CN113122575B - siglec-5、基因表达拮抗剂或蛋白活性拮抗剂的应用 - Google Patents

siglec-5、基因表达拮抗剂或蛋白活性拮抗剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及siglec‑5、siglec‑5基因表达拮抗剂、siglec‑5蛋白活性拮抗剂在调节细胞对脂质摄取中的应用；还涉及一种调节细胞对脂质摄取的方法，包括改变所述细胞中siglec‑5表达量或活性的步骤；还涉及siglec‑5基因表达拮抗剂或siglec‑5蛋白活性拮抗剂在制备AS治疗药物中的应用。本发明发现siglec‑5作为oxLDL新型受体在内皮细胞中介导oxLDL穿胞和在巨噬细胞中介导oxLDL的摄取，从而影响巨噬泡沫细胞的形成具有重要作用。根据该发现，通过敲除或敲降siglec‑5表达，或者封闭或抑制内皮细胞和巨噬细胞膜上siglec‑5的功能，获得一种治疗或预防动脉粥样硬化发生发展的新药物和方法。

Description

siglec-5、基因表达拮抗剂或蛋白活性拮抗剂的应用
技术领域
本发明涉及AS发病机理与防治领域，更特别地，涉及siglec-5、siglec-5基因表达拮抗剂或siglec-5蛋白活性拮抗剂在调剂细胞对脂质摄取中的应用，以及siglec-5基因表达拮抗剂或siglec-5蛋白活性拮抗剂在治疗AS中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是血管壁的一种慢性非可控性炎症性疾病，是心脑血管疾病的共同病理基础。AS发病机制复杂，至今仍未完全阐明。近年来，“滞留-反应”学说收到广泛关注，该学说认为，低密度脂蛋白尤其是是氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)在血管内皮下沉积滞留AS发生发展的关键因，与AS的形成直接相关，oxLDL是动脉粥样斑块的核心组成部分。
Siglec-5属于唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(siglecs)受体超家族蛋白质的一员，有四个细胞外免疫球蛋白样结构域和两个胞内酪氨酸信号基序。已有研究报道siglec-5主要表达在人类单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞以及树突状细胞膜上，也可分泌至细胞外，主要参与天然免疫反应的调节。
发明内容
我们在研究中发现，siglec-5可与oxLDL相互作用，介导oxLDL穿胞，并且其在oxLDL的致动脉粥样硬化机制中具有重要作用，并发现siglec-5拮抗剂具有降低细胞对oxLDL的摄取和穿胞作用的功能。
基于以上发现，本发明提供了siglec-5、siglec-5基因表达拮抗剂或siglec-5蛋白活性拮抗剂在调节细胞对脂质摄取中的应用。这种应用可为治疗应用或非治疗应用。
本发明还提供了一种调节细胞对脂质摄取的方法，包括改变所述细胞中siglec-5表达量或活性的步骤。该方法可为治疗方法或非治疗性方法。
在一个具体实施方案中，通过向所述细胞中导入siglec-5的超表达框，或siglec-5基因表达拮抗剂，或者用siglec-5蛋白活性拮抗剂孵育所述细胞，或其组合，来改变所述细胞中siglec-5表达量或活性。
在一个具体实施方案中，所述siglec-5基因表达拮抗剂为敲除或敲降siglec-5表达的核酸构建体。例如，可为例如可敲降siglec-5的siRNA、miRNA，也可为CRISPR基因编辑系统，只需要能够敲除或敲降siglec-5的表达即可。这样的核酸构建体，可搭载在表达载体上，用于转入相应的细胞中
在一个具体实施方案中，所述siglec-5蛋白活性拮抗剂为抗siglec-5抗体或可溶性siglec-5蛋白。所述抗siglec-5抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体等，或其组合。所述可溶性siglec-5蛋白可为截去跨膜区段的siglec-5蛋白，也可为截短蛋白的部分区段，只需要包含与oxLDL结合的受体区域即可。
在一个具体实施方案中，所述细胞为血管上皮细胞或巨噬细胞。
在一个具体实施方案中，所述脂质为oxLDL。
本发明还提供了siglec-5基因表达拮抗剂或siglec-5蛋白活性拮抗剂在制备AS治疗药物中的应用。
在一个具体实施方案中，所述siglec-5基因表达拮抗剂为敲除或敲降siglec-5表达的核酸构建体。
在一个具体实施方案中，所述siglec-5蛋白活性拮抗剂为抗siglec-5抗体或可溶性siglec-5蛋白。
本发明证明siglec-5作为oxLDL新型受体在内皮细胞中介导oxLDL穿胞和在巨噬细胞中介导oxLDL的摄取，从而影响巨噬泡沫细胞的形成具有重要作用。根据该发现，通过敲除或敲降siglec-5表达，或者封闭或抑制内皮细胞和巨噬细胞膜上siglec-5的功能，获得一种治疗或预防动脉粥样硬化发生发展的新药物和方法。
附图说明
图1为THP-1源性巨噬细胞和HUVEC中siglec-5的RT-PCR检测电泳照片和westernblot照片。
图2为脐静脉免疫组化染色照片，以及HUVEC胞浆和胞膜中siglec-5蛋白的western blot检测照片。
图3为不同浓度的oxLDL对siglec-5表达的影响。其中，A为不同浓度oxLDL刺激HUVEC后siglec-5 mRNA水平统计图；B为不同浓度oxLDL刺激HUVEC后蛋白的westernblot照片；C为根据B得到的siglec-5蛋白水平统计图。*，P<0.05；**，P<0.05；与Control组比较；n＝4。
图4为3个siRNA对siglec-5的表达影响。其中，A为转染了siRNA的HUVEC中siglec-5mRNA水平统计图；B为转染了siRNA的HUVEC的蛋白的westernblot照片；C为根据B得到的siglec-5蛋白水平统计图。*，P<0.05，与Scrambled siRNA组比较，n＝4。
图5为siRNA对oxLDL在HUVEC中的穿胞和摄取的影响。其中，A为转染siglec-5siRNA后，用穿胞模型检测oxLDL的穿胞统计图；B为转染siglec-5 siRNA后，观察DiI-oxLDL的摄取的激光共聚焦照片，胞浆中红色颗粒为DiI-oxLDL，蓝色为胞核；；C为根据B的荧光统计的HUVEC对oxLDL摄取率的统计图；*，P<0.01，与Scrambled siRNA组比较，n＝3；标尺为50μm。
图6为过表达siglec-5对oxLDL在HUVEC中的穿胞和摄取的影响。其中，A为过表达siglec-5后，用穿胞模型检测oxLDL的穿胞统计图；B为过表达siglec-5后，观察DiI-oxLDL的摄取的激光共聚焦照片，胞浆中红色颗粒为DiI-oxLDL，蓝色为胞核；C为根据B的荧光统计的HUVEC对oxLDL摄取率的统计图；*，P<0.01，与Scrambled siRNA组比较，n＝3；标尺为50μm。
图7为Siglec-5与oxLDL的结合。其中，A为siglec-5-GFP与DiI-oxLDL共定位荧光照片，标尺为150μm；B为Siglec-5与oxLDL的免疫共沉淀照片。
图8为抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白对FITC-oxLDL在HUVEC中穿胞的影响。其中，A为抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白处理过的HUVEC中的FITC-oxLDL穿胞率统计图；B为抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白处理过的HUVEC对FITC-oxLDL摄取的激光共聚焦照片；C为根据B的荧光统计的HUVEC对oxLDL摄取率的统计图；*，P<0.05，与IgG组比较，n＝3；标尺为50μm。
图9为抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白对THP-1源性巨噬细胞对oxLDL的摄取的影响。其中，A为抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白处理过THP-1源性巨噬细胞进行摄取处理后的流式细胞检测图；B为根据A统计的THP-1源性巨噬细胞对oxLDL摄取率的统计图；*，P<0.05，与IgG组比较，n＝3。
图10为Siglec-5及其拮抗剂对高脂诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变形成的影响。其中，A为ApoE-/-小鼠尾静脉注射siglec-5腺相关病毒4周后观察血管GFP荧光，标尺为200μm；B为免疫组化染色观察FLAG表达，标尺为200μm；C为油红O染色观察主动脉斑块的显微照片，标尺为700μm；D为根据C统计的斑块面积占比统计图；*，P<0.05，与rAAV-GFP组比较，n＝7。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、HUVEC中的siglec-5表达情况
取原代人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)用于研究血管内皮细胞中是否表达siglec-5。以100ng/mL PMA处理THP-1细胞24h得到诱导分化的THP-1源性巨噬细胞为阳性对照，使用PCR法和westernblot法分别检测HUVEC中siglec-5的mRNA水平和蛋白水平。结果如图1所示，HUVEC存在siglec-5表达，取脐静脉进行针对siglec-5的免疫组化染色，也显示出脐静脉内皮血管上具有siglec-5表达(图2)。通过进一步的细胞定位研究，我们发现HUVEC中，siglec-5定位于细胞膜上，为跨膜蛋白。
2、oxLDL浓度对siglec-5表达的影响
我们用不同浓度的oxLDL(10、25、50、100和300μg/mL)处理HUVEC24h，提取RNA和蛋白，定量RT-PCR和Westernblot方法检测siglec-5在转录mRNA水平和蛋白水平的表达情况。
结果如图3所示，随着oxLDL的浓度增大，siglec-5mRNA和siglec-5蛋白的表达都增加，在100μg/mL时到峰值，而在300μg/mL时有所下降。需要指出的是，在oxLDL300μg/mL这个浓度作用24h对细胞可能有毒性作用。根据该实验结果可知，oxLDL可上调siglec-5在mRNA和蛋白水平上的表达。
3、siglec-5 siRNA对oxLDL穿胞的影响
我们针对siglec-5设计了多个siRNA，转入到HUVEC中，检测转化子中siglec-5的表达情况，其中三个siRNA的转化子中siglec-5的表达情况如图4所示，1号siRNA(靶序列CTTGGAGCTTCGTCGAGTA，SEQ ID NO:1)导致转化子中的siglec-5表达水平为原来的约50％，3号siRNA(靶序列CCATTATGCCTCCCTTAGT，SEQ ID NO:2)导致转化子中的siglec-5表达水平为原来的约25％。使用这两个siRNA用于后续研究。
使用原始HUVEC和转化子HUVEC进行oxLDL穿胞实验，方法如下：1)将HUVEC按分组接种于穿胞小室中，按实验设计分组处理细胞，细胞处理好后，每组加50μg/mL的FITC-oxLDL作用3h，另加每组加一个6倍oxLDL的竞争组。2)oxLDL处理完成后，将穿胞小室下液体先混匀后再取400μL装入透析袋中避光透析，4℃，3h，同时加一个阴性对照组(培养基透析组)。3)透析完成后用酶标仪检测OD值：激发光波长490nm，发射光波长520nm。4)将每次结果测得的荧光OD值，都分别与OPTI-MEN组OD值相减即为最后OD值，oxLDL穿胞OD值＝处理组OD值－对应竞争组OD值，采用SPSS分析，p<0.05表示差异有统计学意义。
结果如图5A所示，siglec-5敲低后可减少FITC-oxLDL在血管内皮细胞中的穿胞。穿胞是由胞吞、转移及胞吐这一连串过程发生的，HUVEC对FITC-oxLDL的摄取是穿胞的中间状态，可以反映穿胞的情况，我们采用激光共聚焦显微镜观察siglec-5 siRNA处理细胞后对oxLDL的摄取情况。如图5B-5C所示，胞浆内红色荧光(DiI-oxLDL示踪荧光)的强弱代表细胞摄入的oxLDL量的高低。结果显示：siglec-5敲低后可减少血管内皮细胞对DiI-oxLDL的摄取。
对THP-1源性巨噬细胞进行了类似了的实验，也发现了使用1号和3号siglec-5siRNA敲降细胞中的siglec-5可导致该细胞减少对oxLDL的摄取。
4、过表达siglec-5对oxLDL穿胞的影响
构建siglec-5基因过表达载体，转入HUVEC中，得到的过表达siglec-5的转化子，进行oxLDL穿胞实验，方法如上文所述。结果如图6A所示，siglec-5蛋白过表达的转化子具有更高的oxLDL穿胞作用。进一步我们采用激光共聚焦显微镜观察siglec-5过表达后细胞对oxLDL的摄取情况。如图6B和C所示，超表达siglec-5的细胞胞浆内红色荧光(DiI-oxLDL示踪荧光)大大高于对照组，显示siglec-5超表达大大提高了HUVEC对oxLDL的摄取。针对THP-1源性巨噬细胞进行了相应的实验，得到类似的结果。
5、Siglec-5与oxLDL的结合
我们进一步研究siglec-5如何介导细胞对oxLDL的穿胞作用和摄取作用。
我们对HUVEC进行GFP-siglec-5过表达转染，转染24h后向细胞中加入50μg/mL的DiI-oxLDL作用0.5h，再进行共聚焦拍片观察，发现过表达的siglec-5可以与DiI-oxLDL重合，如图7A。接着进一步做siglec-5与oxLDL的免疫共沉淀实验，先对HUVEC转染FLAG-siglec-5，24h后向细胞中加入50μg/mLoxLDL作用1h，然后提蛋白，用oxLDL抗体和FLAG抗体进行COIP实验，如图7B所示，Western blot检测FLAG可以被oxLDL抗体拉下来，说明siglec-5可以与oxLDL结合，这表明siglec-5是oxLDL的一种新型受体，可介导oxLDL在血管内皮细胞中的摄取、穿胞，并参与单核巨噬细胞对oxLDL的摄取，影响泡沫细胞的形成。
基于以上研究，我们推测，除了siRNA之外，与siglec-5蛋白作用的抑制剂也可能对oxLDL穿胞产生影响。
6、抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白对oxLDL穿胞的影响
根据上述实验结果和假说，我们预测，抗siglec-5抗体可遮蔽oxLDL与siglec-5的结合位点，阻碍oxLDL与质膜siglec-5的结合，从而阻断oxLDL的作用。可溶性siglec-5蛋白(SEQ ID NO:3)可竞争性结合oxLDL，使质膜siglec-5无法与oxLDL结合，从而影响oxLDL的穿胞。
将HUVEC接种于穿胞小室中，分别加入10μg/mL的IgG、抗体siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白处理内皮细胞24h，然后加入50μg/mLFITC-oxLDL处理6h，进行穿胞实验。
结果如图8A所示，抗siglec-5抗体处理组和可溶性siglec-5蛋白处理组的oxLDL穿胞作用都大大降低。我们进一步采用激光共聚焦显微镜观察，结果如图8B和C所示，抗siglec-5抗体处理组和可溶性siglec-5蛋白处理组中的荧光远低于对照组，说明抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白都能有效降低HUVEC对oxLDL的摄取。
观察抗siglec-5抗体处理组和可溶性siglec-5蛋白对THP-1源性巨噬细胞的作用，也能得到类似的结果。对分别使用抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白处理24h，然后使用FITC-oxLDL处理6h后的THP-1源性巨噬细胞进行流式细胞检测，结果如图9A和B所示，抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白处理后，大大减少巨噬细胞摄取oxLDL。
7、抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白对小鼠AS形成的影响
购买5周龄的雄性ApoE-/-小鼠(14-18g)分成四组(n＝8)，先适应正常饲料饲养一周。
对照组经静脉注射rAAV9-GFP空载对照病毒(搭载GFP表达框的腺病毒载体AAV)，并高脂饮食饲喂(15％脂肪+0.15％胆固醇)4周，然后处死处死两只对照组小鼠。主动脉冰冻切片，通过观察GFP荧光情况，了解病毒在体内的表达情况，如图10A所示，主动脉可见GFP荧光，说明病毒在体内表达正常。
3个处理组在1周的正常饮食后，经尾静脉注射rAAV9-GFP-siglec-5-FLAG(搭载了GFP和FLAG标记的siglec-5表达框的腺病毒载体)，并高脂饮食饲喂(15％脂肪+0.15％胆固醇)4周。然后分别经尾静脉注射IgG、抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白，之后继续维持高脂饮食饲喂，并每两周注射一次，10周后处死小鼠。
取各组小鼠大体主动脉进行油红O染色，检测大体主动脉及主动脉根部脂质沉积情况，并免疫荧光法观察主动脉融合标签蛋白FLAG的表达。如图10B所示，主动脉环表达FLAG，印证了图10A的结果，腺相关病毒载体成功表达。油红O染色结果如图10C和D所示，过表达siglec-5促进了大体主动脉及主动脉根部的脂质沉积，抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白一定程度可以减少大体主动脉及主动脉根部的脂质沉积，抵消了siglec-5过表达带来的效果。
由此可见，采用抗siglec-5抗体和可溶性siglec-5蛋白经尾静脉注射，可在一定程度上缓解oxLDL在主动脉及主动脉根部的沉积，从而对AS起到治疗作用。
同理，根据上文中siRNA的实验结果，我们推测针对siglec-5的siRNA也具有治疗AS的效果，在随后的实验中，我们也验证了这一点。
综合上述实验结果，siglec-5作为oxLDL新型受体在内皮细胞中介导oxLDL穿胞和在巨噬细胞中介导oxLDL的摄取，从而影响巨噬泡沫细胞的形成具有重要作用。通过封闭或抑制内皮细胞和巨噬细胞膜上siglec-5的功能，有望成为一种潜在的治疗或预防动脉粥样硬化发生发展的新药物和方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属梨园医院
<120> siglec-5、基因表达拮抗剂或蛋白活性拮抗剂的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttggagctt cgtcgagta 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccattatgcc tcccttagt 19
<210> 3
<211> 551
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Leu Pro Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Gly Ser Leu Gln
1 5 10 15
Glu Lys Pro Val Tyr Glu Leu Gln Val Gln Lys Ser Val Thr Val Gln
20 25 30
Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Trp Arg
35 40 45
Ser Trp Tyr Ser Ser Pro Pro Leu Tyr Val Tyr Trp Phe Arg Asp Gly
50 55 60
Glu Ile Pro Tyr Tyr Ala Glu Val Val Ala Thr Asn Asn Pro Asp Arg
65 70 75 80
Arg Val Lys Pro Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Val
85 90 95
Gln Lys Lys Asn Cys Ser Leu Ser Ile Gly Asp Ala Arg Met Glu Asp
100 105 110
Thr Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Arg Asp Val Lys Tyr
115 120 125
Ser Tyr Gln Gln Asn Lys Leu Asn Leu Glu Val Thr Ala Leu Ile Glu
130 135 140
Lys Pro Asp Ile His Phe Leu Glu Pro Leu Glu Ser Gly Arg Pro Thr
145 150 155 160
Arg Leu Ser Cys Ser Leu Pro Gly Ser Cys Glu Ala Gly Pro Pro Leu
165 170 175
Thr Phe Ser Trp Thr Gly Asn Ala Leu Ser Pro Leu Asp Pro Glu Thr
180 185 190
Thr Arg Ser Ser Glu Leu Thr Leu Thr Pro Arg Pro Glu Asp His Gly
195 200 205
Thr Asn Leu Thr Cys Gln Met Lys Arg Gln Gly Ala Gln Val Thr Thr
210 215 220
Glu Arg Thr Val Gln Leu Asn Val Ser Tyr Ala Pro Gln Thr Ile Thr
225 230 235 240
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245 250 255
Leu Pro Val Leu Glu Gly Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Asp Ala Pro
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275 280 285
Asn Ala Thr Pro Ile Ser Asn Thr Gly Ile Leu Glu Leu Arg Arg Val
290 295 300
Arg Ser Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Arg Ala Gln His Pro Leu
305 310 315 320
Gly Phe Leu Gln Ile Phe Leu Asn Leu Ser Val Tyr Ser Leu Pro Gln
325 330 335
Leu Leu Gly Pro Ser Cys Ser Trp Glu Ala Glu Gly Leu His Cys Arg
340 345 350
Cys Ser Phe Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ser Leu Cys Trp Arg Leu Glu
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Glu Gly Asn Ser Ser Gln Gly Ser Phe Lys Val Asn
370 375 380
Ser Ser Ser Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ser Ser Leu Ile Leu His Gly
385 390 395 400
Gly Leu Ser Ser Asp Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Trp Asn Ile Tyr
405 410 415
Gly Ser Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Leu Gln Gly Arg Ser Asn Leu
420 425 430
Gly Thr Gly Val Val Pro Ala Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Met Ala
435 440 445
Leu Leu Cys Ile Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Leu Ile Val Lys Ala
450 455 460
Arg Arg Lys Gln Ala Ala Gly Arg Pro Glu Lys Met Asp Asp Glu Asp
465 470 475 480
Pro Ile Met Gly Thr Ile Thr Ser Gly Ser Arg Lys Lys Pro Trp Pro
485 490 495
Asp Ser Pro Gly Asp Gln Ala Ser Pro Pro Gly Asp Ala Pro Pro Leu
500 505 510
Glu Glu Gln Lys Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Ser Glu Met
515 520 525
Lys Ser Arg Glu Pro Lys Asp Gln Glu Ala Pro Ser Thr Thr Glu Tyr
530 535 540
Ser Glu Ile Lys Thr Ser Lys
545 550

Claims (2)

1.siglec-5、siglec-5基因表达拮抗剂或siglec-5蛋白活性拮抗剂在制备调节细胞对脂质摄取的药物中的应用，所述细胞为HUVEC或THP-1来源的巨噬细胞，所述siglec-5基因表达拮抗剂为siglec-5 siRNA，所述siglec-5蛋白活性拮抗剂为抗siglec-5抗体或可溶性siglec-5蛋白，所述脂质为oxLDL。
2.一种体外调节细胞对脂质摄取的方法，其特征在于，包括改变所述细胞中siglec-5表达量或活性的步骤，通过向所述细胞中导入siglec-5的超表达框，或siglec-5基因表达拮抗剂，或者用siglec-5蛋白活性拮抗剂孵育所述细胞，或其组合，来改变所述细胞中siglec-5表达量或活性，
所述细胞为HUVEC或THP-1来源的巨噬细胞，所述siglec-5基因表达拮抗剂为siglec-5siRNA，所述siglec-5蛋白活性拮抗剂为抗siglec-5抗体或可溶性siglec-5蛋白，所述脂质为oxLDL。
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