ES2614807T3

ES2614807T3 - Formulaciones vacunales

Info

Publication number: ES2614807T3
Application number: ES11728059.4T
Authority: ES
Inventors: Lakshmi Khandke; Abbas Rashidbaigi
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2017-06-02
Anticipated expiration: 2031-05-25
Also published as: RU2607024C2; JP2015143252A; CN102933229A; IL223206A0; EP2575870A2; CA2799747C; CA2799747A1; BR112012030950B1; JP5959161B2; EP3170508B1; EP2575870B1; ES2764674T3; US9095567B2; JP2011256168A; AU2011262346A1; CN107080838A; BR112012030950A2; IL223206A; RU2012151376A; DK2575870T3

Abstract

Una composición inmunogénica multivalente que comprende conjugados de polisacárido-proteína que consisten en polisacáridos capsulares neumocócicos de los serotipos de Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F conjugados individualmente con CRM197, y que comprenden además 2-fenoxietanol (2-PE) a una concentración de entre 7 mg/ml y 15 mg/ml.

Description

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seleccionándose las concentraciones de sal para complementar otros componentes (por ejemplo, azúcares) de manera que la osmolalidad total final de la formulación sea compatible con la administración parenteral (por ejemplo, inyección intramuscular o subcutánea) y potencie la estabilidad a largo plazo de los componentes inmunogénicos de la formulación de vacuna en varios intervalos de temperatura. Las formulaciones de sales libres tolerarán mayores intervalos de uno o más crioprotectores seleccionados para mantener los niveles de osmolaridad finales deseados.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más crioprotectores seleccionados de, pero sin limitación, disacáridos (por ejemplo, lactosa, maltosa, sacarosa o trehalosa) e hidrocarburos polihidroxilados (por ejemplo, dulcitol, glicerol, manitol y sorbitol).

En ciertas realizaciones, la osmolaridad de la formulación está en un intervalo de aproximadamente 200 mOs/l a aproximadamente 800 mOs/l, con un intervalo preferido de aproximadamente 250 mOs/l a aproximadamente 500 mOs/l, o de aproximadamente 300 mOs/l -de aproximadamente 400 mOs/l. Una formulación exenta de sal puede contener, por ejemplo, del aproximadamente 5 % al aproximadamente 25 % de sacarosa, y preferentemente del aproximadamente 7 % al aproximadamente 15 %, o del aproximadamente 10 % al aproximadamente 12 % de sacarosa. Como alternativa, una formulación exenta de sal puede contener, por ejemplo, del aproximadamente 3 % al aproximadamente 12 % de sorbitol, y preferentemente del aproximadamente 4 % al 7 %, o del aproximadamente 5 % al aproximadamente 6 % de sorbitol. Si se añade sal, tal como cloruro de sodio, entonces, el intervalo eficaz de sacarosa o sorbitol se reduce relativamente. Estas y otras dichas consideraciones de osmolalidad y osmolaridad pertenecen al ámbito de la técnica.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más inhibidores de la oxidación de radicales libres y/o agentes quelantes. Se conoce una variedad de neutralizadores de radicales libres y quelantes en la materia y se aplican a las formulaciones y los procedimientos de uso descritos en el presente documento. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, etanol, EDTA, una combinación de EDTA/etanol, trietanolamina, manitol, histidina, glicerol, citrato de sodio, hexafosfato de inositol, tripolifosfato, ácido ascórbico/ascorbato, ácido succínico/succinato, ácido málico/maleato, desferal, EDDHA y DTPA, y diversas combinaciones de dos o más de los anteriores. En ciertas realizaciones, se puede añadir al menos un neutralizante de radicales libres no reductor a una concentración que potencie efectivamente la estabilidad a largo plazo de la formulación. También se pueden añadir uno o más inhibidores de la oxidación de radicales libres/quelantes en diversas combinaciones, tales como un neutralizante y un catión divalente. La elección del quelante determinará si se requiere o no la adición de un neutralizante.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más tensioactivos no iónicos, incluyendo, pero sin limitación, ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán, polisorbato-80 (Tween 80), Polisorbato-60 (Tween 60), polisorbato-40 (Tween 40) y polisorbato20 (Tween 20), alquiléteres de polioxietileno, incluyendo, pero sin limitación, Brij 58, Brij 35, así como otros tales como Triton X-100; Triton X-114, NP40, Span 85 y la serie Pluronic de tensioactivos no iónicos (por ejemplo, Pluronic 121), con componentes preferidos de Polisorbato-80 a una concentración del aproximadamente 0,001 % al aproximadamente 2 % (prefiriéndose hasta aproximadamente 0,25 %) o Polisorbato-40 a una concentración del aproximadamente 0,001 % al 1 % (prefiriéndose hasta aproximadamente 0,5 %).

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención comprende uno o más agentes estabilizantes adicionales adecuados para la administración parenteral, por ejemplo, un agente reductor que comprende al menos un grupo tiol (-SH) (por ejemplo, cisteína, N-acetil-cisteína, glutatión reducido, tioglicolato de sodio, tiosulfato, monotioglicerol o mezclas de los mismos). Como alternativa u opcionalmente, las formulaciones vacunales que contienen conservantes de la invención se pueden estabilizar aún más mediante la eliminación del oxígeno de los recipientes de almacenamiento, protegiendo la formulación de la luz (por ejemplo, mediante el uso de envases de vidrio ámbar).

Las formulaciones vacunales que contienen conservantes de la invención pueden comprender uno o más vehículos

o excipientes farmacéuticamente aceptables, que incluyen cualquier excipiente que no induzca por sí mismo una respuesta inmune. Los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitación, macromoléculas tales como proteínas, sacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa (Paoletti y col, 2001, Vaccine, 19:2118), trehalosa, lactosa y agregados de lípidos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Dichos vehículos son bien conocidos para el experto en la materia. Se describen excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, en Gennaro, 2000, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20ª edición, ISBN:0683306472.

Las composiciones de la invención pueden estar liofilizadas o en forma acuosa, es decir, soluciones o suspensiones. Las formulaciones líquidas se pueden administrar ventajosamente directamente desde su forma envasada y ser, por lo tanto, ideales para la inyección sin la necesidad de su reconstitución en un medio acuoso como, de otro modo, se requiere para las composiciones liofilizadas de la invención.

En la presente invención, la vacuna es una composición inmunogénica multivalente que comprende polisacáridos capsulares de neumococos de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F, conjugados individualmente a CRM197. La vacuna se puede formular para que comprenda: de 1 a 5 g, preferentemente aproximadamente 4,4 g/ml de cada polisacárido, pero preferentemente aproximadamente 8,8 g/ml de 6B; de 20 a

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100 g/ml, preferentemente aproximadamente 58 g/ml de proteína vehículo CRM197; de 0,02 a 2 mg/ml, preferentemente 0,25 mg/ml de aluminio elemental en forma de fosfato de aluminio; cloruro sódico del 0,5 al 1,25 %, preferentemente aproximadamente al 0,85 %; polisorbato 80 del 0,002 al 0,2 %, preferentemente al aproximadamente 0,02 %; tampón de succinato sódico 1 a 10 mM, preferentemente aproximadamente 5 mM a un pH de 4 a 7, preferentemente a un pH de 5,8; y de 4 a 20 mg/ml, preferentemente aproximadamente 10 mg/ml de 2fenoxietanol.

En presente invención, la vacuna es una composición inmunogénica multivalente que comprende polisacáridos capsulares de neumococos de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F, conjugados individualmente a CRM197. La vacuna se puede formular para que comprenda: aproximadamente 4,4 g/ml de cada polisacárido, a excepción de 6B a aproximadamente 8,8 g/ml; aproximadamente 58 g/ml de proteína vehículo CRM197; aproximadamente 0,25 mg/ml de aluminio elemental en forma de fosfato de aluminio; cloruro de sodio al aproximadamente 0,85 %; polisorbato 80 al aproximadamente 0,02 %; tampón de succinato sódico aproximadamente 5 mM a un pH de 5,8; y aproximadamente 10 mg/ml de 2-fenoxietanol.

La cantidad de muchos de los materiales que puede comprender la composición de la invención se puede expresar en peso/dosis, en peso/volumen, o % de concentración (en peso/volumen o peso/peso). Todos estos valores se pueden convertir entre sí. Para las conversiones en y a partir de una unidad de peso/dosis, se especifica un volumen de la dosis. Por ejemplo, dada una dosis de 0,5 ml, 5,0 mg/dosis de 2-PE es equivalente a una concentración de 10 mg/ml o 1,0 % (g/100 ml).

La formulación de la vacuna también se puede expresar como una proporción de polisacárido:2-PE. Por ejemplo, una dosis de 0,5 ml de la formulación preferida de 4,4 g/ml de cada sacárido, a excepción de 6B a 8,8 g/ml y de 10 mg/ml de 2-PE tendrá 30,8 g de polisacárido (2,2 g x 12 serotipos + 4,4 g para el serotipo 6B) y 5.000 g de 2-PE. Por lo tanto, la proporción en peso de polisacárido:2-PE es de 30,8:5.000.

En ciertas realizaciones de la invención, la proporción en peso de polisacárido:2-PE de la vacuna es de 5:5.000 a

100:5.000. En una realización preferida de la invención, dicha proporción en peso de polisacárido:2-PE es de aproximadamente 30,8:5.000.

Administración de formulaciones vacunales

También se proporcionan procedimientos de uso de las composiciones y formulaciones farmacéuticas desveladas que comprenden al menos un conservante para inducir una respuesta inmune contra un neumococo en un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano, preferentemente en un niño o un bebé, y para protegerlo de este modo contra la infección. Las formulaciones vacunales de la presente invención se pueden usar para proteger a un sujeto humano susceptible a la infección neumocócica, mediante la administración de la vacuna a través de una vía sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir, por ejemplo, la administración parenteral o la administración mucosa por la vía oral/alimentaria, respiratoria o genitourinaria.

La administración directa de los preparados vacunales de la presente invención a un sujeto se puede realizar mediante la administración parenteral (intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa o al espacio intersticial de un tejido); mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración mucosa. En una realización preferida, la administración parenteral es por inyección intramuscular, por ejemplo, en el muslo o parte superior del brazo del sujeto. La inyección puede ser mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero, como alternativa, se puede usar una inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml. Las composiciones de la invención pueden prepararse en diversas formas, por ejemplo, para la inyección bien como soluciones o suspensiones líquidas. En ciertas realizaciones, la composición se puede preparar como un polvo o pulverizado para la administración pulmonar, por ejemplo, en un inhalador. En otras realizaciones, la composición se puede preparar como un supositorio o pesario, o para la administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, en forma de un pulverizado, gotas, gel o polvo.

En una realización, se puede usar la administración intranasal para la prevención de la neumonía o la otitis media (pues se puede prevenir de manera más eficaz el porte nasofaríngeo de neumococos, atenuándose así la infección en su etapa más temprana).

La cantidad de conjugado de cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos adversos significativos. Dicha cantidad puede variar dependiendo del serotipo del neumococo. En general, cada dosis comprenderá de 0,1 a 100 g de polisacárido, particularmente de 0,1 a 10 g, y más particularmente de 1 a 5 g.

Las cantidades óptimas de componentes para una determinada vacuna se pueden determinar mediante estudios convencionales que impliquen la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas.

La pauta periódicas para bebés y niños pequeños contra la enfermedad invasiva causada por S. pneumoniae debido a los serotipos incluidos en la vacuna Prev(e)nar 13 es de 2, 4, 6 y 12-15 meses de edad. Las composiciones de la

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(Continuación)

Reducción logarítmica de UFC/ml Organismos Procedimiento 6 h 24 h 7 d 14 d 28 d

Levadura y

JP ---3NA

hongos

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EPA ---NA

EP B: - - - 1 NA

USP: - - NA NA NA

JP: - - - NA NA

*Los criterios A expresan la eficacia recomendada que se debe alcanzar. En casos justificados, cuando los criterios A no se pueden alcanzar, se deben cumplir los criterios B. **NA: Ningún aumento: se define como no más de 0,5 Log10 superior al valor anterior medido. *** NR: Ninguna recuperación.

En ciertas realizaciones de la presente invención, un conservante de la invención es eficaz en la reducción de la concentración de microorganismos en la formulación inmunogénica. En ciertas realizaciones de la invención, la formulación de vacuna, que comprende al menos un conservante, reduce la concentración de uno o más microorganismos tras la inoculación con dichos microorganismos en comparación con la formulación de vacuna sin el uno o más conservantes. En una realización particular de la invención, la formulación presenta una reducción logarítmica de al menos 1,0 con respecto al recuento inicial de microorganismos a las 24 horas, una reducción logarítmica de al menos 3,0 a los 7 días con respecto al valor anterior medido y un aumento logarítmico no superior a 0,5 a los 28 días con respecto al valor medido anterior. En otra realización particular de la invención, la formulación presenta una reducción logarítmica de al menos 2,0 con respecto al recuento inicial calculado a las 6 horas de la inoculación, una reducción logarítmica de al menos 3,0 a las 24 horas con respecto l valor anterior medido y ninguna recuperación a los 28 días, en comparación de el recuento inicial de microorganismos. En otra realización de la invención, la formulación cumple los requisitos de la Farmacopea europea (EP) para los preparados parenterales y oftálmicos, en particular, la Categoría A (EP-A) y/o la Categoría B (EP-B) de requisitos de la EP 5ª edición 5.6 (5.1. 3). En otra realización de la invención, la formulación cumple con los requisitos de la Farmacopea estadounidense (USP) 29 NF 24 Suplemento 2 para los preparados parenterales.

En ciertas realizaciones de la invención, el al menos un conservante de la invención es eficaz en la reducción de la concentración de microorganismos en la formulación cuando se expone a microorganismos en comparación con una formulación que carece de los uno o más conservantes. Los microorganismos pueden ser, sin limitación, uno o más de los siguientes: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Candida albicans, Aspergillus niger y otros.

En ciertas realizaciones de la invención, los microorganismos se pueden introducir o inocular en la vacuna una o más veces en diversos intervalos. La inoculación puede producirse en el contexto de una inoculación experimental deliberada o en el contexto de una aguja hipodérmica contaminada que se introduce en un recipiente de una formulación de vacuna multidosis. El intervalo entre las inoculaciones puede estar entre 1 minuto y 1 mes. En una realización particular, las múltiples inoculaciones se producen, tras una inoculación inicial, a las 6 horas de la inoculación inicial, a las 24 horas de la inoculación inicial, a los 7 días de la inoculación inicial y a los 14 días de la inoculación inicial.

Parámetros para la estabilidad de las vacunas y de los conservantes

En ciertas realizaciones de la presente invención, la antigenicidad de al menos un determinante antigénico (es decir, preparado de polisacáridos de un serotipo de Streptococcus pneumoniae) en la formulación de vacuna es estable durante un intervalo de tiempos y temperaturas de almacenamiento. La antigenicidad se puede medir mediante procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, la antigenicidad total se puede determinar mediante el uso de antisueros de tipo específico, tales como los descritos en el Ejemplo 3.

En ciertas realizaciones de la presente invención, la antigenicidad de al menos un determinante antigénico en la formulación de vacuna es estable durante no menos de 4 semanas, no menos de 6 semanas, no menos de 8 semanas, no menos de 10 semanas, no menos de 12 semanas, no menos de 18 semanas, no menos de 24 semanas, no menos de 48 semanas, no menos de 1 año, no menos de 1,25 años, no menos de 1,5 años, no menos de 1,75 años, no menos de 2 años, no menos de 2,25 años o no menos de 2,5 años. Preferentemente, la antigenicidad de una pluralidad de los determinantes antigénicos, por ejemplo, del al menos 50 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más, de los determinantes antigénicos de la vacuna en la formulación son estables durante no menos de 4 semanas, no menos de 6 semanas, no menos de 8 semanas, no menos de 10 semanas, no menos de 12 semanas, no menos de 18 semanas, no menos de 24 semanas, no menos de 48 semanas, no menos de 1 año, no menos de 1,25 años, no menos de 1,5 años, no menos de 1,75 años, no menos de 2 años, no menos de 2,25 años o no menos de 2,5 años.

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En ciertas realizaciones de la presente invención, la antigenicidad de al menos un determinante antigénico en la formulación de vacuna es estable cuando se almacena de aproximadamente -25 ºC a aproximadamente 37 ºC, o de -20 a -10 ºC, o de 2 a 8 ºC, o aproximadamente la temperatura ambiente, o de 22 ºC a 28 ºC, o aproximadamente 37 ºC. En una realización particular de la invención, la antigenicidad de al menos un determinante antigénico en la formulación de vacuna es estable tras el almacenamiento durante no menos de 2,5 años a una temperatura de 2-8 ºC.

En ciertas realizaciones de la presente invención, la concentración del conservante de la invención se estable tras el almacenamiento de la vacuna en las duraciones y las temperaturas de almacenamiento mencionadas anteriormente. En una realización particular de la invención, la concentración del conservante en la formulación de vacuna es estable tras el almacenamiento de la vacuna durante no menos de 2,5 años a una temperatura de 2-8 ºC. La concentración del conservante se puede medir mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el Timerosal se puede medir usando espectrometría de absorción atómica de vapor en frío (CVAAS), como se describe en el Ejemplo 3. La concentración 2-PE se puede medir con un ensayo de HPLC de fase inversa, también como se describe en el Ejemplo 3. Un ensayo de HPLC de fase inversa se puede realizar de la siguiente manera: Se agitan con formación de vórtice las muestras, y se diluyen a 1:10 en tampón de succinato 5 mM en solución salina, se centrifugan y se diluyen de nuevo a 1:10 en tampón de succinato 5 mM en solución salina (la dilución final de la muestra de ensayo es de 1:100). A continuación, se ensaya la muestra utilizando la columna de HPLC Agilent Eclipse XDB-C18 y un gradiente lineal de agua y acetonitrilo que contiene ácido trifluoroacético. Luego se compara la cuantificación del conservante con una curva patrón. Véase también Sharma y col., Biologicals 36(1): 61-63 (2008).

La divulgación anterior describe la presente invención en general. Se puede obtener una comprensión más completa por referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el ámbito de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 -Estudio preliminar de selección de conservantes

El desarrollo de la formulación de vacuna Prev(e)nar 13 multidosis comenzó con la selección preliminar de los conservantes, que incluían fenol (0,25 %), 2-fenoxietanol (5 mg/ml), Meta-cresol (0,3 %), metilparabeno y propilparabeno (0,18 % y 0,12 %, respectivamente) en formulaciones Prev(e)nar 13.

Para ensayar la eficacia de los conservantes, se inocularon alícuotas de la vacuna con los siguientes organismos:

1.: Staphylococcus aureus (bacterias; ATCC n.º 6538)

2.: Pseudomonas aeruginosa (bacteria ATCC n.º 9027)

3.: Candida albicans (levadura; ATCC n.º 10231)

4.: Aspergillus niger (moho; ATCC n.º 16404).

Se inocularon treinta mililitros (ml) de cada formulación de vacuna con y sin Timerosal o 2-PE a las concentraciones indicadas o solución salina que contenía Timerosal al 0,02 % por triplicado con una suspensión de cada organismo de ensayo para lograr una densidad de inóculo de aproximadamente 105 para 106 UFC/ml en el punto temporal 0 (UFC = unidades formadoras de colonias). El volumen de cada inóculo no superó el 1 % del volumen del producto durante cada exposición deliberada. Se mezclaron las muestras para garantizar una distribución uniforme de los organismos expuestos. Se usaron otros 30 ml de la vacuna por triplicado (con y sin conservante) como control negativo y se añadieron al medio de cultivo solo para evaluar la contaminación inherente que pudiera estar presente en la muestra o en los medios. Se incubó luego, por separado, cada una de las tres series de vacunas, y controles positivos y negativos, a una temperatura de 20 a 25 ºC. Se enumeraron las alícuotas (1 ml) de las muestras y de los controles (o sus diluciones en serie con factor de dilución de diez) expuestos mediante el recuento en placa por duplicado en el punto temporal 0 y a intervalos de 6 horas, 24 horas, 7 días, 14 días y 28 días después de la inoculación.

USP 29 NF 24 Suplemento 2 (USP) requiere que, tras una inoculación de microorganismo/s bacteriano/s, haya una reducción logarítmica de al menos 1,0 con respecto al recuento calculado inicial (es decir, en el momento de la inoculación) a los 7 días, una reducción logarítmica de al menos 3,0 a los 14 días con respecto al valor medido anterior y ningún aumento a los 28 días con respecto al valor medido anterior. Véase la Tabla 1. Para las levaduras y los hongos, el requisito de la USP es que no haya ningún aumento desde el momento de la inoculación hasta los 7, 14 y 28 días.

Los requisitos de la EP son más estrictos. Los requisitos de EP 5ª Edición 5.6 (5.1.3) para los preparados parenterales y oftálmicos tienen dos componentes: la Categoría A y la Categoría B. La Categoría A (EP-A) requiere, para las bacterias, una reducción logarítmica de al menos 2,0 con respecto al recuento inicial calculado a las 6 horas de la inoculación, una reducción logarítmica de al menos 3,0 con respecto al valor anterior medido a las 24 horas y sin recuperación alguna a los 28 días. La Categoría B (EP-B) requiere, para las bacterias, una reducción logarítmica de al menos 1,0 con respecto al recuento inicial calculado a las 24 horas, una reducción logarítmica de al menos 3,0 a los 7 días con respecto al valor medido anterior y un aumento logarítmico no superior a 0,5 con respecto al valor

medido anterior (es decir, sin aumento) a los 28 días. Véase la Tabla 1. Para las levaduras y los hongos, la Categoría A requiere una reducción logarítmica de al menos 2,0 a los 7 días, y ningún aumento a los 28 días con respecto al valor medido anterior; y la Categoría B requiere una reducción logarítmica de al menos 1,0 a los 14 días y ningún aumento a los 28 días con respecto al valor medido anterior.

5 Durante la enumeración, se usaron placas que contenían < 300 UFC para las bacterias o < 100 UFC para la levadura o el moho. Para los estudios de una sola exposición, se midió el recuento medio aritmético de todos los microorganismos supervivientes por triplicado y en las placas por duplicado (6 valores por punto temporal), además de sus muestras diluidas y se normalizaron como UFC/ml. Los resultados se expresan como el log10 de la reducción de las UFC/ml (en comparación con el punto temporal 0). En este caso, se evalúa el recuento de microorganismos

10 supervivientes en el punto temporal 0 como el valor de referencia y se compara con el tiempo de incubación de 6 horas, 24 horas, 7 días, 14 días y 28 días.

Los conservantes ensayados no mostraron ningún impacto evidente en la estabilidad de Prev(e)nar 13 a excepción de los parabenos (metilparabeno y propilparabeno), que mostraron una reducción de la antigenicidad asociada a Prev(e)nar 13. Además, el fenol, el metacresol, los metil-y propil-parabenos interfirieron en el ensayo de proteínas

15 de Lowry modificado (la concentración de proteína de la vacuna se determina mediante el ensayo de proteínas de Lowry modificado disponible en el mercado).

Los resultados del ensayo de la eficacia de los conservantes (PET) mostraron que todos los conservantes ensayados cumplieron los requisitos de la USP, pero no los criterios de la EP (EP-A o EP-B). Véase la Tabla 2. 2-PE fue el único conservante candidato que resultó ser seguro a las dosis más altas. Por lo tanto, se siguieron realizando

20 más ensayos sobre la eficacia de los conservantes, con dosis más altas de 2-PE.

Tabla 2: Eficacia de los posibles conservantes en el cumplimiento de los requisitos de seguridad de las vacunas de la USP y EP* tras una sola exposición a los microorganismos

Dosis de 0,5 ml Conservante: Organismos de la exposición

Bacterias: Levadura Hongos

S aureus: E. coli P. aeruginosa C. albicans A. niger

2-Fenoxietanol a 5,0 mg/ml

USP: Criterios cumplidos Criterios cumplidos Criterios cumplidos Criterios cumplidos Criterios cumplidos

EP: Criterios no cumplidos Criterios no cumplidos Criterios no cumplidos Criterios no cumplidos Criterios no cumplidos

m-cresol al 0,3 %

EP: Criterios no cumplidos Criterios no cumplidos Criterios no cumplidos Criterios cumplidos Criterios cumplidos

Metilparabenos al 0,18 % y propilparabenos al 0,02 %

Fenol al 0,25 %

*EP-B

Ejemplo 2 -Ensayo de eficacia de los conservantes mediante un procedimiento de una sola exposición: 2-PE 25 y Timerosal

El Timerosal a una concentración del 0,01 % se usa comúnmente en las principales vacunas autorizadas en EE.UU.

Se ensayó la eficacia del Timerosal como conservante usando el mismo procedimiento de una sola exposición

descrito anteriormente en el Ejemplo 1. La formulación de vacuna Prev(e)nar 13, que contiene Timerosal al 0,01 %

(equivalente a 25 g de mercurio por 0,5 ml de dosis), no cumplió el criterio de aceptación europeo EP-A o EP-B 30 establecido por el procedimiento de la eficacia antimicrobiana de los conservantes de la EP. Sin embargo, sí cumplió

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los límites de aceptación establecidos por la Farmacopea de EE.UU. o japonesa, ya que los límites de aceptación establecidos por estos procedimientos reunidos son menos estrictos que lo establecido en la EP. Véase la Figura 1.

El Timerosal al 0,02 % (que contiene 50 g de mercurio por dosis), que equivale al doble de la concentración recomendada de Timerosal en algunas de las vacunas autorizadas de Estados Unidos, o al 0,04 % (que contiene 100 g de mercurio por dosis), que equivale a cuatro veces la concentración recomendada de Timerosal en algunas vacunas autorizadas de Estados Unidos, cumplió el criterio de aceptación B de la EP, pero no los criterios de aceptación A más estrictos (con una sola exposición de microorganismos). Véase la Figura 1.

2-PE fue más eficaz como conservante que el Timerosal. Mientras que 2-PE a 2,5 mg/dosis no cumplió los criterios de aceptación A y B de la EP, 2-PE a concentraciones de 3,5 a 5,5 mg/dosis cumplió los criterios de aceptación B de la EP. A concentraciones superiores a 6,0 mg/dosis, 2-PE cumplió ambos criterios de aceptación de eficacia antimicrobiana EP-A y EP-B (Figura 2).

Ejemplo 3 -Procedimiento de una sola exposición con 2-PE y Timerosal: Cambio en el nivel de contaminantes

La ausencia de conservantes en la formulación de vacuna Prev(e)nar 13 dio lugar a un lento crecimiento de P. aeruginosa, ningún cambio en los niveles de C. albicans y A. Niger, y una reducción lenta de unidades formadoras de colonias de S. aureus durante un período de exposición de 28 días a 20-25 ºC (Figura 3).

La presencia de Timerosal al 0,01 % (que contiene 25 g de mercurio por dosis) redujo los niveles de contaminación de los cuatro microorganismos inoculados. Sin embargo, la inhibición de S. aureus y C. albicans fue más débil que la inhibición de P. aeruginosa y A. niger (Figura 4). Se observó una relación de respuesta a la dosis en la velocidad del efecto antimicrobiano del Timerosal en las formulaciones vacunales Prev(e)nar 13, especialmente frente a C. albicans, siendo la reducción de los niveles de contaminación más pronunciados con el Timerosal al 0,02 % (Figura 5). La ausencia de Prev(e)nar 13 en una formulación de solución salina que contenía Timerosal al 0,02 % mejoró ligeramente la eficacia inhibidora del crecimiento del Timerosal contra S. aureus y C. albicans (Figura 6).

El 2-PE fue más eficaz como conservante que el Timerosal. Por ejemplo, en contraste con la lenta disminución de S. aureus con el Timerosal, la eficacia antimicrobiana de 2-PE a 5,0 mg/dosis generó una reducción de S. aureus con respecto al valor inicial a las 24 horas de la inoculación (Figura 7). Aunque el 2-PE fue menos eficaz que el Timerosal como conservante contra A. niger (Figura 7), y la velocidad de reducción de la contaminación por A. niger fue más lenta en comparación con el Timerosal (Figuras 4 y 5), la eficacia superior del 2-PE con respecto a las otras cepas permitió cumplir los criterios de aceptación EP-B de los conservantes a una concentración de 3,5 y 5 mg/dosis (Figura 2), mientras que el Timerosal al 0,01 % no lo hizo (Figura 1).

La eficacia de conservación del 2-PE a una concentración de 3,5 a 5,0 mg/dosis perduró cuando las formulaciones se almacenaron a 37 ºC durante un mes o a 2-8 ºC durante dos años y medio (Figura 2). La concentración de 2-PE en la formulación fue igualmente estable (Figura 15). La actividad inmunológica (antigenicidad total) de cada uno de los 13 serotipos presentes en la formulación de Prev(e)nar 13 también se mantuvo estable en estas condiciones de almacenamiento (Figura 14).

Se derivó la antigenicidad total tanto de los polisacáridos unidos como de los no unidos presentes en la vacuna para cada serotipo. Se determinaron las antigenicidades específicas del tipo mediante el uso de antisueros específicos del tipo. Antes del ensayo, primero se disolvió la vacuna 13-valente formulada con fosfato de aluminio. Después, se neutralizó la solución para evitar la degradación inducida por las condiciones alcalinas. Usando un nefelómetro, el ensayo midió la velocidad de cambio de la intensidad de dispersión de la luz derivada de la formación de complejos de anticuerpo-antígeno. Las antigenicidades de las muestras de ensayo se determinaron por regresión lineal usando las curvas patrón medidas inmediatamente antes o después del análisis de las muestras.

Para garantizar el contenido de Timerosal de las formulaciones vacunales Prev(e)nar 13 y de solución salina, se determinó la concentración de mercurio en algunas de las formulaciones mediante el procedimiento de espectrometría de absorción atómica de vapor en frío (CVAAS). La concentración medida de mercurio estaba muy próxima a sus valores predichos, lo que sugiere que la concentración de Timerosal en estas formulaciones era diana y no se subestimó. La concentración medida de 2-PE también estaba muy próxima a su valor predicho, y no cambió durante el almacenamiento de las formulaciones de Prev(e)nar 13 con el tiempo bien a 2-8 ºC o a 37 ºC. La concentración de 2-PE se midió con un ensayo de HPLC de fase inversa. Se agitaron con formación de vórtice las muestras y se diluyeron a 1:10 en un tampón de succinato 5 mM en solución salina, se centrifugaron y se diluyeron de nuevo a 1:10 en un tampón de succinato 5 mM en solución salina. La dilución final de la muestra de ensayo fue de 1:100. El ensayo utilizó la columna de HPLC Agilent Eclipse XDB-C18, y un gradiente lineal de agua y acetonitrilo que contenía ácido trifluoroacético. Se cuantificó el 2-PE en las muestras de vacunas multidosis de 13vPnC frente a una curva patrón de 2-PE. Véase también, Sharma y col., Biologicals 36(1): 61-63 (2008).

Ejemplo 4 -Ensayo de eficacia de conservación mediante el procedimiento de múltiples exposiciones: Timerosal

Para evaluar la conveniencia de la política de viales abiertos multidosis de la OMS para las vacunas en varias

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El Timerosal no es un conservante eficaz en la protección de Prev(e)nar 13 en la formulación multidosis frente a la contaminación potencial que se puede introducir durante la dispensación. Esto es aún más evidente cuando la contaminación se introduce varias veces durante la administración a los sujetos en formulaciones multidosis. El Timerosal tiene una baja velocidad de inactivación, sobre todo frente a S. aureus y E. coli, con un efecto inmediato

5 de retraso para eliminar los posibles microorganismos contaminantes cuando los médicos en general podrían retirar las vacunas de viales multidosis en condiciones higiénicas deficientes. Sin embargo, 2-PE a 3,5-5 mg/dosis es estable, con una tasa mucho más alta de eficacia antimicrobiana en comparación con el Timerosal y, por lo tanto, protegerá el producto contra la contaminación accidental mientras se administra a pacientes.

Ejemplo 6 -Respuesta inmune generada por la inmunización de Prevenar 13 con o sin 2-fenoxietanol como 10 conservante en primates no humanos

Se evalúa la capacidad de Prevenar 13 y Prevenar 13 que contiene 2-fenoxietanol para inducir la respuesta inmune en macacos cangrejeros.

Para el estudio, se usan dos grupos de inmunización de 10 macacos para un total de 20 macacos cangrejeros como se detalla en la Tabla 3.

15 Tabla 3

Grupo: Macacos/grupo Vacuna Volumen final Administración

1: 10 13vPnC 0,5 ml IM

2: 10 13vPnC + 5 mg de 2PE 0,5 ml IM

Se distribuyen los animales previamente seleccionados aleatoriamente en grupos según sus pesos corporales y los títulos de referencia.

Los macacos reciben la dosis clínica de 13vPnC que contiene 0 o 5 mg de 2-fenoxietanol como conservante. La 20 vacuna se administra por vía intramuscular en una sola zona del músculo cuadriceps de cada mono. El volumen final administrado es de 0,5 ml.

Todos los macacos reciben tres dosis y son vacunados en la semana 2, 4 y 8.

Pauta de extracción de sangre: se muestrea sangre periférica en las semanas 0, 6, 8, 10, 12 y 16 para controlar la inducción de las respuestas inmunes a las vacunas.

25 La respuesta inmune generada por la vacunación se controla mediante la realización de los siguientes ensayos en suero recogido durante el estudio:

 Anticuerpos de unión y funcionales in vitro:

o IgG específica del serotipo mediante ELISA (véase, por ejemplo, Fernsten P, y col., Hum Vaccin. 1 de enero de 2011; 7:75-84).

30 o Ensayo de opsonofagocitosis (OPA) específico del serotipo (véase, por ejemplo, Fernsten P, y col., Hum Vaccin. 1 de enero de 2011;7: 75-84)

 Protección in vivo en el modelo de exposición de ratas lactantes (véase, por ejemplo, Fernsten P, y col., Hum Vaccin. 21 de enero de 2011; 7:75-84):

o se evalúa la mezcla de sueros de macaco para determinar la protección específica del serotipo.

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Claims

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