ES2732476T3 - Reactivos, métodos y kits para el diagnóstico de inmunodeficiencias primarias - Google Patents
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Abstract
Una composición de reactivos para la inmunofenotipificación por citometría de flujo de leucocitos que comprende anticuerpos conjugados con fluorocromo marcados de manera específica y dirigidos contra la siguiente combinación de marcadores: (a) CD27, IgM, IgA, IgG, IgD, CD19, CD21, CD38, e IgE.
Description
DESCRIPCIÓN
Reactivos, métodos y kits para el diagnóstico de inmunodeficiencias primarias.
Esta invención se refiere al campo de las inmunodeficiencias primarias (PID), más específicamente a medios y métodos para el diagnóstico de PID del sistema linfoide. PID son trastornos hereditarios del sistema inmunológico. Los pacientes con PID suelen presentar infecciones recurrentes, graves y, a veces, potencialmente mortales. Hasta la fecha, se han identificado más de 200 genes que se pueden mutar en pacientes con PID (A1Herz, Front Immunol 2014;5:162). Dependiendo del defecto genético, una parte del sistema inmunológico o un tipo de célula puede estar ausente o ser disfuncional. La mayoría de los pacientes con una PID tienen un defecto del sistema inmunológico adaptativo, esto es, que implica un defecto en las células B y/o T. La inmunofenotipificación por citometría de flujo desempeña un papel crucial en el procedimiento de diagnóstico en etapas de los pacientes con PID. El diagnóstico correcto es de suma importancia, porque determina la estrategia terapéutica, que incluye antibióticos, sustitución de inmunoglobulinas o, en algunos casos, trasplante de células madre hematopoyéticas o terapia génica.
Muchos centros de diagnóstico e investigación han desarrollado protocolos de citometría de flujo de múltiples colores para el diagnóstico y clasificación de PID, pero las diferencias en los paneles de anticuerpos, el manejo de muestras, la configuración de instrumentos y el análisis de datos dificultan la reproducibilidad o el intercambio de datos entre centros. Especialmente para PID, existe la necesidad de intercambiar datos entre centros, debido a la gran cantidad de PID diferentes, la baja incidencia de PID y la heterogeneidad clínica e inmunológica de PID.
Se han propuesto varios paneles de anticuerpos monoclonales (MoAb) para el análisis de citometría de flujo del PID del sistema linfoide. La mayoría de estos paneles de MoAb están dedicados a la identificación de defectos importantes en los linfocitos B y T, así como a las células NK, y/o al cribado de diagnóstico de un trastorno hereditario específico. Ejemplos de tales paneles de MoAb de citometría de flujo orientados a enfermedades específicas son: paneles para el cribado de diagnóstico y clasificación de inmunodeficiencia combinada grave (SCID) basada en la cuantificación de las células B, T y n K con CD3, CD19 y CD56 solos o en combinación con CD16; el cribado de diagnóstico de la agammaglobulinemia congénita basada en la enumeración de linfocitos B circulantes (por ejemplo, CD19+); la clasificación de la inmunodeficiencia variable común (CVID) según la proporción de linfocitos B inmaduro/transicional, similar a la zona marginal/no cambiada (smIgMD+) y de clase cambiada (smIgMD-), y CD21dim; cribado de diagnóstico de pacientes con síndrome de DiGeorge en función de los recuentos relativos de células T CD4+ tímicos recientes emigrantes (RTE) en sangre periférica, y; la cuantificación de células T TCRap+ negativas doble CD4 y CD8 (DNT) para el cribado del síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS) (Oliveira et al, Curr Opin Allergy Clin Immunol 2008; 8: 499). Tales paneles de MoAb se enfocan por lo general en la detección y enumeración de subpoblaciones de linfocitos no asociados con la enfermedad únicamente. En consecuencia, ninguno de estos enfoques permite una descripción completa y una descripción detallada de la distribución de distintos subconjuntos de leucocitos circulantes.
En paralelo, se han propuesto paneles inmunofenotípicos integrales y se han usado para el estudio de múltiples subpoblaciones diferentes de leucocitos de sangre periférica, tales como los llamados paneles de anticuerpos EuroFlow (véase el documento WO2010/140885 A1), el panel exhaustivo de inmunofenotipificación de leucocitos (CLIP; Biancotto et al, J Immunol Meth 2011;363:245), un panel de anticuerpos para armonizar la citometría de flujo en ensayos clínicos (Maecker et al, Nat Immunol 2012;12: 191) el panel MoAb del estudio ONE (Streitz et al, Transplant Res 2013; 2: 17), y el panel Pasteur de inmunofenotipificación (Duffy et al, Immunity 2014; 40:436). Estos paneles conocidos permiten la identificación de varias subpoblaciones de células B, T y NK (por ejemplo, células ingenuas frente a activas de la memoria, TCRyS frente a TCRaP) junto con la identificación de monocitos, células dendríticas y granulocitos. Sin embargo, las combinaciones propuestas en estos paneles de MoAb se centran específicamente en la identificación y enumeración de poblaciones de células de leucemia/linfoma o en el seguimiento de compartimientos específicos de células T, B y NK mediante el uso de múltiples tubos de MoAb que solo proporcionan información relevante para condiciones específicas, tales como el seguimiento inmunológico después del trasplante, pero no en otras afecciones como la PID.
Más recientemente, se ha propuesto un panel de MoAb específico para el análisis de subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica que tiene como objetivo el diagnóstico de pacientes con PID. Se afirma que este panel se reivindica para comprender una combinación de MoAb de "descripción general de linfocitos" para la identificación de células T, B y NK totales, junto con siete combinaciones de MoAb adicionales para la caracterización inmunofenotípica de estas células con marcadores que han demostrado ser clínicamente relevante para el diagnóstico y la clasificación de los pacientes con PID (Bolt et al. Cytometry B Clin Cytometry 2014; 86: 191; O'Gorman et al. Methods Mol Biol 2011; 699: 317). La mayoría de estas combinaciones de MoAb (seis de siete) se dirigen a las células T y NK, lo que permite una descripción extensa de estos subconjuntos, incluida la discriminación de los subconjuntos funcionales (por ejemplo, colaboradora frente a citotóxica), etapa de maduración (por ejemplo, ingenuas, memoria, efectora y memoria efectora) y otras subpoblaciones asociadas a enfermedades (por ejemplo, células RTE y DNT). Por el contrario, se logra una disección más limitada del compartimento de células B ya que sus restos se limitan a la delineación de los compartimentos de células asociados a la etapa de maduración de células B de memoria inmaduras/transitorias, ingenuas, sin conmutación y con conmutación de clase, y plasmablastos/células plasmáticas; con este enfoque no se puede obtener una mayor disección de estos subconjuntos células B en otros
compartimentos que están específicamente implicados en PID, tales como los subconjuntos de isotipos Ig. De hecho, aunque la cuantificación de los niveles de inmunoglobulina en suero de los diferentes isotipos es obligatoria en la mayoría de los pacientes con PID, ninguno de los métodos publicados es capaz de identificar la contraparte celular de estas inmunoglobulinas (IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) en el compartimento de células B en al máximo dos tubos. Además, el panel propuesto no proporciona información sobre otros subconjuntos de leucocitos circulantes, tales como: células dendríticas, basófilos o eosinófilos, entre otras células.
Otra limitación para este método es que solo se han proporcionado dos ejemplos de la aplicación en pacientes con PID, ambos del mismo centro, y no hay información disponible sobre el rendimiento del método en una serie representativa de pacientes con PID en una configuración multicéntrica. Finalmente, el número relativamente alto de tubos que deben ser teñidos en pacientes (por ejemplo, con frecuencia niños) con recuentos de células T extremadamente bajos, lleva a la necesidad de altos volúmenes de muestra o decisiones arbitrarias sobre qué subconjunto de tubos se pueden teñir en un paciente específico, debido a la limitada disponibilidad de la muestra. En resumen, los protocolos y técnicas actuales de MoAb para el diagnóstico de citometría de flujo de PID tienen varias limitaciones principales. Estos protocolos no se han diseñado para el cribado y clasificación en etapas de pacientes con PID. En su lugar, por lo general se enfocan en un subgrupo de enfermedad único y relativamente uniforme, no brindan información sobre cómo combinar los marcadores MoAb recomendados con fluorocromos específicos, solo permiten la evaluación simultánea de una fracción de todos los subconjuntos celulares relevantes (sin una descripción completa de los distintos compartimentos de las células inmunes), y no clasifican las células B según el (los) isotipo (s) de inmunoglobulina producido (s). Finalmente, estos protocolos se han evaluado en un número muy limitado de muestras de PID y/o no se ha demostrado que estén lo suficientemente estandarizados para funcionar en una configuración multicéntrica.
Los presentes inventores, por lo tanto, apuntaron a la provisión de medios y métodos para la identificación inequívoca y la disección completa tanto de la maduración como de los subconjuntos funcionales de linfocitos, junto con otras subpoblaciones de leucocitos que muestran distintos patrones de alteración en distintos pacientes con PID. Con ese fin, se diseñaron, evaluaron y optimizaron combinaciones apropiadas de anticuerpos bien definidos en tubos multicolores en varias rondas de pruebas multicéntricas. Además, se seleccionaron combinaciones específicas de fluorocromos unidos a los reactivos de anticuerpos en función de la necesidad de brillo, compensación, estabilidad, etc., para desarrollar un conjunto de reactivos de anticuerpos que podrían aplicarse en etapas para el diagnóstico y la clasificación de PID (véase algoritmo de diagnóstico en etapas en la figura 1).
Los paneles MoAb propuestos de la invención se evaluaron exhaustivamente en estudios multicéntricos mediante el análisis de muestras de control sanas y muestras de pacientes con PID de diferentes grupos de diagnóstico, como SCID, CVID, síndrome de DiGeorge, ALPS, síndrome de Wiskott Aldrich, deficiencia de IgA selectiva, pacientes con deficiencia de BTK y deficiencia de CD40L. La información proporcionada por la evaluación multicéntrica se usó para remodelar el panel a fin de lograr tanto una eficiencia óptima como una alta reproducibilidad entre los diferentes laboratorios.
En un aspecto, la invención proporciona una composición de reactivos para inmunofenotipificación de citometría de flujo de leucocitos que comprende anticuerpos conjugados con fluorocromo marcados claramente dirigidos contra la siguiente combinación de marcadores:
CD27, IgM, IgA, IgG, IgD, CD19, CD21, CD38 e IgE; preferiblemente CD27, IgM, IgA, IgE, IgG, IgD, CD19, CD21 y CD38 en la que la composición que comprende dos anticuerpos marcados claramente contra IgA y en la que el anticuerpo dentro de los pares IgE/IgA e IgG/IgA se conjuga con el mismo fluorocromo y en el que entre los diferentes pares, los fluorocromos son distinguibles (denominado "tubo de células B post-GC"). Se pueden añadir anticuerpos contra marcadores adicionales. Preferiblemente, la composición de reactivos comprende además anticuerpos conjugados con fluorocromo contra los marcadores CD24 y CD5 (denominados "tubos Pre Post-GC de 10 colores").;
Una composición de reactivos de la reivindicación 1 y las que dependen de ella no se enseña ni se sugiere en la técnica. La combinación de marcadores CD27, IgM, IgA, IgG, IgD, CD19, CD21 y CD38 se describió anteriormente, véase, por ejemplo, Kamphuis et al. (Am. J. of Resp. and Critical Care Medicine, Vol. 187, no. 4, 2013, pp. 406-416), Warnatz et al. ("Immune phenotyping in primary immunodeficiency, 2010, retrieved from the internet at http://www.ipidnet.org/protocol-data-1), Rakhmanov et al., PNAS USA, Vol. 106, no. 32, 2009, pp. 13451-13456) o Fridberg et al. (Immunobiology, vol. 210, No. 6-8, 2005, pg. 462). Sin embargo, la técnica anterior no enseña o sugiere la inclusión de IgE como marcador adicional.
También se describe una composición de reactivos para inmunofenotipificación por citometría de flujo de leucocitos que comprende doce anticuerpos conjugados con fluorocromo distintos conjugados con 8 fluorocromos diferentes, el tubo de cribado EuroFlow PID. Este tubo de cribado EuroFlow PID incluye una composición de reactivos que comprende un panel de anticuerpos dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: CD27, CD45RA, CD8, IgD, CD16, CD56, CD4, IgM, CD19, CD3, CD45 y ya sea TCRap o TCRyS, en el que el anticuerpo dentro de los pares CD8/IgD, CD16/CD56, CD4/IgM y CD19/TCRaP o CD19/TCRyS está conjugado con el mismo fluorocromo, y en el que entre los diferentes pares, los fluorocromos son distinguibles (denominado "tubo de cribado
PID"). La composición de reactivos puede comprender un panel de anticuerpos dirigidos contra una de las siguientes combinaciones de marcadores: CD27, CD45RA, CD8, IgD, CD16, CD56, CD4, IgM, CD19, CD3, CD45 y TRCap, en la que el anticuerpo dentro de los pares CD8/IgD, CD16/CD56, CD4/IgM y CD19/TCRap están conjugados con el mismo fluorocromo. Por ejemplo, comprende un panel de anticuerpos dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: CD27, CD45RA, CD8, IgD, CD16, CD56, CD4, IgM, CD19, CD3, CD45 y TCRyS, en la que el anticuerpo dentro de los pares CD8/IgD, CD16/CD56, CD4/IgM y CD19/TCRyS están conjugados con el mismo fluorocromo. De este modo, el tubo de cribado EuroFlow PID puede consistir en un tubo de cribado de 14 parámetros de 8 colores (incluida la dispersión) que permite la detección de los principales subconjuntos de linfocitos, que proporciona información suficiente para guiar pruebas genéticas adicionales o justifica un análisis adicional de subconjuntos de células B y/o T.
Los inventores también han diseñado realizaciones alternativas que comprenden ya sea diez o doce anticuerpos distintos conjugados con fluorocromo, incluidos aquellos contra todos los marcadores descritos anteriormente. Por ejemplo, también se describe una composición de reactivos como la descrita anteriormente que comprende además un anticuerpo conjugado con fluorocromo contra los marcadores CCR7 y/o CD38. Preferiblemente, comprende anticuerpos contra los marcadores CCR7 y CD38 (denominado "tubo de cribado PID de 10 colores").
En un aspecto adicional, la invención describe una composición de reactivos que comprende un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: CD27, IgM, CD38, CD5, IgD, CD19, CD21 y CD24 (tubo de células B Pre-GC).
En un aspecto adicional, la invención describe una composición de reactivos (tubo-1 de células B de Isotipo Ig), que comprende un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: c D27, IgM, IgG3, IgG2., IgG1, IgD, CD19, CD21 y CD38; y en el que la composición comprende dos anticuerpos marcados claramente contra IgG2 y en el que el anticuerpo dentro de los pares IgG3/IgG2 e IgG1/IgG2 está conjugado con el mismo fluorocromo y en el que, entre los diferentes pares, los fluorocromos son distinguibles.
En un aspecto adicional, la invención describe una composición de reactivos (tubo de células B de isotipo Ig-2), que comprende un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: c D27, IgM, IgA2, IgA1, IgG4, IgD, CD19, CD21 y CD38; en el que la composición comprende dos anticuerpos marcados contra IgA1 y en el que el anticuerpo dentro de los pares IgA1/IgG4 e IgA1/IgA2 se conjuga con el mismo fluorocromo y en el que entre los diferentes pares, los fluorocromos son distinguibles.
También se describe una composición de reactivos de un solo tubo para la detección de todos los isotipos de Ig. Esta composición de reactivos comprende un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: c D27, IgM, IgG3, IgG2, IgG1, IgD, CD19, CD21, CD38, IgA1, IgA2 e IgG4; en el que la composición comprende dos anticuerpos marcados claramente contra IgG2 y dos anticuerpos marcados claramente contra IgA1, y en el que el anticuerpo dentro de los pares IgG3/IgG2, IgG1/IgG2, IgA1/IgG4 e IgA1/IgA2 se conjuga con el mismo fluorocromo y en el que entre los diferentes pares, los fluorocromos son distinguibles (denominado "tubo de isotipo Ig de 10 colores"). Esta composición de reactivos se puede adaptar en una composición de reactivos de 12 colores mediante la adición adicional de anticuerpos conjugados con fluorocromo contra los marcadores CD5 y CD21 (denominado "tubo de células B de 12 colores").
En un aspecto adicional, la invención describe una composición de reactivos (tubo SCID/RTE), que comprende un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: CD62L, CD4, CD45RO, CD31, HLA-DR, TCRyS o TCPPaP CD3 y CD8. Este tubo encuentra su uso, entre otros, en el análisis de una muestra obtenida de un sujeto que se evaluó positivamente en una prueba de cribado de SCID. La sospecha de (S)CID se puede basar, por ejemplo, en el cribado neonatal de rutina mediante el uso de los denominados círculos de escisión del receptor de células T (TREC), que son fragmentos de ADN circular generados durante la reordenación del receptor de células T. En los recién nacidos sanos, los TREC se producen en grandes cantidades, mientras que en los bebés con SCID, son apenas detectables.
En un aspecto adicional, la invención describe una composición de reactivos (tubo de subconjunto de células T), que comprende un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: CD27, CD4, CD45RO, CCR7, CD28, TCRyS o TCRaP CD3 y CD8, o los marcadores CD27, CD4, CD45RO, CCR7, HLA-DR, TCRyS o TCRaP, CD3 y CD8.
En otro aspecto adicional, la invención describe una composición de reactivos (tubo de cribado PID de 12 colores), que comprende un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra las siguientes combinaciones de marcadores: CD27, CD45RA, CD45, CD16, CD3, CD8, IgD, CD4, IgM, CD56, CD19, CCR7, CD38, ya sea HLA-DR o CD31, y ya sea TCRaP o TCRyS en la que el anticuerpo se encuentra dentro de los pares CD8/IgD, CD4/IgM y CD19/TCRap o CD19/TCRyS está conjugado con el mismo fluorocromo, y en el que, entre los diferentes pares, los fluorocromos son distinguibles. La composición de reactivos puede comprender anticuerpos dirigidos contra CD27, CD45RA, CD45, CD16, CD3, CD8, IgD, CD4, IgM, CD56, HLA-DR, CD19, CCR7, CD38 y TCRaP, en la que el anticuerpo dentro de los pares CD8/IgD, CD4/IgM y CD19/TCRaP están conjugados con el mismo fluorocromo. Alternativamente, la composición de reactivos puede comprender anticuerpos dirigidos contra CD27, CD45RA,
CD45, CD16, CD3, CD8, IgD, CD4, IgM, CD56, HLA-DR, CD19, CCR7, CD38 y TCRyS, en la que el anticuerpo dentro de los pares CD8/IgD, CD4/IgM y CD19/TCRyS está conjugado con el mismo fluorocromo.
En una realización preferida, una composición de reactivos de la invención comprende anticuerpos monoclonales. CD significa designación de conglomerados y es una nomenclatura para la identificación de antígenos específicos de la superficie celular definidos por anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos (monoclonales) contra los marcadores indicados se pueden obtener comercialmente de diversas compañías, incluyendo Becton Dickinson (BD) Biosciences, Dako, Beckman Coulter, CYTOGNOS, Caltag, Pharmingen, Exbio, Sanquin, Invitrogen y similares. La expresión "en el que entre los diferentes pares los fluorocromos se pueden distinguir en la que el anticuerpo dentro de ya sea de los pares está conjugado al mismo fluorocromo" significa que indican que ambos anticuerpos del primer par están conjugados al fluorocromo A y que ambos anticuerpos del segundo par se conjugan con el fluorocromo B. De este modo, dentro de cada par los fluorocromos son iguales, pero entre los diferentes pares los fluorocromos son distinguibles. Cada una de las composiciones de reactivos se puede usar como tal, por ejemplo, para el cribado de una enfermedad de inmunodeficiencia.
La invención, de este modo, también se refiere a kits de diagnóstico que comprenden una o más composiciones de reactivos. Sin embargo, las composiciones también se usan ventajosamente en combinación con una o más composiciones de reactivos adicionales, en particular composiciones de reactivos diseñadas para el cribado y clasificación adicionales de la enfermedad. La expresión "en combinación con" no se refiere a la combinación física o mezcla de las composiciones de reactivos, sino a su aplicación en etapas de análisis separados (consecutivos o paralelos) y combinación de los datos obtenidos de este modo.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un conjunto de al menos dos composiciones de reactivos que comprenden distintos anticuerpos conjugados con fluorocromos, comprendiendo dicho conjunto una primera composición de reactivos según la reivindicación 1, y al menos una composición de reactivos adicional como se describe anteriormente en este documento. De este modo, ambas composiciones de reactivos comprenden un panel distinto de anticuerpos, aunque algunos anticuerpos podrían estar presentes en ambas composiciones.
En una realización, la invención proporciona un conjunto de al menos dos composiciones de reactivos según la reivindicación 4. Por ejemplo, la invención proporciona un conjunto de al menos dos composiciones de reactivos según la reivindicación 5 o 6.
Por ejemplo, el tubo de cribado EuroFlow PID usado en combinación con un tubo de caracterización puede implicar dos etapas analíticas separadas en alícuotas separadas de la misma muestra biológica, cada una de las cuales usa una de las composiciones de reactivos, seguida de un registro y evaluación de los datos (véase la figura 1). El algoritmo de diagnóstico PID puede comprender un tubo de cribado y un conjunto posterior de tubos de clasificación (Figura 1). El tubo de selección PID tiene como objetivo la identificación, caracterización y enumeración de linfocitos y otros leucocitos en tejidos linfoides y hematopoyéticos primarios y secundarios, tales como las células B, T y NK, células presentadoras de antígenos, fagocitos y células plasmáticas; esto incluye células B del centro pre y post germinal (GC). Dependiendo del resultado del tubo de cribado PID, se pueden usar tubos adicionales diseñados para un análisis más detallado de los subconjuntos de células B y células T para la clasificación adicional de PID. Los tubos de células B Pre-GC, Post-GC y de isotipo Ig tienen como objetivo la identificación, caracterización y enumeración de subconjuntos de células B para la evaluación de defectos de diferenciación de células B asociados con tanto los bloques de maduración como los defectos específicos en la producción de una o varias subclases de inmunoglobulina (por ejemplo, CVID). Finalmente, el tubo de subconjunto de memoria/efector de células T y el tubo de anticuerpo SCID/rTe apuntan a la identificación, caracterización y enumeración de subconjuntos de células T para la evaluación de alteraciones en la producción, diferenciación y/o activación de células T (por ejemplo, SCID). Es muy conveniente si el panel de distintos fluorocromos es esencialmente el mismo para cada una de las composiciones de reactivos, y que se usan en total hasta ocho, diez o doce fluorocromos diferentes.
En una realización, cada composición de reactivos comprende anticuerpos conjugados con (1) azul pacífico (PacB), violeta brillante 421 (BV421) o Horizon V450; (2) naranja pacífica (PacO), Horizon V500 (Hv 500), BV510, naranja Khrome (KO) u OC515, (3) Horizon BB515, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o Alexa488, (4) ficoeritrina (PE), (5) peridinina clorofila proteína/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), PerCP o PE-TexasRed, (6) ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7), (7) aloficocianina (ApC) o Alexa647, y (8) aloficocianina/hilita 7 (APC-H7), APC-Cy7, Alexa680, APC-A750, APCC750 o Alexa700.
En otra realización, cada composición de reactivos comprende anticuerpos conjugados con (1) violeta brillante 421, (2) violeta brillante 510 (BV510), (3) violeta brillante 650 (BV650), (4) violeta brillante 786 (BV786), (5) isotiocianato de fluoresceína (FITC), (6) peridinina clorofila proteína/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), (7) a ficoeritrina (PE), (8) ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7), (9) aloficocianina (APC), y (10) aloficocianina/H7 (ApC-H7), APC-C750 o APC-Alexa750.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un kit de diagnóstico para inmunofenotipificación de citometría de flujo de leucocitos que comprende una composición de reactivos o al menos un conjunto de composiciones de
reactivos según la invención, junto con instrucciones para el uso, solución reguladora y/o muestras de control. Por ejemplo, se proporciona un kit de diagnóstico para uso en el diagnóstico in vitro de inmunodeficiencias primarias (PID), preferiblemente PID del sistema linfoide. En otra realización, el kit se usa para la identificación de alteraciones en subconjuntos de leucocitos en una enfermedad inmunológica, preferiblemente para el seguimiento inmune de pacientes con infecciones, enfermedades autoinmunes, alergias, después del trasplante, vacunación u otro tipo de terapia inmune, incluida la terapia con anticuerpos.
Las combinaciones preferidas de reactivos para uso en un kit de la invención incluyen lo siguiente (véanse las tablas 1, 2 y 3 para la combinación de anticuerpos en cada tubo):
• Tubos #2 y #3
• Tubos #2, #3, #4 y #5
• Tubos #1, #2 y #3
• Tubos #1, #2, #3, #4 y #5
• Tubos #9 y #10
• Tubos #8, #9 y #10
• Tubos # 1, #2, #3, #4, #5, #6, #7
• Y cualquier combinación de los mismos.
También se proporciona un método de citometría de flujo multicolor para inmunofenotipificación de leucocitos, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una primera parte alícuota de una muestra biológica que comprende leucocitos con una primera composición de reactivos de un conjunto según la invención, y poner en contacto al menos una segunda parte alícuota de dicha muestra con una composición de reactivos adicional de dicho conjunto;
(b) analizar los leucocitos en dichas partes alícuotas en un citómetro de flujo; y
(c) almacenar y evaluar los datos obtenidos.
La muestra puede ser cualquier muestra conocida como sospechosa de contener leucocitos. Las muestras biológicas de ejemplo incluyen sangre periférica, médula ósea, muestra de tejido tales como ganglios linfáticos, adenoides, bazo o hígado, u otro tipo de líquido corporal como líquido cefalorraquídeo, líquido vitreo, líquido sinovial, aspirado con aguja final, derrame pleural y ascitis. En una realización preferida, la muestra es una muestra de sangre periférica. En un aspecto específico, la muestra biológica se obtiene de un individuo con SCID, preferiblemente de un individuo que dio positivo en un cribado neonatal de rutina mediante el uso del llamado ensayo TREC basado en la detección de fragmentos de ADN circular generados durante el reordenamiento del receptor de células T. De acuerdo con lo anterior, la invención también proporciona un método de citometría de flujo de múltiples colores para la inmunofenotipificación de leucocitos, que comprende las etapas de:
(a) identificar una prueba individual positiva para SCID mediante el uso de un ensayo TREC;
(b) poner en contacto una parte alícuota de una muestra biológica que comprende leucocitos obtenidos de dicho individuo SCID positivo con una composición de reactivos de la invención, y poner en contacto al menos una segunda parte alícuota de dicha muestra con una composición de reactivos adicional de dicho conjunto;
(c) analizar los leucocitos en dichas partes alícuotas en un citómetro de flujo; y
(d) almacenar y evaluar los datos obtenidos.
El método comprende ventajosamente la combinación de la información inmunofenotípica de las poblaciones de células seleccionadas de múltiples tubos según los llamados cálculos de vecinos más cercanos en los cuales células individuales de una parte alícuota de una muestra se combinan con células individuales correspondientes de otra parte alícuota de la misma muestra, según sus marcadores y perfil de dispersión.
Preferiblemente, el método comprende el uso de software para la integración de datos y el análisis multidimensional de los archivos de citometría de flujo. Por ejemplo, los paneles de anticuerpos según la invención se pueden usar en combinación con las herramientas de software INFINICYT o cualquier otro programa de software, que estén disponibles comercialmente. El software INFINICYT se basa en procedimientos descritos recientemente para generar archivos con un número ilimitado de parámetros mediante la fusión de archivos de datos y el cálculo de la información derivada de la medición de marcadores en una muestra alícuota a las celdas individuales medidas en otras partes alícuotas de la misma muestra, usando diferentes combinaciones de reactivos de anticuerpos que solo
tienen solapamiento parcial (Orfao et al, Patente de los Estados Unidos 7,321,843), así como para comparaciones entre diferentes muestras o diferentes grupos de muestras (Orfao et al, Patente de los Estados Unidos 7,507,548).
Estas inmunotinciones de varios colores se pueden realizar según los denominados protocolos EuroFlow descritos por Van Dongen et al. (Leukemia 2012; 26: 1908) y por Kalina et al. (Leukemia 2012; 26: 1986), o que están disponibles a través de la página web EuroFlow (www.EuroFlow.org).
Descripción detallada
1. Análisis de citometría de flujo y composición de ejemplo de los paneles de anticuerpos en ocho, diez o doce fluorocromos distintos
Los paneles propuestos en el presente documento que comprenden ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo distintos se pueden reducir a un número inferior de tubos que proporcionan información comparable con combinaciones de ya sea diez o doce anticuerpos distintos conjugados con fluorocromeno, como se describe a continuación.
1.1. Análisis de citometría de flujo y composición de ejemplo de los paneles que comprenden anticuerpos conjugados con ocho fluorocromos distintos
La composición de reactivos de cribado EuroFlow PID se diseñó y aprobó para la evaluación de varias afecciones clínicas sospechosas, tales como infecciones recurrentes o persistentes, retraso en el desarrollo, presencia de niveles bajos de inmunoglobulina en suero y fracaso del desarrollo de anticuerpos en la exposición a antígenos. Estos reactivos tienen como objetivo la disección detallada de los subconjuntos de leucocitos circulantes, incluidas las células B, las células T, las células NK, los monocitos, las células dendríticas, los basófilos, los neutrófilos y los eosinófilos. Además, las células B y las células T se pueden clasificar en diferentes subconjuntos funcionales/de maduración. De acuerdo con lo anterior, las células B se dividen en células B pre-GC (que incluyen células B inmaduras/de transición e ingenuas), células B de memoria no conmutadas y conmutadas y células plasmáticas/plasmablastos. El compartimento de células T se puede dividir en diferentes subconjuntos funcionales según la expresión de TCRyS o TCRap, CD4 y CD8. Estos subconjuntos de células T se pueden subdividir aún más según su etapa de maduración en células ingenuas, de memoria, efectora y RA+ efectora.
La composición de un tubo de cribado PID de ejemplo se proporciona en la tabla 1. Esta composición de reactivos detecta defectos en la producción de células B, células T y células NK, junto con alteraciones (producción defectuosa pero también mayor) en la producción de monocitos, células dendríticas, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Sin embargo, en la mayoría de los casos, este tubo no permite la clasificación precisa de los defectos detectados de células T y células B. Esto por lo general requiere una mayor caracterización con tubos adicionales (Figura 1).
Los paneles de anticuerpos de células B Pre-GC, Post-GC y de Isotipo Ig consisten en combinaciones dedicadas a la caracterización en profundidad de defectos relacionados con niveles de inmunoglobulina disminuidos o ausentes en el suero y/u otros tejidos (por ejemplo, mucosa). Para ciertas PID, especialmente las deficiencias de anticuerpos con defectos en el sistema de células B, se requiere un análisis más detallado para estudiar en detalle las subpoblaciones de células B. Las células B se originan a partir de células madre de la médula ósea y se diferencian a través de múltiples etapas de diferenciación en células B inmaduras que abandonan la médula ósea y entran en la periferia, incluida la sangre que se analiza con análisis de citometría de flujo en el diagnóstico de PID. En la periferia, la célula B se encuentra con el antígeno, por lo que puede sufrir una reacción en el centro germinal (GC). En consecuencia, en la sangre, están presentes células B que aún no experimentaron una reacción del centro germinal (células B pre-GC) o que ya sufrieron una reacción del centro germinal (células B post-GC).
Estos subconjuntos post-GC se pueden subdividir adicionalmente según sus isotipos de Ig: IgM, IgD, IgE, IgG (incluyendo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) e IgA (incluyendo IgA1, IgA2), o IgM, IgD, IgG (incluyendo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) e IgA (incluyendo IgA1, IgA2). Estos paneles incluyen marcadores para la identificación de defectos asociados con la producción de diferentes subconjuntos de células B pre-GC, incluyendo células B inmaduras/transitorias, CD5+ ingenuas y CD5' ingenuas, la producción de subconjuntos post-GC, incluyendo las células B de memoria y plasmablastos/células plasmáticas, y la clasificación de tanto las células B de memoria como los plasmablastos/las células plasmáticas según el isotipo total en un solo tubo (IgM, IgD, IgG, IgA, IgE) o en otra realización IgM, IgD, IgG e IgA y/o la subclase de inmunoglobulina específica expresada con la combinación de dos tubos (IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2).
Para la PID del sistema linfoide, también se prefiere el análisis detallado de los subconjuntos de células T para hacer un diagnóstico correcto. Para la inmunodeficiencia combinada grave (SCID), las células T presentes en la sangre periférica pueden no ser autólogas, pero pueden ser células T maternas derivadas de forma transplacentaria. Es importante hacer una distinción entre las células T maternas y las células T autólogas que recientemente emigraron del timo, llamadas emigrantes tímicos recientes (RTE). Esto requiere un análisis de citometría de flujo adicional que solo es necesario si se sospecha de SCID, por ejemplo, sobre la base de un examen de cribado (neonatal) basado en la detección de los llamados círculos de escisión del receptor de células T (TREC). De acuerdo con lo anterior, la
invención describe dos tubos destinados a la identificación de estos y otros subconjuntos adicionales de células T: uno para el análisis de subconjuntos de células T y un tubo SCID/RTE específico.
Los fluorocromos apropiados para conjugar anticuerpos para uso en la presente invención contra los marcadores citados son conocidos en la técnica. Como se entenderá, los fluorocromos usados dentro de una composición de reactivos se deben distinguirse entre sí mediante citometría de flujo. Los fluorocromos se seleccionan preferiblemente por brillo, solapamiento espectral limitado y necesidad limitada de compensación, estabilidad, etc. (véase: Kalina et al. Leukemia 2012; 26: 1986).
En la tabla 1 de la presente solicitud, el siguiente panel de fluorocromos es de uso particular: (1) azul pacífico (PacB), violeta brillante 421 (BV421) o Horizon V450, (2) naranja pacífico (PacO), Horizon V500 (HV500), BV510, naranja Khrome (KO) u OC515, (3) Horizon BB515, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o Alexa488, (4) ficoeritrina (PE), (5) peridinina clorofila proteína/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), PerCP o PE-TexasRed, (6) ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7), (7) aloficocianina (APC) o Alexa647, y (8) aloficocianina/hilita 7 (APC-H7), APC-Cy7, Alexa680, APC-A750, APC-C750 o Alexa700.
Tabla 1. Composiciones de reactivos de 8 colores de ejemplo.
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 CD19
# 1 tubo de cribado CD27 CD45RA CD8 CD16 CD4
IgD CD56 IgM TCRy8 o CD3 CD45
TCRaP
#2 tubo Pre-GC CD27 IgM CD38 CD5 IgD CD19 CD21 CD24
(IgE)*
#3 tubo Post-GC CD27 IgM IgG (IgA)
* IgD CD19 CD21 CD38 IgA
IgG3 IgG1
#4 tubo 1 isotipo Ig CD27 IgM IgD CD19 CD21 CD38
IgG2 IgG2
IgA1 IgA1
#5 tubo 2 isotipo Ig CD27 IgM IgD CD19 CD21 CD38
IgG4 IgA2
#6 tubo de subconjunto de
lulas T CD27 CD28 CD8 CCR7 CD4 TCRy8 o
cé TCRaP CD3 CD45RO
#7 SCID/RTE CD62L HLA-DR CD8 CD31 CD4 TCRy8 o
TCRaP CD3 CD45RO asterisco * indica que la composición puede contener un anticuerpo contra IgE y un segundo anticuerpo contra IgA
La invención también describe un método para el diagnóstico por citometría de flujo de PID, que comprende las etapas de proporcionar una muestra biológica de un sujeto humano y poner en contacto al menos una parte (alícuota) de la muestra con una composición de reactivos proporcionada en este documento. Cualquier tipo de muestra que se sepa o se sospeche que contiene leucocitos se puede usar directamente, o después de lisar los glóbulos rojos no nucleados, o después de la centrifugación de densidad, o después de los procedimientos de clasificación de células.
1.2. Análisis de citometría de flujo y composición de los paneles que comprenden anticuerpos conjugados con diez fluorocromos distintos
Se han diseñado paneles alternativos que comprenden anticuerpos conjugados con diez fluorocromos distintos que proporcionan información comparable a la de los tubos de la sección 1.1. Toda la información contenida tanto en los tubos de células B pre-GC y post-GC de los paneles de la sección 1.1 está contenida aquí en un solo tubo (tubo de células B Pre-GC Post-GC). Además, la clasificación de las células B de memoria y los plasmablastos/las células plasmáticas según la subclase de inmunoglobulina expresada (IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2 en los dos tubos de células B de isotipo Ig de los paneles 1.1) se pueden realizar en un solo tubo (tubo de células B de isotipo Ig). Además, el tubo SCID/RTE y los tubos de subconjunto de células T ahora se combinan en un tubo de subconjunto de células T, que contiene los marcadores CD31 y CD61L. Finalmente, el tubo de cribado EuroFlow ofrece una mejor discriminación de los subconjuntos de maduración de células T en función de la expresión de
CCR7 (por ejemplo, memoria central frente a periférica), mientras que la inclusión de CD38 permite la discriminación de células B inmaduras/transitorias frente a ingenuas y ayuda para alcanzar una identificación más precisa de plasmablastos/células plasmáticas.
En la tabla 2 de la presente solicitud, el fluorocromo número 1 corresponde a violeta brillante 421 (BV421), número 2 a violeta brillante 510 (BV510), número 3 a violeta brillante 650 (Bv 650), número 4 a violeta brillante 786 ( BV786), número 5 a isotiocianato de fluoresceína (FITC), número 6 a peridinina clorofila proteína/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), número 7 a ficoeritrina (PE), número 8 a ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7), número 9 a la aloficocianina (APC), y el número 10 a la aloficocianina/H7 (APC-H7), APC-C750 o APC-Alexa750. Dicha combinación de fluorocromo se usa solo como ejemplo y no debe limitar el uso de otras combinaciones de fluorocromos compatibles, también contenidos en la presente invención.
Tabla 2. Composiciones de reactivos de 10 colores de ejemplo.
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 # 8 tubo de CD27 CD45RA CD45 CD3 CD8 CD4 CD16 CD19 CCR7 CD38 cribado IgD IgM CD56
TCRy8 o
TCRaP
#9 tubo Pre- CD27 IgM CD24 CD19 IgE CD5 IgG IgD CD21 CD38 GC+post- GC IgA IgA
#10 tubo de CD27 IgM CD24 CD19 IgG3 IgA1 IgG1 IgD IgA1 CD38 isotipo Ig IgG2 IgA2 IgG2 IgG4
#11 tubo de CD27 HLA-DR CD45RO CD3 CD8 CD4 CCR7 TCRy8 o CD31 CD62L subconjunto de TCRap
células T
1.3. Análisis de citometría de flujo y composición de los paneles que comprenden anticuerpos conjugados con doce fluorocromos distintos
Se han diseñado composiciones de reactivos alternativos que comprenden anticuerpos conjugados a doce fluorocromos distintos que proporcionan información comparable a la de los tubos de los paneles 1.1 descritos anteriormente. Toda la información contenida en los tubos tanto de Pre-GC, Post-GC como de isotipo Ig de los paneles 1.1 y 1.2 está aquí contenida en un solo tubo (tubo de células B). Además, junto con la información adicional proporcionada por el tubo de cribado PID EuroFlow de los paneles 1.3, el tubo PID EuroFlow de doce colores se puede usar para la identificación de células T RTE, mejorando el análisis de los pacientes con SCID y permite la discriminación de subconjuntos de células NK basados en CD16 frente a la expresión de CD56.
En la tabla 3 de la presente solicitud, el fluorocromo número 1 corresponde a violeta brillante 421 (BV421), número 2 a violeta brillante 510 (BV510), número 3 a violeta brillante 650 (BV650), número 4 a violeta brillante 711 (BV711), número 5 a violeta brillante 786 (BV786), número 6 a isotiocianato de fluoresceína (FITC), número 7 a peridinina clorofila proteína/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), número 8 a ficoeritrina (PE), número 9 a PE-CF594, número 10 a ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7), número 11 a aloficocianina (APC), y número 12 a aloficocianina/H7 (APC-H7), APC-C750 o APC-Alexa750. Tal combinación de fluorocromo se usa solo como ejemplo y no debe limitar el uso de otras combinaciones de fluorocromos compatibles, también contenidos en la presente invención.
Leyenda para las figuras
Figura 1. Algoritmo de la estrategia para la inmunofenotipificación de citometría de flujo para el cribado y clasificación de inmunodeficiencias primarias (PID). Panel A. Sobre la base de varias entradas de parámetros clínicos y de laboratorio, las muestras de sangre de pacientes con sospecha de PID se criban con el tubo de cribado de PID de 8 o 10 colores. En función de los resultados obtenidos, se aplican tubos de clasificación de células T y/o B de 8 o 10 colores adicionales de una manera en etapas. En caso de sospecha de (S) CID, tanto el tubo de cribado de PID como los dos tubos de células T (SCID/RTE y el tubo de subconjunto de células T) se pueden aplicar juntos ("rama de células T" en el lado izquierdo). En caso de sospecha de PAD, tanto el tubo de cribado PID como el (los) tubo (s) Pre-GC Post-GC pueden aplicarse juntos, opcionalmente seguido de un análisis mediante el uso de tubos de isotipo Ig ("rama de células B a la derecha del lado de la mano). Si los síntomas clínicos son lo suficientemente claros, se puede omitir el tubo de cribado de PID. Panel B. Variante de 12 colores del algoritmo de diagnóstico EuroFlow, que consta de dos tubos de 12 colores: el tubo de cribado de PID, que también incluye el análisis del subconjunto de células T y el tubo de clasificación de células B, que combina los análisis Pre-GC, Post-GC y de isotipo Ig. Tener en cuenta que los tubos de células B precursoras no están incluidos en esta solicitud de patente, ya que varios tubos de > 8 colores informativos ya se han propuesto (Van Dongen et al. Leukemia 2012; 26: 1986). Abreviaturas: GC, centro germinal; PAD, deficiencia de anticuerpos primarios; RTE, emigrante tímico reciente; SCID, inmunodeficiencia combinada grave.
Figura 2. Generación de un análisis del componente principal de referencia 1 (PC1) frente a la representación de PCA2 en un espacio n-dimensional para la discriminación de los subconjuntos de linfocitos identificados con la combinación de cribado PID de marcadores.
Los archivos de datos de 5 donantes sanos se fusionaron y se identificaron subconjuntos de linfocitos de interés mediante el uso de gráficos bivariados. Este análisis se usó para definir en un espacio n-dimensional el mejor análisis de componente principal 1 (PC1) frente a la representación de PCA2 para discriminar estos subconjuntos. La representación PCA de los datos se reanuda en las curvas de desviación estándar (SD) 2x que se usarán como referencia para el análisis automático supervisado de las muestras.
Figura 3. Aplicación de la representación del análisis de componentes principales (PCA) de los distintos subconjuntos de leucocitos presentes en la sangre periférica (PB) de los archivos de datos de referencia (panel superior) para el análisis supervisado de muestras de PB de donantes sanos y pacientes de inmunodeficiencia primaria analizados con la combinación de cribado de PID de marcadores.
El análisis del componente principal de referencia 1 (PC1) frente a la representación de PCA2 se generó a partir de 5 archivos de datos de donantes sanos (paneles superiores) analizados con la combinación de cribado de marcadores EuroFlow PID. Se analizaron diferentes muestras contra las representaciones de prototipo PC1 frente a PC2 de referencia definidas en base a la distribución de subconjuntos de sangre periférica en los cinco donantes sanos teñidos, que incluyen: un donante sano, un paciente con STAT3 mutado y dos pacientes con SCID con diferentes defectos genéticos: La cadena gamma del receptor IL2 (IL2RG) y el gen activador de la recombinación 2 (RAG2), todas las muestras se tiñeron y adquirieron en condiciones idénticas/comparables.
Figura 4: Identificación con la combinación de marcadores Pre-GC de marcadores de los principales subconjuntos de células B de sangre periférica (PB) circulante mediante el uso de gráficos bidimensionales frente al análisis de componentes principales (PCA) n-dimensional.
Análisis de los subconjuntos de maduración de células B (FS/SSloCD19+) en circulación identificados dentro de 2x106 leucocitos PB mediante el uso de los marcadores del tubo Pre-GC: Inmaduros (CD5+ CD27' CD38++ smIgM++ smIgD+), células B CD5+ y CD5' ingenuas (CD27‘ CD38>+d smIgM+ smIgD++), células B de memoria Ig no conmutadas e Ig conmutadas (CD5'CD27+ CD38' smIgM+ smIgD++ y CD5' CD27+/_ c D38‘ smIgM' smIgD', respectivamente), y células plasmáticas (CD5‘ CD27++ CD38+++). El panel A muestra la identificación de subconjuntos biológicamente relevantes de células B mediante el uso del número mínimo de gráficos bivariados requeridas para una combinación de 5 marcadores (tres gráficos bivariados/población celular) frente a B) un componente principal 1 (PC1) frente a la representación de PC2 de un espacio de 5 dimensiones.
Figura 5: Representación del análisis de componentes principales (PCA) de los distintos subconjuntos de células B presentes en la sangre periférica (PB) de una muestra normal/de referencia (panel A) y muestras de PB de pacientes inmunodeficientes primarios con distribución alterada analizada con el tubo de Pre-GC. El análisis de la distribución de células B de sangre periférica en pacientes diagnosticados de: inmunodeficiencia variable común (CVID) y agammaglobulinemia, se muestra en comparación con la PC1 de referencia frente a la representación prototipo de PC2 definida sobre la base de la distribución de los subconjuntos de células B PB de seis donantes sanos se tiñeron con el tubo Pre-GC y se adquirieron en condiciones idénticas/comparables.
Figura 6: Aplicación del tubo de isotipo para la disección de células B de memoria conmutada y plasmoblastos/células plasmáticas en la sangre periférica de los donantes sanos y los pacientes inmunodeficientes primarios.
Distribución de células B de memoria conmutada (smIgMD-CD19+CD38-) y plasmoblastos/células plasmáticas (CD19+ CD27++ CD38+++) según la expresión de la membrana superficial (sm) de las diferentes subclases de la cadena pesada de inmunoglobulina (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) en 5x106 leucocitos de sangre periférica analizada con el tubo de isotipos en muestras de un adulto sano (paneles superiores), de un individuo con deficiencia selectiva de IgA (paneles centrales) y de pacientes con CVID (paneles inferiores). No se detectaron plasmablastos/células plasmáticas en la sangre periférica del paciente con CVID en una frecuencia superior a 0.001 células/|iL.
Figura 7. Disección del compartimiento de las células B de la sangre con el tipo de célula B de 12 colores (incluida la detección del isotipo IGH), lo que resulta en la detección y cuantificación de ~25 subconjuntos de células B diferentes (subconjuntos de células B ingenuas, subconjuntos de células B de memoria, y subconjuntos de células plasmáticas).
Seccion experimental
El poder del enfoque de la citometría del flujo multicolor descrito en este documento se basa en la combinación de los conjuntos de marcadores y el uso de los análisis multivariados para la identificación de células normales (por ejemplo, Células B precursoras normales, linfocitos B normales y células plasmáticas normales) y la comparación de las poblaciones celulares en las muestras de pacientes sospechosos de tener PID con las poblaciones celulares en las muestras de controles sanos. Para este propósito, se usa un poderoso análisis multivariado para evaluar la contribución de cada marcador individual en el panel a todos los otros marcadores en la combinación para separar las poblaciones de leucocitos. Esta estrategia se usó para seleccionar combinaciones de los marcadores más discriminatorios en varias rondas secuenciales de pruebas experimentales. Debido a estas múltiples rondas de pruebas en muestras de controles sanos y muestras de pacientes con PID bien definidos, las combinaciones de anticuerpos finales propuestas se volvieron extremadamente fuertes cuando se usaron en combinación con el análisis de componentes principales o el análisis canónico, específicamente con la herramienta de separación automática de la población (APS) del software Infinicyt, para que el valor añadido (independiente) de cada marcador se use en una sola etapa de análisis
La sección experimental a continuación proporciona ejemplos representativos de los resultados de los extensos estudios experimentales para la aplicación del tubo de cribado EuroFlow PID (Ejemplo 1), el tubo de células B EuroFlow PID pre-GC (Ejemplo 2), el tubo de células B de isotipo Ig EuroFlow PID (Ejemplo 3) y tubo de subconjunto de células T EuroFlow (Ejemplo 4).
Los siguientes ejemplos (individualmente no son parte de la invención como se reivindica) demuestran la potencia de los tubos EuroFlow según la invención cuando se analizan, por ejemplo con análisis de componentes principales, específicamente con la herramienta APS. Según las múltiples rondas de pruebas, las combinaciones de anticuerpos finales parecían poder separar los diferentes subconjuntos de leucocitos, linfocitos, células B y subconjuntos de células T (Figura 3, Figura 4 y Figura 6). Basado en el enfoque completamente estandarizado, los patrones de subconjuntos de leucocitos y linfocitos de diferentes controles sanos son completamente comparables entre diferentes centros (Figura 2, Figura 4 y Figura 6). Los resultados de los controles sanos han proporcionado plantillas únicas para el cribado y clasificación de los pacientes con PID al trazar los resultados de los pacientes con PID en comparación con las plantillas obtenidas de los controles sanos (véanse la figura 3, la figura 5 y la figura 6).
De manera importante, los tubos PID analizados con las herramientas de software APS están diseñados para proporcionar plantillas de poblaciones de leucocitos relacionadas. Esto es particularmente visible para los diversos subconjuntos de células B y células T, que muestran relaciones cercanas como en las vías de maduración (Figura 2 y Figura 3). Al trazar los resultados de las muestras de pacientes contra las plantillas de APS de controles sanos, se visualiza fácilmente la distribución alterada de los subconjuntos de leucocitos y linfocitos en pacientes con PID. De hecho, la figura 3, la figura 5 y la figura 6 muestran con elegancia qué subconjuntos están ausentes o (muy) reducidos en los pacientes con PID y qué bloque de maduración está presente en los pacientes en particular, dependiendo del tipo de defecto.
Los tubos propuestos de 8 colores, 10 colores y 12 colores (Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3) que se proporcionan en este documento no solo son aplicables para el diagnóstico y la clasificación de pacientes con PID. También son perfectamente apropiados para el seguimiento inmunológico de pacientes con infecciones, enfermedades autoinmunes, alergias, posttrasplante, vacunación u otro tipo de terapia inmune, incluida la terapia con anticuerpos. En contraste con otros enfoques de inmunofenotipificación, los reactivos y métodos descritos en este documento ofrecen un enfoque más profundo e integrado con una poderosa visualización de la distribución alterada entre pacientes y controles, así como dentro de los pacientes a lo largo del tiempo durante el seguimiento del curso de la enfermedad y los procedimientos de recuperación.
Ejemplos
Ejemplo 1. Panel de anticuerpos de cribado EuroFlow PID
Los tubos de cribado se pueden usar para detectar alteraciones en la producción de subconjuntos de leucocitos asociados con defectos de los tejidos linfoides primarios (BM y timo), tales como defectos de STAT3, IL2RG y RAG2 (Figura 3), aunque otros defectos relacionados con la respuesta en tejidos linfoides secundarios, también se pueden detectar (por ejemplo, defectos de CD40L). Otro ejemplo de aplicación podría ser el seguimiento de resultados después del trasplante de células madre hematopoyéticas. Estos tubos se pueden usar solos o en combinación con tubos de células B y/o tubos de células T para una descripción más detallada de estos subconjuntos cuando sea necesario, por ejemplo, para el seguimiento inmune.
El tubo de cribado EuroFlow PID se probó en 20 muestras de sangre de 15 niños sanos y 5 niños con infecciones recurrentes. Sobre la base de los valores de referencia preliminares, establecidos para los 15 niños sanos, los 5 pacientes mostraron números de linfocitos alterados en la sangre, con diferentes perfiles: 1) Se encontró una distribución alterada de células B ingenuas/memoria y células T en un paciente con aumento IgE en suero que luego se confirmó que tenía un defecto STAT3; 2) se descubrió que disminuyeron los números de células T y NK con recuentos normales de linfocitos B en dos pacientes confirmados que tienen una mutación en el gen IL2RG; y 3) los 2 casos restantes mostraron números significativamente reducidos de linfocitos B y T en la sangre, que se demostró además que estaban asociados con un defecto del gen RAG2. Los ejemplos de estos pacientes se ilustran en la figura 3.
Ejemplo 2. Tubos de células B EuroFlow
Entre otras aplicaciones, estos tubos se pueden usar para la detección de bloqueos de maduración en la médula ósea (por ejemplo, agammaglobulinemia; Figura 5), defectos en la respuesta de las células B en los ganglios linfáticos y/u otros tejidos linfoides (por ejemplo, CVID); Figura 5) y defectos específicos de isotipo (por ejemplo, deficiencia selectiva de IgA; Figura 6). Estos tubos también se podrían usar para controlar las inmunodeficiencias secundarias inducidas, tales como las inducidas por terapias de anticuerpos en hematooncología.
Diez muestras de médula ósea (5 muestras de médula ósea normal de 5 donantes sanos diferentes y 5 muestras de médula ósea de 5 pacientes diferentes que sufrieron una infección, que mostraron una disminución significativa en el número de células B después de teñir una muestra de sangre con el tubo de cribado EuroFlow) se tiñeron con los tubos de células B EuroFlow. Para este propósito, se usó una técnica de preparación de la muestra de lisis, tinción y luego lisis/fijación, que consiste en aplicar secuencialmente el método de lisis a granel EuroFlow, seguido de tinción con anticuerpos durante 30 minutos a temperatura ambiente, y la fijación final con lisis con 10 mL de la solución FACSLyse (Becton Dickinson Biosciences, San José, CA, EE. UU.) diluida 1/10 (vol/vol) en agua destilada durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se encontró un bloqueo completo de la maduración de las células B en las primeras etapas de la maduración en 3 casos, dos de los cuales correspondían a pacientes con agammaglobulinemia con un defecto del gen BTK, mientras que el tercer niño estaba bajo tratamiento con el anticuerpo monoclonal Rituximab anti-CD20). En los otros dos pacientes, la producción de células B en la médula ósea normal en ausencia de células plasmáticas y un número significativamente menor de células B de memoria IgA+ e IgG+ conmutadas, ambos pacientes finalmente fueron diagnosticados de CVID.
Ejemplo 3. Tubos de células B de isotipo Ig para el análisis de donantes sanos y pacientes con CVID.
Los tubos de isotipo de Ig EuroFlow se han analizado en muestras de sangre de 10 adultos sanos, 5 individuos con deficiencia de IgA selectiva y 5 pacientes con CVID (Figura 6). Se han calculado valores de referencia preliminares para la distribución de las células B de memoria IgM+D-/+, IgG1+, IgG2+, IgG3+, IgG4+, IgA1+, IgA2+, IgM-D+ (8-55, 21 33, 4-20, 3-10, <0.01-2, 8-25, 2-11, y <0.01-2 células/^L) y células plasmáticas/plasmablastos (0.5-4.6, 0.3-1.0, 0.2 1.2, <0.01-0.2, <0.01-0.3, 0.4-3.8, 0.4-0.9, y <0.01-0.1 células/^L). La evaluación de las mismas combinaciones de anticuerpos en los pacientes con CVID ha demostrado que, aunque la falta de células plasmáticas/plasmablastos en circulación (<0.01) parece ser una característica común en todos los pacientes investigados, los subconjuntos de células B que expresan el isotipo Ig dentro del compartimiento de células B de memoria se ve afectado de manera diferente entre los diferentes pacientes, lo que sugiere que el estado del compartimiento de células B de memoria podría estar directamente asociado con el nivel de inmunocompetencia frente a diferentes antígenos en estos pacientes. Se han observado alteraciones comparables en individuos con deficiencia selectiva de IgA, pero restringidos a los compartimentos de IgA1 e IgA2 de las células B de memoria y las células plasmáticas/plasmablastos.
Ejemplo 4. Paneles de anticuerpos de células T
Los paneles de anticuerpos de células T están compuestos por conjuntos de anticuerpos que apuntan a una descripción más detallada de los subconjuntos de células T que incluyen la identificación de células B de memoria central frente a efectora, la identificación de células T diferenciadas terminalmente y la cuantificación de células T CD4+ tímicos recientes emigrantes (RTE). Estos paneles están especialmente recomendados para la clasificación diagnóstica de pacientes con SCID, pero también son de interés para la identificación de otras alteraciones relacionadas con la producción de células T (por ejemplo, el síndrome de Di George).
Se estudiaron un total de 5 muestras de sangre de recién nacidos que presentaban alteraciones de la facila, enfermedad cardíaca e hipocalcemia con el panel de anticuerpos de células T EuroFlow mediante el uso de métodos
convencionales de inmunofluorescencia directa multicolor mediante el uso de tubos TrueCOUNT; inmediatamente después de la tinción, las muestras de sangre teñidas se midieron en un citómetro de flujo FACSCANTO II (Becton/Dickinson Biosciences, San José CA, EE. UU.). Dos casos mostraron recuentos de células T normales y una distribución normal de los distintos subconjuntos de células T, mientras que en los otros tres casos, los recuentos de células T disminuyeron, en particular, los recuentos de células T c D4+ (por debajo de 400 células T CD4+ por microlitro de sangre), se detectaron; además, los tres casos mostraron números muy bajos de células T CD31+ CD4 (tímicos recientes emigrantes), lo que sugiere una disminución en la producción de células T en el timo. Los 3 casos mostraron una deleción genética en el cromosoma 22q11.2, compatible con el diagnóstico del síndrome de Di George.
REFERENCIAS
Al Herz W, Aziz Bousfiha A, Casanova JL, Chatila T, Conley ME, Cunningham-Rundles C, Etzioni A, Franco JL, Gaspar HB, Holland S, Klein C, Nonoyama S, Ochs H, Oksenhendler E, Picard C, Puck J, Sullivan K, Tang M. Primary Immunodeficiency Diseases: An Update on the Classification from the International Union of Immunological Societies Expert Committee for Primary Immunodeficiency. Front Immunol 2014;5:162
Biancotto A, Fuchs JC, Williams A, Dagur PK, McCoy JP Jr.High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J Immunol Meth 2011;363:245-61.
Boldt A, Borte S, Fricke S, Kentouche K, Emmrich F, Borte M, Kahlenberg F, Sack U. Fight-color immunophenotyping of T-, B-, and NK-cell subpopulations for characterization of chronic immunodeficiencies. Cytometry B Clin Cytom 2014; 86: 191-206.
Duffy D, Rouilly V, Libri V, Hasan M, Beitz B, David M, Urrutia A, Bisiaux A, Labrie ST, Dubois A, Boneca IG, Delval C, Thomas S, Rogge L,Schmolz M, Quintana-Murci L, Albert ML; Milieu Intérieur Consortium. Functional analysis via standardized whole-blood stimulation systems defines the boundaries of a healthy immune response to complex stimuli. Immunity. 2014;40:436-50.
Kalina T, Flores-Montero J, van der Velden VH, Martin-Ayuso M, Bottcher S, Ritgen M, Almeida J, Lhermitte L, Asnafi V, Mendonga A, de Tute R, Cullen M, Sedek L, Vidriales MB, Pérez JJ, te Marvelde JG, Mejstrikova E, Hrusak O, Szczepanski T, van Dongen JJ, Orfao A; EuroFlow Consortium (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708). EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia 2012; 26: 1986 2010.
Maecker HT, McCoy JP, Nussenblatt R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project_Nature Reviews 2012; 12: 191-200.
Mishra A, Gupta M, Dalvi A, Ghosh K, Madkaikar M. Rapid Flow cytometric prenatal diagnosis of primary immunodeficiency (PID) disorders. J Clin Immunol 2014; 34: 316-322.
O'Gorman MR, Zollett J, Bensen N. Flow cytometry assays in primary immunodeficiency diseases. Methods Mol Biol 2011; 699: 317-335.
Oliveira JB, Notarangelo LD, Fleisher TA. Applications of flow cytometry for the study of primary immune deficiencies. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2008; 8: 499-509.
Orfao de Matos Correia e Vale JA, Pedreira CE, Sobral Da Costa E. Method for generating new flow cytometry data files containing an infinite number of dimensions based on data estimation. US7321843 B2, 30 September 2005 Orfao de Matos Correia e Vale JA, Pedreira CE, Sobral Da Costa E. Multidimensional detection of aberrant phenotypes in neoplastic cells to be used to monitor minimal disease levels using flow cytometry measurements. US7507548 B2, 4 March 2003
Streitz M, Miloud T, Kapinsky M, Reed MR, Magari R, Geissler EK, Hutchinson JA, Vogt K, Schlickeiser S, Kverneland AH, Meisel C, Volk HD, Sawitzki B. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant Res 2013; 2: 17.
Van Dongen JJM, Orfao de Matos Correia e Vale JA, Flores-Montero J, Almeida PJM, Van der Velden VHJ, Bottcher S, Rawstron AC, De Tute RM, Lhermitte LBS, Asnafi V, Mejstríková E, Szczepanski T, Da Silva Lucio PJM, Marín Ayuso M, Pedreira CE. Methods, reagents and kits for flow cytometric immunophenotyping. WO2010140885 A1, 3 June 2009.
Van Dongen JJ, Lhermitte L, Bottcher S, Almeida J, van der Velden VH, Flores-Montero J, Rawstron A, Asnafi V, Lécrevisse Q, Lucio P, Mejstrikova E, Szczepanski T, Kalina T, de Tute R, Brüggemann M, Sedek L, Cullen M, Langerak AW, Mendonga A, Macintyre E, Martin-Ayuso M, Hrusak O, Vidriales MB, Orfao A; EuroFlow Consortium ' ' (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708). EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia 2012; 26 :1908-1975.
Claims (15)
1. Una composición de reactivos para la inmunofenotipificación por citometría de flujo de leucocitos que comprende anticuerpos conjugados con fluorocromo marcados de manera específica y dirigidos contra la siguiente combinación de marcadores:
(a) CD27, IgM, IgA, IgG, IgD, CD19, CD21, CD38, e IgE.
2. Composición de reactivos según la reivindicación 1, que comprende anticuerpos conjugados con fluorocromos contra CD27, IgM, IgA, IgE, IgG, IgD, CD19, CD21 y CD38, en la que la composición comprende dos anticuerpos marcados claramente contra IgA y en la que los anticuerpos están dentro de los pares IgE/IgA e IgG/IgA se conjugan con el mismo fluorocromo y en el que entre los diferentes pares los fluorocromos son distinguibles.
3. Composición de reactivos según la reivindicación 2, que comprende además anticuerpos conjugados con fluorocromo contra los marcadores CD24 y CD5.
4. Un conjunto de al menos dos composiciones de reactivos, comprendiendo dicho conjunto una combinación de una composición de reactivos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y al menos una composición de reactivos que comprende anticuerpos conjugados con fluorocromo marcados claramente dirigidos contra una de las siguientes combinaciones de marcadores:
(b) CD27, IgM, CD38, CD5, IgD, CD19, CD21 y CD24;
(c) CD27, CD45RA, CD8, IgD, CD16, CD56, CD4, IgM, CD19, CD3, CD45, y ya sea TCR«p o TCRyS, en los que los anticuerpos dentro de los pares CD8/IgD, CD16/CD56, CD4/IgM y CD19/TRCaB o CD19 /TCRyS están conjugados al mismo fluorocromo, y en el que entre los diferentes pares los fluorocromos son distinguibles;
(d) CD27, IgM, IgG3, IgG2, IgG1, IgD, CD19, CD21 y CD38; la composición que comprende dos anticuerpos marcados claramente contra IgG2 y en la que los anticuerpos dentro de los pares IgG3/IgG2 e IgG1/IgG2 están conjugados con el mismo fluorocromo y en el que entre los diferentes pares, los fluorocromos son distinguibles; (e) CD27, IgM, IgA2, IgA1, IgG4, IgD, CD19, CD21 y CD38; la composición que comprende dos anticuerpos marcados claramente contra IgA1 y en la que los anticuerpos dentro de los pares IgA1/IgG4 e IgA1/IgA2 están conjugados con el mismo fluorocromo y en el que entre los diferentes pares, los fluorocromos son distinguibles; (f) CD62L, CD4, CD45RO, CD31, HLA-DR, TCRyS o TCR«p, CD3 y CD8;
(g) CD27, CD4, CD45RO, CCR7, CD28, TCRyS o TCRaP, CD3 y CD8; o
(h) CD27, CD45RA, CD45, CD16, CD3, CD8, IgD, CD4, IgM, CD56, CD19, CCR7, CD38, ya sea CD31 o HLADR, y ya sea TRCap o TCRyS, en la que los anticuerpos dentro de los pares CD8/IgD, CD4/IgM y CD19/TRCap o CD19 /TCRyS se conjugan al mismo fluorocromo, y en el que entre los diferentes pares, los fluorocromos son distinguibles.
5. Conjunto según la reivindicación 4, que comprende la combinación de al menos la composición de reactivos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y la composición de reactivos de la reivindicación 4 sub (b).
6. Conjunto según la reivindicación 5, que comprende además la composición de reactivos de la reivindicación 4 sub (d) y/o sub (e), que comprende además preferiblemente las composiciones de reactivos de la reivindicación 4 sub (d) y sub (e).
7. Composición de reactivos o conjunto de composiciones de reactivos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que cada composición de reactivos comprende anticuerpos conjugados a (1) azul pacífico (PacB), violeta brillante 421 (BV421) o Horizon V450; (2) naranja pacífica (PacO), Horizon V500 (HV500), BV510, naranja Khrome (KO) u OC515; (3) Horizon BB515, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o Alexa488; (4) ficoeritrina (PE); (5) peridinina clorofila proteína/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), PerCP o PE-TexasRed; (6) ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7); (7) aloficocianina (APC) o Alexa647; y (8) aloficocianina/hilita 7 (APC-H7), APC-Cy7, Alexa680, APC-A750, APC-C750 o Alexa700.
8. Composición de reactivos o conjunto de composiciones de reactivos según la reivindicación 7, en la que cada composición de reactivos comprende anticuerpos conjugados con (1) violeta brillante 421; (2) violeta brillante 510 (Bv 510); (3) violeta brillante 65o (BV650); (4) violeta brillante 786 (Bv 786); (5) isotiocianato de fluoresceína (FITC); (6) peridinina clorofila proteína/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5); (7) ficoeritrina (PE); (8) ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7); (9) aloficocianina (APC); y (10) aloficocianina/H7 (APC-H7), APC-C750 o APC-Alexa750.
9. Un kit de diagnóstico para inmunofenotipificación por citometría de flujo de leucocitos que comprende una composición de reactivos según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 7 u 8 o al menos un conjunto de composiciones de reactivos según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 junto con instrucciones de uso, solución reguladora y/o muestras de control.
10. Uso de un kit de diagnóstico según la reivindicación 9, para el diagnóstico in vitro de inmunodeficiencias primarias (PID), preferiblemente PID del sistema linfoide.
11. Uso de un kit de diagnóstico según la reivindicación 9, para la identificación in vitro de alteraciones en subconjuntos de leucocitos en una enfermedad inmunológica, preferiblemente para el seguimiento inmune in vitro de un paciente con una infección, enfermedad autoinmune, alergia, después del trasplante, vacunación u otro tipo de terapia inmune, incluida la terapia con anticuerpos.
12. Un método de citometría de flujo de múltiples colores para la inmunofenotipificación de los leucocitos, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una primera parte alícuota de una muestra biológica que comprende leucocitos con una primera composición de reactivos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 de un conjunto según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 y poner en contacto al menos una segunda alícuota de dicha muestra con una composición de reactivos adicional de dicho conjunto;
(b) analizar los leucocitos en dichas partes alícuotas en un citómetro de flujo; y
(c) almacenar y evaluar los datos obtenidos.
13. Método según la reivindicación 12, en el que la muestra biológica es sangre periférica, médula ósea, muestra de tejido tal como ganglios linfáticos, adenoides, bazo o hígado, u otro tipo de fluido corporal, preferiblemente fluido cerebroespinal, fluido vítreo, fluido sinovial, aspirada de aguja final, derrames pleurales o ascitis.
14. Método según la reivindicación 12 o 13, en el que la etapa (b) comprende combinar la información inmunofenotípica de las poblaciones de células seleccionadas de múltiples tubos según los llamados cálculos de vecino más cercano en los que las células individuales de una parte alícuota de una muestra se combinan con células individuales correspondientes de otra alícuota de la misma muestra, según sus marcadores y su perfil de dispersión.
15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que comprende el uso de software para la integración de datos y el análisis multidimensional de los archivos de citometría de flujo.
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| CN109254147A (zh) * | 2018-10-12 | 2019-01-22 | 东莞暨南大学研究院 | 人体外周血免疫细胞功能全面评估试剂盒及评估方法 |
| CN109406775A (zh) * | 2018-10-12 | 2019-03-01 | 东莞市暨科生物科技有限公司 | 自身免疫性疾病患者免疫功能评估试剂盒及评估方法 |
| CN109781987B (zh) * | 2019-01-09 | 2022-04-26 | 暨南大学 | 终末效应t细胞亚群在制备辅助评估再生障碍性贫血病情程度试剂盒中的应用 |
| CN110687292A (zh) * | 2019-11-11 | 2020-01-14 | 北京大学人民医院(北京大学第二临床医学院) | 双阴性b细胞与调节性b10细胞在制备自身免疫性疾病诊断试剂中的应用 |
| CN111430034A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-07-17 | 广州康途活细胞医疗科技有限责任公司 | 人体免疫系统功能水平检测数据模型及其在健康分析中的应用 |
| CN114112868B (zh) * | 2020-08-26 | 2024-12-13 | 上海睿昂基因科技股份有限公司 | 一种用于监测肿瘤相关免疫微环境的流式细胞术试剂盒及监测方法 |
| CN112684188A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-04-20 | 四川扬克斯特科技有限公司 | 用于犬类伴侣动物tb淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒及方法 |
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Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5994088A (en) * | 1991-03-08 | 1999-11-30 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods and reagents for preparing and using immunological agents specific for P-glycoprotein |
| CN1284568A (zh) * | 1999-08-13 | 2001-02-21 | 杨梦甦 | 利用白细胞分化抗原(cd)基因芯片的检测疾病的方法 |
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| AU2003279618B2 (en) * | 2002-11-07 | 2009-07-16 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Method and probes for the detection of a tumor specific fusion protein |
| US7507548B2 (en) | 2003-03-04 | 2009-03-24 | University Of Salamanca | Multidimensional detection of aberrant phenotypes in neoplastic cells to be used to monitor minimal disease levels using flow cytometry measurements |
| US7786266B2 (en) * | 2005-05-12 | 2010-08-31 | Oncotherapy Science, Inc. | Methods for damaging cells using effector function of anti-DSC2 antibody |
| US7321843B2 (en) | 2005-09-30 | 2008-01-22 | Universidad De Salamanca | Method for generating new flow cytometry data files containing an infinite number of dimensions based on data estimation |
| EP2259065A1 (en) | 2009-06-03 | 2010-12-08 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Methods, reagents and kits for flow cytometric immunophenotyping |
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-
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