CN108047282B - 一种唾液酸衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种唾液酸衍生物及其制备方法和应用，其中唾液酸衍生物为一种小分子抗肿瘤化合物(TCC‑Neu5Gc)，可以利用其特异的、广谱的性质对肿瘤进行杀伤。TCC‑Neu5Gc靶向体内的肿瘤，经过代谢生长在肿瘤细胞的表面，形成TCC‑Neu5Gc配体。肿瘤附近的巨噬细胞识别后，将其吞噬，同时释放出肿瘤碎片并呈递给其它免疫细胞，引发抗肿瘤免疫反应。本发明提供的唾液酸衍生物对多种肿瘤均有效，对肿瘤转移也有抑制效果。此外，本发明提供的唾液酸衍生物不仅可以注射，还可以通过口服发挥作用，其细胞毒性和动物毒性均很低，因此具有很高的药用价值和广阔的应用前景。

Description

一种唾液酸衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，特别涉及一种唾液酸衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

唾液酸为N-乙酰神经胺酸或任何其酯或其醇羟基的衍生物，位于细胞膜糖蛋白侧链末端，是细胞膜表面受体的重要组成部分，在发生各种炎症性疾病及恶性肿瘤病时其数量和浓度会增高，如肺癌、胃癌、肠癌、肝癌、卵巢癌等疾病中。

传统治疗癌症的方式包括手术、放疗和化疗，但这些方式均无法有效消灭癌症。进入21世纪以后，随着肿瘤学和免疫学的深入发展，肿瘤免疫疗法作为最新最先进的疗法应运而生。

肿瘤免疫治疗是指应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。肿瘤免疫治疗近来备受关注，是肿瘤治疗领域的焦点。

近几年，肿瘤免疫治疗的好消息不断，目前已在一些肿瘤类型如黑色素瘤，非小细胞肺癌等的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，并已有肿瘤免疫治疗药物获得美国FDA(Food and Drug Administration,FDA)批准临床应用。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。肿瘤免疫治疗有望成为继手术，化疗，放疗，靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。

目前针对肿瘤免疫治疗的关注焦点主要集中在免疫检查点抑制剂的研发，主要针对三个作用靶点，包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lympHocyte-associatedantigen-4，CTLA-4)、程序性死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)和程序性死亡配体1(programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)。在肿瘤的免疫治疗中，巨噬细胞发挥着重要作用，其可以直接吞噬肿瘤细胞，而且还可以将肿瘤细胞消化后会呈递肿瘤特异抗原给其它免疫细胞，如NK细胞、细胞毒性T细胞等，并释放免疫激活因子。这样，肿瘤部位会进一步吸引极具攻击性的NK细胞和细胞毒性T细胞，从而达到抑制肿瘤生长的目的。

在巨噬细胞表面有一类特殊的生物标志物，即唾液酸结合免疫球蛋白凝集素1(Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins，SIGLEC-1)，其又称CD169或Sialoadhesin。CD169+巨噬细胞通过该受体与其它细胞表面的配体识别并结合，完成细胞间的“交流”，在抗原呈递、调节淋巴细胞增殖、诱导炎症反应和免疫耐受中发挥重要作用。

SIGLEC-1具有特异结合唾液酸的能力，但是对唾液酸的亲和力不高，因此在肿瘤免疫反应中CD169+巨噬细胞难以发挥抗肿瘤功能，如何提高CD169对唾液酸的亲和力，激发CD169+巨噬细胞的肿瘤杀伤功能是人们一直关注的问题。

发明内容

为解决以上背景技术中提到的问题，本发明提供一种唾液酸衍生物，其化学式为：

进一步地，包括以下制备步骤：

S100、制备^TosSia methyl ester；

S200、将S100制备的^TosSia methyl ester与叠氮化钠加入到DMF中制得^N3Siamethyl ester；

S300、制备化合物C4包括S310-S340：

S310、将S200制得的^N3Sia methyl ester与Pd/C催化剂和无水甲醇混合，并加入乙酰氯调节至PH为1-2，得到混合物M4后，在H₂气氛下搅拌；

S320、将S310中搅拌后的物质通过TLC监测至反应完全时，进行过滤以除去Pd/C催化剂，得到混合物M5；

S330、将混合物M5去除溶剂后的残留物R3与EDC·HCl、HOBT、三乙胺、TCC-COOH以及DMF混合后，得到混合物M6；

S340、将混合物M6在黑暗中搅拌48小时后，将蒸发除去溶剂后的残余物R4通过柱层析纯化，得到浅黄色固体，即制得化合物C4；

S400、制备唾液酸衍生物包括S410-S420：

S410、将S300制备的化合物C4和甲醇、NaOH水溶液混合，并在室温下搅拌一定时间，然后用HCl水溶液调节至pH为7，得到混合物M7；

S420、将混合物M7完全除去溶剂后的残余物R5通过柱层析纯化，得到浅黄色固体，即制得唾液酸衍生物。

进一步地，S100制备^TosSia methyl ester的方法包括如下所述：

S110、将唾液酸、三氟乙酸与无水甲醇混合，并在室温下搅拌至澄清后，蒸发除去溶剂，得到白色固体；

S120、将S110制得的白色固体与P₂O₅在真空中干燥过夜，并与无水吡啶共蒸发两次以除去痕量的水，然后溶于无水吡啶中，得到混合物M1

S130、将混合物M1冷却至0℃后，加入对甲苯磺酰氯，并加热至室温，搅拌一定时间后得到混合物体M2；

S140、将混合物M2采用减压加热除去溶剂得到残留物R1；

S150、将残留物R1通过柱层析纯化，得到白色固体，即制得^TosSia methyl ester。

进一步地，S200中，将S100制备的^TosSia methyl ester和叠氮化钠加入到DMF中，并加热至80℃一段时间后，得到混合物M3；

将混合物M3完全去除溶剂后得到的残留物R2通过柱层析，得到浅黄色固体，即制得^N3Sia methyl ester。

进一步地，所述^TosSia methyl ester的化学式为：

进一步地，所述^N3Sia methyl ester的化学式为：

进一步地，所述化合物C4的化学式为：

一种如上任意所述的唾液酸衍生物在制备治疗肿瘤药物方面的应用。

本发明提供的一种唾液酸衍生物及其制备和应用，其中唾液酸衍生物为这种化合物为N-乙酰神经氨酸单糖的9位取代基衍生物(TCC-Neu5Gc)，这种化合物应用在抗肿瘤中发现其具有良好的抑制肿瘤生长的效果。

其作用机理如下：该化合物进入体内后，由于肿瘤存在Warburg效应而富集在肿瘤部位，其被肿瘤细胞摄取后在细胞内一系列酶的催化代谢及转运下在细胞膜表面表达。由于该化合物对CD169具有很高的亲和力，因此表达该化合物的肿瘤细胞会吸引CD169+巨噬细胞，并触发巨噬细胞的吞噬功能，而且，巨噬细胞作为抗原呈递细胞，在将吞噬的肿瘤细胞消化后会呈递肿瘤抗原给其它免疫细胞，尤其是细胞毒性T细胞。这样，肿瘤部位会进一步吸引极具攻击性的细胞毒性T细胞，从而达到抑制肿瘤生长的目的。TCC-Neu5Gc作为免疫调节剂，不仅可以直接注射发挥作用，而且通过口服方式也可以激活机体免疫系统，因此具有很高的药用价值和广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的TCC-Neu5Gc的细胞毒性测试效果图；

图2为化合物TCC-Neu5Gc在体外诱导CD169+巨噬细胞吞噬杀伤肿瘤细胞的效果图；

图3为尾静脉注射化合物TCC-Neu5Gc的体内抗肿瘤效果；

图4为口服化合物TCC-Neu5Gc的体内抗肿瘤效果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的唾液酸衍生物的化学式为：

本发明提供的唾液酸衍生物为N-乙酰神经氨酸单糖的9位取代基衍生物(TCC-Neu5Gc)，其具体的合成路线如下所示：

具体本发明提供的具体合成方法实施例如下：

一、制备^TosSia methyl ester(2)：将唾液酸(1)(15.0g，50mmol)、三氟乙酸(1ml)与无水甲醇(300ml)混合，将混合物在室温下搅拌至澄清。蒸发除去溶剂，得到唾液酸甲酯，为白色固体，无需进一步纯化；

将固体与P₂O₅在真空干燥过夜，并与无水吡啶共蒸发两次以除去痕量的水，然后溶于无水吡啶(200ml)中；

将溶液冷却至0℃，加入对甲苯磺酰氯(10.0g，53mmol)，将混合物加热至室温并搅拌过夜；

减压加热除去溶剂，将残余物通过柱层析(20:1EtOAc:MeOH)纯化，得到白色固体的化合物2(18.0g，38mmol)，即为^TosSia methyl ester，其产率为76％。

二、制备^N3Sia methyl ester(3)：叠氮化钠(8.0g)，化合物2(14.0g，30mmol)加入DMF(150ml)中。将溶液加热至80℃过夜。完全除去溶剂，残余物通过柱层析(20:1EtOAc:MeOH)纯化，得到化合物3，即为^N3Sia methyl ester，为浅黄色固体(8.5g，25mmol，产率为83％)。

三、制备化合物C4，将化合物3(^N3Sia methyl ester)(3.0g，8.6mmol)、Pd/C(300mg)与无水甲醇(100ml)混合均匀，加入乙酰氯调节至PH≈1-2；将混合物置于H₂气氛下搅拌；

通过TLC监测至反应完全时(≈12小时)，将反应物过滤以除去催化剂。蒸发除去溶剂，将残余物、EDC·HCl(2.0g，10.3mmol)、HOBT(1.4g，10.3mmol)、三乙胺(3.6ml，25.8mmol)、TCC-COOH(2.6g，8.6mmol)与DMF(150ml)混合均匀；

将混合物在黑暗中搅拌48小时；

蒸发除去溶剂，残余物通过柱层析(10:1CH₂Cl₂:MeOH)纯化，得到化合物4，为浅黄色固体(2.91g,4.8mmol,产率为55％)。

四、制备终产物TCC-Neu5Gc：将化合物4(606mg，1mmol)、甲醇(5ml)和2M NaOH水溶液(5ml)混合均匀；

将溶液在室温下搅拌20分钟，然后用HCl水溶液(2M)调节至pH＝7；

完全除去溶剂，残余物通过柱层析(2:1CH₂Cl₂:MeOH)纯化，得到化合物5(即终产物TCC-Neu5Gc)，为浅黄色固体(326mg,0.55mmol,产率为55％)。

将以上制备的TCC-Neu5Gc进行以下实验，以证明其在抗肿瘤的显著效果。

一、化合物TCC-Neu5Gc的细胞毒性

将小鼠源黑色素瘤细胞(B16F10)在含有5％二氧化碳的37℃无菌恒温培养箱中培养，所用培养基为含有10％胎牛血清的DMEM。将细胞传代48孔板上，待细胞贴壁后将原有培养基移除，加入含不同浓度TCC-Neu5Gc的DMEM培养基，继续培养24小时，然后用MTT法进行细胞毒性检测。结果如图1所示。

从图1可以看出TCC-Neu5Gc对细胞基本无毒性，因此将其用于肿瘤治疗具有可行性。

二、化合物TCC-Neu5Gc在体外诱导CD169+巨噬细胞吞噬杀伤肿瘤细胞的效果

将小鼠源黑色素瘤细胞(B16F10)在含有5％二氧化碳的37℃无菌恒温培养箱中培养，所用培养基为含有10％胎牛血清的DMEM。将细胞传代48孔板上，待细胞贴壁后将原有培养基移除，加入含100微摩尔(100μM)浓度的TCC-Neu5Gc的培养基，继续培养24小时。然后使用0.125％的EDTA溶液将B16F10细胞消化并用含10％胎牛血清的DMEM培养基将细胞吹打下来形成细胞悬液。调节细胞悬液的浓度为1×10⁵个/mL，取出100μL与小鼠单核巨噬细胞Raw264.7按1:5的数量比加入到96孔板中在37℃培养箱中继续孵育24小时。之后采用荧光显微镜对GFP标记的B16F10的数量进行活细胞计数。结果如图2所示。

从图2中可以看出，喂食TCC-Neu5Gc可以进一步增加巨噬细胞吞噬杀伤肿瘤细胞的效率。这是由于喂食与CD169亲和力更强的唾液酸衍生物TCC-Neu5Gc后，会增加CD169+巨噬细胞与肿瘤细胞的黏附，从而进一步增加了对肿瘤细胞的杀伤效果。这一实验结果同时也可证明肿瘤细胞可以将TCC-Neu5Gc代谢呈递到细胞膜表面而发挥抗肿瘤作用。

三、尾静脉注射化合物TCC-Neu5Gc的体内抗肿瘤效果

将B16F10细胞正常培养在10厘米细胞培养皿中，培养至80％的密度。用2毫升胰酶消化90秒，加入2毫升培养基终止消化并吹打成单细胞悬液，1000rpm离心3分钟，用PBS重复润洗离心一次，去除残留的培养基，加入PBS重悬，计数。

将100万个制备好的细胞注入B6品系小鼠(C57BL/6)皮下，进行肿瘤种植。之后每隔两天，从小鼠尾静脉注射含有100微摩尔浓度TCC-Neu5Gc的PBS溶液100微升，作为实验组。对照组注射同体积的PBS，含有100微摩尔的天然唾液酸，其余条件与实验组一致。

15天后将小鼠杀死并从中取出，对肿瘤进行拍照并测量肿瘤大小进行数据分析，结果如图3所示。从图3中可以明显的看出，注射有TCC-Neu5Gc的患肿瘤小鼠的肿瘤大小明显小于注射同体积的PBS，含有100微摩尔的天然唾液酸(不含TCC-Neu5Gc)的患肿瘤小鼠的肿瘤大小。因此，可以看出，通过注射TCC-Neu5Gc可以产生明显的抗肿瘤效果。

四、口服化合物TCC-Neu5Gc的体内抗肿瘤效果

将B16F10细胞正常培养在10厘米细胞培养皿中，培养至80％的密度。用2毫升胰酶消化90秒，加入2毫升培养基终止消化并吹打成单细胞悬液，1000rpm离心3分钟，用PBS重复润洗离心一次，去除残留的培养基，加入PBS重悬，计数。将100万个制备好的细胞注入B6品系小鼠(C57BL/6)皮下，进行肿瘤种植。

之后每天灌喂含有本发明100微摩尔浓度的水溶液200微升，作为实验组2。对照组2灌喂同体积含有天然唾液酸的水溶液。

15天后，将小鼠肿瘤取出并测量肿瘤大小，结果如图4所示。从图4中可以明显的看出，通过口服有TCC-Neu5Gc的患肿瘤小鼠的肿瘤大小明显小于口服同体积的PBS、含有100微摩尔的天然唾液酸(不含TCC-Neu5Gc)的患肿瘤小鼠的肿瘤大小。因此，可以看出，通过口服TCC-Neu5Gc也可以产生明显的抗肿瘤效果。

本发明还提供一种如上任意所述的唾液酸衍生物TCC-Neu5Gc在制备治疗肿瘤药物方面的应用，具体地可将TCC-Neu5Gc制成液态药液、药片药物、胶囊药物或散剂等药物。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种唾液酸衍生物的制备方法，其特征在于，化学式为：

包括以下制备步骤：

S100、制备^TosSia methyl ester；

S200、将S100制备的^TosSia methyl ester与叠氮化钠加入到DMF中制得^N3Sia methylester；

S300、制备化合物C4，包括S310-S340：

S310、将S200制得的^N3Sia methyl ester与Pd/C催化剂和无水甲醇混合，并加入乙酰氯调节至PH为1-2，得到混合物M4后，在H₂气氛下搅拌；

S320、将S310中搅拌后的物质通过TLC监测至反应完全时，进行过滤以除去Pd/C催化剂，得到混合物M5；

S330、将混合物M5去除溶剂后的残留物R3与EDC·HCl、HOBT、三乙胺、TCC-COOH以及DMF混合后，得到混合物M6；

S340、将混合物M6在黑暗中搅拌48小时后，将蒸发除去溶剂后的残余物R4通过柱层析纯化，得到浅黄色固体，即制得化合物C4；

S400、制备唾液酸衍生物，包括S410-S420：

S410、将S300制备的化合物C4和甲醇、NaOH水溶液混合，并在室温下搅拌一定时间，然后用HCl水溶液调节至pH为7，得到混合物M7；

S420、将混合物M7完全除去溶剂后的残余物R5通过柱层析纯化，得到浅黄色固体，即制得唾液酸衍生物。

2.根据权利要求1所述的唾液酸衍生物的制备方法，其特征在于，S100制备^TosSiamethyl ester的方法包括如下所述：

S110、将唾液酸、三氟乙酸与无水甲醇混合，并在室温下搅拌至澄清后，蒸发除去溶剂，得到白色固体；

S120、将S110制得的白色固体与P₂O₅在真空中干燥过夜，并与无水吡啶共蒸发两次以除去痕量的水，然后溶于无水吡啶中，得到混合物M1；

S130、将混合物M1冷却至0℃后，加入对甲苯磺酰氯，并加热至室温，搅拌一定时间后得到混合物体M2；

S140、将混合物M2采用减压加热的方法除去溶剂得到残留物R1；

S150、将残留物R1通过柱层析纯化，得到白色固体，即制得^TosSia methyl ester。

3.根据权利要求1所述的唾液酸衍生物的制备方法，其特征在于：S200中，将S100制备的^TosSia methyl ester和叠氮化钠加入到DMF中，并加热至80℃一段时间后，得到混合物M3；

将混合物M3完全去除溶剂后得到的残留物R2通过柱层析，得到浅黄色固体，即制得^N3Sia methyl ester。

4.根据权利要求1所述的唾液酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述^TosSia methylester的化学式为：

5.根据权利要求1所述的唾液酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述^N3Sia methylester的化学式为：

6.根据权利要求1所述的唾液酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述化合物C4的化学式为：

7.一种如权利要求1-6任一项所述方法制备得到的唾液酸衍生物在制备治疗肿瘤药物方面的应用。

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