CN102241665B - 4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-l-氨基酸苄酯及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了如通式3a-t所示的一类4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯化合物及其合成方法，还公开了它们对K562和U937肿瘤细胞株增殖的抑制作用、进一步公开了它们在移植性小鼠S180肉瘤模型上的抗肿瘤活性。因而本发明提供的4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-)苯甲酰氨基酸苄酯具有作为抗肿瘤剂的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一类4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯化合物，还涉及其合成方法，进一步涉及它们对K562和U937肿瘤细胞株增殖的抑制作用、在移植性小鼠S180肉瘤模型上的抗肿瘤活性和作为抗肿瘤剂的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，人类因恶性肿瘤而引起的死亡率是所有疾病死亡率的第二位，仅次于心脑血管疾病。肿瘤的治疗方法有手术治疗、放射治疗和药物治疗(化学治疗)。目前，化学治疗仍然是临床治疗肿瘤的主要手段。寻找抗肿瘤药物是新药研究的热点之一。在最近几年中，抗肿瘤药物开发已经从常规的细胞毒性化疗剂转移至更为基于机理的靶向阻止肿瘤生长的共同目标方案。肿瘤细胞的DNA是抗肿瘤药物最重要的作用靶点之一。作用于肿瘤细胞DNA的抗肿瘤药物既可以通过直接作用于DNA来破坏肿瘤细胞DNA的结构和功能，也可以通过与DNA相互作用抑制DNA的合成。药物嵌入DNA的沟区，是一种重要的抗肿瘤机制。发明人认识到，4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酸符合DNA嵌入剂的结构要求。于是，对4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酸进行结构改造，得到本发明的化合物。
发明内容
本发明的目的是对4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酸进行结构改造，提供一类4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯化合物。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一类4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯化合物，如通式3a-t所示结构：
其中，AA表示L-苏氨酸残基、L-组氨酸残基、L-色氨酸残基、甘氨酸残基、L-蛋氨酸残基、L-酪氨酸残基、L-谷氨酸残基、L-亮氨酸残基、L-丝氨酸残基、L-脯氨酸残基、L-苯丙氨酸残基、L-天冬氨酸残基、L-异亮氨酸残基、L-缬氨酸残基、L-半胱氨酸残基、L-谷氨酰胺残基、L-赖氨酸残基、L-天冬酰胺残基、L-精氨酸残基。
本发明的另一目的是提供所述4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯化合物的制备方法，如图2所示，该方法包括以下步骤：
(1)在通入干燥HCl气体的甲醇溶液中将二巯基丁二酸转变为二巯基丁二酸二甲酯；
(2)在二氯甲烷溶剂中加入三氟化硼乙醚溶液和对醛基苯甲酸，将二巯基丁二酸二甲酯转化为4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酸；
(3)在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-甲基吗啉(NMM)、无水四氢呋喃(THF)存在下将4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酸和L-氨基酸苄酯缩合转化为4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯。
本发明的又一目的在于提供所述4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯化合物的应用，通过在细胞模型和小鼠S180模型上评价3a-t的抗肿瘤活性，即采用MTT法评价3a-t的体外抑制肿瘤细胞繁殖的活性，以及选取K562、U937两株细胞，得出3a-t抑制肿瘤细胞生长的IC50值，提供所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
附图说明
图1为本发明通式3a-t化合物的合成路线，其中i)干燥氯化氢、甲醇、0℃冰浴；ii)对醛基苯甲酸、三氟化硼乙醚溶液、二氯甲烷、0℃冰浴；iii)L-氨基酸苄酯、DCC、HOBt、NMM、THF、0℃冰浴。3a-t中AA＝L-苏氨酸残基、L-组氨酸残基、L-色氨酸残基、甘氨酸残基、L-蛋氨酸残基、L-酪氨酸残基、L-谷氨酸残基、L-亮氨酸残基、L-丝氨酸残基、L-脯氨酸残基、L-苯丙氨酸残基、L-天冬氨酸残基、L-异亮氨酸残基、L-缬氨酸残基、L-半胱氨酸残基、L-谷氨酰胺残基、L-赖氨酸残基、L-天冬酰胺残基、L-精氨酸残基。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1 制备二巯基丁二酸二甲酯(1)
在200毫升甲醇溶液中加入5.0克(27.5mmol)二巯基丁二酸固体，搅拌混匀，在冰浴下往溶液中通入新制备的干燥的HCl气体。反应1小时后撤去冰浴，常温下继续通HCl气体直至溶液澄清。反应混合物室温搅拌6小时。TLC薄层板确定反应完全后中止反应。水泵抽干甲醇溶液，加入10毫升乙醚再抽干，反复三次。所得固体用50％乙醇水溶液重结晶，得到4.8克(收率83.4％)目标化合物，为针状晶体。ESI-MS：211[M+H]+。
实施例2 制备4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酸(2)
在20ml干燥的二氯甲烷溶液中加入1.0克(4.8mmol)二巯基丁二酸二甲酯(1)固体和0.65克(4.3mmol)对醛基苯甲酸，搅拌混匀，冰浴下往溶液中滴入5滴(0.25ml)三氟化硼乙醚溶液。反应1小时后撤去冰浴并中止反应。反应混合物通过布氏漏斗过滤，滤液用10毫升饱和氯化钠水溶液洗涤，反复三次。滤液用旋转蒸发仪上减压浓缩至干，得到的固体再用5毫升乙醚洗涤并过滤。所得固体用四氢呋喃与水重结晶，得到0.95克(收率64.6％)目标化合物，为针状或片状晶体。Rf＝0.20(石油醚∶丙酮，1∶1)；Mp：169℃；[α]D 25＝-3.9(c＝1.0，甲醇)；ESI-MS(m/e)341[M-H]+；IR(KBr)：2955，1738，1690，1609，1431，1298，1213，1015，748.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.04(s，1H)，7.93(d，J＝5.1Hz，2H)，5.94(s，1H)，4.98(s，2H)，3.70(s，6H)；13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝169.38，167.25，142.00，131.52，130.14，129.05，56.61，53.54，53.18.
实施例3 制备4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯(3a-t)的通法
在茄形瓶中将0.34克(1.0mmol)4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酸(2)溶于10毫升无水四氢呋喃。冰浴下往得到的溶液中先加入0.14克(1.0mmol)HOBt，再缓慢滴入0.23克(1.1mmol)DCC的无水四氢呋喃溶液，反应0.5小时。在锥形瓶中加入1.1mmol L-氨基酸苄酯，用无水四氢呋喃溶解，缓慢滴入前一反应瓶中，搅拌混合液并加NMM调节溶液pH值到8-9，0℃反应至冰自然融化。6小时后TLC薄层板确定反应完全后中止反应。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解并过滤，滤液依次用5％碳酸氢钠水溶液洗三遍、饱和氯化钠水溶液洗三遍、饱和碳酸氢钠水溶液洗三遍、饱和氯化钠水溶液洗三遍。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、滤液减压浓缩至干。然后用乙酸乙酯反复溶解、过滤、滤液减压浓缩至干。残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，无法重结晶的样品经石油醚丙酮混合液柱层析纯化。
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-苏氨酸苄酯(3a)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得到280mg(收率52.3％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.20(石油醚∶丙酮，1∶1)；Mp：155℃；[α]D 25＝-14.0(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)535[M+H]+；IR(KBr)：3354，2932，2853，1740，1634，1533，1314，1209，754，702.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.33(d，J＝8.1Hz，1H)，7.87(d，J＝4.2Hz，2H)，7.63(d，J＝7.8Hz，2H)，7.37(s，5H)，7.09(d，J＝7.8Hz，1H)，5.93(s，1H)，5.17(s，2H)，4.99(s，2H)，4.55(m，1H)，3.95(s，1H)，3.70(s，6H)，1.15(d，J＝6.0Hz，3H)，3.70(s，6H)；13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝170.92，169.41，166.96，140.60，136.45，134.62，128.15，66.92，66.40，59.60，56.57，53.52，53.18，20.73.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-组氨酸苄酯(3b)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得到355mg(收率53.8％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：110℃；[α]D 25＝2.1(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)660[M+H]+；IR(KBr)：3314，2953，1744，1634，1533，1309，1207，1013，725.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.87(d，J＝6.9Hz，1H)，7.74(d，J＝8.1Hz，2H)，7.73(s，1H)，7.59(d，J＝7.8Hz，2H)，7.33(s，5H)，7.25(m，5H)，6.92(s，1H)，5.93(s，1H)，5.12(s，2H)，5.10(s，2H)，4.99(s，2H)，4.71(m，1H)，3.70(s，6H)，3.01(d，J＝6.6Hz，2H)；13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝171.90，169.43，166.28，140.44，138.15，137.63，136.42，134.58，129.03，128.85，128.44，128.15，127.81，127.70，117.60，66.35，56.57，53.53，53.18，49.93，29.78.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-丙氨酸苄酯(3c)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得362mg(收率71.8％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，2∶1)；Mp：157-158℃；[α]D 25＝-5.5(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)504[M+H]+；IR(KBr)：3308，2955，1740，1641，1501，1314，1213，1163，754，696.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.75(d，J＝8.4Hz，2H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.37(s，5H)，6.79(d，J＝7.2Hz，1H)，5.72(s，1H)，5.23(d，J＝3.3Hz，2H)，4.84(m，1H)，4.65(s，2H)，3.81(s，6H)，1.53(d，J＝7.2Hz，3H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝172.98，169.24，168.99，166.11，140.30，135.28，134.34，128.85，128.67，128.51，128.16，127.45，77.49，77.06，76.64，67.31，56.90，54.58，53.07，48.63，18.57.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-色氨酸苄酯(3d)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得407mg(收率65.8％)目标化合物，为黄色固体。Rf＝0.20(石油醚∶丙酮，1∶1)；Mp：66-70℃；[α]D 25＝-61.4(c＝1.0，甲醇)；ESI-MS(m/e)620[M+H]+；IR(KBr)：3410，2953，1736，1653，1526，1298，1209，1011，745，698.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝8.13(s，1H)，7.62(d，J＝8.1Hz，2H)，7.58(s，1H)，7.54(d，J＝8.1Hz，2H)，7.37(m，5H)，7.30(m，2H)，7.20(t，J＝7.5Hz，1H)，7.08(t，J＝7.5Hz，1H)，6.76(d，J＝2.1Hz，1H)，6.67(d，J＝7.5Hz，1H)，5.70(s，1H)，5.18(m，1H)，5.15(d，J＝3.6Hz，2H)，4.65(s，2H)，3.81(s，6H)，3.45(d，J＝5.1Hz，2H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝171.69，168.99，166.24，140.20，136.09，135.24，134.31，128.78，128.63，128.56，127.68，127.50，122.96，122.31，119.80，118.65，111.31，109.76，67.31，56.95，56.84，54.58，53.58，53.09，27.59.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-甘氨酸苄酯(3e)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得379mg(收率77.3％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，1∶1)；Mp：129-132℃；[α]D 25＝-5.5(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)490[M+H]+；IR(KBr)：3329，2953，1763，1721，1645，1339，1206，1001，957，750.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.78(m，2H)，7.64(t，J＝8.1Hz，2H)，7.39(s，5H)，6.66(d，J＝4.5Hz，1H)，5.73(s，2H)，5.25(s，2H)，4.66(s，2H)，4.29(d，J＝5.1Hz，2H)，3.82(s，6H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝169.86，169.20，168.95，166.70，140.56，140.48，135.10，134.12，128.89，128.78，128.68，128.61，128.40，127.51，127.46，67.39，56.94，56.88，55.63，54.59，53.04，53.01，41.92.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-蛋氨酸苄酯(3f)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得345mg(收率61.2％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：134-138℃；[α]D 25＝-13.4(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)564[M+H]+；IR(KBr)：3313，2949，1740，1638，1501，1314，1233，1018，754，702.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.77(d，J＝8.4Hz，2H)，7.63(d，J＝8.4Hz，2H)，7.38(s，5H)，5.73(s，1H)，5.24(d，J＝6.0Hz，2H)，4.94(m，1H)，4.66(m，2H)，3.81(s，6H)，2.53(m，2H)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)，2.07(s，3H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝171.82，168.99，166.33，140.48，135.12，134.15，128.92，128.84，128.70，128.63，128.53，128.42，128.38，127.49，127.10，67.52，56.94，54.58，53.09，52.26，31.48，29.99，15.54.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-酪氨酸苄酯(3g)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得379mg(收率63.6％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：176-179℃；[α]D 25＝-56.3(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)596[M+H]+；IR(KBr)：3429，3327，2936，1738，1639，1528，1312，1211，1098，746，700.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝9.22(s，1H)，8.84(d，J＝7.5Hz，1H)，7.78(d，J＝8.1Hz，2H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.33(m，5H)，7.08(d，J＝8.4Hz，2H)，6.66(d，J＝8.4Hz，2H)，5.91(s，1H)，5.12(s，2H)，4.98(s，2H)，4.62(m，1H)，3.70(s，6H)，3.06(m，1H)；13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝172.08，169.41，166.50，157.10，156.46，140.49，136.36，134.57，130.50，128.83，128.76，128.44，128.24，128.19，127.94，115.54，66.41，56.58，55.32，53.55，53.17，33.82.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-谷氨酸苄酯(3h)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得390mg(收率59.8％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：136-137℃；[α]D 25＝-5.5(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)652[M+H]+；IR(KBr)：3318，2949，1728，1638，1329，1202，750，698.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.82(d，J＝7.2Hz，1H)，7.85(d，J＝8.1Hz，2H)，7.62(d，J＝8.4Hz，2H)，7.35(s，5H)，7.34(s，5H)，5.93(s，1H)，5.15(s，2H)，5.08(s，2H)，4.98(s，2H)，4.54(m，1H)，3.95(s，1H)，3.70(s，6H)，2.52(d，J＝7.8Hz，2H)，2.11(m，2H)；13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝172.54，172.00，169.41，166.78，140.59，136.55，136.42，134.47，128.87，128.76，128.45，128.36，128.21，66.48，66.01，56.59，53.55，53.17，52.57，30.57，26.11.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-亮氨酸苄酯(3i)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得381mg(收率58.4％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.20(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：147℃；[α]D 25＝-2.1(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)548[M+H]+；IR(KBr)：2959，1744，1516，1217，1171，1013，681.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.75(d，J＝8.1Hz，2H)，7.61(d，J＝8.4Hz，2H)，7.37(s，5H)，6.58(d，J＝8.1Hz，1H)，5.73(s，1H)，5.21(s，2H)，4.91(m，1H)，4.66(s，2H)，3.81(s，6H)，1.72(m，3H)，0.97(t，J＝6.0Hz，6H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝172.96，168.98，166.40，140.32，135.30，134.39，128.87，128.63，128.46，128.25，127.46，67.21，56.92，54.59，53.07，51.33，41.78，25.00，24.92，22.82，22.09.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-丝氨酸苄酯(3j)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得355mg(收率68.3％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.20(石油醚∶丙酮，1∶1)；Mp：141-144℃；[α]D 25＝-10.5(c＝1.0，甲醇)；ESI-MS(m/e)520[M+H]+；IR(KBr)：3302，2953，1736，1641，1537，1314，1217，1051，752，696.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝7.79(d，J＝5.4Hz，2H)，7.62(d，J＝8.4Hz，2H)，7.38(s，5H)，7.12(d，J＝6.9Hz，1H)，5.73(s，1H)，5.27(s，2H)，4.91(m，1H)，4.66(s，2H)，4.09(m，2H)，3.82(s，6H)，2.49(m，1H)；13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝170.83，169.41，166.61，140.55，136.49，134.58，128.84，128.76，128.40，128.31，128.05，66.34，61.46，56.57，56.31，54.15，53.54，53.17.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-脯氨酸苄酯(3k)
残留物最后用硅胶层析柱纯化(石油醚∶丙酮，3∶1)得275mg(收率51.9％)目标化合物，为黄色固体。Rf＝0.20(石油醚∶丙酮，1∶1)；Mp：114-115℃；[α]D 25＝-4.6(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)530[M+H]+；IR(KBr)：3306，2955，1734，1639，1539，1304，1206，1016，754，718.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.60(d，J＝8.1Hz，2H)，7.54(d，J＝8.4Hz，2H)，7.37(s，5H)，5.83(s，1H)，5.22(s，2H)，4.91(m，1H)，4.64(s，2H)，3.81(s，6H)，3.54(m，2H)，2.32(m，1H)，2.01(m，2H)，1.90(m，1H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝171.94，169.03，135.77，128.56，128.23，128.10，127.64，126.94，66.85，59.25，56.87，54.77，53.29，53.24，49.88，29.33，27.42，25.32.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-苯丙氨酸苄酯(3l)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得382mg(65.9％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：121-122℃；[α]D 25＝7.4(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)581[M+H]+；IR(KBr)：3348，2953，1744，1645，1533，1292，1217，1009，746，696.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.68(d，J＝8.1Hz，2H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.39(m，5H)，7.24(m，3H)，7.03(m，2H)，6.58(d，J＝7.5Hz，1H)，5.72(s，1H)，5.23(s，1H)，5.20(s，1H)，5.12(m，1H)，4.66(s，2H)，3.81(s，6H)，3.26(t，J＝6.3Hz，2H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝171.36，169.00，168.96，166.09，140.41，135.60，135.01，134.31，129.39，128.90，128.68，128.62，127.41，127.18，67.45，56.96，56.89，54.58，53.52，53.08，37.78.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-天冬氨酸苄酯(3m)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得504mg(收率79.0％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：118-120℃；[α]D 25＝-1.5(c＝1.0，甲醇)；ESI-MS(m/e)638[M+H]+；IR(KBr)：3314，2955，1736，1645，1530，1308，1209，1165，754，696.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.68(d，J＝8.4Hz，2H)，7.59(d，J＝8.1Hz，2H)，7.35(m，10H)，7.16(d，J＝7.8Hz，1H)，5.73(s，1H)，5.09(m，3H)，4.67(s，2H)，3.81(s，6H)，3.17(d，J＝4.2Hz，1H)，3.06(t，J＝4.8Hz，1H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝170.73，170.49，168.98，166.23，140.50，135.24，135.10，134.01，128.88，128.66，128.63，128.53，128.42，128.32，127.52，67.70，66.91，56.93，54.58，53.09，49.11，36.38.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-异亮氨酸苄酯(3n)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得337mg(收率61.7％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：128-129℃；[α]D 25＝-2.1(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)546[M+H]+；IR(KBr)：3327，2965，1748，1634，1521，1341，1194，1148，1022，959，831.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.76(d，J＝8.4Hz，2H)，7.62(d，J＝8.1Hz，2H)，7.38(s，5H)，6.64(d，J＝8.1Hz，1H)，5.73(s，1H)，5.22(m，2H)，4.87(m，1H)，4.66(s，2H)，3.82(s，6H)，2.03(m，1H)，1.46(m，1H)，1.22(m，1H)，0.94(m，6H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝171.91，168.96，166.42，140.35，135.25，134.60，128.88，128.62，128.51，128.41，127.43，67.17，56.94，56.85，54.59，53.05，38.33，25.27，15.52，11.59.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-缬氨酸苄酯(3o)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得402mg(收率75.6％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：138-139℃；[α]D 25＝5.1(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)533[M+H]+；IR(KBr)：3325，2963，1740，1638，1530，1310，1209，1182，970，754，702.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.76(d，J＝8.4Hz，2H)，7.63(d，J＝8.4Hz，2H)，7.38(s，5H)，6.62(d，J＝8.7Hz，1H)，5.74(s，1H)，5.22(m，2H)，4.84(m，1H)，4.66(s，2H)，3.82(s，6H)，2.31(m，1H)，0.97(m，6H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝171.93，168.96，166.61，140.38，135.24，134.61，128.89，128.64，128.52，128.41，127.45，67.21，57.45，56.94，54.58，53.05，33.92，31.67，25.62，24.93，19.00，17.79.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-半胱氨酸苄酯(3p)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得370mg(收率62.5％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.40(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：101-102℃；[α]D 25＝-24.0(c＝1.0，甲醇)；ESI-MS(m/e)592[M+H]+；IR(KBr)：3318，2953，1736，1641，1530，1310，1206，1020，752，698.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.78(d，J＝8.1Hz，2H)，7.63(d，J＝8.4Hz，2H)，7.38(s，5H)，6.95(d，J＝7.2Hz，1H)，5.73(s，1H)，5.24(s，2H)，5.10(m，1H)，4.66(s，2H)，3.82(s，6H)，3.15(d，J＝4.8Hz，2H)，1.29(s，9H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝170.55，168.97，166.26，140.47，135.08，134.20，128.90，128.61，128.52，128.39，127.53，67.65，56.94，56.92，54.60，53.07，52.34，42.73，30.84，30.51.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-谷氨酰胺苄酯(3q)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得229mg(收率40.8％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.10(石油醚∶丙酮，1∶1)；Mp：209-210℃；[α]D 25＝-1.4(c＝1.0，甲醇)；ESI-MS(m/e)561[M+H]+；IR(KBr)：3339，2930，1632，1630，1578，1312，1244，1231，893，640.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.88(d，J＝7.2Hz，1H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，7.61(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(s，5H)，5.93(s，1H)，5.56(d，J＝8.1Hz，2H)，5.15(s，2H)，4.97(s，2H)，4.47(m，1H)，3.70(s，6H)，2.24(m，2H)，1.62(m，2H)；13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝172.91，171.56，169.50，166.29，143.45，135.27，134.54，129.22，127.48，128.18，128.13，66.56，57.54，52.83，52.17，51.27，50.32，37.01.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-赖氨酸苄酯(3r)
残留物最后用二氯甲烷石油醚重结晶，得426mg(收率61.3％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.30(石油醚∶丙酮，3∶1)；Mp：99-100℃；[α]D 25＝-6.7(c＝1.0，氯仿)；ESI-MS(m/e)696[M+H]+；IR(KBr)：3319，2953，1736，1688，1501，1314，1252，1215，750，696.1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝7.77(d，J＝8.1Hz，2H)，7.58(d，J＝8.1Hz，2H)，7.37(s，5H)，7.34(s，5H)，6.85(d，J＝6.9Hz，1H)，5.70(s，1H)，5.21(m，2H)，5.05(s，2H)，4.84(m，2H)，4.65(s，2H)，3.81(s，6H)，3.15(d，J＝6.0Hz，2H)，1.95(m，2H)，1.49(m，2H)，1.37(m，2H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝172.31，168.96，166.56，156.57，140.35，136.59，135.27，134.29，128.83，128.66，128.56，128.51，128.37，128.06，128.02，127.55，67.30，66.60，56.93，54.58，53.04，52.52，40.41，31.98，29.38，22.27.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-天冬酰胺苄酯(3s)
残留物最后用硅胶层析柱纯化(石油醚∶丙酮，3∶1)得249mg(收率45.5％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.10(石油醚∶丙酮，1∶1)；Mp：184-185℃；[α]D 25＝-15.5(c＝1.0，甲醇)；ESI-MS(m/e)547[M+H]+；IR(KBr)：3298，2938，1555，1503，1223，1107，998，579.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.89(d，J＝7.5Hz，1H)，7.81(d，J＝8.1Hz，2H)，7.61(d，J＝8.1Hz，2H)，7.45(s，1H)，7.34(s，5H)，7.00(s，1H)，5.92(s，1H)，5.13(s，2H)，4.98(s，2H)，4.83(m，1H)，3.69(s，6H)，2.74(m，1H)，2.62(m，1H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝171.71，171.44，169.40，166.25，140.55，136.47，134.57，128.82，128.38，128.19，128.03，66.46，56.58，53.55，53.17，50.26，36.83.
4-(4，5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-精氨酸苄酯(3t)
残留物最后用硅胶层析柱纯化(石油醚∶丙酮，3∶1)得233mg(收率36.8％)目标化合物，为无色固体。Rf＝0.10(石油醚∶丙酮，1∶1)；Mp：174-175℃；[α]D 25＝-4.6°(c＝1.0，甲醇)；ESI-MS(m/e)634[M+H]+；IR(KBr)：3308，2953，1728，1630，1499，1263，1209，1113，1011，748.1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.81(d，J＝7.2Hz，1H)，8.51(m，1H)，8.32(s，1H)，7.84(d，J＝8.1Hz，2H)，7.61(d，J＝8.1Hz，2H)，7.36(s，5H)，5.93(s，1H)，5.15(s，2H)，4.98(s，2H)，4.49(m，1H)，3.70(s，6H)，3.18(m，2H)，1.86(m，2H)，1.61(s，2H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ/ppm＝172.31，169.54，169.41，166.77，140.54，136.43，134.59，128.88，128.76，128.49，128.33，128.21，79.64，66.42，56.57，53.54，53.17，53.12，53.07，28.10.
实施例4 化合物3a-t抑制肿瘤细胞增殖实验
本发明的3a-t均用含1％二甲基亚砜(DMSO)的PBS配制，共使用了U937(人白血病单核淋巴瘤细胞)、K562(慢性粒细胞白血病细胞)两株肿瘤细胞。
分别将生长状态良好、处于对数生长期的U937、K562细胞按照3×104个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。在37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度10μM、5μM、100nM、5nM和1nM加入经灭菌处理的本发明的化合物，对照组加入等体积溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μl浓度为5mg/mL的四噻唑兰(MTT)溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去上清液)后每孔加入100μl DMSO，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定吸光度(O.D.)值。计算抑瘤率及IC50。结果表明(见表1)本发明的化合物3a-t对这两株肿瘤细胞增殖有明确的抑制作用。
表1 3a-t的体外抗肿瘤活性(IC50，μM)
实施例5 3a-t在S180小鼠模型上的抗肿瘤活性
测定前将本发明的3a-t加吐温80助溶，溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为1×107个/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2ml本发明化合物的水溶液，连续给药7天，剂量为8.9μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2ml生理盐水。以阿霉素(剂量为4μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第8天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。结果列入表2。表2的数据表明在8.9μmol/kg剂量下化合物3j、3r的活性最强。
表2 3a-t对S180荷瘤小鼠的瘤重的影响
注：n＝12，阿霉素组2只死亡；瘤重表示为均值±SD g；a)与生理盐水组比较p＜0.05；b)与生理盐水组比较p＜0.01；c)与生理盐水组比较p＜0.001。
实施例6 3j和3r的剂量依赖实验
按照实施例9的方法，选择活性较强的3j和3r测定8.9μmol/kg、1.8μmol/kg和0.45μmol/kg三种剂量下的活性，结果见表3。表3的数据表明，在8.9μmol/kg、1.8μmol/kg剂量下3j和3r都具有明显的抗肿瘤活性。在0.45μmol/kg的剂量下3j和3r不再显示抗肿瘤活性。三种剂量下的活性显示明显差异，呈现剂量依赖关系。
表3 不同剂量的3j和3r对S180荷瘤小鼠瘤重的影响
注：n＝12，阿霉素组3只死亡；瘤重表示为均值±SD g；a)与生理盐水组比较p＜0.05；b)与生理盐水组比较p＜0.01；c)与生理盐水组比较p＜0.001。
Claims (4)
1.一类4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯化合物：
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-苏氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-组氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-色氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-甘氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-蛋氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-酪氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-谷氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-亮氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-丝氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-脯氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-苯丙氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-天冬氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-异亮氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-缬氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-半胱氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-谷氨酰胺苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-赖氨酸苄酯，
4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-天冬酰胺苄酯或4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-精氨酸苄酯。
2.一种制备权利要求1所述的4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-氨基酸苄酯化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)在通入干燥HCl气体的甲醇溶液中将二巯基丁二酸转变为二巯基丁二酸二甲酯；
(2)在二氯甲烷溶剂中加入三氟化硼乙醚溶液和对醛基苯甲酸，将二巯基丁二酸二甲酯转化为4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酸；
(3)在N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-甲基吗啉(NMM)、无水四氢呋喃(THF)存在下将4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酸和L-氨基酸苄酯缩合转化为4-(4,5-二甲氧羰基-1,3-二硫戊环-2-基)苯甲酰氨基酸苄酯。
3.权利要求1的化合物在制备抗肿瘤剂中的应用。
4.4-(5-二甲氧羰基-1，3-二硫戊环-2-基)苯甲酰-L-丙氨酸苄酯。
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