある（参考文献４）。

ＣＤ３３シグレックとＣＤ３３関連シグレックは、１１種のヒトシグレックのうち８種を含む。これらの分子は、高度な配列類似性を共有しているものの、哺乳類種の間では組成の点で有意差がある。これらの受容体をコード化した遺伝子は、染色体１９ｑ１３．３−１３．４上に密集し、造血系及び免疫系で支配的に発現していると思われる。また、前記の遺伝子は、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、樹状細胞を含む先天性免疫システムの殆どの成熟細胞で、差次的発現パターンを示す（参考文献６−１４）。全てのヒトＣＤ３３関連シグレックは、細胞質尾部に、保存膜近位の免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を保持しているだけでなく、保存膜遠位のＩＴＩＭ様モチーフを保持している（参考文献５）。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または前駆細胞の異常増殖及び異常分化に由来する血液悪性腫瘍の一つである（参考文献１）。ＡＭＬの場合、細胞が正常で成熟した血液細胞に分化ができなくなり、無制限に増殖する。その結果、未熟な骨髄細胞または芽細胞が蓄積されて急速に骨髄に取って代わり、赤血球、白血球、血小板の産生が減少する。赤血球の減少は、貧血、感染、出血などの合併症を招く虞がある。場合によっては、芽細胞がリンパ系、脾臓、その他の主要臓器に侵入することもある。

フランス・アメリカ・イギリス（ＦＡＢ）（参考文献２）から世界保健機構（参考文献３）に発展した分類システムによって、ＡＭＬは形態的特徴と遺伝子的特徴の組合せで分類される。この分類システムは、主な白血病性（芽球）細胞の分化状態を説明する。分化の度合いは、サブタイプＭ０，Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３と共に上昇し、一方、サブタイプＭ４とＭ５は大多数が単球系統であり、サブタイプＭ６とＭ７は、それぞれ赤血球と巨核球の特徴を有する（参考文献２７）。

白血病は、正常な造血幹細胞（ＨＳＣ）と相似するが、器官形成の調節プロセスを妨げ、異常を来たす白血性幹細胞（ＬＳＣ）の始まりとなる異常造血組織として説明できる。目下、ＣＤ３４^＋，ＣＤ３３⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ７１⁻，ＣＤ１１７^＋／−，ＣＤ１２３⁻，Ｌｉｎ^―、は正常な造血幹細胞と見なされ、ＣＤ３４^＋，ＣＤ３３^＋／−，ＣＤ３８⁻，ＣＤ７１⁻，ＣＤ１１７^＋/−，ＣＤ１２３^＋，Ｌｉｎ^―、は白血性幹細胞（ＬＳＣ）と見なされる。ＨＳＣの突然変異または初期の原型がＬＳＣの発育をもたらし、これは、自己再生能力を有する。ＬＳＣは、白血性芽細胞の繁殖と分化に携わる分化始原細胞を増殖する。

ＡＭＬ細胞におけるＣＤ３３の排他的な存在は、ＡＭＬ細胞と抗体療法の標的の検出に有効なマーカを提供する。マイロターグ（Mylotarg^?）は、以下の化学療法で再発AMLの治療薬として認可された有効抗生物質カリケアマイシン-γ１（Calicheamicin-γ_１）と結合させたヒト型抗ＣＤ３３モノクローナル抗体である。

本発明は、ＣＤ３３関連シグレック、シグレック−９が正常な骨髄原型には存在しないが、ＡＭＬで発現するため、細胞増殖性及び／又は細胞分化性障害の治療の潜在的な新標的を提供する可能性あるという発明者の観察に基づく。具体的には、シグレック−９は、深刻な障害（Ｍ４とＭ５ＦＡＢ分類）と関連するＡＭＬ細胞のサブセットで発現することに気づいた。さらに、ＣＤ３３やシグレック−５とは違い、骨髄血漿におけるシグレック−９のレベルは低いか、検出不能であった。

本発明の目的の１つは、例えば、急性骨髄性白血病などの細胞増殖性及び／又は細胞分化性障害の治療に付加的な手段を提供し、先行技術に伴う課題を軽減または克服することにある。

本発明の一つは、細胞増殖性及び／又は細胞分化性障害の治療薬製造におけるシアル酸免疫グロブリン様レクチン−９（シグレック−９）結合剤の使用を提案する。

"細胞"なる用語は、シグレック−９を表現またはシグレック−９^＋である細胞または細胞型を意味している。特に、"細胞"なる用語は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＣＤ１６^＋＋／ＣＤ５６⁻及びＣＤ１６^＋／ＣＤ５６^＋）、単核細胞、マクロファージ、好中球などの末梢血のような免疫システムの細胞を意味する。さらに、"細胞"なる用語には、例えば、造血幹細胞などの骨髄細胞も含まれる。

また、"細胞増殖性及び／又は細胞分化性障害"なる用語は、癌のような疾病を含む。特に、"細胞増殖性及び／又は細胞分化性障害"は、単球性、マクロファージ、組織球性の悪性障害などを含む悪性血液に関係し、急性ミエロイド性白血病（AML）もこれに含むことができる。表１は、本発明で使用する"細胞増殖性及び／又は細胞分化性障害"なる用語が定義すると見なされる疾病を一覧にしたものである。

本発明の結合剤は、シグレック−９と結合または協働し、例えば、小さな有機分子、ペプチド、炭水化物、抗体などを含んでも構わない。

結合剤は、好都合に、特に、シグレック−９と結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの抗体であっても構わない。抗体は、好都合に、補体媒介または抗体依存性細胞障害反応（ＡＤＣＣ）を誘導しない。モノクローナル抗体を生成するのに使用する技術は公知で、典型的なモノクローナル抗体は、１９９６年刊行のＺｈａｎｇ他著の文献に記載されている（J. Biol. Chem 225：22121−22126）。さらに、当業者であれば、例えば、抗体のＨ鎖やＬ鎖の除去や、分子の"ヒト化"の場合、分子をコードする核酸の修正などにより、本発明の抗体（またはその他の結合剤）をさらに変更することができる。

"結合剤"なる用語が、シグレック−９と結合または協働する能力を保持するその断片（fragments）も含むことは理解されよう。例えば、抗体をペプシンで処理することでＦ(ａｂ)_２フラグメントが生成できるように、抗体は容易に断片化できる。Ｆａｂフラグメントを生成するために、Ｆ(ａｂ)_２フラグメントを処理してジスルフィド・ブリッジを減少させても構わない。抗体の断片化にその他の技術を利用して、分子の相補性決定領域(ＣＤＲ)だけを備えるようもできる。当該技術分野では、こうした抗体断片は"領域抗体"または"ナノボディ（nanobodies）"として知られている。

本発明の抗体は、任意の種、特に、馬やヒト、またはウサギ、ネズミ、ハツカネズミなどのげっ歯類などの哺乳類に由来する。好都合に、抗体を修正して、"ヒト化"させても構わない。ヒト以外の種に由来する抗体のヒト化技術は当該分野で公知である。さらに、特定の抗体をコードする核酸を分離・操作し、例えば、結合特性の改善、分子の大きさ及び／又は構造の"ヒト化"または調節も可能である。例えば、抗シグレック−９抗体のようなシグレック−９結合剤をコードする核酸を、特定領域を除去することで分離させ、例えば、抗体の可変領域などの特定部位を構成する分子を減少させることもできる。また、分子を構成する残基を変えて、結合特性及び／又は結合構成を調整することもできる。

あるいは、シグレック−９の結合剤に、シグレック−９の天然リガンド、または、その断片、アナログ（analogue）、もしくは一部を含んでも構わない。例えば、シグレック−９の結合剤は、シアル酸から成る炭水化物を含んでも構わない。また、例えば、ペプチドファージディスプレイライブラリ、グリコペプチドライブラリまたはＦＶファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることでその他のペプチドや炭水化物リガンドを容易に識別できる。

シグレック−９結合剤は、シグレック−９の活性の調節及び／又は、異常増殖・分化細胞や変異増殖・分化細胞を含む細胞の増殖及び／又は分化状態を調節できる。"異常増殖・分化細胞や変異増殖・分化細胞"が、正常または適切な増殖・分化細胞と比較して、制御レベル外にあることは理解されよう。

細胞が示す増殖レベルは、従来技術による手段で試験できる。例えば、[３Ｈ]チミジンなどの放射性ヌクレオチドアナログの新しい合成核酸への融合レベルを細胞の増殖状態の指標として使用しても構わない。あるいは、例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）のような非放射性ヌクレオチドアナログを細胞増殖の指標として使用しても構わない。新しい合成ＤＮＡに取り込む放射性アナログの量は、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィ手段で決定しても構わない。非放射性ヌクレオチドアナログを使用する場合（例えば、ＢｒｄＵ）、ヌクレオチドアナログと結合する抗体やその他の分子を使って、新しい合成核酸に取り込むアナログレベルを決定しても構わない。培養して細胞の自己保存及び増殖能力を試験したり、増殖細胞の指標である特定の抗原やマーカの存在を検出したりすることで細胞の増殖状態を決定しても構わない。同様に、特定マーカの存在や形態分析で細胞の分化状態を決定しても構わない。さらに、例えば、カルボキシルフルオレセイン・ジアセタート・スクシンイミジル・エステル｛（carboxyfluorecein diacetate succinimidyl ester）（ＣＤＳＥ）｝のような蛍光色素の添加やフローサイトメトリーを使用して細胞の特定個体群の増殖を監視することもできる。このような場合、細胞が増殖すると、細胞ごとの色素レベルは分裂のたびに減少する。

好ましくは、一旦結合したシグレック−９結合剤は内在化し、結合剤は細胞内部、細胞内の区画（compartment）または小胞（vehicle）に送られる。本発明の一実施例においては、シグレック−９結合剤が自身の内在化を開始したり、影響を与えたりしても構わない。もしくは、結合剤はシグレック−９と結合または協働し、内在化しなくても構わない。このように、シグレック−９結合剤は、細胞の増殖及び／又は分化状態を調節する一方、細胞表面に結合または内在化できる。

好都合に、シグレック−９結合剤は、シグレック−９と相互作用・結合あるいは協働可能な結合部位と、細胞の増殖及び／又は分化状態を調節可能な活性部位とを備えても構わない。結合剤の活性部位は結合部位と、例えば、融合、連結、結合、接合、一体化、または協働可能で、その後、これらの部位は"連結"していると見なされる。

結合剤の活性部位は、付加的または択一的に、シグレック−９結合剤の結合部位と連結する、例えば、小さな有機分子、ペプチド、炭水化物、拡散などの異種分子（a heterologous molecule）を備えても構わない。

分子同士の融合、連結、結合、接合、一体化、または協働に使用する技術は、当該分野において公知で、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（"Antibodies: A laboratory Manual"）やＢ.Ｌｏ（"Antibody Engineering: Methods and Protocols"）に記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ（"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"）が開示する組換え技術によって、例えば、ペプチドのような分子を抗体と融合、連結、結合、接合、一体化、または協働させても構わない。あるいは、特定の条件下において、結合させる分子に適当な調整を行った後に分子間の共有結合相互作用（covalent interaction）を確立しても構わない。

好都合に、シグレック−９結合剤の結合部位と活性部位とを連結させ、特定の条件または作用物質にさらされると、連結分子が分離するようにもできる。この場合、シグレック−９結合剤の結合部位と活性部位を、塩の濃度、pＨ及び／又は温度等の環境条件における変化や酵素的開裂に敏感な部位を備える連結領域で連結させても構わない。こうした連結部位は当該分野では公知で、例えば、ｐＨの変化に応答してシグレック−９結合剤の結合部位から活性部位の加水分解の発生に影響する成分を含んでも構わない。

従って、シグレック−９結合剤が細胞の増殖及び／又は分化状態を調節可能な場合、"活性部位"なる用語は、シグレック−９の結合剤全体を指すと見なすことができる。あるいは、"活性部位"なる用語は、この結合剤の一部を指すと見なしても構わない。さらに、"活性部位"は、本明細書及び先行技術が開示する任意の手段でシグレック−９結合剤と結合する分子や異種を意味しても構わない。

ひとたびシグレック−９と結合すると、シグレック−９結合剤の活性部位は、好都合に内在化し、その活動は細胞内部に向けられる。あるいは、シグレック−９結合剤の活性部位は細胞表面またはその近辺に留まり、細胞の増殖及び／又は分化状態を調節しても構わない。

活性部位を、例えば、細胞の異常または変異増殖及び／又は分化の静止や消滅に役立てることができる。本発明の一実施例では、活性部位は、例えば、細胞代謝のアスペクトを調節したり、細胞死に至らしめたりできる。例えば、重金属、毒素、類毒素、または、プログラム式細胞死経路（programmed cell death pathways）（細胞自滅）を活性化させて有毒物質や細胞毒に晒した結果として細胞死に至らしめても構わない。また、例えば、細胞溶解や、細胞代謝の１つまたは複数のアスペクトの調節、及び／又は、細胞膜ポンプ・トランスポータなどの細胞システムの調節でも細胞死を引き起こすことができる。

シグレック−９結合剤の活性部位は、細胞死を招く細胞毒成分を備えても構わないし、特定の経路、タンパク質、分子や核酸を非活動状態にしたり、抑制または調節したりして、細胞が正しく機能できないようにすることもできる。また、シグレック−９結合剤が特定の代謝経路率を加減しても構わないし、特定のタンパク質、核酸、その他の分子の生成を調節して、細胞が正しく機能できないようしても構わない。

本発明のシグレック−９結合剤は、特に、タンパク質及び／又は核酸合成を調節する作用因子を含んでも構わない。例えば、結合剤が特定の酵素やリボソームを調節または相互作用するようにしても構わない。

無細胞シグレック−９のレベルはその他の関連シグレックよりかなり低いため、シグレック−９を本発明の結合剤の標的分子として用いると特に有効である。"無細胞シグレック"は、全血血漿分画で検出可能で、かつ、細胞と協働しないシグレック分子を意味する。従って、"無細胞"シグレック−９を、"可溶性"または"血漿" シグレック−９と呼称しても構わない。一例として、血漿内で検出可能なシグレック−５とＣＤ３３のレベルは、シグレック−９のレベルより有意に高い。そのため、シグレック−９向きの特性を備える結合剤が、溶解性リガンドに吸収あるいは中和されることはあまりない。従って、シグレック−９結合剤は、その他のシグレック分子に特有の結合剤より効果が高い。

シグレック−９が深刻な障害に関係するＡＭＬ細胞のサブセットで発現することを観察してきた。そのため、シグレック−９を本発明の作用因子の標的分子として使用することで、深刻な障害（Ｍ４及びＭ５分類）の患者の識別や診断に役立てたり、深刻な疾病に有効な治療薬を提供したりできる。

本発明の一実施例では、シグレック−９結合剤の活性部位が細胞毒物質カリケアマイシン-γ１（Calicheamicin-γ_１）を含んでも構わない。

本発明の第２実施例は、細胞増殖性及び細胞分化性障害の治療ためのシグレック−９結合剤の使用を提供し、シグレック−９結合剤は、カリケアマイシン-γ１と共役するシグレック−９と特に結合する抗体を備えても構わない。

本明細書に開示するシグレック−９結合剤は、好都合に、薬剤として許容される担体、希釈剤または賦形済を備える無菌医薬組成物として調合できる。こうした薬剤として許容される担体、希釈剤または賦形済は、当業者には周知で、例えば、水、食塩水、食塩加リン酸緩衝液、ブドウ糖、グリセロール、エタノール、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清アルブミンなどの血清蛋白、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物(partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids)、乳酸、塩水、リン酸塩などの緩衝剤、あるいは、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、硫酸プロタミンなどの電解液、αサイクロデキストリン、βサイクロデキストリン、スルホンブチルエーテル_７−βサイクロデキストリン（sulfobutylether_７-βCyclodextrin）及びヒドロキシプロピル−β−メサイクロデキストリンなどのサイクロデキストリン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール(polyethylene glycon)、カルボキシメチルセルロースナトリウム(sodium carboxymethylcellulose)、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリエチレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、羊毛脂などの他、上記の組合せを含んでも構わない。

さらに、別の処理と組み合わせて、シグレック−９結合剤を投与しても構わない。例えば、例えば、シグレック−３または５など、他のシグレックを結合可能な薬剤と組み合わせて投与しても構わない。付加的に、または、択一的に、シグレック−９を、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、化学療法剤、免疫刺激薬または組成物（immunostimulaltory drug or compound）、オリゴヌクレオチド、シトキン、ホルモンなどと組み合わせて投与することもできる。

本発明の第２実施例は、細胞増殖性及び／又は細胞分化性障害を有する被験者を治療する方法を提供し、この方法は、シグレック−９を結合可能な薬剤を被験者に有効量投与することを含む。

本明細書に記載する薬剤は、１個または複数の結合剤を含むように調合しても構わない。例えば、１個または複数のシグレック−９結合剤、あるいは、１個のシグレック−９とシグレック−９^＋細胞の別の成分を結合可能なエージェントを薬剤に含んでも構わない。さらに、例えば、ＣＤ３３あるいはＣＤ３３関連のシグレックを結合可能なエージェントを含んでも構わない。

本発明の第３実施例は、シグレック−９を結合可能なエージェントを選別するための方法を提供し、この方法は、
ａ) 試験エージェントを細胞発現シグレック−９と接触させるステップと；
ｂ）試験エージェントとシグレック−９との相互作用を検出するステップと、から成る。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）、エリザ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫ブロット法などの技術で、分子間の相互作用を検出しても構わない。一実施例として、細胞発現シグレック−９またはシグレック−９分子を、例えば、マイクロタイタプレートの表面に接着または塗布しても構わない。その後、シグレック−９と試験エージェントの相互作用を生む環境下で細胞またはシグレック−９に試験エージェントを塗布しても構わない。適当な洗浄工程の後に、シグレック−９関連または試験エージェント関連の抗体を、そのエピトープとの相互作用を許容する環境下で添加しても構わない。その後、適当な手段で抗体−抗原相互作用を検出できる。例えば、抗体を、比色反応、化学発光反応、または生物発光反応によって抗体の結合レベルを報告可能な組成物と組み合わせても構わない。こうした組成物の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とアルカリ性ホスファターゼ（ＡｌｋＰ）があるが、これに限定されることはない。付加的または択一的に、例えば、"バンドシフト"（band shift）分析のような電気泳動技術で、試験エージェントとシグレック−９を決定しても構わない。一例として、シグレック−９と試験エージェントとの相互作用を容認する環境下で、最初に、試験エージェントをシグレック−９と接触させるか、または、培養させても構わない。このような培養期間が、シグレック−９／試験エージェント錯体の形成をもたらし、こうした錯体は、試料を電気泳動にかけることで、容易に検出可能である。具体的には、電気泳動による対照試料の移動と試料の移動とを比較することでシグレック−９／試験エージェント錯体の存在を検出できる。シグレック−９／試験エージェント錯体は、シグレック−９と試験エージェントを別個に電気泳動にかけたときより、移動が少ないと予想される。電気泳動による移動の変化は、"バンドシフト"として証明できる。"対照試料"は、電気泳動に先駆けて、シグレック−９または試験エージェントと接触させたシグレック−９または試験エージェントの試料を意味する。

上述した方法を変更して、シグレック−９と結合し、かつ、細胞の増殖及び／又は分化状態を調節可能なエージェントのスクリーニング法を提供できる。この方法は、
ａ）試験エージェントを細胞発現シグレック−９と接触させるステップと；
ｂ）ステップ（ａ）による細胞の増殖及び／又は分化を対照細胞のそれと比較するステップと、から成る。

ステップ（ａ）で使用する細胞が異常増殖細胞であっても構わないことは理解されよう。あるいは、この細胞は、正常増殖細胞または正常分化細胞であっても構わない。

"対照細胞"は、試験エージェントスクリーニング分析（ステップ２）で使用する細胞と関連し、試験エージェントに晒したり、接触させたりした細胞ではないことは理解されよう。

あるいは、この方法は、試験エージェントを既知のシグレック−９結合剤と融合、連結、結合、接合、合体、または協働させて"ハイブリッド"シグレック−９分子を形成し；細胞を"ハイブリッド" シグレック−９結合剤と接触させる付加的なステップを含んでも構わない。この方法では、上述したように、細胞の増殖及び／又は分化を対照細胞のそれと比較することにより、エージェントが細胞の増殖及び／又は分化状態を調節可能かどうかを決定できる。この独特な方法では、試験エージェントに晒されていない対照細胞の使用に加えて、既知のシグレック−９結合剤に晒されていない対照細胞を私用することが望ましい。こうすることで、細胞増殖または分化で観察された影響が試験エージェントによるものかどうかを決定できる。

上記に詳細に説明した技術を使って、細胞の増殖状態を決定することができる。すなわち、これは、放射性または非放射性ヌクレオチド類似体及び／又は増殖の特異な状態を指示する特定の抗原やマーカの検出を含んでも構わない。同様に、特定の細胞マーカの存在あるいは形態分析によって、細胞の分化状態を決定しても構わない。

本発明の第４実施例は、細胞増殖及び／又は分化障害が疑われる被験者から採取した試料から細胞増殖及び／又は分化障害を検出する方法を提供し、この方法は、
ａ) 患者から試料を採取するステップと；
ｂ）試料を、シグレック−９を結合可能なエージェントと接触させるステップと；
ｃ）結合エージェントとシグレック−９との相互作用を検出するステップと、から成る。

この方法は、被験者の試料から検出したシグレック−９のレベルを、対照試料に存在するシグレック−９のレベルと比較するステップをさらに備える。"対照試料"は、細胞増殖及び／又は分化障害の疑いが無い被験者またはソースの試料で、好ましくは、実施的に同一の組織または体液から採取する。

適当な試料は、特定の組織または体液の試料あるいは生体組織を含んで構わない。例えば、細胞を含む、骨髄、リンパ節、もしくは血液や唾液などの体液から採取した組織試料から胞増殖及び／又は分化障害を検出しても構わない。

本発明の第５実施例は、異常増殖及び／又は分化細胞を採取する方法を提供し、この方法は、
ａ) 支持体基質（a support substrate）上にシグレック−９結合剤を固定化するステップと；
ｂ）固定化したシグレック−９結合剤を細胞試料と接触させるステップと、から成る。

固体支持体は、例えば、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、アガロース／ポリアクリルアミド、共重合体、デキストラン、セルロース、ポリプロピレン、ポリカーボネット、ニトロセルロース、ガラスペーパー、あるいは、適当な固体支持体を提供可能なその他の任意の物質であっても構わない。

固体支持体は、好都合に、アマーシャムバイオサイエンス（Amersham Biosciences）などで入手可能な、クロマトグラフィーでの使用に適した顆粒、粉末、またはゲルの形式であっても構わない。

シグレック−９結合剤は、シグレック−９結合剤を固体支持体と結合させる手段を提供する結合部分（a binding moiety）をさらに含んでも構わない。こうした結合部分は、例えば、ペプチドやその他のビオチン／ステレプトアビジンなどの小さな化学的成分であっても構わない。

本発明の別の実施例によれば、結合部分は任意のオリゴペプチドＨｉｓ_ｎを備えることができる。このとき、ｎ＝４−２０で、好ましくは、ｎ＝５−１０、より好ましくは、ｎ＝６である。こうしたオリゴペプチドは、二価ニッケル（Ｎｉ）について高い親和性を有し、シグレック−９結合剤とニッケルキレート樹脂Ｎｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースとの結合を可能にする。

あるいは、本発明のさらに別の実施例によれば、シグレック−９結合剤を固体支持体と化学的に架橋結合させても構わない。例えば、Ａｘｅｎ他（１９６７年）が開示する臭化シアン（ＣＮＢr）を付加して固体支持体を活性化させることで、好都合に、シグレック−９結合剤を固体支持体と化学的に架橋結合させても構わない。すなわち、ＣＮＢrの付加により、固体支持体は、ｐＨ８−９で急速にポリペプチドの遊離アミノ酸グループに反応し、固体支持体と架橋結合する。このとき使用する固体支持体は、例えば、ＣＮＢr活性化アガロースなどのアガロースが好ましい。

シグレック−９結合剤の一部に反応する抗体またはその断片によって、好都合に、シグレック−９結合剤と固体支持体を結合させても構わない。好ましくは、抗体を適当な固体支持体と結合させる。この場合、有効な抗体またはその断片は、好都合に、シグレック−９結合剤に対して親和性があるモノクローナル抗体または断片であっても構わない。モノクローナル抗体の生成は当業者に公知である。

あるいは、細胞集団を含む試料または溶液からシグレック−９発現細胞を除去するのに上記の方法を使用しても構わない。こうして、細胞集団から異常増殖及び／又は異常分化する細胞を除去して、実質的に、正常増殖及び／又は正常分化する細胞から成る細胞集団を獲得することができる。この特定の方法で使用する細胞は、血液及び／又は骨髄から採取しても構わない。従って、患者、または急性骨髄性白血病などの細胞増殖及び／又は分化障害を有する被験者から採取した（あるいは提供された）細胞を含む試料は、異常増殖または異常分化する細胞を実質的に全て枯渇させることができる。細胞試料からこれらの細胞を除去したら、残りの細胞を患者及び／又は被験者に戻しても構わない。

細胞集団からシグレック−９発現細胞を除去するための方法は、ＣＤ３３を発現させる細胞を除去する工程と組み合わせても構わない。例えば、シグレック−９結合剤とＣＤ３３結合剤とを適当な基質上で固定化させても構わない。固定化したシグレック−９／ＣＤ３３結合剤を細胞集団を含む試料と接触させることで、ＣＤ３３及び／又はシグレック−９発現細胞がこの細胞集団から除去できる。また、細胞増殖及び／又は分化障害を患う人々に包括的な治療戦略を提供するために、こうした方法を化学療法と組み合わせても構わない。

発明の詳述

図を参照しながら、本発明を実施例の形で説明する。

図１はＡＭＬ細胞のＣＤ３３関連シグレックの発現を示す。試料ＸＸＩ（表２参照）から採取した単核ＡＭＬ骨髄細胞を抗ＣＤ３３ビオチンｍＡｂと指示ＦＩＴＣ標識抗シグレックｍＡｂとで染色し、続いて、ストレプトアビジンＡＰＣに晒し、フローサイメトリで分析した。７ＡＡＤで標識した生育不能細胞は、分析に含まなかった。左の象限は、イソタイプ対照で標識した細胞の９９％以上を含むように設定した。ＣＤ３３^＋／シグレック^＋細胞の百分率を示す。

図２は、ＡＭＬ細胞のシグレック−９陽性部分集合上のシグレック−７とシグレック−５の共発現を示す。試料Ｉ（上のパネル）とＸＸＩ（下のパネル）（図２参照）の単核ＡＭＬ骨髄細胞を抗シグレック−９−ＦＩＴＣｍＡｂと、抗シグレック−５ビオチンｍＡｂ又は抗シグレック−７ビオチンｍＡｂの何れかで染色し、続いて、ストレプトアビジンＡＰＣに晒し、フローサイメトリで分析した。

図３は、フローサイメトリによるシグレック−９陽性ＡＭＬ細胞の表現型特性付けを示す。
Ａ) 試料ＩＩ（図２参照）の単核ＡＭＬ骨髄細胞を、以下のｍＡｂの何れか１つと組み合わせた抗シグレック−９−ＦＩＴＣｍＡｂで染色した：抗ＣＤ３８ビオチン、抗ＣＤ１２３ビオチン（ストレプトアビジンＡＰＣが続く）、抗ＣＤ１１７−ＰＥ、抗ＣＤ１４−ＰＥ。
B) 単核ＡＭＬ骨髄細胞を、抗ＣＤ３４分類ＩＩ−ビオチンと組み合わせた抗ＣＤ３３ＦＩＴＣｍＡｂまたは抗シグレック−９−ＦＩＴＣｍＡｂで染色し、続いて、ストレプトアビジンＡＰＣに晒した。図２に３個のＡＭＬ試料を示す（上のパネル：試料Ｉ、２９％ＣＤ３４^＋；真ん中のパネル：試料ＩＩ、２．５％ＣＤ３４^＋；下のパネル：試料ＸＩＸ、３１％ＣＤ３４^＋）。
それぞれのドット・プロットについて、ダブル陽性細胞の百分率を示す。

図４は、ＡＭＬ細胞と正常骨髄細胞のメイ・グリュンワルド・ギムザ染色を示す。単核ＡＭＬ骨髄細胞（Ａ）と単核正常骨髄細胞（Ｂ）を、メイ・グリュンワルド・ギムザを使って染色したシグレック−９陽性および陰性分画に免疫磁気作用的（immunomagnetically）に保存した。シグレック−９陽性分画内の細胞を、単球系統細胞について濃縮した。

図５は、正常骨髄細胞上のＣＤ３３関連シグレックの発現を示す。単核骨髄細胞を指示ＦＩＴＣ標識ｍＡｂで染色し、フローサイメトリで分析した。
A) 前方散乱（ＦＳＣ）と側方散乱（ＳＳＣ）を比較したプロットが、３個の集団：Ｒ２、ＳＳＣ^ｌｏｗ；Ｒ３、ＳＳＣ^{ｍｅｄｉｕｍ}；Ｒ４、ＳＳＣ^ｈｉｇｈの定義を容認する。
B) 灰色のヒストグラムは、上記のように定義した細胞の３個の部分集団上で、指示ｍＡｂを使ったＣＤ３３関連シグレックの発現を示す。白色のヒストグラムは、イソタイプ対照による染色を示す。

図６は、正常骨髄におけるシグレック陽性部分集団の特性付けを示す。
Ａ) 骨髄細胞を、抗シグレック−５ビオチン又は抗シグレック−７ビオチンの何れかと共に抗ＣＤ３３−ＡＰＣおよび抗シグレック−９−ＦＩＴＣで標識し、続いて、ストレプトアビジンＰＥに晒した。２個のシグレック−９陽性集団を以下のように定義する：ゲート１、ＣＤ３３^ｈｉｇｈ、シグレック−９^＋；ゲート２、ＣＤ３３^{ｍｅｄｉｕｍ}、シグレック−９^＋。ヒストグラムは、各ゲート・サブ集団におけるシグレック−５とシグレック−７の発現を示す。
Ｂ) 骨髄細胞を、抗ＣＤ３８ビオチン又は抗ＣＤ１２３ビオチンの何れかと共に抗シグレック−９−ＦＩＴＣで標識し、続いて、ストレプトアビジンＡＰＣまたは抗ＣＤ１４−ＰＥに晒した。シングル及びダブル陽性細胞の百分率を示す。
C) 骨髄細胞を、ＣＤ３３−ＦＩＴＣ、抗シグレック−５−ＦＩＴＣ、抗シグレック−７−ＦＩＴＣ又は抗シグレック−９−ＦＩＴＣの何れかと共に抗ＣＤ３４ビオチンで標識し、続いて、ストレプトアビジンＡＰＣに晒した。ＣＤ３４^＋細胞をゲートし（Ｍ１、灰色のヒストグラム、左側パネル）、ＣＤ３３と、シグレック−５、シグレック−７、シグレック−９の発現についてそれぞれ分析した（灰色のヒストグラム、右側パネル）。イソタイプ整合対照（isotype matched control）によるＣＤ３４^＋細胞の標識を白色ヒストグラムに示す。

図７は、抗シグレック−９ｍＡｂの内在化を示す。
A) シグレック−９の野生型（ＷＴ）、（Ｙ１Ｆ）または（Ｙ２Ｆ）変異体（右側パネル）で安定して感染（transfected）させた試料ＸＶＩ、ＸＩＸ、及びＸＸＩ（左側パネル）またはＲＢＬ細胞から採取した単核ＡＭＬ骨髄細胞を氷の上で４５分間抗シグレック−９−アレクサ−４８８ｍＡｂで標識し、洗浄後に３７℃で４０分または２４０分培養した。やぎ抗マウスＡＰＣを使って、表面の残余抗シグレック−９ｍＡｂを検出した。表面に残った抗シグレック−９ｍＡｂ発現を値Ｂで始まる百分率でグラフに示す。
（Ａ）で説明したように内在化分析を行い、抗シグレック−９−アレクサ−４８８関連の全細胞レベルを各時点で評価した。右側パネルに見られる上昇は、ＦＬ−１チャンネルで検出したＲＢＬ細胞の自動蛍光における時間依存ゲインを表す。残余抗シグレック−９ｍＡｂ発現を開始値の百分率としてグラフに示す。

図８は、感染ＲＢＬ細胞による抗シグレック−９ｍＡｂ内在化の共焦点顕微鏡分析を示す。氷の上で、シグレック−９感染ＲＢＬ細胞のＷＴ(Ａ,Ｂ)、Ｙ１Ｆ(Ｃ)、Ｙ２Ｆ(Ｄ)変異体を、抗シグレック−９−アレクサ−４８８ｍＡｂで１時間培養し、洗浄後に３７℃（Ｂ、Ｃ、Ｄ）で１時間、あるいは氷の上で１時間（Ａ）培養した。氷の上で冷却して、コレラトキシンＢサブユニット・アレクサ５９４で標識した形質膜で内在化を停止させた。洗浄後に、細胞をパラホルムアルデヒド４％で固定し、共焦点顕微鏡で検査した。

〔試験材料と方法〕
[ＡＭＬ患者と正常骨髄及び血液ドナー]
ＡＭＬ患者から骨髄を採取し、説明後の承諾をもらって、人工股関節置換手術を行う健康な患者から骨髄試料を採取した。ＡＭＬ試料は、テイサイド癌組織バンク（Tayside Cancer Tissue Bank）に貯蔵した。研究は、貯蔵組織に関する研究の医学研究倫理の面からテイサイド癌組織委員会（Tayside Cancer Tissue Committee）を代表する同委員会によって承認された（承認番号０４／S１４０１／８５）。フィコール・パーク・プラス^TM（Ficoll−Paque ^TM Plus）（Amersham Biosciences, Bucks, UK）密度勾配遠心で単核細胞（ＭＮＣ）を浄化した。ＡＭＬ細胞アリコットを液体窒素に保存し、正常ＭＮＣを、直接、実験に用いた。低温保存した試料を解凍し、実験前に、ＦＣＳ２０％、ペニシリン／ストレプトマイシン１％、ＨＥＰＥＳ緩衝液１０ｍＭで補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｌグルタミンと共に）培地で９０分間、ＣＯ_２５％、３７℃で培養した（試薬は全てInvitrogen Gibco, Paisley, UKから入手）。凝固防止措置した全骨髄吸引物を遠心分離して、骨髄血漿を調整し、−８０℃で保存した。血清調合用の血液試料は、地域の倫理ガイドラインに沿って研究所の有志から採取した。

[抗体]
以下のＣＤ３３関連シグレックに特有のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を我々の研究所で生成した：ＣＤ３３（６Ｃ５）、シグレック−５（１Ａ５）^６、シグレック−７（Ｓ７５ａ）^７、シグレック−８（７Ｃ９）^９、シグレック−９（ＫＡＬＬＩ）^１１、シグレック−１０（５Ｇ６）^１２、とシグレック−１１（４Ｃ４）^１３。ＩｇＧ２ｃである４Ｃ４を除いて、全てマウスＩｇＧｌである。プロテインＧセファロース（Sigma, dorset, UK）を使って、組織培養上澄み液からＩｇＧｓを浄化し、フルオレセイン５イソチオシアネート（異性体１）（ＦＩＴＣ）（Invitrogen, Dorset, UK）で標識した。抗シグレック−５と抗シグレック−７ＩｇＧｓをＥＺリンクビオチン（Pierce, Rockford）で標識し、抗ＣＤ３３、抗シグレック−８、抗シグレック−９ＩｇＧｓをアレクサ・フルオール４８８（Invitrogen）で標識した。以下の商用Ａｂｓも使用した：。抗ＣＤ３３ビオチン（WM53, Serotec, Oxford, UK）、抗ＣＤ３３ＡＰＣ（WM53, Serotec）、抗シグレック−６（E20-1232, BD Pharmingen, Oxford, UK）、抗ＣＤ３４ビオチン（QBEND, Serotec）、抗ＣＤ１４ＰＥ（Caltag-Medsystems, Buckingham, UK）、抗ＣＤ３８ビオチン（HIT2, Caltag-Medsystems）、抗ＣＤ１２３ビオチン（6H6, eBioscience, San Diego, USA）、抗ＣＤ１１７（104D2, Caltag-Medsystems）、抗マウス免疫グロブリンＦＩＴＣ（DAKO, Ely, UK）。

[フローサイメトリ]
氷の上で、４５分間、３−４×１０^５細胞を指示ｍＡｂ飽和濃度で染色した。洗浄後、氷の上で、３０分間、ストレプトアビジンＡＰＣまたはＰＥで培養し、さらなる洗浄工程を経て、０．２５％ウシ血清アルブミン、１０ｍＭ窒化ナトリウム、７アミノ・アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を含むＰＢＳで再懸濁した。シグレック−６染色について、細胞を飽和レベル浄化シグレック−６ｍＡｂで培養し、続いて、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣで培養した。フローサイメトリ分析は全て、ＦＡＣＳキャリバーまたはＬＳＲフローサイメトリ（BD Biosciences）とＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを使って実行した。全ての例において、イソタイプ対照標識細胞を９９％以上含むように負の象限を設定し、生育不可能な７−ＡＡＤ陽性細胞は全てのＦＡＣＳ分析から規定通りに除外した。

［シグレック−９＋とシグレック−９−細胞のメイ・グリュンワルド・ギムザ染色］
ＡＭＬ細胞と正常骨髄細胞を抗シグレック−９ＩｇＧ−ＦＩＴＣで標識し、続いて、抗ＦＩＴＣ結合常磁性マイクロビーズに晒し、ＡｕｔｏＭＡＣＳシステム（Miltenyi Biotech, Bisley, UK）を使って、製造者の指示に従って、磁気的に陽性断片と陰性断片に分類した。分離した細胞断片の純度は、フローサイメトリによると概ね９０％と評価された。サイトプシンを調整し、メイ・グリュンワルド・ギムザで染色した。無作為に選択した領域からの画像を、６３×１.２５のオイルレンズ(Zeiss, Jena, Germany) とアキシオビジョン(Axiovision)３.０ソフトウエアを使ってアキシオスコップ（Axioskop）(Zeiss)顕微鏡で撮影した。製造者の指示に従って、白黒基準を設定し、露出時間は１２７３ｍｓとした。

［コロニー形成アッセイ］
ＡＭＬ細胞と正常骨髄細胞を抗シグレック−９ＦＩＴＣで標識し、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ（FACS Vantage SE）(BD Biosciences)を使って、製造者の指示に従って、陽性断片と陰性断片に分類した。陽性断片の純度は、常時、９５％を越えていた。コロニー形成能力における抗シグレック−９ｍＡｂの潜在的効果を制御するために、培養または抗シグレック−９ＦＩＴＣで培養していない非分類細胞を全ての実験に含めた。ＦＡＣＳ分類細胞と対照Ａｂ培養細胞をメチルセルロース培地（HSC-CFU complete with erythropoietin, Miltenyi Biotech）で１４日間、３７℃、５％Ｃｏ_２で培養し、製造者の指示に従って、ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭの数を調べた。正常な骨髄細胞についても同じ培養条件を使って、記載（参考文献１９）通りにＣＦＵ−ブラストアッセイを実施した。

［抗シグレック−９ｍＡｂ内在化のフローサイメトリ分析］
細胞を氷の上で、抗シグレック−９−アレクサ−４８８ｍＡｂで４５分間標識した。細胞を洗浄し、６０分または２４０分間、氷の上、もしくは、３７℃で５％Ｃｏ_２の完全培地で培養した。各時点で、チューブを氷に置いて内在化を停止させた。全ての培養が終了した時点で、細胞表面に残留する抗シグレック−９−アレクサ−４８８ｍＡｂのレベルを、やぎ抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣを使ってＦＬ−４チャンネルで３通り検出した。細胞関連アレクサ−４８８標識抗シグレック−９ｍＡｂ（表面および内在化）の全量をＦＬ−１チャンネルで測定した。抗シグレック−８−アレクサ−４８８ｍＡｂをイソタイプ対照として用いた。抗シグレック−９で獲得したＦＬ−４中央値蛍光度（ＭＦＩ）を抗シグレック−８で獲得したＦＬ−４ＭＦＩから差し引くことで、内在化を定量化した。実験の間中、氷の上に保存した細胞のＦＬ−４ＭＦＩの数値を１００％とした。対応するＦＬ−１ＭＦＩ値を使って、同様に、細胞関連抗シグレック−９ｍＡｂを計算した。

［共焦点顕微鏡検査による内在化の分析］
野生型またはチロシンからフェニルアラニンへの突然変異体のシグレック−９（参考文献１５）を発現するラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）粘着細胞を８−ウエル・チャンバ・スライド（NalgeNunc International, VWR, Leics, UK）で培養し、氷の上で１時間、抗シグレック−９−アレクサ−４８８ｍＡｂで培養した。洗浄後、細胞を氷の上の完全培地または３７℃で指示時間、５％Ｃｏ_２で培養した。細胞を氷の上に置いて内在化を停止させ、原形質膜を５μｇ／ｍｌコレラトキシンＢサブユニット−アレクサ−５９４（Invitrogen）で標識した。洗浄後、細胞を室温にて１０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ベクタシールド・マウント培地（Vectashield Mounting Medium）ＤＡＰＩ（Vector Laboratories, Peterborough, UK）に乗せた。６３×１.４オイルレンズを備えたレイカＳＰ２ＡＯＢＳ焦点顕微鏡（Leica, Heidelberg, Germany）でスライドを検査した。異なる蛍光レベルの励起／放出は以下の通りである：アレクサ−４８８、励起：４８８ｎｍ／検出放出：５０３−５８５ｎｍ；アレクサ−５９４、励起：５９４ｎｍ／検出放出：６１１−６８９ｎｍ；ＤＡＰＩ励起：４０５ｎｍ／検出放出：４１０−５２７ｎｍ。全ての画像は、アドフォトショップＣＳ（Adobe Photoshop CS）を使って処理した。

［可溶性シグレックの測定］
酵素結合免疫吸着検査(ＥＬＩＳＡ)キットを使って、製造者（R & D Systems, Abingdon, UK）の指示に従い、可溶性シグレック−５とシグレック−９のレベルを測定した。当研究所内(in house)でＥＬＩＳＡを開発して、ＣＤ３３を測定した。ｐＨ９.６の炭酸緩衝液中の４μｇ／ｍｌの精製６Ｃ５抗ＣＤ３３ｍＡｂを、４℃で、一晩イミュロン４ＥＬＩＺＡプレート(Immulon 4 ELIZA plates)（Dynatech, Chantilly, VA）に塗布し、続いて、緑色蛍光タンパクを高めるのに溶融したＣＤ３３細胞外領域を備えるＣＤ３３スタンダードもしくは検査試料に晒した。室温で１時間後、ウェル（wells）を洗浄し、親和性精製したラビット抗ＣＤ３３で培養し、ヤギ抗ラビット・ホースラディッシュペルオキシダーゼに晒した。４５０ｎｍで測定した吸光度とＯ−フェニルアミン・ジアミンを使って、ＥＬＩＳＡを開発した。２つの独立した検定法において２つの異なる希釈度で３回にわたり、全試料を分析した。

〔結果〕
［ＡＭＩにおけるＣＤ３３関連シグレックの発現パターンの特性付け］
２１個の低温保存したＡＭＬ細胞試料についてＣＤ３３関連シグレックの発現を検査するのに、当研究所内で生成した抗シグレックｍＡｂをＦＩＴＣで標識し、正常白血球の着色で決定したように飽和濃度で使用した。抗シグレックｍＡｂの各々について、ストレプトアビジンＡＰＣで検出したビオチン化商業用抗ＣＤ３３ｍＡｂ（biotinylated commercial anti-CD33 mAb）を使って２色着色を施し、フローサイメトリで試料の分析を行った（表２）。予想したように、ＦＩＴＣ標識１抗ＣＤ３３ｍＡｂによる１ステップ着色は直接標識ｍＡｂの全般的な低感度を反映して、２ステップ着色と比べて、低レベルの標識をもたらした（表２）。シグレック陽性細胞の百分率に大きなばらつきが観察されたが、各シグレックは、ＡＭＬ細胞のＣＤ３３＋部分集合内で一定して発現した（図１）。ＦＩＴＣ標識ｍＡｂを使って、５％カットオフを行ったところ、２１個の試料中、１７個がＣＤ３３を発現し（中央値％が３７；中央値ＭＦＩが２５）、１２個がシグレック−５を発現し（中央値％が１３.５；中央値ＭＦＩが２７.５）、１１個がシグレック−９を発現し（中央値％が２５；中央値ＭＦＩが３７）、５個がシグレック−７を発現し（中央値％が２８.５；中央値ＭＦＩが２２.５）、２個がシグレック−１０を発現した（中央値％が１０.４；中央値ＭＦＩが２１）。分析した試料の何れでもシグレック−８とシグレック−１１は見つからず、僅かなレベルのシグレック−６の発現が１例認められた（表２）。ＣＤ３３を除いて、ＣＤ３３関連シグレックでは、陽性細胞の比率と陽性部分集合のＭＦＩ数値の両方の観点からシグレック−９の発現が最も顕著であった。分析の結果、７つの事例で、ＣＤ３３と近い、あるいは、これより高比率のＡＭＬ細胞の発現が認められた（表２）。ＡＭＬ細胞に複数のＣＤ３３関連シグレックが明確に検出された代表例（ＸＸＩ、表２）を図１に示す。

未熟表現型（ＦＡＢ：Ｍ０，Ｍ１，Ｍ２）のＡＭＬ細胞と比べると、骨髄ボノブラスティック（myelomonoblastic）（ＦＡＢ：Ｍ４）及びボノブラスティック（monoblastic）（ＦＡＢ：Ｍ５）ＡＭＬ細胞でシグレック−５、７、９、１０の発現に増加が見られた（表２）。この結果は、先の研究が開示するＡＭＬ細胞におけるシグレック−５と７の発現と一致する（参考文献１７、１８）。細胞のＣＤ３３陽性部分集合上のシグレック−５、７、９の発現は、これらの分子が別個の部分集合ではなく、同じＡＭＬ細胞の部分集合と共発現する可能性を示唆する。この仮説を、複合パラメータフローサイメトリを使って、２個の異なるＡＭＬ試料で確認した（図２）。

［表２］一次骨髄ＡＭＬ細胞（primary bone marrow AML cells）におけるＣＤ３３関連シグレックの発現

表中、ＦＡＢはフランス・アメリカ・イギリス分類；ＭＦＩは陽性部分集合の蛍光強度中央値；（−）はシグレック陽性細胞の検出無し；−は適用外；ＮＤは決定せず、を意味する。＊２ステップは、ビオチン化Ａｂビオチン化で着色を実施した後、続いてストレプトアビジンＡＰＣ（ＣＤ３３）に晒すか、または、無標識Ａｂの後、抗マウスＦＩＴＣ（シグレック−６）で標識したことを意味する。†ＭＦＩ値は２６であった。

［シグレック−９＋ＡＭＬ細胞の免疫形質特性及びコロニー形成可能性］，
複数のＡＭＬ細胞で比較的高いシグレック−９の発現が見られた。これは、ある種のＡＭＬの亜型では、このシグレックが有効なマーカおよび潜在的な治療標的となり得ることを示唆する。シグレック−９のＡＭＬ部分集合をさらに特性付けするために、付加的な形質分析を行ったところ、シグレック−９^＋細胞の大部分は、ＣＤ３８⁻，ＣＤ１２３^＋／−，ＣＤ１１７^＋，ＣＤ１４^＋であった（図３Ａ）。さらに、白血性幹細胞（ＬＳＣ）で発現することが知られる（参考文献２０）ＣＤ３４［分類ＩＩ］の発現について、ＣＤ３３^＋とシグレック−９^＋細胞を比較した。その結果によると、分析した１０個の試料のうち８個で、ごく僅かなシグレック−９^＋細胞がＣＤ３４を発現した。これは、高い確率でＣＤ３４^＋細胞を検出したＣＤ３３とは相違する（図３Ｂ）。これらを組み合わせてみると、シグレック−９^＋細胞の免疫形質が、単球細胞と一致することが分かった。この発見を、分類したシグレック−９^＋とシグレック−９⁻ＡＭＬ細胞のメイ・グリュンワルド・ギムザ染色によって確認した（図４Ａ）。

シグレック−９^＋細胞の大部分でＣＤ３４の発現を欠いた（図３Ｂ）が、少数のシグレック−９^＋シグレック−９^＋／ＣＤ３４^＋細胞は、芽コロニー形成可能性を備える白血性細胞を含むことができた（参考文献１９）。この可能性を調べるために、シグレック−９^＋とシグレック−９⁻ＡＭＬ細胞をＦＡＣＳ分類で精製し、３個の異なるＡＭＬ試料について、メチルセルロースでのＣＦＵ−ブラスト検査を行った。全ての事例において、シグレック−９^＋断片ではＣＦＵ−ブラストは検出されなかったが、シグレック−９⁻断片からは、３人の患者の試料細胞１０５個につき、２２００個と２３８個のＣＦＵ−ブラストコロニー始原細胞を検出した。抗シグレック−９ｍＡｂを含有または除外して培養した非分類細胞による比較実験では、ＣＦＩ−ブラスト形成に対するｍＡｂの影響は皆無であった（データの図示省略）。

［正常骨髄細胞におけるＣＤ３３関連シグレック発現の特長付け］
ＣＤ３３とシグレック−５を除いて、正常骨髄細胞でのＣＤ３３関連シグレック系統群の発現プロファイルに関する詳細な報告はなかった。これは、細胞障害効果から正常な始原細胞を守るのに望ましいＡＭＬ細胞のＡｂ媒介性標識の状況において、とても重要である。それぞれ、ＳＳＣ^ｌｏｗ（図５、Ｒ２）、ＳＳＣ^{ｍｅｄｉｕｍ}（図５、Ｒ３）、ＳＳＣ^ｈｉｇｈ（図５、Ｒ４）の側方散乱（ＳＳＣ）特性（参考文献２１）に従って、フローサイメトリにより正常な骨髄細胞の３つの系統群を定義した。分析した４個の正常骨髄試料中、ＣＤ３３関連シグレックの発現は、ＳＳＣ^{ｍｅｄｉｕｍ}とＳＳＣ^ｈｉｇｈ集団にほぼ限定されていた。代表的な例を図５に示す。ＳＳＣ^{ｍｅｄｉｕｍ}細胞の大部分は、ＣＤ３３とシグレック−９について強い陽性を示し、シグレック−５とシグレック−７について弱い陽性を示した。対照的に、ＳＳＣ^ｈｉｇｈ細胞は、ＣＤ３３とシグレック−５について弱い陽性を示し、シグレック−９については、大部分が陰性を示した（図５）。多色標識の結果、ＳＳＣ^{ｍｅｄｉｕｍ}、ＣＤ３３^ｈｉｇｈ、シグレック−９^＋系統群（図６Ａ，ゲート１）もシグレック−５とシグレック−７を共発現することが分かった。対照的に、ＳＳＣ^ｈｉｇｈ、ＣＤ３３^ｌｏｗ、シグレック−９^＋（図６Ａ，ゲート２）細胞は、シグレック−５だけ陽性で、シグレック−７については陰性だった。ＣＤ３８⁻，ＣＤ１２３^＋／−，ＣＤ１４^＋，ＣＤ３４⁻（図６Ｂ，６Ｃ）についてグレック−９^＋系統群をさらに定義した。精製したグレック−９^＋系統群のメイ・グリュンワルド・ギムザ染色（図４Ｂ）と併せて考慮すると、正常骨髄におけるシグレック−９^＋細胞は、単球系統の未熟細胞が支配的であることを示唆する。ＣＤ３４^＋細胞の実験結果は、シグレック−９と同様で、シグレック−７はほぼ認められず、シグレック−５は、ＣＤ３４^＋細胞の５％以下で検出され、ＣＤ３３は、１４％以下で検出された（図６Ｃ）。骨髄性始原細胞は、特質的に、ＣＤ３４とＣＤ３３を発現する。正常骨髄におけるシグレック−９^＋細胞の大部分は、ＣＤ３４⁻とＣＤ３３^＋であったが、ＣＤ３４^＋細胞の小断片（１％以下）は、シグレック−９^＋であった（図６Ｃ）。始原細胞の部分集合がシグレック−９を発現したかどうかを調査するために、フローサイメトリによって、正常骨髄細胞をシグレック−９^＋とシグレック−９^―細胞断片とに分類し、標準メチルセルロースベースのクローン化アッセイ（standard methylcellulose-based clonogenic assay）を使って、コロニー形成能力を計測した。２つの独立した実験の結果、シグレック−９陽性細胞断片は、コロニー化能力を持たなかったが、シグレック−９陰性細胞断片は、予想したレベルのＢＦＵ−Ｅ，ＣＦＵ−Ｅ，ＣＦＵ−Ｇ，ＣＦＵ−ＧＭを有していた（表３）。

表中、ＢＭは正常骨髄、ｍＡｂは抗シグレック−９ｍＡｂを示す。（＊）データは、幹細胞因子，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，ＩＬ−６，ＩＬ−３とエリストポエチンで懸濁したメチルセルロース培地で１４日間培養した１×１０^４細胞からウエル当りの複製コロニーの平均を示す。括弧内は、２個の複製の数値をそれぞれ示す。別の２人の提供者から入手した正常骨髄を使った２つの独立した実験からも同様の結果を得た。

結論として、正常骨髄の分析によれば、シグレック−５，７，９は、骨髄性系統の文化細胞で発現することが分かった。シグレック−９については、ＣＤ３３と違って、この受容体は骨髄始原細胞には存在しない。全体として、ＣＤ３３関連のシグレックを発現するＡＭＬ細胞の表現型と始原骨髄細胞は類似し、ＣＤ３３関連シグレックがＡＭＬにおいて異常発現しないことを示唆する。

［抗シグレック−９ｍＡｂは、ＡＭＬ細胞とシグレック−９感染ラット好塩基球性白血病細胞によって急速に内在化する］
シグレック−９の単球ＡＭＬ細胞における比較的高い発現と骨髄始原細胞での不在は、シグレック−９を、芽細胞の除去及び毒素デリバリによる患者の白血性細胞負荷の軽減を目指すｍＡｂに基づく治療の新たな潜在的候補とする。これを効果的にするために、細胞表面への結合により抗シグレック−９ｍＡｂを内在化させることが重要である。ｍＡｂ内在化を分析するのに、フローサイメトリを開発し、細胞を氷の上でアレクサ４８８標識抗シグレック−９ｍＡｂで標識し、３７℃で、時間を変えて培養した。結合したｍＡｂの残余量を、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇと、続いて、フローサイメトリを使って測定した。原始ＡＭＬ試料を使った３つの独立した実験の結果、３７℃で４０分以内に結合した抗シグレック−９ｍＡｂの３０〜５０％が内在化し、９０％が２４０分以内に内在化した（図７Ａ，左側のパネル）。細胞関連アレクサ４８８標識抗シグレック−９ｍＡｂの量は、実験期間を通じて一定であったため、表面の抗シグレック−９ｍＡｂの損失は、落下ではなく内在化によるものであった（図７Ｂ，左側パネル）。シグレック−９が抗シグレック−９ｍＡｂの内在化を仲介することを直接証明し、２個の細胞質チロシン系信号モチーフ（cytoplasmic tyrosine-based signaling motifs）（Ｙ１とＹ２）の役割（参考文献１５）を調査するために、フローサイメトリと共焦点顕微鏡を使って、シグレック−９安定感染ＲＢＬ細胞における抗シグレック−９ｍＡｂの内在化を調べた。上述したＡＭＬ細胞のアッセイと同様の検定法を使って、野性型またはＹ２Ｆ（膜遠位エンイチロシンのフェニルアラニンへの変化：membrane distal tyrosine changed to phenylalanine）突然変異シグレック−９を発現するＲＢＬ細胞は、似たような割合のエンドサイトーシスを示し、４０分で４０〜５０％のシグレック−９の内在化が確認された（図７Ａ，右側のパネル）。比較するために、シグレック−９Ｙ１Ｆ（膜近位チロシンのフェニルアラニンへの変化：membrane proximal tyrosine changed to phenylalanine）変異体をよりゆっくりと内在化させた（図７Ａ，右側のパネル）。実験期間を通じて、自動蛍光（autofluoresence）のゲインにより、細胞関連抗シグレック−９アレクサ４８８の全体量が若干増加した（図７Ｂ，右側パネル）。共焦点顕微鏡を使ってＲＢＬによる内在化を確認した。１時間の培養後、野生型またはＹ２Ｆ型のシグレック−９については高レベルの内在化が見られたが、シグレック−９Ｙ１Ｆ変異型は大部分が細胞表面に留まった（データ付加図）。実験結果は、シグレック−９の膜近位ＩＴＩＭに最適エンドサイトーシスが必要で、ＣＤ３３に関する過去の研究（参考文献１６）と一致することを示す。

［可溶シグレック−９はＡＭＬ骨髄血漿で低レベルまたは検出不能であるが、シグレック−５は高レベルで存在する］
抗シグレック−９ｍＡｂがインビボの標的ＡＭＬ細胞で効果的に機能するには、高レベルの抗シグレック−９が血漿中に存在しないことが重要であり、これは、注入されたＡｂを中和させて、治療効果が下がるのを防ぐためである。実際、血液中のＣＤ３３の抗原負荷が高いと、マイロターグ治療に続く臨床的成果に顕著な影響を及ぼす可能性がある（参考文献２２）。そこで、我々は、Ｍ４／Ｍ５ＦＡＢ状態を呈する数人と高レベルのシグレック−９^＋ＡＭＬ細胞（表２の試料XIII）を有する１人（表４、ＡＰ３）を含む８人のＡＭＬ患者から採取した骨髄血漿中の可溶シグレック−９のレベルを調べた。また、比較できるように可溶ＣＤ３３とシグレック−５も測定した。６人の患者の血漿中に、検出不可能なレベルの可溶シグレック−９が存在し（検出限界１.２５ｎｇ／ｍｌ）、２人の患者からは、低レベル（−４ｎｇ／ｍｌ）の可溶シグレック−９を検出した（表４）。一方、低レベルから中程度の（４〜３０ｎｇ／ｍｌ）の可溶ＣＤ３３を８人の患者全員で確認し、うち７人の患者から、５００ｎｇ／ｍｌ以内のレベルのシグレック−５が容易に検出された（表４）。正常な骨髄血漿または血清試料では、シグレック−９は検出できなかったが、シグレック−５は、１例を除いて全検体から検出された。ＣＤ３３は、３個の正常骨髄血漿試料のうち１つの試料と、全ての正常血清試料とで検出された。全般的に、ＡＭＬ試料におけるシグレック−５とＣＤ３３のレベルは、比較グループのそれより高く、これは、各患者の循環血液の白血球の数とある程度の相関性があった（表４）。

表４中、ＷＢＣは白血球、ＡＰはＡＭＬ骨髄血漿、ＮＰは正常骨髄血漿、ＮＳは正常血清、（−）は検出されず、−は無関係、ＮＤは未決定、をそれぞれ意味する。データは、平均±１標準偏差を示す。ＦＡＢは、フランス・アメリカ・イギリス分類を意味する。†の付いた試料は、表２のXIIIに対応する。

［検討項目］
本明細書は、ＡＭＬにおけるＣＤ３３関連シグレックの発現を初めて総合的に分析したものである。この検査の目的は、疾病を監視するマーカまたは治療用標的として臨床的に使用可能な付加的なＣＤ３３関連シグレックがあるかどうかを決定することにあった。ＣＤ３３は別として、シグレック−９は興味深い新候補として際立ち、２１個のＡＭＬ検体中７例でＣＤ３３と同等のレベルで存在した。ＣＤ３３関連シグレックについて、正常骨髄細胞における発現プロフィールを比較したところ、シグレック−９はＣＤ３３とは対照的に、骨髄性始原細胞には存在しないが、単球系統の未熟細胞ではＣＤ３３と等しいレベルで存在した。この実験結果は、抗シグレック−９がＡＭＬ細胞によって急速に内在化し、血漿中には有意なレベルで存在しないことを証明した。この発見は、抗シグレック−９が単独もしくは抗ＣＤ３３ｍＡｂに基づく療法を含むその他の治療と組み合わせてＡＭＬの治療目的に使用できる可能性を示唆する。

ＣＤ３３関連シグレックの典型的な特長は、その系統制限（lineage-restricted）発現パターンにある。例えば、シグレック−５とシグレック−９は、大部分が単核細胞で見つかり、好中球（参考文献６，１１，２３，２４）シグレック−７は、単球およびＮＫ細胞での発現が優勢で（参考文献７）、シグレック−８は、好酸球に制限され（参考文献９．１０）、シグレック−１１は、組織マクロファージで発現するが、循環白血球には存在しない（参考文献１３）。正常な血液白血球でのこの特異な染色は、ＦＡＢ分類でＭ０からＭ６にわたるＡＭＬ試料の様々なコレクションを使用してここで観察した発現パターンと一致する。すなわち、シグレック−８と１１は、分析した白血病試料では検出されず、シグレック−５と、７と、９は殆どの試料で不定に存在した。全てのＣＤ３３関連シグレックを横一列に比較した結果、ＦＡＢ分類に関係なく、ＡＭＬ試料の大部分で高レベルのＣＤ３３が発現し（過去の多数の研究と一致）、その他のＣＤ３３関連シグレックは、骨髄単球性分化特長を備えるＣＤ３３^＋ＡＭＬ細胞の部分集合でのみ有意なレベルで発現することが明白である。治療的見地から重要な問題は、シグレック−５と、７と、９がＡＭＬ細胞の同一あるいは分離した部分集合で発現するかどうかである。本明細書で、我々は、これら３つのシグレックが同じ部分集合で共発現することをマルチパラメータ標識によって証明した。これは、これらの分子の発現がＡＭＬ細胞分化中に、同等に規制されるという概念と一致する。

この研究で、我々は、ＣＦＵ−Ｇ，ＣＦＵ−Ｍ，ＣＦＵ−ＧＭを含むシグレック−９が全ての始原細胞に不在であることを示した。この結果は、シグレック−５と７も骨髄性始原細胞に不在であることを示唆する。従って、成長因子に反応して、ひとたびコロニー形成能力を失うと、シグレック−５と、７と、９が骨髄単球系統のＣＤ３３^＋細胞で最初に発現することになる。興味深いことに、未熟骨髄好中球（図５、高い側方散乱で定義）におけるシグレック−９発現が弱小または不在になり、シグレック−９が骨髄から出るとこれらの細胞で上方制御されることを示唆する。一方、ＣＤ３３は未熟骨髄好中球ですぐに検出され、成熟すると下方制御されることを示唆する。

ＬＳＣは、目下、ＡＭＬの治療の主要標的として認められ（参考文献１、２５）、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻集団内で見つかる（参考文献２０，２６）。骨髄始原細胞におけるシグレック−９の不在は、これがＬＳＣにも不在である可能性を示す。我々がここに証明した、シグレック−９発現に基づいて分類した細胞はＡＭＬコロニー形成芽細胞を含まなかったという事実は、この可能性と一致するものである。従って、単独で使用した抗シグレック−９ｍＡｂが直接ＬＳＣを除去する可能性は稀で、これらの希少細胞に対するバイスタンダー毒性として骨髄への放射性同位元素を標的するのに有効であるかもしれない。抗ＣＤ３３Ａｂｓまたはその他の療法と組み合わせた抗シグレック−９ｍＡｂも、例えば、骨髄増多症のいくつかの症例で、白血性負担を軽減するのに有効であろう。

この目的のために、シグレック−５やシグレック−７と比べて、シグレック−９を標的とするのにはいくつかの潜在的な利点がある。第１に、ＭＦＩ値（表1および図1）が示すように、シグレック−９は最大の発現レベルを有した。これをここに示す結合Ａｂの急速な吸収と組み合わせると、高レベルの貪食Ａｂが白血性細胞と共役し、効率的な細胞死をもたらすことが期待される。第２に、ＡＭＬ患者からの骨髄血漿の可溶シグレック−９の濃度と制御が低いか又は検出不能な一方、シグレック−５は高濃度で存在し、注入したＡｂの断片を有意に中和可能である。可溶ＣＤ３３の分析はこの分子が高レベルに存在することを示し、ＡＭＬ試料におけるＣＤ３３とシグレック−５両方の上昇は、各患者の循環白血球の数と明らかに相関関係がある。これは、増加した可溶シグレックのプールが白血性細胞に由来することを示唆する。可溶シグレックの分子特性は、目下、未知であるが、過去の文献は、可溶分泌型（a soluble secreted form）をコードするものを含むシグレック−５の複数の接合変異体の存在を開示している（参考文献２４）。

結論として、我々の発見は、シグレック−９が（骨髄）単芽球白血病で発現し、特に個々の患者用の治療として考えた場合、抗ＣＤ３３指向戦略を含む新規な薬または従来の細胞毒剤と組み合わせて使用可能な新規な治療用標的を提供することを示すものである。

ＡＭＬ細胞のＣＤ３３関連シグレックの発現を示す。 ＡＭＬ細胞のシグレック−９陽性部分集合上のシグレック−７とシグレック−５の共発現を示す。 フローサイメトリによるシグレック−９陽性ＡＭＬ細胞の表現型特性付けを示す。 ＡＭＬ細胞と正常骨髄細胞のメイ・グリュンワルド・ギムザ染色を示す 正常骨髄細胞上のＣＤ３３関連シグレックの発現を示す。 正常骨髄におけるシグレック陽性部分集団の特性付けを示す。 抗シグレック−９ｍＡｂの内在化を示す。 感染ＲＢＬ細胞による抗シグレック−９ｍＡｂ内在化の共焦点顕微鏡分析を示す。

参考文献一覧

Claims (8)

1. 急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)の治療薬剤製造のための、シグレック−９と特異的に結合し、薬剤の担体である抗シグレック−９抗体の使用。
2. 請求項１に記載の使用であって，
   前記抗シグレック−９抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である使用。
3. 請求項２に記載の使用であって，
   前記抗体が、補体媒介性細胞傷害活性又は抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を誘発しない使用。
4. 請求項２に記載の使用であって，
   前記抗体がヒト化抗体である使用。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の使用であって，
   前記抗体が、
   (i) Ｆ(ａｂ)_２フラグメント；
   (ii) Ｆａｂフラグメント；及び
   (iii) 領域抗体（ナノボディ）、
   からなる群から選ばれる抗体断片である使用。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の使用であって，
   前記抗シグレック−９抗体が、一旦結合すると細胞の内部に内在化するか、細胞内の区画または小胞に送られて内在化する使用。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の使用であって，
   前記抗シグレック−９抗体は、カリケアマイシン-γ１と接合する使用。
8. シグレック−９と特異的に結合し、薬剤の担体である抗シグレック−９抗体を含む、
   急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)の治療剤。

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