SK50672005A3

SK50672005A3 - Prípravok imunoglobulínu a spôsob jeho prípravy

Info

Publication number: SK50672005A3
Application number: SK5067-2005A
Authority: SK
Inventors: David J. Burke; Shaun E. Buckley; Sherwood Russ Lehrman; Barbara Horsey O�Connor; James Callaway
Original assignee: Elan Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2003-02-10
Filing date: 2004-02-09
Publication date: 2006-03-02
Also published as: JP2014028831A; UY28184A1; AU2004210679A1; EP3417875A1; EP2236154A1; CN1771053A; PT2236154T; US8815236B2; CA2515444A1; NO20054164L; TW200505478A; HK1182021A1; EP1592440A4; EP1592440A2; MXPA05008409A; PT3417875T; CY1120574T1; DK3417875T3; RU2358763C2; TWI367766B

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka stabilných, koncentrovaných prípravkov proteínov alebo protilátok, ako je natalizumab, v ktorom je zachovaná aktivita protilátky a možno ho tiež podávať v malom objeme a môže sa podávať subjektu, ktorý ho potrebuje, a ktorý má kolísavú hmotnosť.

Doterajší stav techniky

Prípravky protilátok a proteínov sú v stave techniky známe. Príprava proteínových prípravkov, ako sú prípravky protilátok, ktoré sú chemicky a biologicky stabilné, je však otvoreným problémom. Pripravenie prípravkov, ktoré sú nielen stabilné, ale môžu udržovať malý objem (t.j. umožňujúci injekcie s malým objemom) aj so zvýšenou koncentráciou proteínu, ako je protilátka, je tiež problematické. Existuje potreba takýchto prípravkov. Napríklad, koncentrované množstvo proteínu v stálom objeme, ktoré je tiež stabilné, by bolo prínosom pre pacientov, ktorý majú kolísavú hmotnosť. Podávanie tekutín pacientom s kolísavou hmotnosťou môže mať napríklad nepriaznivú reakciu. Vývoj takýchto prípravkov bol brzdený samotnými proteinmi alebo protilátkami, ktoré majú vysokú tendenciu k zhlukovaniu a zrážaniu.

Podstata vynálezu

Preto nehľadiac na to, čo už bolo zaznamenané v literatúre, tu existuje potreba zlepšenia spôsobov prípravy proteínov a/alebo protilátok. Taktiež existuje potreba stabilných prípravkov s vysokými koncentráciami protilátky alebo proteinu, kde je zachovaná aktivita protilátky alebo proteinu. Tiež sú potrebné stabilné prípravky koncentrovaných proteinov, ktoré udržujú stály objem. Prihlasovatelia tu popisujú stabilné zlúčeniny, ktoré môžu byť d’alej využité na prípravu prípravkov protilátky, zvlášť prípravkov v vysokými koncentráciami protilátky, ktoré sa nezrážajú a sú stabilné pri uchovávaní pri odporúčanej teplote. Vysoko koncentrované a stabilné prípravky protilátky ohromne pomôžu lekárom pri liečení subjektov s kolísavou hmotnosťou.

Jeden aspekt vynálezu uskutočňuje stabilný, hydratačný farmaceutický prípravok zahrňujúci imunoglobulín (alebo iný proteín), tlmivý roztok fosfátu, polysorbát a chlorid sodný. Prednostne je polysorbátom polysorbát 80, a prednostne v množstve od 0,001 hmotn. % do 2 hmotn. %. Prednostnejšie sa tu polysorbát nachádza v množstve 0,02 hmotn. %. V ďalšom uskutočnení sa imunoglobulín alebo iný protein nachádza v prípravku v množstve 0,1 mg/ml až 200 mg/l. Prednostne sa prípravok tlmí na pH medzi 3,0 a 7,0 a najprednostnejšie je 6,0 ± 0,5. Prípravok je prednostne izotonický. Prípravok môže ďalej obsahovať histidín. Prednostne je histidínom L-histidín.

V ďalšom uskutočnení vynálezu imunoglobulínom z vyššie zvedeného prípravku je anti-alfa-4-integrin protilátka, ako je natalizumab alebo iná humanizované protilátka alebo monoklonálna protilátka. Táto protilátka sa môže nachádzať v štandardnom množstve alebo v koncentrovanom množstve, napríklad 15 mg/ml alebo viac. Prednostne sa natalizumab nachádza v množstve od 20 mg/ml do 150 mg/ml. V prípadoch, kde sa prípravok nachádza v koncentrácii 15 mg/ml alebo viac, je tento prípravok udržovaný v stálom objeme, napríklad 125 ml.

Ďalším cieľom tohto vynálezu je uskutočniť spôsob liečenia stavu pacienta s kolísavou hmotnosťou terapeutickým množstvom imunoglobulínu, ktoré zahrňuje podávanie prípravku, ako bol popísaný vyššie a bude ďalej, kde tento stav je liečený podávaním tohto prípravku. Ďalším aspektom tohto vynálezu je, že tento stav je sprostredkovaný alfa-4-integrinom, a v takýchto stavoch imunoglobulín rozpoznáva a viaže sa na alfa-4-integrin, ako je natalizumab.

Ďalší aspekt tohto vynálezu uskutočňuje zmes zahrňujúcu fosfát sodný, polysorbát, protein a NaCl s pH 6,0 ± 0,5, v ktorom je zmes stabilná pri uchovávaní pri 5°C až 8°C po dlhú dobu.

Ďalší aspekt tohto vynálezu uskutočňuje spôsob prípravy stabilného proteínu zahrňujúceho prípravok obsahujúci zmiešanie fosfátu sodného, chloridu sodného, polysorbátu a proteínu a upravenie pH zmesí fosforečnou kyselinou na pH 6,0 ± 0,5.

V prípravku podľa tohto vynálezu môže byť protein lyofilizovaný. Polysorbátom je prednostne polysorbát 80k, ktorý sa nachádza v množstve 0,02 hmotn. % a proteinom je prednostne natalizumab. Prípravok môže ďalej zahrňovať histidín.

Prednostne je protein lyofilizovaný v roztoku zahrňujúcom 5 mM histidin, 20 mg/ml sacharózy a 0,02 % polysorbátu 80 pri pH 6, a proteínom je natalizumab s koncentráciou 20 mg/ml.

Ďalší cieľ vynálezu je uskutočniť výrobok zahrňujúci nádobku udržujúcu stabilný prípravok, ktorý bol popísaný vyššie a dalej.

Ďalší aspekt tohto vynálezu uskutočňuje spôsob liečenia stavu pacienta s kolísavou hmotnosťou, ktorý obsahuje súbežné alebo následné podávanie pacientovi terapeutického množstva účinnej kombinácie prípravku popísaného vyššie a ďalej a zlúčeniny alebo terapie účinnej proti tomuto stavu.

Ďalší aspekt tohto vynálezu je uskutočniť použitie akýchkoľvek stabilných prípravkov, ktoré sú tu popísané, na prípravu lieku na liečbu stavu, kde liek je účinný na liečenie uvedeného stavu. Tento liek môže ďalej zahrňovať druhú zlúčeninu alebo terapiu na liečenie tohto stavu.

Príklady uskutočnenia vynálezu „Proteinom“ sa rozumie, že zahrňuje, ale nie je na ne obmedzený, imunoglobulíny, enzýmy, receptor a ich fragmenty. Hoci sa diskusia o tomto prípravku uskutočňuje hlavne vzhľadom na protilátku alebo imunoglobulín, v popisovaných prípravkoch sú uvažované ako zameniteľné aj iné proteíny.

„Imunoglobulínom“ sa rozumie, že zahrňuje, ale nie je na ne obmedzený, protilátku a fragment protilátky (ako je scFv, Fab, Fc F(ab')2), a iné časti protilátok vytvorené genetickým inžinierstvom. V závislosti na konštantných doménach ťažkých reťazcov sekvencií aminokyselín môžu byť imunoglobulíny zaradené do rôznych tried. Existuje päť hlavných tried imunoglobulínov : IgA, IgD, IgE, IgG a IgM. Niektoré z nich môžu byť rozdelené do podtried (izotypov), napr. IgGl, lgG2, lgG3, and lgG4; lgA1 a lgA2. Konštantné domény ťažkých reťazcov, ktoré zodpovedajú rôznym triedam imunoglobulínov sa nazývajú alfa (a), delta (δ) epsilon (ε), gama (γ) a mí (μ). Dobre známe sú podjednotkové štruktúry a trojrozmerné konfigurácie rôznych tried imunoglobulínov. Prednostne imunoglobulín rozpoznáva a viaže sa na alfa-4-integrin.

Pojem „protilátka“ sa používa v najširšom zmysle a špecificky zahŕňa monoklonálne protilátky (vrátane agonistických a antagonistických protilátok), zmesí protilátok s polyepitopicku špecifickosťou, a fragmenty protilátok (napr. Fab, F(ab’)₂), scFv a Fv), pokiaľ vykazujú požadovanú biologickú aktivitu. „Protilátkou“ sa rozumie, že zahrňuje polyklonálne protilátky, monoklonálne protilátky, humanizované protilátky, humánne protilátky, primatizované® protilátky a iné protilátky vytvorené genetickým inžinierstvom.

Pojem „monoklonálne protilátky“, ako je tu použitý, sa vzťahuje na protilátku získanú z populácie v podstate homogénnych protilátok, t.j. jednotlivé protilátky zahrňujúce túto populáciu sú identické okrem prírodné sa vyskytujúcich mutácií, ktoré sa môžu nachádzať v menšinových množstvách. Monoklonálne protilátky sú vysoko špecifické, sú namierené proti jednotlivým antigénovým miestam. Navyše oproti konvenčným (polyklonálnym) prípravkom protilátky, ktoré typicky zahrňujú rôzne protilátky orientované proti rôznym determinantom (epitopom), každá monoklonálna protilátka je orientovaná proti jednému jedinému determinantu na antigéne. Popri svojej špecifickosti sú monoklonálne protilátky výhodné vtom, že sú syntetizované systémami expresie buniek cicavcov alebo transgénovou technológiou, nedotknutou inými imunoglobulínmi. Napríklad monoklonálne protilátky, ktoré sa použijú v súlade s týmto vynálezom, môžu byť expresované u husí, ako to popísal Behboodi, et al. (2002) Transgenic cloned goats and the production of therapeutic proteins. V Prínciple of Cloning. Elsevier Science (USA); a Meade et al. (1999). Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals in gene expression systems: using náture f or the art o f expression. J. M. Fernandez a J.P. Hoeffler ed., Academic Press. Modifikátor „monoklonálny“ indikuje charakter tejto protilátky, ktorá je získaná z v podstate homogénnej populácie protilátok, a nemá sa vytvoriť ako požadovaná produkcia protilátky nejakým konkrétnym spôsobom. Napríklad monoklonálne protilátky, ktoré sa použijú v súlade s týmto vynálezom, môžu byť pripravené spôsobmi, ktoré popísal Shepard et al., Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000).

Pojem „monoklonálne protilátky“ tiež zahrňuje „chimérické“ protilátky (imunoglobulíny), v ktorých časť ťažkého a/alebo ľahkého reťazca je identická alebo homologická s príslušnými sekvenciami v protilátke odvodenými od konkrétnych druhov alebo patriacimi do konkrétnej triedy alebo podtriedy protilátky, pričom zvyšok reťazca (reťazcov) je identický alebo homologický s príslušnými sekvenciami v protilátkach odvodenými z ďalších druhov alebo patriacimi do ďalšej triedy alebo podtriedy protilátky, ako aj fragmentárni takýchto protilátok, pokiaľ vykazujú požadovanú biologickú aktivitu. Napríklad, schopnosť viazať sa na alfa-4-integrin. „Monoklonálne protilátky“ môžu byť izolované aj z knižníc fágových protilátok použitím techník popísaných napríklad vCIackson et al., 1991 Náture 352: 624-628 a Marks et al., 1991 J.Mol.Biol., 222: 581-597. „Humanizované“ formy nehumánnych (napr. myšacích, králičích, kravských, konských, bravčových a pod.) protilátok sú chimérické imunoglobulíny, imunoglobulínove reťazce alebo ich fragmenty (ako sú Fv, Fab, Fab', F(ab')2 alebo iné antigén-viažúce subsekvencie protilátok), ktoré obsahujú minimálne sekvenciu odvodenú od nehumánneho imunoglobulínu. Z väčšej časti sú humanizované protilátky humánne imunoglobulíny (prijímajúce protilátky), v ktorých sú rezíduá z doplnkového determinujúceho regiónu (CDR) prijímateľa nahradené rezíduami z CDR nehumánnych druhov (donorové protilátky) ako je myš, potkan, králik, majúcimi požadovanú špecifickosť, afinitu a kapacitu.

V niektorých prípadoch sú Fv nosné konštrukcie rezíduí humánneho imunoglobulínu nahradené zodpovedajúcimi nehumánnymi rezíduami. Ďalej môže humanizované protilátka zahrňovať rezíduá, ktoré neboli zistené ani v prijímajúcej protilátke, ani v importovanej CDR alebo nosnej konštrukcii sekvencií. Tieto modifikácie sú vykonané pre ďalšie kultivovanie a optimalizovanie správania protilátky. Vo všeobecnosti humanizované protilátka bude zahrňovať v podstate všetky z aspoň jednej, a typicky dvoch meniteľných domén, v ktorých všetky alebo v podstate všetky CDR regióny zodpovedajú nehumánnemu imunoglobulínu a všetky alebo v podstate všetky FR regióny sú zo zhodnej sekvencie humánneho imunoglobulínu. Humanizovaná protilátka optimálne bude zahrňovať tiež aspoň časť konštantného regiónu imunoglobulínu (Fc), typicky toho, ktorý má humánny imunoglobulín.

Výraz „lineárne protilátky“ je tiež zahrnutý vo všeobecnom pojme „protilátky“ a je to pár za sebou zaradených Fd segmentov (VH-CH1-VH-CH1), ktoré vytvárajú pár regiónov viažúcich antigén.

„Variantná protilátka“ (tiež zahrnutá v generickom pojme „protilátka“) je molekula, ktorá sa líši sekvenciou aminokyseliny od „pôvodnej“ sekvencie aminokyseliny protilátky prostredníctvom adície, vyradenia a/alebo substitúcie jedného alebo viacerých rezíduí aminokyselín v pôvodnej sekvencii protilátky.

V prednostnom uskutočnení variant zahrňuje jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v jednej alebo viacerých hypervariabilných regiónoch pôvodnej protilátky. Variant môže napríklad zahrňovať aspoň jednu substitúciu, napr. od jednej do desať, a prednostne od dvoch do piatich, v jednom alebo viacerých hypervariabilných regiónoch pôvodnej protilátky. Bežne bude mať variant sekvenciu aminokyseliny majúcu aspoň 75% identitu sekvencie aminokyseliny s ťažkými alebo ľahkými reťazcami variabilných doménových sekvencii pôvodnej protilátky, prednostne aspoň 80%, prednostnejšie aspoň 85%, ešte prednostnejšie aspoň 90% a najprednostnejšie aspoň 95%. Identita alebo homológia týkajúca sa tejto sekvencie je tu definovaná ako percentuálny podiel rezíduí aminokyselín v kandidujúcej sekvencii, ktoré sú identické s pôvodnými rezídumi protilátky, po zoradení sekvencii a zavedení medzier, ak je to potrebné, pre dosiahnutie maximálneho percenta identity sekvencie. Žiadne N-zakončenie, C-zakončenie, alebo vnútorné predĺženia, vyradenia alebo zapojenia do sekvencie protilátky nemajú byť vytvorené tak, aby poškodili identitu alebo homológiu sekvencie.

Na analýzu takýchto vlastností treba porovnať Fab formu tohto variantu s Fab formou pôvodnej protilátky alebo celú dĺžku tohto variantu s celou dĺžkou pôvodnej protilátky, napríklad, keďže bolo zistené, že formát protilátky vplýva na jej aktivitu pri skúške biologickej aktivity, ktorá je tu popísaná. Variantná protilátka príslušného záujmu je tá, ktorá zobrazuje aspoň 10-násobne, prednostne aspoň 20-násobne a najprednostnejšie aspoň 50-násobne zvýšenie biologickej aktivity v porovnaní s pôvodnou protilátkou. „Pôvodná“ protilátka je tá, ktoré je kódovaná sekvenciou aminokyseliny použitej na prípravu tohto variantu. Prednostne má pôvodná protilátka región humánnej nosnej konštrukcie a má konštantný región (regióny) humánnej protilátky. Napríklad, pôvodná protilátka môže byť humanizovaná pôvodná protilátka alebo humánna protilátka.

„Izolovaná protilátka“ je tá, ktorá bola identifikovaná a separovaná a/alebo navrátená do pôvodného stavu zo zložky svojho prírodného prostredia. Prímesové zložky jej príprodného prostredia sú materiály, ktoré by boli na prekážku diagnostickému alebo terapeutickému použitiu u protilátky, a môžu zahrňovať enzýmy, hormóny a iné proteínové alebo neproteinové roztoky. V prednostnom uskutočnení bude protilátka čistená (1) viac než na 95% hmotnosti protilátky, ako stanovuje Lowryho metóda, a najprednostnejšie viac než na 99% hmotnosti, (2) na stupeň dostatočný pre získanie aspoň 15 rezíduí s N-zakončenou alebo vnútornou sekvenciou aminokyseliny použitím vretenového sekvenátora, alebo (3) na homogenitu s SDS-PAGE pri redukčných alebo neredukčných podmienkach

Ί použitím Coomasieho modrej, alebo prednostne, strieborného farbiva. Izolovaná protilátka zahrňuje protilátku in situ v rekombinantných bunkách, keďže nebude prítomná aspoň jedna zložka prírodného prostredia protilátky. Bežne sa však izolovaná protilátka bude pripravovať aspoň jedným krokom čistenia.

„Fragmenty protilátky“ zahrňujú časť neporušenej protilátky, vo všeobecnosti antigén viažúci región alebo variabilný región neporušenej protilátky. Príklady fragmentov protilátky zahrňujú Fab, Fab', F(ab')2, a Fv fragmenty; dialátky; lineárne protilátky; jednoreťazcové protilátkové molekuly; a viacšpecifické protilátky vytvorené z fragmentov protilátky. „Jednoreťazcové Fv“ alebo sFv“ fragmenty protilátky zahrňujú VH aVL domény protilátky, kde sa tieto domény nachádzajú v jednom polypetidickom reťazci. Vo všeobecnosti Fv polypeptid ďalej zahrňuje polypeptidový spojovač medzi VH a VH doménami, ktorý umožňuje, aby sFv vytvorilo požadovanú štruktúru u viazania antigénu.

„Dialátky“ sa vzťahujú na malé fragmenty protilátky s dvoma antigén-viažucimi miestami, ktorých fragmenty zahrňujú doménu s variabilným ťažkým reťazcom (VH) spojenú s doménou s variabilným ľahkým reťazcom (VL) v tom istom polypeptidovom reťazci (VH-VL). Použitím spojovača, ktorý je príliš krátky, aby umožnil spárenie medzi týmito dvoma doménami na tom istom reťazci, sú domény prinútené spáriť sa s doplnkovými doménami iného reťazca a vytvoriť antigén-viažuce miesta. Cesta podávania protilátky je v súlade so známymi spôsobmi a tieto cesty sú dobre známe, a môžu zahrňovať napríklad injekciu alebo infúziu intravenózne, intraperitoneálne, intracerebrálne, intramuskulárne, intraokulárne, intraarteriálne alebo intralézionálne cesty, alebo konštantné prepúšťacie systémy. Protilátka môže byť podávaná kontinuálne infúziou alebo bolusovou injekciou. Terapeutické zmesi protilátky sú vo všeobecnosti umiestnené do nádobky majúcej sterilný prístupový otvor, napríklad vrecko s intravenóznym roztokom alebo ampulu majúcu uzáver prepichovateľný podkožnou injekčnou ihlou. „Farmaceutický prijateľné“ excipienty (napr. vehikulá, aditíva) sú také, ktoré môžu byť vhodne podávané cicavcovi pre uskutočnenie účinnej dávky s obsahom aktívnej zložky. „Stabilný“ prípravok je taký, v ktorom obsiahnutý protein si pri uchovávaní v základe zachováva svoju fyzikálnu stabilitu a/alebo chemickú stabilitu a/alebo biologickú stabilitu. „Stabilný“ tiež znamená prípravok, ktorý vykazuje malé alebo žiadne známky nestability, vrátane zhlukovania a/alebo deamidácie. Napríklad, prípravky uskutočnené týmto vynálezom môžu zostať stabilnými aspoň dva roky, ak sú uchovávané ako je indikované pri teplote 5-8°C.

V stave techniky sú dostupné rôzne analytické techniky na meranie stability proteínov a sú zaznamenané napríklad v Peptide and Protein Drug Delivery, 247301 (Vincent Lee ed., New York, N.Y., 1991) a Jones, 1993 Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90. Stabilitu možno merať pri zvolenej teplote počas zvolenej časovej doby ako je doložené v uskutočnených príkladoch. Uchovávanie stabilných formulácií je prednostne aspoň 6 mesiacov, prednostnejšie 12 mesiacov, ešte prednostnejšie 12-18 mesiacov a ešte viac prednostnejšie 2 alebo viac rokov.

Protein, ako je protilátka alebo jej fragment, „zachováva svoju fyzikálnu stabilitu“ vo farmaceutickom prípravku, ak nevykazuje žiadne známky zhlukovania, zrážania, deamidácie a/alebo denaturácie pri vizuálnom preskúmaní farby a/alebo čírosti, alebo meraní rozptylu UV svetla alebo chromatografii s vylúčením podľa veľkosti.

Protein „zachováva svoju chemickú stabilitu“ vo farmaceutickom prípravku, ak je chemická stabilita v danom čase taká, že u tohto proteínu sa uvažuje, že si ešte stále zachováva svoju biologickú stabilitu. Chemickú stabilitu možno stanoviť zisťovaním a kvantifikovaním chemicky zmenených foriem proteinu. Chemická zmena môže zahrňovať modifikáciu veľkosti (napr. odrezok), ktorý môže byť hodnotený napríklad použitím chromatografie s vylúčením podľa veľkosti, SDS-PAGE a/alebo laserovej desorpčnej ionizácie s pomocou matrice/hmotnostnej spektrometrie s časom letu (MALDI/TOF MS). Iné typy chemickej zmeny zahrňujú zmenu náboja (napr. vyskytujúcu sa ako výsledok deamidácie), ktorá môže byť hodnotená napríklad chromatografiou s výmenou iónov. Protilátka „zachováva svoju biologickú aktivitu“ vo farmaceutickom prípravku, ak je biologická aktivita protilátky v danom čase do 10% (s chybami skúšky) biologickej aktivity vykazovanej v tom čase, keď farmaceutický prípravok bol pripravený, ako je determinované napríklad pri skúške viazania antigénu.

„Izotonický“ znamená, že daný prípravok má v základe rovnaký osmotický tlak ako ľudská krv. Izotonické prípravky budú všeobecne mať osmotický tlak od 250 do 350 mOsm. Izotonickosť možno merať napríklad použitím typu osmometra s tlakom vodnej pary alebo zamrznutia ľadu.

Ako je tu použité, „pufer“ sa vzťahuje na tlmivý roztok, ktorý odoláva zmenám pH pôsobením svojich kyselino-bázických konjugačných zložiek. Pufer podľa tohto vynálezu má pH v rozmedzí od 3,0 do 7,5; prednostne od pH 4,0 do 7,0; prednostnejšie od pH 5,0 do 6,5; a najprednostnejšie má pH 6,0 ± 6,5. Vynález uvažuje aj každý bod pH, ktorý sa nachádza v tomto rozmedzí.

Vo farmakologickom zmysle v kontexte tohto vynálezu „terapeuticky účinné množstvo“ protilátky sa vzťahuje na množstvo účinné pri prevencii alebo liečbe ochorenia, na liečbu ktorého je protilátka účinná. „Ochorenie“ je akýkoľvek stav, ktorému môže prospieť liečba s protilátkou alebo proteinom. Toto zahrňuje chronické alebo akútne ochorenia alebo ochorenia zahrňujúce patologické stavy, ktoré predisponujú cicavcov k tejto liečbe.

„Liečba“ sa vzťahuje na terapeutickú liečbu a profylaktické alebo preventívne opatrenia. To, kde je liečba potrebná, zahrňuje stavy s ochorením, ako aj tie stavy, kde má byť prevencia ochorenia.

„Ochranný prostriedok“ je zlúčenina, ktorá môže byť zahrnutá v prípravku, aby tu v podstate redukovala pôsobenie baktérií, tak uľahčujúc vytvorenie prípravku s viacerým použitím. Príklady potenciálnych ochranných prostriedkov zahrňujú oktadecyldimetylbenzylamónium chlorid, hexametónium chlorid, benzalkónium chlorid (zmes alkylbenzyldimetyamónium chloridov, v ktorých alkylové skupiny sú zlúčeniny s dlhým reťazcom) a benzetónium chlorid. Iné typy ochranných látok zahrňujú aromatické alkoholy, ako je fenol, butyl alebo benzylalkohol, alkyparabény, ako je metyl alebo propylparabén, katechol, rezorcinol, cyklohexanol, 3-pentanol a m-krezol.

„Pacientom“ alebo „subjektom“ sa rozumie, že zahrňuje ktoréhokoľvek cicavca. „Cicavec“ na „účely liečby“ je ktorékoľvek zviera v triede cicavcov, čo zahrňuje, ale nie je obmedzené na, človeka, domáce a hospodárske zvieratá, zvieratá v ZOO, športové zvieratá alebo domácich miláčikov, ako sú psi, kone, mačky a podobne. Prednostne, je cicavcom človek.

„Antegren®“ znamená, že zahrňuje protilátku známu tiež ako AN100226 (číslo kódu protilátky) alebo natalizumab (názov USAN). Natalizumab je rekombinantné, humanizované anti-alfa-4-integrin protilátka. Prednostne je liečené u cicavcov také ochorenie alebo stav, ktorý je zmiernený, ak je podávaná terapeuticky účinná dávka natalizumabu.

„Stabilným“ sa rozumie prípravok, ktorý vykazuje malé alebo nevykazuje žiadne známky nestability, vrátane zhlukovania a/alebo deamidácie. Popri tom sa môže stabilný vzťahovať na prípravok, ktorý nevykazuje žiadne známky nestability po dobu 2 rokov alebo dlhšiu, ak je uchovávaný ako je indikované.

Podrobný popis vynálezu

V diskusii ďalej a v príkladoch, ktoré nasledujú, sú popísané stabilné protilátkové prípravky. Popísané určité stabilné prípravky majú vysoké koncentrácie protilátky, ale udržujú stály objem, pričom protilátka sa nevyzráža z roztoku alebo sa nezhlukuje. Pre vysoko koncentrované prípravky sa tu uvažujú aj iné proteiny než sú protilátky.

Protilátky sú typicky podávané subjektu (napr. človeku) v koncentráciách 0,01 mg/ml až 200 mg/ml. Typickejšie je rozmedzie koncentrácií od 0,1 mg/ml až 150 mg/ml. Existujú však prípady, v ktorých sa vyžaduje podávať pacientovi vyššie koncentrácie, napr. 15 až 200 mg/ml, prednostnejšie 15 mg/ml až 150 mg/ml, ešte prednostnejšie 20 až 50 mg/ml a najprednostnejšie 20 mg/ml a každá iná hodnota v týchto rozmedziach.

Prípravok protilátky sa môže podávať cicavcovi, ktorý vyžaduje liečbu proteinmi, v súlade so známymi metódami. Tieto metódy môžu zahrňovať, ale nie sú na ne obmedzené, intravenózne podávanie ako bolus alebo ako kontinuálna infúzia po určitú dobu, intramuskulárne, intraperitoneálne, intracerobrospinálne, subkutánne, intraartikulárne, intrasynoviálne, intratekálne a orálne podávanie, podávanie miestnou alebo inhalačnou cestou. V prednostných uskutočneniach sa prípravok protilátky podáva cicavcovi intravenóznym podávaním.

Príslušné dávkovanie tohto proteínu závisí napríklad na danom stave, ktorý sa lieči, na vážnosti a priebehu tohto stavu, či sa protein podáva na prevenciu alebo terapeutické ciele, na doterajšej terapii, klinickej anamnéze pacienta a reakcii na protein, type použitého proteinu a voľbe príslušného lekára. Protein sa vhodne podáva pacientovi jednorazovo alebo počas postupného liečenia alebo sa môže podávať pacientovi kedykoľvek podľa napredovania diagnostiky. Protein sa môže podávať pacientovi ako jediná liečba alebo s inými liečivami alebo terapiami užitočnými pri liečbe konkrétneho stavu. Ako sa tu používa, dve (alebo viac) činidiel sa bude podávať v kombinácii, ak sa tieto dve činidlá podávajú súbežne alebo sa podávajú nezávisle takým spôsobom, že tieto činidlá budú pôsobiť súčasne.

Pri uvedení spôsobov podľa tohto vynálezu do praxe môžu byť zlúčeniny podľa tohto vynálezu použité samostatne alebo v kombinácii s inými terapeutickými činidlami. V určitých prednostných uskutočneniach môžu byť zlúčeniny podľa tohto vynálezu spolupodávané s inými zlúčeninami typicky predpísanými pre tieto stavy podľa všeobecne akceptovanej medicínskej praxe. Napríklad prípravky podľa tohto vynálezu sa môžu podávať v kombinácii s inými terapeutickými činidlami alebo fyzikálnymi terapiami na liečenie reumatickej artritídy, sklerózy multiplex a Crohnovej choroby.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Pre odborníka v danej oblasti je známe, že postup sa môže meniť, ale všeobecne sa postupuje podľa nasledujúceho postupu. Získaj ampulu z banky pracovných buniek, ktorá obsahuje bunky, ktoré vytvárajú danú protilátku alebo proteín. Priprav očkovaciu látku. Kultivuj lebo fermentuj bunky ďalším privedením buniek, ak je to potrebné.

Zozbieraj/vyčer tieto bunky centrifugovaním a/alebo filtráciou. Toto sa môže urobiť napríklad koncentrovaním buniek 10-násobne filtráciou so špirálovým vinutím. Filtruj 0,2 pm filtráciou, po čom nasleduje čistenie proteinom ASepharose Fast Flow® (f.j. afinitná chromatografia) a spätné vymývanie. Zmes obsahujúca protilátku sa potom upraví na pH 3,6-3,7. Táto zmes potom prejde vírovou filtráciou, po čom nasleduje krok koncentrácie/diafiltrácie. Zmes môže byť čistená pomocou DEAE Sepharose Fast Flow® (výmena aniónov). Tento krok sa môže vykonať viacnásobne. Od tohto bodu je zmes potom ďalej koncentrovaná, po čom nasleduje krok čistenia použitím systému Sephacryl S300HR® (t.j. chromatografiou s gólovou filtráciou), kde použitý pretekajúci pufer je fosfát/NaCI. Zmes obsahujúca protilátku sa môže ďalej koncentrovať na prípravky s vysokou koncentráciou (t.j. 200 mg/ml alebo viac), ak je to žiadúce. Zmes obsahujúca protilátku je potom ďalej tlmená a koncentrácia je upravená pridaním 0,02 hmotn. % polysorbátu 80. Táto zmes sa potom podrobí konečnej filtrácii použitím 0,2 pm filtra a môže sa rozdeliť v tomto bode do 100 ml až 10 I polypropylénových fliaš. Takto získaná protilátka alebo imunoglobulín sa môže potom QC testovať a QA uviesť na trh.

Vyššie uvedené sa môže vykonať napríklad pre natalizumab, ako je ďalej uvedené v schéme:

200 1 materiál (5,0 ma/ml) ampula z pracovných buniek 4	2000 1 materiál (5,0; 20 mq/ml) ampula z pracovných buniek 4
príprava očkovacej látky T	príprava očkovacej látky T
fermentácia	fermentácia
4	(privedenie ďalšieho média) ;
zber/vyčerenie filtráciou koncentrovanie 10x filtráciou	zber/vyčerenie centrifugovaním a filtráciou
so špirálovým vinutím 4	koncentrovanie 10x filtráciou so špirálovým vinutím T
0,2 gm filtrácia 1	0,2 gm filtrácia 4
čistenie proteínom A Sepharose	čistenie proteínom A Sepharose

Fast Flow® (afinitná chromatografia) Fast Flow® (afinitná chromatografia)

(prvotné eluovanie) 4	(reverzné eluovanie) T
pH 3,7-3,8 1	pH 3,6-3,7 Φ vírová filtrácia
1	T
čistenie s DEAE Sepharose Fast Flow® (chromatografia s výmenou iónov) (jediný cyklus) 1	čistenie s DEAE Sepharose Fast Flow® (chromatografia s výmenou iónov) (viacnásobný cyklus)
koncentrácia	koncentrácia
1 čistenie s Sephacryl S300HR®	T čistenie s Sephacryl S300HR®

(chromatografiou s gólovou filtráciou) (chromatografiou s gólovou filtráciou)

(pretekajúci pufer: histidín/NaCI) 4

(pretekajúci pufer; fosfát/NaCI 1

200 I materiál (5,0 mg/ml)_2000 I matéria! (5,0; 20 mg/ml)

I L (ďalšia koncentrácia na 20 mg/ml)

I L úprava tlmením a koncentráciou fosfát/NaCI, 0,02 hmotn. %

Polysorbátu 80)

I

0,2 pm výsledná filtrácia (100 ml-1 I polypropylénové fľaše)

I

QC testovanie a QA uvedenie na trh objemovej, čistenej AN 100226 úprava tlmením a koncentráciou (pridanie 0,02 hmotn. %

Polysorbát 80)

L

0,2 pm výsledná filtrácia 100 ml - 10 I polypropylénové fľaše)

I

QC testovanie a QA uvedenie na trh objemovej, čistenej AN 100226

Prípravok protilátky

V jednom aspekte tohto vynálezu je pripravený imunoglobulín s koncentráciou 1,7; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0; 25,0; 30,0; 40,0; alebo 50,0 mg/ml v 10 mM fosfáte sodnom, 140 mM NaCl (ph 6,0±0,5) a 0,02% Polysorbáte 80. Ak je to potrebné, pH sa upraví na 6,0 ± 0,5 kyselinou fosforečnou.

Jeden príklad rozdielneho prípravku je zobrazený ďalej.

Kvantitatívna zmes: Prípravok s pufrom fosfátu

Zložka	Funkcia	Jednotkový predpis (na ml) 1,7 mg/ml	Jednotkový predpis (na ml) 5,0 mg/ml	Jednotkový predpis (na ml) 20 mg/ml)
Aktívna zložka:
Anti-a-4-integrin humanizovaná monoklonálna protilátka	aktívna	1,7 mg	5,0 mg	20 mg

Ostatné zložky:
Fosfát sodný, USP	tlmenie a toxicita	1,4 mg	1,4 mg	1,4 mg
Chlorid sodný, USP	tlmenie a toxicita	8,2 mg	8,2 mg	8,2 mg
Kyselina fosforečná, NF	úprava pH na 6,0±0,5	QS	QS	QS
Polysorbát 80, NF	inhibuje zhlukovanie proteínu	0,2 mg	0,2 mg	0,2 mg
Voda do injekcie, USP	rozpúšťadlo	QS do 1 ml	QS do 1 ml	QS do 1 ml

Každý z vyššie uvedených prípravkov je optimálne umiestnený do antiseptickej ampulky. Tieto ampulky môžu byť napríklad Typu I EP z neutrálneho skla (ampulky naplnené napr. na 5,0 alebo 20 ml) z Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 so šedými gumenými uzávermi s hliníkovým utesnením. Uvažované sú však aj iné vhodné aseptické ampulky. Napríklad, prípravky môžu byť uzavreté do fliaš nasledovne:

Uzavretie do fliaš zmiešanie s pufrom fosfát/chlorid sodný/polysorbát 80, ak je to potrebné sterilizácia ampuliek, uzávery a výrobné zariadenie 4 riedenie pufru fosfát/chlorid sodný/pufrom polysorbát 80 protilátky na 1,7 alebo 50 mg/ml sterilná filtrácia aseptické plnenie a uzavretie ampuliek nasadenie uzávera 4 testovanie pre uvedenie na trh

Špecifickejšie, natalizumab získaný napríklad postupmi diskutovanými vyššie, môže byť uzavretý do fliaše nasledovne. 200 I alebo 2000 I výrobok liečiva natalizumab sa môže plniť na plne automatizovanej plniacej linke vybavenej premývaním ampuliek, sterilizáciou a vytavovacím tunelom. Uzávery, utesnenia a plniace zariadenie sú pred použitím premyté a sterilizované. Tento proces umožňuje operácie väčšieho rozsahu konzistentné s objemami vyrobenými z 2000 I fermentácie.

Ak je to potrebné, pufer prípravku, 10 mM fosfát, 140 mM NaCl, pH 6,0 ± 0,5, 0,02% polysorbát 80, sa môže zmiešať do série Triedy 10 000 a použiť sa na zriedenie objemu liečiva na výslednú koncentráciu. Špecifikácie koncentrácie vo vnútri procesu, pH a hustota sa prednostne dosiahnu pred filtráciou.

Formulovaný natalizumab alebo iný imunoglobulín môže byť sterilné filtrovaný cez 0,2 μιη Millipak filter do vyrovnávacej komory z nehrdzavejúcej ocele vo vnútri sterilného jadra. Plnenie, uzatvorenie a nasadenie uzávera na natalizumab je plne automatizované. Na sterilitu objemu sa zbierajú sa vzorky vo vnútri procesu; počas operácie plnenia sa vykonáva testovanie hmotnosti naplnenia a vstupného priestoru. Naplnené liečivo je uchovávané v chladničke pri 2-8°C.

Náplň sa nachádza v plne legalizovanom sterilnom jadre Triedy 100. Plniaca linka je legalizovaná na uskutočnenie plnenia objemov v rámci očakávaných tolerancií na objemy 5 ml a 20 ml. Úplné environmentálne monitorovanie sa vykonáva v priebehu operácie plnenia a preskúmava sa na overenie súladu s touto normou. Naplnenie médií sa vykonáva na štvrtenom základe, aby sa podporili operácie aseptického naplnenia.

Alternatívne, môže byť vyrobená 200 I liečivová látka uzavretá do fliaš podľa nasledujúceho príkladu. Ampulky, plniace ihly, filtračná zostava a trubice sú pripravené pre použitím. Uzávery môže pripraviť dodávateľ. Uzávery sú potom pre plnením sterilizované.

Výrobok liečiva natalizumab alebo iný proteín sa plní na poloautomatickej plniacej linke várkou zo zložiek, automatizovaným plnením, okamžitým uzatvorením a následnou operáciou nasadenia uzávera. Táto operácia je primeraná pre operácie s várkou malého rozsahu.

Konečný roztok objemu je potom sterilné prefiltrovaný cez 0,2μ Millipack filter do sterilnej sklenenej nádoby v rámci environmentu Triedy 100. Kontroly pravidelnej kalibrácie a vnútorného procesu zaisťujú, že tolerancia naplnenia je ± 2%. Ampulky sa uzatvoria a okamžite sa nasadia uzávery. Naplnené liečivo je prednostne uchovávané v chladničke pri 2-8°C.

Sklenými nádobkami môže byť akékoľvek množstvo ampuliek, ale napríklad to môže byť 5,0 alebo 20 ml ampulka Typu I (EP) z neutrálneho skla, napríklad Epsom Glass alebo AMILCO alebo 5,0 ml alebo 20 ml ampulka USP Typu I z bórosilikátového skla, dodávaná od Kimble alebo Wheaton. Tieto ampulky môžu používať ktorékoľvek prostriedky vhodného uzáveru. Uzávery ampuliek zahrňujú, ale nie sú na ne obmedzené, 13 mm Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 uzáver zo šedej butylovej gumy alebo 13 mm a 20 mm Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 uzáver zo šedej butylovej gumy alebo 13 mm alebo 20 mm West 4432/50 uzáver zo šedej butylovej gumy. Uzatvorené ampulky s gumeným uzáverom sú potom utesnené typicky použitím hliníkového utesnenia, napríklad ako je vyrábané fy West.

Hoci predkladaný vynález bol popísaný detailne vzhľadom na príklady uvedené ďalej, rozumie sa, že sa môžu urobiť jeho rôzne modifikácie bez toho, aby sa odklonilo od podstaty vynálezu a toto je odborníkovi v danej oblasti známe.

Príklad 1

Výber Polysorbátu 80

Typický spôsob podávania natalizumabu je intravenózny. Intravenózne podávanie vyžaduje, aby výsledný prípravok bol izotonický. Na začiatku bol vybraný prípravok AN 100226 (natalizumab), 5mg/ml v 50 mM L-histidíne, 150 mM NaCl, pH 6,0 (Prípravok #1). Počas štúdie Fázy II bolo pri riedení a zavedení natalizumabu do klinického dávkovacieho zariadenia pozorované zrážanie proteinu protilátky. Do tohto prípravku bol zavedený Polysorbát 80 (prípravok #2), aby vyriešil pozorované zrážanie proteinu. Prednostne má polysorbát na použitie s týmto vynálezom malý obsah peroxidu, t.j. polysorbát od Sigma, číslo výrobku P6479, číslo série 071K7283.

Dvoma faktormi, ktoré boli predvedené na zrýchlenie zrážania AN 100226 protilátky, sú prítomnosť stopových hladín silikónového oleja a denaturácia na rozhraní vzduch-kvapalina. Silikónový olej bol zavedený do produktu pri použití štandardných namazaných polypropylénových striekačiek vybavených silikonizovanými gumenými uzávermi. Zavedenie silikónového oleja je dostatočné, aby spôsobilo zistiteľné zrážanie protilátky v Prípravku #1 pri jemnom miešaní a uchovaní pri izbovej teplote. Zhlukovanie, deamidácia a následné zrážanie spôsobené denaturáciou na rozhraní vzduch-kvapalina sa stali rozoznateľné problematickými u liečiva dodaného na klinickejšie miesta. Obe príčiny zrážania proteínu bolo riešené pridaním polysorbátu 80 s koncentráciou0,02 hmôt. %.

Prípravok #2 ukazuje porovnateľnú stabilitu s prípravkom histidín/NaCI (Prípravok #1) u všetkých proteínových charakterizačných skúšok, pokiaľ zabezpečuje zvýšenú stabilitu pri doprave a manipulovaní s produktom v klinickom prostredí.

Adícia polysorbátu 80 do prípravku predchádza tiež problému zrážania alebo zhlukovania protilátky pri príprave prípravkov s vyšším obsahom proteínu. Počiatočná práca sa zamerala na miešaním vyvolané zhlukovanie pri vysokých koncentráciách proteínu, vrátane 50 mg/ml. Podrobením materiálu miešaniu použitím mixéra vírového typu boli zistené vysoko výkonnou kvapalnou chromatografiou s vylúčením podľa veľkosti (SEC-HPLC) zhlukované druhy. Tento model identifikuje polysorbát 80 ako účinný inhibítor zhlukovania, kým sacharóza a ostatné pufračné zložky mali malý prínosový účinok.

Účinnosť adície 0,02 hmôt. % polysorbátu 80 pri prevencii miešaním vyvolaného zrážania s koncentráciou proteínu 5 mg/ml bolo stanovené po adícii 10 μί 10% roztoku polysorbátu 80 do ampuliek natalizumabu (séria č. AN 100226-0003). Ampulky boli trepané na svojich stranách spolu s niekoľkými ampulkami natalizumabu v Prípravku #1 pri 150 otočeniach za minútu v horizontálnej rovine. Po troch hodinách takéhoto trepania pri izbovej teplote mali ampulky s Prípravkom #1 častice a objavilo sa zakalenie, zatiaľ čo ampulky s 0,02 hmotn. % polysorbátu 80 ostali číre a bez častíc.

Predpokladá sa, že pozorované zhlukovanie je spôsobené rozhraním vzduchpovrch, keďže ampulky úplne naplnené s AN100226 v neprítomnosti polysorbátu 80 boli trepané po dlhšiu dobu bez toho, aby sa vytvorili dodatočné častice.

Uskutočnilo sa hodnotenie schopnosti 0,02 hmotn. % polysorbátu 80 inhibovať zrážanie proteínu uľahčené stopovými hladinami silikónu. Ampulka natalizumabu (séria č. AN 100226-0003) bola upravená 0,02 hmotn. % polysorbátu 80 a daná do komerčne dostupnej, namazanej 60 ml polypropylénovej striekačky. Tento materiál sa nechal stáť niekoľko hodín pri izbovej teplote. Vizuálna kontrola potvrdila, že sa nevyskytlo žiadne zrážanie. Tento materiál bol potom filtrovaný cez 0,2 μίτι filter do 5 ml ampulky a skontrolovaný a bolo zistené, že je po niekoľkých dňoch v podstate bez častíc, pričom ampulky, s ktorými sa nakladalo rovnakým spôsobom v neprítomnosti polysorbátu 80 (Prípravok #1), obsahovali častice.

Príklad 2

Výber pufru fosfátu

Pri testovaní pre uvedenie na trh placebo histidínu (obsahujúceho 0,02 hmotn. % polysorbátu 80) boli zistené nové stopové nečistoty. Tieto nečistoty vznikli z rozkladu polysorbátu 80, zrejme prostredníctvom oxidačnej reakcie obsahujúcej ióny kovu a histidín. U aktívneho liečiva natalizumab boli tieto nečistoty zistené len po uchovávaní pri zvýšenej teplote (napr. 25°C a 40°C). Bolo teda prijaté rozhodnutie modifikovať placebo a použiť fosfát na nahradenie histidínu v pufri. Séria histidínu použitá u výrobku placebo bola iná než tá, ktorá bola použitá u sérií aktívneho liečiva natalizumab AN100226-004 a AN100226-005. Dopad zdroja histidínu na rozklad polysorbátu 80 je diskutovaný detailnejšie nižšie v texte.

Pri testovaní placebo boli zistené stopové nečistoty v histidín/NaCI/0,02 hmotn. % polysorbát 80 placebo (Prípravok #2). Tieto nečistoty boli zistené ich absorbanciou pri nízkych vlnových dĺžkach ultrafialovej oblasti. Boli stanovené profily absorbancie od 200 do 400 nm u placebo uchovávaného pri 5°C, 25°C a 40°C po jeden mesiac. Tieto údaje indikujú, že nečistoty sa zvyšujú ako funkcia teploty.

Metóda HPLC s vylúčením podľa veľkosti použitá na monitorovanie zhlukovania protilátky bola modifikovaná, aby sa zvýšila senzitivita pre zisťovanie týchto stopových nečistôt zvýšením zaťaženia stĺpca 5-násobne na 100 μΙ, a vzorka sa použije skôr nezriedená než 10-násobne zriedená. Pritom je absorbancia monitorovaná pri 260 nm, aby odrážala maximum absorbancie nečistôt. Tento spôsob uskutočňuje prostriedok na vyhodnotenie prítomnosti stopových nečistôt v placebo a výrobku, keďže protilátka sa v elučnom profile objavuje oveľa skôr.

Výsledný produkt placebo a výsledný liečivový produkt natalizumab pripravené v Prípravku #1 a #2 boli analyzované spôsobom SEC-HPLC, ktorý bol popísaný vyššie. Analýza placebo v Prípravku #1 spojeného s polysorbátom 80 do 0,02 hmotn. % bola vykonaná tesne pred chromatografiou. To ukazuje UV absorbanciu spektra polysorbátu, histidínu a soli bez stopových nečistôt. Zreteľný vrchol po 16 minútach je spojený s polysorbátom 80, pričom vrcholy po približne 26-27 minútach sú pripisované vlastnostiam histidínu a soli. Histidín/NaCI/0,02 hmotn. % polysorbát 80 placebo (Prípravok #2) uchovávaný pri 5°C po dobu 2 mesiacov ukazuje viditeľný nárast u posledne eluovaných vrcholov, ktorý zapríčiňuje polysorbát 80 pri vytvorení týchto nečistôt. Navyše, eluovanie sa po 16 minútach stratilo, čo indikuje, že polysorbát 80 bol rozložený.

AN100226 uchovávaný ako objemová liečivová látka po dobu približne 5 mesiacov pri 5°C v Prípravku #1 bol analyzovaný po spojení s polysorbátom 80 do 0,02 hmotn. % tesne pred chromatografiou. Pri použití týchto zaťažovacích podmienok protilátka eluuje po 18 minútach. Zvyšok profilu pripomína spojenie placebo s polysobrátom 80. Dvojmesačné stabilné vzorky u série natalizumabu #AN 100226-0004 boli analyzované týmto spôsobom. Elučný profil u vzorky 5°C natalizumabu indikuje po 26-27 minútach neprítomnosť akýchkoľvek ďalších vrcholov a porovnateľných hladín s vrcholmi histidín/soľ. Stopové nečistoty sú zistené po 2 mesiacoch u 25°C vzorky, a zvýšené hladiny sú prítomné u dvojmesačnej 40°C vzorky. Teda, nečistoty neboli zistené u klinicky uchovávaných vzoriek, ktoré boli uchovávané pri 5°C. Objavenie sa týchto stopových nečistôt sa vyskytuje oveľa rýchlejšie u placebo než u natalizumabu.

Pre vyhnutie sa vytvoreniu týchto nečistôt u placebo, bol v prípravku placebo nahradený histidín zložkami anorganických pufrov. Produkt placebo na klinické pokusy je sterilný izotonický roztok tlamivého roztoku fosfátu s 0,02 hmotn. % polysorbátu 80, s pH 6,0. Pre výrazné redukovanie rýchlosti degradácie polysorbátu 80 bola vykonaná substitúcia histidínu fosfátom. 100 μΙ prípravku fosfát/NaCI/0,02 hmotn. % polysorbát 80 placebo bolo analyzované pomocou HPLC s vylúčením podľa veľkosti monitorovaným pri 260 nm v čase nula a po 3 dňoch pri 60°C. Ako výsledok tejto inkubácie bolo visieť malé zmeny v SEC-HPLC profile. SEC-HPLC profil u prípravku histidín/NaCI/0,02 hmotn. % polysorbát 80 len po dvoch dňoch pri 60°C ukazuje výrazné hladiny stopových nečistôt vzhľadom na degradáciu polysorbátu 80. Tieto údaje ukazujú, že degradácia polysorbátu 80 je výrazne ohrozená nahradením histidínu fosfátom v prípravku placebo.

Príklad 3

Prípravok natalízumabu kombinovaný s polysorbátom 80 a histidínom

Mechanizmus, ktorým sú stopové nečistoty vytvorené, sa predpokladá prostredníctvom kovom katalyzovanej oxidácie polysorbátu (viď Donbrow et al., 1978 J. Pharmaceutical Sciences, 67(12): 28). Donbrow popisuje, že u rôznych typov polysorbátu (napr. polysorbát 20) sa vyskytuje pri uchovávaní autooxidácia. Na autooxidáciu vplýva aj svetlo, teplota a ióny kovov. Donbrow et al. (1978). Potvrdilo sa, že histidín a polysorbát 80 vyžadujú u tejto reakcie, aby sa postupovalo výraznou rýchlosťou. Ajinomoto je jediný zdroj histidínu použitého v prípravku. Avšak výrazné rozdiely v rýchlosti reakcie medzi sériami dodanými Ajinmomotom neboli pozorované.

Ďalším faktorom, ktorý zohráva úlohu pri urýchľovaní reakcie je prítomnosť kovu. Toto bolo ukázané vedením reakcie pri 60°C počas piatich dní v sklenej nádobe s 50 mM histidínom (séria č. R016A008) a 2 hmotn. % polysorbátu 80. Pri týchto podmienkach boli vytvorené u série histidínu minimálne hladiny stopových nečistôt. Reakcia bola potom rozdelená do troch nádobiek: (1) prvá nádobka ostala ako kontrolná; (2) k druhej nádobky bol pridaný šedý butylový uzáver nádobky; a (3) k tretej nádobke bola pridaná ihla z nehrdzavejúcej ocele. Tieto reakcie potom boli vedené po dobu štyroch dní pri 60°C a analyzované UV skenom od 200 do 400 nm. Reakcia postupovala po tomto čase ďalej v prítomnosti ihly.

Príklad 4

Vyhodnotenie nečistôt - test s obmedzením na jednu dávku u myši

Potenciálna toxicita týchto nečistôt bola vyhodnotená testom s obmedzením na jednu dávku u myši. Boli použité vzorky histidín placebo a natalizumab v Prípravku #2 uchovávané pri 40°C po dobu šiestich týždňov, pretože tieto vzorky poskytujú najväčšie množstvo nečistôt. Kvôli nečistotám sa nevyskytli žiadne známky toxicity. Predbežné údaje sú uskutočnené v neklinickej sekcii skúmania.

U 100 μΙ injekcií vzoriek použitých pre test s obmedzením na jednu dávku u myši boli určené SEC-HPLC profily. Vzorka natalízumabu v Prípravku #1 spojená s polysorbátom 80 pred analýzou má neveľa 260 nm absorbujúcej látky eluujúcej po 20 minútach. Vrchol eluujúci po 34 minútach bol zistený v tejto sérii natalízumabu bez pridania polysorbátu 80, a teda to neindikuje degradáciu polysorbátu 80.

Naopak, placebo u Prípravku #2 uchovávanom pri 40°C po dobu šiestich týždňov ukázalo úplnú degradáciu, keď celková oblasť pod krivkou bola 12,8 miliónov μλ/s. Vzorka natalizumabu u Prípravku #2 a uchovávanom pri 40°C po dobu šiestich týždňov mala menšiu celkovú degradáciu. Analýza potvrdzuje, že vo vzorkách uchovávaných pri 40°C a testovaných testom s obmedzenímna jednu dávku u myši sa nachádza degradovaný polysobrát 80.

Príklad 5

Zavedenie špecifikácií nečistôt

Pre stanovenie, či degradovaný polysorbát 80 je ešte schopný zabrániť zhlukovaniu protilátky, bol Prípravok #2 zohrievaný na 60°C po dobu troch dní v prítomnosti ihly na konvertovanie celého polysorbátu 82 kvôli maximálnym hodnotám nečistôt. Pomocou SEC a reverznej fázy HPLC bolo potvrdené, že reakcia má degradovaný všetok polysorbát 80 Tento materiál bol zriedený jedna k jednej 10 mg/ml roztoku AN 100226 v prípravku #2, čo vyústilo do roztoku obsahujúceho 0,01 hmotn. % polysorbátu 80 a 50% maximálnych hodnôt degradovaného polysorbátu 80. Tieto roztoky protilátok boli vystavené po niekoľko hodín trepaniu a silikonizovaným striekačkám; zhlukovaniu protilátky sa zabránilo. Kontrolné vzorky vystavené tým istým podmienkam bez polysorbátu 80 ukázali výrazné zrážanie.

Z tejto práce sa uzavrelo, že pokiaľ sa degraduje menej ako päťdesiat percent polysorbátu 80, tento materiál môže zabezpečiť zodpovedajúce prostredie na zabránenie zhlukovania protilátky.

Hoci sa vyskytuje v aktívnom liečive veľmi slabá degradácia polysorbátu 80, je urobené monitorovanie modelu izoelektrického zaostrovania (IEF) na potvrdenie, že tento prípravok neohrozuje protilátku. Boli určené IEF profily pre šesťtýždňové stabilné časové body pre 5°C, 25°C a 40°C podmienky uchovávania. 5°C a 25°C vzorky sú porovnateľné s referenčným štandardom, bez dôkazu akejkoľvek zmeny u všetkých stránok obsahu proteínu. 40°C vzorka ukázala posun k viac kyslejším druhom typickým pre tento produkt v kvapalnom prípravku, buď v prítomnosti, alebo neprítomnosti polysorbátu 80.

Na zavedenie vzťahu medzi rozsahom degradácie polysorbátu 80 a oblasťou vrcholu zo SEC-HPLC boli hodnotené zriedené rady šiestich koncentrácií degradovaného polysorbátu 80 od 0 do 50 %. Prípravok #2 bol zohrievaný na 60°C po dobu 3 dní s ihlou a prostredníctvom SEC a reverznej fázy HPLC potvrdil, že je 100% degradovaný. Reakčná zmes bola potom zriedená čisteným objemom AN100226 v Prípravku #1, čerstvo spojeným s 0,02 hmotn. % polysorbátu 80 a analyzovaná prostredníctvom SEC-HPLC. SEC profily boli monitorované pri 260 nm.

Údaje z týchto radov zriedení boli vynesené do diagramu pomocou integrovanej oblasti celkového vrcholu (pVs) u absorbančného profilu po približne 24 minútach ako funkcia pomeru degradovaného polysorbátu 80. Diagram indikuje, že oblasť s menej než 5 miliónmi μλ/s. predstavuje 50% straty polysorbátu 80 u degradačných produktov. Je tu priamy vzťah medzi množstvom oxidovaného polysorbátu 80, ktorý bol pridaný, a oblasťou vrcholov pre vrcholoy neskoro eluujúce v chromatograme.

Na základe testu s obmedzením na jednu dávky u myší bol zavedený predbežný limit pre tieto nečistoty u natalizumabu, údaje rozpustnosti protilátky s 50% degradovaným polysorbátom 80 a odhaduje sa rozsah degradácie polysorbátu 80. Tento spôsob bol zahrnutý do súčasného stabilizačného programu a bol zavedený limit. Ak sú vyrábané ďalšie série s histidínovým pufrom, tieto limity sa budú takisto používať v čase uvedenia na trh.

Limit: celková obasť pod vrcholmi po približne 24 minútach nesmie prekročiť 4 x 106 pV-s.

Príklad 6

1,7 mg/ml prípravok natalizumab

1,7 mg natalizumab

1,4 mg fosfát sodný, USP

8,2 mg chlorid sodný, USP

0,2 mg polysorbát 80

Upravenie pH na 6,0+0,5 kyselinou fosforečnou, NF. QS na 1 ml. S prednostným uchovávaním pri 5-8°C.

Príklad 1

5,0 mg/ml prípravok natalizumab

5,0 mg natalizumab

1,4 mg fosfát sodný, USP

8,2 mg chlorid sodný, USP

0,2 mg polysorbát 80, NF

Upravenie pH na 6,0±0,5 kyselinou fosforečnou, NF. QS na 1 ml. S prednostným uchovávaním pri 5-8°C.

Príklad 8

20,0 mg/ml prípravok natalizumab

20,0 mg natalizumab

1,4 mg fosfát sodný, USP

8,2 mg chlorid sodný, USP

0,2 mg polysorbát 80, NF

Príklad 9

50,0 mg/ml prípravok natalizumab

50,0 mg natalizumab

1,4 mg fosfát sodný, USP

8,2 mg chlorid sodný, USP

0,2 mg polysorbát 80, NF

Príklad 10

5,0 mg/ml prípravok natalizumab

5,0 mg natalizumab

140 mM NaCl

0,02 hmotn. % polysorbát 80 mM fosfát sodný

Upravenie pH na 6,0±0,5 kyselinou fosforečnou,. Optimálne uchovávať prípravok pri

5-8°C.

Príklad 11

10,0 mg/ml prípravok natalizumab

10,0 mg natalizumab

1,4 mg fosfát sodný, USP

8,2 mg chlorid sodný, USP

0,2 mg polysorbát 80, NF

Príklad 12

10,0 mg/ml prípravok natalizumab

10,0 mg natalizumab

1,4 mg fosfát sodný, USP

8,2 mg chlorid sodný, USP

0,2 mg polysorbát 80, NF

Príklad 13

20,0 mg/ml prípravok natalizumab

20,0 mg natalizumab

140 mM NaCI

0,02 hmotn. % polysorbát 80 mM fosfát sodný

Upravenie pH na 6,0±0,5 kyselinou fosforečnou, a doplnenie objemu na 125 ml. Optimálne uchovávať prípravok pri 5-8°C.

Prípravok 15

Prípravok lyofílizovaný natalizumab

Ďalšie kvapalné prípravky protilátky s vysokou koncentráciou, od 20-200 mg/ml, môžu obsahovať fosfát alebo iný vhodný pufer (ako je histidín, citrát, octan alebo jantáran) v rozmedzí koncentrácií 2 až 50 mM, na uskutočnenie pufru v rozmedzí pH 3,0 až 7,0. Najprednostnejšie je pH 6,0 ± 0,5. Adícia polyolov (ako je sorbitol a manitol), disacharidov (ako je sacharóza alebo trehalóza) a aminokyselín (ako je glycín) môžu byť pridané v meniacich sa množstvách s chloridom sodným pre udržanie stability a uskutočnenie izotonického roztoku. Použitie povrchovo aktívnych látok, ako sú polysorbáty, ale bez obmedzenia na ne, pridá stabilitu, ak sú použité v rozmedzí od 0,001 až 2%. Na prípravu kvapalného prípravku bol natalizumab koncentrovaný na 65 mg/ml v 10 mM fosfátu sodného, 140 mM chloridu sodného, s 0,06% polysorbátu 80. Výsledný roztok bol jemne opalizujúci, aLe bez častíc. Vzorka obsahovala viac než 99% monoméru bez zhlukov s vyššou molekulovou hmotnosťou alebo druhov s nižšou molekulovou hmotnosťou podľa SEC.

Je uskutočnený stabilný lyofilizovaný farmaceutický prípravok. Pretože fosfátový pufer prechádza pri mrazení zmenou pH, je potrebné nahradiť fosfát iným pufrom. Tento pufer môže zahrňovať histidín, citrát alebo jantáran so schopnosťou účinne vytvárať pufer v rozmedzí pH 3,0 až 7,0, najprednostnejšie v rozmedzí pH 6,0±0,5.

Použitie polyolov (ako je manitol) a cukrov (ako je sacharóza) je potrebné pre uskutočnenie kryo- a lyo-ochrany. Tieto polyoly môžu byť použité samostatne alebo v kombinácii pre uskutočnenie stability a úpravy tonusu. Ďalej, na zabránenie zhlukovania sa môžu použiť aminokyseliny (ako je glycín) s hodnotami 10-1000 mM.

Povrchovo aktívne látky, ako sú polysorbáty alebo poloxaméry, môžu byť použité s hladinami od 0,001% do 0,2%, aby zabezpečili stabilitu pred lyofilizáciou apo opätovnom nastolení rovnováhy a aby pripravili rýchlejšie čas pre opätovné nastolenie rovnováhy.

Proteín sa po konečnom kroku čistenia môže pripraviť použitím ultrafiltrácie pre koncentráciu a diafiltrácie pre výmenu pufru. Protein môže byť pripravený aj použitím stĺpcovej chromatografie pre výmenu pufru. Môžu sa použiť aj niektoré kombinácie týchto techník.

Pritom môže byť výsledná požadovaná koncentrácia proteínu získaná doplnením na koncentráciu proteínu a excipienta nižšiu než je požadovaná a opätovné nastolenie rovnováhy malým objemom. Napríklad, môže sa použiť 2,5 ml doplneného objemu zo 40 mg/ml roztoku, po čom nasleduje opätovné nastolenie rovnováhy s 1 ml na získanie 100 mg/ml roztoku.

Napríklad, natalizumab, s koncentráciou 20 mg/ml bol lyofilizovaný v roztoku obsahujúcom 5mM histidín, 20 mg/ml sacharózy a 0,02 hmotn. % polysorbátu 80, pH 6. Roztok bol naplnený 5 ml na ampulku do 10 ml ampuliek z bórosilikátového skla a utesnený s lyofilizačnými uzávermi zo šedej butylovej gumy. Produkt bol zmrazovaný na uchovávaciu teplotu -60°C po dobu 10 hodín a potom bola uchovávacia teplota zvýšená na -40°C. Primárne sušenie bolo vykonané pri uchovávacej teplote -10°C a tlakovej komore so 10132,5 Pa po dobu 20 hodín. Sekundárne sušenie sa dosiahlo pri uchovávacej teplote 25°C s tlakovou komorou 10132,5 Pa po dobu 10 hodín. Ampulky boli uzatvorené vo vákuu.

Ampulky boli potom opätovne uvedené do rovnováhy použitím 1 ml sterilného WFI za vzniku prípravku obsahujúceho 100 mg/ml natalizumabu. Vzorky boli analyzované ihneď po lyofilizácii a po 2 týždňoch uchovávania v lyofilizovanej forme pri 40 stupňoch. V oboch prípadoch bol čas opätovného nastolenia rovnováhy okamžite. Roztoky opätovne uvedené do rovnováhy boli číre a bezfarebné a neobsahovali časticový materiál. Vzorky obsahovali viac než 99% monoméru podľa SEC, bez zhlukov s vyššou molekulovou hmotnosťou alebo druhov s nižšou molekulovou hmotnosťou. Po 2 týždňoch uchovávania pri 40 stupňoch vzorky ukázali 94% potenciu vzhľadom na referenciu (špecifikácia 80-125%).

Všetky citované patenty a publikácie týkajúce sa tejto prihlášky sú tu zahrnuté referenciou vo svojej úplnosti na všetky účely.

Claims

1. Stabilný, hydratačný farmaceutický prípravok zahrňujúci imunoglobulín, pufer fosfátu, polysorbát a chlorid sodný.

2. Prípravok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že polysorbátom je polysorbát 80.

3. Prípravok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že polysorbát 80 sa v ňom nachádza v množstve 0,001 hmotn. % až 2,0 hmotn. %.

4. Prípravok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že polysorbát sa v ňom nachádza v množstve 0,02 hmotn. %.

5. Prípravok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že imunoglobulín sa v ňom nachádza v množstve 0,01 mg/ml až 200 mg/ml.

6. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci v ňom nachádza v množstve 1,7 mg/ml. sa t ý m, že imunoglobulín sa 7. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci v ňom nachádza v množstve 5 mg/ml. sa t ý m, že imunoglobulín sa 8. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci v ňom nachádza v množstve 20 mg/ml. sa t ý m, že imunoglobulín sa 9. Prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, že prípravok, má pH 3,0 až 7,0. vyznačujúci sa tým,

10. Prípravok podľa nároku 9, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že pH je 5,5 až 6,5.

11. Prípravok podľa nároku 10, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že pH je 6,0 ± 0,5.

12. Prípravok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že je v stálom objeme a imunoglobulín sa v ňom nachádza v množstve 50 mg/ml.

13. Prípravok podľa nároku 12,vyznačujúci sa tým, že imunoglobulín viaže alfa-4-integrin.

14. Prípravok podľa nároku 13, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že imunoglobulínom je natalizumab.

15. Prípravok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že fosfátový pufer je pri pH 6,0 ± 0,5, polysorbátom je polysorbát 80 a nachádza sa v ňom v množstve 0,02 hmotn. %, imunoglobulínom je natalizumab, a t ý m, že prípravok je stabilný pri teplote 2°C až 8°C po dobu aspoň 6 mesiacov.

16. Prípravok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že natalizumab sa v ňom nachádza v množstve 20 mg/ml až 150 mg/ml.

17. Prípravok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že tento prípravok je izotonický.

18. Prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14 alebo17, vyznačujúci sa t ý m, že imunoglobulínom je monoklonálna protilátka.

19. Prípravok podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že monoklonálnou protilátkou je natalizumab.

20. Prípravok podľa nárokov 18a19, vyznačujúci sa tým, že protilátka sa v ňom nachádza v množstve 0,1 mg/ml až 200 mg/ml.

21. Prípravok podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že protilátka sa v ňom nachádza v množstve 1 mg/ml až 150 mg/ml.

22. Prípravok podľa nároku 21,vyznačujúci sa tým, že protilátka sa v ňom nachádza v množstve 1,7 mg/ml až 50 mg/ml.

23. Prípravok podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že protilátka sa v ňom nachádza v množstve 15 mg/ml až 50 mg/ml.

24. Prípravok podľa nároku 18, vyz n a č u j ú c i sa t ý m, že protilátka sa v ňom nachádza v množstve 20 mg/ml.

25. Prípravok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že tento prípravok ďalej zahrňuje histidín.

26. Prípravok podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že polysorbátom je polysorbát 80.

27. Spôsob liečenia stavu pacienta s kolísavou hmotnosťou terapeutickým množstvom imunoglobulínu zahrňujúci podávanie prípravku podľa nároku 1 tomuto pacientovi, vyznačujúci sa tým, že tento stav sa lieči podávaním tohto prípravku.

28. Spôsob podľa nároku 27, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že imunoglobulínom je natalizumab.

29. Zmes zahrňujúca fosfát sodný, polysorbát, protein a chlorid sodný s pH 6,0±0,5, vyznačujúca sa t ý m, že zlúčenina je stabilná, ak je uchovávaná pri 5°C až 8°C pod dobu do 6 mesiacov.

30. Zmes podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že polysorbátom je polysorbát 80 a nachádza sa v nej v množstve 0,001 hmotn. % až 2 hmotn. %.

31. Zmes podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že proteínom je imunoglobulín, ktorý sa v nej nachádza v množstve 0,01 mg/ml až 200 mg/ml.

32. Zmes podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že polysorbátom je polysorbát 80 a nachádza sa v nej v množstve 0,02 hmotn.%, chlorid sodný sa v nej nachádza v množstve 150 mM, fosfátový pufer sa v nej nachádza v množstve 10 mM a imunoglobulínom je natalizumab a nachádza sa v nej v množstve 1,7 mg/ml, 5 mg/ml, 20 mg/ml alebo 50 mg/ml.

33. Spôsob prípravy stabilného prípravku obsahujúceho proteín a zahrňujúceho zmiešanie fosfátu sodného, chloridu sodného, polysorbátu a proteínu a upravenie pH zmesi kyselinou fosforečnou na pH 6,0 ± 0,5.

34. Spôsob prípravy stabilného prípravku zahrňujúceho proteín podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že fosfát sodný sa v ňom nachádza v množstve 10 mM, chlorid sodný sa v ňom nachádza v množstve 150 mM, polysorbátom je polysorbát 80 a nachádza sa v ňom v množstve 0,02 hmot.%. a proteínom je natalizumab.

35. Spôsob prípravy stabilného prípravku obsahujúceho protein podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že natalizumab sa v ňom nachádza v množstve 20 mg/ml až 200 mg/ml.

36. Spôsob prípravy stabilného prípravku obsahujúceho protein podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že natalizumab sa v ňom nachádza v množstve 150 mg/ml.

37. Spôsob prípravy stabilného prípravku obsahujúceho protein podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že protein je prípravku podľa nároku 1 lyofilizovaný.

38.Spôsob prípravy stabilného prípravku obsahujúceho protein podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že polysorbátom je polysorbát 80 a nachádza sa v ňom v množstve 0,02 hmotn. % a proteínom je natalizumab.

39. Spôsob prípravy stabilného prípravku obsahujúceho proteín podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že tento prípravok ďalej zahrňuje histidín.

40. Spôsob prípravy stabilného prípravku obsahujúceho proteín podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že proteín je lyofilizovaný v roztoku obsahujúcom 5 mM histidín, 20 mg/ml sacharózy a 0,02 hmotn. % polysorbátu 80 pri pH 6 a t ý m, že proteinom je natalizumab s koncentráciou 20 mg/ml.

41. Výrobok obsahujúci nádobku, v ktorej je stabilný prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 29.

42. Spôsob liečenia stavu pacienta s kolísavou hmotnosťou zahrňujúci simultánne alebo po častiach podávanie tomuto pacientovi terapeuticky účinného množstva prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24 a a zlúčeniny alebo terapie účinnej proti tomuto stavu.

43. Použitie stabilného prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24 na prípravu lieku na liečbu stavu u pacienta s kolísavou hmotnosťou, vyznačujúci sa t ý m, že tento liek je účinný na liečenie uvedeného stavu.

44. Použitie stabilného prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24 na prípravu lieku na liečbu stavu u pacienta s kolísavou hmotnosťou, vyznačujúci sa t ý m, že tento liek je kombináciou prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24 a zlúčeniny alebo terapie, a t ý m, že uvedený liek je účinný na liečenie uvedeného stavu.