CN105283200A - 基于血红蛋白衍生肽的新型药物组合物 - Google Patents

基于血红蛋白衍生肽的新型药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含至少一种Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质和至少一种血红蛋白衍生肽以及任选的药学可接受的载体的药物组合物。本发明还涉及用于预防和/或治疗肿瘤、预防和/或治疗感染、预防和/或治疗变态反应、预防和/或治疗年龄相关性免疫失衡、刺激先天性和适应性免疫系统和/或减轻辐照的不良副作用的根据本发明的药物组合物。此外，本发明还涉及血红蛋白衍生肽以及其在治疗细菌感染中的用途。

Description

基于血红蛋白衍生肽的新型药物组合物
技术领域
本发明涉及包含至少一种Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质和至少一种血红蛋白衍生肽以及任选的药学可接受的载体的药物组合物。本发明还涉及用于预防和/或治疗肿瘤、预防和/或治疗感染、预防和/或治疗变态反应、预防和/或治疗年龄相关性免疫失衡、刺激先天性和适应性免疫系统和/或减轻辐照的不良副作用的根据本发明的药物组合物。此外，本发明还涉及血红蛋白衍生肽以及其在治疗细菌感染中的用途。
在本说明书中，引用了许多文件包括专利申请和制造商的手册。这些文件的公开内容虽然不视为与本发明的专利性有关，但整体通过引用并入本文。更具体而言，所有提及的文件均通过引用并入本文，其程度与每个个别文本特别且个别指出通过引用并入相同。
背景技术
在过去，胎儿器官、组织或细胞的转移已作为针对疾病例如癌症或严重感染以及针对衰老过程的预防或治疗措施传播。胎儿组织的提取物因此看起来具有有利的医学效应，并且有时在癌症和某些感染的治疗或预防中特别推荐。尽管本领域中相当大的兴趣，但这些胎儿组织提取物中的医学有效原理通常是难以捉摸的。此类组合物的注册问题是不言而喻的。
另外，自一个多世纪以来，通过注射活的和/或热杀死的细菌的癌症治疗得到传播(Coley，W.B.:Am.J.Med.Sci105，487-511(1893))。约50年前，显示此类治疗的肿瘤坏死效应是由于细菌内毒素。内毒素也称为脂多糖(LPS)，是革兰氏阴性菌的细胞壁的组成成分。内毒素活化先天性免疫系统且促成适应性免疫系统的活化。在严重革兰氏阴性感染期间，内毒素在脓毒性休克的发展中起关键作用(Rietschel等人1994)。然而，低浓度的LPS以及LPS部分结构例如单磷酰脂质A(MPLA)，显示出对于宿主有利的效应。这些效应包括由于其惊人的免疫刺激和免疫调节活性，对感染的抗性增强和针对恶性肿瘤的保护(Fox等人2010)。有害以及有利的宿主应答并非被LPS直接诱导，而是由免疫调节剂分子介导，所述免疫调节剂分子例如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素家族成员(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12)、干扰素、还原氧种类和脂质。这些介质主要由单核细胞/巨噬细胞释放，而且还由其他细胞类型如血管细胞、上皮细胞、多形核细胞和肥大细胞释放(Galanos等人(1992)，Loppnow(1994)；Supajatura等人(2001))。先前，T细胞也已显示参与针对LPS的应答(Mattern等人(1994))。
绵羊或人起源的胎儿血红蛋白(HbF)已发现在体外在来自鼠巨噬细胞和人外周血单核细胞的细胞因子诱导中与LPS和脂质A协同作用。另外，在体内观察到LPS诱导的通过HbF的先天性和适应性免疫应答的调节(Gorczynski等人(2006)；Howe等人(2008a)；WO2004/073728A2)。这种协同活性可以显示主要位于胎儿HbF的γ链(Hbγ)中。关于Hbγ和脂质A之间的合作效应的一种解释是Hb诱导的脂质A的构象变化，这导致增强的生物活性。生物物理学分析显示Hb以及Hb链导致脂质A成为更圆锥形的内毒素构象，其中Hb嵌入内毒素聚集体内，随后为崩解过程(Howe等人(2008a)；Brandenburg等人(2003)；Howe等人(2007)；Howe等人(2008b))。近来，已显示Hb的Hbα-亚基和Hbβ-亚基具有LPS结合位点。这些结合位点的特征在于得自Hbα-亚基和Hbβ-亚基序列的独特合成肽，其能够中和而不是协同LPS的内毒素活性(Bahl等人(2011))。
尽管这些发展，但全长胎儿血红蛋白或其单链的使用具有下述缺点：所述全长蛋白质必须借助于纯化或经由重组或(半)合成方式由组织提供，所有这些方式均为昂贵和耗时的。
相应地，仍存在提供可以更有利地用于抵抗疾病例如肿瘤或严重感染或者衰老中的手段的需要，所述手段易于制备并且与上文讨论的缺点无关。
这种需要通过提供在权利要求中表征的实施方案得到解决。
发明内容
相应地，本发明涉及包含至少一种Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质和至少一种血红蛋白衍生肽以及任选的药学可接受的载体的药物组合物，其中所述血红蛋白衍生肽由下述组成：
(a)由式I的序列组成的氨基酸序列：
A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19(式I)，
其中
A1选自苏氨酸、半胱氨酸和丝氨酸；
A2选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；
A3选自亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
A4选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
A5选自异亮氨酸、组氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
A6选自组氨酸、精氨酸和亮氨酸；
A7选自苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
A8选自甘氨酸和丙氨酸；
A9选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
A10选自谷氨酸和天冬氨酸；
A11选自苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
A12选自苏氨酸和丝氨酸；
A13选自脯氨酸和甘氨酸；
A14选自谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；
A15选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；
A16选自谷氨酰胺和天冬酰胺；
A17选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
A18选自丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸；和
A19选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
和
(b)位于(a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列和/或位于(a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列，
其中
(b-i)位于(a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列选自：
N1：V；
N2：LV；
N3：VLV；
N4：NVLV(SEQIDNO:108)；
N5：GNVLV(SEQIDNO:109)；
N6：LGNVLV(SEQIDNO:4)；
N7：LLGNVLV(SEQIDNO:110)；
N8：KLLGNVLV(SEQIDNO:111)；
N9：FKLLGNVLV(SEQIDNO:112)；
N10：NFKLLGNVLV(SEQIDNO:113)；
N11：ENFKLLGNVLV(SEQIDNO:114)；
N12：PENFKLLGNVLV(SEQIDNO:115)；
N13：DPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:116)；
N14：VDPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:117)；
N15：HVDPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:118)；和
N16：LHVDPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:5)；
并且其中
(b-ii)位于(a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列选自：
(1)由式II的序列组成的氨基酸序列：
C1-C2-C3-C4-C5(式II)，
其中
C1：选自谷氨酰胺、天冬酰胺和酪氨酸；
C2：选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
C3：选自甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；
C4：选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；和
C5：选自苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸和赖氨酸；
(2)由式III的序列组成的氨基酸序列：
C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12(式III)，
其中
C1至C5如(b-ii)(1)中定义；
C6：选自丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
C7：选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；
C8：选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
C9：选自丝氨酸、天冬酰胺和苏氨酸；
C10：选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
C11：选自亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和
C12：是由氨基酸序列SSRYH组成的肽或不存在；和
(3)由式IV的序列组成的氨基酸序列：
C1-C2-C3-C4-C5-C6-X(式IV)，
其中
C1至C5如(b-ii)(1)中定义；
C6：选自丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
X：是由以任何次序的五种氨基酸残基丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸组成的肽，
或其拟肽。
依照本发明，术语“药物组合物”指用于施用于患者优选人患者的组合物。本发明的药物组合物包含至少一种Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质和至少一种血红蛋白衍生肽。本发明的药物组合物可以任选且另外包含药学可接受的载体。“药学可接受的载体”意指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、赋形剂、封装材料或制剂助剂。合适的药学载体的例子是本领域众所周知的，并且包括氯化钠溶液、磷酸盐缓冲氯化钠溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的湿润剂、无菌溶液、有机溶剂等。优选地，载体是肠胃外载体，更优选与接受者的血液等渗的溶液。如本文使用的，术语“肠胃外的”指施用模式，其包括静脉内、肌内、腹膜内和皮下注射和输注。这些施用模式连同肌内、皮内、鼻内、经口、经颊、舌下、粘膜(例如经由鼻喷雾剂、滴鼻剂或滴眼剂或霜剂以及直肠或阴道(凝胶)制剂)或支气管内施用一起，是依照本发明的优选施用模式。依照本发明的最优选的施用模式是肌内施用或经口应用。载体任选含有少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。此类材料在采用的剂量和浓度时对于接受者是无毒的，并且包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其他有机酸或其盐；抗氧化剂例如抗坏血酸；低分子量(少于约十个残基)(多)肽例如聚精氨酸或三肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；抗衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或PEG。
包含此类载体的组合物可以通过众所周知的常规方法进行配制。一般地，通过使药物组合物的组分均匀且紧密地与液体载体或精细分开的固体载体或两者接触来制备制剂。随后，需要时，使产物成形为所需制剂。
这些药物组合物可以以合适剂量施用于对象。剂量方案由主治医师和临床因素决定。如医学领域中众所周知的，关于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康和其他同时施用的药物。关于给定情况的治疗有效量将通过例行实验容易地确定，并且在普通临床医生或医师的技术和判断内。药物组合物可以用于施用一次或经过延长时间段的有规律施用。一般地，取决于施用途径，以单一剂量形式的药物组合物的施用应在例如0.1ng/kg体重至20μg/kg体重的Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质的范围内，以及例如0.1ng/kg体重至200μg/kg体重的本发明的血红蛋白衍生肽的范围内。然而，对于单一剂量，活性化合物各自的更优选剂量可以在0.05–10μg/kg体重的范围内，并且甚至更优选在0.1–1μg/kg体重的范围内。更具体而言，对于Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质和血红蛋白衍生肽分别地，关于i.v.施用的优选单一剂量可以在0.1–10ng/kg体重的范围内，对于s.c.、i.m.或i.d.施用，在5–500ng/kg体重()的范围内，或对于经口施用最高达20μg/kg体重。在本发明的药剂与进一步的药学活性化合物例如本文其他地方描述的那些组合的情况下，这些剂量的调整在普通临床医生或医师的技术和判断内。优选地，组分的重量相关在血红蛋白衍生肽与Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质1:1至100:1的范围内。
待用于治疗施用的药物组合物的组分必须是无菌的。无菌性通过经由无菌过滤膜(例如0.2微米膜)过滤而容易地完成，尽管本发明并不限于这种达到无菌性的示例性方法。本发明的药物组合物根据GMP标准依照国家法律和法规要求进行配制。
药物组合物的组分通常作为水溶液或用于重构的冻干制剂，贮存于单位或多剂量容器中，例如密封安瓿或小瓶。作为冻干制剂的例子，10-ml小瓶填充有5ml无菌过滤的1％(w/v)水溶液，并且所得到的混合物是冻干的。通过使用抑菌注射用水重构一种或多种冻干化合物，来制备输注溶液。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。取决于药物组合物的预期用途，药物组合物可以包含进一步试剂。
如本文使用的，术语“包含”指“由……组成”以及“涵盖”(即，在其他中)两者。就活性成分一种或多种Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质和一种或多种血红蛋白衍生肽而言，该术语指仅这两种化合物作为活性化合物的存在(即由……组成)，或这两类化合物和另外药剂的存在(即包含/涵盖)。此类另外的药剂可以例如是本领域已知有效治疗本文下文描述的疾病的药剂，例如用于预防和/或治疗肿瘤、预防和/或治疗感染、预防和/或治疗变态反应、预防和/或治疗年龄相关性免疫失衡、刺激先天性和适应性免疫系统和/或减轻辐照的不良副作用的药剂。这些疾病在本文下文更详细地描述。
因为本发明的药物制剂依赖上述化合物，即与(a)一种或多种血红蛋白衍生肽组合的(a)一种或多种Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质，所以优选另外的试剂仅用作补充物，即以与用作唯一药物时的推荐剂量相比较的降低剂量，以便例如降低由所述进一步试剂赋予的副作用。
如本文使用的，术语“至少”指具体记载的量，以及指超过具体记载的量或数目。例如，术语“至少一种TLR活化两亲性脂质”还涵盖至少两种、至少三种、至少四种、至少五种TLR活化两亲性脂质等等。此外，该术语还涵盖刚好两种、刚好三种、刚好四种、刚好五种TLR活化两亲性脂质等等。
Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质是本领域众所周知的。Toll样受体(TLR)最初通过遗传手段鉴定为传感器，其检测对微生物独特且在微生物分类群中广泛表现的分子标志；参见例如Blasius和Beutler，"IntracellularToll-likeReceptors."Immunity32:305-315(2010)。首先LPS(TLR4)，随后为DNA(TLR9)、RNA(TLR3、TLR7、TLR8)、脂肽(TLR2)，且随后为鞭毛蛋白(TLR5)显示为活化Toll样受体的配体。相应地，能够活化Toll样受体的两亲性脂质例如LPS或脂肽多年来已经是本领域已知的。此外，脂质LPS和脂肽/脂蛋白视为两亲性脂质的例子的事实也是本领域众所周知的，参见例如"PropertiesofAmphiphiles."于：ChemistryandBiologicalActivitiesofBacterialSurfaceAmphiphiles，编辑GeraldShockman和AnthonyJ.Wicken，AcademicPress，eBookISBN9780323151986(2012)，第1-9页。优选地，TLR活化两亲性脂质选自内毒素，或其内毒素活性部分，和细菌脂肽。
术语“内毒素”(在本文中也称为脂多糖，LPS)指一般而言由革兰氏阴性菌产生的生物活性化合物，并且构成它们可以由其生物学或化学释放的细菌外膜的主要组分。内毒素是由亲水多糖部分和共价结合的称为脂质A的疏水脂质组分组成的两亲性分子。一般而言，脂质A组分包含磷酸化的β-1,6-连接的D葡糖胺二糖，其携带最高达七个酰基残基。然而，在脂肪酸的长度、位置和数目中存在变动。脂质A已显示构成LPS的内毒素要素，因为LPS的生物学效应通过无多糖脂质A再现(Galanos等人(1985))。该发现以后通过使用完全化学合成的脂质A和相应的脂质A部分结构例如大肠杆菌(E.coli)脂质A得到证实(Imoto等人(1987))。此外，此类合成化合物是用于研究LPS和脂质A的结构-活性关系的基础(Rietschel等人(1987))。相对于细胞因子诱导能力，脂质A生物活性的最低限度要求是由两个D-葡萄糖构型的己糖胺残基、两个磷酰基和六个脂肪酸组成的分子，如大肠杆菌脂质A或流感嗜血杆菌(H.influenzae)中存在的(Rietschel等人(1994))。根据关于结构-活性关系的大量数据，得出结论天然形式的大肠杆菌脂质A代表关于强单核细胞/巨噬细胞活化能力的最佳构型。无论是在己糖胺二糖的磷酸化模式还是酰化模式中不同，大肠杆菌脂质A的所有化学不同的结构或衍生物，在诱导单核因子中活性较小或甚至无活性。
依照本发明应当理解本发明的药物组合物中采用的内毒素可以衍生自任何革兰氏阴性、携带内毒素的细菌。优选地，所述内毒素衍生自大肠杆菌。
术语内毒素的“内毒素活性部分”指展示天然存在的内毒素的至少50％，优选至少75％，更优选至少90％例如至少95％，且最优选至少100％的内毒素活性的部分。内毒素的内毒素活性部分可以例如通过LPS的化学或酶促断裂或者通过LPS的(生物)化学修饰而衍生，由此药学有利部分(基本上)得到维持或改善。此类内毒素活性部分包括通过部分酶促/水解去糖基化、去磷酸化和脱酰基而产生的片段，或者通过糖基、磷酰基或酰基转移酶的作用，或通过已知在哺乳动物组织特别是肝中发生的其他酶促修饰步骤而生成的衍生物。优选所述内毒素活性部分是LPS衍生的无多糖天然或合成脂质A组分。最优选的是内毒素活性部分是MPLA。
在生物物理学研究中，可以显示所有内毒素高度活性的脂质A结构具有特定‘内毒素构象’，即对应于如亲水区的更高疏水横截面的脂质A部分的圆锥形(Seydel等人(2000))。与圆锥形关联的是脂质A二葡糖胺主链的倾角，具有就膜法线即酰基链的方向而言大约50°的倾角(Seydel等人(2000))。
单磷酰脂质A(MPLA)是例如通过明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota)的LPS的受控酸水解或通过化学合成获得的脂质A的部分结构(Fox等人(2010))。MPLA仅显示出低毒性且具有有利的免疫刺激特性包括佐剂活性。因此，疫苗佐剂MPLA被称为“脱毒形式的内毒素”。这种结构代表第一种Toll样受体活化两亲性脂质，其用作人中的疫苗佐剂(Fox等人(2010))。
优选地，内毒素是细菌的或合成的S或R形式脂多糖(LPS)。
在本发明的药物组合物的一个进一步优选实施方案中，内毒素的内毒素活性部分是天然或合成五酰基和/或六酰基脂质A。在本发明的药物组合物的另一个优选实施方案中，内毒素的内毒素活性部分是天然或合成五酰基和/或六酰基脂质A单磷酸酯。这些特异性内毒素的使用是有利的，因为它们的剧毒性显著低于(约100倍)六酰基双磷酰基脂质A或LPS的毒性。
LPS弱应答者C3J/HeJ小鼠品系的lps基因的表征将Toll样受体TLR4鉴定为LPS信号传导受体(Poltorak等人(1998))。对于信号传导，TLR4需要称为MD-2的衔接蛋白质的共表达(Shimazu等人(1999))。这种蛋白质由二聚亚基的大型二硫键合寡聚物组成，由单核细胞和树突状细胞产生且分泌，与TLR4紧密结合且是LPS应答必需的(Shimazu等人(1999)；Akashi等人(2000))。使用放射性标记的LPS，LPS、TLR4和MD-2之间的物理接触可以仅在称为CD14的进一步分子存在时得到证实(daSilva等人(2001))。CD14已显示涉及LPS与TLR4的结合和经由LPS的细胞活化(daSilva等人(2001))。CD14作为糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白质(mCD14)定位于单核细胞、多形核白细胞、一些B淋巴细胞(Haziot等人(1988))、以及上皮细胞(Pugin等人(1993))的表面上。
细菌脂蛋白是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的膜的组成成分。另外，它们还在支原体属(Mycoplasma)和分枝杆菌属(Mycobacteria)的膜中发现。这些脂蛋白包含二-O-酰化-S-(2,3-二羟基丙基)-半胱氨酰残基，其与不同多肽的N末端偶联。S-(2,3-二羟基丙基)-半胱氨酸可以由第三种脂肪酸N-酰化，如在革兰氏阴性菌如大肠杆菌中的情况下一样。另外，单酰化脂蛋白已得到描述(Salunke等人(2012))。虽然多肽的脂肪酸模式和氨基酸序列可以改变，但S-(2,3-二羟基丙基)-半胱氨酸主链是这些脂蛋白的不可缺少的组成成分。
如同LPS和MPLA，脂蛋白是具有疏水部分(脂肪酸)和亲水部分(蛋白质)的两亲性分子。成纤维细胞刺激脂肽-1(FSL-1)是衍生自唾液支原体(Mycoplasmasalvarium)的合成二酰化脂肽。Pam3C-SK4衍生自大肠杆菌的脂蛋白。如上所述，MLPA通过TLR4/MD2同聚受体发信号，而细菌脂蛋白如Pam3C-SK4和FSL-1，通过TLR2分别以TLR1或TLR6依赖性方式发信号。虽然TLR2仅诱导MyD88信号传导途径，这导致促炎细胞因子的诱导，但TLR4/MD2诱导MyD88途径和TRIF途径。这后面一种途径介导IFN-α和IFN-β的诱导。
在本发明的药物组合物的一个优选实施方案中，细菌脂肽是具有S-(2,3-二羟基丙基)-半胱氨酸主链的单、二或三酰化脂肽。此类脂肽的例子是成纤维细胞刺激脂肽-1(FSL-1)、来自发酵支原体(Mycoplasmafermentans)的巨噬细胞活化脂肽(MALP2)、Pam2C-SK4和Pam3C-SK4。进一步的合成修饰由例如Buwitt-Beckmann等人(Buwitt-Beckmann等人(2005)，FEBSJ.)和在如增补物中列出的BiochemicalCatalogue2012/2013ofEMC-microcollection(Tübingen，德国；参见万维网microcollections.de/pdf/EMC％20Biochemicals.pdf处)中描述。
本发明的药物组合物进一步包含至少一种血红蛋白衍生肽。如本文使用的，术语“肽”指含有由肽键共价连接的多达55个氨基酸的线性氨基酸分子链。肽可以形成由至少两个相同或不同分子组成的寡聚物。此类多聚体的相应更高级别结构相应地被称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。依照本发明，序列指示从N末端到C末端的延伸。如本发明自始至终用于鉴定氨基酸的单字母和三字母代码缩写对应于通常用于氨基酸的那些。
本发明的肽衍生自血红蛋白，更特别是人胎儿血红蛋白。
血红蛋白(Hb)是分子量大约64,500Da的四聚血红素蛋白复合物。血红蛋白的主要生物学功能是循环中的氧(O2)转运(Perutz(1979))。成人Hb(HbA)由两条α链和两条β链组成，其中这些亚基各自含有一个血红素基团作为辅基。胎儿Hb(HbF)由以其血红素复合形式的两条α链和两条γ链组成。在人个体发育中，HbA在出生后的寿命中在骨髓中合成，而HbF主要在胎儿的肝和脾中产生(Karlsson和Nienhuis(1985))。术语胎儿血红蛋白通常指示HbF的四聚体形式以及无血红素HbF。α链、β链和γ链是衍生自HbA和/或HbF的单体无血红素球蛋白链。
依照本发明，术语“衍生自血红蛋白”不要求肽得自全长血红蛋白(例如通过其消化)，而是指下述事实：本发明的一种或多种肽的序列是这样的序列，其对应于或类似于血红蛋白序列的部分。
相应地，本发明的肽可以合成产生。肽的化学合成是本领域众所周知的。固相合成是通常使用的，并且各种商业合成仪是可获得的，例如通过AppliedBiosystemsInc.，FosterCity，CA；Beckman；MultiSyntech，Bochum，德国的自动化合成仪等。还可以使用液相合成方法，尽管它们较不方便。例如，肽合成可以使用Na-9-芴甲氧羰酰基氨基酸和预装载的三苯甲基树脂或氨基甲基化聚苯乙烯树脂与对羧基三苯甲醇接头进行。可以使用N-羟基苯并三唑和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯，在二甲基甲酰胺中进行偶联。常用的侧链保护基团是用于D、E和Y的叔丁基；用于N、Q、S和T的三苯甲基；用于R的2,2,4,6,7-五甲基二羟基苯并呋喃-5-磺酰基；以及用于K的叔丁氧羰基。在合成后，通过用例如92％三氟乙酸/4％三乙基硅烷/4％H2O处理，使肽脱保护且从聚合物支持物上切割。肽通过添加叔丁基醚/戊烷(8:2)进行沉淀，并且通过反相HPLC进行纯化。肽通常通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱法进行分析。通过使用这些标准技术，天然存在的氨基酸可以由非天然氨基酸特别是D-立体异构体置换，以及由具有不同长度或功能性的侧链的氨基酸置换。用于缀合至小分子、标记部分、肽或蛋白质的官能团可以在化学合成期间引入分子内。另外，小分子和标记部分可以在合成期间附着。优选地，官能团的引入和与其他分子的缀合不影响或仅最低限度影响主题肽的结构和功能。
N末端和C末端可以使用常规化学合成方法进行衍生。本发明的肽可以含有酰基例如乙酰基。用于酰化且特别是用于酰化N末端处的游离氨基的方法是本领域众所周知的。对于C末端，羧基可以通过用醇酯化进行修饰或酰胺化，以形成-CONH2或CONHR。酯化和酰胺化的方法是本领域众所周知的。此外，本发明的肽还可以例如通过重组和合成产生的组合半合成产生。在肽的片段合成产生的情况下，肽的剩余部分必须以其他方式产生，例如如本领域众所周知的重组产生，并且随后与片段连接以形成本发明的肽。
此外，本发明涵盖如上定义的肽的拟肽(peptidomimetics)。拟肽是设计为模拟肽的小蛋白质或肽样链。拟肽通常起于现有肽的修饰，以便改变肽的特性。例如，它们可以起于修饰以改变肽的稳定性。这些修饰涉及并非天然存在的肽变化(例如改变的主链和非天然氨基酸的掺入)，包括氨基酸或肽键替换为功能类似物。此类功能类似物包括除20种基因编码的氨基酸外的所有已知氨基酸，例如硒代半胱氨酸。与其他模拟物相比较，拟肽的使用具有一些特定优点。例如，它们的构象受限结构允许使与非靶化合物的结合降到最低，并且增强对所选靶的活性。通过添加疏水残基和/或酰胺键的替换，拟肽穿过细胞膜的转运可以得到改善。此外，拟肽例如等排物、逆反式(全-d逆或逆对映体(retroenantio))肽和环肽对通过肽酶及其他酶的降解较不敏感。天然存在的肽的逆反式修饰涉及具有与相应的L-氨基酸的那种相反的α碳立体化学的氨基酸，即以就天然肽序列而言的倒序的D或D-别-氨基酸的合成装配。逆反式类似物因此具有逆转的末端和肽键的逆转方向，同时大致维持如在天然肽序列中的侧链的拓扑学。
本发明的血红蛋白衍生肽的氨基酸序列如本文上文定义的。相应地，肽包含由如定义的氨基酸A1至A19表示的核心序列(即式I)。此外，肽包含在所述核心序列的N末端或C末端处、或N末端和C末端两者处的另外氨基酸序列。N末端序列基于显示为N16的序列、或如显示为N1至N15的其片段。C末端序列基于式II、式III或式IV。式II(C1至C5)代表式III和IV的片段。
在本发明的药物组合物的一个更优选实施方案中，式I的氨基酸残基如下：
A1选自苏氨酸和半胱氨酸；
A2是缬氨酸；
A3是亮氨酸；
A4是丙氨酸；
A5选自异亮氨酸和组氨酸；
A6是组氨酸；
A7是苯丙氨酸；
A8是甘氨酸；
A9是赖氨酸；
A10是谷氨酸；
A11是苯丙氨酸；
A12是苏氨酸；
A13是脯氨酸；
A14选自谷氨酸和脯氨酸；
A15是缬氨酸；
A16是谷氨酰胺；
A17是丙氨酸；
A18选自丝氨酸和丙氨酸；和
A19选自色氨酸和酪氨酸。
依照该优选实施方案，式I是：A1-VLA-A5-HFGKEFTP-A14-VQA-A18-A19，其中残基A1、A5、A14、A18和A19如上定义。
在本发明的药物组合物的另一个更优选实施方案中，位于(a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列选自N1、N6和N16。
在本发明的药物组合物的一个进一步更优选实施方案中，式II的氨基酸残基如下：
C1：是谷氨酰胺；
C2：是赖氨酸；
C3：选自甲硫氨酸和缬氨酸；
C4：是缬氨酸；和
C5：选自苏氨酸和丙氨酸。
依照该优选实施方案，式II是：QK-C3-V-C5，其中残基C3和C5如上定义。
在本发明的药物组合物的再一个进一步更优选实施方案中，式III的氨基酸残基如下：
C1至C5如前述段落中就式II而言定义的；
C6：选自丙氨酸和甘氨酸；
C7：是缬氨酸；
C8：是丙氨酸；
C9：选自丝氨酸和天冬酰胺；
C10：是丙氨酸；
C11：选自亮氨酸和谷氨酰胺；和
C12：是由氨基酸序列SSRYH组成的肽或不存在。
依照该优选实施方案，式III是：QK-C3-V-C5-C6-VA-C9-A-C11-C12，其中残基C3、C5、C6、C9、C11和C12如上定义。
在本发明的药物组合物的再一个进一步更优选实施方案中，式IV的氨基酸残基如下：
C1至C5如前述段落中就式II和III而言定义的；
C6：选自丙氨酸和甘氨酸；
X：是由氨基酸序列VASAL组成的肽。
依照该优选实施方案，式IV是：QK-C3-V-C5-C6-VASAL，其中残基C3、C5和C6如上定义。
依照本发明，在其中式记载替代方案的那些情况下，由此涵盖的主题的任何组合视为得到明确公开。例如，当对于第一残基1记载三个替代方案A、B和C，并且对于第二残基2记载三个替代方案D、E和F，并且对于第三残基3记载三个替代方案G、H和I时，则应当理解说明书明白地公开了对应于组合A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I的实施方案，除非另有具体说明。
相同考虑应用于不同式的组合，即预期核心序列(式I)的每个实施方案可以与N末端序列(如(b-i)中定义的)的每个实施方案和/或C末端序列(如(b-ii)中定义的)的每个实施方案组合。例如，在每种情况下具有氨基酸A1至A19作为第一列出氨基酸的核心序列，即苏氨酸用于A1，缬氨酸用于A2，亮氨酸用于A3，丙氨酸用于A4，异亮氨酸用于A5等等，可以与选自N1至N16的任何N末端序列和/或上文(b-ii)中记载的C末端序列中任一种组合。相应地，(a)的任何氨基酸序列可以例如与N1组合；(a)的任何氨基酸序列可以例如与N1和具有氨基酸序列QKMVT的(b-ii)(1)的氨基酸序列组合；(a)的任何氨基酸序列可以例如与N1和具有氨基酸序列NRVAA的(b-ii)(1)的氨基酸序列组合；(a)的任何氨基酸序列可以例如与N1和具有氨基酸序列QKMVA的(b-ii)(1)的氨基酸序列组合等等；(a)的任何氨基酸序列可以例如与N2和具有氨基酸序列QKMVT的(b-ii)(1)的氨基酸序列组合；(a)的任何氨基酸序列可以例如与N2和具有氨基酸序列NRVAA的(b-ii)(1)的氨基酸序列组合；(a)的任何氨基酸序列可以例如与N2和具有氨基酸序列QKMVA的(b-ii)(1)的氨基酸序列组合等等。
药物组合物的纯化或部分纯化组分可以通过本领域已知的任何方法且以任何所需比例(重量)，优选本文上文详述的比例混合在一起。
依照本发明，惊讶地发现衍生自天然人Hbγ1链的某些肽能够在刺激纯化的人单核细胞中与内毒素或细菌脂蛋白协同作用，从而调节先天性和适应性免疫应答。特别地，所附例子中的肽：
Hbg-32：TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAQ(SEQIDNO:16)
Hbg-33:LGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVT(SEQIDNO:17)
Hbg-34:VTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:14)
Hbg-35:TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAL(SEQIDNO:13)
Hbg-36:LHVDPENFKLLGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:18)
Hbg-39:VTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASALSSRYH(SEQIDNO:15)
显示提供所述协同效应。此外，如例如图13中所示，与天然Hbγ1相比较，这些肽提供了增强的与内毒素或细菌脂蛋白的协同活性。
所有这些肽均具有占优势的α螺旋结构。不希望受理论束缚，本发明人假定该结构允许肽越过双层脂质例如MPLA，因此使这些化合物崩解。具体地，存在于各种各样的协同活性肽中的序列TPEVQASWQKMVTAVA假定对于脂质跨膜区内的Hbg肽的α螺旋结构是重要的。存在于迄今为止测试的所有协同活性肽中的另一种结构是序列VLAIHFGKEFTPEVQASW。
然而，如所附例子中所示，仅由这两种氨基酸序列组成的肽发现为接近协同失活的(参见例如图19)。这指示邻近氨基酸对于协同活性是重要的，如通过如上定义的N末端和/或C末端氨基酸序列的存在反映的。
另外，基于保守氨基酸置换的氨基酸序列变体包括在本文上文定义的氨基酸序列中，因为它们被认为具有与所附实施例中指定为肽Hbg-35的肽相同或至少相似的协同活性。这是因为保守置换即其侧链具有相似生物化学特性的氨基酸置换，被认为不影响肽功能或仅最低限度影响其功能。Hbg-35的残基的保守氨基酸替换的总结在下表1中提供。
此外，如下文实施例5中所示，本文另外研究了具有肽Hbg-35的同源序列，衍生自Hbα-Hbβ-和Hbγ2链的肽。令人惊讶的是，仅Hbβ和Hbγ2衍生的肽发现以与Hbg-35相似的范围协同活性，而Hbα衍生的肽仅显示最低限度的协同活性。该发现的一种解释可能在于与Hbα链相比较，在形成肽基础的结构区域中Hbβ和Hbγ2链与Hbγ1链的更紧密的氨基酸序列相似性(参见例如图29中的加框序列比较)。
相应地，本文上文定义的结构涵盖此类Hbβ和Hbγ2衍生肽，而不是Hbα衍生肽。
依照本发明相对短的肽可以更成本效益和更少耗时地产生，从而提供超过如本领域先前采用的全长胎儿血红蛋白使用的优点。
在本发明的药物组合物的一个优选实施方案中，(a)的氨基酸序列选自TVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:1)和CVLAHHFGKEFTPPVQAAY(SEQIDNO:2)。
SEQIDNO:1的序列是所附例子中指定为肽Hbg-32至Hbg-36、Hbg-39和Hbg2-70的特异性肽的核心序列，而SEQIDNO:2的序列是特异性肽Hbb-67的核心序列。如所附例子中所示，所有这些肽均能够在刺激纯化的人单核细胞中与内毒素或细菌脂蛋白协同作用，从而调节先天性和适应性免疫应答。
在本发明的药物组合物的另一个优选实施方案中，(b-i)的氨基酸序列选自(i)V(序列N1)、(ii)LGNVLV(SEQIDNO:4)和(iii)LHVDPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:5)，和/或(b-ii)的氨基酸序列选自(i)QKMVT(SEQIDNO:6)、(ii)QKVVA(SEQIDNO:7)、(iii)QKMVTAVASAL(SEQIDNO:8)、(iv)QKMVTAVASAQ(SEQIDNO:9)、(v)QKMVTGVASAL(SEQIDNO:10)、(vi)QKVVAGVANAL(SEQIDNO:11)和(vii)QKMVTAVASALSSRYH(SEQIDNO:12)。
N1的序列存在于所附例子中所示的肽Hbg-34和Hbg-39的N末端处，而SEQIDNO:4存在于所附例子中指定为肽Hbg-33的肽的N末端处。SEQIDNO:5的序列存在于所附例子中指定为肽Hbg-36的肽的N末端处。
此外，C末端序列如下存在于所附例子中所示的肽中：SEQIDNO:6存在于Hbg-33中，SEQIDNO:7存在于Hbb-67中，SEQIDNO:8存在于Hbg-35中，SEQIDNO:9存在于Hbg-32中，SEQIDNO:10存在于Hbg2-70中，SEQIDNO:11存在于Hbb-67中，并且SEQIDNO:12存在于Hbg-39中。
在本发明的药物组合物的一个甚至更优选实施方案中，血红蛋白衍生肽由选自下述的氨基酸序列组成：
(i)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAL(SEQIDNO:13)，
(ii)VTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:14)，
(iii)VTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASALSSRYH(SEQIDNO:15)，
(iv)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAQ(SEQIDNO:16)，
(v)LGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVT(SEQIDNO:17)，
(vi)LHVDPENFKLLGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:18)，
(vii)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTGVASAL(SEQIDNO:19)，和
(viii)CVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANAL(SEQIDNO:20)。
其活性显示于所附例子中的这些肽是依照本发明特别优选的。SEQIDNO:13代表所附例子中指定为肽Hbg-35的肽，SEQIDNO:14代表所附例子中指定为肽Hbg-34的肽，SEQIDNO:15代表所附例子中指定为肽Hbg-39的肽，SEQIDNO:16代表所附例子中指定为肽Hbg-32的肽，SEQIDNO:17代表所附例子中指定为肽Hbg-33的肽，SEQIDNO:18代表所附例子中指定为肽Hbg-36的肽，SEQIDNO:19代表所附例子中指定为肽Hbg2-70的肽，并且SEQIDNO:20代表所附例子中指定为肽Hbb-67的肽。进一步优选血红蛋白衍生肽不由氨基酸序列TVLAIHFGKEFTPEAQASWQKMVTAVASAL(SEQIDNO:3)组成，或不包含氨基酸序列TVLAIHFGKEFTPEAQASWQKMVTAVASAL(SEQIDNO:3)。
本发明进一步涉及用于预防和/或治疗肿瘤、预防和/或治疗感染、预防和/或治疗变态反应、预防和/或治疗年龄相关性免疫失衡、刺激先天性和适应性免疫系统和/或减轻辐照的不良副作用的本发明的药物组合物。
依照本发明，术语“肿瘤”指特征在于不受控制的细胞分裂的疾病或病症类别，并且涵盖所有类型的肿瘤，例如癌性肿瘤和良性肿瘤以及实体瘤和非实体瘤。癌性治疗进一步的特征在于这些肿瘤扩散的能力，通过经由侵袭直接生长到邻近组织内，或通过经由转移植入远端部位内(其中肿瘤细胞通过血流或淋巴系统转运)。
优选地，肿瘤是癌性肿瘤(在本文中也称为癌症)。可以通过施用本发明的组合物进行治疗或预防的癌性肿瘤包括但不限于前列腺癌例如前列腺的腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、肾癌、肺癌、关于上消化道的癌症、结肠癌、结肠直肠癌、头与颈或子宫颈的鳞状细胞癌、成胶质细胞瘤、恶性腹水、淋巴瘤和白血病以及胰腺的腺癌。
依照本发明的感染是宿主生物由外来物种的有害建群。在感染中，感染生物寻求利用宿主的资源以便繁殖(通常以宿主为代价)。宿主对感染的应答是炎症。感染包括例如通过细菌、病毒和具有单细胞或多细胞结构的真核生物例如酵母细胞、真菌、蠕虫等的感染。
依照本发明，细菌感染或起于其的状况包括但不限于细菌性脑膜炎、霍乱、白喉、李斯特菌病、百日咳(pertussis)(百日咳(WhoopingCough))、肺炎球菌性肺炎、沙门氏菌病、破伤风、斑疹伤寒或泌尿道感染。
依照本发明，病毒感染或起于其的状况包括但不限于单核细胞增多症、AIDS、水痘、普通感冒、巨细胞病毒感染、登革热、埃博拉出血热、手足口病、疱疹、肝炎、流感、流行性腮腺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、天花、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎或黄热病。
依照本发明，真菌感染或起于其的状况包括但不限于曲霉菌病、芽生菌病、假丝酵母病、球孢子菌病、隐球菌病、组织胞浆菌病或足癣。
依照本发明特别优选的是所述感染是病毒感染，优选慢性病毒感染，更优选疱疹、乙型肝炎或丙型肝炎感染。
依照本发明，变态反应包括1型变态反应、花粉热和变应性哮喘。
依照本发明，年龄相关性免疫失衡涉及随着时间过去通常不可逆的免疫失衡的生成。在本发明的药物组合物的一个优选实施方案中，所述年龄相关性免疫失衡包含异常细胞因子产生。在本发明的药物组合物的一个更优选实施方案中，所述年龄相关性异常细胞因子产生是增加的TNFα、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8和/或IL-10产生和/或减少的IL-2产生。依照本发明的药物组合物进一步优选的是年龄相关性免疫失衡的所述预防和/或治疗与巨噬细胞的活化有关。
任选地，本发明的药物组合物可以连同进一步的药物活性化合物一起施用，所述药物活性化合物开发为停止或延缓衰老的生理学或病理生理学后果，包括对肿瘤、感染和变态反应的敏感性增加。
自一个多世纪以来，LPS的医学应用包括肿瘤的治疗和感染的预防得到传播，但通常被副反应例如发热和低血压阻碍。近来，本发明人显示包含内毒素和胎儿血红蛋白的制剂强烈活化巨噬细胞，诱导肿瘤细胞毒性，抑制肿瘤生长，并且将年龄相关性免疫状态逆转为年幼个体的那种(WO2004/073728)。这些制剂也发现适合作为阻断辐照的有害反应的手段，例如作为佐剂以避免或降低通过辐照在肿瘤治疗中的不良副作用。
如所附例子中所示，本发明的肽提供了与天然Hbγ1相比较，TLR活化两亲性脂质，特别是内毒素或细菌脂蛋白的增强的协同活性(参见例如图13)，并且因而可以有利地用于上述医学方法中。
本发明进一步涉及由下述组成的血红蛋白衍生肽：
(a)氨基酸序列TVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:1)；和
(b)位于(a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列和/或位于(a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列，
其中
(b-i)位于(a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列，其选自：
(i)V(SEQIDNO:3)，
(ii)LGNVLV(SEQIDNO:4)和
(iii)LHVDPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:5)和/或
和
(b-ii)位于(a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列，其选自：
(i)QKMVT(SEQIDNO:6)，
(ii)QKMVTAVASAL(SEQIDNO:8)，
(iii)QKMVTAVASAQ(SEQIDNO:9)，
(iv)QKMVTAVASALSSRYH(SEQIDNO:12)。
本发明的这种新型血红蛋白衍生肽可以有利地用于本文上文描述的应用的任一种中。相应地，本文上文就药物组合物而言提供的定义以及优选实施方案还在细节上作必要修改后，应用于与本发明的血红蛋白衍生肽有关的实施方案。例如，药物组合物的制备、施用或用途的优选实施方案在上文定义肽的优选实施方案中具有其配对物。
在本发明的血红蛋白衍生肽的一个优选实施方案中，肽由选自下述的氨基酸序列组成：
(i)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAL(SEQIDNO:13)，
(ii)VTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:14)，
(iii)VTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASALSSRYH(SEQIDNO:15)，
(iv)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAQ(SEQIDNO:16)，
(v)LGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVT(SEQIDNO:17)和
(vi)LHVDPENFKLLGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:18)。
在本发明的血红蛋白衍生肽的一个更优选实施方案中，肽用于治疗细菌感染。
脂蛋白是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、支原体属和分枝杆菌属的细胞膜的部分。此外，内毒素也是革兰氏阴性菌的细胞壁外膜的部分。相应地，本发明的肽可以单独施用于被此类病原体感染的患者，以便获益于本发明的肽与脂蛋白或内毒素的组合的协同治疗效应。另外组分还可以施用于患者，例如药学可接受的载体或佐剂。本文上文就药物组合物而言提供的所有定义以及优选实施方案，相应地还应用于涉及用于治疗细菌感染的本发明的血红蛋白衍生肽的该实施方案。
引起适于用本发明肽的治疗的细菌感染的革兰氏阴性病原体的非限制性例子包括大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、流感嗜血杆菌、百日咳博德特氏杆菌(Bordetellapertussis)和霍乱弧菌(Vibriocholerae)。另外，引起适于用本发明肽的治疗的细菌感染的革兰氏阳性病原体的非限制性例子包括葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)和李斯特菌属(Listeria)，而引起适于用本发明肽的治疗的细菌感染的支原体属的非限制性例子包括发酵支原体和唾液支原体，并且引起适于用本发明肽的治疗的细菌感染的分枝杆菌属的非限制性例子包括结核分枝杆菌(Mycobacteriumtubercolosis)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)和鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)。
依照本发明，在其中独立和/或从属权利要求不记载替代方案的那些情况下，应当理解如果从属权利要求回引多个前述权利要求，则由其覆盖的主题的任何组合视为得到明确公开。例如，在独立权利要求1，回引权利要求1的从属权利要求2以及回引权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，遵循权利要求3和1的主题的组合得到明确和明白公开，并且权利要求3、2和1的主题的组合也得到明确和明白公开。在存在引用权利要求1-3中任一项的进一步从属权利要求4的情况下，遵循权利要求4和1，权利要求4、2和1，权利要求4、3和1，以及权利要求4、3、2和1的主题的组合得到明确和明白公开。
附图说明
附图显示：
图1：用于筛选的N末端赖氨酸连接的Hbγ1肽。该图显示人Hbγ1蛋白质的氨基酸序列。这个序列细分为由15或16个氨基酸组成的27种重叠肽。每种肽N末端连接至5个赖氨酸。
图2：筛选测试：K5-Hbγ1肽对用MPLA刺激MNC的作用。
在图1中所示的K5-Hbγ1肽文库的肽(10μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(10μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-8浓度通过ELISA进行测定。每个值代表三次独立实验的平均值。在这三次独立实验各自中，已进行一式两份培养。
图3：用于筛选的Hbγ1肽。该图显示人Hbγ1蛋白质的氨基酸序列。这个序列细分为由15或16个氨基酸组成的27种重叠肽。
图4：筛选测试：Hbγ1肽对用MPLA刺激MNC的作用。在图3中所示的Hbγ1肽文库的肽(10μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(10μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-8浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图5：在各种Hbg肽的存在下，用MPLA刺激人MNC。在浓度为1、3和10μM的Hbg-23-110、Hbg-24-111和Hbg-34-112的存在或不存在，人MNC用MPLA(1μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图6：衍生自Hbγ1蛋白质的部分序列的3种长链重叠肽。Hbg-30-105(Hbγ86-115)、Hbg-31-106(Hbγ99-128)和Hbg-32-107(Hbγ112-141)。
图7：Hbγ1肽对用MPLA刺激人MNC的协同作用。在Hbγ1衍生肽Hbg-23、Hbg-24、Hbg-30-105、Hbg-31-106和Hbg-32-107(3和10μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图8：在人血清的存在或不存在下，Hbγ1肽对用MPLA刺激人MNC的作用。在Hbγ1肽Hbg-23和Hbg-32-107(1、3和10μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。培养基补充有或不补充有10％人血清。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图9：Hbg-23和Hbg-32肽对用MPLA刺激人单核细胞的协同作用。在Hbγ1肽Hbg-23和Hbg-32-107(1、3和10μM)的存在或不存在下，纯化的人单核细胞(>95％)用MPLA(1μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图10：在合成Hbg-32肽的三种不同制剂的存在下，用MPLA刺激人MNC。在Hbγ1肽Hbg-23的三种不同制剂，即Hbg-32-107、Hbg-32-108和Hbg-32-KB(1、3和10μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图11：在人MNC中的各种细胞因子的诱导期间，Hbg-32肽与MPLA的协同效应。在Hbg-32-113(3和10μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图12：Hbg-32对用MPLA和LPS刺激人MNC的协同作用。在Hbg-32-113(1、3和10μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)或LPS(1ng/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA或LPS进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图13：Hbg-32-107和天然Hbγ1链对用MPLA刺激人MNC的协同作用的比较。在天然Hbγ1链和Hbγ1肽Hbg-32-107(3和10μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-8浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图14：在用MPLA刺激人MNC期间，Hbγ1112-141肽(Hbg-32-113)与Hbγ1112-141[L141Q]肽(Hbg-35-114)的比较。在Hbγ1112-141肽(Hbg-32-113)或Hbγ1112-141[L141Q]肽(Hbg-35-114)(1、3和10μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。细胞培养物在(A)人血清的不存在或(B)10％人血清的存在下进行。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图15：各种Hbg-γ1肽对用MPLA刺激人MNC的协同作用。在以1、3和10μM的各种Hbg肽，即Hbg-35-114(Hbγ1112-141)、Hbg-33-109(Hbγ1106-135)、Hbg-34-112(Hbγ1111-130)、Hbg-36-115(Hbγ196-130)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图16：各种Hbg-γ1肽对用MPLA刺激人MNC的协同作用。在以1、3和10μM的各种Hbg肽，即Hbg-35-114(Hbγ1112-141)、Hbg-38-117(Hbγ1106-140)和Hbg-39-118(Hbγ1111-146)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图17：Hbg-35肽的丙氨酸扫描。Hbg-35序列的每个氨基酸个别替换为丙氨酸。该图显示合成的肽的序列。
图18：衍生自Hbg-35丙氨酸扫描的肽对MPLA刺激的人MNC的作用。在衍生自Hbg-35丙氨酸扫描的各种Hbg肽(3μM)的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表用一式两份培养物进行的两次个别实验的平均值±SEM。*p<0.05与Hbg-35有关的显著性(适当时，曼怀二氏秩和检验或成对斯氏t检验)。
图19：各种Hbg-γ1肽对用MPLA刺激人MNC的协同作用。在以0.1、1、3和10μM的各种Hbg肽，即Hbg-35-114(Hbγ1112-141)、Hbg-68-155(Hbγ1[113-130])Hbg-69-156(Hbγ1[123-138])的存在或不存在下，人MNC用MPLA(1μg/ml)进行刺激。Hbg-68-155代表肽Hbg-32至Hbg-39的共同部分结构。Hbg-69-156的序列假定为负责脂质跨膜区内的Hbg肽的α螺旋结构。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图20：在用回忆抗原刺激记忆T细胞期间，MPLA的佐剂效应。在MPLA(10、100和1000ng/ml)的存在或不存在下，人MNC用结核分枝杆菌的纯化蛋白质衍生物(PPD)(1μg/ml)或破伤风类毒素(TT)(0.1絮凝极限[LF]/ml)进行刺激。在培养6天后，细胞用3H-胸苷(3HTdR；2Ci/mmol、0.2μCi/培养)进行标记，并且在培养另外一天后，细胞在玻璃过滤垫上进行收获，用于测量掺入DNA内的放射性。结果表示为一式两份培养物的平均值±SD。
图21：在用PPD和TT刺激人记忆T细胞期间，Hbg-35对MPLA的佐剂活性的协同作用。在MPLA(10ng/ml)和Hbg-35(1或3μM)的存在或不存在下，人MNC用PPD(1μg/ml)或TT(0.1LF/ml)进行刺激。在培养6天后，细胞用3HTdR(2Ci/mmol、0.2μCi/培养)进行标记，并且在培养另外一天后，细胞在玻璃过滤垫上进行收获，用于测量掺入DNA内的放射性。结果表示为一式两份培养物的平均值±SD。
图22：单独(A)或在Hbg-32的存在下(B)，MPLA的小角度X射线散射图样。散射强度的对数相对于散射矢量s(＝1/d，d＝间隔)进行标绘。在不存在肽的情况下，在4.11nm处的尖锐反射指示多层周期性的存在，在肽的存在下，各种另外的反射的出现对于立方聚集体结构的存在是特征性的。
图23：Hbg-32加入其中的MPLA聚集体的共振能量转移光谱法(FRET)。MPLA聚集体用染料NBD-PE(供体)和RhoPE(受体)进行染色，并且强度比ID/IA是外部化合物例如此处观察到的Hbg-32肽的掺入的灵敏测量。
图24：单独或在Hbg-32的存在下的MPLA分散体在90°处的激光散射。折线：单独的MPLA(0.1mM)。实线：MPLA(0.1mM)+Hbg-32(0.1mM)。通过对于单独的MPLA在1000nm周围的大小变化(右侧峰)，以及在以等摩尔浓度的Hbg-32的存在下的减少(左侧两个峰)，显示出MPLA通过肽的明确崩解效应。
图25：单独(A)和在以等摩尔浓度的Hbg-32的存在下(B)，MPLA(1mM)的冷冻断裂电子显微镜检查。在不存在肽的情况下，MPLA聚集体紧密填充，形成大的多双层排列。在肽的存在下，这些聚集体分散且变得更球形。
图26：在Hbg-32的存在或不存在下，MPLA的原子力显微镜检查。(A)在云母表面上的MPLA(25μM)的原子力显微镜照片。呈现的是脂质聚集体的x-y＝5.0x5.0μm2切片的深度剖面。不同地貌晕渲代表MPLA装配的不同高度，显示在z＝50和300nm之间的致密层。(B)在云母上等摩尔含量的Hbγ32的存在下，MPLA(25μM)的原子力显微镜照片。不同地貌晕渲代表MPLA装配的不同高度，其中最大高度最高达10nm。超过90％的平面显示大约5nm厚度的双层结构。
图27：单磷酰脂质A(MPLA)用Hbγ35的等温量热滴定。MPLA用Hbγ35的等温量热滴定对时间的依赖性(上)，以及所得到的焓变ΔH根据肽与MPLA的摩尔比进行测定。在恒定搅拌下，将肽每5分钟以3μl份滴定到含MPLA室内，并且在每次注射后通过ITC仪器测量的相互作用热相对于时间进行标绘。
图28：单独和在MPLA的存在下的Hbγ35的红外光谱。对于单独的Hbγ35(上)和在等摩尔含量的MPLA的存在下(下)，红外光谱在1700和1590cm-1之间的酰胺I振动带(主要为C＝O伸缩振动)的范围内进行测量。对于α螺旋和β片层二级结构的存在，分别指示在1659和1628cm-1周围的吸光度最大值。
图29：在用MPLA刺激人MNC期间，Hbg-35与Hbα-、Hbβ-和Hbγ2链的同源肽的协同作用的比较。在以1、3和10μM的各种Hb肽，即Hbg-35-158(Hbγ1[112-141])、Hba-66-153(Hbα[107-136])、Hbb-67-154(Hbβ[112-141])和Hbg2-70-157(Hbγ2[112-141])的存在或不存在下，人MNC用MPLA(3000ng/ml)进行刺激。对照培养物不含MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
图30：Hbg-35肽对用合成脂肽刺激人MNC的协同作用。在以1、3和10μM的Hbg-35的存在或不存在下，人MNC用Pam3C-SK4(10nM)、FSL-1(1nM)或MPLA(3μg/ml)进行刺激。对照培养物不含脂肽或MPLA进行维持。在20小时的培养期后，上清液中的IL-6浓度通过ELISA进行测定。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
具体实施方式
实施例举例说明本发明：
实施例1：材料与方法
Hbγ、肽和MPLA
所有合成肽均由EMCmicrocollectionsGmbH(Tübingen，德国)制备且获得。短长度肽(15-16个氨基酸)通过沉淀进行纯化，并且它们的结构通过MS分析加以验证。长长度肽通过HPLC进行纯化，并且声明为具有超过95％的纯度。肽文库的肽以10mM的浓度溶解于DMSO中。所有其他肽以10mM的浓度溶解于0.9％NaCl中。衍生自Hbγ链的肽命名为Hbg-##-***。##-编号指肽数目，并且***-编号指批号。相应地，衍生自Hbα链或Hbβ链的肽分别命名为Hba和Hbb。
化学纯化的天然Hbγ链通过Prof.J.PMach(Lausanne)进行制备。它们以100μM的浓度溶解于0.9％NaCl中。
MPLA得自AvantiPolarLipids，Inc.(Alabaster，AlabamaUSA)。MPLA通过涡旋(30分钟)和在超声波浴中温育(15分钟)的五个循环，以250μg/ml的浓度溶解于注射用水(B.BraunMelsungenAG，Melsungen，德国)中。
细胞培养
通过在Ficoll梯度培养基(PAALaboratoriesGmbH，Pasching，奥地利)上的密度梯度离心，从健康供体的外周血中分离人单核细胞(MNC)。将细胞在RPMI-1640培养基中悬浮且培养，所述RPMI-1640培养基含有1μg/ml青霉素和100U/ml链霉素。使50μl肽溶液与50μlMPLA溶液一起在U形96孔微量细胞培养板#3799(CorningCostarGmbH，Bodenheim，德国)中在37℃下温育15分钟。在该温育期后，加入20μl热灭活(56℃/30分钟)的人血清或RPMI-1640培养基。最后，加入80μlMNC细胞悬浮液，以获得对于在不存在人血清的情况下的培养2x106细胞的最终浓度，或对于在血清的存在下的培养1x106细胞的最终浓度。在20小时培养时间后，将细胞向下旋转并且收获培养上清液。通过得自InvitrogenGmbH，Darmstadt(德国)，用于ELISA的匹配抗体对，测定上清液中的细胞因子浓度。大多数情况下，每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。在图3中，给出三次独立实验的平均值，这三次独立实验各自具有一式两份培养。
对于T淋巴细胞的刺激，人MNC以0.5至1.0x106细胞/ml的浓度在平底96孔组织培养板中的RPMI-1640培养基中进行培养，所述RPMI-1640培养基含有1μg/ml青霉素、100U/ml链霉素和10％灭活的人血清。为了研究MPLA和Hbg肽的佐剂效应，使用回忆抗原破伤风类毒素(TT)和结核分枝杆菌的纯化蛋白质衍生物(PPD)(两者均来自StatensSerumInstitute，Copenhagen，丹麦)。在培养6天后，细胞用3H-胸苷(3HTdR(2Ci/mmol、0.2μCi/培养))进行标记，并且在培养另外一天后，细胞在玻璃过滤垫上进行收获，用于测量掺入DNA内的放射性。结果表示为一式两份培养物的平均值±SD。
对于HEK293细胞的转染和培养，细胞以1.5x105/ml的密度在96孔板中的DMEM中铺平板，所述DMEM补充有10％FCS、0.5单位/ml青霉素和0.5μg/ml链霉素。第二天，根据制造商的方案，细胞使用Polyfect(Quiagen，Hilden，德国)进行瞬时转染。含有huTLR4、huMD2和huCD14的表达质粒以200ng/转染使用。在转染6小时后，将细胞洗涤且如附图中所示用配体刺激进一步20小时。使用得自InvitrogenGmbH，Darmstadt(德国)，用于ELISA的匹配抗体对，测定培养上清液中的IL-8含量。每个值代表一式两份培养物的平均值±SD。
适当时，借助于SigmaPlot软件，使用成对斯氏t检验或曼怀二氏秩和检验进行统计分析。在<0.05时，差异视为显著的。
激光散射
在Malvern粒度仪(Malvern，Herrsching，德国)上，进行在以不同浓度的Hbg-32肽的不存在和存在下，MPLA悬浮液(0.1mM)的尺寸和粒度分布。光散射强度在90°的散射角处进行监控，并且通过假定球形粒度记录且评估强度。
冷冻断裂透射电子显微镜检查(FFTEM)
少量样品夹在两个铜型材之间，并且通过将夹层立即插入在液氮中冷却的液化乙烷-丙烷-混合物内进行冷冻。断裂和重复在-150℃下在BAF400T冷冻断裂装置(BAL-TEC，Balzers，Liechtenstein)中进行，所述BAF400T冷冻断裂装置配备电子枪和膜片层厚度监视器。对于重复，Pt(C)在35°的角度下进行蒸发，并且(C)在90°的角度下进行蒸发。将重复置于铜栅上，并且用氯仿-甲醇混合物进行清洁。
小角度X射线散射(SAXS)
在欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory)(EMBL)分站处，在Hamburg同步辐射设施HASYLAB处，使用照相机X33进行SAXS测量。使用具有联机读出的成像板检测器(MAR345，MarResearch，Norderstedt/德国)，在40℃下记录在散射矢量0.1<s<1.0nm-1(s＝2sinθ/λ，2θ散射角和λ波长＝0.15nm)范围内的衍射图样，伴随1分钟的暴露时间。脂质浓度在所有情况下均为20mM。s轴用具有58.4nm的周期性的Ag山嵛酸盐进行校正。如先前描述的(Howe等人(2008a))评估衍射图样，对限定的三维结构指定主要散射最大值的间隔比。层状和立方体结构在此处是最有关的。下述特点表征超分子结构：
(1)层状：反射以层状重复距离d的等距离比即1、1/2、1/3、1/4等成群；
(2)立方体：这些非层状三维结构的不同空间群在其间隔比中不同。倒易空间shkl＝1/dhkl和晶格常数a之间的关系为
shkl＝[(h2+k2+l2)/a]1/2
(hkl＝平面的相应设置的米勒指数)。
(荧光)共振能量转移光谱法(FRET)
通过作为探针稀释测定应用的FRET光谱法，测定嵌入MPLA聚集体内的Hbg-32。MPLA用供体染料NBD-磷脂酰乙醇胺(NBD-PE)和受体染料罗丹明-PE进行标记。供体染料在470nm处进行激发，并且它的发射强度在531nm处进行测量。在FRET方法学中，供体发射荧光强度在对受体的较少放射的过程中转移，所述受体具有对应于供体发射波长(531nm)的激发波长。将Hbγ肽以0.01或1mM的最终浓度加入MPLA(0.01mM)中。嵌入监控为以时间依赖性方式，在531nm处的供体发射强度Id与受体发射强度IA[在593nm处(FRET信号)的那种的比增加。
原子力显微镜检查分析
原子力显微镜检查(AFM)允许直接查看在接近生理条件下在分子规模下的脂质聚集体形态。这允许获得MPLA分散体下至低于1nm的分辨率极限的深度剖面。对于分析，在等摩尔含量的Hbg-32的不存在和存在下，MPLA分散体以25μM的浓度在生理盐水中进行制备。
等温滴定量热法(ITC)
如近期描述的(Kaconis等人(2011))，在37℃下在MCS等温滴定量热计(MicrocalInc.)上进行与MPLA结合的肽的微量量热测量。将如上所述制备的MPLA(0.05mM)分配到微量量热室(体积1.3ml)内，并且将肽溶液(1mM)填充到注射器区室(体积100μl)内。在温度平衡后，在恒定搅拌下，将肽每5分钟以3μl份滴定到含脂质室内，并且在每次注射后通过ITC仪器测量的相互作用热相对于时间进行标绘。在该测定中，两种配体之间的吸热反应导致峰向上，并且放热反应导致峰向下。
傅里叶变换红外光谱法
在IFS-55光谱仪(Bruker)上进行红外光谱法测量。肽和MPLA:肽混合物分散在20mMHepes缓冲液，pH7.0中，并且在ZnSe衰减全反射(ATR)单元上扩散。在游离缓冲溶液蒸发后，将100个样品干涉图累积、变迹、傅里叶变换且转换为吸收光谱。红外光谱在酰胺I振动(主要为C＝O伸缩振动)的范围内进行评估，其峰位置对于Hbγ35肽的二级结构是特征性的。通常，α螺旋结构在1655至1662cm-1的峰位置处发现，而β片层结构显示在1630cm-1周围的主要吸光度最大值。
实施例2：合成Hbγ衍生肽和MPLA之间的协同作用
生成各具有15或16个氨基酸，来自已知huHb-γ1氨基酸序列的27种重叠人(hu)Hb衍生肽的肽文库(参见万维网uniprot.org/uniprot/P69891处)。肽N末端连接至5个赖氨酸残基，以增强肽在水溶液中的溶解度(图1)。发现在用MPLA刺激MNC期间，这些赖氨酸偶联的肽中的几个表达增强活性(图2)。然而，在不存在MPLA的情况下，这些肽中的一些还具有相当大的刺激活性，并且另外，赖氨酸偶联肽已知以非特异性方式活化多形核白细胞。因此，相反生成27种天然(即，未经修饰的)重叠肽的相应文库(图3)。发现在用MPLA刺激MNC期间，这些天然Hbγ衍生肽中的几种天然肽表达协同活性(图4)。尤其地，肽编号23(Hbγ11-125)和编号24(Hbγ116-130)显示出在增强人MNC中MPLA诱导的细胞因子释放中显著的协同活性。在不存在MPLA的情况下，这些天然肽无一表达任何细胞因子诱导能力。
肽Hbg-23和Hbg-24显示最佳命中。因此，合成具有两者的合并氨基酸的肽，即VTVLAIHFGKEFTPEVQASW，其被称为Hbg-34(Hbγ1111-130)。这种肽表达与Hbg-23和Hbg24相似程度的对MPLA的协同活性(图5)。
因为大多数C末端肽(肽编号20至编号27)是生物活性的，所以合成三种更长的重叠肽，指定为Hbg-30-105(Hbγ86-115)、Hbg-31-106(Hbγ99-128)和Hbg-32-107(Hbγ112-141[L141Q])(图6)。与Hbg-23相比较，发现延长肽Hbg-32-107展示关于MPLA诱导的免疫刺激增加的协同效应(图7)。
Hbg-23和Hbg-32-107两者均显示在MNC的MPLA刺激期间，在人血清的不存在以及存在下的协同效应(图8)。除在MNC刺激中的协同效应之外，Hbg-23和Hbg-32-107还显示在刺激纯化的人单核细胞中与MPLA协同(图9)。
为了证实延长的C末端Hbg肽的这些协同效应，产生且分析两种另外的Hbg-32-107制剂，即Hbg-32-108和Hbg-32-KB。发现Hbg-32-108和Hbg-32-KB表达与Hbg-32-107可比较的协同效应(图10)。然而，Hbg-23的第二分批显示在人MNC中的IL-释放诱导期间，与MPLA无协同效应(数据未示出)。
这些数据指示在MNC中的IL-6和IL-8释放诱导期间，Hbg肽且特别是Hbg-32与MPLA协同。如图11中所示，Hb-32(分批113)的这种协同效应并不仅限制于IL-6和IL-8释放，还就IL-1β和TNFα释放而言发现。
因为MPLA是LPS是部分结构，所以研究Hbg-32是否也展示与这种肽的MPLA相关效应相比较，通过完全LPS在MNC刺激中的协同作用。如图12中所示，发现两种内毒素化合物的免疫刺激活性被Hbg-32协同增强。
最后，Hbg-32的协同效应与完全Hbγ链即Hb-γ-133的协同效应相比较。与天然Hbγ相比较，发现Hbg-32-107在MNC刺激期间表达更高的协同活性(图13)。这些结果显示Hbg-32与MPLA的协同活性超出总天然Hbγ链的活性。
在这个研究阶段时，认识到由于数据传送中的错误，C末端氨基酸残基在Hgb-32肽的合成中不正确地加以选择。代替如天然Hbγ1序列中存在的亮氨酸(L141)，谷氨酰胺(Q)残基已引入Hbg-32中。因而，合成具有Hbγ序列的正确天然氨基酸的Hbg肽，即具有序列TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAL的Hbg-35。在细胞培养期间，在人血清的存在或不存在下，这种肽的协同效应类似由Hbg-32介导的协同作用(图14A和14B)。可以得出结论如Hbg-32中存在的C末端极性/中性谷氨酰胺可以替换为非极性/中性亮氨酸，而不损害与MPLA的协同效应。因此，在下述实验中，使用Hbg-35肽代替Hbg-32肽，以便使用天然序列。
完成下述实验以表征Hbg-35的活性区，其负责协同效应。因此合成Hbg衍生肽，其中Hbg-35肽的序列延伸或截短至Hbg蛋白质的N末端和C末端端部，和/或移向Hbγ1蛋白质的N末端端部。图14和15中呈现的数据显示所有合成的Hbg肽均为就在体外协同MPLA的炎症活性而言是生物学活性的。然而，存在与Hbg35相比较，指示C末端截短和/或N末端转移的肽表达更低程度的协同活性的趋势(图15和16)，而Hbg-35序列一直到天然Hbγ1蛋白质的端部的C末端延伸略微增强协同效应(图16)。
接下来，进行丙氨酸扫描，以测定特异性氨基酸对Hbg-35的稳定性或功能的贡献。在这种技术中，将肽的每一个个别氨基酸替换为丙氨酸，如图17中对于Hbg-35证实的。根据合成的25种Hbg肽，发现如Hbg-51、Hbg-54和Hbg-55中存在的三种丙氨酸替换影响Hbg-35的协同活性(图18)。虽然如Hbg-51中存在的Phe122/Ala替换增强Hbg-35的协同活性，但Glu125/Ala和Val126/Ala的替换取消协同效应。所有三种替换均位于Hbg-23和Hbg-24的序列内，发现其具有强协同活性(图5)。然而，其中还包括这些氨基酸的Hbg-25是失活的。这指示连同F122、E125和V126一起，另外的氨基酸参与Hbg-35的稳定性和/或功能。
所有协同活性的Hbg肽均具有占优势的α螺旋结构，即TPEVQASWQKMVTAVA，其可以假定为跨越双层脂质例如MPLA，并且因此使这些化合物崩解。二级结构通过因特网程序例如LOMETS和3D-JIGSAW进行预测。另外，这些Hbg肽的共同部分结构为VLAIHFGKEFTPEVQASW。因此合成这些肽并且测定其与MPLA的协同活性。然而，发现这些肽仅表达微小的协同活性或完全不表达活性(图19)。这指示这些序列对于最佳协同效应不足够，但另外的N末端和/或C末端氨基酸是必需的。
实施例3：MPLA和Hbg-35在用回忆抗原活化T淋巴细胞中的贡献
在如通过例如单核细胞和树突状细胞呈现的先天性免疫系统，以及如通过T淋巴细胞和B淋巴细胞呈现的适应性免疫系统之间存在紧密相互作用。单核细胞和树突状细胞将抗原片段呈递给适应性免疫系统的细胞，以起始特异性免疫反应。另外，它们借助于细胞因子的释放支持免疫应答的强度和极化。对于呈现的研究，使用在人MNC的细胞制剂中用结核分枝杆菌的纯化蛋白质衍生物(PPD，其用于皮肤结核菌素敏感性测试)和破伤风类毒素(TT，其用作破伤风疫苗)的T记忆淋巴细胞的活化模型。在这种细胞系统中，仅记忆T淋巴细胞以特异性方式响应这些抗原。这要求在细菌感染的发作期间或在疫苗接种期间，血液的供体与这些抗原具有主要接触。
在用PPD和TT刺激人MNC后，发现MPLA对用回忆抗原刺激T记忆细胞具有非常有效的佐剂活性。少至10ng/ml的MPLA足以发挥接近最佳的佐剂效应(图20)。在一些实验中(例如图20A)，观察到用单独的MPLA的T淋巴细胞增殖。然而，在其中未检测到针对单独的MPLA的T淋巴细胞应答的实验中，也观察到MPLA的佐剂效应(例如图20B)。MPLA对PPD和TT诱导的T淋巴细胞增殖的佐剂作用可以通过添加Hbg-35得到增强(图21A和21B)，指示包含MPLA和Hbg-35的组合物在适应性免疫系统中也是协同活性的。
实施例4：合成的Hbγ衍生肽和MPLA之间的协同机制
为了研究Hbg-32肽与MPLA的协同活性的分子机制，应用物理方法。内毒素的聚集体结构是其在免疫细胞中诱导细胞因子的能力中的决定因素。这种聚集体结构通过在肽的不存在和存在下进行同步辐射X射线小角度散射进行表征。发现单独的MPLA的结构为大部分多层的(图22A)，对应于无生物活性或仅低生物活性的聚集形式。在肽的存在下，发现这种聚集体转换为具有立体对称的那种(图22B)，先前显示为代表内毒素的生物活性形式(10)。
Hb掺入内毒素聚集体内的能力显示为代表协同作用的重要特性。应用(荧光)共振能量转移光谱法，以监控Hbg-32肽进入MPLA聚集体内的嵌入行为。发现在10:1的[MPLA]:[Hbg-32]摩尔比时，肽在MPLA内的相当大的嵌入，在等摩尔浓度时显著得多(图23)。
由于Hb作用的内毒素崩解是生物活性增强的进一步先决条件(Howe等人(2008a)；Brandenburg等人(2003)；Howe等人(2007)；Howe等人(2008b))。因此，含和不含肽的MPLA聚集体的粒度分布通过监控细胞中经由激光散射的颗粒进行测定。结构显示对于不含肽的MPLA，在500-2000nm范围内的相当大的MPLA粒度(图24)。在添加肽后，观察到具有在80-300nm范围内的广泛分布的这些尺寸的急剧减少。
因为来自激光散射的粒度分布数据仅通过假定球形颗粒有效，所以MPLA的形态通过独立方法冷冻断裂电子显微镜检查进行研究。这允许通过使样品震荡冷冻(shock-freezing)维持脂质的结构。关于单独的MPLA的结果指示依照上述结果，具有在微米范围内的大尺寸的非常致密和层状填充的聚集体(图25A)。在肽的存在下，存在伴随形态变化的粒度的强烈降低，导致填充排列分解为在20至几百nm的尺寸范围内的球样聚集体(图25)。这些结果依照通过光散射获得的数据。
原子力显微镜检查(AFM)允许直接查看在接近生理条件下在分子规模下的脂质聚集体形态。这允许获得MPLA分散体下至低于1nm的分辨率极限的深度剖面。数据显示对于在云母板上扩散的纯MPLA，在z方向上具有几百nm延伸的致密填充的多层聚集体的存在。在脂质分散体上小心扩散的肽仅通过被动扩散与脂质聚集体相互作用。这种施用技术具有下述优点：通常在数分钟的时间尺度上发生的在两种化合物之间的混合过程，减慢至几小时，因此允许相互作用过程的详细分析。
如在Hbg-32的存在下对于MPLA装配可见的(图26A和26B；在一小时后记录)，紧密填充的层通过多层分解成双层结构而急剧崩解。肽的作用模式是其跨膜掺入MPLA双层内，因此相当大地降低层状单元的尺寸。
这些数据依照使用冷冻断裂(图25A和25B)和SAXS实验(图22)的电子显微镜数据，现在给出清晰的观察画面：肽引起生物学活性中的增加：相当小的MPLA颗粒可以更好地与血清和膜蛋白例如CD14和LBP结合，所述血清和膜蛋白负责由MPLA诱导的炎症反应。
使用等温滴定量热法(ITC)，可以推导两个不同分子种类的相互作用的热力学。在图27中，测量的相互作用的功率和焓变相对于[Hbγ35]:[MPLA]摩尔比显示(i)仅发生吸热反应(峰朝上)，和(ii)仅存在相对于时间和摩尔比轻微的焓变减少。还发现这种观察对于甚至更高的摩尔比也是真实的，即肽与MPLA聚集体的相互作用显示不饱和的行为。这指示催化而不是典型的结合反应(其形成复合物)，并且与对于其发生放热反应的抗微生物肽与内毒素的作用形成对比，导致结合的饱和。
最后，为了获得关于肽的二级结构的信息，应用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)。在图28中，标绘纯Hbγ35的光谱(上)和Hbγ35:MPLA混合物的那种(下，1:1摩尔)。如可见的，两个图均显示在1659cm-1周围的主要吸光度最大值和在1628cm-1周围的第二峰，其指示主要α螺旋结构和次要β片层组分。重要的是，脂质的添加不影响肽的二级结构。这再次依照上文呈现的数据，因为肽的直接结合而不是催化反应导致其二级结构的变化。
实施例5：衍生自Hbα-Hbβ和Hbγ2链的肽
另外研究具有Hbg-35的同源序列，衍生自Hbα-Hbβ-和Hbγ2链的肽。这三种肽具有下述序列：
Hba-66-153:Hbα[107-136]VTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVL(SEQIDNO:21)
Hbb-67-154:Hbβ[112-141]CVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANAL(SEQIDNO:20)
Hbg2-70-157:Hbγ2[112-141]TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTGVASAL(SEQIDNO:19)。
这些肽还具有占优势的α螺旋结构，其可以假定为跨越双层脂质例如MPLA，并且因此使这些化合物崩解。如图29中所示，发现Hbb-67-154和Hbg2-70-157两者均以与Hbg-35-146m相似的范围协同活性，而Hba-66-153仅显示最低限度协同活性。
实施例6：Hb肽与细菌脂蛋白的协同活性
另外研究细菌脂蛋白例如Pam3C-SK4或FSL-1在人MNC中的细胞因子诱导中是否与Hbg-35协同，类似于LPS和MPLA。图30中所示的结果指示事实上存在合成脂肽与Hbg-35的协同活性。
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表1：Hbg-35的保守变体。列出了Hbg-35的氨基酸的保守置换，其导致预期具有与Hbg-35相同或至少相似的协同活性的变体序列。

Claims (14)

1.一种包含至少一种Toll样受体(TLR)活化两亲性脂质和至少一种血红蛋白衍生肽以及任选的药学可接受的载体的药物组合物，其中所述血红蛋白衍生肽由下述组成：
(a)由式I的序列组成的氨基酸序列：
A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19(式I)，
其中
A1选自苏氨酸、半胱氨酸和丝氨酸；
A2选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；
A3选自亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
A4选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
A5选自异亮氨酸、组氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
A6选自组氨酸、精氨酸和亮氨酸；
A7选自苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
A8选自甘氨酸和丙氨酸；
A9选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
A10选自谷氨酸和天冬氨酸；
A11选自苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
A12选自苏氨酸和丝氨酸；
A13选自脯氨酸和甘氨酸；
A14选自谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；
A15选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；
A16选自谷氨酰胺和天冬酰胺；
A17选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
A18选自丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸；和
A19选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
和
(b)位于(a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列和/或位于(a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列，
其中
(b-i)所述位于(a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列选自：
N1：V；
N2：LV；
N3：VLV；
N4：NVLV(SEQIDNO:108)；
N5：GNVLV(SEQIDNO:109)；
N6：LGNVLV(SEQIDNO:4)；
N7：LLGNVLV(SEQIDNO:110)；
N8：KLLGNVLV(SEQIDNO:111)；
N9：FKLLGNVLV(SEQIDNO:112)；
N10：NFKLLGNVLV(SEQIDNO:113)；
N11：ENFKLLGNVLV(SEQIDNO:114)；
N12：PENFKLLGNVLV(SEQIDNO:115)；
N13：DPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:116)；
N14：VDPENFKLLGNVLV；(SEQIDNO:117)
N15：HVDPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:118)；和
N16：LHVDPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:5)；
并且其中
(b-ii)所述位于(a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列选自：
(1)由式II的序列组成的氨基酸序列：
C1-C2-C3-C4-C5(式II)，
其中
C1：选自谷氨酰胺、天冬酰胺和酪氨酸；
C2：选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
C3：选自甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；
C4：选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；和
C5：选自苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸和赖氨酸；
(2)由式III的序列组成的氨基酸序列：
C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12(式III)，
其中
C1至C5如(b-ii)(1)中定义；
C6：选自丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
C7：选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；
C8：选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
C9：选自丝氨酸、天冬酰胺和苏氨酸；
C10：选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
C11：选自亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和
C12：是由氨基酸序列SSRYH组成的肽或不存在；和
(3)由式IV的序列组成的氨基酸序列：
C1-C2-C3-C4-C5-C6-X(式IV)，
其中
C1至C5如(b-ii)(1)中定义；
C6：选自丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
X：是由以任何次序的五种氨基酸残基丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸组成的肽，
或其拟肽。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中(a)的氨基酸序列选自TVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:1)和CVLAHHFGKEFTPPVQAAY(SEQIDNO:2)。
3.根据权利要求1或2的药物组合物，其中(b-i)的氨基酸序列选自
(i)V(SEQIDNO:3)，
(ii)LGNVLV(SEQIDNO:4)和
(iii)LHVDPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:5)和/或
(b-ii)的氨基酸序列选自
(i)QKMVT(SEQIDNO:6)，
(ii)QKVVA(SEQIDNO:7)，
(iii)QKMVTAVASAL(SEQIDNO:8)，
(iv)QKMVTAVASAQ(SEQIDNO:9)，
(v)QKMVTGVASAL(SEQIDNO:10)，
(vi)QKVVAGVANAL(SEQIDNO:11)和
(vii)QKMVTAVASALSSRYH(SEQIDNO:12)。
4.根据权利要求1-3中任一项的药物组合物，其中所述血红蛋白衍生肽由选自下述的氨基酸序列组成：
(i)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAL(SEQIDNO:13)，
(ii)VTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:14)，
(iii)VTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASALSSRYH(SEQIDNO:15)，
(iv)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAQ(SEQIDNO:16)，
(v)LGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVT(SEQIDNO:17)，
(vi)LHVDPENFKLLGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:18)，
(vii)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTGVASAL(SEQIDNO:19)，和
(viii)CVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANAL(SEQIDNO:20)。
5.根据权利要求1-4中任一项的药物组合物，其中所述TLR活化两亲性脂质选自内毒素或其内毒素活性部分和细菌脂肽。
6.根据权利要求5的药物组合物，其中所述内毒素是细菌的或合成的S或R形式脂多糖(LPS)。
7.根据权利要求5或6的药物组合物，其中所述内毒素的内毒素活性部分是LPS衍生的无多糖天然或合成脂质A组分。
8.根据权利要求5或6的药物组合物，其中所述内毒素是天然或合成五酰基和/或六酰基脂质A。
9.根据权利要求5或6的药物组合物，其中所述内毒素是天然或合成五酰基和/或六酰基脂质A单磷酸酯。
10.根据权利要求5或6的药物组合物，其中所述细菌脂肽是具有S-(2,3-二羟基丙基)-半胱氨酸主链的单、二或三酰化脂肽。
11.根据权利要求1-10中任一项的药物组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤、预防和/或治疗感染、预防和/或治疗变态反应、预防和/或治疗年龄相关性免疫失衡、刺激先天性和适应性免疫系统和/或减轻辐照的不良副作用。
12.一种血红蛋白衍生肽，其由下述组成：
(a)TVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:1)的氨基酸序列；和
(b)位于(a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列和/或位于(a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列，
其中
(b-i)位于(a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列选自：
(i)V(SEQIDNO:3)，
(ii)LGNVLV(SEQIDNO:4)和
(iii)LHVDPENFKLLGNVLV(SEQIDNO:5)和/或
和
(b-ii)位于(a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列选自：
(i)QKMVT(SEQIDNO:6)，
(ii)QKMVTAVASAL(SEQIDNO:8)，
(iii)QKMVTAVASAQ(SEQIDNO:9)，
(iv)QKMVTAVASALSSRYH(SEQIDNO:12)。
13.根据权利要求12的血红蛋白衍生肽，其中所述血红蛋白衍生肽由选自下述的氨基酸序列组成：
(i)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAL(SEQIDNO:13)，
(ii)VTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:14)，
(iii)VTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASALSSRYH(SEQIDNO:15)，
(iv)TVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASAQ(SEQIDNO:16)，
(v)LGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVT(SEQIDNO:17)和
(vi)LHVDPENFKLLGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASW(SEQIDNO:18)。
14.根据权利要求12或13的血红蛋白衍生肽，其用于治疗细菌感染。
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