CN113750228B - 一种冷冻保护剂在铝佐剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冷冻保护剂在铝佐剂中的应用，用于保护铝佐剂悬浮液在冷冻过程中不受冻害。本发明提供的冷冻保护方法避免了在疫苗中使用的含铝佐剂冷冻过程中的大量聚集、减少了冷冻过程对其结构的破坏。本发明可以提高铝佐剂在冷冻过程中的稳定性，大大降低在冷链运输过程中由于意外冷冻事件的发生导致的佐剂效用损失可能性，可以避免不必要的损失和严重后果。
Description
技术领域
本发明属于疫苗佐剂生产工艺技术领域，具体涉及一种冷冻保护剂在铝佐剂中的应用。
背景技术
疫苗是目前预防传染病最有效的方法，早期的疫苗一般由活的、减毒的和完全灭活的病原体组成，这些疫苗具有内源性佐剂，能引起强烈的保护性免疫反应，而如今大多数现代疫苗中的抗原是类毒素、多糖、蛋白质和病毒样颗粒，它们虽然更具安全性，但弊端是抗原的免疫原性差，通常需要添加额外的佐剂来引起保护性免疫反应。
佐剂加强免疫反应是一个非常复杂的过程，根据目前的研究佐剂主要起两方面的作用，一方面佐剂吸附抗原后，可以呈递抗原至免疫细胞，比如说最普遍的储存库效应，抗原被佐剂吸附后，佐剂可以作为抗原的储库，将抗原长时间呈递给免疫细胞，诱导免疫应答。FDA目前批准了6种人用疫苗佐剂，包括铝盐、AS03、MF59、AS10B、AS04、CpG 1018，这些佐剂均在人类疫苗中发挥着不可替代的作用,其中铝盐佐剂是第一个被批准用于人类疫苗的佐剂，也是种类最多，应用最为广泛的佐剂。
根据世界卫生组织的建议，含白喉、百日咳、破伤风、乙型肝炎、B型流感嗜血杆菌、IPV及其组合物的铝佐剂疫苗配方都应当储存在2-8摄氏度之间，不应冷藏。然而，在冷链运输和储存过程中，偶尔会有系统运行不良的情况发生，使疫苗暴露在冷冻温度下。我国由于幅员辽阔，南北气候差异大，在冷链运输过程中设备的外部环境，路况，气温，电力能源等因素的干扰都可能会使得运输环节出现冷链“断链”的问题，使意外冷冻事件发生。
其中冷冻对于铝佐剂产生的影响明显高于对抗原的影响，研究表明，在冷冻过程中，由于冰晶的形成所产生的机械应力对铝佐剂的挤压会使铝佐剂发生团聚，而这种挤压也会破坏铝佐剂表面结构，影响其理化性质。这直接对含铝佐剂疫苗的稳定性和有效性造成了破坏。
因此，提供一种，避免冷链运输中由意外冷冻造成的损失，提高疫苗的稳定性和安全性，降低成本和风险是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种冷冻保护剂在铝佐剂中的应用，该保护剂可抑制铝佐剂在冷冻过程中的团聚，保护其结构和表面理化性质不受影响，保护其免疫原性，可以降低生产成本，解决疫苗在冷链运输中发生的意外冷冻问题。
本发明的第一目的之一在于提供了一种冷冻保护剂在铝佐剂中的应用，在铝佐剂悬浮液中加入冷冻保护剂，制备得到含冷冻保护剂的铝佐剂；所述的冷冻保护剂为一类多羟基表面活性剂，所述多羟基表面活性剂为非离子型表面活性剂，具有多羟基结构(4个-7个)，以及一定长度的烷基链(8碳-17碳)，包括辛基葡萄糖苷，椰油基葡糖苷，棕榈酸蔗糖，聚丙三醇6-二硬脂酸酯，蔗糖二硬脂酸酯中的一种或多种。
本发明所述含冷冻保护剂的铝佐剂的冷冻温度范围在-20℃至-80℃，冷冻时间为12h以上。
本发明所述冷冻保护剂的质量浓度为0.05％～5％(w/v)，进一步的优选为0.05％～1％，更优选为0.05％。
本发明所述铝佐剂为羟基氧化铝佐剂。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的用于铝佐剂的冷冻保护剂所用多羟基表面活性剂选用辛基葡萄糖苷。结构式如下：
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的铝佐剂冷冻保护剂所用多羟基表面活性剂选用椰油基葡糖苷。结构式如下：
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的铝佐剂冷冻保护剂所用多羟基表面活性剂选用棕榈酸蔗糖。结构式如下：
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的铝佐剂冷冻保护剂所用多羟基表面活性剂选用聚丙三醇6-二硬脂酸酯。结构式如下：
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的铝佐剂冷冻保护剂所用多羟基表面活性剂选用蔗糖二硬脂酸酯。结构式如下：
本发明的第二个目的是提供一种含冷冻保护剂的铝佐剂的制备方法，；包含以下步骤：
(1)将铝佐剂溶于水中，分散均匀；
(2)在铝佐剂悬浮液中加入所选用的冷冻保护剂，混合均匀。
作为本发明优选的实施方案，以铝佐剂悬浮液的最终体积为1ml时计算：其中，所述的铝佐剂为1-10mg。
其中，步骤(1)所述的分散方式包括搅拌、涡旋、超声；优选的，所述的分散方式为超声，超声分散均匀的时间为十五分钟。
其中，步骤(2)所述的冷冻保护剂的量为0.5-50mg。
其中，步骤(2)所述的混合方式为机械混合，包括搅拌、超声；优选的，所述的混合方式为超声混合均匀，超声混合均匀的时间为五分钟。
本发明的第三个目的是提供上述含冷冻保护剂的铝佐剂或上述方法制备得到的含冷冻保护剂的铝佐剂可应用于多种疫苗制剂中，如白喉、破伤风和无细胞百日咳(DTaP)疫苗、b型流感嗜血杆菌(HiB)疫苗、乙型肝炎(HBsAg)疫苗、甲型肝炎肺炎疫苗等，包括：预防性和治疗性铝佐剂疫苗的生产制备、运输储存。
本发明所述的含冷冻保护剂的铝佐剂，经冷冻后羟基氧化铝未出现明显团聚、粒子结构和表面理化性质也未受到影响，与多种抗原结合后所制备疫苗也未出现失活现象。
本发明选择HBsAg、BSA作为模型抗原，通过体内外实验证明，该含冷冻保护剂的铝佐剂可有效保护佐剂性质和功能，经过冻融的佐剂与抗原结合依然能发挥良好的免疫效果。
作为本发明优选的实施方案之一，配制的冷冻保护剂配方中铝佐剂含量为1mg/ml，冷冻保护剂含量为0.5mg/mL时，经过冻融后吸附HBV抗原进行免疫，与未经冷冻的铝佐剂效果相比，产生的抗体IgG以及IgG1的水平无显著性差异，IgG1亚型抗体水平反映体液免疫应答水平，本申请在较低的保护剂用量下可以有效避免铝佐剂的冷冻损害，不影响其吸附抗原后的疫苗应答效果。
有益效果
本发明提供的冷冻保护方法避免了在疫苗中使用的含铝佐剂冷冻过程中的大量聚集、减少了冷冻过程对其结构的破坏。本发明可以提高铝佐剂在冷冻过程中的稳定性，大大降低在冷链运输过程中由于意外冷冻事件的发生导致的佐剂效用损失可能性，可以避免不必要的损失和严重后果。
本发明的含冷冻保护剂的铝佐剂，重复性好，稳定性高，由于保护剂含量低，因此成本也较低。
本发明的含冷冻保护剂的铝佐剂可以摆脱冷链运输，降低成本，提高疫苗在偏远地区的普及率。
相比现有技术，本发明具有以下优点：
本发明作为用于铝佐剂的冷冻保护剂配方，所用的冷冻保护剂成分单一，用量低，不易发生过敏等不良反应。
本发明可以实现铝佐剂悬浮液在极寒气温下的稳定运输和储存，极大地提高了铝佐剂疫苗的稳定，节约资源，降低成本。
本发明含冷冻保护剂的铝佐的制备方法简单快捷，成品低，条件温和，易于扩大化生产，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中羟基氧化铝的粒径分布图。
图2是实施例1中羟基氧化铝佐剂结合抗原后的免疫应答结果。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
准确称取5mg羟基氧化铝(购自InvivoGen(San Diego,CA))溶解到5mL超纯水溶液中，震荡，涡旋，并超声分散十五分钟，待羟基氧化铝粒子在溶液中分散均匀，准确称取2.5mg辛基葡萄糖苷，溶解于羟基氧化铝悬浮液中，超声分散五分钟使其完全溶解，由此制备了铝佐剂浓度为1mg/mL的含冷冻保护剂的铝佐剂。上述含冷冻保护剂的铝佐剂材料经-80℃冷冻24h后得到保护剂存在下-80℃冷冻的铝佐剂，对其进行检测，同时以浓度为1mg/mL羟基氧化铝悬浮液作为新鲜的铝佐剂，以及浓度为1mg/mL羟基氧化铝悬浮液经-80℃冷冻24h得到-80℃冷冻的铝佐剂：(1)使用DLS进行测定，发现在含有保护剂的配方中冷冻的铝佐剂粒径分布无明显增大，与新鲜铝佐剂的曲线基本保持一致(见图1)；(2)通过酸碱滴定中和法测定表面羟基含量，发现在含有保护剂的配方中冷冻的铝佐剂表面羟基含量未见减少，维持在了0.45mmol/g(见表1)；(3)将保护剂存在下-80℃冷冻的铝佐剂与乙肝抗原结合，配制疫苗浓度为1mg Al/mL，40ug HBV/mL的乙肝疫苗，以50μL的剂量注入小鼠体内，42天后产生抗体IgG以及IgG1的水平见图2，与使用新鲜的铝佐剂相比，未添加保护剂的铝佐剂冷冻后结合抗原获得的两种抗体水平显著性下降，而在含有保护剂配方中冷冻的铝佐剂组抗体水平则恢复正常。
表1实施例1中羟基氧化铝表面羟基含量滴定结果
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围。
Claims (3)
1.一种冷冻保护剂在铝佐剂中的应用,其特征在于，在铝佐剂悬浮液中加入冷冻保护剂，得到含冷冻保护剂的铝佐剂；
所述冷冻保护剂选自辛基葡萄糖苷；
所述铝佐剂为羟基氧化铝佐剂；
所述铝佐剂悬浮液的浓度为1-10mg/mL，所述冷冻保护剂的质量浓度为0.05％～5％。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含冷冻保护剂的铝佐剂的冷冻温度范围为-20℃至-80℃，冷冻时间为12h以上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铝佐剂悬浮液的制备方法为：将铝佐剂溶于水中，分散均匀。
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