CN1583710A

CN1583710A - β－（3，4－二羟基苯基）－α－羟基丙酸异丙酯及其合成方法

Info

Publication number: CN1583710A
Application number: CN 200410026205
Authority: CN
Inventors: 郑晓晖; 张延长; 王世祥; 赵新锋
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2004-06-03
Filing date: 2004-06-03
Publication date: 2005-02-23
Anticipated expiration: 2024-06-03
Also published as: CN100441563C

Abstract

本发明公开了丹参内真正起到治疗效果的有效成分及结构及其合成，并用于治疗心脑血管疾病。从丹参在人血清中的主要代谢产物中筛选出的β－(3，4－二羟基苯基)－α羟基丙酸异丙酯的结构为上式，其合成纯度达98.0％，研究结果证明该药物具有较强的扩张血管、抗脑缺血及体内外抗氧化、保护心、脑及治疗糖尿病所引起的缺血性心肌梗塞等生理作用。

Description

β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯及其合成方法

技术领域

本发明属于医药卫生领域，涉及一种药，具体说是涉及一种防治心脑血管疾病的新药β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯及其合成方法。

背景技术

丹参是一种疗效明确的治疗心脑血管疾病的中药复方制剂，而其中真正起到治疗效果的有效成分及结构一直未能明确。目前普遍认为丹参素是丹参中的有效成分，但是现有的文献只是从临床观察和动物实验的角度对其药理及功效进行了研究，而没能从分子水平予以表达，在药动学研究方面也仅仅给出了其血药浓度关系曲线及参数，而没能对主要代谢产物的结构、代谢机理及相应的临床功效进行探讨。

发明内容

本发明的目的在于，筛选和明确丹参中真正起到治疗效果的有效成分及结构，进行反合成，并将其用于对心脑血管疾病的预防和治疗。

实现上述目的的技术解决方案是，从丹参在人血清中的主要代谢产物中发现并筛选出具有治疗效果的β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯，设计了它的合成路线，并合成出了此化合物。

1)一种治疗心脑血管疾病的药物β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯，其结构为：

2)β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯是用于对心脑血管疾病的治疗。

其合成方法包括以下步骤：

1)血清中丹参的代谢产物先在预柱中被富集除杂，再被反冲入分析柱进行分离，流出物进入质谱，利用离子阱多级质谱技术对其结构进行初步确证；

2)再按合成路线合成此化合物，配成溶液进行质谱分析，进一步确证主要代谢产物的结构。

本发明合成出的β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯纯度可达98.0％，通过初步药理试验证明：它具有较强的扩张血管、抗脑缺血及体内外抗氧化作用，具有降低糖尿病不稳定性引起的心绞痛病人发病频率、降低心肌梗塞发病率、保护心、脑和减轻症状的效果。

附图说明

图1是柱切换流路图；

图2是合成路线图；

图3为正常大鼠小脑皮质结构，蒲青野细胞层正常；

图4、图5、图6分别为对照组、衰老组、实验组大鼠小脑皮质结构，其中蒲青野细胞层出现凋亡细胞，衰老组最显著。

具体实施方式

以下结合附图和药效学试验报告对本发明作进一步的详细说明。

血清中丹参的代谢产物按图1所示流路图，先在预柱中被富集除杂，然后被反冲入分析柱进行分离，流出物进入质谱，利用离子阱多级质谱技术对其结构进行初步确证，再按图2所示合成路线合成此两类化合物，配成溶液进行质谱分析，进一步确证主要代谢产物的结构。

β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯合成方法(见图3)。

(1)乙酰甘氨酸的合成：

称取氨基乙酸(甘氨酸)15克，于400毫升烧杯中，加入蒸馏水60毫升，搅拌微热溶解，冷却至室温，加入乙酸酐43克，冷却至室温后，放入冰箱过夜，抽滤得白色晶体。

(2)Azlactone的合成：

在已固定的烧瓶中，加入醋酸钠1.7g，加热至熔融状态微凉后，称取苯甲醛0.8g和乙酰甘氨酸1.2g加入瓶中，安装回流装置并通水，再加入醋酸酐25ml混和，安装干燥管，在100℃下搅拌反应3h，溶液由黄色变为棕色，冷却，放置，析出黄色针状结晶；

(3)β-(3，4-二乙酰氧基苯基)-α-乙酰氨基丙烯酸的合成：

在干燥的结晶中加入适量沸水100ml，反应4h，再加入适量活性炭脱色，煮沸0.5h，热过滤，除去活性炭，减压蒸馏除去水，加入适量无水乙醇溶解，抽滤，残渣为醋酸钠，收集滤液，减压蒸馏除去乙醇，得白色结晶为产品产率为61.67％。

(4)β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸的合成：

取结晶5.0g置于烧瓶中，加162mL水，18mL浓盐酸和10克Zn-Hg齐，加热沸腾反应，维持浴温使不断有氢气溢出，反应7H，热过滤，用7％NaHCO₃(AR)溶液调节pH为5，减压蒸馏至干，加入适量甲醇溶解，抽滤，滤液减压蒸馏至干，沸水溶解，活性炭脱色后，在减压蒸馏至干即得。

(5)β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯的合成：

在烧瓶中加入β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸0.76g，苯20ml，对甲苯磺酸0.1g和异丙醇3ml，连接回流冷凝管和分水器，加热回流(66.5摄氏度，6小时)到不再有水份蒸出为止，减压蒸馏除去苯和异丙醇，加入碳酸氢钠调节pH为中性，加入乙酸乙酯反复萃取(5×20ml)，减压蒸馏除去乙酸乙酯得结晶。

药效学试验

1.对D-半乳糖致衰大鼠小脑的作用

1.1实验分组：

纯系健康6月龄Wistar大鼠48只，雌雄各半，体重400g±10g，雌性300g±10g。自然条件下饲养，饮水、摄食任意。随机分成3，每组雌雄各半，①衰老模型组：每天腹腔注射D-半乳糖50mg/kg；②实验组：每天腹腔注射D-半乳糖50mg/kg的同时，腹腔注射β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯4mg/L；③空白对照组：每天腹腔注射等量0.85％生理盐水。各组大鼠在连续注射8周后处死。

1.2实验方法

1.2.1总SOD测定：

3组大鼠每组随机各取8只，雌雄各半。用1％戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉后，取出小脑，立即加入组织块重量9倍的冷0.85％生理盐水，制成10％小脑组织匀浆，然后3000～4000r/min离心15min，取适量上清液测SOD活力。按公式计算出各组大鼠小脑SOD活力，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，统计结果用方差分析。

1.2.2甲基绿哌洛宁染色：

①取材与制片：

3组大鼠每组随机各取8只，雌雄各半。1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉下，按图谱取小脑蚓部(VIII、IX区)组织，组织块厚度为1.5～2mm，立即置于Carnoy固定液中，4℃固定4h，然后直接转入95％乙醇和无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚4μm。

②甲基绿纯化：

新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理，以去除甲基紫。方法是将2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，加入氯仿20ml充分混匀，使其内的甲基紫溶于氯仿中而呈现紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉带紫红色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，如此反复更换氯仿，直到无紫红色为止。该液作为贮存液，4℃保存。

③染液配制(临用前配制，滤纸过滤)：

2％甲基绿贮存液5ml，5％哌洛宁水溶液1ml，蒸馏水12ml，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.8)18ml。

④染色步骤：切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水，置染液中室温下染片15min，取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液，95％乙醇迅速分化，100％乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.3实验结果

光学显微镜下凋亡细胞的体积变小，细胞核固缩，甲基绿使细胞核DNA特异性着色呈绿或绿蓝色；细胞凋亡时常伴有蛋白质合成增加，哌洛宁使胞浆RNA特异性着色呈紫红色。观察时计算凋亡指数，即随机选择约10～20个视野，计数凋亡细胞的百分率。所有数据以均数±标准差(x±s)表示，统计结果用方差分析。

由于甲基绿和哌洛宁的特殊染色性质，可见正常的蒲青野细胞(图3)排列整齐、大小均一，细胞质染成淡粉红色，核呈淡绿色，核仁清晰；随着年龄的增加，可见有的蒲肯野细胞体积明显变小，细胞质呈紫红色，核固缩呈蓝绿色，是为凋亡细胞，其在对照组(图4)仅偶见，衰老组(图5)即明显增多，实验组(图6)介于二者之间。凋亡指数及SOD活力的具体结果见表1。

表1 β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯对D-半乳糖

致衰大鼠小脑SOD活力(NU·mg-1prot)、蒲肯野细胞凋亡指数的(％)影响

组别例数 SOD活力凋亡指数

衰老模型组 8 95.13±14.85 51.4±6.3

正常对照组 8 130.18±16.78^※※ 13.1±9.2^※※

实验组 8 112.45±9.83^※ 29.6±6.5^※※

^※P＜0.05，^※※P＜0.01

2.对离体大鼠缺氧/复氧心肌的保护作用

2.1实验分组

Wistar大鼠42只，体重250-280g，雌雄不限，随机分为6组，每组均为7只。①正常对照组(control group)：大鼠心脏离体后接在灌流装置上持续灌流75min。②单纯缺氧/复氧组(A/R group)：大鼠心脏离体后接在灌流装置上先预灌15min，然后停止灌流，保持心脏温度恒定在37℃，在无氧、无灌流液的条件下旷置40min，再恢复灌流20min。③复方丹参滴丸前保护组(Pre-DS group)及复方丹参滴丸后保护组(Post-DS group)：分别在预灌时和再灌时加入复方丹参滴丸，其它处理同单纯缺氧/复氧组。④实验前保护组(Pre-egroup)及实验后保护组(Post-e group)：分别在预灌时和再灌时加入β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯，其它处理同单纯缺氧/复氧组，实验时(3，4-二羟基)-苯基-α-羟基丙酸异丙酯溶解于灌流液中，浓度分别为4mg/L。

2.2实验方法

大鼠用0.6％戊巴比妥钠(45mg/kg体重)腹腔注射麻醉，同时腹腔注入0.2％肝素20mg/kg。动物麻醉后按常规开胸取心，心脏取出后立即放入盛有预冷灌流液的平皿内，用冷灌流液冲掉残留血液，并迅速移到Langendorff灌流装置上，灌流液为Krebs-Hanseleit磷酸缓冲液，灌流压为88kPa。灌流前用95％氧气和5％二氧化碳混合气体向灌流液中平衡15min，在灌流过程中以1个大气压将上述混合气体持续向储液瓶灌流液内补充。

①灌注结束时，取心脏左室立即用在液氮中预冷的金属夹板将心肌组织夹成冰冻薄片，迅速称取100mg心肌组织，加入预冷的0.42mol/L高氯酸制成匀浆，再加入1mol/L氢氧化钾中和，然后用超声波细胞粉碎器将线粒体膜打碎，使能量物质全部释放于溶液中(以上操作过程均在冰水中进行)。然后3000r/min离心15min，上清液用0.2μm微孔滤膜过滤，取10μL滤液上柱分析。

②每组随机取3只大鼠。于心脏灌流结束时，在心脏左室游离壁处取材，在冷的4％戊二醛-磷酸缓冲液中切成1mm×1mm×1mm的小块预固定，经脱水、包埋、超薄切片、染色后在H-600透射电镜下对心肌细胞超微结果进行观察。

2.3实验结果

2.3.1.A/R组心肌组织中的一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)及腺苷酸总量(AN)均明显低于control组(P＜0.01)。

2.3.2.Pre-e组及Post-e组大鼠心肌组织内的AMP、ADP、ATP、AN含量均高于A/R组(P＜0.01)，也相应高于Pre-DS、Post-DS组(P＜0.01)，两组心肌组织中的ATP含量均接近正常水平(P＞0.05)；

2.3.3.Pre-e组及Post-e组之间AMP、ADP、ATP、AN含量比较均无明显差异(P＞0.05)。见表2。

表2 实验各组心肌组织中高能磷酸化合物的含量比较

Group AMP ADP ATP AN

Control 36.30±15.31 38.75±15.10 43.62±10.71 118.68±12.02

A/R 3.56±1.29^△ 2.97±1.07^△ 12.47±3.76^△ 18.99±4.88^△

Pre-DS 8.77±2.40^△※ 9.21±0.49^△※ 42.07±8.13^※ 60.05±9.25^※

Post-DS 8.10±2.92^△※ 8.45±2.23^△※ 30.84±10.89^※ 47.39±10.24^※

Pre-e 12.58±2.05^△□ 13.62±1.48^△※□ 59.29±10.31^※□ 85.48±11.27^△※□

Post-e 11.89±1.53^△☆ 12.74±1.67^△※☆ 49.72±11.85^※☆ 74.34±13.86^△※☆

^△P＜0.01 vs control group； ^※P＜0.01 vs A/R group；

^□P＜0.01 vs Pre-DS group； ^☆P＜0.01 vs Post-DS group

3.对外源性自由基所致心律失常的影响

3.1实验分组：

健康Wistar大鼠，体重250～300g，雌雄不限，随机分组。用2％戊巴比妥钠(0.2ml/100g体重)和1％肝素钠(0.5ml/100g体重)同时腹腔注射。动物麻醉后，取仰卧位固定，开胸，在距主动脉起始部3～4mm处取下心脏，迅速放入预冷0℃灌流液中停跳，冲洗心腔和血管内的残留血液后，将心脏迅速移置到Langendorff灌流装置进行非循环不作功灌流，灌流压0.82kPa。灌流液为Krebs-Henseleit缓冲液，其组成为(mmol/L)：NaCl 118，KCl 4.7，MgSO₄·7H₂O 1.2，KH₂PO₄ 1.2，NaHCO₃ 25.0，CaCl₂ 22.5，Glucose 11.0，pH7.4，渗透压300mOsm/L。灌流前以95％O₂+5％CO₂混合气平衡15min，灌流中持续通气。在整个灌流过程中，用501型超级恒温水浴器使灌流液保持在37℃。

3.1.1对照组(7例)：离体心脏预灌15min后，灌流液中加入硫酸亚铁(0.25mmol/L)/抗坏血酸(1.0mmol/L)持续灌注30min，观察心电图变化。

3.1.2实验组(8例)：灌流液中以5mg/L浓度加入β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯预灌15min后，灌流液中加入硫酸亚铁(0.25mmol/L)/抗坏血酸(1.0mmol/L)持续灌注30min，观察心电图变化。

3.2实验结果：

以硫酸亚铁(0.25mmol/L)/抗坏血酸(1.0mmol/L)作为外源性自由基生成系统可导致离体灌流大鼠心脏发生心律失常，在灌流液中预先加入β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯可使外源性自由基生成系统所致的心律失常发生率明显降低(见表3)。

表3 丹参素对外源性自由基生成系统所致心律失常的作用

房室分离室性早搏室速室颤总心率失常

分组(mg/L) 例数

例数％例数％例数％例数％例数％

对照组 7 5 71.4 5 71.4 3 42.7 3 42.7 7 100

实验组

8 1 12.5 0 0 0 0 0 0 1^※※ 12.5

(5mg/L)

与自由基组相比 ^※P＜0.05 ^※※P＜0.01

Claims

1.一种预防和治疗心脑血管疾病的药物，其特征在于，从丹参在人血清中的主要代谢产物中筛选出β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯，其结构为：

2.一种预防和治疗心脑血管疾病药物β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯的合成方法，其特征在于，合成方法包括以下步骤：

2)再按合成路线合成此化合物，配成溶液进行质谱分析，进一步确证主要代谢产物的结构；

β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯的合成方法：

(1)乙酰甘氨酸的合成：

称取氨基乙酸即甘氨酸15克，于400毫升烧杯中，加入蒸馏水60毫升，搅拌微热溶解，冷却至室温，加入乙酸酐43克，冷却至室温后，放入冰箱过夜，抽滤得白色晶体；

(2)Azlactone的合成：

(3)β-(3，4-二乙酰氧基苯基)-α-乙酰氨基丙烯酸的合成：

在干燥的结晶中加入适量沸水100ml反应4h，再加入适量活性炭脱色，煮沸0.5h，热过滤，除去活性炭，减压蒸馏除去水，加入适量无水乙醇溶解，抽滤，残渣为醋酸钠，收集滤液，减压蒸馏除去乙醇，得白色结晶即为产品；

(4)β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸的合成：

取结晶5.0g置于烧瓶中，加162mL水，18mL浓盐酸和10克Zn-Hg齐，加热沸腾反应，维持浴温使不断有氢气溢出，反应7H，热过滤，用7％NaHCO₃(AR)溶液调节pH为5，减压蒸馏至干，加入适量甲醇溶解，抽滤，滤液减压蒸馏至干，沸水溶解，活性炭脱色后，在减压蒸馏至干即得；

(5)β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯的合成：

在烧瓶中加入β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸0.76g，苯20ml，对甲苯磺酸0.1g和异丙醇3ml，连接回流冷凝管和分水器，加热回流(66.5摄氏度，6小时)到不再有水份蒸出为止，减压蒸馏除去苯和异丙醇，加入碳酸氢钠调节pH为中性，加入乙酸乙酯反复萃取，减压蒸馏除去乙酸乙酯得结晶。

3.β-(3，4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯用于预防和治疗心脑血管疾病的药物用途。