CN112684188A - 用于犬类伴侣动物tb淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒，包括试剂盒本体、盒盖、第一限位板、第二限位板、通孔、限位槽和试剂管，方法包括，步骤一，样品获取；步骤二，样品初处理；步骤三，样品分析；步骤四，记录分析；该发明安全、可靠，通过本发明，可以一次性地使用少量样本进行T、B淋巴细胞亚群及免疫功能检测，并获取到全套数据，不必再次测定其余类似的数据；运用该发明设计的方案，可以获得外周血中T淋巴细胞总数及CD4和CD8阳性淋巴的的数量及比例，同时获得B淋巴细胞总数及比列，实现一次性快速简便得到犬类伴侣动物外周血T、B淋巴细胞亚群全套免疫学检测数据的目的。
Description
技术领域
本发明涉及免疫功能检测技术领域，具体为用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒及方法。
背景技术
流式细胞术是一种对细胞进行自动化分析和分选的仪器装置，它可以对细胞悬液中细胞形态、表面和内部多肽分子进行快速测定、记录和分析，进而获得细胞的生物化学参数，并可以根据不同的荧光标记分子用于鉴定或分选不同类型的细胞亚群；流式细胞日常应用过程中，对于制备完好的细胞悬液，用于流式细胞仪分析，仪器首先对细胞悬液中进入流动池中不同类型的细胞进行前向散射光和侧向散射光检测，其中FSC信号强度反映细胞颗粒的体积大小和活力，SSC信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化；检测过程中，常利用FSC和SSC这两参数组合对不同群体的细胞类型进行区分，同时去除细胞碎片、死细胞及粘连体的干扰，通过FSC-SSC散点图gate出目标细胞进行分析；淋巴细胞根据其发生来源、形态结构、表面标志和免疫功能等方面的不同，可分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞；而T淋巴细胞和B淋巴细胞是各种动物体内获得性免疫功能的主要参与细胞，同时衡量动物免疫功能、病原体感染治疗干预及预后的重要参考指标，根据其在体内数量或比值的改变反映不同的感染类型；目前各家宠物诊疗机构对伴侣动物免疫功能的检测主要依靠较粗浅的血常规，对动物的特异性免疫功能水平检测很难进行，主要是没有一套完整评估免疫功能的试剂盒及行之有效的统一化检测标准；目前仅依靠血常规等粗略手段进行动物免疫功能检测过于粗放，已不能满足针对不同类型免疫功能的精确诊断和分析要求；因此，随着爱宠人士日益增多，开发新一代伴犬类侣动物免疫功能检测方案已迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒，包括试剂盒本体、盒盖、第一限位板、第二限位板、通孔、限位槽和试剂管，所述试剂盒本体的顶端外壁上设置有盒盖，所述试剂盒本体的一侧内壁上固定连接有第一限位板，所述试剂盒本体的底端内壁上固定连接有第二限位板，所述第一限位板的一侧外壁上分布贯通开设有通孔，所述通孔的一侧内壁上插接有试剂管，且试剂管的一端插接于限位槽的一侧内壁上。
用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒的方法，包括以下步骤，步骤一，样品获取；步骤二，样品初处理；步骤三，样品分析；步骤四，记录分析；
其中上述步骤一中，取适量犬的血液样本，经过洗涤、离心处理后，获得犬的外周血作为检测样本；
其中上述步骤二中，样品初处理包括以下步骤：
1)将取得的犬外周血于肝素钠的抗凝管中进行抗凝处理；
2)取100μl的血液于流式管中，分别加入试剂盒本体中的CD45、CD5、CD4、CD8、CD21抗体，并孵育30分钟；
其中上述步骤三中，样品分析包括以下步骤；
1)加入2ml红细胞裂解液，旋涡震荡混匀并于室温避光裂解红细胞，进行离心处理，去除上清液，并用磷酸盐缓冲液洗涤一次；
2)加入500μl上样缓冲液，用流式细胞仪分析步骤二中得到的淋巴细胞，通过CD45表达情况分析粒细胞群体；
3)再以CD45+CD5+和CD45+CD21+分别分析T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群，结合其比值的变化反应整体免疫功能。
其中上述步骤四中，记录分析包括以下步骤；
1)记录通过步骤三的处理后犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的所有信息；
2)通过上述信息对比研究来揭示犬瘟热病犬与正常健康犬在这方面的差异，从而揭示病毒感染致犬类伴侣动物体内免疫功能的变化规律，为临床诊断及干预疗效提供方便。
根据上述技术方案，所述试剂管的数量为十个。
根据上述技术方案，所述试剂盒本体中包含以下5种抗体：CD45、CD5、CD4、CD8、CD21。
根据上述技术方案，其特征在于：上述的5种指标抗体各自由5种不同类型的荧光标记物标记。
根据上述技术方案，上述5种荧光标记物选自：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5.5、PE-CY7、APC、APC、PE-CF594、BV421、BV450、BV500、BV510、BV605、BV650和APC-cy7等。
根据上述技术方案，所述步骤二2)中，在4℃的温度环境下孵育30分钟。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：该发明安全、可靠，通过本发明，可以一次性地使用少量样本进行T、B淋巴细胞亚群及免疫功能检测，并获取到全套数据，不必再次测定其余类似的数据；运用该发明设计的方案，可以获得外周血中T淋巴细胞总数及CD4和CD8阳性淋巴的的数量及比例，通过CD21同时获得B淋巴细胞总数及比列，实现一次性快速简便得到犬类伴侣动物外周血T、B淋巴细胞亚群全套免疫学检测数据的目的；并且通过得到的数据信息对比研究来揭示犬瘟热病犬与正常健康犬在这方面的差异，从而揭示病毒感染致犬类伴侣动物体内免疫功能的变化规律，为临床诊断及干预疗效提供方便。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的整体立体结构示意图；
图2是本发明的整体主视剖切结构示意图；
图3是正常健康犬外周血中CD45+CD5+淋巴细胞水平的流式细胞仪分析结果图；
图4是犬瘟热病毒感染犬外周血中CD45+CD5+淋巴细胞水平的流式细胞仪分析结果图；
图5是正常健康犬外周血中CD45+CD21+淋巴细胞水平的流式细胞仪分析结果图；
图6是犬瘟热病毒感染犬外周血中CD45+CD21+淋巴细胞水平的流式细胞仪分析结果图；
图7是正常健康犬外周血中表达CD45+CD5+的CD4+淋巴细胞流式细胞仪分析结果图；
图8是犬瘟热病毒感染犬外周血中表达CD45+CD5+的CD4+淋巴细胞流式细胞仪分析结果图；
图9是正常健康犬外周血中表达CD45+CD5+的CD8+淋巴细胞流式细胞仪分析结果图；
图10是犬瘟热病毒感染犬外周血中表达CD45+CD5+的CD8+淋巴细胞流式细胞仪分析结果图；
图11是本发明的方法流程图。
图中：1、试剂盒本体；2、盒盖；3、第一限位板；4、第二限位板；5、通孔；6、限位槽；7、试剂管。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒，包括试剂盒本体1、盒盖2、第一限位板3、第二限位板4、通孔5、限位槽6和试剂管7，试剂盒本体1的顶端外壁上设置有盒盖2，试剂盒本体1的一侧内壁上固定连接有第一限位板3，试剂盒本体1的底端内壁上固定连接有第二限位板4，第一限位板3的一侧外壁上分布贯通开设有通孔5，通孔5的一侧内壁上插接有试剂管7，且试剂管7的一端插接于限位槽6的一侧内壁上；试剂管7的数量为十个，多个试剂管7配合使用，减小了检测误差；试剂盒本体1中包含以下5种抗体：CD45、CD5、CD4、CD8、CD21；上述的5种指标抗体各自由5种不同类型的荧光标记物标记；上述5种荧光标记物选自：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5.5、PE-CY7、APC、APC、PE-CF594、BV421、BV450、BV500、BV510、BV605、BV650和APC-cy7等，通过多种荧光标记物标记，便于区分记录，便于检测。
请参阅图3-11，本发明提供一种技术方案：用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒的方法，包括以下步骤，步骤一，样品获取；步骤二，样品初处理；步骤三，样品分析；步骤四，记录分析；
其中上述步骤一中，取适量犬的血液样本，经过洗涤、离心处理后，获得犬的外周血作为检测样本；
其中上述步骤二中，样品初处理包括以下步骤：
1)将取得的犬外周血于肝素钠的抗凝管中进行抗凝处理；
2)取100μl的血液于流式管中，分别加入试剂盒本体(1)中的CD45、CD5、CD4、CD8、CD21抗体，并在4℃的温度环境下孵育30分钟；
其中上述步骤三中，样品分析包括以下步骤；
1)加入2ml红细胞裂解液，旋涡震荡混匀并于室温避光裂解红细胞，进行离心处理，去除上清液，并用磷酸盐缓冲液洗涤一次；
2)加入500μl上样缓冲液，用流式细胞仪分析步骤二中得到的淋巴细胞，通过CD45表达情况分析粒细胞群体；
3)再以CD45+CD5+和CD45+CD21+分别分析T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群，结合其比值的变化反应整体免疫功能。
其中上述步骤四中，记录分析包括以下步骤；
1)记录通过步骤三的处理后犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的所有信息；
2)通过上述信息对比研究来揭示犬瘟热病犬与正常健康犬在这方面的差异，从而揭示病毒感染致犬类伴侣动物体内免疫功能的变化规律，为临床诊断及干预疗效提供方便。
基于上述，本发明的优点在于，通过以上述方法，使用流式细胞仪快速得到关于犬外周血淋巴细胞亚群和免疫功能的所有信息，并可以通过这些信息的对比研究来揭示犬瘟热病犬与正常健康犬在这方面的差异，从而揭示病毒感染致犬类伴侣动物体内免疫功能的变化规律，为临床诊断及干预疗效提供方便；如图3中，犬瘟热病毒感染犬中CD45+CD5+、CD45+CD21+淋巴细胞比例异常升高，提示犬瘟热病毒可以影响T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育与分化成熟；在此基础上gate出CD45+CD5+淋巴细胞进行后续分析；犬瘟热病犬的CD45+CD5+淋巴细胞的CD4和CD8水平异常，CD4/CD8比值异常，提示犬瘟热病毒可以引起辅助性T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞的成熟与分化。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒，包括试剂盒本体(1)、盒盖(2)、第一限位板(3)、第二限位板(4)、通孔(5)、限位槽(6)和试剂管(7)，其特征在于：所述试剂盒本体(1)的顶端外壁上设置有盒盖(2)，所述试剂盒本体(1)的一侧内壁上固定连接有第一限位板(3)，所述试剂盒本体(1)的底端内壁上固定连接有第二限位板(4)，所述第一限位板(3)的一侧外壁上分布贯通开设有通孔(5)，所述通孔(5)的一侧内壁上插接有试剂管(7)，且试剂管(7)的一端插接于限位槽(6)的一侧内壁上。
2.用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒的方法，包括以下步骤，步骤一，样品获取；步骤二，样品初处理；步骤三，样品分析；步骤四，记录分析；其特征在于：
其中上述步骤一中，取适量犬的血液样本，经过洗涤、离心处理后，获得犬的外周血作为检测样本；
其中上述步骤二中，样品初处理包括以下步骤：
1)将取得的犬外周血于肝素钠的抗凝管中进行抗凝处理；
2)取100μl的血液于流式管中，分别加入试剂盒本体(1)中的CD45、CD5、CD4、CD8、CD21抗体，并孵育30分钟；
其中上述步骤三中，样品分析包括以下步骤；
1)加入2ml红细胞裂解液，旋涡震荡混匀并于室温避光裂解红细胞，进行离心处理，去除上清液，并用磷酸盐缓冲液洗涤一次；
2)加入500μl上样缓冲液，用流式细胞仪分析步骤二中得到的淋巴细胞，通过CD45表达情况分析粒细胞群体；
3)再以CD45+CD5+和CD45+CD21+分别分析T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群，结合其比值的变化反应整体免疫功能。
其中上述步骤四中，记录分析包括以下步骤；
1)记录通过步骤三的处理后犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的所有信息；
2)通过上述信息对比研究来揭示犬瘟热病犬与正常健康犬在这方面的差异，从而揭示病毒感染致犬类伴侣动物体内免疫功能的变化规律，为临床诊断及干预疗效提供方便。
3.根据权利要求1所述的用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒，其特征在于：所述试剂管(7)的数量为十个。
4.根据权利要求1所述的用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒本体(1)中包含以下5种抗体：CD45、CD5、CD4、CD8、CD21。
5.根据权利要求4所述的用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒，其特征在于：所述上述的5种指标抗体各自由5种不同类型的荧光标记物标记。
6.根据权利要求5所述的用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒，其特征在于：所述上述5种荧光标记物选自：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5.5、PE-CY7、APC、APC、PE-CF594、BV421、BV450、BV500、BV510、BV605、BV650和APC-cy7等。
7.根据权利要求2所述的用于犬类伴侣动物TB淋巴细胞亚群及免疫功能的试剂盒的方法，其特征在于：所述步骤二2)中，在4℃的温度环境下孵育30分钟。
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| 邱立华 等: "流式细胞术(CD45/SSC设门法)检测恶性淋巴瘤骨髓受累的临床意义", 《中国肿瘤临床》, vol. 32, no. 20, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 1165 - 1167 * |
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