CN108743595B - 一种nk细胞免疫检查点抑制剂及其制备方法 - Google Patents

一种nk细胞免疫检查点抑制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞免疫检查点抑制剂及其制备方法，其结构式如下：
Figure DDA0001690041760000011
本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂可通过反式相互作用与NK细胞表面的siglec‑7相互作用，阻碍siglec‑7与肿瘤细胞表面唾液酸的反式结合，从而在NK细胞与肿瘤细胞相互作用时释放NK细胞的杀伤活。

Description

一种NK细胞免疫检查点抑制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种NK细胞免疫检查点抑制剂及其制备方法。
背景技术
自然杀伤细胞(简称NK细胞)是人体中参与免疫反应的一类淋巴细胞，在人体免疫监视中占有重要地位，是机体识别自己和非己的关键效应细胞。作为先天免疫系统的一部分，NK细胞对异常细胞的反应很迅速，不同于B细胞和T细胞那样需要有一个免疫启动过程。NK细胞的这种固有性质对于保持机体对异常细胞的警戒状态非常重要。NK细胞主要通过识别细胞表面分子来确定自己和非己成分。一般情况下，正常机体细胞表面会表达第一类主要组织相容性复合体(MHC I)来抑制NK细胞的杀伤作用。但是，异常细胞例如很多种癌变细胞表面常常缺乏MHC I，但是其却能逃避NK细胞的免疫杀伤。研究发现，很多种癌变细胞表面唾液酸含量表达会异常增加，其通过与NK细胞表面的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-7(siglec-7)结合而抑制NK细胞的杀伤作用，逃避了正常的免疫监视过程，获得了免疫耐受。
唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-7(siglec-7)是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族的重要成员，其主要表达于人NK细胞，、单核细胞和部分CD8+T细胞表面。Siglec-7是I型跨膜蛋白，胞外区由一个能结合唾液酸的N端免疫球蛋白结构域V区和两个免疫球蛋白结构域C2区构成，经过一个跨膜区，胞内区由两个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)组成。因此siglec-7是一类抑制性受体，当其与相应的配体产生相互作用时，ITIM在Src激酶催化下发生磷酸化，进一步招募抑制性磷酸酶类SHP-1/2，向胞内传递抑制性信号。Siglec-7主要通过两种方式与相应的配体发生相互作用，第一种是顺式相互作用，NK细胞表面的siglec-7可以与NK细胞表面的唾液酸结构相结合，另一种是反式相互作用，NK细胞表面的siglec-7也可以与非NK细胞表面的配体相结合。
唾液酸作为siglec-7的配体，在很多癌细胞表面的大量表达，其通过反式相互作用与NK细胞表面的siglec-7结合，启动了NK细胞内部的抑制信号通路，抑制了NK细胞的免疫杀伤功能。因此，肿瘤细胞表面的唾液酸可以看作一类新型的免疫检查点，通过阻止肿瘤表面的唾液酸与NK细胞表面的siglec-7的结合就能增强NK细胞对肿瘤细胞的监视，并释放NK细胞的杀伤功能，清除肿瘤。目前已有报道siglec-7抗体可有效促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。但是采用抗体治疗技术门槛较高，成本昂贵，不能使大部分癌症患者受益，如何研发出高效而低廉的siglec-7小分子抑制剂一直是人们所关注的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NK细胞免疫检查点抑制剂。
本发明的另一目的在于提供上述NK细胞免疫检查点抑制剂的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种NK细胞免疫检查点抑制剂，其结构式如下：
Figure BDA0001690041740000021
上述NK细胞免疫检查点抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)氮气保护下，将第一化合物与3-氯-1-丙醇溶于含有分子筛的无水DCM和乙腈邓亮混合的混合溶剂中，室温下搅拌30min后加入N-碘代丁二酰亚胺，室温下继续搅拌25～35min，反应用-40～-35℃的冷却仪冷却，然后缓慢加入TfOH，2.5～3.5h后用DCM稀释反应混合液，用18～22％Na2S2O3和水清洗，然后对所得有机相进行干燥浓缩，过柱分离后旋蒸得到第二化合物；上述第一化合物的结构式为：
Figure BDA0001690041740000022
(2)将第二化合物和NaN3溶于DMF中，在氮气保护下于75～82℃回流10～12h，真空浓缩后用DCM稀释，然后用水清洗，硫酸钠干燥，过滤浓缩得到第三化合物；
(3)将第三化合物和4-乙炔联苯溶于19mL叔丁醇中，加入2.8mL DMF，再与溶有抗坏血酸钠和硫酸铜的水混合，然后搅拌15～20h，除去叔丁醇，加入DCM，用乙酸水溶液清洗，水相用DCM清洗，收集DCM相，用硫酸镁干燥，过滤浓缩后通过硅胶柱纯化，旋蒸得到第四化合物；
(4)将第四化合物溶于无水甲醇中，然后与新制备的甲醇钠混合至pH为9.8～10.2，用TLC检测反应进程，2.5～3.2h后终止反应，将物料通过陶氏化学离子交换树脂除去其中的金属离子，过滤浓缩，得到第五化合物；
(5)用DMF将第五化合物进行浓缩除去其中的水份，加入干燥的LiN3，将溶液置于冰水混合物上进行冷却。加入CBr4和三苯基膦，室温下反应15～18h后加入甲醇搅拌25～35min终止反应，再加入二氯甲烷，然后用100mL水对物料进行清洗，接着对水相采用DCM进行萃取，与原先的DCM溶液混合后进行浓缩，进行硅胶柱分离，旋蒸后得到第六化合物；
(6)将第六化合物、Pd/C与无水甲醇混合均匀，加入乙酰氯调节至Ph＝1～2；将混合物置于氢气气氛下搅拌反应，通过TLC监测至反应完全时，将反应物过滤以除去催化剂；蒸发除去溶剂，将残余物、EDC·HCl、HOBT、三乙胺、第八化合物与DMF混合均匀，于黑暗中搅拌45～50h；蒸发除去溶剂，残余物通过柱层析纯化，得到浅黄色固体；称取该浅黄色固体，将其溶于H2O中，与溶于DMF的5-叠氮荧光素混合，接着加入预先配制好的CuI/TTTA的DMF溶液，室温下搅拌1h，加入抗坏血酸钠，继续反应1.5～2.5h，并用TLC监测反应进程，之后离心过P-2柱，将产物冻干后重溶于水中，除去不溶杂质，然后再将上清液进行过C18柱，得到所述NK细胞免疫检查点抑制剂；上述第八化合物的结构式为：
Figure BDA0001690041740000031
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中，所述第一化合物、3-氯-1-丙醇、混合溶剂、N-碘代丁二酰亚胺和TfOH的比例为6～6.5mmol∶10～10.5mmol∶55～65mL∶6～6.5mmol∶0.8～0.9mmol。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中，所述第二化合物、NaN3和DMF的比例为1.1～1.2mmol∶9.1～9.2mmol∶12～16mL。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中，所述第三化合物、4-乙炔联苯、DMF、抗坏血酸钠和硫酸铜的比例为2～2.5mmol∶2～2.5mmol∶2.5～3mL∶1～1.2mmol∶1～1.2mmol，叔丁醇和水的体积比为18～20∶18～20；
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(5)中，所述第五化合物、LiN3、CBr4和三苯基膦的质量比为500∶200～220∶620～630∶290～300。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(6)中，所述第六化合物、Pd/C、无水乙醇、EDC·HCl、HOBT、三乙胺和第八化合物的比例为5.2～5.3g∶280～320mg∶80～110mL∶10～10.5mmol∶10～10.5mmol∶25～26mmol∶8.5～9mmol；所述浅黄色固体、5-叠氮荧光素、CuI和TTTA的质量比为4～4.5∶4～4.5∶0.4～0.6∶2～2.3。
本发明的有益效果是：本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂可通过反式相互作用与NK细胞表面的siglec-7相互作用，阻碍siglec-7与肿瘤细胞表面唾液酸的反式结合，从而在NK细胞与肿瘤细胞相互作用时释放NK细胞的杀伤活。
附图说明
图1为本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂对不同比例NK细胞杀伤活力的影响。
图2为本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂对NK细胞杀伤不同细胞活力的影响图。
图3为本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂在体内对NK细胞杀伤不同细胞活力的影响图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
(1)氮气保护下将第一化合物(3.01g，6.32mmol)与3-氯-1-丙醇(0.84g，10.1mmol)溶于含有分子筛的无水DCM和乙腈混合液(30∶30mL)中，室温下搅拌30min后加入N-碘代丁二酰亚胺(1.42g，6.32mmol)，室温下继续搅拌30min。反应用-40℃的冷却仪冷却，然后缓慢加入TfOH(0.07g，0.88mmol)，3h后用DCM稀释反应混合液，用20％Na2S2O3清洗两次，然后用水清洗三次，然后对有机相进行干燥浓缩，过柱分离(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)后旋蒸得到第二化合物(2.51g，70％)，上述第一化合物的结构式为：
Figure BDA0001690041740000041
(2)将第二化合物(0.65g，1.14mmol)和NaN3(0.595g，9.15mmol)溶于15mL DMF中，在氮气保护下于80℃回流12h，真空浓缩后用DCM稀释，然后用水清洗，硫酸钠干燥，过滤浓缩得到化合物第三化合物(0.65g，98％)。
(3)将第三化合物(1.26g，2.2mmol)和4-乙炔联苯(391mg，2.2mmol)溶于19mL叔丁醇中，加入2.8mL DMF，与溶有抗坏血酸钠(218mg，1.1mmol)和硫酸铜(175mg，1.1mmol)的19mL水混合。然后搅拌17h，除去叔丁醇，加入100mL DCM，用100mL 20％的乙酸清洗，水相用20mL DCM清洗，收集DCM相，用硫酸镁干燥，过滤浓缩后通过硅胶柱纯化(EtOAc∶EtOH＝10∶1)，旋蒸得到第四化合物(1.84g，99％)。
(4)将第四化合物(1.04g，1.39mmol)溶于20mL绝对无水甲醇中，然后与新制备的甲醇钠混合至pH约为10，用TLC检测反应进程，大约3h后终止反应，将溶液通过陶氏化学离子交换树脂(Dowex Monophere 650C H+)除去其中的金属离子，过滤浓缩，得到第五化合物(725mg，90％)。
(5)采用3mL DMF将第五化合物(500mg，0.855mmol)进行浓缩除去其中的水份，加入干燥的LiN3(209mg，4.27mmol)，将溶液置于冰水混合物(0℃)上进行冷却。加入CBr4(624mg)和三苯基膦(291mg，1.11mmol)，室温下反应17h后加入0.5mL甲醇搅拌30min终止反应。加入100mL二氯甲烷，然后用100mL水对溶液进行清洗，然后对水相采用50mL DCM进行萃取，与原先的DCM溶液混合后进行浓缩。接着进行硅胶柱分离(DCM∶EtOH＝30∶1)，旋蒸后得到第六化合物(410mg，79％)。
(6)将第六化合物(5.237g，8.6mmol)、Pd/C(300mg)与无水甲醇(100mL)混合均匀，加入乙酰氯调节至Ph≈1-2；将混合物置于H2气氛下搅拌。通过TLC监测至反应完全时(≈12h)，将反应物过滤以除去催化剂。蒸发除去溶剂，将残余物、EDC·HCl(2.0g，10.3mmol)、HOBT(1.4g，10.3mmol)、三乙胺(3.6mL，25.8mmol)、第八化合物(860mg，8.6mmol)与DMF(150mL)混合均匀。将混合物在黑暗中搅拌48h。蒸发除去溶剂，残余物通过柱层析(10∶1 CH2 Cl2∶MeOH)纯化，得到浅黄色固体产物(3.125g，4.8mmol，55％)。然后称取该浅黄色固体(4.3mg，6.6μmol)，将其溶于H2O(250μL)中，与溶于DMF(200μL)的5-叠氮荧光素(4.2mg，11.2μmol)混合。然后加入预先配置好的CuI/TTTA的DMF溶液(50μL DMF，0.5mg CuI，2.2mgTTTA)，室温下搅拌1h。加入50μL抗坏血酸钠(100mM)，继续反应2h，并用TLC监测反应进程，之后离心过柱(P-2柱，0.625×42.5cm)，将产物冻干后重溶于水中，除去不溶杂质，然后再将上清液进行过柱(C18柱，50％MeOH in H2O)，得到所述NK细胞免疫检查点抑制剂(5.138mg，4.95μmol，75％)，结构式如下：
Figure BDA0001690041740000061
上述第八化合物的结构式为：
Figure BDA0001690041740000062
实施例2
1.1细胞培养
NK细胞的分离和培养：抽取健康人体外周血，采用密度梯度离心对细胞进行初分离，然后采用NK细胞提取试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)对NK细胞进行进一步分离。采用流式细胞仪进行细胞分选，表型为NKp46+，CD3-，CD56+的细胞即为所需的NK细胞。分离后的细胞在IMDM培养基(含10％人血清，1％非必须氨基酸，1％丙酮酸钠)中悬浮培养，细胞密度约2×106个/mL。在进行其它实验前，需要将NK细胞在100IU/mL的白细胞介素-2中培养24h。
K562细胞的培养：采用IMDM培养基(含10％胎牛血清)于二氧化碳恒温培养箱(37℃、5％CO2)对K562进行悬浮培养，细胞浓度约为1×105个/mL，2-3天后进行细胞传代并更换新鲜培养基。
Me11106细胞的培养：采用IMDM培养基(含10％胎牛血清)于二氧化碳恒温培养箱(37℃、5％CO2)对Me11106细胞进行贴壁培养，每2-3天采用胰酶消化后传代。
1.2本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂诱导NK细胞杀伤作用
1.2.1本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂对不同比例NK细胞杀伤活力的影响
为了探究本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂对NK细胞(效应细胞)杀伤Mel1106细胞(靶细胞)的影响。取对数生长期的Mel1106细胞，经胰酶消化后调整细胞浓度为5×104个细胞/mL，接种于96孔板中，然后按照效应细胞数对靶细胞数比例(E∶T比)为2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1加入经IL-2激活的NK细胞，设置三组实验，一组作为空白对照，一组加入天然唾液酸，一组加入本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂溶液(0.3mM)。于37℃、5％CO2的二氧化碳恒温培养箱中恒温培养4h，然后加入15μl的CCK-8试剂，置于培养箱内继续孵育2h，然后用酶标仪检测450nm波长的OD值。每组设置3个对照孔，计算平均特异杀伤率。
从图1可以看出，相比于空白，天然唾液酸(nature-sia)对NK细胞杀伤Mel1106细胞无明显变化。加入本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂(compound 1)后NK细胞对Mel1106细胞的杀伤活性明显增加，而且，随着效应细胞与靶细胞比例(E∶T ratio)的增加，NK细胞对Mel1106的细胞毒性逐渐增大。这可能是因为本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂可以阻断靶细胞表面唾液酸和NK细胞表面siglec-7的相互作用，从而释放了NK细胞的杀伤活性。这对于体内激活NK细胞的免疫监视功能，清除癌变细胞具有重要意义。
1.2.2本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂对NK细胞杀伤不同细胞活力的影响
为了探究本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂对NK细胞(效应细胞)杀伤不同靶细胞如K562细胞、Hela细胞及721.221细胞的影响。收集细胞并调整细胞浓度为5×104个细胞/mL，接种于96孔板中，然后按照效应细胞数对靶细胞数比例(E/T)为20∶1加入经IL-2激活的NK细胞，设置三组实验，一组作为空白对照，一组加入天然唾液酸，一组加入本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂溶液(0.3mM)。于37℃、5％CO2的二氧化碳恒温培养箱中恒温培养4h，然后加入15μl的CCK-8试剂，置于培养箱内继续孵育2h，然后用酶标仪检测450nm波长的OD值。每组设置3个对照孔，计算平均杀伤率。
K562细胞是一种人类髓性白血病细胞，其细胞表面唾液酸含量高表达；Hela细胞是人宫颈癌细胞，其细胞表面唾液酸含量高表达；721.221细胞是一种白血病细胞株，其表面唾液酸含量低表达。从图2可以看出，NK细胞对唾液酸高表达的癌细胞株的细胞毒性杀伤活力较低，加入天然唾液酸后对NK细胞的杀伤活力无明显影响。这是由于唾液酸含量高表达的癌细胞株可以通过与NK细胞表面的siglec-7相结合而抑制NK细胞的杀伤活性。而加入本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂后，由于其可以阻碍癌细胞表面唾液酸和NK细胞表面siglec-7的反式相互作用，因而释放了NK细胞的杀伤活性，从而可以有效的提升NK细胞对唾液酸高表达的癌细胞株的特异杀伤活力。
1.2.3体内本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂对NK细胞杀伤不同细胞活力的影响
采用50μg聚肌胞苷酸对重组人NK细胞的huNSG小鼠进行预处理12h。对K562细胞和Hela细胞用5μM的绿色荧光染料CFSE进行荧光标记。之后采用腹腔注射将1×106个细胞注入huNSG小鼠体内。然后采用尾静脉注射抑制剂溶液，分成三个实验组，第一组为空白对照，第二组为天然唾液酸(0.3mM)，第三组为本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂溶液。12h后采用腹腔灌洗收集细胞，离心清洗后采用流式检测荧光强度，用空白对照作参照计算体内细胞毒性。
从图3可以看出，相比于空白组，加入天然唾液酸对两种唾液酸高表达的细胞株存活率均无影响，这可能是因为这两种细胞株表面的唾液酸可以与小鼠体内的NK细胞表面siglec-7结合，从而抑制了NK细胞对其的杀伤。而游离唾液酸不能有效抑制这一过程，反而因肿瘤细胞对唾液酸糖的代谢而增加了其表面唾液酸含量，从而进一步抑制了NK细胞对其的杀伤活性。对于使用本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂的实验组，由于其可以妨碍肿瘤细胞表面唾液酸与NK细胞表面siglec-7的结合，因而其能增强体内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活力。与空白对照相比，使用本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂后K562细胞的存活率下降了约30％，Hela细胞的存活率下降了约40％，结果显示本发明的NK细胞免疫检查点抑制剂可以有效的激活体内NK细胞识别异质细胞的能力，增强其免疫监视作用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (6)

1.一种NK细胞免疫检查点抑制剂，其特征在于：其结构式如下：
Figure FDA0002637972450000011
其制备方法包括如下步骤：
(1)氮气保护下，将第一化合物与3-氯-1-丙醇溶于含有分子筛的无水DCM和乙腈等量混合的混合溶剂中，室温下搅拌30min后加入N-碘代丁二酰亚胺，室温下继续搅拌25～35min，反应用-40～-35℃的冷却仪冷却，然后缓慢加入TfOH，2.5～3.5h后用DCM稀释反应混合液，用18～22％Na2S2O3和水清洗，然后对所得有机相进行干燥浓缩，过柱分离后旋蒸得到第二化合物；上述第一化合物的结构式为：
Figure FDA0002637972450000012
(2)将第二化合物和NaN3溶于DMF中，在氮气保护下于75～82℃回流10～12h，真空浓缩后用DCM稀释，然后用水清洗，硫酸钠干燥，过滤浓缩得到第三化合物；
(3)将第三化合物和4-乙炔联苯溶于19mL叔丁醇中，加入2.8mL DMF，再与溶有抗坏血酸钠和硫酸铜的水混合，然后搅拌15～20h，除去叔丁醇，加入DCM，用乙酸水溶液清洗，水相用DCM清洗，收集DCM相，用硫酸镁干燥，过滤浓缩后通过硅胶柱纯化，旋蒸得到第四化合物；
(4)将第四化合物溶于无水甲醇中，然后与新制备的甲醇钠混合至pH为9.8～10.2，用TLC检测反应进程，2.5～3.2h后终止反应，将物料通过陶氏化学离子交换树脂除去其中的金属离子，过滤浓缩，得到第五化合物；
(5)用DMF将第五化合物进行浓缩除去其中的水份，加入干燥的LiN3，将溶液置于冰水混合物上进行冷却，加入CBr4和三苯基膦，室温下反应15～18h后加入甲醇搅拌25～35min终止反应，再加入二氯甲烷，然后用100mL水对物料进行清洗，接着对水相采用DCM进行萃取，与原先的DCM溶液混合后进行浓缩，进行硅胶柱分离，旋蒸后得到第六化合物；
(6)将第六化合物、Pd/C与无水甲醇混合均匀，加入乙酰氯调节至pH＝1～2；将混合物置于氢气气氛下搅拌反应，通过TLC监测至反应完全时，将反应物过滤以除去催化剂；蒸发除去溶剂，将残余物、EDC·HCl、HOBT、三乙胺、第八化合物与DMF混合均匀，于黑暗中搅拌45～50h；蒸发除去溶剂，残余物通过柱层析纯化，得到浅黄色固体；称取该浅黄色固体，将其溶于H2O中，与溶于DMF的5-叠氮荧光素混合，接着加入预先配制好的CuI/TTTA的DMF溶液，室温下搅拌1h，加入抗坏血酸钠，继续反应1.5～2.5h，并用TLC监测反应进程，之后离心过P-2柱，将产物冻干后重溶于水中，除去不溶杂质，然后再将上清液进行过C18柱，得到所述NK细胞免疫检查点抑制剂；上述第八化合物的结构式为：
Figure FDA0002637972450000021
2.如权利要求1所述的一种NK细胞免疫检查点抑制剂，其特征在于：所述步骤(1)中，所述第一化合物、3-氯-1-丙醇、混合溶剂、N-碘代丁二酰亚胺和TfOH的比例为6～6.5mmol∶10～10.5mmol∶55～65mL∶6～6.5mmol∶0.8～0.9mmol。
3.如权利要求1所述的一种NK细胞免疫检查点抑制剂，其特征在于：所述步骤(2)中，所述第二化合物、NaN3和DMF的比例为1.1～1.2mmol∶9.1～9.2mmol∶12～16mL。
4.如权利要求1所述的一种NK细胞免疫检查点抑制剂，其特征在于：所述步骤(3)中，所述第三化合物、4-乙炔联苯、DMF、抗坏血酸钠和硫酸铜的比例为2～2.5mmol∶2～2.5mmol∶2.5～3mL∶1～1.2mmol∶1～1.2mmol，叔丁醇和水的体积比为18～20∶18～20。
5.如权利要求1所述的一种NK细胞免疫检查点抑制剂，其特征在于：所述步骤(5)中，所述第五化合物、LiN3、CBr4和三苯基膦的质量比为500∶200～220∶620～630∶290～300。
6.如权利要求1所述的一种NK细胞免疫检查点抑制剂，其特征在于：所述步骤(6)中，所述第六化合物、Pd/C、无水乙醇、EDC·HCl、HOBT、三乙胺和第八化合物的比例为5.2～5.3g∶280～320mg∶80～110mL∶10～10.5mmol∶10～10.5mmol∶25～26mmol∶8.5～9mmol；所述浅黄色固体、5-叠氮荧光素、CuI和TTTA的质量比为4～4.5∶4～4.5∶0.4～0.6∶2～2.3。
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