CN108699158B - Siglec中和抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合在免疫细胞中具有抑制活性的人类Siglec并且中和这种Siglec的抑制活性的药剂。此类药剂可以用于治疗癌症或感染性疾病。

Description

Siglec中和抗体
相关申请的引用
本申请要求于2016年3月8日提交的美国临时申请号62/304,957的权益，将该临时申请通过引用以其全文(包括任何附图和序列表)结合在此。
序列表的引用
本申请是连同电子格式的序列表提交的。序列表被提供为题为“Sig792PCT_ST25txt”的文件，创建于2017年2月22日，大小是124KB。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文结合在此。
发明领域
本发明涉及结合在NK和/或其他免疫细胞中具有抑制活性的人类Siglec蛋白并且中和这种Siglec的抑制活性的药剂。此类药剂可以用于治疗癌症或感染性疾病。
背景技术
NK细胞是在来自淋巴祖细胞的骨髓中发育的单核细胞，并且形态特征和生物学特性典型地包括簇决定簇(CD)CD16、CD56和/或CD57的表达；细胞表面上α/β或γ/δTCR复合物的缺乏；结合并杀伤无法表达“自身”主要组织相容性复合物(MHC)/人白细胞抗原(HLA)蛋白的靶细胞的能力；以及杀伤表达激活NK受体的配体的肿瘤细胞或其他疾病细胞的能力。NK细胞的特征在于它们无需在先免疫或活化而结合并杀伤几种类型的肿瘤细胞系的能力。NK细胞还可以释放对免疫系统发挥调节作用的可溶性蛋白质和细胞因子；并且可以进行多轮细胞分裂并产生具有与亲本细胞相似的生物学特性的子细胞。保护正常的健康细胞免受由NK细胞造成的裂解。
基于它们的生物学特性，本领域已经提出了依赖于NK细胞的调节的各种治疗和疫苗策略。然而，NK细胞的活性通过涉及刺激信号和抑制信号两者的复杂机制进行调节。简而言之，NK细胞的裂解活性受各种细胞表面受体的调节，这些细胞表面受体在与靶细胞上的配体相互作用时转换阳性或阴性细胞内信号。经由这些受体传递的阳性和阴性信号之间的平衡决定了靶细胞是否被NK细胞裂解(杀伤)。NK细胞刺激信号可以通过以下介导：天然细胞毒性受体(NCR)如NKp30、NKp44和NKp46；以及NKG2C受体、NKG2D受体、某些活化的杀伤性Ig样受体(KIR)和其他活化的NK受体(Lanier,Annual Review of Immunology[免疫学年度评论]2005；23:225-74)。NK细胞抑制信号可以由识别主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的受体如CD94/NKG2-A、以及某些抑制性KIR介导(Wagtmann等人(1995)Immunity[免疫力]5:439-449)。这些抑制性受体结合存在于其他细胞上的MHC I类分子(包括HLA I类)的多态性决定簇并且抑制NK细胞介导的裂解。
NK细胞的裂解活性也可以通过siglec多肽调节。Siglec(唾液酸结合型免疫球蛋白样凝集素)是I型凝集素的子集，这些I型凝集素与唾液酸聚糖结合并且以依赖于细胞类型和分化的方式主要在造血系统的细胞上表达。尽管唾液酸典型地在糖蛋白和脂质的末端位置普遍表达，但是取决于与亚末端碳水化合物部分的一致性和键，仅非常特异的不同的唾液酸聚糖结构被个体Siglec受体识别。Siglec对含有N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)α2-6和α2-3键的常见哺乳动物唾液酸苷结构仅具有低的一般亲和力。
Siglec通常被分为两组：由Siglec-1、Siglec-2、Siglec-4和Siglec-15组成的第一子集，以及包括Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14和Siglec-16的CD33相关的Siglec组。CD33相关的Siglec尤其通过低进化保守性和通过多种机制的快速进化的序列来表征。
Siglec-7(CD328)是一种于1999年由意大利热那亚(Genoa)的Moretta小组首次克隆和表征的1型跨膜蛋并且属于人CD33相关的Siglec受体，该Siglec-7的特征在于唾液酸结合的N末端V-组Ig结构域、两个C2-组Ig结构域和含有一种基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)和一种ITIM样基序的胞质内区域。Siglec-7在NK细胞、树突细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞上组成型表达。该受体的细胞外结构域优先结合(2,8)-连接的二唾液酸和支链α2,6-唾液酸残基，如由神经节苷脂GD3显示的那些残基。
Siglec-9(CD329)在2000年由Varki小组表征(参见，例如，Angata等人J BiolChem[生物化学杂志]2000；275:22127–22135)并且在单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、CD34+细胞和NK细胞上表达。已经发现Siglec-9(以及Siglec-8)对含有唾液酸和硫酸酯两者的唾液酸苷配体具有不同的特异性，其中硫酸酯的位置是特异性的重要决定因素。已经发现Siglec-9结合在癌细胞上过表达的MUC16。与Siglec-7一样，Siglec 9还含有唾液酸结合型N-末端V-组Ig结构域、两个C2-组Ig结构域、和含有一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)和一个ITIM样基序的胞质内区域。人类Siglec-9的N-末端V-组Ig结构域与人类Siglec-7的N-末端V-组Ig结构域共享约77％的总氨基酸序列一致性，并且这两个siglec显示不同的唾液酸结合特异性。
结合试验已经报道，与Siglec-7类似，Siglec-9识别在与半乳糖的α2,3-或α2,6-糖苷键中的唾液酸。使用Siglec-9特异性mAb，Zhang等人((2000)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]第275卷,第29期:22121–22126)报道发现Siglec-9以高水平或中等水平被单核细胞、嗜中性粒细胞以及少数CD16+、CD56细胞群体表达。然而，在约50％的B细胞和NK细胞以及小的CD8+T细胞和CD4+T细胞亚群上观察到较弱的表达。作者得出结论，尽管它们具有高度的序列相似性，但Siglec-7和Siglec-9具有不同的表达谱。
尽管在NK和其他免疫细胞上Siglec-9具有令人感兴趣的表达谱，并且对于中和Siglec-9具有潜在的治疗意义，但迄今为止还没有推进或提出特异性中和Siglec-9的候选治疗剂用于治疗用途。据报道，Siglec-9通过肿瘤相关的唾液酸配体在骨髓单核细胞谱系的细胞上的接合通过NK细胞以及通过嗜中性粒细胞(识别并直接杀伤微生物的特异性粒细胞)抑制免疫监视和肿瘤细胞杀伤(Laubli等人(2014)Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]111(39):14211-14216)。Carlin等人((2009)Blood[血液]113:3333-3336)报道了宿主唾液酸化聚糖的模拟允许细菌病原体接合嗜中性粒细胞Siglec-9并抑制先天免疫应答。Carlin等人将抗Siglec-9抗体191240(研发系统公司(R&D Systems,inc.))描述为与Siglec-9上的唾液酸结合位点结合并抑制与唾液酸的相互作用。Carlin等人进一步报道，与非阻断抗体(克隆E10-286，BD生物科学公司(BD Biosciences inc.))不同，克隆191240增强了嗜中性粒细胞针对细菌细胞的活化。同样地，Laubli等人(2014)，同上报道了与不增强通过嗜中性粒细胞杀伤肿瘤细胞的克隆E10-286相比，抗Siglec-9抗体克隆191240能够增强嗜中性粒细胞对肿瘤细胞的杀伤。
抗Siglec-7抗体已在欧洲专利1238282B1(Moretta等人)和Vitale等人((1999)Proc.Nat.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]96(26):15091-96)(参考小鼠抗siglec-7抗体QA79)，以及在Falco等人(1999)J.Exp.Med.[实验医学杂志]190:793-801(报道了抗Siglec-7抗体Z176)中描述。
Hudak等人(2014)Nat.Chem.Biol.[自然化学生物学]10:69-77报道，阻断抗Siglec-7抗体抑制了Siglec-7介导的保护肿瘤靶细胞免受NK细胞裂解。然而，当转向Siglec-9时，抗Siglec-9抗体(使用克隆191240)不能抑制Siglec-9介导的保护肿瘤靶细胞免受从人类供体纯化的NK细胞裂解(参见Hudak等人(2014))，尽管有能力增强嗜中性粒细胞对肿瘤细胞的杀伤(参见Laubli等人(2014))。Laubli等人(2014)中报道为不阻断并且不增强嗜中性粒细胞对肿瘤细胞的杀伤的二价结合抗体克隆E10-286也无法抑制Siglec-9介导的保护肿瘤靶细胞免受原代NK细胞裂解(Jandus等人(2014)J.Clin.Invest.[临床研究杂志]124(4):1810-18020)。
尽管对Siglec-7和Siglec-9感兴趣，但尚未开发出靶向这些受体的治疗剂。因此，存在对靶向这些受体的用于治疗诸如癌症等疾病的药剂的需要。
发明内容
在一个方面，本披露提供了高亲和力结合抗体，该抗体充当人类Siglec的有效中和剂(尤其在人类个体中与嗜中性粒细胞和/或其他细胞相比表达较低水平的细胞表面Siglec的NK细胞上)，并且充当效应淋巴细胞中的抑制性细胞表面受体(Siglec-7、Siglec-9)。
在一个实施例中，本披露提供了Siglec抑制剂(例如，在细胞表面表达的Siglec-9)，包括Siglec-9的竞争性和非竞争性抑制剂。相应的抑制剂在伴随或不伴随基本上阻断Siglec与其唾液酸配体之间的相互作用的情况下在中和Siglec的抑制活性方面具有特别高的效力。
在一个实施例中，Siglec抑制剂是包含免疫球蛋白抗原结合结构域的蛋白质，该蛋白质特异性地结合人类Siglec-9蛋白(例如抗体或抗体片段)、或包含其的蛋白质。在一个实施例中，Siglec抑制剂特异性地结合人类Siglec-9蛋白而不结合人类Siglec-7和/或表1的其他人类Siglec(由mAbA、-B、-C、-D、-E和-F例示)。在一个实施例中，Siglec抑制剂特异性地结合人类Siglec-9蛋白和结合人类Siglec-7蛋白，任选地另外不结合表1的其他人类Siglec(由mAb4、-5、-6例示)。在一个实施例中，Siglec抑制剂是特异性地结合人类Siglec-9蛋白、结合人类Siglec-7蛋白和结合人类Siglec-12蛋白、任选地另外不结合表1的其他人类Siglec(由mAb1、-2、-3例示)的抗体或抗体片段。在一个实施例中，Siglec抑制剂是能够与人类Siglec-9蛋白二价结合的抗体或抗体片段(该抑制剂包含各自能够结合人类Siglec-9蛋白的两个抗原结合结构域)。
在一个实施例中，本披露提供了特异性地结合人类Siglec-9多肽并中和Siglec-9多肽的抑制活性的分离的抗体，任选地其中该抗体基本上不阻断Siglec-9多肽与其唾液酸配体(由mAb1、2和3例示，参见实例10)之间的相互作用，任选地其中该抗体阻断Siglec-9多肽与其唾液酸配体之间的相互作用(由mAbA、B和C例示，参见实例10)。任选地，Siglec-9多肽在细胞表面上表达，该细胞是例如效应淋巴细胞、NK细胞(例如原代NK细胞)、来自人类个体的CD56dim NK细胞。在一个实施例中，抗体进一步结合人类Siglec-7多肽并中和Siglec-7多肽的抑制活性，任选地另外其中该抗体基本上不阻断Siglec-7多肽与其唾液酸配体之间的相互作用。在另一个实施例中，抗体不结合人类Siglec-7多肽。
在一个方面，本发明尤其产生自对特异性地结合人类Siglec-9并且增强NK细胞(例如原代NK细胞)对具有唾液酸配体的靶细胞的活性(例如细胞毒性)的抗体的发现。与仅在嗜中性粒细胞、Siglec转染子和/或在细胞表面表达高水平Siglec-9或使得在细胞表面表达高水平Siglec-9的其他细胞中增强细胞毒性的在先抗体不同，本文所述的抗体即使在表达低水平的Siglec-9的细胞(如人类中的NK细胞(例如CD56dim NK细胞))中也有功能。增强这样的低表达Siglec-9的NK细胞的细胞毒性的能力具有如下优点：能够另外动员该细胞群体对抗疾病靶细胞(例如肿瘤细胞和/或细菌细胞)的能力。
在一个实施例中，提供了特异性地结合人类Siglec-9并且在标准4小时体外细胞毒性测定中增强和/或恢复NK细胞(原代NK细胞)的细胞毒性的抗体或抗体片段(或包含这样的片段的蛋白质)，在该体外细胞毒性测定中表达Siglec-9的NK细胞与表达Siglec-9的唾液酸配体的靶细胞一起孵育。在一个实施例中，在添加NK细胞之前，用51Cr标记靶细胞，并且然后将杀伤(细胞毒性)估计为与51Cr从细胞到培养基的释放成比例。任选地，可以根据本文实例(参见例如实例8)中的方法实施测定。在一个实施例中，抗体或抗体片段能够将表达Siglec-9的NK细胞的细胞毒性恢复到至少用不表达Siglec-9的NK细胞观察到的水平(例如，如根据本文实例的方法确定的)。
在本文的任何方面，NK细胞(例如原代NK细胞)可以被规定为从供体纯化的新鲜NK细胞，任选在使用前在37℃孵育过夜。在本文的任何方面，NK细胞或原代NK细胞可以被指定为是表达Siglec-9的，例如，以用于细胞可以通过流式细胞术对Siglec-9进行门控的测定。参见，例如如本文的实例8所描述的NK细胞。
在另一个实施例中，提供了特异性地结合人类Siglec-9并中和Siglec-9多肽在单核细胞衍生的树突细胞(moDC)中的抑制活性的抗体或抗体片段(或包含这样的片段的蛋白质)。在一个实施例中，moDC在其表面具有Siglec-9的唾液酸配体。在一个实施例中，moDC在其表面具有与唾液酸发生顺式相互作用的Siglec-9多肽。在一个实施例中，抗体增加moDC中的活化或信号传导。在一个实施例中，抗体中和Siglec-9多肽在具有Siglec-9的唾液酸配体的moDC中的抑制活性，其中该moDC是其中用神经氨酸酶处理moDC以除去唾液酸配体导致抗体与moDC结合的EC50较低的细胞。
在另一个方面，本发明尤其产生自以可比的亲和力结合Siglec-7和Siglec-9多肽两者的抗Siglec抗体的发现。此类抗体具有有利的药理学特征。如本文所示，NK细胞可以表达抑制性Siglec-7和抑制性Siglec-9蛋白两者，但Siglec-7和Siglec-9也可以在不同细胞群体中具有不同的表达谱。此外，已经显示肿瘤细胞可以表达Siglec-7和Siglec-9的天然配体(聚糖)。因此，抑制一种Siglec但不抑制另一种Siglec的治疗剂在中和Siglec介导的对NK和/或其他免疫细胞群体的活性的限制方面可能不是最高效的。因此，抑制Siglec 7和Siglec 9两者可能是有利的。然而，Siglec-9与人类Siglec-7的N-末端V-组Ig结构域共享仅约77％的总氨基酸序列一致性。此外，这两个siglec显示不同的唾液酸结合特异性，表明在被唾液酸配体结合的区域中的结构差异。
在一个方面，本披露提供了中和Siglec-7和/或Siglec-9的抑制活性并且能够以可比的亲和力特异性地结合抑制性人类Siglec-7多肽和人类Siglec-9多肽的高亲和力结合抗体。例如，在某些实施例中，以可比的亲和力结合Siglec-7和Siglec-9的抗体可能具有增强的阻断每个Siglec与其一个或多个唾液酸配体之间的相互作用的能力(由mAb4、5和6例示，参见实例6)。在其他实施例中，结合Siglec-9的抗体可以表征为中和Siglec-9的抑制活性，而基本上不阻断Siglec-9与其一个或多个唾液酸配体(特别是包含Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb结构的唾液酸)之间的相互作用(由mAb1、2和3例示，参见实例9)。
如本文所示，人类Siglec-9与Sia1(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb)和Sia2(6'-唾液酸乳糖)两者结合，然而Siglec-7仅与Sia2结合。在一个方面提供了能够阻断这样的一种或多种Siglec多肽与Siglec-9和Siglec-7两者的唾液酸配体(例如Sia2唾液酸)的相互作用的抗体。在一个实施例中，唾液酸是唾液酸化的三糖。在一个实施例中，唾液酸包含6'-唾液酸乳糖结构。
在另一个方面提供了一种结合人类Siglec-9多肽并中和其抑制活性的抗体，其中该抗体能够阻断Sia1(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb)和Sia2(6'-唾液酸乳糖)与Siglec-9多肽的相互作用(由mAb1、2和3例示，参见实例9)。
在一个实施例中，能够结合Siglec-7和Siglec-9的抗体具有与结合人类Siglec-9多肽的EC50相差小于1-log的结合人类Siglec-7多肽的EC50，如针对与在细胞表面表达Siglec-7或Siglec-9的细胞(例如，用相应的Siglec之一转染但不表达另一个Siglec的CHO细胞)的结合通过流式细胞术所确定的。在一个实施例中，抗体具有相差不超过0.5log、0.3log、0.2log或0.1log的结合人类Siglec-7多肽和人类Siglec-9多肽的EC50，如针对与在细胞表面表达Siglec-7或Siglec-9的细胞的结合通过流式细胞术所确定的。在细胞表面表达Siglec-7或Siglec-9的细胞可以表征为以可比的表达水平表达相应的siglec。
在一个实施例中，抗体以与对人类Siglec-7和/或Siglec-9可比的亲和力进一步结合非人类灵长类动物Siglec。在一个实施例中，抗体具有相差不超过1-log、0.5log、0.3log、0.2log或0.1log的结合人类Siglec-7多肽、人类Siglec-9多肽和非人类灵长类动物Siglec的EC50，如针对与在细胞表面表达Siglec-7或Siglec-9的细胞(例如，用相应的Siglec转染的CHO细胞)的结合通过流式细胞术所确定的。
在一个实施例中，提供了如下抗体，该抗体中和人类Siglec-9活性并且具有相差不超过1-log、0.5log、0.3log、0.2log或0.1log的结合人类Siglec-9多肽和非人类灵长类动物Siglec的EC50，如针对与在细胞表面表达Siglec-9的细胞(例如，用Siglec转染的CHO细胞)的结合通过流式细胞术所确定的。
在一个实施例中，对于与人类Siglec-7多肽和与人类Siglec-9多肽(和任选地另外的非人类灵长类动物Siglec)的结合，抗体具有相差不超过10倍、5倍、3倍或2倍的结合亲和力的KD，如通过例如表面等离子体共振(SPR)筛选(如通过用BIAcoreTM SPR分析装置分析)确定的。
在一个实施例中，对于与人类Siglec-9多肽(以及任选地另外的人类Siglec-7多肽和/或非人类灵长类动物Siglec)的结合，抗体具有约1x 10-8M至约1x 10-10M、或约1x 10-9M至约1x 10-11M的KD。在一个实施例中，对于与人类Siglec-9多肽的结合(例如，单价亲和力)，抗Siglec-9抗体具有约1x 10-8M至约1x 10-10M、或约1x 10-9M至约1x 10-11M的KD，其中该抗体不与人类Siglec-7多肽具有实质性结合。
在一个实施例中，抗体另外基本上不结合人类Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-8、Siglec-10、Siglec-11和Siglec-12中的任一者。在一个实施例中，抗体另外基本上不结合Siglec-14和-16中的任一者。在一个实施例中，抗体另外基本上不结合人类Siglec-6。在一个实施例中，抗体另外基本上不结合人类Siglec-12。
在本文的任何实施例中，抗Siglec抗体可以通过与细胞(例如，NK细胞，使得表达Siglec-7和/或Siglec-9的细胞，例如，使得在细胞表面表达Siglec-7和/或Siglec-9的重组CHO宿主细胞，如实例中所示)表面上表达的多肽的结合来表征，并且任选地另外其中该抗体以如通过流式细胞术确定的高亲和力结合。例如，抗体可以通过对于与原代NK细胞(例如，从来自人类个体或供体的生物样品中纯化的NK细胞)、任选地CD56dimNK细胞的结合不超过5μg/ml、任选地不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml、不超过0.2μg/ml或不超过0.1μg/ml的EC50表征，如通过流式细胞术确定的。例如，可以根据实例9的方法确定EC50，例如，测试4个或更多个健康人类供体，在BD FACS Canto II上获得并使用FlowJo软件分析染色，以及使用4-参数logistic拟合计算EC50。
在另一个方面，本披露提供了特异性地结合人类Siglec-7和/或Siglec-9多肽并且能够中和这样的一种或多种Siglec在免疫细胞中的抑制活性且能够阻断这样的一种或多种Siglec多肽与其唾液酸配体的相互作用的抗体或抗体片段(例如抗原结合结构域或包含其的蛋白质)。在一个实施例中，唾液酸是唾液酸化的三糖。在一个实施例中，唾液酸包含Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb结构。在一个实施例中，唾液酸包含6'-唾液酸乳糖结构。在一个实施例中，抗体或抗体片段特异性地结合人类Siglec-7和/或Siglec-9多肽，并且能够中和这样的一种或多种Siglec在人类NK细胞(例如人类原代NK细胞；CD56dim NK细胞)、在人类单核细胞、在人类树突细胞、在人类巨噬细胞(尤其是免疫抑制性或M2巨噬细胞)、CD8T细胞、和/或在人类嗜中性粒细胞中的抑制活性。在一个实施例中，抗体或抗体片段特异性地结合人类Siglec-7和/或Siglec-9多肽，并且能够中和这样的一种或多种Siglec在来自人类供体的免疫抑制性巨噬细胞(例如M2巨噬细胞)中的抑制活性，其中抗体或抗体片段降低巨噬细胞的免疫抑制性活性或能力。
如所讨论的，人类Siglec-9与Sia1(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb)和Sia2(6'-唾液酸乳糖)两者结合，然而Siglec-7仅与Sia2结合。在某些方面提供了能够阻断一种或多种Siglec-9多肽与作为Siglec-9的配体而非Siglec-7的配体的唾液酸(例如Sia1唾液酸)相互作用的抗体。在一个实施例中，唾液酸是唾液酸化的三糖。在一个实施例中，唾液酸包含Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb结构。在一个实施例中，抗体基本上不阻断一种或多种Siglec-7多肽与作为Siglec-7的配体而非Siglec-9的配体的唾液酸(例如含有6'-唾液酸乳糖的唾液酸)的相互作用。
还提供了此类抗体的片段和衍生物。在一个实施例中，抗体包含能够结合人类Siglec-7多肽和/或人类Siglec-9多肽的抗原结合结构域(例如，单个抗原结合结构域，由重链和轻链可变结构域组成的结构域等)。在一个实施例中，抗原结合结构域结合人类Siglec-9多肽而非人类Siglec-7多肽(由mAbA、-B、-C、-D、-E和-F例示)。在一个实施例中，抗原结合结构域结合人类Siglec-9多肽和人类Siglec-7多肽两者(由mAb1、-2、-3、-4、-5和-6例示)。在一个实施例中，提供了蛋白质(例如抗体、多聚体和/或多特异性蛋白质)或编码这样的抗原结合结构域的核酸。
在一个实施例中，本披露的中和性抗Siglec抗体减轻由Siglec-7和/或Siglec-9在免疫细胞中发挥的抑制活性，从而增强淋巴细胞有效识别和/或消除表达Siglec-7的唾液酸配体和/或Siglec-9的唾液酸配体的癌细胞的能力。抗体(或抗体片段)降低了癌细胞由于一种或其他类型配体的表达而逃避裂解的能力，并且因此它们增强了通过免疫系统的肿瘤监视。在NK隔室中，Siglec-9主要在CD56dim NK细胞上表达，然而siglec-7在CD56dim和CD56bright NK细胞上表达。CD56dim NK细胞(CD56dim CD16+KIR+)代表约90％的外周血和脾脏NK细胞，表达穿孔素和颗粒酶，并且是主要的细胞毒性子集，然而CD56bright NK细胞(CD56bright CD16dim/–KIR–)构成淋巴结和扁桃体中的大多数NK细胞，并且在活化后主要响应细胞因子产生。在一个实施例中，提供了特异性地结合人类Siglec-9并减轻Siglec-9在人类NK细胞(例如人类原代NK细胞；CD56dim NK细胞)中发挥的抑制活性，增强NK细胞有效识别和/或消除表达Siglec-9的唾液酸配体的癌细胞的能力的抗体或抗体片段。在一个实施例中，提供了特异性地结合人类Siglec-7和Siglec-9并且减轻了Siglec-7和Siglec-9在人类NK细胞(例如人类原代NK细胞中；CD56dim NK细胞)中发挥的抑制活性，增强NK细胞有效识别和/或消除表达Siglec-7和Siglec-9的唾液酸配体的癌细胞的能力的抗体或抗体片段。
在一个实施例中，本披露的抗体可以结合Siglec-7和Siglec-9两者，并且可以中和Siglec-7和Siglec-9两者介导的淋巴细胞(例如，NK细胞、CD8+T细胞)细胞毒性的抑制。在一个方面，抗体在靶细胞(例如，表达Siglec-7的配体和/或Siglec-9的配体的细胞，肿瘤细胞)的存在下增加淋巴细胞活化。在一个实施例中，抗体增加NK细胞的细胞毒性，如在标准体外细胞毒性测定中评估的，在该体外细胞毒性测定中表达Siglec-9的NK细胞从人类供体中纯化并与表达Siglec-9的唾液酸配体的靶细胞一起孵育。在一个实施例中，通过细胞毒性/细胞毒性潜力标记的增加(例如CD107和/或CD137表达(动员)来评估细胞毒性的活化的增加或抑制的中和。在一个实施例中，通过在51Cr释放测定中51Cr释放的增加来评估细胞毒性的活化的增加或抑制的中和。Siglec-7可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。Siglec-9可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个实施例中，Siglec-9包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列。
在一个实施例中，本披露的抗体能够结合包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的Siglec-9多肽(具有位置100处的赖氨酸，代表约49％的群体)和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的Siglec-9多肽(在对应于SEQ ID NO:2的残基100的位置处具有谷氨酸，代表约36％的群体)。在任何实施例中，本披露的抗体或抗体片段可以被规定为能够在表达(或其细胞表达)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的Siglec-9多肽的个体以及在表达(或其细胞表达)包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的Siglec-9多肽的个体中中和Siglec-9的抑制活性。
在一个实施例中，提供了结合人类Siglec-9多肽并且能够中和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的Siglec-9多肽和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的Siglec-9多肽两者的抑制活性的抗体或抗体片段(或包含这样的片段的蛋白质)。在一个实施例中，提供了结合人类Siglec-9多肽并且能够中和Siglec-9多肽在表达包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的Siglec-9多肽的NK细胞中以及在表达包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的Siglec-9多肽的NK细胞中的抑制活性的抗体或抗体片段(或包含这样的片段的蛋白质)。在一个实施例中，抗体增加NK细胞的细胞毒性，如在标准体外细胞毒性测定中评估的，在该体外细胞毒性测定中表达特定的Siglec-9的NK细胞从人类供体中纯化并与表达Siglec-9的唾液酸配体的靶细胞一起孵育。
在本文任何实施例的一个方面，抗体是以二价方式结合存在于Siglec的细胞外结构域上的表位的四聚体(例如，全长、F(ab)’2片段)抗体或抗体片段。例如，以二价方式结合Siglec的抗体或抗体片段可以包含各自能够结合Siglec-9多肽或者各自能够结合存在于Siglec-7和Siglec-9多肽两者上的表位的两个抗原结合结构域。在本文任何实施例的另一个方面，抗体以单价方式与Siglec结合并且在每个Siglec(例如Siglec-7和/或Siglec-9)上缺乏激动剂活性。在一个实施例中，以单价方式结合Siglec的抗体是Fab片段。在本文的任何实施例中，以单价或二价方式与Siglec结合的抗体在Siglec9上没有激动剂活性。对于治疗用途，抗体优选是非耗减性抗体。任选地，抗体包含能够被人类新生儿Fc受体(FcRn)结合的Fc结构域，但是该抗体基本上缺乏经由其Fc结构域与人类FcγR(例如，CD16’，任选地人类CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64多肽中的一种或多种、或每一种)的结合。任选地，抗体包含人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的Fc结构域，该Fc结构域包含降低抗体对人类CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64多肽中的一种或多种、或每一种的结合亲和力的氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一个实施例中，抗体包含一个或多个(例如，两个)结合Siglec-9、任选地另外结合Siglec-7的抗原结合结构域。在一个具体实施例中，抗体是四聚体的、任选地全长的抗体，该抗体包含两个相同的抗原结合结构域(任选地，两个重链和轻链可变区对)并且结合并中和Siglec-9、任选地另外的Siglec-7的抑制活性，该抗体包含能够被人类新生儿Fc受体(FcRn)结合的Fc结构域并且基本上缺乏与人类FcγR(例如，CD16；任选地人类CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64多肽中的一种或多种、或每一种)的结合。
在本文的任何实施例中，在与人类淋巴细胞上的Siglec结合后，单克隆抗体具有增强或重构在靶细胞表面上具有Siglec的唾液酸配体的人类靶细胞的裂解的能力，和/或当所述靶细胞与所述淋巴细胞(例如效应淋巴细胞、来自人类个体的NK或CD8+T细胞，例如CD56dim NK细胞)接触时，具有增加淋巴细胞活化的能力(例如，如通过在淋巴细胞上的CD107和/或CD137表达增加所确定的)。在一个实施例中，提供了中和由第一淋巴细胞亚群表达的第一Siglec(例如在CD56dim NK细胞上表达的Siglec-9)并且中和由第二淋巴细胞亚群表达的第二Siglec(在CD56bright NK细胞上表达的Siglec-7)的抗体。第一和第二人类淋巴细胞的亚群(例如，NK细胞、CD8+T细胞、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞、免疫抑制性或M2巨噬细胞)可以例如通过不同的细胞表面标记或不同的功能特性或者裂解或识别不同的靶细胞(例如，被其激活)的能力来表征。在一个实施例中，抗体减少(阻断)Siglec与其唾液酸苷配体(例如，存在于肿瘤细胞上的配体)的结合。
在本文的任何实施例中，Siglec的唾液酸苷或唾液酸配体是天然配体，例如，已知唾液酸配体(包含唾液酸的配体)与抗体结合的Siglec多肽结合。唾液酸，是九碳酸性单糖家族，典型地被发现是N-聚糖、O-聚糖和糖脂的终端分支。认为Siglec识别唾液酸分子的许多方面，如来自2-位的酸性唾液酸键、唾液酸的排列及其呈现的方式。在本文的任何实施例中，Siglec的配体主要包含5-N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)衍生物，并且可以包含其他唾液酸衍生物，如5-N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)衍生物。在一个实施例中，Siglec-9和/或Siglec-7的配体是存在于糖蛋白(例如粘蛋白)或糖脂上的唾液酸。在一个实施例中，Siglec-7的配体包含呈现在b-系列神经节苷脂(例如GD2、GD3和GT1b)上的α2,8-连接的二唾液酸。在一个实施例中，Siglec-7的配体包含内部分支的α2,6-连接的二唾液酸神经节苷脂，例如DSGb5。在一个实施例中，Siglec-9的配体是存在于粘蛋白上或包含粘蛋白(例如MUC1)的配体。在一个实施例中，Siglec-9的配体是含有唾液酸和硫酸酯两者的唾液酸聚糖配体。
在一个方面，抗体结合作为第一和第二人类CD33相关Siglec的存在于细胞外结构域上的共同决定簇。在本文任何实施例的一个方面，抗体结合存在于Siglec-9而非Siglec-7上的决定簇。在本文任何实施例的一个方面，抗体结合存在于Siglec-7和存在于Siglec-9上的共同决定簇。任选地，被抗体结合的决定簇不存在于一种或多种其他Siglec上，例如，Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-8、Siglec-10、Siglec-11和Siglec-12中的一种或多种(或全部)。
在本文的任何实施例中，抗体结合Siglec的细胞外结构域。在本文的某些实施例中，特别是在抗体阻断Siglec与其唾液酸配体之间的相互作用时，抗体可以在Siglec的唾液酸结合结构域内或附近至少部分地结合。在本文的其他实施例中，特别是在抗体不阻断Siglec与其唾液酸配体之间的相互作用时，抗体可以在Siglec的唾液酸结合结构域外部结合。
在本文的任何实施例中，在与人类淋巴细胞(例如，原代NK细胞)上的Siglec结合后，单克隆抗体具有重构具有Siglec的唾液酸配体的人类靶细胞在靶细胞表面上的裂解的能力(当所述靶细胞与所述淋巴细胞接触时)。
在本文的任何实施例中，对于与Siglec多肽(例如，人类Siglec-7和/或人类Siglec-9)的结合，抗体具有小于10-8M、优选地小于10-9M的KD(例如，对于单价结合，如根据本文实例中所披露的方法确定的)。因为认为Siglec-7和Siglec-9结合位点由于与大量表达的低亲和力唾液酸的顺式相互作用而通常在细胞表面被掩盖，因此可发生与表达更高亲和力(和配体相比)的抗体的反式相互作用，与顺式相互作用竞争。在一个实施例中，中和性抗Siglec抗体能够置换唾液酸苷配体与Siglec(例如，Siglec-7和/或Siglec-9)的结合。
本发明还提供了具有任何前述特性(单独的或以任何合适的组合)的人或人源化抗体或抗体片段或其衍生物。
在一个方面，提供了竞争结合被mAbA、-B、-C、-D、-E和/或-F结合的Siglec-9上的表位(例如，与具有mAbA、-B、-C、-D、-E和/或-F中任一种的重链和轻链CDR或可变区的抗体竞争结合Siglec-9多肽上的表位)的单克隆抗体。
在一个方面，提供了竞争结合被mAb1、-2、-3、-4、-5和/或-6结合的Siglec-7和/或Siglec-9上的表位(例如，与具有mAb1、-2、-3、-4、-5或-6中任一种的重链和轻链CDR或可变区的抗体竞争结合Siglec-7和/或Siglec-9多肽上的表位)的单克隆抗体。
在一个方面，抗Siglec抗体与在残基N82、P83、A84、R85、A86和/或V87处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-7多肽具有降低的结合。在一个方面，抗Siglec-7抗体与在残基N81、D100、H102和/或T103处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-7多肽具有降低的结合。在一个方面，抗Siglec-7抗体与在残基W88、E89、E90、R92处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-7多肽具有降低的结合。突变的残基位置参考SEQ IDNO:1的Siglec-7多肽。任选地，抗体不会丧失对表3的一种或多种其他突变体Siglec-7多肽(例如，突变体M6、M8、M15或M16中的一种或多种(或全部))的结合。
在一个方面，抗Siglec抗体与在残基N78、P79、A80、R81、A82和/或V83处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-9多肽具有降低的结合。在一个方面，抗Siglec-9抗体与在残基N77、D96、H98和/或T99处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-9多肽具有降低的结合。在一个方面，抗Siglec-9抗体与在残基W84、E85、E86和/或R88处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-9多肽具有降低的结合。突变的残基位置参考SEQ IDNO:2的Siglec-9多肽。任选地，抗体不会丧失对表3的一种或多种其他突变体Siglec-9多肽(例如，突变体M6、M8、M15或M16中的一种或多种(或全部))的结合。
在一个方面，抗Siglec抗体与在残基S47、H48、G49、W50、I51、Y52、P53和/或G54处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-9多肽具有降低的结合。突变的残基位置参考SEQ ID NO:2的Siglec-9多肽。任选地，抗体不会丧失对表3的一种或多种其他突变体Siglec-9多肽(例如突变体9、10和/或11、或突变体M7或M8中的一种或多种(或全部))的结合。
在一个方面，抗Siglec抗体与在残基P55、H58、E122、G124、S125和/或K127处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-9多肽具有降低的结合。突变的残基位置参考SEQ ID NO:2的Siglec-9多肽。任选地，抗体不会丧失对表3的一种或多种其他突变体Siglec-9多肽(例如突变体9、10和/或11)的结合。
在一个方面，抗Siglec抗体与在残基K131和/或H132处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-9多肽具有降低的结合。突变的残基位置参考SEQ ID NO:2的Siglec-9多肽。任选地，抗体不会丧失对表3的一种或多种其他突变体Siglec-9多肽(例如突变体9、10和/或11、或突变体M8或M15中的一种或多种(或全部))的结合。
在一个方面，抗Siglec抗体与在残基R63、A66、N67、T68、D69、Q70和/或D71处具有突变(例如，如表3中列出的突变)的Siglec-9多肽具有降低的结合。突变的残基位置参考SEQ ID NO:2的Siglec-9多肽。任选地，抗体不会丧失对表3的一种或多种其他突变体Siglec-9多肽(例如突变体9、10和/或11、或突变体M6、M15或M16中的一种或多种(或全部))的结合。
在一个实施例中，提供了抗原结合化合物，其包含Siglec-7和/或Siglec-9多肽的重链和轻链CDR1、2和3，或与选自下组的抗体结合相同的表位和/或竞争结合Siglec-7和/或Siglec-9多肽，该组由以下组成：
(a)包含(i)含有SEQ ID NO:3的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:4的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；
(b)包含(i)含有SEQ ID NO:5的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:6的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；
(c)包含(i)含有SEQ ID NO:7的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:8的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；
(d)包含(i)含有SEQ ID NO:9的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:10的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；
(e)包含(i)含有SEQ ID NO:11的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:12的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；以及
(f)包含(i)含有SEQ ID NO:13的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:14的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体。
(g)包含(i)含有SEQ ID NO:15的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:16的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；
(h)包含(i)含有SEQ ID NO:17的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:18的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；
(i)包含(i)含有SEQ ID NO:19的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:20的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；
(j)包含(i)含有SEQ ID NO:21的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:22的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；
(k)包含(i)含有SEQ ID NO:23的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:24的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体；以及
(l)包含(i)含有SEQ ID NO:25的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQID NO:26的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的单克隆抗体。
在本发明的任何实施例的一个方面，结合Siglec-9多肽的抗体可以含有具有选自下组的抗体的重链的一个、两个或三个CDR的重链，该组由以下组成：抗体mAbA、-B、-C、-D、-E和-F；以及具有选自下组的相应抗体的轻链的一个、两个或三个CDR的轻链，该组由以下组成：抗体mAbA、-B、-C、-D、-E和-F。
在一个方面，提供了结合人类Siglec-9多肽的抗原结合结构域或抗体，该抗原结合结构域或抗体包括：包含氨基酸序列SYWMH(SEQ ID NO:75)的重链CDR1；包含氨基酸序列EINPSNGHTNYNEKFES(SEQ ID NO:78)的重链CDR2；包含氨基酸序列GVESYDFDDALDY(SEQ IDNO:80)的重链CDR3；包含氨基酸序列RASQDINNYLN(SEQ ID NO:83)的轻链CDR1；包含氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:57)的轻链CDR2；包含氨基酸序列QQGNTLPFT(SEQ ID NO:86)的轻链CDR3；以及人类重链和轻链框架序列。
在一个方面，提供了结合人类Siglec-9多肽的抗原结合结构域或抗体，该抗原结合结构域或抗体包括：包含氨基酸序列SYWMH(SEQ ID NO:75)的重链CDR1；包含氨基酸序列EINPSNGHTNYNEKFKT(SEQ ID NO:90)的重链CDR2；包含氨基酸序列GVETYDFDDAMDY(SEQ IDNO:92)的重链CDR3；包含氨基酸序列RASQDINNYLN(SEQ ID NO:83)的轻链CDR1；包含氨基酸序列FTSRLHS(SEQ ID NO:95)的轻链CDR2；包含氨基酸序列QQGDTFPFT(SEQ ID NO:96)的轻链CDR3；以及人类重链和轻链框架序列。
在一个方面，提供了结合人类Siglec-9多肽的抗原结合结构域或抗体，该抗原结合结构域或抗体包括：包含氨基酸序列NYEMN(SEQ ID NO:98)的重链CDR1；包含氨基酸序列WINTYTGESTYADDFK(SEQ ID NO:101)的重链CDR2；包含氨基酸序列DDYGRSYGFAY(SEQ IDNO:103)的重链CDR3；包含氨基酸序列RASESVDSYGNSFMH(SEQ ID NO:106)的轻链CDR1；包含氨基酸序列LASKLES(SEQ ID NO:109)的轻链CDR2；包含氨基酸序列HQNNEDPPWT(SEQ IDNO:110)的轻链CDR3；以及人类重链和轻链框架序列。
在一个方面，提供了结合人类Siglec-9多肽的抗原结合结构域或抗体，该抗原结合结构域或抗体包括：包含氨基酸序列DYSMH(SEQ ID NO:112)的重链CDR1；包含氨基酸序列WIITETGEPTYADDFRG(SEQ ID NO:115)的重链CDR2；包含氨基酸序列DFDGY(SEQ ID NO:117)的重链CDR3；包含氨基酸序列RASENIYSYLA(SEQ ID NO:119)的轻链CDR1；包含氨基酸序列NAKTLTE(SEQ ID NO:122)的轻链CDR2；包含氨基酸序列QHHYGFPWT(SEQ ID NO:123)的轻链CDR3；以及人类重链和轻链框架序列。
在一个方面，提供了结合人类Siglec-9多肽的抗原结合结构域或抗体，该抗原结合结构域或抗体包括：包含氨基酸序列TFGMH(SEQ ID NO:125)的重链CDR1；包含氨基酸序列YISSGSNAIYYADTVKG(SEQ ID NO:128)的重链CDR2；包含氨基酸序列PGYGAWFAY(SEQ IDNO:130)的重链CDR3；包含氨基酸序列RASSSVSSAYLH(SEQ ID NO:133)的轻链CDR1；包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:136)的轻链CDR2；包含氨基酸序列QQYSAYPYT(SEQ ID NO:137)的轻链CDR3；以及人类重链和轻链框架序列。
在一个方面，提供了结合人类Siglec-9多肽的抗原结合结构域或抗体，该抗原结合结构域或抗体包括：包含氨基酸序列DYSMH(SEQ ID NO:112)的重链CDR1；包含氨基酸序列VISTYNGNTNYNQKFKG(SEQ ID NO:139)的重链CDR2；包含氨基酸序列RGYYGSSSWFGY(SEQID NO:141)的重链CDR3；包含氨基酸序列KASQNVGTDVA(SEQ ID NO:144)的轻链CDR1；包含氨基酸序列SASYRYS(SEQ ID NO:147)的轻链CDR2；包含氨基酸序列QQYNSFPYT(SEQ ID NO:148)的轻链CDR3以及人类重链和轻链框架序列。
在本发明的任何实施例的一个方面，结合Siglec-7和Siglec-9多肽的抗体可以包含具有选自下组的抗体的相应重链和/或轻链的一个、两个或三个CDR的重链和/或轻链，该组由以下组成：抗体mAb1、-2、-3、-4、-5和-6；
在本发明的任何实施例的一个方面，与Siglec的结合可以被规定为细胞Siglec，其中该Siglec在细胞表面表达，例如天然或经修饰的细胞Siglec、由重组宿主细胞表达的Siglec、由NK细胞、CD8T细胞等表达的Siglec。
本发明还提供了编码具有任何前述特性的人或人源化抗体或抗体片段的核酸、包含这种核酸的载体、包含这种载体的细胞、以及产生人类抗Siglec抗体的方法，该方法包括在适合于表达抗Siglec抗体的条件下培养这种细胞。本发明还涉及组合物如药学上可接受的组合物和试剂盒，该组合物和试剂盒包含此类蛋白质、核酸、载体和/或细胞以及典型地一种或多种另外的成分，这些另外的成分可以是活性成分或者促进组合物的配制、递送、稳定性或其他特征的非活性成分(例如，各种载体)。本发明进一步涉及，如在调节Siglec介导的生物活性中，例如在治疗与其相关的疾病(尤其是癌症和感染性疾病)中，制造和使用此类抗体、核酸、载体、细胞、生物体和/或组合物的各种新的且有用的方法。
在另一个方面，提供了产生中和Siglec-9的抑制活性的抗体的方法，该方法包括：
(a)提供结合Siglec-9多肽的多种抗体，
(b)选择中和Siglec-9多肽任选地在原代人类NK细胞例如CD56dimNK细胞中的抑制活性的抗体(例如步骤(a)的那些抗体)，并且(c)选择基本上不阻断Siglec-9多肽与其唾液酸配体之间的相互作用的抗体(例如步骤(b)的那些抗体)。在一个实施例中，Siglec-9多肽在细胞(例如CHO细胞、淋巴细胞、NK细胞)的表面上表达。
在另一个方面，提供了产生中和Siglec-9的抑制活性的抗体的方法，该方法包括：
(a)提供结合Siglec-9多肽的多种抗体，
(b)选择中和Siglec-9多肽任选地在原代人类NK细胞例如CD56dim NK细胞中的抑制活性的抗体(例如步骤(a)的那些抗体)，并且
(c)选择基本上阻断Siglec-9多肽与其唾液酸配体之间的相互作用的抗体(例如步骤(b)的那些抗体)，任选地选择阻断Siglec-9的唾液酸配体Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb和6'-唾液酸乳糖两者的抗体。
在另一个方面，提供了产生中和Siglec-7的抑制活性的抗体的方法，该方法包括：
(a)提供结合Siglec-7多肽的多种抗体，
(b)选择中和Siglec-7多肽的抑制活性的抗体(例如步骤(a)的那些抗体)，并且
(c)选择基本上不阻断Siglec-7多肽与其唾液酸配体之间的相互作用的抗体(例如步骤(b)的那些抗体)。在一个实施例中，Siglec-7多肽在细胞(例如CHO细胞、淋巴细胞、NK细胞)的表面上表达。
应当理解，任何上述方法中的步骤(b)和(c)可以按任何所希望的顺序进行。
在另一个方面，提供了产生中和Siglec-9和Siglec-7的抑制活性的抗体的方法，该方法包括：
(a)提供结合Siglec-9和Siglec-7多肽的多种抗体，
(b)选择中和Siglec-9多肽和Siglec-7多肽任选地在原代人类NK细胞中例如在CD56bright和CD56dim NK细胞中的抑制活性的抗体(例如步骤(a)的那些抗体)。
在一个实施例中，选择中和Siglec的抑制活性的抗体可以包括选择加强原代NK细胞的抗体(例如，如获自人类供体的纯化的NK细胞；例如根据实例10的方法)。
在一个实施例中，确定抗体是否中和两种不同Siglec基因产物中任一种的抑制活性包括评估当使表达一种或多种Siglec的淋巴细胞与靶细胞(例如，表达该一种或多种Siglec的配体的细胞)接触时抗体是否引起细胞毒性标记的增加(例如，CD107和/或CD137的表达增加)。细胞毒性标记的增加(例如，CD107和/或CD137的表达增加)表明该抗体能够中和一种或多种Siglec基因产物的抑制活性。
本发明还提供了用于调节表达Siglec-7和/或Siglec-9的淋巴细胞(任选地NK细胞和/或CD8+T细胞)的活性的体外方法，该方法包括使在细胞表面表达Siglec-7和/或Siglec-9的淋巴细胞(例如原代NK细胞)与中和Siglec-7和Siglec-9的抑制活性的抗体接触。
本发明还提供了增强和/或调节对其有需要的受试者中淋巴细胞(例如，NK细胞、CD8+T细胞)的活性的方法，例如通过调节CD56dim NK细胞(主要的细胞毒性亚群)和任选地另外的CD56bright NK细胞(在淋巴结和扁桃体中并且在活化时主要响应细胞因子产生的大多数NK细胞)来增强NK细胞活性的方法，该方法包括向受试者给予有效量的任何前述组合物。在一个实施例中，受试者是患有癌症的患者。例如，患者可能患有造血细胞癌，例如急性髓细胞白血病、慢性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤。可替代地，患者可能患有实体瘤，例如结直肠癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌或恶性黑色素瘤。在另一个实施例中，受试者是患有感染性疾病的患者。
这些方面将在本文提供的本发明的描述中更加完全地描述，并且另外的方面、特征和优点将是明显的。
附图说明
图1显示了抗Siglec抗体与NK细胞的结合。Siglec MFI：荧光强度均值。显著部分(约44％)的NK细胞表达Siglec-7和Siglec-9两者，表明随着例如存在于肿瘤细胞上的聚糖配体的变化，大部分NK细胞可以被这些受体中的每一种(或全部两种)抑制。
图2显示了来自流式细胞术的针对以下抗体实例的代表性结果，这些抗体与Siglec-7而非Siglec-9或食蟹猴Siglec结合(右图)，与Siglec-7、Siglec-9和食蟹猴Siglec中的每一种结合(中间图)，以及与Siglec-9而非Siglec-7或食蟹猴Siglec结合(左图)。
图3显示了针对抗体mAbA、mAbC和mAbD与moDC(左侧图)和神经氨酸酶处理的moDC(右侧图)的结合，通过流式细胞术的滴定，连同它们相应的EC50值。在神经氨酸酶处理后EC50高度增强(10倍)，表明在神经氨酸酶处理前，在moDC上表达的Siglec-9与其唾液酸配体发生了顺式相互作用。然而，平台期水平未改变，表明抗体可以结合细胞表面上的所有Siglec-9(结合的和未结合的)构象并抑制monoDC中以及其他细胞类型(例如，单核细胞和巨噬细胞M1和M2)中的顺式相互作用和信号传导。
图4显示了Siglec-7和Siglec-9交叉反应性抗体之间(图4B)和Siglec-9单特异性(非Siglec-7结合型)抗体之间(图4A)的YTS Siglec-9*细胞毒性增加的剂量依赖性诱导。
图5显示了使用原代NK细胞(作为从供体纯化的新鲜NK细胞)和HT29结直肠癌细胞，在经典的51Cr释放测定中，在两种不同人类供体(供体D1(左侧图)和D2(右侧图))中由抗体mAbA、mAbC、mAbD、mAbE和mAbF介导的原代NK细胞细胞毒性增加。
图6显示了在HT29肿瘤细胞存在的情况下在一个人类供体中由几种抗Siglec-9和抗Siglec-7/9抗体mAbA、mAbB、mAbF、mAb6和mAb4介导的表达CD137的Siglec-9阳性NK细胞的％增加。抗Siglec-9抗体将表达Siglec-9的原代人类NK细胞的细胞毒性完全恢复至在来自相同供体的Siglec-9阴性原代人类NK细胞中观察到的水平。
图7显示了抗体mAbA和mAb1诱导Siglec-9阳性CD137+NK细胞(％)(中间图)而非Siglec-9阴性CD137+NK细胞(％)(右侧图)的增加。在左侧图中显示了在不存在抗体的情况下表达CD137的NK的％。
图8显示了在抗体存在的情况下Siglec-9-Fc蛋白与Ramos细胞的结合(顶图)。抗Siglec/9mAb mAbA、mAbB、mAbC和mAbD各自抑制Siglec-9-Fc蛋白与Ramos细胞的结合，然而mAbE显示部分抑制并且mAbF不抑制结合。底图中显示了在抗体存在的情况下Siglec-9-Fc蛋白与K562细胞的结合。抗Siglec/9mAb mAbA、mAbB、mAbC和mAbD各自抑制Siglec-9-Fc蛋白与Ramos细胞的结合，然而mAbE和mAbF两者显示部分抑制。
图9和10显示了使用ELISA测定测试了通过抗Siglec-7/9抗体阻断Siglec-7和Siglec-9与唾液酸化配体之间的相互作用。图9显示mAb 1、2、4、5和6阻断了Siglec-7与Sia2的相互作用，但mAb3没有。图10显示所有mAb阻断Siglec-9与Sia2的相互作用，然而mAb1、mAb2和mAb3显示了抑制Siglec-9与Sia1相互作用的能力低，并且因此基本上不阻断Sia1相互作用。
图11-14显示了人类Siglec-9蛋白。图11显示了Siglec-9N-末端V-组Ig-样结构域的结构，其中在Siglec-9突变体M9、M10和M11中被取代的残基以深色阴影显示。图12显示了Siglec-9N-末端V-组Ig-样结构域的结构，其中在Siglec-9突变体M6和M7中被取代的残基以深色阴影显示。图13显示了Siglec-9N-末端V-组Ig-样结构域的结构，其中在Siglec-9突变体M16中被取代的残基以深色阴影显示。图14显示了Siglec-9N-末端V-组Ig-样结构域的结构，其中在Siglec-9突变体M8中被取代的残基以深色阴影显示。在图11-14中的每一个中，唾液酸配体结合位点以浅色阴影显示。
具体实施方式
定义
如说明书中使用的，“一个/一种(a或an)”可以意指一个/一种或多个/多种。如在权利要求中使用的，当与词“包含(comprising)”结合使用时，词“一个/一种(a或an)”可以意指一个/一种或多于一个/一种。如本文所使用的，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
在使用“包含(comprising)”的情况下，这可以任选地被“基本上由……组成(consisting essentially of)”或被“由……组成(consisting of)”替换。
人类Siglec-7(以Genbank登录号NP_055200.1显示，其全部披露内容通过引用并入本文)是CD33相关的Siglec家族的成员(Angata和Varki,Glycobiology[糖生物学]10(4),431-438(2000))。人类Siglec-7包含467个氨基酸，具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0001783781250000231
人类Siglec-9(以Genbank登录号NP055256.1显示，其全部披露内容通过引用并入本文)是CD33相关的Siglec家族的成员(Angata和Varki,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]275(29),22127-22135(2000))。人类Siglec-9包含463个氨基酸，具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0001783781250000232
Figure BDA0001783781250000241
在本发明的上下文中，“中和Siglec介导的对NK细胞细胞毒性的抑制”、“中和Siglec介导的对T细胞细胞毒性的抑制”或“中和Siglec的抑制活性”是指如下过程，在该过程中Siglec(例如，Siglec-7、Siglec-9)在它的能力范围内被抑制至负面影响细胞内过程，从而导致淋巴细胞应答如细胞因子释放和细胞毒性应答。这可以例如在基于标准NK或T细胞的细胞毒性测定中测量，其中测量了治疗化合物刺激Siglec阳性淋巴细胞杀伤唾液酸配体阳性细胞的能力。在一个实施例中，抗体制剂引起Siglec限制性淋巴细胞的细胞毒性至少增加10％、任选地至少增加40％或50％的淋巴细胞细胞毒性、或任选地至少增加70％的NK细胞毒性，并参考所述的细胞毒性测定。在一个实施例中，抗体制剂引起Siglec限制性淋巴细胞的细胞因子释放增加至少10％、任选地细胞因子释放增加至少40％或50％、任选地细胞因子释放增加至少70％，并参考所述的细胞毒性测定。在一个实施例中，抗体制剂引起Siglec限制性淋巴细胞的细胞毒性标记(例如CD107和/或CD137)的细胞表面表达增加至少10％、任选地增加至少40％或50％、或任选地细胞毒性标记(例如CD107和/或CD137)的细胞表面表达增加至少70％。
抗Siglec抗体“阻断”Siglec分子与唾液酸配体结合的能力意指在使用可溶性或细胞表面相关的Siglec和唾液酸分子的测定中，抗体可以剂量依赖性方式可检测地降低Siglec分子与唾液酸分子的结合，其中在不存在抗体的情况下该Siglec分子与唾液酸分子可检测地结合。
当在这整个说明书内关于抗Siglec结合剂(例如抗体)提及“癌症的治疗”或类似物时，意味着：(a)治疗癌症的方法，所述方法包括向对此类治疗有需要的个体、哺乳动物、尤其是人类，以允许治疗癌症的剂量(治疗有效量)、优选地以如本文所规定的剂量(量)给予(对于至少一种治疗)抗Siglec结合剂(优选地在药学上可接受的载体材料中)的步骤；(b)使用抗Siglec结合剂用于治疗癌症，或使用抗Siglec结合剂用于所述治疗(尤其是在人类中)；(c)使用抗Siglec结合剂用于制造用于治疗癌症的药物制剂，使用抗Siglec结合剂用于制造用于治疗癌症的药物制剂(包括混合抗Siglec结合剂与药学上可接受的载体)或包含有效剂量的适用于治疗癌症的抗Siglec结合剂的药物制剂的方法；或者(d)a)、b)和c)的任何组合，这是根据允许在提交本申请的国家取得专利权的本发明主题。
如本文所用的，术语“抗原结合结构域”是指包含能够免疫特异性地结合到表位的三维结构的结构域。因此，在一个实施例中，所述结构域可以包含高变区，任选地抗体链的VH和/或VL结构域，任选地至少VH结构域。在另一个实施例中，该结合结构域可以包含抗体链的至少一个互补决定区(CDR)。在另一个实施例中，该结合结构域可以包含来自非免疫球蛋白支架的多肽结构域。
如在本文可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体及其任何抗原结合片段或单链。典型的抗体包括由二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由一个重链可变区(VH)和一个重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。每条轻链由一个轻链可变区(VL)和一个轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域(CL)构成。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每个链的N端定义了具有约100至110个或更多个氨基酸的一个可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。这些中的几个被进一步分为亚类或同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。IgG是在此使用的示例性抗体类别，因为它们是生理状况下最常见的抗体且在实验室条件下最容易制备。任选地，该抗体是单克隆抗体。抗体的具体实例是人源化的、嵌合的、人的或其他适合人的抗体。“抗体”还包括任何本文所述抗体的任何片段或衍生物。
“交叉反应性”抗Siglec抗体是以特异性和/或亲和力结合多于一种Siglec分子的抗体。例如，单克隆抗体可以与Siglec-7和Siglec-9交叉反应。
术语“特异性地结合至”意指优选地在竞争性结合测定中抗体可以结合至结合配偶体(例如Siglec-7、Siglec-9)上，如使用重组形式的蛋白质、其中的表位、或存在于分离的靶细胞表面上的天然蛋白所评估的。用于确定特异性结合的竞争性结合测定和其他方法在下面进一步描述，并且在本领域中是熟知的。
当抗体被称为与特定的单克隆抗体竞争时，它意指在使用重组Siglec分子或表面表达的Siglec分子的结合测定中，该抗体与该单克隆抗体竞争。例如，如果测试抗体在结合测定中降低参考抗体与Siglec多肽或表达Siglec的细胞的结合，那么该抗体被称为相应地与参考抗体“竞争”。
如在此使用的术语“亲和力”意指一种抗体与一种表位结合的强度。一种抗体的亲和性通过解离常数Kd(定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag])给出，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和力常数Ka是由1/Kd定义的。用于确定mAb的亲和力的方法可以发现于Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港实验室],纽约州,1988)；Coligan等人，编辑,Current Protocols in Immunology[当代免疫学实验手册],GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience[格林出版联盟和威利国际科学出版公司],纽约州,(1992,1993)；以及Muller,Meth.Enzymol.[酶学方法]92:589-601(1983)，将这些参考文献通过引用整体并入本文。本领域中熟知的用于确定mAb亲和力的一种标准的方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTMSPR分析装置分析)。
在本文的上下文中，“决定簇”指明多肽上相互作用或结合的位点。
术语“表位”是指一种抗原决定簇，并且是在抗原上与抗体结合的面积或区域。一个蛋白质表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基连同通过特异性抗原结合的抗体或肽被有效地阻断的氨基酸残基，即，抗体“足迹”内的氨基酸残基。它是可以与例如一种抗体或一种受体组合的复杂抗原分子上的最简单形式或最小结构区域。表位可以是线性的或构象性的/结构性的。术语“线性表位”被定义为由在氨基酸的线性序列(一级结构)上连续的氨基酸残基构成的表位。术语“构象性或结构性表位”被定义为一种由并非都是连续的氨基酸残基构成的表位，并且因此代表通过分子的折叠彼此进入接近状态(二级、三级和/或四级结构)的线性氨基酸序列的分开的部分。构象性表位依赖于三维结构。因此，术语“构象性”经常与“结构性”互换使用。
关于表达Siglec的细胞(例如，表达Siglec-7或Siglec-9的淋巴细胞)，术语“耗减(deplete)”或“耗减性(depleting)”意指导致杀伤、消除、裂解或诱导此类杀伤、消除或裂解的过程、方法或化合物，以便负面影响存在于样品或受试者中的此类表达Siglec的细胞的数量。关于过程、方法或化合物，“非耗减性”意指该过程、方法或化合物没有被耗减。
本文使用术语“药剂”来表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、或由生物材料制成的提取物。术语“治疗剂”是指一种具有生物活性的药剂。
出于本文的目的，“人源化”或“人类”抗体是指一种或多种人类免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区(例如CDR)相融合的一种抗体。这类抗体被设计成保持衍生出这些结合区的非人类抗体的结合特异性，但是却要避免对抗非人类抗体的免疫反应。此类抗体可获自已经被“工程化”以产生响应于抗原激发的特异性人类抗体的转基因小鼠或其他动物(参见，例如，Green等人(1994)Nature Genet[自然遗传学]7:13；Lonberg等人(1994)Nature[自然]368:856；Taylor等人(1994)Int Immun[国际免疫学]6:579，将其全部传授内容通过引用并入本文)。还可以通过遗传学或染色体转染方法、以及噬菌体展示技术来构建完全人类抗体，所有这些在本领域内是已知的((参见，例如，McCafferty等人.(1990)Nature[自然]348:552-553))。人类抗体也可以通过体外活化的B细胞产生(参见，例如，美国专利号5,567,610和5,229,275，通过引用以其全文并入本文)。
“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一部份被改变、替换或交换，这样使得抗原结合位点(可变区)被连接至不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区，或连接至赋予该嵌合抗体新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区或其一部份被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。
当在本文中使用时，术语“超变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区通常包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及在重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；卡巴特(Kabat)等人(1991)和/或来自“超变环”的那些残基(例如，在轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及在重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol[分子生物学杂志]1987；196:901-917)，或用于确定负责抗原结合的必需氨基酸的类似系统。典型地，这个区域中的氨基酸残基的编号通过Kabat等人，同上中所描述的方法进行。短语如本文的“Kabat位置”、“如在Kabat中对可变结构域残基进行编号”和“根据Kabat”是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际直链氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的更少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包含在CDR H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
如本文所使用的，“框架”或“FR”残基意指排除定义为CDR的那些区域的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可以进一步细分为由CDR分开的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
术语“Fc结构域”、“Fc部分”、以及“Fc区”是指抗体重链的C-末端片段，例如人类γ(伽马)重链的从约氨基酸(aa)230至约aa 450或其他类型的抗体重链(例如人类抗体的α、δ、ε和μ)中的其对应序列、或其天然存在的同种异型。除非另外指明，贯穿本披露使用普遍接受的免疫球蛋白卡巴特氨基酸编号(参见卡巴特(Kabat)等人(1991)免疫学上感兴趣的蛋白的序列(Sequences of Protein of Immunological Interest)，第5版，美国公共卫生署(United States Public Health Service)，美国国立卫生研究院(National Instituteof Health)，贝塞斯达，马里兰州)。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指基本上或本质上不含在天然状态下发现的通常伴随其的组分的物质。纯度和均质性典型地是使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定的。制剂中存在的主要种类的蛋白基本上是纯化的。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在此可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语应用到氨基酸聚合物上，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然发生氨基酸的一种人工化学模拟物，并且应用到天然发生的氨基酸聚合物以及非天然发生的氨基酸聚合物上。
术语“重组”当用于指例如一种细胞、核酸、蛋白或载体时表明该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过导入异源核酸或蛋白或者改变天然的核酸或蛋白进行修饰，或者表明该细胞衍生自这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内部找不到的基因，或表达天然基因然而却异常表达、低表达或根本不表达。
在此上下文中，“结合”多肽的或表位的术语抗体指定一种结合所述具有特异性和/或亲和性决定簇的抗体。
术语“一致性”或“一致的”当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系时，是指多肽之间的序列关联程度，如通过两个或更多个氨基酸残基链之间匹配的数目来确定的。“一致性”使用由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)解决的空位比对(如果有的话)测量两个或更多个序列中较短序列之间的一致匹配的百分比。相关多肽的一致性可以通过已知方法容易地计算出。此类方法包括但不限于在以下文献中描述的那些：ComputationalMolecular Biology[计算分子生物学],Lesk,A.M.,编辑,Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目]Smith,D.W.,编辑,Academic Press[学术出版社],纽约,1993；Computer Analysis of Sequence Data[序列数据的计算机分析],第1部分，Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑，Humana Press[胡玛纳出版社]，新泽西州，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology[分子生物学的序列分析],von Heinje,G.，AcademicPress[学术出版社]，1987；Sequence Analysis Primer[序列分析引物],Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑，M.Stockton Press[斯托克顿出版社]，纽约，1991；以及Carillo等人，SIAM J.Applied Math.[工业和应用数学学会应用数学杂志]48,1073(1988)。
用于确定一致性的方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。确定一致性的方法描述于可公开获得的计算机程序中。用于确定两个序列之间一致性的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.[核酸研究]12,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis[遗传学计算机组，威斯康星大学，麦迪逊，威斯康星州]、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215,403-410(1990))。BLASTX程序可以公开地获自美国国家生物技术信息中心(NCBI)以及其他来源(BLAST Manual[BLAST手册],Altschul等人NCB/NLM/NIH贝塞斯达，马里兰州20894；Altschul等人，同上)。熟知的史密斯-沃特曼算法(Smith Watermanalgorithm)也可以用来确定一致性。
抗体的产生
用于治疗疾病(例如癌症、感染性疾病)的抗Siglec剂结合人类Siglec-9蛋白的细胞外部分(并且任选地进一步结合人类Siglec-7蛋白，有或没有进一步的Siglec-12结合)并且降低在Siglec阳性免疫细胞表面上表达的人类Siglec的抑制活性。在一个实施例中，该药剂抑制唾液酸分子在嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、M2巨噬细胞、NK细胞和/或CD8+T细胞中通过Siglec引起抑制性信号传导的能力。
在一个实施例中，本文所述的抗Siglec剂可以用于增加人类或人类供体中NK细胞和/或嗜中性粒细胞对具有Siglec配体的靶细胞(例如癌细胞)的细胞毒性。NK细胞和嗜中性粒细胞是识别并直接杀伤微生物和癌细胞的特化粒细胞。显示在肿瘤细胞表面上表达的唾液酸降低NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。这些抗体可以用于增强NK细胞细胞毒性，例如以便将细胞毒性水平恢复到在其表面不表达特定的Siglec的NK细胞或嗜中性粒细胞中基本上观察到的水平。
唾液酸还在树突细胞上高度表达，并且已被描述调节几种DC功能，包括对TLR刺激的反应性。唾液酸合成的阻断降低了TLR刺激的moDC的活化阈值，并且Siglec-E缺失增强了对几种微生物TLR配体的树突细胞反应。Siglec-9是小鼠中最接近的Siglec-E的人类直系同源成员，阻断抗Siglec-9抗体可以增强树突细胞活化并调节DC-T相互作用。用唾液酸修饰抗原调节了抗原特异性调节性T(Treg)细胞的生成，并阻止经由树突细胞形成效应CD4+和CD8+T细胞。树突细胞的吞噬能力也可以通过α2,6-唾液酸缺乏得以改善。
Siglec-7和Siglec-9两者都在M1和M2型巨噬细胞上表达，并且Siglec-9的敲低已被描述为可调节各种表面表达标记(例如CCR7和CD200R)，表明通过Siglec-9对巨噬细胞功能的调节。实际上，在巨噬细胞系中转染了各种Siglec-9突变体(ITIM结构域中的突变)，并且证明了Siglec-9增强抗炎症性细胞因子IL-10的产生。Siglec-9与可溶性配体的结合还可以诱导巨噬细胞显示肿瘤相关的巨噬细胞样表型，其中检查点配体PD-L1的表达增加。
在一个实施例中，该药剂与唾液酸分子竞争结合Siglec，即该药剂阻断Siglec与其唾液酸配体之间的相互作用。
在本发明的一个方面，该药剂是一种抗体，该抗体选自全长抗体、抗体片段以及合成或半合成抗体衍生的分子。
在本发明的一个方面，该药剂是一种抗体，该抗体选自完全人类抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
在本发明的一方面中，该药剂是一种抗体的片段，该抗体选自IgA、IgD、IgG、IgE和IgM抗体。
在本发明的一个方面，该药剂是一种抗体的片段，该抗体包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定结构域。
在本发明的一个方面，该药剂是选自以下的抗体片段：Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、Fv片段、重链Ig(美洲驼或骆驼Ig)、VHH片段、单结构域FV和单链抗体片段。
在本发明的一个方面，该药剂是选自以下的合成的或半合成的抗体衍生的分子：scFV、dsFV、微小抗体、双抗体、三抗体、κ体、IgNAR；以及多特异性抗体。
因此，本发明涉及与Siglec结合的抗体和抗原结合结构域(以及包含前述的多肽)。在一个方面，抗体或抗原结合结构域与Siglec-7和/或Siglec-9以比与另外的人类Siglec(例如，Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-8、Siglec-10、Siglec-11和/或Siglec-12)的结合低至少100倍的结合亲和力(例如，KD)结合。在一个方面，抗体或抗原结合结构域与Siglec-9而非Siglec-7结合；在一个实施例中，抗体以比与人类Siglec-7多肽结合低至少100倍的结合亲和力(例如，KD)结合人类Siglec-9多肽。在另一个方面，抗体以彼此相差不超过1-log的结合亲和力(例如，KD)结合人类Siglec-9多肽和人类Siglec-7多肽两者，并且其中针对所述Siglec-7和Siglec-9的结合亲和力比与另外的人类Siglec(例如，Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-8、Siglec-10、Siglec-11和/或Siglec-12)的结合亲和力低至少100倍。对于与重组Siglec多肽的结合，可以例如通过表面等离子体共振确定亲和力。
在本发明的一个方面，抗体是纯化的或至少部分纯化的形式。在本发明的一个方面，抗体处于本质上分离的形式。
这些抗体可以通过多种本领域中已知的技术产生。典型地，它们可以通过用包括Siglec多肽(优选地人类Siglec多肽)的免疫原来免疫非人类动物(优选小鼠)来产生。Siglec多肽可以包含人类Siglec-9和/或Siglec-7多肽的全长序列、或其片段或衍生物，典型地为免疫原性片段，即，包含在表达Siglec多肽的细胞表面上暴露的表位的多肽的一部分。这类片段典型地包含至少约7个连续氨基酸的成熟多肽序列，甚至更优选地是至少约10个连续氨基酸的成熟多肽序列。片段典型地基本上是从受体的胞外结构域衍生的。在一个实施例中，免疫原包含在脂质膜中(典型地在细胞表面上)的野生型人类Siglec多肽。在具体实施例中，该免疫原包括完整的细胞，具体是完整的人类细胞(任选地经处理的或经裂解的)。在另一个实施例中，多肽是重组Siglec多肽。
对非人类哺乳动物用抗原免疫进行免疫的步骤可以按任何本领域中熟知的方式进行，以刺激在小鼠体内产生抗体(参见，例如E.哈洛(Harlow)和D.拉内(Lane)，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual.)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约州(NY)(1988)，将该文献的全部披露通过引用结合在此)。免疫原任选地用佐剂(例如完全的或不完全的弗氏佐剂)悬浮或溶解于缓冲剂中。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型和佐剂的量的方法对于本领域的普通技术人员来说是熟知的并且不以任何方式限制。对于不同的免疫原而言，这些参数是不同的，但是易于说明。
类似地，足以刺激产生抗体的免疫的位置和频率也是本领域中熟知的。在一个典型的免疫实验方案中，在第1天用抗原腹膜内注射非人类动物并且在约1周之后再次注射。随后在第20天左右进行抗原的记忆注射(recall injection)，任选地，与佐剂例如不完全弗氏佐剂一起注射。经静脉内进行该记忆注射，并且可重复持续连续数天。随后在第40天进行加强注射，经静脉内或腹膜内，典型地不含佐剂。这种实验方案导致在约40天后产生抗原特异的产生抗体的B细胞。还可以使用其他实验方案，只要它们导致产生表达抗体的B细胞，该抗体针对在免疫中使用的抗原。
在替代性实施例中，将来自未经免疫的非人类哺乳动物的淋巴细胞进行分离、体外培养，并且然后暴露于在细胞培养物中的免疫原。然后收获淋巴细胞，并且进行下面描述的融合步骤。
对于单克隆抗体，下一个步骤是将脾细胞从经免疫的非人类哺乳动物进行分离，并且随后将那些脾细胞与永生化细胞进行融合以便形成产生抗体的杂交瘤。从一种非人类哺乳动物体内分离脾细胞在本领域内史熟知的，并且典型地涉及从一种已麻醉的非人类哺乳动物体内取出脾，将它切成小块，并将脾膜中的脾细胞挤压通过细胞过滤网的尼龙网而进入一种适当的缓冲液中，从而产生一种单细胞悬浮液。将这些细胞洗涤、离心并且再悬浮于裂解任何红细胞的缓冲液中。将该溶液再次离心，将沉淀中剩余的淋巴细胞最终重悬于新鲜缓冲液中。
一旦分离并且存在于单细胞悬液中，这些淋巴细胞即可以融合至永生化细胞系。这典型地为一种小鼠骨髓瘤细胞系，尽管许多其他可用于产生杂交瘤的永生化细胞系在本领域中是已知的。鼠骨髓瘤细胞系包括，但不局限于衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，所述小鼠肿瘤可获得自美国圣地亚哥的细胞分布中心索尔克研究所(Salk InstituteCell Distribution Center,San Diego,U.S.A.)，X63Ag8653和SP-2细胞，可获得自美国马里兰州罗克维尔的美国种质保存中心(American Type Culture Collection,Rockville,Maryland U.S.A.)。融合是使用聚乙二醇或其他类似物实现的。然后，将所得的杂交瘤在选择性培养基中生长，这些选择性培养基包含抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或生存的一种或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地将包含次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
杂交瘤典型地在巨噬细胞的饲养层上生长。这些巨噬细胞优选地是来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物的同窝动物，并且典型地在将杂交瘤涂板之前用不完全弗氏佐剂或类似物预处理数天。在Goding,“Monoclonal Antibodies:Principles and Practice[单克隆抗体：原理和实践]”,第59-103页(Academic Press[学术出版社],1986))中描述了融合方法，该文献的披露内容通过引用并入本文。
允许细胞在选择性培养基中生长足够的时间以供菌落形成和抗体产生。这通常是在大约7天和大约14天之间。
然后测定杂交瘤菌落中特异性地结合Siglec多肽基因产物的抗体的产生。该测定典型地是比色ELISA型测定，但是可采用适合于杂交瘤生长的孔的任何测定。其他测定包括放射免疫测定或荧光激活细胞分选术。对所希望的抗体产生呈阳性的孔进行检查以确定是否存在一种或多种不同的克隆。如果存在多于一个菌落，可以将这些细胞再克隆并且使其生长以确保仅有单个细胞已经产生生成所希望的抗体的克隆。典型地，还将测试抗体与Siglec多肽(例如表达Siglec的细胞)结合的能力。
确认会产生单克隆抗体的杂交瘤可以在适当的培养基(例如DMEM或RPMI-1640)中生长到更大的量。可替代地，杂交瘤细胞可以在一种动物中在体内作为腹水瘤生长。
经过充分生长以产生所希望的单克隆抗体之后，将包含单克隆抗体的生长培养基(或腹水)分离远离这些细胞，并且对存在于其中的单克隆抗体进行纯化。纯化典型地是通过凝胶电泳法、透析、使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖的色谱法，或连接到固体载体(例如琼脂糖或琼脂糖凝胶珠粒(例如，在Antibody Purification Handbook,Biosciences,publication No.18-1037-46,Edition AC中所说明的全部，其披露内容通过引用结合在此)上的抗小鼠Ig来实现的。典型地，所结合的抗体通过使用低pH缓冲液(pH 3.0或更低的甘氨酸或乙酸盐缓冲液)从蛋白质A/蛋白质G柱上洗脱，立即中和含抗体的部分。根据需要将这些部分合并、透析并浓缩。
对具有单个明显集落的阳性孔典型地重新克隆并重新测定，以确保正在检测并在产生仅一个单克隆抗体。
还可以通过选择免疫球蛋白的组合文库来产生抗体，如披露于例如Ward等人，Nature[自然]，341(1989)第544页中，其全部披露内容通过引用并入本文)。
可以针对达到与Siglec多肽最大结合所需的浓度在Siglec上滴定抗体。关于与Siglec多肽(或表达此类多肽的细胞)结合的“EC50”是指抗Siglec抗体产生其关于结合Siglec多肽(或表达此类多肽的细胞)的50％最大响应或效果的有效浓度。
一旦抗体被鉴定为能够结合Siglec和/或具有其他所希望的特性，典型地也将使用标准的方法(包括本文描述的那些)来评价它们结合其他多肽(包括其他Siglec多肽和/或不相关多肽)的能力。理想地，抗体仅以实质的亲和力与Siglec(例如人类Siglec-7和/或人类Siglec-9)结合，并且不以显著水平结合不相关的多肽，尤其是除CD33相关的Siglec之外的多肽、或除所希望的Siglec(例如，Siglec-7和/或Siglec-9)以外的Siglec。然而，应当理解的是，只要针对Siglec的亲和力实质大于(例如5x、10x、50x、100x、500x、1000x、10,000x、或更多)其针对其他Siglec和/或其他不相关多肽的亲和力，那么这些抗体就适合用于本发明的方法中。
可以将抗Siglec抗体制备为非耗减性抗体，这样使得它们具有减少的与人类Fcγ受体的结合或基本上缺乏与人类Fcγ受体的特异性结合。此类抗体可以包含已知不与Fcγ受体结合或对Fcγ受体具有低结合亲和力的各种重链的恒定区。一个这样的实例是人类IgG4恒定区。可替代地，不包含恒定区的抗体片段(例如Fab或F(ab')2片段)可用于避免Fc受体结合。可以根据本领域已知的方法来评估Fc受体结合，这些方法包括例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。而且，可以使用任何抗体同种型，其中Fc部分被修饰以最小化或消除与Fc受体的结合(参见例如WO 03101485，其披露内容通过引用并入本文)。用于评估Fc受体结合的测定例如基于细胞的测定是本领域中熟知的，并且描述于例如WO03101485中。
编码与存在于Siglec多肽上的表位结合的抗体的DNA是分离自杂交瘤，并且将其置于适当的表达载体中以转染到适当的宿主中。然后将该宿主用于重组产生抗体或其变体，如该单克隆抗体的人源化形式、抗体的活性片段、嵌合抗体(包含抗体的抗原识别部分)、或包含可检出部分的形式。
编码单克隆抗体的DNA可以使用常规的程序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)容易地进行分离和测序。一旦被分离，DNA被置于表达载体中，然后将这些载体转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以便在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。如在本说明书的其他地方所说明，可以出于多个目的中任何一项(例如，用于人源化抗体、产生片段或衍生物、或用于修饰抗体的序列)而例如在抗原结合位点中对这类DNA序列进行修饰，从而优化该抗体的结合特异性。在细菌中重组表达编码抗体的DNA在本领域中是熟知的(参见，例如，Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.[免疫学新见]，5,第256页(1993)；以及Pluckthun，Immunol.[免疫学]130,第151页(1992))。
在本发明的上下文中，“共同决定簇”表示由人类抑制性Siglec受体(尤其是CD33相关的Siglec)的几种基因产物共享的决定簇或表位。抗体可以结合由至少Siglec-7和Siglec-9共享的共同决定簇。在一个实施例中，任选地在CD33相关的Siglec(特别是Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-8、Siglec-10、Siglec-11和Siglec-12)中的一种或多种或全部上可能不存在共同决定簇。在一个实施例中，在Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-8、Siglec-10、Siglec-11和Siglec-12上不存在共同决定簇。
与siglec多肽(例如，Siglec-7和/或Siglec-9，特别是与单克隆抗体mAbA、-B、-C、-D、-E或-F(Siglec-9特异的)或者mAb1、-2、-3、-4、-5或-6(Siglec-7/9特异的)具有基本上或本质上相同的表位)结合的一种或多种抗体的鉴定，可以使用多种可以评估抗体竞争的免疫筛选测定中的任何一种容易地确定。许多此类测定是常规实施的并且是本领域中熟知的(参见，例如，美国专利号5,660,827，其通过引用并入本文)。应当理解的是，实际上不再以任何方式要求对在此说明的抗体所结合的表位进行确定以便鉴别结合到与在此说明的单克隆抗体相同的或基本上相同的表位上的抗体。
例如，在待检查的测试抗体获自不同来源的动物、或者甚至属于不同的Ig同种型的情况下，可以采用简单的竞争测定，其中将对照(例如，mAbA、-B、-C、-D、-E或-F或者mAb1、-2、-3、-4、-5或-6)和测试抗体掺和(或预吸附)并施用到含有Siglec多肽的样品上。基于蛋白质印迹法的实验方案和使用BIACORE分析适合用于这类竞争研究。
在某些实施例中，在施用到Siglec抗原样品上之前，技术人员将对照抗体(例如，mAbA、-B、-C、-D、-E或-F或者mAb1、-2、-3、-4、-5或-6)与不同量的测试抗体(例如，约1:10或约1:100)预混合持续一段时间。在其他实施例中，在暴露于Siglec抗原样品期间可以简单地将对照与不同量的测试抗体混合。只要技术人员可以将结合抗体与游离抗体区分(例如，通过使用分离或洗涤技术以清除未结合抗体)，并且将mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6与测试抗体区分(例如，通过使用物种特异性或同种型特异性第二抗体或通过用可检测标签特异性地标记mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6)，技术人员就可以确定测试抗体是否降低了mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6与抗原的结合，表明测试抗体竞争结合和/或识别在Siglec如mAb1、mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6上的共同结合位点。在不存在完全不相关抗体的情况下，(标记的)对照抗体的结合可以用作对照高值。对照低值可以通过将标记的(mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6)抗体与未标记的完全相同类型的抗体(mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6)孵育来获得，其中竞争将出现并降低标记抗体的结合。在测试测定中，在测试抗体存在的情况下标记抗体反应性的显著降低指示测试抗体识别在Siglec上基本上相同的区域，并且与标记的(mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6)抗体“交叉反应”或与其竞争。在约1:10与约1:100之间的mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6:测试抗体的任何比例下，将mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6与Siglec抗原的结合降低至少约50％、如至少约60％、或更优选地至少约80％或90％(例如，约65％-100％)的任何测试抗体被认为是与相应的mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6竞争的抗体。优选地，这样的测试抗体会将相应的mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6与Siglec抗原的结合降低至少约90％(例如，约95％)。
竞争还可以通过例如流式细胞术测试来评价。在这种测试中，具有一种或多种给定的Siglec多肽的细胞可以首先与例如mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6孵育，并且然后与用荧光染料或生物素标记的测试抗体孵育。如果在与饱和量的mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6预孵育后获得的结合是通过抗体没有与相应的mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6预孵育获得的结合(如通过荧光均值测量的)的约80％、优选地约50％、约40％或更少(例如，约30％、20％或10％)，抗体被称为与mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6竞争。可替代地，如果用细胞上相应的标记的mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6抗体(通过荧光染料或生物素)与饱和量的测试抗体预孵育获得的结合是没有与测试抗体预孵育获得的结合的约80％、优选约50％、约40％或更少(例如，约30％、20％或10％)，抗体被称为与mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6竞争。
还可以采用简单的竞争测定，其中测试抗体被预吸收并且在饱和浓度下施用到固定有Siglec抗原的表面上。在这种简单的竞争测定中，该表面优选地是一种BIACORE芯片(或适合用于表面等离子共振分析的其他介质)。然后，在Siglec-饱和的浓度下，使对照抗体(例如，mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6)与表面接触，并且测量与对照抗体的Siglec和表面结合。将对照抗体的结合与在不存在测试抗体的情况下对照抗体与含Siglec的表面的结合进行比较。在测试测定中，在测试抗体存在的情况下对照抗体对含Siglec的表面的结合的显著降低表示测试抗体竞争结合，并且因此可以识别在Siglec上与对照抗体相同的区域，这样使得测试抗体与对照抗体“交叉反应”。将对照(如mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6)抗体与Siglec抗原的结合降低至少约30％或更多、优选约40％的任何测试抗体，可以被认为是与对照(例如，相应的mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6)竞争结合Siglec的抗体。优选地，这种测试抗体会将对照抗体(例如，mAbA、-B、-C、-D、-E、-F、-1、-2、-3、-4、-5或-6)与Siglec抗原的结合降低至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、或更多)。应当理解的是对照和测试抗体的顺序可以逆转。即，在一个竞争测定中可以首先将对照抗体结合到表面上并且之后将测试抗体与该表面接触。优选地，首先将对Siglec抗原具有更高亲和力的抗体结合到表面上，正如将预期的对第二抗体(假设这些抗体是交叉反应的)观察到的结合降低将具有更大的幅度。此类测定的另外的实例提供于例如Saunal(1995)J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]183:33-41，将其披露内容通过引用并入本文。
确定抗体是否结合在表位区之内可以用本领域的普通技术人员已知的方式进行。作为此类作图/表征方法的一个实例，对于抗Siglec抗体的表位区可以使用Siglec蛋白中暴露的氨基/羧基的化学修饰通过表位“足迹法(foot-printing)”来确定。这样的足迹技术的一个具体实例是使用HXMS(通过质谱法检测的氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白质酰胺质子的氢/氘交换、结合和反向交换，其中参与蛋白质结合的主链酰胺基团被保护免受反向交换并且因此将保持被氘化。可以在这一点上通过胃蛋白酶水解作用、快速微孔高效液相色谱分离、和/或电喷雾离子化质谱法来鉴别相关区域。参见，例如Ehring H,Analytical Biochemistry[分析生物化学],第267卷(2)，第252-259页(1999)；Engen,J.R.和Smith,D.L.,(2001)Anal.Chem.[分析化学]73，256A-265A。适当的表位鉴别技术的另一个实例是核磁共振表位作图(NMR)，其中典型地将游离抗原和与结合抗原肽复合的抗原的二维NMR谱图中信号的位置进行比较。典型地用15N对该抗原进行选择性核素标记，这样使得在NMR谱图中可以看到仅相应于抗原的信号以及没有来自该抗原结合肽的信号。与游离抗原的谱图相比，在复合物的谱图中由涉及与抗原结合肽的相互作用的氨基酸来源的抗原信号典型地将移动位置，并且那样可以鉴定涉及该结合的氨基酸。参见，例如，ErnstSchering Res Found Workshop[恩斯特先灵研究基金会研讨会],2004；(44):149-67；Huang等人,Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志],第281卷(1)第61-67页(1998)；以及Saito和Patterson,Methods[方法].1996年6月；9(3):516-24。
表位作图/表征还可以使用质谱法进行。参见，例如，Downard,J Mass Spectrom[质谱杂志]，2000年4月；35(4):493-503以及Kiselar和Downard,Anal Chem[分析化学]，1999年5月1日；71(9):1792-1801。在表位作图和鉴定的上下文中，蛋白酶消化技术也可能是有用的。抗原决定簇-相关区域/序列可以通过蛋白酶消化来确定，例如通过以与Siglec比率为大约1:50使用胰蛋白酶或在pH 7-8过夜消化，随后进行质谱(MS)分析以用于肽鉴定。被抗Siglec粘合剂保护而免受胰蛋白酶切割的肽可以随后通过将经历胰蛋白酶消化的样品与用抗体孵育过的、并且之后经历通过例如胰蛋白酶消化的样品进行比较(由此展现粘合剂的足迹)来鉴定。在类似的表位表征方法中还可以或可替代地可以使用其他酶像胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。而且，酶消化可以提供一种快速方法来分析潜在的抗原决定簇序列是否在Siglec多肽的区域内，该区域不是表面暴露的并且因此就免疫原性/抗原性而言最可能是不相关的。
定点诱变是可用于阐明结合表位的另一种技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白片段中每个残基都用一个丙氨酸残基替换，并且测量结合亲和性的结果。如果该突变导致结合亲和力的显著降低，则它最可能参与结合。可以使用对结构性表位具有特异性的单克隆抗体(即不结合未折叠蛋白的抗体)来证实该丙氨酸取代不影响蛋白的整体折叠。参见，例如，Clackson和Wells,Science[科学]1995；267:383-386；以及Wells,Proc Natl Acad SciUS[美国国家科学院院刊]1996；93:1-6。
电子显微镜也可以用于表位“足迹法”。例如Wang等人,Nature[自然]1992；355:275-278使用了冷冻电子显微镜术、三维图像重建和X射线晶体法的协同应用来确定Fab片段天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的物理足迹。
其他形式的用于表位评估的“无标签”测定包括表面等离子体共振(SPR、BIACORE)和反射干涉光谱法(RifS)。参见，例如，
Figure BDA0001783781250000401
等人,Journal Of MolecularRecognition[分子识别杂志]1990；3:208-14；Nice等人,J.Chroma-togr.[色谱法杂志]1993；646:159–168；Leipert等人,Angew.Chem.Int.Ed.[德国应用化学国际版]1998；37:3308–3311；
Figure BDA0001783781250000402
等人,Biosensors and Bioelectronics[生物传感器和生物电子学]2002；17:937-944。
还应当注意的是可以在本文所述的一项或多项示例性竞争测定中鉴定结合与本发明的抗体所结合表位相同的或基本上相同的表位的抗体。
交叉阻断测定也可以用于评估测试抗体是否影响天然或非天然唾液酸配体对人类Siglec(例如，Siglec-7和/或Siglec-9)的结合。例如，为了确定人源化抗Siglec抗体制剂是否降低或阻断Siglec-7与唾液酸的相互作用，可以进行以下测试：将剂量范围的抗人类Siglec-9Fab在室温下与固定剂量的人类Siglec-Fc(例如，Siglec-7 Fc和/或Siglec-9Fc)共同孵育30分钟，然后添加到表达唾液酸配体的细胞系上持续1h。在染色缓冲液中将细胞洗涤两次后，将稀释在染色缓冲液中的PE偶联的山羊抗小鼠IgGFc片段第二抗体添加到细胞中，并将板在4℃下再孵育30分钟。将细胞洗涤两次，并在配备有HTFC读板器的AccuryC6流式细胞仪上进行分析。在不存在测试抗体的情况下，Siglec-Fc与细胞结合。在与Siglec-Fc(例如，Siglec-7 Fc和/或Siglec-9 Fc)预孵育的抗体制剂存在的情况下，该Siglec-Fc阻断Siglec与唾液酸的结合，存在Siglec-Fc与细胞的降低的结合。然而，应当理解，可以直接评估针对表达唾液酸配体的靶细胞的NK细胞裂解活性的重建，而无需评估Siglec-唾液酸配体相互作用的阻断。
任选地，本披露的抗体可以被指定为除以下中的任何一种或多种之外的抗体：抗体E10-286(BD生物科学公司(BD Biosciences Corp.))、在欧洲专利1238282 B1中披露的QA79(Moretta等人,Universita degli Studi di Genova[热那亚大学])、或在Falco等人(1999)J.Exp.Med.[实验医学杂志]190:793-801中提及的Z176、或前述的衍生物(例如，包含全部或部分的抗原结合区或重链和/或轻链CDR)。任选地，本披露的抗体可以被指定为除以下中的任何一种或多种之外的抗体：在2015年9月9日提交的PCT申请号PCT/EP 2015/070550中披露的抗体3A11、1H9和2B4(依奈特制药公司(Innate Pharma))。在其他实施例中，取决于抗体的性质，上述抗体可以被修饰以致于具有本披露的抗体的特征。
本文提供了结合细胞外结构域(例如人类Siglec-9的N-末端V-组结构域或Ig样C2-型结构域1或2)的抗体，例如结合在本文的实例中所示的表位的抗体。
在一个方面，抗体结合与抗体mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E或-F所结合表位基本上相同的表位。在一个实施例中，抗体结合Siglec-9和/或Siglec-7的表位，该表位与抗体mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E或-F结合的表位至少部分重叠或包括其中至少一个残基。由抗体结合的残基可以被指定为存在于Siglec-9和/或Siglec-7多肽的表面上，例如，在细胞表面上表达的Siglec-9或Siglec-7多肽中。由抗体结合的在Siglec-9和/或Siglec-7上的氨基酸残基可以例如选自下组，该组由以下各项组成：在表3中列出的残基。
可以测量抗Siglec抗体与用Siglec-9突变体转染的细胞的结合，并将其与抗Siglec抗体结合野生型Siglec-9多肽(例如，SEQ ID NO:2)的能力进行比较。对于另外结合Siglec-7的抗体，抗Siglec抗体的结合可以另外地或可替代地使用用(例如表3的)Siglec-7突变体转染的细胞进行，并将其与抗Siglec抗体结合野生型Siglec-7多肽(例如，SEQ IDNO:1)的能力进行比较。抗Siglec抗体与突变体Siglec-9和/或Siglec-7多肽(例如，表3的突变体Siglec-9或Siglec-7)之间的结合的降低意味着在结合亲和力上有所降低(例如，如通过已知方法测量的，如对表达特定突变体的细胞进行FACS测试，或通过BiacoreTM(SPR)测试与突变多肽的结合)和/或抗Siglec抗体的总结合能力有所降低(例如，如通过在抗Siglec抗体浓度对多肽浓度的曲线图中Bmax降低所证实的)。结合的显著降低指示当抗Siglec抗体结合至Siglec-9时突变的残基直接参与与抗Siglec抗体的结合，或紧密靠近该结合蛋白。
在一些实施例中，结合的显著降低意味着在抗Siglec抗体与突变体Siglec-9多肽之间的结合亲和力和/或能力相对于在该抗体与野生型Siglec-9多肽之间的结合降低了大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施例中，结合被降至低于检测限度。在一些实施例中，当抗Siglec抗体与突变体Siglec-9多肽的结合小于观察到的在抗Siglec抗体和野生型Siglec-9多肽之间的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，结合的显著降低得到证实。
在一些实施例中，提供了抗Siglec抗体，其展示出对突变体Siglec-9和/或Siglec-7多肽的显著更低的结合，其中包含由抗体mAb1、-2、-3、-A、-B、-C、-D、-E或-F结合的氨基酸残基的区段中的残基被不同的氨基酸取代。在一个实施例中，与结合到野生型Siglec多肽(例如SEQ ID NO:2的Siglec-9多肽)相比，突变体是选自表3的突变体M6、M8、M9、M10、M11、M15和M16的突变体。在一个实施例中，与结合到野生型Siglec-7多肽(例如SEQID NO:1的多肽)相比，突变体是选自表3的突变体M6、M8、M9、M10、M11、M15和M16的突变体。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-9上的表位，该表位包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自下组的残基，该组由以下组成：N78、P79、A80、R81、A82和/或V83(参考SEQ ID NO:2)。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-9上的表位，该表位包含一个、两个、三个或四个选自下组的残基，该组由以下组成：N77、D96、H98和/或T99(参考SEQ ID NO:2)。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-9上的表位，该表位包含一个、两个、三个或四个选自下组的残基，该组由以下组成：W84、E85、E86和/或R88(参考SEQ ID NO:2)。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-9上的表位，该表位包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个选自下组的残基，该组由以下组成：S47、H48、G49、W50、I51、Y52、P53和/或G54(参考SEQ ID NO:2)。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-9上的表位，该表位包含残基K131和/或H132(参考SEQ ID NO:2)中的一个或两个。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-9上的表位，该表位包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个选自下组的残基，该组由以下组成：R63、A66、N67、T68、D69、Q70和/或D71(参考SEQ ID NO:2)。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-9上的表位，该表位包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自下组的残基，该组由以下组成：P55、H58、E122、G124、S125和/或K127(参考SEQ ID NO:2)。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-7上的表位，该表位包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自下组的残基，该组由以下组成：N82、P83、A84、R85、A86和/或V87(参考SEQ ID NO:1)。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-7上的表位，该表位包含一个、两个、三个或四个选自下组的残基，该组由以下组成：N81、D100、H102和/或T103(参考SEQ IDNO:1)。
在一个方面，抗Siglec抗体结合在人类Siglec-7上的表位，该表位包含一个、两个、三个或四个选自下组的残基，该组由以下组成：W88、E89、E90、R92(参考SEQ ID NO:1)。
一旦获得具有所希望的对Siglec的结合的抗原结合化合物，就可以评估其抑制Siglec(例如，Siglec-7和/或Siglec-9)的能力。例如，如果抗Siglec抗体减少或阻断由唾液酸配体(例如，存在于细胞上的)诱导的Siglec活化，则该抗体可以增加Siglec限制性淋巴细胞的细胞毒性。这可以通过典型的细胞毒性测定来评估，其实例描述如下。
可以使用例如表达Siglec-7或Siglec-9的NK细胞和表达相应Siglec的唾液酸配体的靶细胞，在标准的4小时体外细胞毒性测定中测试抗体减少Siglec介导的信号传导的能力。此类NK细胞不能有效地杀伤表达唾液酸配体的靶标，因为Siglec-7或Siglec-9识别唾液酸配体，导致阻止淋巴细胞介导的细胞溶解的抑制性信号传导的启动和传播。这样的测定可以根据本文实例(参见例如实例8)中的方法使用作为从供体纯化的新鲜NK细胞的原代NK细胞(在使用前于37℃下孵育过夜)进行。这样的体外细胞毒性测定可以通过本领域中熟知的标准方法进行，如描述于例如Coligan等人,编辑,Current Protocols inImmunology[免疫学现代方法],Greene Publishing Assoc.[格林出版协会]和WileyInterscience[威利国际科学公司],纽约州,(1992,1993)。在添加NK细胞之前，用51Cr标记靶细胞，然后杀伤被估计为与从细胞到培养基的51Cr释放成比例，作为杀伤的结果。添加阻止Siglec-7和/或Siglec-9与唾液酸配体结合的抗体导致经由Siglec阻止抑制性信号传导的启动和传播。因此，添加此类药剂导致靶细胞的淋巴细胞介导的杀伤的增加。该步骤由此鉴定通过例如阻断配体结合来阻止Siglec-7或Siglec-9诱导的负的信号传导的药剂。在特定的51Cr-释放细胞毒性测定中，表达Siglec-7或Siglec-9的NK效应细胞可以杀伤唾液酸配体阴性靶细胞(例如用唾液酸酶处理的细胞)，但是对表达唾液酸配体的对照细胞的杀伤表现不太好。因此，由于经由特定Siglec的唾液酸诱导的抑制性信号传导，NK效应细胞效率较低地杀伤唾液酸配体阳性细胞。当在这样的51Cr-释放细胞毒性测定中将NK细胞与阻断抗Siglec抗体预孵育时，以抗体浓度依赖性方式更有效地杀伤表达唾液酸配体的细胞。可以对每种Siglec(例如Siglec-7和Siglec-9)分别进行测定。
抗体的抑制活性(即，细胞毒性增强潜力)也能以通过许多其他方式中的任一种来评估，例如，通过如例如在Sivori等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]1997；186:1129-1136(其披露内容通过引用并入本文)中描述的其对细胞内游离钙的影响，或通过对NK细胞细胞毒性活化的标记(例如脱粒标记CD107或CD137表达)的影响。NK、T或NKT细胞活性还可以使用任何基于细胞的细胞毒性测定来评估，例如，测量任何其他参数以评估抗体刺激NK细胞杀伤靶细胞的能力，这些靶细胞例如是如在以下文献中披露的P815、K562细胞或适当的肿瘤：Sivori等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]1997；186:1129-1136；Vitale等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]1998；187:2065-2072；Pessino等人J.Exp.Med.[实验医学杂志]1998；188:953-960；Neri等人Clin.Diag.Lab.Immun.[临床及诊断实验室免疫学]2001；8:1131-1135；Pende等人，J Exp Med.[实验医学杂志]1999；190:1505-1516中，每个全部披露内容通过引用并入本文。
在一个实施例中，抗体制剂导致Siglec限制性淋巴细胞的细胞毒性增加至少10％、优选地NK细胞毒性增加至少40％或50％、或更优选地NK细胞毒性增加至少70％。
还可以使用细胞因子释放测定来解决细胞毒性淋巴细胞的活性，其中将NK细胞与抗体一起孵育以刺激NK细胞的细胞因子产生(例如IFN-y和TNF-α产生)。在一个示例性方案中，通过细胞表面和胞质内染色以及在培养4天后通过流式细胞术的分析来评估来自PBMC的IFN-y产生。简而言之，在培养物的最后4小时以5μg/ml的最终浓度添加布雷非德菌素A(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))。然后在透化(IntraPrepTM；贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))和用PE-抗IFN-y或PE-IgG1(Pharmingen公司)染色之前，将细胞与抗CD3和抗CD56mAb一起孵育。使用ELISA(GM-CSF：DuoSet Elisa，R&D系统公司，明尼阿波里斯，明尼苏达州，IFN-y：OptElA set，Pharmingen)在上清液中测量来自多克隆激活的NK细胞的GM-CSF和IFN-y产生。
抗体的片段和衍生物(它们被如在本申请中使用的术语“抗体”或“多种抗体”涵盖，除非另外陈述或与上下文明显矛盾)可以通过本领域中已知的技术来产生。“片段”包括完整抗体的一部份，通常为抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab',Fab'-SH、F(ab')2、和Fv片段；双抗体；任何为具有由连续氨基酸残基的未中断序列组成的一级结构的多肽的抗体片段(在此称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv分子，(2)仅含一个轻链可变结构域的单链多肽，或其包含该轻链可变结构域的三个CDR的片段，不含相关的重链部分，以及(3)仅含一个重链可变区的单链多肽，或其包含该重链可变区的三个CDR的片段，不含相关的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性(例如双特异性)抗体。尤其包括纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”。
在某些实施例中，产生抗体的杂交瘤的DNA可以在插入表达载体之前进行修饰，例如通过将用于人类重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源性非人类序列(例如Morrison等人,PNAS第6851页(1984))或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价地连接至免疫球蛋白编码序列。以该方式，制备了具有原始抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。典型地，这种非免疫球蛋白多肽可被取代为抗体的恒定结构域。
任选地抗体是人源化的。“人源化”形式的抗体是特异性嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合的抗体亚序列)，它们含有源自于鼠免疫球蛋白的最小序列。大多数情况下，人源化的抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体的一个互补决定区(CDR)的残基被来自初始抗体(供体抗体)的一个CDR的残基替换，同时保持所希望的初始抗体的特异性、亲和性、以及能力。
在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基可以被相应的非人类残基替代。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体中或在输入的CDR或框架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。总体上，人源化抗体将包括基本上全部的至少一个、并且典型地两个可变区，其中全部或基本上全部的CDR区相应于初始抗体的情况，并且全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白一致序列的情况。人源化抗体还任选地包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人类免疫球蛋白的至少一部分。更多的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321,第522页(1986)；Reichmann等人,Nature[自然],332,第323页(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学新见],2,第593页(1992)；Verhoeyen等人Science[科学],239,第1534页；以及美国专利号4,816,567，将其全部披露是通过引用并入本文。用于人源化抗体的方法是本领域所熟知的。
选择用于制备人源化抗体的人类轻链和重链可变结构域，这对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳适配”方法，针对已知人类可变结构域序列的整个文库来筛选抗体的可变结构域的序列。然后将最接近于小鼠序列的人类序列接受为用于人源化抗体的人类框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.[免疫学杂志]151,pp.2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.[分子生物学杂志]196,1987,第901页)。另一种方法采用来自具有特定亚组轻链或重链的全部人类抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,PNAS 89,第4285页(1992)；Presta等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151,第2623页(1993))。
进一步重要的是将抗体人源化，同时保留对Siglec受体的高亲和力以及其他有利的生物学特性。为了实现这个目标，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和多种概念性人源化产物的过程而制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可得到的并且对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。可以得到说明并且显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维结构的计算机程序。这些展示的检查允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能方面的可能作用进行分析，即对影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基进行分析。按照此方式，可以从一致的并且输入的序列中选择并且组合FR残基，这样使得所希望的抗体特征，例如增加一种或多种靶抗原的亲和性得以实现。总体上，CDR残基直接地并且在多数情况下基本上涉及影响抗原结合。
另一种制备“人源化”单克隆抗体的方法是使用一种XenoMouse(安根尼克斯(Abgenix),菲蒙市(Fremont),加利福尼亚州(CA))作为用于免疫的小鼠。XenoMouse是鼠宿主，该鼠宿主已经具有免疫球蛋白基因被功能性人免疫球蛋白基因替代。因此，由这种小鼠产生的抗体或从这种小鼠的B细胞制造的杂交瘤中产生的抗体已经被人源化。XenoMouse描述与美国专利号6,162,963中，其通过引用以其全文在此结合。
还可以根据各种其他技术，如通过使用已经被工程化以表达人类抗体谱系的其他转基因动物用于免疫(Jakobovitz等人,Nature[自然]362(1993)255)或者通过使用噬菌体展示方法选择抗体谱系来产生人类抗体。此类技术是技术人员已知的并且可以从如在本申请中披露的单克隆抗体开始来实施。
在一个实施例中，可以制备抗Siglec抗体，这样使得它们不具有与人类Fcγ受体(例如CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64中的任一个或多个)的实质的特异性结合。此类抗体可以包含已知缺乏与Fcγ受体的结合或具有低的与Fcγ受体的结合的各种重链的恒定区。可替代地，不包含恒定区例如F(ab')2片段(或包含恒定区的部分)的抗体片段可以用于避免Fc受体结合。可以根据本领域已知的方法评估Fc受体结合，这些方法包括例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。而且，通常可以使用任何抗体IgG同种型，其中Fc部分被修饰(例如通过引入1、2、3、4、5个或更多个氨基酸取代)以最小化或消除与Fc受体的结合(参见，例如，WO 03/101485，其披露内容通过引用在此结合)。用于评估Fc受体结合的测定例如基于细胞的测定是本领域熟知的，并且描述于例如WO 03/101485中。
在一个实施例中，抗体可以在Fc区中包含一个或多个特异性突变，该特异性突变导致与效应细胞具有最小相互作用的“Fc沉默”抗体。沉默的效应子功能可以通过抗体的Fc区域中的突变而获得，并且已在本领域描述为：N297A突变、LALA突变(Strohl，W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术新见],第20卷(6):685-691)；和D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.[免疫学杂志]181:6664-69)，还参见Heusser等人,WO 2012/065950，其披露内容通过引用并入本文。在一个实施例中，抗体在铰链区中包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代。在一个实施例中，抗体是IgG1或IgG2并且包含在残基233-236、任选地233-238(EU编号)处的一个、两个或三个取代。在一个实施例中，抗体是IgG4并且包含在残基327、330和/或331(EU编号)处的一个、两个或三个取代。沉默Fc lgG1抗体的实例是在lgG1Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变的LALA突变体。Fc沉默突变的另一个实例是在残基D265处、或在D265和P329处的突变，例如在IgG1抗体中用作DAPA(D265A、P329A)突变(US 6,737,056)。另一种沉默的IgG1抗体包含在残基N297处的突变(例如N297A、N297S突变)，其产生无糖基化/非糖基化抗体。其他沉默突变包括：在残基L234和G237处的取代(L234A/G237A)；在残基S228、L235和R409处的取代(S228P/L235E/R409K,T,M,L)；在残基H268、V309、A330和A331处的取代(H268Q/V309L/A330S/A331S)；在残基C220、C226、C229和P238处的取代(C220S/C226S/C229S/P238S)；在残基C226、C229、E233、L234和L235处的取代(C226S/C229S/E233P/L234V/L235A)；在残基K322、L235和L235处的取代(K322A/L234A/L235A)；在残基L234、L235和P331处的取代(L234F/L235E/P331S)；在残基234、235和297处的取代；在残基E318、K320和K322处的取代(L235E/E318A/K320A/K322A)；在残基(V234A、G237A、P238S)处的取代；在残基243和264处的取代；在残基297和299处的取代；使得由EU编号系统定义的残基233、234、235、237和238包含选自PAAAP、PAAAS和SAAAS的序列的取代(参见WO 2011/066501)。
在一个实施例中，抗体可以包含在Fc区中的导致本披露抗体的稳定性提高的一个或多个特定突变，例如，包含多个芳香族氨基酸残基和/或具有高疏水性。例如，这种抗体可以包含人类lgG1起源的Fc结构域，包含在Kabat残基234、235、237、330和/或331处的突变。这样的Fc结构域的一个实例包括在Kabat残基L234、L235和P331处的取代(例如，L234A/L235E/P331S或L234F/L235E/P331S)。这样的Fc结构域的另一个实例包括在Kabat残基L234、L235、G237和P331处的取代(例如，L234A/L235E/G237A/P331S)。这种Fc结构域的另一个实例包括在Kabat残基L234、L235、G237、A330和P331处的取代(例如，L234A/L235E/G237A/A330S/P331S)。在一个实施例中，抗体包含Fc结构域，任选地人类IgG1同种型的Fc结构域，该Fc结构域包含：L234X1取代、L235X2取代和P331X3取代，其中X1是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X2是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，并且X3是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基；任选地，其中X1是丙氨酸或苯丙氨酸或其保守取代；任选地，其中X2是谷氨酸或其保守取代；任选地，其中X3是丝氨酸或其保守取代。在另一个实施例中，抗体包含Fc结构域，任选地人类IgG1同种型的Fc结构域，该Fc结构域包含：L234X1取代、L235X2取代、G237X4取代和P331X4取代，其中X1是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X2是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X3是除甘氨酸以外的任何氨基酸残基，并且X4是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基；任选地，其中X1是丙氨酸或苯丙氨酸或其保守取代；任选地，其中X2是谷氨酸或其保守取代；任选地，X3是丙氨酸或其保守取代；任选地，X4是丝氨酸或其保守取代。在另一个实施例中，抗体包含Fc结构域，任选地人类IgG1同种型的Fc结构域，该Fc结构域包含：L234X1取代、L235X2取代、G237X4取代、G330X4取代和P331X5取代，其中X1是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X2是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，X3是除甘氨酸以外的任何氨基酸残基，X4是除丙氨酸以外的任何氨基酸残基，并且X5是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基；任选地，其中X1是丙氨酸或苯丙氨酸或其保守取代；任选地，其中X2是谷氨酸或其保守取代；任选地，X3是丙氨酸或其保守取代；任选地，X4是丝氨酸或其保守取代；任选地，X5是丝氨酸或其保守取代。在这里使用的简化符号中，格式为：野生型残基：在多肽中的位置：突变体残基，其中残基位置根据Kabat按照EU编号表示。
在一个实施例中，抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含下面的氨基酸序列、或与其至少90％、95％或99％一致但保留了在Kabat位置234、235和331处(加下划线的)的氨基酸残基的氨基酸序列：
Figure BDA0001783781250000501
在一个实施例中，抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含下面的氨基酸序列、或与其至少90％、95％或99％一致但保留了在Kabat位置234、235和331处(加下划线的)的氨基酸残基的氨基酸序列：
Figure BDA0001783781250000502
在一个实施例中，抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含下面的氨基酸序列、或与其至少90％、95％或99％一致但保留了在Kabat位置234、235、237、330和331处(加下划线的)的氨基酸残基的氨基酸序列：
Figure BDA0001783781250000503
在一个实施例中，抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含下面的氨基酸序列、或与其至少90％、95％或99％一致但保留了在Kabat位置234、235、237和331处(加下划线的)的氨基酸残基的序列：
Figure BDA0001783781250000511
Fc沉默抗体导致没有或低的ADCC活性，意味着Fc沉默抗体展现出低于50％特异性细胞裂解的ADCC活性。优选地，抗体基本上缺乏ADCC活性，例如，Fc沉默抗体展现出低于5％或低于1％的ADCC活性(特异性细胞裂解)。Fc沉默抗体还可导致缺乏在细胞(例如NK细胞、T细胞、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞)表面的Siglec-9和/或Siglec-7的FcγR介导的交联。
在一个实施例中，抗体在重链恒定区中具有在选自下组的残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个残基处的取代，该组由以下组成：220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330、331和409(重链恒定区中的残基的编号是根据Kabat按照EU编号进行的)。在一个实施例中，抗体包含在残基234、235和322处的取代。在一个实施例中，抗体具有在残基234、235和331处的取代。在一个实施例中，抗体具有在残基234、235、237和331处的取代。在一个实施例中，抗体具有在残基234、235、237、330和331处的取代。在一个实施例中，Fc结构域是人类IgG1亚型的Fc结构域。氨基酸残基根据Kabat按照EU编号来表示。抗体CDR序列
抗体mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E和-F的重链和轻链可变区的氨基酸序列如表B所示。在具体实施例中，提供了结合与单克隆抗体mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E和-F所结合表位或决定簇基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，该抗体包含抗体mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E或-F的高变区。在本文的任何实施例中，抗体mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E或-F可以通过氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个实施例中，单克隆抗体包含mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E或-F的VH和/或VL或者Fab或F(ab')2部分。还提供了包含mAb1的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施例，该单克隆抗体包含mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E或-F的重链可变区的三个CDR。还提供了进一步包含相应mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E或-F的可变轻链可变区或相应mAb1、-2、-3、-4、-5、-6、-A、-B、-C、-D、-E或-F的轻链可变区的一个、两个或三个CDR的单克隆抗体。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体mAb1的抗原结合区的部分或全部的任何轻链和/或重链可变区与人IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，任选地进一步包含降低效应子功能(与人类Fcγ受体结合)的氨基酸取代)融合。
在另一个方面，提供了一种抗体，该抗体包含：mAb1的HCDR1区，其包含在表A-1中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb1的HCDR2区，其包含在表A-1中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb1的HCDR3区，其包含在表A-1中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb1的LCDR1区，其包含在表A-1中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb1的LCDR2区，其包含在表A-1中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb1的LCDR3区，其包含在表A-1中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-1
Figure BDA0001783781250000531
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中该抗体包含：mAb3的HCDR1区，其包含在表A-3中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb3的HCDR2区，其包含在表A-3中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb3的HCDR3区，其包含在表A-3中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb3的LCDR1区，其包含在表A-3中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb3的LCDR2区，其包含在表A-3中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb3的LCDR3区，其包含在表A-3中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-3
Figure BDA0001783781250000541
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中该抗体包含：mAb4的HCDR1区，其包含在表A-4中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb4的HCDR2区，其包含在表A-4中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb4的HCDR3区，其包含在表A-4中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb4的LCDR1区，其包含在表A-4中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb4的LCDR2区，其包含在表A-4中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb4的LCDR3区，其包含在表A-4中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-4
Figure BDA0001783781250000551
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中该抗体包含：mAb5的HCDR1区，其包含在表A-5中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb5的HCDR2区，其包含在表A-5中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb5的HCDR3区，其包含在表A-5中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb5的LCDR1区，其包含在表A-5中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb5的LCDR2区，其包含在表A-5中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAb5的LCDR3区，其包含在表A-5中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-5
Figure BDA0001783781250000561
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中该抗体包含：mAbA的HCDR1区，其包含在表A-7中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbA的HCDR2区，其包含在表A-7中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbA的HCDR3区，其包含在表A-7中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbA的LCDR1区，其包含在表A-7中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbA的LCDR2区，其包含在表A-7中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbA的LCDR3区，其包含在表A-7中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-7
Figure BDA0001783781250000571
Figure BDA0001783781250000581
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中该抗体包含：mAbB的HCDR1区，其包含在表A-8中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbB的HCDR2区，其包含在表A-8中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbB的HCDR3区，其包含在表A-8中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbB的LCDR1区，其包含在表A-8中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbB的LCDR2区，其包含在表A-8中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbB的LCDR3区，其包含在表A-8中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-8
Figure BDA0001783781250000582
Figure BDA0001783781250000591
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中该抗体包含：mAbC的HCDR1区，其包含在表A-9中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbC的HCDR2区，其包含在表A-9中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbC的HCDR3区，其包含在表A-9中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbC的LCDR1区，其包含在表A-9中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbC的LCDR2区，其包含在表A-9中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbC的LCDR3区，其包含在表A-9中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-9
Figure BDA0001783781250000592
Figure BDA0001783781250000601
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中该抗体包含：mAbD的HCDR1区，其包含在表A-10中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbD的HCDR2区，其包含在表A-10中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbD的HCDR3区，其包含在表A-10中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbD的LCDR1区，其包含在表A-10中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbD的LCDR2区，其包含在表A-10中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbD的LCDR3区，其包含在表A-10中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-10
Figure BDA0001783781250000611
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中该抗体包含：mAbE的HCDR1区，其包含在表A-11中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbE的HCDR2区，其包含在表A-11中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbE的HCDR3区，其包含在表A-11中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbE的LCDR1区，其包含在表A-11中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbE的LCDR2区，其包含在表A-11中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbE的LCDR3区，其包含在表A-11中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-11
Figure BDA0001783781250000621
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中该抗体包含：mAbF的HCDR1区，其包含在表A-12中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbF的HCDR2区，其包含在表A-12中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbF的HCDR3区，其包含在表A-12中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbF的LCDR1区，其包含在表A-12中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbF的LCDR2区，其包含在表A-12中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；mAbF的LCDR3区，其包含在表A-12中所列出的氨基酸序列或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代。
表A-12
Figure BDA0001783781250000631
在本文的任何实施例的另一个方面，HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列中的任一序列可以任选地被指定为全部(或每个，独立地)是Kabat编号系统的那些(如对于每个CDR在表A-1至A-12中所示)、Chotia编号系统的那些(如对于每个CDR在表A-1至A-12中所示)、IMGT编号系统的那些(如对于每个CDR在表A-1至A-12中所示)、或任何其他合适的编号系统的那些。
在本文的任何实施例的另一个方面，mAbA、mAbB、mAbC、mAbD、mAbE、mAbF、mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5或mAb6的重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以被表征为其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，和/或被表征为具有与列于对应的SEQ ID NO中的特定CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列一致性的氨基酸序列。
在本发明的任何抗体中，例如，mAbA、mAbB、mAbC、mAbD、mAbE、mAbF、mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5或mAb6，指定的可变区和CDR序列可以包含序列修饰，例如，取代(1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个序列修饰)。在一个实施例中，重链和轻链的CDR1、CDR2和/或CDR 3包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，其中取代的残基是存在于人起源的序列中的残基。在一个实施例中，取代是保守修饰。保守的序列修饰是指未显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守的修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变以及PCR介导的诱变)将多种修饰引入本发明的抗体中。保守氨基酸的取代典型地是以下取代，其中用具有类似理化特性的侧链的一个氨基酸残基来替换一个氨基酸残基。所指定的可变区以及CDR序列可以包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。当进行取代时，优选的取代应当是保守修饰。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且经改变的抗体可以使用本文所述的测定来测试所保留的功能(即，本文所列出的特性)。
根据IMGT、Kabat和Chothia定义系统的CDR序列总结在表A-1至A-12中。根据本发明的抗体的可变区序列在下表B中列出。在本文的任何实施例中，VL或VH序列可以被指定或编号以便进一步包含或缺少信号肽或其任何部分。
在一个实施例中，本发明的抗体是保留其结合和/或功能特性的抗体片段。
表B
Figure BDA0001783781250000651
Figure BDA0001783781250000661
Figure BDA0001783781250000671
抗体配制品
可以将抗Siglec抗体掺入药物配制品中，该药物配制品包含从1mg/ml至500mg/ml浓度的抗体，其中所述配制品具有从2.0至10.0的pH。该配制品可以进一步包含缓冲系统、一种或多种防腐剂、一种或多种张力剂、一种或多种螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施例中，药物配制品是水性配制品，即包含水的配制品。此类配制品典型地是溶液或悬浮液。在另外的实施例中，药物配制品是水性溶液。术语“水性配制品”被定义为包含至少50％w/w水的配制品。同样，术语“水性溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，并且术语“水性悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施例中，药物配制品是冷冻干燥的配制品，在使用前医生或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施例中，药物配制品是干燥的配制品(例如冷冻干燥或喷雾干燥的)，可立即使用而需无任何预先溶解。
在另外的方面，药物配制品包含这种抗体的水性溶液、和缓冲液，其中抗体以1mg/ml或更高的浓度存在，并且其中所述配制品具有从约2.0至约10.0的pH。
在另一个实施例中，配制品的pH在选自以下列表的范围内，该列表由从约2.0至约10.0、约3.0至约9.0、约4.0至约8.5、约5.0至约8.0、以及约5.5至约7.5组成。
在另外的实施例中，所述缓冲剂选自下组，该组由以下组成：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、以及三(羟甲基)-氨基甲烷、二甘氨酸、曲辛、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲剂中的每一种构成本发明的可替代实施例。
在另外的实施例中，该配制品进一步包含药学上可接受的防腐剂。在另外的实施例中，该配制品进一步包含等渗剂。在另外的实施例中，该配制品进一步包含螯合剂。在本发明的另外的实施例中，该配制品进一步包含稳定剂。在另外的实施例中，该配制品进一步包含表面活性剂。为了方便起见，参考Remington：The Science and Practice ofPharmacy[药学科学与实践]，第19版，1995。
可能的是其他成分可以存在于本发明的药物配制品中。此类另外的成分可以包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油质载体、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，此类另外的成分不应不利地影响本发明的药物配制品的总体稳定性。
含有根据本发明的抗体的药物组合物可以在几个部位向对此类治疗有需要的患者给予，例如在局部部位，例如皮肤和粘膜部位，在旁路吸收的部位，例如在动脉中、在静脉中、在心脏中和在涉及吸收的部位给予，例如在皮肤中、在皮肤下、在肌肉中或在腹部中给予。根据本发明的药物组合物的给予可以通过以下几个给予途径向对此类治疗有需要的患者给予：例如，皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内、舌、舌下、颊、口腔内、口服、胃和肠内、鼻、肺(例如通过细支气管和绒毛膜或其组合)、表皮、真皮、透皮、阴道、直肠、眼睛(例如通过结膜)、输尿管和胃肠外。
合适的抗体配制品也可以通过检查其他已经开发的治疗性单克隆抗体的经验来确定。在临床方面，数种单克隆抗体已经显示是有效的，例如美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、艾克斯莱尔(xolair)(奥巴佐单抗)、托西莫(托西莫单抗)、坎帕斯(阿伦单抗)、泽娃灵(Zevalin)、Oncolym，并且类似的配制品可以与本发明的化合物一起使用。例如，单克隆抗体可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用的小瓶中以10mg/mL的浓度供应，被配制在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和注射用无菌水中用于IV给予。将pH调节至6.5。在另一个实施例中，在约6.0的pH下，将抗体以包含约20mM柠檬酸钠、约150mM NaCl的配制品提供。
恶性肿瘤的诊断和治疗
还提供了使用如本文所述的抗Siglec抗体治疗个体(尤其是人类患者)的方法。在一个实施例中，本发明提供了如本文所述的抗体在制备用于向人类患者给予的药物组合物中的用途。典型地，患者患有癌症或传染病(例如细菌或病毒疾病)，或者处于患有其的风险。
例如，在一个方面，本发明提供了一种在有需要的患者中增强Siglec-7和/或Siglec-9限制性免疫细胞(例如淋巴细胞)的活性的方法，该方法包括向所述患者给予中和性抗Siglec7和/或-9抗体的步骤。抗体可以是例如人或人源化抗Siglec-7和/或Siglec-9抗体，该抗体减少或阻止唾液酸介导的Siglec-7和/或Siglec-9受体的活化。在一个实施例中，该方法旨在增加患有其中淋巴细胞(例如，NK和/或CD8+T细胞)活性增加是有益的疾病的患者中此类淋巴细胞的活性，该疾病涉及、影响对通过NK或CD8+T细胞的裂解敏感的细胞或由其引起，或者该疾病由NK或CD8+T细胞活性不足引起或表征，如癌症或感染性疾病。例如，在一个方面，本发明提供了一种在有需要的患者中增强Siglec-7和/或Siglec-9-限制性免疫细胞(例如NK细胞(例如CD56bright细胞)、T细胞、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞(例如，免疫抑制性或M2巨噬细胞))的活性(例如细胞活化、抗肿瘤免疫力或活性、细胞因子产生、增殖)的方法，该方法包括向所述患者给予本披露的中和性抗Siglec7和/或-9抗体的步骤。
在一个实施例中，将本披露的抗体用于治疗肿瘤，该肿瘤的特征在于ST3GAL6和/或ST3GAL1酶的表达(或例如高水平的ST3GAL6和/或ST3GAL1酶活性)、任选地ST3GAL6酶的过表达(与健康个体中的例如健康组织中的表达相比)。
更具体地，本文中的方法和组合物用于治疗各种癌症和其他增殖性疾病。因为这些方法经由阻断淋巴细胞上的抑制性受体来增强免疫应答，所以它们适用于非常广泛的癌症。在一个实施例中，用本披露的抗Siglec抗体治疗的人类患者患有肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌(例如HNSCC)、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)、黑色素瘤、子宫癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症(包括由石棉诱导的那些癌症)、血液恶性肿瘤包括例如多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴样白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B-淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和前体T淋巴细胞淋巴瘤、以及所述癌症的任何组合。本发明也可用于治疗转移性癌症。可以在治疗之前、在治疗期间或在治疗之后针对上述临床属性中的一种或多种来检测或选择患者。
基于抗Siglec抗体的治疗还可以用于治疗或预防感染性疾病，包括优选地由病毒、细菌、原生动物、霉菌或真菌感染引起的任何传染病。此类病毒感染性生物体包括但不限于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、腺病毒、I型单纯性疱疹(HSV-1)、2型单纯性疱疹(HSV-2)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、乳头瘤病毒、巨细胞病毒、棘皮病毒(echinovirus)、虫媒病毒、汉坦病毒(huntavirus)、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒以及I型或2型人类免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)。细菌构成另一类优选的感染性生物体，包括但不限于以下：葡萄球菌属(Staphylococcus)；链球菌属(Streptococcus)，包括化脓链球菌(S.pyogenes)；肠球菌属(Enterococcl)；芽孢杆菌属(Bacillus)(包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis))，和乳酸杆菌属(Lactobacillus)；李斯特菌属(Listeria)；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；加德纳菌属(Gardnerella)，包括阴道加德纳菌(G.vaginalis)；诺卡氏菌属(Nocardia)；链霉菌属(Streptomyces)；普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)；密螺旋体属(Treponerna)；弯曲杆菌属(Camplyobacter)，假单胞菌属(Pseudomonas)(包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))；军团杆菌属(Legionella)；奈瑟氏菌属(Neisseria)，包括淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitides)；黄杆菌属(Flavobacterium)，包括脑膜炎败血性黄杆菌(F.meningosepticum)和气味黄杆菌(F.odoraturn)；布鲁氏菌属(Brucella)；博德特菌属(Bordetella)，包括百日咳博德特菌(B.pertussis)和支气管炎博德特菌(B.bronchiseptica)；埃希氏菌属(Escherichia)(包括大肠杆菌(E.coli))，克雷伯氏菌属(Klebsiella)；肠杆菌属(Enterobacter)，沙雷氏菌属(Serratia)(包括粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和液化沙雷氏菌(S.liquefaciens))；爱德华菌属(Edwardsiella)；变形杆菌属(Proteus)，包括奇异变形杆菌(P.mirabilis)和普通变形杆菌(P.vulgaris)；链杆菌属(Streptobacillus)；立克次氏体科(Rickettsiaceae)(包括R.fickettsfi)，衣原体(Chlamydia)(包括鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和沙眼衣原体)；分枝杆菌属(Mycobacterium)，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、偶发分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌(M.avium)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)和鼠麻风分枝杆菌；以及诺卡氏菌属(Nocardia)。原生动物可以包括但不限于利什曼原虫属(leishmania)、可可地亚虫属(kokzidioa)和锥虫属(trypanosoma)。寄生虫包括但不限于衣原体和立克次氏体。
抗体组合物可以用于治疗个体，不论在个体表达的等位基因中在Siglec-9中的位置100处(参考SEQ ID NO:2)或在Siglec-7中的位置104处(参考SEQ ID NO:1)存在的残基如何。在位置100处具有赖氨酸的Siglec-9(例如SEQ ID NO:2)代表约49％的群体，然而在位置100处具有谷氨酸的Siglec-9(例如SEQ ID NO:160)代表约36％的群体。在一个实施例中，抗体组合物用于治疗在Siglec-9中的位置100处(参考SEQ IDNO:2)具有赖氨酸的个体和在Siglec-9中的位置100处具有谷氨酸的个体。在一个实施例中，相同的给予方案用于治疗其细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞等)在Siglec-9中的位置100处(参考SEQ ID NO:2)表达赖氨酸的个体以及其细胞在Siglec-9中的位置100处表达谷氨酸的个体。在一个实施例中，给予方案包括相同的给予模式、相同的剂量和相同的给予频率，而不论个体中表达的MICA的特定等位基因如何。
抗体组合物可以用于单一疗法或与一种或多种其他治疗剂(包括通常用于给予抗体的特定治疗目的的药剂)的组合疗法。另外的治疗剂将通常按照在用于正治疗的具体疾病或病状的单次疗法中针对该药剂典型使用的量和治疗方案来给予。这样的治疗剂包括但不限于抗癌剂和化疗剂。
在一个实施例中，抗Siglec-9和/或-7中和抗体缺乏与人类CD16的结合，但仍增强表达CD16的效应细胞(例如NK或效应T细胞)的活性。因此，在一个实施例中，第二或另外的第二治疗剂是能够诱导针对其结合的细胞的ADCC的抗体或其他含Fc结构域的蛋白质，例如，经由NK细胞表达的CD16。典型地，这样的抗体或其他蛋白质将包含结合感兴趣的抗原(例如，存在于肿瘤细胞(肿瘤抗原)上的抗原)的结构域和Fc结构域或其部分，并且将展示经由抗原结合结构域与抗原的结合以及经由Fc结构域与Fcγ受体(例如CD16)的结合。在一个实施例中，其ADCC活性将至少部分地由CD16介导。在一个实施例中，另外的治疗剂是具有天然或经修饰的人类Fc结构域的抗体，例如来自人IgG1或IgG3抗体的Fc结构域。术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是在本领域中已被充分理解的术语，并且是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致该靶细胞溶解。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、以及嗜酸性粒细胞。术语“ADCC诱导的抗体”是指如通过本领域技术人员已知的一种或多种测定来测量的显示ADCC的抗体。典型地，这种活性的特征在于Fc区与各种FcR的结合。不受任何特定机制的限制，本领域技术人员将认识到抗体显示ADCC的能力可以例如凭借其亚类(例如IgG1或IgG3)、通过引入Fc区的突变、或凭借对抗体Fc区中的碳水化合物模式的修饰。诱导ADCC的抗体的实例包括利妥昔单抗(用于治疗淋巴瘤、CLL)、曲妥珠单抗(用于治疗乳腺癌)、阿仑单抗(用于治疗慢性淋巴细胞白血病)和西妥昔单抗(用于治疗结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌)。ADCC增强的抗体的实例包括但不限于：GA-101(低岩藻糖基化抗CD20)、马格妥昔单抗(margetuximab)(Fc增强的抗HER2)、美泊利单抗(mepolizumab)、MEDI-551(Fc工程化抗CD19)、阿妥珠单抗(obinutuzumab)(糖基工程化/低岩藻糖基化抗CD20)、奥妥珠单抗(ocaratuzumab)(Fc工程化抗CD20)、
Figure BDA0001783781250000721
5574/MOR208(Fc工程化抗CD19)。
在一个实施例中，抗Siglec-9和/或-7中和抗体增加了中和人类PD-1的抑制活性(例如，抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用)的药剂的功效，尤其是在对用中和人类PD-1的抑制活性的药剂的治疗反应差(或不敏感)的个体中。抗Siglec-9和/或-7中和抗体可以用于增强表达PD-1的效应细胞(例如NK或效应T细胞，例如表达Siglec-9的NK细胞)的活性。因此，在一个实施例中，第二或另外的第二治疗剂是中和人类PD-1的抑制活性的抗体或其他药剂。
程序性死亡因子1(PD-1)(也称为“程序性细胞死亡因子1”)是CD28受体家族的抑制成员。完整的人类PD-1序列可以在GenBank登录号U64863下找到。抑制或中和PD-1的抑制活性可能涉及使用预防PD-L1诱导的PD-1信号传导的多肽剂(例如，抗体、与Fc结构域融合的多肽、免疫粘附素等)。目前在市场上或在临床评价中存在至少六种阻断PD-1/PD-L1途径的药剂。一种药剂是BMS-936558(纳武单抗(Nivolumab)/ONO-4538，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)；以前是MDX-1106)。纳武单抗(商品名
Figure BDA0001783781250000731
)是FDA批准的完全人类IgG4抗PD-L1mAb，其抑制PD-L1配体与PD-1和CD80两者的结合，并且在WO 2006/121168中被描述为抗体5C4，将其披露内容通过引用并入本文。对于黑色素瘤患者，在3mg/kg的剂量下观察到最显著的OR，而对于其他癌症类型，其为10mg/kg。纳武单抗通常以10mg/kg每3周一次给药，直到癌症进展。术语“降低人类PD-1的抑制活性”、“中和PD-1”或“中和人类PD-1的抑制活性”是指由于PD-1与其结合配偶体中的一种或多种(例如PD-L1或PD-L2)的相互作用而造成PD-1在其信号转导能力方面被抑制的过程。中和PD-1的抑制性活性的药剂降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其一种或多种结合配偶体(例如PD-L1、PD-L2)的相互作用产生的信号转导。因此，此这种药剂可以减少通过或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的阴性共刺激信号，以便增强T细胞效应子功能(例如增殖、细胞因子产生和/或细胞毒性)。
MK-3475(来自默克公司(Merck)的人类IgG4抗PD1mAb)，也称为拉立珠单抗(lambrolizumab)或派姆单抗(pembrolizumab)(商品名
Figure BDA0001783781250000732
)，已被FDA批准用于治疗黑色素瘤并正在其他癌症中进行测试。以2mg/kg或10mg/kg每2周或每3周一次测试派姆单抗(Pembrolizumab)直至疾病进展。DNA构建体编码人源化抗体h409的重链和轻链可变区。所有这些都保存在美国典型培养物保藏中心专利储存库(American Type CultureCollection Patent Depository)(维吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号(10801University Blvd.,Manassas,VA))。含有编码h409A-l 1重链的DNA的质粒于2008年6月9日储存并鉴定为081469_SPD-H，并且含有编码h409Al 1轻链的DNA的质粒于2008年6月9日储存并鉴定为0801470_SPD-L-I 1。MK-3475，也称为Merck 3745或SCH-900475，也描述于WO 2009/114335中。
MPDL3280A/RG7446(来自罗氏公司(Roche)/基因技术公司(Genentech)的抗PD-L1)是包含工程化的Fc结构域的人类抗PD-L1mAb，其通过最小化FcγR结合和随后的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)而优化功效和安全性。每3周一次给予≤1mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、和25mg/kgMPDL3280A的剂量长达1年。在3期试验中，在NSCLC中每三周一次通过静脉内输注以1200mg给予MPDL3280A。
AMP-224(阿帕里免疫公司(Amplimmune)和GSK公司)是包含融合到Fc结构域的PD-L2胞外结构域的免疫黏附素。中和PD-1的药剂的其他实例可以包括结合PD-L2(抗PD-L2抗体)并阻断PD-1和PD-L2之间的相互作用的抗体。
皮立珠单抗(Pidilizumab)(CT-011；CureTech)(来自CureTech/Teva的人源化IgG1抗PD1mAb)、皮立珠单抗(CT-011；CureTech)(参见，例如WO 2009/101611)试另一个实例；该药剂在患有对利妥昔单抗敏感的复发性FL的三十名患者中进行了测试，这些患者每4周接受的3mg/kgCT-011静脉内输注持续4次输注、联合每周给予375mg/m2的利妥昔单抗持续4周(开始于第一次输注CT-011后2周)的治疗。
进一步已知的PD-1抗体和其他PD-1抑制剂包括：AMP-224(GSK许可的B7-DC/IgG1融合蛋白)、描述于WO 2012/145493中的AMP-514、描述于WO 2011/066389和US 2013/034559中的抗体MEDI-4736(由阿斯利康公司(AstraZeneca)/米迪缪尼公司(Medimmune)研发的抗PD-L1)，描述于WO 2010/077634中的抗体YW243.55.S70(抗PD-L1)、MDX-1105(也称为BMS-936559，是由百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)研发的描述于WO 2007/005874中的抗PD-L1抗体)、以及描述于WO 2006/121168、WO 2009/014708、WO 2009/114335和WO 2013/019906中的抗体和抑制剂，将其披露内容通过引用特此结合。抗PD1抗体的另外的实例披露于WO 2015/085847(上海恒瑞药业有限公司(Shanghai HengruiPharmaceutical Co.Ltd.))中，例如分别具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8的轻链可变结构域CDR1、2和3的抗体、以及分别具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的重链可变结构域CDR1、2和3的抗体，其中SEQ ID NO参考是根据WO 2015/085847进行编号的，将其披露内容通过引用并入本文。也可以使用与这些抗体中的任一种竞争结合PD-1或PD-L1的抗体。
示例性抗PD-1抗体是派姆单抗(pembrolizumab)(参见，例如WO 2009/114335，将其披露的内容通过引用并入本文)。抗PD-1抗体可以是WO 2008/156712中的抗体h409Al 1，其包含由在ATCC中作为081469_SPD-H保藏的DNA编码的重链可变区和由在ATCC中作为0801470_SPD-L-l 1保藏的DNA编码的轻链可变区。在其他实施例中，该抗体包含派姆单抗的重链和轻链CDR或可变区。因此，在一个实施例中，该抗体包含由作为081469_SPD-H保藏在ATCC的DNA编码的派姆单抗的VH的CDR1、CDR2、和CDR3结构域，以及由作为0801470_SPD-L-I1保藏在ATCC的DNA编码的派姆单抗的VL的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施例中，PD-1中和剂是抑制PD-L1与PD-1结合的抗PD-L1 mAb。在一些实施例中，PD-1中和剂是抑制PD-1与PD-L1结合的抗PD1mAb。在一些实施例中，该PD-1中和剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外结合部分或PD-1结合部分的免疫粘附素)。
在治疗方法中，抗Siglec抗体和该第二治疗剂可以分开、一起或顺序地给予，或在混合剂中给予。在一些实施例中，结合抗原的化合物在给予第二治疗剂之前被给予。例如，抗Siglec抗体可以在给予第二治疗剂之前大约0至30天被给予。在一些实施例中，Siglec结合的化合物在给予第二治疗剂之前从约30分钟至约2周、从约30分钟至约1周、从约1小时至约2小时、从约2小时至约4小时、从约4小时至约6小时、从约6小时至约8小时、从约8小时至1天、或从约1天至5天被给予。在一些实施例中,抗Siglec抗体是在给予治疗剂的同时被给予的。在一些实施例中,抗Siglec抗体在给予第二治疗剂之后被给予。例如，抗Siglec抗体可以在给予第二治疗剂之后大约0至30天被给予。在一些实施例中，抗Siglec抗体在给予第二治疗剂之后从约30分钟至约2周、从约30分钟至约1周、从约1小时至约2小时、从约2小时至约4小时、从约4小时至约6小时、从约6小时至约8小时、从约8小时至1天、或从约1天至5天被给予。
在其他方面，提供了用于鉴定Siglec-7+和/或Siglec-9+NK细胞和/或T细胞(例如CD8T细胞、CD56bright NK细胞、CD56dim NK细胞)的方法。评估Siglec-7和/或Siglec-9在NK细胞和/或T细胞上的共表达可以用于诊断或预后方法中。例如，可以从个体(例如，从血液样品、从癌症患者获得的癌症或癌症相邻组织)获得生物样品，并对其分析Siglec-7和/或Siglec-9+NK和/或T细胞的存在。Siglec-9在此类细胞上的表达可以例如用于鉴定具有NK和/或T细胞(例如被Siglec-9多肽抑制的肿瘤浸润性NK和/或T细胞)的个体。Siglec-7和Siglec-9两者在此类细胞上的表达可以例如用于鉴定具有NK和/或T细胞(例如被Siglec-7和Siglec-9多肽两者抑制的肿瘤浸润性NK和/或T细胞)的个体。该方法可以例如用作对用中和Siglec-7和/或Siglec-9的药剂治疗的反应的预后。Siglec-9(和任选地另外的Siglec-7)在此类细胞上的表达可以指示适合用本披露的抗体治疗的个体。
在某些任选的方面，通过评估在肿瘤样品(例如，肿瘤组织和/或肿瘤相邻组织)中Siglec-7和/或Siglec-9天然配体的存在，可以鉴定供抗Siglec-7和/或Siglec-9抗体治疗的患者。在本文的任何治疗用途或癌症治疗或预防方法的一个实施例中，个体中癌症的治疗或预防包括：
a)确定具有癌症的个体内的恶性细胞(例如肿瘤细胞)是否表达Siglec-7的配体和/或Siglec-9的配体，以及
b)在确定恶性细胞(例如，肿瘤细胞)(例如，在其表面上)显著表达Siglec-7的配体和/或Siglec-9的配体后，向个体给予相应的抗Siglec7和/或-9抗体，例如，根据本披露的任何方面的抗体。
在一个实施例中，生物样品(例如，包含肿瘤细胞、肿瘤组织和/或肿瘤相邻组织的样品)显著表达Siglec-7的配体和/或Siglec-9的配体的确定表明该个体患有可以用分别抑制Siglec-7和/或Siglec-9多肽的抗体治疗和/或可以从分别抑制Siglec-7和/或Siglec-9多肽的抗体中获益的癌症。
在一个实施例中，Siglec-7的配体和/或Siglec-9的配体的显著表达意味着所述一种或多种配体在取自给定个体的大量肿瘤细胞中表达。虽然不受精确百分比值的限制，但在一些实例中，如果配体存在于至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的取自患者(在样品中)的肿瘤细胞，则配体可以被称为“显著表达”。
在任何方法的一个实施例中，确定患有癌症的个体内的恶性细胞(例如，肿瘤细胞)是否表达Siglec-7和/或Siglec-9的配体包括确定生物样品中恶性细胞上Siglec-7的配体和/或Siglec-9的配体的表达水平，并将该水平与参考水平(例如，值、弱或强的细胞表面染色等)进行比较。参考水平可以例如对应于健康个体、对应于从用抗Siglec抗体的治疗没有得到/得到低的临床益处的个体、或对应于从用抗Siglec抗体的治疗得到实质性临床益处的个体。生物样品以增加的水平(例如，高值、强的表面染色、对应于个体从用抗Siglec抗体的治疗得到实质性临床益处的水平、比对应于个体从用抗Siglec抗体的治疗没有得到临床益处/得到低的临床益处的水平更高的水平，等等)表达Siglec-7的配体和/或Siglec-9的配体的确定表明该个体患有可以用抗Siglec抗体治疗的癌症。
实例
实例1：共表达Siglec-7和Siglec-9两者的人类NK细胞亚群
在CD33相关的Siglec中，Siglec-7(CD328)和Siglec-9(CD329)共享与唾液酸结合的特性，包括由癌细胞过表达的聚糖，并且被认为在表达他们的免疫细胞中起抑制性受体的作用。为了研究Siglec在淋巴细胞上的表达，在人类NK细胞上研究了Siglec-7和Siglec-9的分布。
通过流式细胞术在从人类供体纯化的新鲜NK细胞上确定NK细胞上的Siglec-7和Siglec-9表达。将NK群体确定为CD3-CD56+细胞(抗CD3太平洋蓝(Pacific blue)-BDPharmingen#558124；抗CD56-PE-Vio770-Milteny#130 100 676)。使用了抗Siglec-7抗体(克隆194211-IgG1APC-研发系统公司(R&D Systems)#FAB11381A)、抗Siglec-9抗体(克隆191240–IgG2A PE-研发系统公司#FAB1139P)以及同种型对照IgG1APC和IgG2A APC。将NK细胞与50μl染色Ab混合物孵育30分钟，用染色缓冲液洗涤两次，并用Canto II(HTS)显示荧光。
将结果示于图1中。显示了代表性结果。MFI：荧光强度均值。显著部分(约44％)的NK细胞表达Siglec-7和Siglec-9两者，表明随着例如存在于肿瘤细胞上的聚糖配体的变化，大部分NK细胞可以被这些受体中的每一种(或全部两种)抑制。
实例2：抗Siglec抗体的产生
为了获得抗人类Siglec-7和Siglec-9抗体，用人类Siglec-7 Fc和人类Siglec-9Fc胞外结构域重组蛋白对Balb/c小鼠进行免疫。进行了两次不同的免疫。
在用Siglec-7 Fc和Siglec-9 Fc蛋白进行的第一次免疫中，小鼠腹膜内接受2次30μg每种蛋白质和完全弗氏佐剂的乳剂的注射。然后，小鼠静脉接受7.5μg每种蛋白质的加强免疫。进行了两种不同的融合(融合1和2)。在该加强后3天将免疫脾细胞与X63.Ag8.653无限增殖的B细胞融合，并且在经辐照的脾细胞存在下培养。将杂交瘤铺在含有半固体甲基纤维素的培养基中，并且使用clonepix 2装置(分子器械公司(Molecular Devices))挑取生长的克隆。
再次用Siglec-7 Fc和Siglec-9 Fc蛋白进行第二次免疫。小鼠腹膜内接受3次30μg每种蛋白质和完全弗氏佐剂的乳剂的注射。然后，小鼠静脉内接受5μg每种蛋白质的加强免疫。进行了三种不同的融合(融合3、4和5)。在该加强后3天将免疫脾细胞与X63.Ag8.653无限增殖的B细胞融合，并且在经辐照的脾细胞存在下培养。将杂交瘤置于P96中的培养基中。在CHO细胞中产生在该免疫中(以及下文实例中)使用的Siglec-7 Fc和Siglec-9 Fc蛋白。Siglec-7 Fc蛋白具有以下氨基酸序列：
QKSNRKDYSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQLNVSYPPQNLTVTVFQGEGTASTALGNSSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDEGEFTCRAQNSLGSQHVSLNLSLQQEYTGKMRPVSGVLLGAVGGGGSSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:164)
Siglec-9 Fc蛋白具有以下氨基酸序列：
QTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGGGGSSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:165)
初级筛选：使用亲本细胞系和表达huSiglec-7、huSiglec-9和cynoSiglec的CHO细胞系通过流式细胞术在初级筛选中测试两种免疫的生长克隆的上清液(SN)。将表达HuSiglec-7、-和cynoSiglec的CHO分别用0.5μM和0.05μM CFSE进行染色。对于流式细胞术筛选，所有细胞均等混合，并且通过用alexa fluor 647标记的山羊抗小鼠多克隆抗体(pAb)揭示出在上清液中的反应抗体的存在。
结果：在融合1、2和融合3/4/5中分别与人类Siglec-7和/或Siglec-9和/或Siglec-cyno结合的相应融合中选择了20、19和超过80种抗体。将来自3种不同融合的不同交叉反应性抗Siglec-7、Siglec-9和Siglec-Cyno抗体和抗Siglec-9抗体(不结合Siglec-7)克隆并产生为具有重链N297Q(Kabat EU编号)突变的嵌合人类IgG1抗体，该突变导致缺乏N-连接的糖基化和与Fcγ受体的结合减少。
图2显示了来自流式细胞术的针对以下抗体实例的代表性结果，这些抗体与Siglec-7而非Siglec-9或食蟹猴Siglec结合(右图)，与Siglec-7、Siglec-9和食蟹猴Siglec中的每一种结合(中间图)，以及与Siglec-9而非Siglec-7或食蟹猴Siglec结合(左图)。
表1：Siglec序列
Figure BDA0001783781250000791
Figure BDA0001783781250000801
Figure BDA0001783781250000811
Figure BDA0001783781250000821
Figure BDA0001783781250000831
实例3：与CD33相关Siglec的结合
与Siglec-7和Siglec-9共享序列相似性的CD33相关Siglec通常被分为两组：由Siglec-1、Siglec-2、Siglec-4和Siglec-15组成的第一子集，以及包括Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14和Siglec-16的CD33相关的Siglec组。由于其他CD33相关Siglec具有不同的生物学功能和/或不被认为参与肿瘤监测，因此进一步筛选抗体以评估是否有可能获得不与其他CD33相关Siglec结合的交叉反应性Siglec-7/9抗体。
产生表达Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-8、Siglec-10、Siglec-11和Siglec-12的细胞，并通过流式细胞术针对与这些细胞的结合测试交叉反应性Siglec-7/9抗体的代表性亚组。本文使用的不同Siglec的氨基酸序列和Genbank参考显示在上面的表1中。
简而言之，使用了表达HuSiglec的CHO细胞系(其表达Siglec之一)。对于流式细胞术筛选，将抗体与表达每种HuSiglec的CHO细胞系(CHOHuSiglec-3细胞系、CHO HuSiglec-5细胞系、CHO HuSiglec-6细胞系、CHO HuSiglec-8细胞系、CHO HuSiglec-10细胞系、CHOHuSiglec-11细胞系、CHO HuSiglec-12细胞系)孵育1小时，在染色缓冲液中洗涤两次，用PE标记的山羊抗小鼠多克隆抗体(pAb)显示，用染色缓冲液洗涤两次并且在HTFC细胞计数器上获得染色并使用FlowJo软件进行分析。
结果显示，抗Siglec-9抗体mAbA、mAbB、mAbC、mAbD、mAbE和mAbF均不结合Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-10、Siglec-11或Siglec-12中的任何一种。
结果显示，除了Siglec-7和Siglec-9之外，一些交叉反应性Siglec-7/9抗体也能够与Siglec-12或Siglec-6结合，除了Siglec-7和Siglec-9之外，mAb1、mAb2和mAb3也能够与Siglec-12结合，然而mAb3、mAb4、mAb5和mAb6不与Siglec-12结合。示例性抗体mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5或mAb6中没有一种与Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-8、Siglec-10或Siglec-11中任何一种结合。
实例4：与Siglec结合的抗体的滴定
通过流式细胞术在用人类Siglec-7和人类Siglec-9和食蟹猴Siglec-9转染的CHO细胞上通过滴定实验来测试抗体对人类Siglec-7、人类Siglec-9和食蟹猴Siglec-9的结合。将细胞在染色缓冲液(SB)中与在20ug/ml和1:5的系列稀释度下的一级抗体一起孵育1h。将它们用SB洗涤三次，然后用山羊F(ab')2抗人类IgG(Fc)PE(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter)#IM05510)孵育30分钟，并用SB洗涤两次。用HTFC Intellicyt细胞计数器显示荧光。
发现以下从2次免疫中的5种融合中显示的六种抗体对由细胞表达的人类Siglec-7和人类Siglec-9具有可比的结合亲和力，并且此外对食蟹猴Siglec具有可比的结合亲和力。对每种抗体结合的EC50值(μg/ml)显示如下。
Figure BDA0001783781250000841
实例5：通过表面等离子体共振(SPR)的Siglec-9结合亲和力
BiacoreTMT100通用程序和试剂
在25℃下在BiacoreTMT200装置(BiacoreTMGE医疗集团)上进行SPR测量。在所有BiacoreTM实验中，HBS-EP+(BiacoreTMGE医疗集团)和NaOH 10mM分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。使用BiacoreTMT200评估软件来分析传感图。在依奈特制药公司(Innate Pharma)克隆、生产和纯化人类siglec-9和-7多聚体蛋白。
蛋白A的固定化
将蛋白质共价地固定在传感器芯片CM5上的葡聚糖层中的羧基基团上。用EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(BiacoreTM，GE医疗集团))将芯片表面激活。将蛋白质在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 4.2和5.0)中稀释至10μg/ml，并且注射直到达到适当的固定水平(即600RU至2000RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(BiacoreTM，GE医疗集团)将剩余的激活的基团失活。
亲和力研究
根据制造商推荐的标准动态方案(BiacoreTMGE医疗集团动态向导(kineticwizard))进行亲和力研究。在固定的Siglec-9 Fc和Siglec-7 Fc蛋白上顺序地注射从600nM至0.975nM范围内的抗Siglec-9和-7/9抗体Fab片段的系列稀释液，并在再生之前使其解离10分钟。使用1:1动态结合模型拟合整个传感图组。一价亲和力和动态结合和解离速率常数显示于下表2中。
表2
Figure BDA0001783781250000851
Figure BDA0001783781250000861
实例6：对单核细胞衍生的树突细胞的滴定
单核细胞衍生的树突细胞(moDC)的产生：
从外周血单核细胞产生单核细胞衍生的树突细胞。从健康供体获得的血沉棕黄层中分离PBMC。使用试剂盒单核细胞分离试剂盒II(美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec))纯化单核细胞，并在补充有10％灭活FBS(GIBCO公司)、谷氨酰胺(GIBCO公司)、MEMNEAA(GIBCO公司)、丙酮酸钠(GIBCO公司)、IL-4(20ng/ml)(派普泰克公司(Peprotech))和GM-CSF(400ng/ml)(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))的RPMI培养基(GIBCO公司)中分化成moDC持续总共6天。将细胞在潮湿的CO2培养箱中于37℃下培养，并在第4天更新细胞因子。
用25mU神经氨酸酶(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))将moDC脱唾液酸化2小时。在神经氨酸酶处理之前和之后控制脱唾液酸化：将moDC细胞在染色缓冲液(SB)中与小鼠Siglec-7 Fc(IPH)和小鼠Siglec-9Fc重组蛋白(IPH)以10ug/ml孵育1h，用SB洗涤两次，用山羊F(ab')2抗小鼠IgG(Fc)PE(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))孵育30分钟，用SB洗涤两次，并用Canto II(HTS)显示荧光。
滴定
通过流式细胞术在滴定实验中测试对moDC和神经氨酸酶处理的moDC的结合。将细胞在染色缓冲液(SB)中与在10ug/ml和1:10的系列稀释度下的一级抗体一起孵育1h。将它们用SB洗涤两次，然后用山羊F(ab')2抗人类IgG(Fc)PE(贝克曼库尔特公司(杰克森免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))孵育30分钟，并用SB洗涤两次。用HTFC Intellicyt细胞计数器显示荧光。
结果
在神经氨酸酶处理后EC50高度增强(10倍)，表明在神经氨酸酶处理前，在moDC上表达的Siglec-9与其唾液酸配体发生了顺式相互作用。然而，平台期水平未改变，表明高亲和力抗体可以结合细胞表面上的所有Siglec-9(结合的和未结合的)构象并抑制monoDC中以及其他细胞类型(例如，NK细胞、CD8T细胞、单核细胞和巨噬细胞M1和M2)中的顺式相互作用和信号传导。图3中显示了针对在moDC(左侧图)和神经氨酸酶处理的moDC(右侧图)中的代表性抗体mAbA、mAbC和mAbD的结果，连同它们相应的EC50值。
实例7：对抗体中和NK细胞中的Siglec活性的能力的评价
使用原代NK细胞(从人类供体纯化的新鲜NK细胞，在使用前于37℃下孵育过夜)测试在第一次和第二次免疫中测试的抗Siglec-7/9抗体在NK细胞活化测定中对Siglec活性的阻断。在24小时内CD137表达的增加与几种淋巴细胞(包括NK细胞)的活化相关(Kohrt等人(2011)Blood[血液]117(8):2423-2432)。通过流式细胞术分析NK细胞上的CD137表达，确定抗Siglec-7/9抗体和靶细胞脱唾液酸化对NK细胞活化的影响。抗Siglec-7/9mAb mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5和mAb6中的每种诱导在24小时的CD137表达增加。
然后通过细胞毒性测定(Cr51)使用YTS Siglec-9*效应细胞系(用人类Siglec-9转染的人类NK细胞系YTS)作为效应物和使用Ramos细胞系作为靶标研究抗Siglec-7/9抗体的作用。该测试通过直接定量负载51Cr的靶细胞的裂解来测量YTS Siglec-9*细胞系的细胞毒性。简而言之，首先用放射性51Cr同位素标记靶细胞，然后在37℃下与效应细胞共孵育4h。在此期间，裂解对YTS细胞敏感的靶细胞，从而将51Cr释放到培养基中。通过液体闪烁计数测量回收的上清液中的51Cr。获得的结果允许评价NK细胞对靶细胞的裂解百分比。在96U孔板中在完全的RPMI中，以200μL最终体积/孔、用5/1的E:T比进行该测定。以10ug/ml和1:10的系列稀释度添加抗Siglec-7/9抗体和同种型对照。
抗Siglec-7/9mAb mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5和mAb6中的每种以剂量依赖性方式诱导YTS Siglec-9*细胞毒性的增加。作为对照，在野生型YTS细胞系上没有观察到这种作用(没有Siglec-9表达)。类似地，抗Siglec-9mAb mAbA、mAbB、mAbC、mAbD、mAbE和mAbF中的每种以剂量依赖性方式诱导YTS Siglec-9*细胞毒性的增加。图4显示了Siglec-7和Siglec-9交叉反应性抗体之间(图4B)和Siglec-9单特异性(非Siglec-7结合的)抗体之间(图4A)的YTS Siglec-9*细胞毒性增加的剂量依赖性诱导。
实例8：原代人类NK细胞中Siglec-9中和的详细研究(低Siglec-9表达)
我们认为先前抗体不能中和NK细胞中的Siglec-9可能与如下有关：例如与嗜中性粒细胞和在细胞表面表达更高水平的Siglec-9的其他细胞相比在原代NK细胞中Siglec-9表达的差异、以及在不同的NK细胞亚群中表达的Siglec-7。为了研究是否可以获得中和NK细胞中的Siglec-9的抗体，我们研究并选择来自许多人类供体的原代NK细胞中的抗体，通过流式细胞术在Siglec-9上进行门控。通过在经典51Cr释放测定中评估肿瘤细胞裂解的细胞毒性并且通过评估NK细胞上CD137表面表达的活化测定来研究抗Siglec-9抗体的作用。在每种情况下，将原代NK细胞(作为从供体纯化的新鲜NK细胞)用作效应细胞并将HT29结直肠癌细胞系用作靶标。
第1部分：细胞毒性测定：在两个人类供体中纯化的NK与HT29肿瘤细胞
细胞毒性测定通过直接定量负载51Cr的靶细胞的裂解来测量NK细胞的细胞毒性。简而言之，首先用放射性51Cr同位素标记靶细胞，然后在37℃下与效应细胞共孵育4h。在此期间，裂解对NK细胞敏感的靶细胞，从而将51Cr释放到培养基中。通过液体闪烁计数测量回收的上清液中的51Cr。获得的结果允许评价NK细胞对靶细胞的裂解百分比。在96U孔板中在完全的RPMI中，以200μL最终体积/孔、用8/1的E:T比进行该测定。以10ug/ml添加抗Siglec-9抗体和同种型对照。
抗Siglec9抗体mAbA、mAbB、mAbC、mAbD、mAbE和mAbF以及抗Siglec7/9抗体mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5和mAb6中的每种诱导NK细胞细胞毒性的增加。图5是显示在两个不同人类供体(供体D1(左侧图)和D2(右侧图))中由抗体mAbA、mAbC、mAbD、mAbE和mAbF介导的原代NK细胞细胞毒性增加的代表性图。
第2部分：活化测定(CD137)：在单个人类供体中纯化的NK与HT29的mAb比较
通过流式细胞术分析在Siglec-9阳性NK细胞上的CD137表达，确定抗Siglec-7/9和抗Siglec-9抗体对NK细胞活化的影响。效应细胞是原代NK细胞(从供体纯化的新鲜NK细胞，在使用前于37℃下孵育过夜)并且靶细胞(HT29细胞系)以1:1的比例混合。在96U孔板中在完全的RPMI中，以200μL最终体积/孔进行CD137测定。将抗体在37℃下与效应细胞预孵育30分钟，并且然后将靶细胞在37℃下共孵育过夜。以下步骤是：在500g下旋转3分钟；用染色缓冲液(SB)洗涤两次；添加50μL染色Ab混合物(抗CD3太平洋蓝-BD Pharmingen公司)；抗CD56-PE-Vio770(美天旎公司(Miltenyi))；抗CD137-APC(美天旎公司(Miltenyi))、抗Siglec-9K8-PE(生物传奇公司(Biolegend))；在4℃下孵育30分钟；用SB洗涤两次；用SB重悬沉淀；并且用Canto II(HTS)显示荧光。
阴性对照是NK细胞与单独的HT29并且是在同种型对照的存在下。图6是显示在一个人类供体中由几种抗Siglec-9和抗Siglec-7/9抗体mAbA、mAbB、mAbF、mAb6和mAb4介导的表达CD137的Siglec-9阳性NK细胞的％增加的代表性图。作为对照，表达CD137的Siglec-9阴性NK细胞的％不受这些抗体的影响。从图中可以看出，抗Siglec-9抗体将表达Siglec-9的原代人类NK细胞的细胞毒性完全恢复至在来自相同供体的Siglec-9阴性原代人类NK细胞中观察到的水平。
第3部分：活化测定(CD137)：在6个人类供体中纯化的NK与HT29mAbA和mAb1
通过使用一种抗Siglec-9(mAb.A)和一种抗Siglec-7/9(mAb1)，用6个供体再现实验。在不存在抗体的情况下(“培养基”设置)，表达CD137的NK的％在供体之间在6％与27％之间变化(参见(图7，左侧图))。将数据归一化为与来自每个实验的对照培养基值相比的相对变化：((X-X培养基))/X培养基)(％)。如图7所示，mAbA和mAb1诱导Siglec-9+CD137+NK％(图7，中间图)而不是Siglec-9-CD137+NK％(图7，右侧图)的增加。
实例9：对原代NK细胞的滴定
通过流式细胞术通过滴定实验测试在新鲜纯化的人类NK细胞上的抗体的结合。将细胞在染色缓冲液(SB)中与在10ug/ml和1:10的系列稀释度下的一级抗体一起孵育1h。将它们用SB洗涤三次，然后用山羊F(ab')2抗人类IgG(Fc)PE(杰克森免疫研究公司(JacksonImmunoResearch))孵育30分钟。在BD FACS Canto II上获得染色，并且使用FlowJo软件进行分析。EC50值以μg/ml显示在下表中(使用4参数logistic拟合计算)。
Figure BDA0001783781250000901
实例10：阻断Siglec与唾液酸配体的结合
部分A：通过流式细胞术阻断Siglec-9与表达唾液酸的肿瘤细胞的结合
将剂量范围的抗人类Siglec-9Fab在室温下与固定剂量的人类Siglec-9 Fc融合重组蛋白共孵育30分钟，然后添加到表达各种唾液酸的细胞系K562E6(用人类HLA-E转染的K562细胞系)和Ramos上持续1小时。在染色缓冲液中将细胞洗涤两次后，将稀释在染色缓冲液中的PE偶联的山羊抗小鼠IgG Fc片段第二抗体(杰克森免疫研究公司)添加到细胞中，并将板在4℃下再孵育30分钟。将细胞洗涤三次，并且在配备有HTFC读板器的Accury C6流式细胞仪上分析。在图上绘制荧光均值与Fab和Siglec-9 Fc融合重组蛋白的比率的图。
结果示于图8中。在顶图上，显示了在抗体的存在下Siglec-9-Fc蛋白与Ramos细胞的结合。抗Siglec/9mAb mAbA、mAbB、mAbC和mAbD各自抑制Siglec-9-Fc蛋白与Ramos细胞的结合，然而mAbE显示出抑制Siglec-9-Fc蛋白与Ramos细胞结合的部分能力，并且mAbF没有显著抑制Siglec-9-Fc蛋白与Ramos细胞的结合。在图8底图中，显示了在抗体的存在下Siglec-9-Fc蛋白与K562细胞的结合。抗Siglec/9mAb mAbA、mAbB、mAbC和mAbD各自抑制Siglec-9-Fc蛋白与Ramos细胞的结合，而mAbE和mAbF两者显示出抑制Siglec-9-Fc蛋白与K562细胞结合的部分能力，且仅在抗体浓度显著较高时如此。总之，抗体mAbA、mAbB、mAbC和mAbD完全阻断Siglec-9与其在肿瘤细胞上的唾液酸配体的结合，而抗体mAbE阻断依赖于表达唾液酸的细胞系并且mAbF不阻断该结合。
部分B：通过ELISA测定Siglec-7和Siglec-9与唾液酸化配体的结合的阻断
唾液酸是在的糖基化蛋白质和脂质上形成的九碳羧基化单糖。包括唾液酸转移酶(催化它们的生物合成)和唾液酸酶(也称为神经氨酸酶(催化它们的切割))的几种酶，调节它们在哺乳动物系统中的出现。在癌症中，改变的唾液酸谱在增强肿瘤生长、转移和逃避免疫监视中起主导作用，导致癌细胞存活(Bork等人,J Pharm Sci.[药物科学杂志]2009年10月；98(10):3499-508)。在几种癌症中已经报道了唾液酸化增加以及改变的调节唾液酸化的酶谱。ST3GAL6酶在多发性骨髓瘤细胞系和患者中过表达，并且在体外与多发性骨髓瘤细胞表面上α-2,3-连接的唾液酸的表达相关。在体内，ST3GAL6敲低与多发性骨髓瘤细胞至骨髓微环境的归巢和植入减少、连同肿瘤负荷降低和生存期延长相关(Glavey等人,Blood.[血液]2014年9月11日；124(11):1765-76)。在神经胶质瘤中高的ST3GAL1酶表达与间充质分子分类的较高肿瘤等级相关(Chong等人,Natl Cancer Inst.[国家癌症研究]2015年11月7日；108(2))。异常的启动子甲基化在调节癌症中几种唾液酸转移酶表达中起作用(Vojta等人,Biochim Biophys Acta.[生物化学与生物物理学学报]2016年1月12日)。在膀胱癌中，异常的ST6GAL1启动子甲基化诱导ST6Gal1表达缺失(Antony等人,BMC Cancer.[BMC癌症]2014年12月2日；14:901)。
Siglec-7和Siglec-9与各种唾液酸键结合。印在芯片上的唾液酸苷文库鉴定了几种Siglec和一种选择性Siglec-7配体共同的唾液酸苷配体(Rillahan等人,ACS ChemBiol.[ACS化学生物学]2013年7月19日；8(7):1417-22)。鉴于Siglec-7和Siglec-9可能差异性地识别唾液酸苷，在免疫细胞上靶向Siglec-7和Siglec-9两者可以允许在给定各种唾液酸转移酶和唾液酸的情况下靶向几种癌症类型。
在ELISA测定中测试了通过抗Siglec-7/9抗体阻断在Siglec-7和Siglec-9与唾液酸化配体之间的相互作用。Siglec蛋白是Siglec-7人类Fc和Siglec-9人类Fc重组蛋白，并且配体是具有唾液酸化三糖的生物素化聚合物(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb-PAA-生物素Glycotech#01-077(被称为“Sia1”)和6'-唾液酸乳糖-PAA-生物素Glycotech#01-039(被称为“Sia2”)。简而言之，在4℃下将蛋白A包被在ELISA板上过夜。在3次洗涤和饱和后，在室温下以0.8μg/孔添加Siglec-7 Fc和Siglec-9 Fc，持续1小时30分钟。在洗涤3次后，以20ug/ml和1:5的系列稀释度添加mAb。在洗涤3次后，在室温下添加生物素化的唾液酸化聚合物持续3小时。在洗涤3次后，以1:1000添加链霉亲和素-过氧化物酶(贝克曼公司(Beckman))。最后，通过在室温下在黑暗中添加TMB(Interchim公司)显示唾液酸化聚合物在Siglec-7和Siglec-9蛋白上的结合，并且通过添加H2SO4终止反应。在450nm处读取吸光度。
将结果示于图9和图10中。mAb 1、2、4、5和6阻断Siglec-7与Sia2的相互作用，但是mAb3不阻断(图9)。所有mAb都阻断了Siglec-9与Sia2的相互作用(图10)，然而mAb1、mAb2和mAb3显示出抑制Siglec-9与Sia1相互作用的低能力(图10)，并且因此基本上不阻断Sia1相互作用。mAb5和mAb6阻断了Siglec-9与Sia1的相互作用，并且mAb4具有阻断Siglec-9与Sia1相互作用的中间能力。对Siglec-9的阻断作用取决于唾液酸类型。总体而言，用抗Siglec-9抗体mAbA、mAbB、mAbC和mAbD观察到最完全的抑制，其实现了Siglec-9与唾液酸相互作用的基本上完全抑制。
实例11：使用点突变体的抗Siglec抗体的表位
为了定义抗Siglec-9抗体的表位，通过在HEK293T细胞中表达具有标签V5的每个单一Siglec-9结构域(V-组Ig样结构域、Ig样C2型结构域1、和Ig样C2型结构域2)并测试抗体与每种蛋白质的结合，我们首先鉴定了我们的抗体的结合结构域。
然后我们设计了Siglec-9突变体，该突变体是通过在N-末端V-组Ig样结构域的表面上在分子表面上暴露的氨基酸的取代来定义。Siglec-9的结构尚未解析，并且在可用的Siglec结构中，Siglec-7是最接近的成员(与Siglec-9氨基酸序列具有超过80％的一致性)。因此，我们使用Siglec-7结构来设计Siglec-9突变体。SEQ ID NO:2的多肽的天然Siglec-9肽前导序列被替代性前导序列和V5标签替换(示于表1中的Siglec-9结构域蛋白V-组Ig样结构域、Ig样C2型结构域1、和Ig样C2型结构域2中)，其后是表1中的Siglec-9氨基酸序列，其中掺入了表3中列出的氨基酸取代。蛋白质在HEK293T细胞系中表达。
所有图(图11-图14)对应于由Alphey等人(2003)，同上描述的SIGLEC-7结构107V的N-末端V-组Ig样结构域。图中以浅色阴影显示配体结合区，包括精氨酸124(其是在所有Siglec中保守的用于与末端唾液酸糖上的羧基基团相互作用的关键残基)、以及周围残基W132、K131、K135和N133(其在Siglec-7与Siglec-9之间保守，并且也被描述为唾液酸结合所必需的)。W132提供与唾液酸的甘油部分的疏水相互作用。表3中的靶向氨基酸突变是Siglec-7和Siglec-9两者中存在的残基，并且使用SEQ ID NO:1(对于Siglec-7)或SEQ IDNO:2(对于Siglec-9)的编号来显示(野生型Siglec-9中的残基/残基的位置/突变体中的残基)。
表3
Figure BDA0001783781250000931
Figure BDA0001783781250000941
突变体的产生
通过PCR产生Siglec-9突变体。扩增的序列在琼脂糖凝胶上跑电泳并使用Macherey Nagel PCR清除凝胶提取试剂盒纯化。然后用ClonTechInFusionTM系统将每个突变体产生的纯化的PCR产物连接到表达载体中。将含有突变序列的载体制备为小量制备品(Miniprep)并测序。在测序之后，使用Promega PureYieldTMPlasmid Midiprep系统将含有突变序列的载体制备为MidiprepTM。在测试转基因表达之前，HEK293T细胞在DMEM培养基(英杰公司(Invitrogen))中生长，使用英杰公司(Invitrogen)的LipofectamineTM2000用载体进行转染，并且在37℃下在CO2培养箱中孵育24或48小时。
抗-Siglec-9与HEK293T转染细胞结合的流式细胞术分析
抗体mAb4、mAb5和mAb6结合Ig样C2型结构域1，然而mAbA、mAbB、mAbC、mAbD、mAbE、mAbF、mAb1、mAb2和mAb3结合N-末端V-组Ig样结构域。通过流式细胞术测试V-组Ig样结构域结合抗体与突变体1-16中的每种的结合。进行第一个实验以确定在一个浓度下失去其与一个或若干个突变体的结合的抗体。为了确认结合的丧失，对抗体进行抗体滴定，对该抗体的结合似乎受到Siglec-9突变的影响。结果示于下表4中。
没有抗体失去与突变体M2的结合，该突变体M2包括在群体中变化的在残基K100(参考SEQ ID NO:2的Siglec-9)或K104(参考SEQ ID NO:1的Siglec-7)处的取代；因此，这些抗体将结合表1中所示的Siglec-9等位基因(SEQ ID NO:160)。
抗Siglec-7和Siglec-9特异性抗体mAb1、mAb2和mAb3以及Siglec-9特异性抗体mAbE和mAbF全部都失去与Siglec-9的突变体M9、M10和M11的结合，但没有失去与任何其他突变体的结合。突变体9在残基N78、P79、A80、R81、A82和V83(参考Siglec-9)处含有氨基酸取代，表明突变体的一个或多个或全部残基对这些抗体的核心表位是重要的。突变体10在残基N77、D96、H98和T99处含有氨基酸取代，表明突变体的一个或多个或全部残基对这些抗体的核心表位是重要的。突变体11在残基W84、E85、E86和R88处含有氨基酸取代，表明突变体的一个或多个或全部残基对这些抗体的核心表位是重要的。如图11所示，M9、M10和M11中取代的残基发现位于N-末端V-组Ig样结构域的一侧(深色阴影)，远离含有唾液酸结合位点的面(浅色阴影)。值得注意的是，抗体不会失去与M8的结合，该M8在定义Siglec的唾液配体特异性的C-C'环结构域中具有突变(参见，例如，Alphey等人,2003J.Biol.Chem.[生物化学杂志]278(5):3372-3377)，也不会失去与部分覆盖配体结合区的M15或M16的结合。因此，抗体在阻断Siglec-9方面达到高的效力，而不会结合唾液酸接触区或结合位点，或结合C-C'环。
抗Siglec-9特异性抗体mAbD失去了与突变体M6的结合，但没有失去与任何其他突变体的结合。突变体6在残基S47、H48、G49、W50、I51、Y52、P53和G54(参考Siglec-9)处含有氨基酸取代，表明突变体的一个或多个或全部残基对抗体的核心表位是重要的。如图12所示，发现M6中取代的残基(深色阴影)位于含有唾液酸结合位点的N-末端V-组Ig样结构域面的顶部，但位于配体结合位点的外部(浅色阴影)。mAbD没有失去与M7的结合，但确实显示与该突变体M7的结合的部分减少；M7含有可以部分重叠到配体结合区中的残基(以浅色阴影显示)。M7包括在残基P55、H58、E122、G124、S125和K127处的氨基酸取代(参考Siglec-9)。因此，然而M7的残基对抗体的核心表位不重要。抗体不会失去与在C-C'环结构域中具有突变的M8的结合，也不会失去与部分覆盖配体结合区的M15或M16的结合。因此，抗体在阻断Siglec-9方面达到高的效力，而不会结合唾液酸接触区或结合位点，或结合C-C'环。
抗Siglec-9特异性抗体mAbA和mAbB两者都失去与Siglec-9的突变体M16的结合，但没有失去与任何其他突变体的结合。突变体16在残基K131和H136处含有氨基酸取代(参考Siglec-9)，表明突变体的一个或多个或全部残基对这些抗体的核心表位是重要的。有趣的是，虽然M16位于Siglec-9的近端或唾液酸配体接触位点内(参见图13)，但是抗体不会失去与M8(C-C'环结构域突变体)的结合，也不会失去与M15的结合。因此，抗体在阻断Siglec-9方面达到高的效力，并且是在唾液酸接触区域内，但不会与C-C'环结合。
在另一方面，抗体mAbC失去与Siglec-9的突变体M8(即在C-C'环内)的结合，但不会失去与M15或M16的结合，也不会失去与M6、M7或M8的结合，也不会失去与M9、M10或M11的结合(也不会失去与任何其他突变体的结合)，但是与M15和M16的结合有部分减少。M8中突变的残基显示在图14中。突变体8在残基R63、A66、N67、T68、D69、Q70和D71(参考Siglec-9)处含有氨基酸取代，表明突变体的一个或多个或全部残基对这些抗体的核心表位是重要的。因此，抗体结合在C-C'环结构域中的残基，该结构域定义Siglec的唾液酸特异性。
Figure BDA0001783781250000971
本文所引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请、和专利)均通过引用以其全文特此结合，并且引用的程度如同每个参考文献被个别地并且明确地指示通过引用结合并且以其全文在本文中阐述(至法律允许的最大程度)，而不考虑本文其他地方做出的具体文件的任何单独提供的结合。
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本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
序列表
<110> 依奈特制药公司（Innate Pharma）
<120> Siglec中和抗体
<130> Sig792
<150> 62/304,957
<151> 2016-03-08
<160> 169
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 467
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Arg Glu Arg Val
1 5 10 15
Glu Gly Gln Lys Ser Asn Arg Lys Asp Tyr Ser Leu Thr Met Gln Ser
20 25 30
Ser Val Thr Val Gln Glu Gly Met Cys Val His Val Arg Cys Ser Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Cys Phe Gln Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln
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Gly Val Thr Thr Asn Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro
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Gln Asn Leu Thr Val Thr Val Phe Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ser Thr
245 250 255
Ala Leu Gly Asn Ser Ser Ser Leu Ser Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu
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Thr Trp Arg Ser Leu Thr Leu Tyr Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Leu
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Arg Ala Gln Asn Ser Leu Gly Ser Gln His Val Ser Leu Asn Leu Ser
325 330 335
Leu Gln Gln Glu Tyr Thr Gly Lys Met Arg Pro Val Ser Gly Val Leu
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Leu Gly Ala Val Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu Ser
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Phe Cys Val Ile Phe Ile Val Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala
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<211> 463
<212> PRT
<213> 智人
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Leu Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg Asp Ala Ala Glu Phe Thr Cys
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Leu Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly Val Val Gly Gly
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Gly Asp Thr Gly Ile Glu Asp Ala Asn Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser
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<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
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<210> 4
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 4
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1 5 10 15
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<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
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Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Thr Leu Glu Trp
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Met Gly Tyr Ile Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
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Asn Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe
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Leu Gln Phe Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
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Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
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Asn Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe
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Gly
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<211> 7
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<213> 小鼠
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Gly Asp Ser Leu Phe Ala Tyr
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<213> 小鼠
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Asp Ser Leu Phe Ala
1 5
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<213> 小鼠
<400> 68
Ala Arg Gly Asp Ser Leu Phe Ala Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 69
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
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<211> 7
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<213> 小鼠
<400> 70
Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
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<213> 小鼠
<400> 71
Gln Asn Val Gly Thr Asn
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<213> 小鼠
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Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser
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<213> 小鼠
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Gln Gln Tyr Ile Thr Tyr Pro Tyr Thr
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<213> 小鼠
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Tyr Ile Thr Tyr Pro Tyr
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Tyr Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
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<213> 小鼠
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Ser
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Val Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
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<213> 小鼠
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Thr
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<213> 小鼠
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Ile Asn Pro Ser Asn Gly His Thr
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Gly Val Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Asp Ala Met Asp Tyr
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<213> 小鼠
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Val Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Asp Ala Met Asp
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<213> 小鼠
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Ala Asn Gly Val Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Asp Ala Met Asp Tyr
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Gly Asp Thr Phe Pro Phe
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<213> 小鼠
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Asn Tyr Glu Met Asn
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Glu
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
<400> 104
Asp Tyr Gly Arg Ser Tyr Gly Phe Ala
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<213> 小鼠
<400> 105
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 106
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
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<213> 小鼠
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Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe
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<213> 小鼠
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Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe
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<213> 小鼠
<400> 109
Leu Ala Ser Lys Leu Glu Ser
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<213> 小鼠
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His Gln Asn Asn Glu Asp Pro Pro Trp Thr
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Asn Asn Glu Asp Pro Pro Trp
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<213> 小鼠
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Asp Tyr Ser Met His
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Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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<213> 小鼠
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Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser
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Trp Ile Ile Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Arg
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Gly
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<213> 小鼠
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Ile Ile Thr Glu Thr Gly Glu Pro
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<213> 小鼠
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Asp Phe Asp Gly Tyr
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<213> 小鼠
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Ala Arg Asp Phe Asp Gly Tyr
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 119
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 120
Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 121
Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 122
Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 123
Gln His His Tyr Gly Phe Pro Trp Thr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 124
His Tyr Gly Phe Pro Trp
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 125
Thr Phe Gly Met His
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 126
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 127
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe Gly
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 128
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 129
Ile Ser Ser Gly Ser Asn Ala Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 130
Pro Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 131
Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 132
Ala Ser Pro Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 133
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 133
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ala Tyr Leu His
1 5 10
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 134
Ser Ser Ser Val Ser Ser Ala Tyr
1 5
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 135
Ser Ser Val Ser Ser Ala Tyr
1 5
<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 136
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 137
Gln Gln Tyr Ser Ala Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 138
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 138
Tyr Ser Ala Tyr Pro Tyr
1 5
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 139
Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 140
Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 141
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 141
Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Ser Trp Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 142
Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Ser Trp Phe Gly
1 5 10
<210> 143
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 143
Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Ser Trp Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 144
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asp Val Ala
1 5 10
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 145
Ser Gln Asn Val Gly Thr Asp
1 5
<210> 146
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 146
Gln Asn Val Gly Thr Asp
1 5
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 147
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 148
Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 149
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 149
Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr
1 5
<210> 150
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Gln Lys Ser Asn Arg Lys Asp Tyr Ser Leu Thr Met Gln Ser Ser Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Glu Gly Met Cys Val His Val Arg Cys Ser Phe Ser Tyr
20 25 30
Pro Val Asp Ser Gln Thr Asp Ser Asp Pro Val His Gly Tyr Trp Phe
35 40 45
Arg Ala Gly Asn Asp Ile Ser Trp Lys Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn
50 55 60
Pro Ala Trp Ala Val Gln Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu
65 70 75 80
Gly Asp Pro Gln Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg
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Met Ser Asp Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Asn Ile
100 105 110
Lys Trp Asn Tyr Lys Tyr Asp Gln Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu
115 120 125
Thr His Arg Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys
130 135 140
Phe Gln Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr
145 150 155 160
Pro Pro Met Ile Ser Trp Met Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu His Pro
165 170 175
Ser Thr Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln His
180 185 190
His Gly Thr Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Leu Pro Gly Ala Gly Val
195 200 205
Thr Thr Asn Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn
210 215 220
Leu Thr Val Thr Val Phe Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ser Thr Ala Leu
225 230 235 240
Gly Asn Ser Ser Ser Leu Ser Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu
245 250 255
Val Cys Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp Thr Trp
260 265 270
Arg Ser Leu Thr Leu Tyr Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Leu Val Leu
275 280 285
Glu Leu Gln Val His Leu Gly Asp Glu Gly Glu Phe Thr Cys Arg Ala
290 295 300
Gln Asn Ser Leu Gly Ser Gln His Val Ser Leu Asn Leu Ser Leu Gln
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Thr Gly Lys Met Arg Pro Val Ser Gly Val Leu Leu Gly
325 330 335
Ala Val Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu Ser Phe Cys
340 345 350
Val Ile Phe Ile Val Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala Arg Pro
355 360 365
Ala Ala Asp Val Gly Asp Ile Gly Met Lys Asp Ala Asn Thr Ile Arg
370 375 380
Gly Ser Ala Ser Gln Gly Asn Leu Thr Glu Ser Trp Ala Asp Asp Asn
385 390 395 400
Pro Arg His His Gly Leu Ala Ala His Ser Ser Gly Glu Glu Arg Glu
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Ile Gln Tyr Ala Pro Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Pro Gln Asp Leu
420 425 430
Ser Gly Gln Glu Ala Thr Asn Asn Glu Tyr Ser Glu Ile Lys Ile Pro
435 440 445
Lys
<210> 151
<211> 446
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln Glu
1 5 10 15
Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His Gly
20 25 30
Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly
35 40 45
Ala Asn Thr Asp Gln Asp Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn Pro Ala Arg
50 55 60
Ala Val Trp Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu Gly Asp Pro
65 70 75 80
His Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg Arg Ser Asp
85 90 95
Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Ile Lys Trp Asn
100 105 110
Tyr Lys His His Arg Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu Thr His Arg
115 120 125
Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys Pro Gln Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Met
145 150 155 160
Ile Ser Trp Ile Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu Asp Pro Ser Thr Thr
165 170 175
Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly Thr
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Thr Thr Asn
195 200 205
Lys Thr Val His Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn Leu Thr Met
210 215 220
Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Val Leu Gly Asn Gly
225 230 235 240
Ser Ser Leu Ser Leu Pro Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys Ala
245 250 255
Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser Trp
260 265 270
Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val Leu
275 280 285
Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg Asp Ala Ala Glu Phe Thr Cys Arg
290 295 300
Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln Gln Val Tyr Leu Asn Val Ser Leu
305 310 315 320
Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly Val Val Gly Gly Ala
325 330 335
Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu Ser Phe Cys Val Ile Phe Val Val
340 345 350
Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala Arg Pro Ala Ala Gly Val Gly
355 360 365
Asp Thr Gly Ile Glu Asp Ala Asn Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser Gln
370 375 380
Gly Pro Leu Thr Glu Pro Trp Ala Glu Asp Ser Pro Pro Asp Gln Pro
385 390 395 400
Pro Pro Ala Ser Ala Arg Ser Ser Val Gly Glu Gly Glu Leu Gln Tyr
405 410 415
Ala Ser Leu Ser Phe Gln Met Val Lys Pro Trp Asp Ser Arg Gly Gln
420 425 430
Glu Ala Thr Asp Thr Glu Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Arg
435 440 445
<210> 152
<211> 347
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu
1 5 10 15
Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro Tyr
20 25 30
Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly Ala
35 40 45
Ile Ile Ser Gly Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln Glu
50 55 60
Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro Ser
65 70 75 80
Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn
85 90 95
Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Tyr
100 105 110
Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg Pro
115 120 125
Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn Leu
130 135 140
Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile Phe
145 150 155 160
Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr His
165 170 175
Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr Asn
180 185 190
Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu Arg
195 200 205
Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr Gly
210 215 220
Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly Val
225 230 235 240
Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala Leu
245 250 255
Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys Ala
260 265 270
Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly Ser
275 280 285
Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr Glu
290 295 300
Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu Glu
305 310 315 320
Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys Asp
325 330 335
Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln
340 345
<210> 153
<211> 535
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Glu Lys Pro Val Tyr Glu Leu Gln Val Gln Lys Ser Val Thr Val Gln
1 5 10 15
Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Trp Arg
20 25 30
Ser Trp Tyr Ser Ser Pro Pro Leu Tyr Val Tyr Trp Phe Arg Asp Gly
35 40 45
Glu Ile Pro Tyr Tyr Ala Glu Val Val Ala Thr Asn Asn Pro Asp Arg
50 55 60
Arg Val Lys Pro Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Val
65 70 75 80
Gln Lys Lys Asn Cys Ser Leu Ser Ile Gly Asp Ala Arg Met Glu Asp
85 90 95
Thr Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Arg Asp Val Lys Tyr
100 105 110
Ser Tyr Gln Gln Asn Lys Leu Asn Leu Glu Val Thr Ala Leu Ile Glu
115 120 125
Lys Pro Asp Ile His Phe Leu Glu Pro Leu Glu Ser Gly Arg Pro Thr
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ser Leu Pro Gly Ser Cys Glu Ala Gly Pro Pro Leu
145 150 155 160
Thr Phe Ser Trp Thr Gly Asn Ala Leu Ser Pro Leu Asp Pro Glu Thr
165 170 175
Thr Arg Ser Ser Glu Leu Thr Leu Thr Pro Arg Pro Glu Asp His Gly
180 185 190
Thr Asn Leu Thr Cys Gln Met Lys Arg Gln Gly Ala Gln Val Thr Thr
195 200 205
Glu Arg Thr Val Gln Leu Asn Val Ser Tyr Ala Pro Gln Thr Ile Thr
210 215 220
Ile Phe Arg Asn Gly Ile Ala Leu Glu Ile Leu Gln Asn Thr Ser Tyr
225 230 235 240
Leu Pro Val Leu Glu Gly Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Asp Ala Pro
245 250 255
Ser Asn Pro Pro Ala His Leu Ser Trp Phe Gln Gly Ser Pro Ala Leu
260 265 270
Asn Ala Thr Pro Ile Ser Asn Thr Gly Ile Leu Glu Leu Arg Arg Val
275 280 285
Arg Ser Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Arg Ala Gln His Pro Leu
290 295 300
Gly Phe Leu Gln Ile Phe Leu Asn Leu Ser Val Tyr Ser Leu Pro Gln
305 310 315 320
Leu Leu Gly Pro Ser Cys Ser Trp Glu Ala Glu Gly Leu His Cys Arg
325 330 335
Cys Ser Phe Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ser Leu Cys Trp Arg Leu Glu
340 345 350
Glu Lys Pro Leu Glu Gly Asn Ser Ser Gln Gly Ser Phe Lys Val Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ser Ser Leu Ile Leu His Gly
370 375 380
Gly Leu Ser Ser Asp Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Trp Asn Ile Tyr
385 390 395 400
Gly Ser Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Leu Gln Gly Arg Ser Asn Leu
405 410 415
Gly Thr Gly Val Val Pro Ala Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Met Ala
420 425 430
Leu Leu Cys Ile Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Leu Ile Val Lys Ala
435 440 445
Arg Arg Lys Gln Ala Ala Gly Arg Pro Glu Lys Met Asp Asp Glu Asp
450 455 460
Pro Ile Met Gly Thr Ile Thr Ser Gly Ser Arg Lys Lys Pro Trp Pro
465 470 475 480
Asp Ser Pro Gly Asp Gln Ala Ser Pro Pro Gly Asp Ala Pro Pro Leu
485 490 495
Glu Glu Gln Lys Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Ser Glu Met
500 505 510
Lys Ser Arg Glu Pro Lys Asp Gln Glu Ala Pro Ser Thr Thr Glu Tyr
515 520 525
Ser Glu Ile Lys Thr Ser Lys
530 535
<210> 154
<211> 411
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Gln Glu Arg Arg Phe Gln Leu Glu Gly Pro Glu Ser Leu Thr Val Gln
1 5 10 15
Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Arg Leu Pro Thr Thr Leu Pro
20 25 30
Ala Ser Tyr Tyr Gly Tyr Gly Tyr Trp Phe Leu Glu Gly Ala Asp Val
35 40 45
Pro Val Ala Thr Asn Asp Pro Asp Glu Glu Val Gln Glu Glu Thr Arg
50 55 60
Gly Arg Phe His Leu Leu Trp Asp Pro Arg Arg Lys Asn Cys Ser Leu
65 70 75 80
Ser Ile Arg Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn Ala Ala Tyr Phe Phe Arg
85 90 95
Leu Lys Ser Lys Trp Met Lys Tyr Gly Tyr Thr Ser Ser Lys Leu Ser
100 105 110
Val Arg Val Met Ala Leu Thr His Arg Pro Asn Ile Ser Ile Pro Gly
115 120 125
Thr Leu Glu Ser Gly His Pro Ser Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp
130 135 140
Val Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile Phe Ser Trp Met Ser Ala Ala
145 150 155 160
Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr Gln Ser Ser Val Leu Thr Ile
165 170 175
Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Ser Thr Asn Leu Thr Cys Gln Val Thr
180 185 190
Phe Pro Gly Ala Gly Val Thr Met Glu Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val
195 200 205
Ser Ser Phe Lys Ile Leu Gln Asn Thr Ser Ser Leu Pro Val Leu Glu
210 215 220
Gly Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Asp Ala Asp Gly Asn Pro Pro Ala
225 230 235 240
His Leu Ser Trp Phe Gln Gly Phe Pro Ala Leu Asn Ala Thr Pro Ile
245 250 255
Ser Asn Thr Gly Val Leu Glu Leu Pro Gln Val Gly Ser Ala Glu Glu
260 265 270
Gly Asp Phe Thr Cys Arg Ala Gln His Pro Leu Gly Ser Leu Gln Ile
275 280 285
Ser Leu Ser Leu Phe Val His Trp Lys Pro Glu Gly Arg Ala Gly Gly
290 295 300
Val Leu Gly Ala Val Trp Gly Ala Ser Ile Thr Thr Leu Val Phe Leu
305 310 315 320
Cys Val Cys Phe Ile Phe Arg Val Lys Thr Arg Arg Lys Lys Ala Ala
325 330 335
Gln Pro Val Gln Asn Thr Asp Asp Val Asn Pro Val Met Val Ser Gly
340 345 350
Ser Arg Gly His Gln His Gln Phe Gln Thr Gly Ile Val Ser Asp His
355 360 365
Pro Ala Glu Ala Gly Pro Ile Ser Glu Asp Glu Gln Glu Leu His Tyr
370 375 380
Ala Val Leu His Phe His Lys Val Gln Pro Gln Glu Pro Lys Val Thr
385 390 395 400
Asp Thr Glu Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Lys
405 410
<210> 155
<211> 483
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Met Glu Gly Asp Arg Gln Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Leu Gln Val Gln
1 5 10 15
Glu Leu Val Thr Val Gln Glu Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser
20 25 30
Phe Ser Tyr Pro Gln Asp Gly Trp Thr Asp Ser Asp Pro Val His Gly
35 40 45
Tyr Trp Phe Arg Ala Gly Asp Arg Pro Tyr Gln Asp Ala Pro Val Ala
50 55 60
Thr Asn Asn Pro Asp Arg Glu Val Gln Ala Glu Thr Gln Gly Arg Phe
65 70 75 80
Gln Leu Leu Gly Asp Ile Trp Ser Asn Asp Cys Ser Leu Ser Ile Arg
85 90 95
Asp Ala Arg Lys Arg Asp Lys Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Leu Glu Arg
100 105 110
Gly Ser Met Lys Trp Ser Tyr Lys Ser Gln Leu Asn Tyr Lys Thr Lys
115 120 125
Gln Leu Ser Val Phe Val Thr Ala Leu Thr His Arg Pro Asp Ile Leu
130 135 140
Ile Leu Gly Thr Leu Glu Ser Gly His Ser Arg Asn Leu Thr Cys Ser
145 150 155 160
Val Pro Trp Ala Cys Lys Gln Gly Thr Pro Pro Met Ile Ser Trp Ile
165 170 175
Gly Ala Ser Val Ser Ser Pro Gly Pro Thr Thr Ala Arg Ser Ser Val
180 185 190
Leu Thr Leu Thr Pro Lys Pro Gln Asp His Gly Thr Ser Leu Thr Cys
195 200 205
Gln Val Thr Leu Pro Gly Thr Gly Val Thr Thr Thr Ser Thr Val Arg
210 215 220
Leu Asp Val Ser Tyr Pro Pro Trp Asn Leu Thr Met Thr Val Phe Gln
225 230 235 240
Gly Asp Ala Thr Ala Ser Thr Ala Leu Gly Asn Gly Ser Ser Leu Ser
245 250 255
Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys Ala Val Asn Ser Asn
260 265 270
Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp Thr Arg Gly Ser Leu Thr Leu Cys Pro
275 280 285
Ser Arg Ser Ser Asn Pro Gly Leu Leu Glu Leu Pro Arg Val His Val
290 295 300
Arg Asp Glu Gly Glu Phe Thr Cys Arg Ala Gln Asn Ala Gln Gly Ser
305 310 315 320
Gln His Ile Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gln Asn Glu Gly Thr Gly Thr
325 330 335
Ser Arg Pro Val Ser Gln Val Thr Leu Ala Ala Val Gly Gly Ala Gly
340 345 350
Ala Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Phe Cys Ile Ile Phe Ile Ile Val
355 360 365
Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala Arg Pro Ala Ala Gly Val Gly Asp
370 375 380
Thr Gly Met Glu Asp Ala Lys Ala Ile Arg Gly Ser Ala Ser Gln Gly
385 390 395 400
Pro Leu Thr Glu Ser Trp Lys Asp Gly Asn Pro Leu Lys Lys Pro Pro
405 410 415
Pro Ala Val Ala Pro Ser Ser Gly Glu Glu Gly Glu Leu His Tyr Ala
420 425 430
Thr Leu Ser Phe His Lys Val Lys Pro Gln Asp Pro Gln Gly Gln Glu
435 440 445
Ala Thr Asp Ser Glu Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Lys Arg Glu Thr
450 455 460
Ala Glu Thr Gln Ala Cys Leu Arg Asn His Asn Pro Ser Ser Lys Glu
465 470 475 480
Val Arg Gly
<210> 156
<211> 681
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
Met Asp Gly Arg Phe Trp Ile Arg Val Gln Glu Ser Val Met Val Pro
1 5 10 15
Glu Gly Leu Cys Ile Ser Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Arg Gln
20 25 30
Asp Trp Thr Gly Ser Thr Pro Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Ala Val
35 40 45
Thr Glu Thr Thr Lys Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn His Gln Ser Arg
50 55 60
Glu Val Glu Met Ser Thr Arg Gly Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp Pro
65 70 75 80
Ala Lys Gly Asn Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Met Gln Asp
85 90 95
Glu Ser Gln Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Tyr Val Arg Tyr
100 105 110
Asn Phe Met Asn Asp Gly Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr Gln
115 120 125
Lys Pro Asp Val Tyr Ile Pro Glu Thr Leu Glu Pro Gly Gln Pro Val
130 135 140
Thr Val Ile Cys Val Phe Asn Trp Ala Phe Glu Glu Cys Pro Pro Pro
145 150 155 160
Ser Phe Ser Trp Thr Gly Ala Ala Leu Ser Ser Gln Gly Thr Lys Pro
165 170 175
Thr Thr Ser His Phe Ser Val Leu Ser Phe Thr Pro Arg Pro Gln Asp
180 185 190
His Asn Thr Asp Leu Thr Cys His Val Asp Phe Ser Arg Lys Gly Val
195 200 205
Ser Val Gln Arg Thr Val Arg Leu Arg Val Ala Tyr Ala Pro Arg Asp
210 215 220
Leu Val Ile Ser Ile Ser Arg Asp Asn Thr Pro Ala Leu Glu Pro Gln
225 230 235 240
Pro Gln Gly Asn Val Pro Tyr Leu Glu Ala Gln Lys Gly Gln Phe Leu
245 250 255
Arg Leu Leu Cys Ala Ala Asp Ser Gln Pro Pro Ala Thr Leu Ser Trp
260 265 270
Val Leu Gln Asn Arg Val Leu Ser Ser Ser His Pro Trp Gly Pro Arg
275 280 285
Pro Leu Gly Leu Glu Leu Pro Gly Val Lys Ala Gly Asp Ser Gly Arg
290 295 300
Tyr Thr Cys Arg Ala Glu Asn Arg Leu Gly Ser Gln Gln Arg Ala Leu
305 310 315 320
Asp Leu Ser Val Gln Tyr Pro Pro Glu Asn Leu Arg Val Met Val Ser
325 330 335
Gln Ala Asn Arg Thr Val Leu Glu Asn Leu Gly Asn Gly Thr Ser Leu
340 345 350
Pro Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu Cys Leu Val Cys Val Thr His Ser
355 360 365
Ser Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp Thr Gln Arg Gly Gln Val Leu Ser
370 375 380
Pro Ser Gln Pro Ser Asp Pro Gly Val Leu Glu Leu Pro Arg Val Gln
385 390 395 400
Val Glu His Glu Gly Glu Phe Thr Cys His Ala Arg His Pro Leu Gly
405 410 415
Ser Gln His Val Ser Leu Ser Leu Ser Val His Tyr Ser Pro Lys Leu
420 425 430
Leu Gly Pro Ser Cys Ser Trp Glu Ala Glu Gly Leu His Cys Ser Cys
435 440 445
Ser Ser Gln Ala Ser Pro Ala Pro Ser Leu Arg Trp Trp Leu Gly Glu
450 455 460
Glu Leu Leu Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asp Ser Phe Glu Val Thr Pro
465 470 475 480
Ser Ser Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ser Ser Leu Ser Leu His Gly Gly
485 490 495
Leu Ser Ser Gly Leu Arg Leu Arg Cys Glu Ala Trp Asn Val His Gly
500 505 510
Ala Gln Ser Gly Ser Ile Leu Gln Leu Pro Asp Lys Lys Gly Leu Ile
515 520 525
Ser Thr Ala Phe Ser Asn Gly Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ile Thr Ala
530 535 540
Leu Leu Phe Leu Cys Leu Ala Leu Ile Ile Met Lys Ile Leu Pro Lys
545 550 555 560
Arg Arg Thr Gln Thr Glu Thr Pro Arg Pro Arg Phe Ser Arg His Ser
565 570 575
Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Asn Val Val Pro Thr Ala Gly Pro Leu Ala
580 585 590
Gln Lys Arg Asn Gln Lys Ala Thr Pro Asn Ser Pro Arg Thr Pro Leu
595 600 605
Pro Pro Gly Ala Pro Ser Pro Glu Ser Lys Lys Asn Gln Lys Lys Gln
610 615 620
Tyr Gln Leu Pro Ser Phe Pro Glu Pro Lys Ser Ser Thr Gln Ala Pro
625 630 635 640
Glu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Glu Leu His Tyr Ala Thr Leu Asn Phe
645 650 655
Pro Gly Val Arg Pro Arg Pro Glu Ala Arg Met Pro Lys Gly Thr Gln
660 665 670
Ala Asp Tyr Ala Glu Val Lys Phe Gln
675 680
<210> 157
<211> 670
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
Asn Lys Asp Pro Ser Tyr Ser Leu Gln Val Gln Arg Gln Val Pro Val
1 5 10 15
Pro Glu Gly Leu Cys Val Ile Val Ser Cys Asn Leu Ser Tyr Pro Arg
20 25 30
Asp Gly Trp Asp Glu Ser Thr Ala Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Gly
35 40 45
Arg Thr Ser Pro Lys Thr Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn Gln Ser
50 55 60
Arg Glu Val Glu Met Ser Thr Arg Asp Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp
65 70 75 80
Pro Gly Lys Gly Ser Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Arg Glu
85 90 95
Asp Glu Ala Trp Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Arg Val Arg
100 105 110
His Ser Phe Leu Ser Asn Ala Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr
115 120 125
Lys Lys Pro Asp Val Tyr Ile Pro Glu Thr Leu Glu Pro Gly Gln Pro
130 135 140
Val Thr Val Ile Cys Val Phe Asn Trp Ala Phe Lys Lys Cys Pro Ala
145 150 155 160
Pro Ser Phe Ser Trp Thr Gly Ala Ala Leu Ser Pro Arg Arg Thr Arg
165 170 175
Pro Ser Thr Ser His Phe Ser Val Leu Ser Phe Thr Pro Ser Pro Gln
180 185 190
Asp His Asp Thr Asp Leu Thr Cys His Val Asp Phe Ser Arg Lys Gly
195 200 205
Val Ser Ala Gln Arg Thr Val Arg Leu Arg Val Ala Tyr Ala Pro Lys
210 215 220
Asp Leu Ile Ile Ser Ile Ser His Asp Asn Thr Ser Ala Leu Glu Leu
225 230 235 240
Gln Gly Asn Val Ile Tyr Leu Glu Val Gln Lys Gly Gln Phe Leu Arg
245 250 255
Leu Leu Cys Ala Ala Asp Ser Gln Pro Pro Ala Thr Leu Ser Trp Val
260 265 270
Leu Gln Asp Arg Val Leu Ser Ser Ser His Pro Trp Gly Pro Arg Thr
275 280 285
Leu Gly Leu Glu Leu Arg Gly Val Arg Ala Gly Asp Ser Gly Arg Tyr
290 295 300
Thr Cys Arg Ala Glu Asn Arg Leu Gly Ser Gln Gln Gln Ala Leu Asp
305 310 315 320
Leu Ser Val Gln Tyr Pro Pro Glu Asn Leu Arg Val Met Val Ser Gln
325 330 335
Ala Asn Arg Thr Val Leu Glu Asn Leu Gly Asn Gly Thr Ser Leu Pro
340 345 350
Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys Val Thr His Ser Ser
355 360 365
Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp Thr Arg Trp Gly Gln Thr Val Gly Pro
370 375 380
Ser Gln Pro Ser Asp Pro Gly Val Leu Glu Leu Pro Pro Ile Gln Met
385 390 395 400
Glu His Glu Gly Glu Phe Thr Cys His Ala Gln His Pro Leu Gly Ser
405 410 415
Gln His Val Ser Leu Ser Leu Ser Val His Tyr Pro Pro Gln Leu Leu
420 425 430
Gly Pro Ser Cys Ser Trp Glu Ala Glu Gly Leu His Cys Ser Cys Ser
435 440 445
Ser Gln Ala Ser Pro Ala Pro Ser Leu Arg Trp Trp Leu Gly Glu Glu
450 455 460
Leu Leu Glu Gly Asn Ser Ser Gln Gly Ser Phe Glu Val Thr Pro Ser
465 470 475 480
Ser Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ser Ser Leu Ser Leu His Gly Gly Leu
485 490 495
Ser Ser Gly Leu Arg Leu Arg Cys Lys Ala Trp Asn Val His Gly Ala
500 505 510
Gln Ser Gly Ser Val Phe Gln Leu Leu Pro Gly Lys Leu Glu His Gly
515 520 525
Gly Gly Leu Gly Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Gly Val Ala Ala Leu
530 535 540
Leu Ala Phe Cys Ser Cys Leu Val Val Phe Arg Val Lys Ile Cys Arg
545 550 555 560
Lys Glu Ala Arg Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Asp Val Pro Ser Thr
565 570 575
Leu Gly Pro Ile Ser Gln Gly His Gln His Glu Cys Ser Ala Gly Ser
580 585 590
Ser Gln Asp His Pro Pro Pro Gly Ala Ala Thr Tyr Thr Pro Gly Lys
595 600 605
Gly Glu Glu Gln Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Gln Gly Leu
610 615 620
Arg Leu Trp Glu Pro Ala Asp Gln Glu Ala Pro Ser Thr Thr Glu Tyr
625 630 635 640
Ser Glu Ile Lys Ile His Thr Gly Gln Pro Leu Arg Gly Pro Gly Phe
645 650 655
Gly Leu Gln Leu Glu Arg Glu Met Ser Gly Met Val Pro Lys
660 665 670
<210> 158
<211> 577
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
Lys Glu Gln Lys Asp Tyr Leu Leu Thr Met Gln Lys Ser Val Thr Val
1 5 10 15
Gln Glu Gly Leu Cys Val Ser Val Leu Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Gln
20 25 30
Asn Gly Trp Thr Ala Ser Asp Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Ala
35 40 45
Gly Asp His Val Ser Arg Asn Ile Pro Val Ala Thr Asn Asn Pro Ala
50 55 60
Arg Ala Val Gln Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu Gly Asp
65 70 75 80
Pro Gln Asn Lys Asp Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Thr Arg Glu Ser
85 90 95
Asp Ala Gly Thr Tyr Val Phe Cys Val Glu Arg Gly Asn Met Lys Trp
100 105 110
Asn Tyr Lys Tyr Asp Gln Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Ser Gln Asp
115 120 125
Leu Leu Ser Arg Tyr Arg Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Val Gln
130 135 140
Glu Gly Leu Cys Val Ser Val Pro Cys Ser Val Leu Tyr Pro His Tyr
145 150 155 160
Asn Trp Thr Ala Ser Ser Pro Val Tyr Gly Ser Trp Phe Lys Glu Gly
165 170 175
Ala Asp Ile Pro Trp Asp Ile Pro Val Ala Thr Asn Thr Pro Ser Gly
180 185 190
Lys Val Gln Glu Asp Thr His Gly Arg Phe Leu Leu Leu Gly Asp Pro
195 200 205
Gln Thr Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg Lys Gly Asp
210 215 220
Ser Gly Lys Tyr Tyr Phe Gln Val Glu Arg Gly Ser Arg Lys Trp Asn
225 230 235 240
Tyr Ile Tyr Asp Lys Leu Ser Val His Val Thr Ala Leu Thr His Met
245 250 255
Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly His Pro Arg Asn
260 265 270
Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Trp Met Gly Ala Ser Val Ser Ser Leu Asp Pro Thr Ile Thr
290 295 300
Arg Ser Ser Met Leu Ser Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly Thr
305 310 315 320
Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Leu Pro Gly Ala Gly Val Thr Met Thr
325 330 335
Arg Ala Val Arg Leu Asn Ile Ser Tyr Pro Pro Gln Asn Leu Thr Met
340 345 350
Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Ala Ser Thr Thr Leu Arg Asn Gly
355 360 365
Ser Ala Leu Ser Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu His Leu Val Cys Ala
370 375 380
Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp Thr Trp Gly Ser Leu
385 390 395 400
Thr Leu Ser Pro Ser Gln Ser Ser Asn Leu Gly Val Leu Glu Leu Pro
405 410 415
Arg Val His Val Lys Asp Glu Gly Glu Phe Thr Cys Arg Ala Gln Asn
420 425 430
Pro Leu Gly Ser Gln His Ile Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gln Asn Glu
435 440 445
Tyr Thr Gly Lys Met Arg Pro Ile Ser Gly Val Thr Leu Gly Ala Phe
450 455 460
Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu Tyr Phe Cys Ile Ile
465 470 475 480
Phe Val Val Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala Arg Pro Ala Val
485 490 495
Gly Val Gly Asp Thr Gly Met Glu Asp Ala Asn Ala Val Arg Gly Ser
500 505 510
Ala Ser Gln Gly Pro Leu Ile Glu Ser Pro Ala Asp Asp Ser Pro Pro
515 520 525
His His Ala Pro Pro Ala Leu Ala Thr Pro Ser Pro Glu Glu Gly Glu
530 535 540
Ile Gln Tyr Ala Ser Leu Ser Phe His Lys Ala Arg Pro Gln Tyr Pro
545 550 555 560
Gln Glu Gln Glu Ala Ile Gly Tyr Glu Tyr Ser Glu Ile Asn Ile Pro
565 570 575
Lys
<210> 159
<211> 353
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 159
Gln Arg Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Pro Leu Thr Met Gln Glu Ser Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Gln Gly Leu Cys Val His Val Leu Cys Ser Phe Ser Tyr
20 25 30
Pro Trp Tyr Gly Trp Ile Ser Ser Asp Pro Val His Gly Tyr Trp Phe
35 40 45
Arg Ala Gly Ala His Thr Asp Arg Asp Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn
50 55 60
Pro Ala Arg Ala Val Arg Glu Asp Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu
65 70 75 80
Gly Asp Pro Gln Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg
85 90 95
Ser Ser Asp Ala Gly Thr Tyr Phe Phe Arg Val Glu Thr Gly Lys Thr
100 105 110
Lys Trp Asn Tyr Lys Tyr Ala Pro Leu Ser Val His Val Thr Ala Leu
115 120 125
Thr His Arg Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys
130 135 140
Pro Arg Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr
145 150 155 160
Ala Pro Met Ile Ser Trp Met Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu Asp Pro
165 170 175
Ser Thr Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp
180 185 190
His Gly Thr Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val
195 200 205
Thr Thr Asn Lys Thr Ile His Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn
210 215 220
Leu Thr Met Thr Val Phe Gln Gly Asn Asp Thr Val Ser Ile Val Leu
225 230 235 240
Gly Asn Gly Ser Ser Val Ser Val Pro Glu Gly Pro Ser Leu Arg Leu
245 250 255
Val Cys Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser Trp
260 265 270
Gly Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val Leu
275 280 285
Glu Leu Pro Arg Val His Leu Arg Asp Glu Glu Glu Phe Thr Cys Arg
290 295 300
Ala Gln Asn Leu Leu Gly Ser Gln Gln Val Ser Leu Asn Val Ser Leu
305 310 315 320
Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Gln Gly Ala Val Gly Ala Gly
325 330 335
Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu Ser Phe Cys Val Ile Phe Val Val Val
340 345 350
Pro
<210> 160
<211> 446
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln Glu
1 5 10 15
Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His Gly
20 25 30
Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly
35 40 45
Ala Asn Thr Asp Gln Asp Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn Pro Ala Arg
50 55 60
Ala Val Trp Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu Gly Asp Pro
65 70 75 80
His Thr Glu Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg Arg Ser Asp
85 90 95
Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Ile Lys Trp Asn
100 105 110
Tyr Lys His His Arg Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu Thr His Arg
115 120 125
Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys Pro Gln Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Met
145 150 155 160
Ile Ser Trp Ile Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu Asp Pro Ser Thr Thr
165 170 175
Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly Thr
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Thr Thr Asn
195 200 205
Lys Thr Val His Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn Leu Thr Met
210 215 220
Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Val Leu Gly Asn Gly
225 230 235 240
Ser Ser Leu Ser Leu Pro Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys Ala
245 250 255
Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser Trp
260 265 270
Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val Leu
275 280 285
Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg Asp Glu Ala Glu Phe Thr Cys Arg
290 295 300
Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln Gln Val Tyr Leu Asn Val Ser Leu
305 310 315 320
Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly Val Val Gly Gly Ala
325 330 335
Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu Ser Phe Cys Val Ile Phe Val Val
340 345 350
Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala Arg Pro Ala Ala Gly Val Gly
355 360 365
Asp Thr Gly Ile Glu Asp Ala Asn Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser Gln
370 375 380
Gly Pro Leu Thr Glu Pro Trp Ala Glu Asp Ser Pro Pro Asp Gln Pro
385 390 395 400
Pro Pro Ala Ser Ala Arg Ser Ser Val Gly Glu Gly Glu Leu Gln Tyr
405 410 415
Ala Ser Leu Ser Phe Gln Met Val Lys Pro Trp Asp Ser Arg Gly Gln
420 425 430
Glu Ala Thr Asp Thr Glu Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Arg
435 440 445
<210> 161
<211> 280
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser
20 25 30
Thr Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln
35 40 45
Glu Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His
50 55 60
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu
65 70 75 80
Gly Ala Asn Thr Asp Gln Asp Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn Pro Ala
85 90 95
Arg Ala Val Trp Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu Gly Asp
100 105 110
Pro His Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg Arg Ser
115 120 125
Asp Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Ile Lys Trp
130 135 140
Asn Tyr Lys His His Arg Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Ala Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val Thr Gln Gly Val Val Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val
165 170 175
Phe Leu Ser Phe Cys Val Ile Phe Val Val Val Arg Ser Cys Arg Lys
180 185 190
Lys Ser Ala Arg Pro Ala Ala Gly Val Gly Asp Thr Gly Ile Glu Asp
195 200 205
Ala Asn Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser Gln Gly Pro Leu Thr Glu Pro
210 215 220
Trp Ala Glu Asp Ser Pro Pro Asp Gln Pro Pro Pro Ala Ser Ala Arg
225 230 235 240
Ser Ser Val Gly Glu Gly Glu Leu Gln Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Gln
245 250 255
Met Val Lys Pro Trp Asp Ser Arg Gly Gln Glu Ala Thr Asp Thr Glu
260 265 270
Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Arg
275 280
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<211> 265
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser
20 25 30
Thr Leu Thr His Arg Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser
35 40 45
Gly Cys Pro Gln Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln
50 55 60
Gly Thr Pro Pro Met Ile Ser Trp Ile Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu
65 70 75 80
Asp Pro Ser Thr Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro
85 90 95
Gln Asp His Gly Thr Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala
100 105 110
Ser Val Thr Thr Asn Lys Thr Val His Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro
115 120 125
Gln Asn Leu Thr Met Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Val Ala Thr
130 135 140
Ser Gly Val Thr Gln Gly Val Val Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Leu
145 150 155 160
Val Phe Leu Ser Phe Cys Val Ile Phe Val Val Val Arg Ser Cys Arg
165 170 175
Lys Lys Ser Ala Arg Pro Ala Ala Gly Val Gly Asp Thr Gly Ile Glu
180 185 190
Asp Ala Asn Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser Gln Gly Pro Leu Thr Glu
195 200 205
Pro Trp Ala Glu Asp Ser Pro Pro Asp Gln Pro Pro Pro Ala Ser Ala
210 215 220
Arg Ser Ser Val Gly Glu Gly Glu Leu Gln Tyr Ala Ser Leu Ser Phe
225 230 235 240
Gln Met Val Lys Pro Trp Asp Ser Arg Gly Gln Glu Ala Thr Asp Thr
245 250 255
Glu Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Arg
260 265
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<211> 246
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser
20 25 30
Thr Ser Thr Val Leu Gly Asn Gly Ser Ser Leu Ser Leu Pro Glu Gly
35 40 45
Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys Ala Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro
50 55 60
Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser Trp Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser
65 70 75 80
Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val Leu Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg
85 90 95
Asp Ala Ala Glu Phe Thr Cys Arg Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln
100 105 110
Gln Val Tyr Leu Asn Val Ser Leu Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val
115 120 125
Thr Gln Gly Val Val Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu
130 135 140
Ser Phe Cys Val Ile Phe Val Val Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser
145 150 155 160
Ala Arg Pro Ala Ala Gly Val Gly Asp Thr Gly Ile Glu Asp Ala Asn
165 170 175
Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser Gln Gly Pro Leu Thr Glu Pro Trp Ala
180 185 190
Glu Asp Ser Pro Pro Asp Gln Pro Pro Pro Ala Ser Ala Arg Ser Ser
195 200 205
Val Gly Glu Gly Glu Leu Gln Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Gln Met Val
210 215 220
Lys Pro Trp Asp Ser Arg Gly Gln Glu Ala Thr Asp Thr Glu Tyr Ser
225 230 235 240
Glu Ile Lys Ile His Arg
245
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<211> 575
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Gln Lys Ser Asn Arg Lys Asp Tyr Ser Leu Thr Met Gln Ser Ser Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Glu Gly Met Cys Val His Val Arg Cys Ser Phe Ser Tyr
20 25 30
Pro Val Asp Ser Gln Thr Asp Ser Asp Pro Val His Gly Tyr Trp Phe
35 40 45
Arg Ala Gly Asn Asp Ile Ser Trp Lys Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn
50 55 60
Pro Ala Trp Ala Val Gln Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu
65 70 75 80
Gly Asp Pro Gln Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg
85 90 95
Met Ser Asp Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Asn Ile
100 105 110
Lys Trp Asn Tyr Lys Tyr Asp Gln Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Leu Thr Val Thr Val Phe Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ser Thr Ala Leu
225 230 235 240
Gly Asn Ser Ser Ser Leu Ser Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu
245 250 255
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Arg Ser Leu Thr Leu Tyr Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Leu Val Leu
275 280 285
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290 295 300
Gln Asn Ser Leu Gly Ser Gln His Val Ser Leu Asn Leu Ser Leu Gln
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Thr Gly Lys Met Arg Pro Val Ser Gly Val Leu Leu Gly
325 330 335
Ala Val Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
340 345 350
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
355 360 365
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
370 375 380
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
385 390 395 400
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
405 410 415
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
420 425 430
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
435 440 445
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
450 455 460
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
465 470 475 480
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
485 490 495
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
500 505 510
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
515 520 525
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
530 535 540
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
545 550 555 560
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570 575
<210> 165
<211> 567
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln Glu
1 5 10 15
Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His Gly
20 25 30
Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly
35 40 45
Ala Asn Thr Asp Gln Asp Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn Pro Ala Arg
50 55 60
Ala Val Trp Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu Gly Asp Pro
65 70 75 80
His Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg Arg Ser Asp
85 90 95
Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Ile Lys Trp Asn
100 105 110
Tyr Lys His His Arg Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu Thr His Arg
115 120 125
Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys Pro Gln Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Met
145 150 155 160
Ile Ser Trp Ile Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu Asp Pro Ser Thr Thr
165 170 175
Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly Thr
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Thr Thr Asn
195 200 205
Lys Thr Val His Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn Leu Thr Met
210 215 220
Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Val Leu Gly Asn Gly
225 230 235 240
Ser Ser Leu Ser Leu Pro Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys Ala
245 250 255
Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser Trp
260 265 270
Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val Leu
275 280 285
Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg Asp Ala Ala Glu Phe Thr Cys Arg
290 295 300
Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln Gln Val Tyr Leu Asn Val Ser Leu
305 310 315 320
Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly Gly Gly Gly Ser Ser
325 330 335
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
355 360 365
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
370 375 380
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
385 390 395 400
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
405 410 415
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
420 425 430
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
435 440 445
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
450 455 460
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
465 470 475 480
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
485 490 495
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
500 505 510
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
515 520 525
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
530 535 540
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
545 550 555 560
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565
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<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 167
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
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210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 169
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330

Claims (16)

1.一种分离的抗体，该抗体结合人类Siglec-9多肽并且能够中和由人类NK细胞表达的Siglec-9多肽的抑制活性，其中该抗体选自下组，该组由以下组成：
(a)包含(i)含有SEQ ID NO:15的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQ IDNO:16的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的抗体；
(b)包含(i)含有SEQ ID NO:17的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQ IDNO:18的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的抗体；
(c)包含(i)含有SEQ ID NO:19的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQ IDNO:20的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的抗体；
(d)包含(i)含有SEQ ID NO:21的重链可变区的CDR 1、2和3的重链和(ii)含有SEQ IDNO:22的轻链可变区的CDR 1、2和3的轻链的抗体。
2.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体在标准4小时体外51Cr释放细胞毒性测定中增强和/或恢复NK细胞的细胞毒性，在该标准4小时体外51Cr释放细胞毒性测定中将表达Siglec-9的NK细胞从人类供体中纯化并且与表达Siglec-9的唾液酸配体的靶细胞一起孵育。
3.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体能够中和由人类moDC表达的Siglec-9多肽的抑制活性，该人类moDC在其表面具有参与与唾液酸发生顺式相互作用的Siglec-9多肽。
4.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体缺乏与CD16人类Fcγ受体结合的能力。
5.如权利要求4所述的抗体，其中该抗体缺乏与人类CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和CD64结合的能力。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中该抗体阻断人类Siglec-9多肽与其唾液酸配体之间的相互作用。
7.如权利要求6所述的抗体，其中该抗体(a)阻断人类Siglec-9多肽与Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb之间的相互作用，并且(b)阻断人类Siglec-9多肽与6'-唾液酸乳糖之间的相互作用。
8.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中该抗体与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的Siglec-9多肽结合并且与包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的Siglec-9多肽结合。
9.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中当将从人类供体纯化的表达Siglec的NK细胞与在靶细胞表面上具有Siglec的配体的人类靶细胞接触时，该抗体引起该NK细胞中的细胞毒性增加和/或与细胞毒性相关的标记的增加。
10.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中该抗体的特征在于与以下的结合降低：
-在残基N78、P79、A80、R81、A82和/或V83处具有突变；在残基N77、D96、H98和/或T99处具有突变和/或在残基W84、E85、E86和/或R88处具有突变的Siglec-9多肽；
-在残基S47、H48、G49、W50、I51、Y52、P53和/或G54处具有突变的Siglec-9多肽；
-在残基P55、H58、E122、G124、S125和/或K127处具有突变的Siglec-9多肽
-在残基K131和/或H132处具有突变的Siglec-9多肽；和/或
-在残基R63、A66、N67、T68、D69、Q70和/或D71处具有突变的Siglec-9多肽；
该降低的结合是相比于与SEQ ID NO:2的野生型Siglec-9多肽的结合而言的，其中氨基酸残基参考SEQ ID NO:2的Siglec-9多肽表示。
11.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中该抗体是具有Fc结构域的抗体，该Fc结构域被修饰以降低该Fc结构域与Fcγ受体之间的结合。
12.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述抗体是抗体片段。
13.一种药物组合物，该药物组合物包括根据权利要求1-5中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
14.一种核酸，该核酸编码如权利要求1至5中任一项所述的抗体的重链和轻链。
15.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞产生如权利要求1至5中任一项所述的抗体。
16.一种药物组合物在制备用于在对其有需要的患者中治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症为由ST3GAL1和/或ST3GAL6酶的表达表征的癌症，该药物组合物包括有效量的如权利要求1-5中任一项所述的抗体或如权利要求13所述的组合物。
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