CN107530438A

CN107530438A - Pll用于改善溶液中分子的稳定性的用途

Info

Publication number: CN107530438A
Application number: CN201580076201.2A
Authority: CN
Inventors: 米歇尔·热弗尔
Original assignee: Hyde Lo Phil Co
Current assignee: Hyde Lo Phil Co
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2018-01-02
Also published as: US20180008722A1; FR3030524B1; FR3030524A1; CA2971019A1; US10596271B2; CA2971019C; EP3233923A1; WO2016097618A1

Abstract

本发明涉及一种分子复合物，包含：‑至少一种聚赖氨酸缀合物(PLL)，包含：‑主PLL直链，和‑至少一种分子F，其平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿，且共价键合到所述主链，和‑至少一种在溶液中不稳定的分子M，所述缀合物和分子M通过非共价键连接。本发明还涉及包含这种复合物的组合物、获得方法及其用途，以及一种或多种基于PLL的缀合物用于改善在与在溶液中不稳定的分子的使用相容的时间段内所述分子的亲水性、有效性和活性的用途。本发明还涉及用于鉴定基于PLL的缀合物或多种基于PLL的缀合物的组合的方法，所述缀合物允许提高在溶液中不稳定的分子的亲水性、有效性和活性，以及用于实施所述方法的试剂盒。

Description

PLL用于改善溶液中分子的稳定性的用途

技术领域

本发明涉及包含基于聚赖氨酸的缀合物(PLL)和溶液中不稳定分子的特定分子复合物。其还涉及包含这种复合物的组合物、其获得方法及其用途。

本发明还涉及一种或多种基于PLL的缀合物在与溶液中不稳定分子的使用相容的时间段内改善所述分子的亲水性和有效性/活性的用途。

本发明还涉及用于鉴定基于PLL的缀合物或多种所述缀合物的组合的方法，所述缀合物允许改善溶液中不稳定分子的亲水性和有效性/活性以及用于其实施的试剂盒。

背景技术

大量的有公益性的大分子，特别是在药物、美容、营养或诊断领域中的大分子，在溶液中不稳定、溶解性差或不溶解。尽管它们显示出药理学、美容、营养和/或诊断活性，但它们在溶液中部分或全部地失去其活性，而变得难以使用甚至完全不可用。

这种溶液中的不稳定性的原因是各种各样的，但通常是由于分子不能在不同的稳定相互作用之间保持平衡，并且其结构熵倾向于使整体不稳定。

这种不稳定性对于将资源投入到这种不可用分子的研究和开发项目中的实业家而言具有重要影响，而对于那些未获得其有益效果的人员也同样。

目前已知克服这种不稳定现象的技术方案通常是非常昂贵的，需要相当大的开发时间，并且也不适合于治疗、美容或营养用途或作为分子的诊断试剂的用途。

例如，不稳定的药物用途溶液通常储存在邻近-80的温度下。其必须进行再加热并在处理下施用于患者。这还产生了与维持-80的稳定温度所需的能量消耗相关的主要缺点，即，与在考虑到避免分子沉淀而进行的溶液的再加热步骤之间必需的同步(synchronisation)相关的逻辑问题，因此导致关于施用的活性分子的实际量和药物产品的给药途径的不确定性。

此外，用于稳定大分子的方法是已知的，例如微胶囊化、纳米颗粒的形成或载体化，但是这些方法也不令人满意。

微胶囊化是将固体、液体或糊状产品并入微粒的过程。在健康领域，使用微粒以实现储存缓慢释放到体内的一定量的药物。该系统虽然在某些情况下有效用于在体内稳定并释放目标分子，但是如果其在溶液中是不稳定的，则不能将其稳定在离体液体溶液中。此外，通常用于形成这些微胶囊的聚合物是乳酸和乙醇酸(PLGA，PLA)的衍生物、乙基纤维素或聚ε-己内酯，它们是可生物降解的并且倾向于为受体和环境留下“痕量污染物”。

纳米颗粒用于生物医药和医学研究。纳米颗粒是三维中的一个小于100nm的超细颗粒。这项技术除了通常极其昂贵的成本之外，还有一些限制和缺点。实际上，这些产品的合成必须是完全可重复的，必须对其物理化学性质进行深入研究并且具有很高的精度，纳米颗粒的表面经常必须被允许增加胶体稳定性和生物相容性的分子或聚合物包覆。最后还要深入研究纳米颗粒的降解机制，必须认真评估细胞、生理和组织毒性的风险。因此，纳米技术的使用会造成不可忽略的物理风险，其可能同时是环境风险和对于使用纳米技术的人以及在生产过程中操纵纳米颗粒的人员而言的健康风险。其他缺点与以下事实有关：暴露于纳米颗粒必须通过可追溯性来降低和/或控制，这必须使得始终可以知道纳米颗粒处理哪里、在哪个产品中、在哪个包装中。

因此，已知的方法虽然以一定比例允许“稳定”、“体内”的大分子，也就是说特别是提高其生物利用度及其在通过酶和其它蛋白质例如蛋白酶、脂肪酶和葡糖苷酶的降解方面的稳定性，但不能稳定“体外”大分子，也就是说特别是：

-一方面，不能在大于约0的温度下将大分子在液相(例如主要是水溶液)中以溶液形式(不沉淀)保持足够长的时间(可以达到数月或数年)，来允许容易地处理溶液中的大分子，以及将其以固相(冷冻形式)以及液相(例如在环境温度下)存储，

-另一方面，还不能在大于0度的温度下在整个其储存期间(可以达到数月或数年)保持其在固相和液相中的活性。

通常，用现有技术的任何方法配制的目标大分子只有很短的时间(从几秒到几分钟或几个小时)在体外液体溶液中是稳定的。

因此，强烈需要一种替代系统，其不仅允许保持体内大分子的良好载体化的优点，而且还允许在体外液体溶液中稳定大分子以便改进其存储和其处理。

还强烈需要克服参考已知系统所述的至少一个缺点的系统，特别是这样的系统，其

-允许溶液中不稳定分子在溶液中的稳定化，优选在溶液处于液相的温度下，持续足够长的时间，以允许大分子的处理和/或储存，

-使得即使在复合形式下也可以保持溶液中不稳定分子的活性，特别是生物活性，

-允许保持溶液中不稳定分子的活性，特别是生物活性，优选在溶液处于液相的温度下持续足够长的时间以允许大分子的操作和/或储存，

-没有免疫原性，

-易于实施，

-可廉价实施，

-需要保护溶液中不稳定分子使其免于分子易于经历的化学、生物化学、酶学或免疫学失活，

-需要改善药代动力学，特别是允许溶液中不稳定分子的可控释放，从而将其浓度保持在治疗功效区间，

-对环境没有毒性或有很少毒性，

-允许减少分子的不良副作用，避免代谢、消除或毒性现象，

-允许在确保向活性部位中输送足量分子的同时，降低毒性作用，

-允许通过能够与靶细胞相互作用的配体选择性和特异性地释放大分子，

-允许在使用时保持分子的药理学、美容、营养药物或其他活性。

发明内容

为了满足上述需求，本发明提供了包含PLL的至少一种缀合物，优选单官能缀合物的非共价分子复合物。这种缀合物与溶液中不稳定分子一起使用允许提高分子的溶解度、其稳定性，并延长和/或维持分子在溶液中的活性。

PLL缀合物，特别是其在制药领域中的应用是已知的。国际专利申请WO96/15810特别公开了这些缀合物用于制备治疗神经元变性、自身免疫、恶性细胞增殖的有效药物组合物的用途。

然而，这些缀合物从未用于通过与溶液中不稳定分子非共价结合而形成分子复合物，来提高其在溶液中的稳定性并延长或维持其活性。

本发明的目的是提供一种分子复合物，其包含：

-至少一种PLL缀合物，包括：

-PLL线性主链，和

-至少一种分子F，其平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿，且共价键合到所述主链，以及

-至少一种在溶液中不稳定的分子M，

缀合物和分子M通过非共价键键合/相互作用。

本发明还提供了获得这种复合物的方法、含有这种复合物的组合物及其用途。

本发明还涉及至少一种PLL缀合物在亲水溶液中通过非共价键与分子M形成分子复合物来提高溶液中不稳定分子M在溶液中的稳定性的用途，该PLL缀合物包括：

-PLL线性主链，和

-至少一种分子F，其平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿，且共价键合到所述主链。本发明还涉及用于实施该用途的试剂盒。

最后，本发明还涉及用于鉴定能够非共价结合溶液中不稳定的给定分子M的至少一种PLL缀合物的方法，以及用于实施该方法的试剂盒。

通常，本发明允许在溶液中稳定分子复合物形式的分子M。实际上，意想不到且令人惊讶的是，本发明允许给予真实价值被忽视或未得到利用的许多溶液中不稳定的分子、特别是大分子、尤其是治疗用途的大分子第二次“寿命”，这通过将所述分子与基于根据所研究的分子而选择的PLL的一种或多种缀合物组合而实现。

根据所有期望，已经表明，在溶液中(通常在亲水性、主要是水性溶液中)不稳定的分子可以通过某些PLL缀合物的存在而储存/保持在液体溶液中，也就是说，例如在高于0℃的温度下，甚至在室温下，主要是在水溶液中，储存/保持几天、几个月甚至可能几年，其初始药理活性或其性质中的各个性质没有显着损失。

还令人惊奇的是，由此形成的并且体外稳定的本发明的复合物也可以直接用于治疗、美容、营养、外科或诊断应用中，特别是可以施用于患者，而没有与毒性相关的特定问题。在这些方面，本发明的复合物也可以作为治疗载体，保护复合的分子M免受对人类或动物体特别是酶代谢系统和免疫系统的攻击。

附图说明

在以下参考非限制性实施例和附图给出的详细描述中，说明本发明的其它优点和特征，在附图中：

图1A示出根据本发明的半胱氨酸-G-PLL缀合物获得的IRFT光谱；在该图中，可以观察到由区域1700-1550cm^-1鉴定的PLL和由1300cm^-1和700cm^-1附近的峰表示的半胱氨酸，

图1B示出根据本发明的甲硫氨酸-G-PLL缀合物获得的IRFT光谱；在该图中，可以观察到由区域1700-1550cm^-1鉴定的PLL和由1300cm^-1、900cm^-1和700cm^-1附近的峰表示的甲硫氨酸，

图1C示出根据本发明的谷胱甘肽-G-PLL缀合物获得的IRFT光谱；在该图中，可以观察到由区域1700-1550cm^-1鉴定的PLL和由1300cm^-1和1200cm^-1附近的峰表示的谷胱甘肽，

图1D代表根据本发明的牛磺酸-G-PLL缀合物获得的IRFT光谱；在该图中，可以观察到由区域1700-1550cm^-1鉴定的PLL和由1300cm^-1、1000cm^-1和700cm^-1附近的峰表示的牛磺酸，

图1E表示根据本发明的乳清基(orotyl)-PLL缀合物获得的IRFT光谱。在该图中，可以观察到由区域1700-1550cm^-1鉴定的PLL和由1300和800cm^-1附近的峰表示的乳清基，

图2示出经电脑模拟研究获得的因子VIII的蛋白质结构，

图3示出经电脑模拟研究获得的血红蛋白的蛋白质结构，

图4示出经电脑模拟研究获得的白蛋白的蛋白质结构。

具体实施方式

定义

根据本发明，术语“复合物”或“分子复合物”是指通过使溶液中不稳定分子M与通过非共价键结合的一种或多种PLL缀合物接触形成的实体。

根据本发明，术语“PLL缀合物”是指由一个或多个分子F共价偶联在PLL上而衍生的分子。“PLL单官能缀合物”是指分子F与PLL偶联的产物。“PLL多官能缀合物”应理解为是指至少两个分子F的偶联产物。例如，双官能缀合物可以由下式表示：分子F1-PLL-分子F2。

根据本发明，“分子F”应理解为是指非免疫原性取代基或分子。

“取代基”应理解为是指低分子量的分子，分子量通常为约50道尔顿至约1000道尔顿，优选约200道尔顿至约600道尔顿，更优选约150道尔顿至约500道尔顿，该分子在碳链的(ε)-氨基位置上通过共价键结合到PLL或通过共价键与PLL相互作用。

“免疫原性”应理解为是指能够诱导免疫反应的任何分子。因此，“非免疫原性”分子是不诱导免疫反应的分子。

根据本发明，“PLL”或“聚赖氨酸”应理解为是指主要由线性L或D-赖氨酸(即，不通过另外的一个或多个赖氨酸而分枝化)或主要由线性L-赖氨酸组成的多肽或均聚物。其对应于下式：

(参见默克索引，第10版缩略本，第7444号)。

根据本发明，“溶液中不稳定分子M”应理解为是指在溶液中不稳定的分子，优选大分子。可能特别涉及蛋白质、脂质、糖、核酸或任何其它的大尺寸生物分子；“溶液中不稳定”是指当溶解在溶剂中，特别是在水性溶剂中时表现出活性降低或丧失的分子。可以涉及在溶液中活性降低的疏水性或微亲水性分子，或亲水性分子。

根据本说明书，“非共价键”是指非共价的任何键，特别是离子键、氢键或范德华键。

根据本发明，“药理学或生物活性”是指通过能够检测此类活性的分析方法获得的生物体对分子或物质的吸收的观察结果。这可以通过例如观察和评价受体的选择性占有或与目标分子或物质的酶或蛋白质的特异性相互作用(例如抗原-抗体相互作用)来评价。在本申请的范围中，在液体溶液中目标物质或大分子的药理活性的降低或丧失表明所述物质在液体溶液中的不稳定性。

根据本发明，“初始生物活性”或“初始药理活性”是指在本发明的复合物溶解之后首次测量的其生物活性或药理活性。复合物的溶解与第一次活性测定之间经过的时间可以是变化的，并受到各种参数的影响，尤其是测量的执行速度，无论其是自动的还是手动的。为了提高实验的重现性，可以标准化为在根据本发明的复合物溶解之后的例如约至少3分钟，优选约15分钟之后进行第一次测量。“原始生物活性”或“原始药理活性”是指分子在与本申请中定义的一种或多种缀合物接触(即其复合)之前的生物或药理活性。“药理活性或生物活性的变化”是指初始活性的观察值和测量值与大分子溶解后时刻“t”时的活性的观察值和测量值之间的差的绝对值。“维持药理活性或生物活性”是指如上定义的药理或生物活性的变化为至多30％，优选至多20％，优选至多10％，更优选至多5％，或甚至至多1％。

根据本发明，“水性溶剂”是指主要或基本上是水性的溶剂，也就是说含有至少约70％的水，优选至少约80％的水，更优选至少约90％的水或至少约95％的水。

根据本发明，“液相溶液”或“液态溶液”是指尚未达到其凝固点的溶液。例如，保持在低于约0℃、优选低于约-5℃的温度的水溶液或基本上呈水性的溶液不能认为是呈液相。

详述

分子复合物

根据第一方面，本发明涉及一种分子复合物，其包含：

-至少一种PLL缀合物，包括：

-PLL线性主链，和

-至少一种在溶液中不稳定的分子M，

缀合物和分子M通过非共价键连接，也就是说通过非共价键相互作用。

PLL缀合物

PLL缀合物可以是单官能或多官能的。同一复合物，如果其含有多个PLL缀合物，则可以仅含有单官能缀合物，仅含有多官能缀合物，或含有单官能与多官能缀合物的混合物。优选地，PLL缀合物是单官能的。

其包括PLL的直链和至少一种平均分子量在50至1000道尔顿之间的分子F。分子F与主链共价键合。PLL缀合物可以排他地由PLL的线性主链和共价结合到所述主链上的至少一种平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿的分子F构成。

PLL链的平均分子量优选为2000至300000道尔顿，这意味着其聚合度(即定义部分给出的式中系数n的值)在约15至约2360之间或为127个赖氨酰残基。

根据本发明的优选实施方案，存在于根据本发明的分子复合物中的PLL链具有通常为2000至300000道尔顿的平均分子量，这意味着其聚合度为约15至约2360，优选为20000至50000道尔顿，这意味着聚合度为155至394，即155至374个赖氨酸。还更优选地，PLL链包含30至150个赖氨酸，对应于3800至19100道尔顿的平均分子量，更优选地包含50至100个赖氨酸，对应于PLL链的平均分子量为6400至13000道尔顿。

缀合物的PLL线性主链优选为α线性链。

分子F的分子量优选地为100道尔顿至1000道尔顿，还更优选200道尔顿至1000道尔顿，特别是300道尔顿至1000道尔顿，更特别是400道尔顿至1000道尔顿，优选500道尔顿至1000道尔顿。

分子F是非免疫原性取代基或分子。PCT专利申请WO96/15810中描述的分子可特别用于本发明。分子F优选选自以下三种类别之一：

-“脂肪酸或脂质”性质的分子，包括：

*单羧酸或二羧酸脂肪酸，以下统称为术语饱和或不饱和直链或支链脂肪酸，通常含有4至24个碳原子；

*在将蛋白质锚定到细胞膜的机制中涉及的化合物，这些化合物特别参与到甲羟戊酸特别是与半胱氨酸连接的类异戊二烯的循环中；

*胆固醇及其衍生物，特别是疏水性激素。

-“抗氧化”性分子，其包括：

*维生素A、维生素C、维生素E或其衍生物；

*式为R₁S-R₂-CH(NH₂)-COOH的半胱氨酸及其衍生物，其中R₁表示H或CH₃，R₂表示C₁-C₃亚烷基。

-具有“氨基酸或神经递质”特征的分子，其包括：

*吲哚烷基胺；

*儿茶酚胺；

*式为R₃-CH(NH₂)-COOH的氨基酸，其中R₃表示氢、咪唑-2-基甲基、羧甲基或氨丙基；

*氨基(C₁-C₅)烷基磺酸或亚磺酸；

*肉碱或肌肽；

*式为2HN-A-NH2的二胺，其中A表示(C₁-C₆)亚烷基或-(CH₂)_m-NH-B-(CH₂)_p-基团，其中m和p彼此独立地为的整数，B表示无或-(CH₂)_n-NH-基团，n为的整数；

*乙酰胆碱，和

*γ-氨基丁酸。

可以划分为三类缀合物(无论其是单官能还是多官能)：“脂肪酸或脂质”缀合物；“抗氧化”缀合物；以及“氨基酸或神经递质”缀合物。

通常，脂肪(二)酸包含4至24个碳原子，例如丁酸、马来酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、癸二酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、花生酸、鳕油酸、花生四烯酸、山萮酸、芥酸或壬二酸。优选地，酸选自例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸或(二)酸、壬二酸。

与半胱氨酸连接的类异戊二烯通常含有6至20个碳原子。优选地，在本发明的范围内，使用法呢基-半胱氨酸、香叶基-香叶基-半胱氨酸或甲羟戊酸酯-半胱氨酸。

作为疏水性激素，优选使用孕酮或2-甲氧基雌二醇。

作为半胱氨酸衍生物，优选使用高半胱氨酸或甲硫氨酸。在本发明的范围内使用的吲哚烷基胺和儿茶酚胺尤其包括色氨酸、5-甲氧基色氨酸、羟色胺、色胺、5-甲氧基色胺、褪黑素、苯丙氨酸、3,4-二羟苯丙氨酸和酪氨酸。

作为氨基酸，优选使用组氨酸、甘氨酸和天冬氨酸。根据本发明使用的氨基(C₁-C₅)烷基磺酸或亚磺酸特别包括牛磺酸、高牛磺酸和亚牛磺酸。优选在本发明的范围中使用的二胺是腐胺、尸胺、精胺和亚精胺。

作为非限制性实例，作为可用于实施本发明的PLL缀合物，可以提及油酸-PLL、壬二酸-PLL和5-甲氧基色胺-PLL。

优选地，使用半胱氨酸-PLL、甲硫氨酸-PLL、牛磺酸-PLL、谷胱甘肽-PLL或硫辛酸(acidethiotic)-PLL。因此，与PLL主链共价连接的分子F选自半胱氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸(thorine)、谷胱甘肽和硫辛酸。

根据合适的实施方案，分子量比和F分子与主链之间的(FTIR测定的)峰面积为约10至约20。

溶液中不稳定的分子M

分子M优选为大分子，即分子量优选大于1000、优选大于2000道尔顿、更优选大于5000道尔顿、特别优选大于10000道尔顿的分子。分子M可以是有机和/或无机的并且可以是天然和/或合成来源的。优选地，其涉及有机分子。

优选地，分子M是生物系统中有用的分子，优选可用于治疗、美容、营养和/或诊断领域。因此，分子M非常优选地是具有药理和/或营养和/或美容活性的分子，和/或是诊断试剂。

优选地，它们属于糖、蛋白质、脂质、蛋白质族化合物(也称为共轭蛋白质)，例如脂蛋白、粘蛋白、核蛋白、核酸(例如DNA、RNA、RNA干扰素，tRNA、cRNA等)和金属蛋白质(例如金属蛋白)的家族。

在糖类的分子M中，可以提及寡糖(由2至10个单糖基单元组成的糖)和多糖。可实施于本发明的寡糖和多糖类型的分子M的实例特别是胶原、纤维素、淀粉、因子VIII、免疫球蛋白。

在蛋白质类型的分子M中，可以特别提及允许细胞维持其在空间中的组织的结构蛋白；确保不同分子在细胞内外的转运的运输蛋白；调节其他蛋白质活性或控制基因表达的调节蛋白；捕获外部信号并确保其传递进入细胞或生物体的信号蛋白，例如激素蛋白(protéine hormonale)；检测信使分子和其它信号以使细胞起相应作用的受体蛋白，例如感觉蛋白和激素受体如胰岛素；允许细胞或生物体或某些元素移动或变形的运动蛋白，如肌动蛋白和肌球蛋白；保护细胞免受病毒的蛋白，例如抗体；允许保存氨基酸以便能够产生其他蛋白质的储存蛋白，例如卵白蛋白和酶。可实施于本发明的蛋白质型分子M的实例是免疫球蛋白、凝血蛋白、因子VIII和IX、白蛋白等。

在脂质型分子M中，可以提及饱和和不饱和脂肪酸、(单、二和三)甘油酯和磷脂。可实施于本发明的脂质型分子M的实例是脂蛋白，例如脂蛋白A。

优选地，分子M是蛋白质。

分子M和PLL缀合物通过至少一个非共价键以非共价方式连接。一个分子M和一个PLL缀合物可以通过一个或多个非共价键连接。

根据一个合适的实施方案，缀合物的分子浓度与分子M的分子浓度之比在1和30之间。

组合物

根据另一方面，本发明还涉及在亲水性溶剂的溶液中的包含一种或多种根据本发明的分子复合物的组合物，所述亲水性溶剂优选选自水、磷酸盐缓冲液、生理盐水或其混合物。

用于实施本发明的亲水性溶剂可以变化，只要它们允许溶解分子M和选定的缀合物。

除了根据本发明的分子复合物和亲水性溶剂之外，组合物还可以包含至少一种其它化合物。其可以涉及例如选自赋形剂、表面活性剂、载体等的另一种药学上相容的化合物。

获得方法

PLL缀合物的合成

用于获得根据本发明的PLL缀合物的分子F和PLL之间的偶联方法是本领域技术人员熟知的在每个分子的官能团与PLL的ε-胺官能团之间的常规化学偶联的方法。这些偶联通过偶联剂进行，例如选自戊二醛、琥珀酸酐或戊二酸酐、碳二亚胺、氯甲酸乙酯或六亚甲基二异氰酸酯。这样的偶联方法的实例特别描述于Geffard et al.,C.R.Acad.Sci.Paris:295,797-802,(1982)中。也可以通过简单吸附将分子与PLL结合。合适的偶联方法的实例在下面的制备例中详细描述。

作为说明，所述分子和PLL之间的偶联可以在PLL的ε-胺官能团与所述分子的羧基官能团或其它可化学激活的官能团之间进行。

因此，在脂肪酸特别是肉豆蔻酸、棕榈酸等的情况下，以及在结合半胱氨酸的类异戊二烯特别是法呢基-半胱氨酸的情况下，与PLL的连接在后者和上述分子的羧基官能团之间进行。

同样，在半胱氨酸及其衍生物的情况下，与PLL的连接有利地发生在后者的胺官能团和这些分子的酸官能团之间。

或者，半胱氨酸及其衍生物可以预先通过与琥珀酸酐或戊二酸酐偶联而活化，然后在PLL的ε-胺官能团与琥珀酰化或戊二酰化分子的游离酸官能团之间进行连接。或者，半胱氨酸及其衍生物可以通过与戊二醛反应与PLL连接，该反应特别如Geffard et al.,Brain Res.:294,161-165,(1984)中所描述。在胆固醇及其衍生物的情况下，与PLL的偶联有利地通过胆固醇的羟基进行。

在变型例中，胆固醇及其衍生物被吸附在PLL上。

在疏水性激素的情况下，与PLL的偶联有利地由六亚甲基二异氰酸酯实现。

在维生素A(视黄酸)的情况下，该分子与PLL之间的连接在后者的氨基化官能团与分子的酸官能团之间进行。

在维生素C(抗坏血酸)的情况下，该分子与PLL之间的连接在后者的胺官能团与分子的氧官能团之间进行。

在维生素E(α-生育酚)的情况下，该分子与PLL之间的连接在后者的胺基化官能团与分子的酸性琥珀酸酯的游离酸官能团之间进行。

在氨基烷基磺酸或亚磺酸，特别是牛磺酸、高牛磺酸和亚牛磺酸的情况下，这些分子与PLL之间的连接通过预先用酸酐(琥珀酸酐或戊二酸酐)激活分子，或通过与戊二醛偶联来进行。

在某些吲哚烷基胺化合物的氨基酸、特别是色氨酸和儿茶酚胺的情况下，这些分子与PLL之间的连接可直接进行，或通过与碳二亚胺、戊二醛、酸酐或酰氯例如氯甲酸乙酯接触来进行。

在二胺的情况下，这些分子与PLL之间的连接可以通过与戊二醛或酸酐偶联来进行。另一方面，肉碱或肌肽与PLL之间的结合通过用碳二亚胺偶联来实现。

根据本发明的分子复合物的获得方法

根据本发明的分子复合物可以通过包括以下步骤的方法获得：

-提供一种或多种PLL缀合物，其包括：

-PLL的线性主链，和

-至少一种分子F，其平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿，且共价键合到所述主链上，并且

-供应一种或多种分子M，

-在允许缀合物和分子M之间形成非共价键的条件下使缀合物与分子M接触。

提供缀合物的步骤优选包括在亲水溶剂中供应包含缀合物的溶液。

优选地，接触步骤在约4℃至25℃的温度和缓冲溶液中进行。

同样地，提供分子M的步骤优选包括在亲水溶剂中供应包含分子M的溶液。

根据特别合适的实施方案，缀合物与分子M的接触时间为1小时至24小时。

分子复合物的用途

分子复合物或含有它们的组合物可以用于各种应用，特别是与分子M的性质和有效性有关的应用。

在具有药理活性的分子M即药理活性剂的情况下，根据本发明的分子复合物可以用作药物。

优选地，对于该用途，分子复合物在组合物内，特别是在根据本发明的组合物内施用。

根据本发明的分子复合物优选通过静脉内、皮下或口腔下的肌肉内、鼻喷雾、口腔或心房或皮肤的途径以及眼用溶液来施用。

有利地，本发明的复合物保留或提高分子M的原始药理活性。因此，基于PLL的缀合物的存在不影响该离体(或体外)活性。还已经证明，它们的存在对分子M在体内的作用(即在施用于患者后)不是有害的。

此外，与预期相反，缀合物的存在也通过提高其生物利用度而对分子M的药理活性具有有益的作用。

因此，可以将包含分子M的本发明的复合物作为药物用于治疗目的，以及通过治疗、手术或在诊断方法中用于治疗人或动物的身体的方法。

治疗的性质明显地取决于复合分子M的药理活性的类型。

举例来说，可以提及止血障碍的治疗。

根据本发明的复合物还可以用于改善食物的味道或质地，降低脂质含量，或将营养物(例如维生素)包封在食品中，使得它们在保质期内不降解。此外，它们可以用于制造允许将食物保存更久的包装。

缀合物用于稳定溶液中不稳定分子的用途

本发明还涉及至少一种PLL缀合物的用途，所述PLL缀合物包括：

-PLL的线性主链，和

-至少一个分子F，其平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿，且共价键合到所述主链上，并且

所述用途为，在亲水溶液中，用于：

-改善亲水性，和/或

-提高在溶液中的稳定性，和/或

-通过非共价键形成根据本发明的分子复合物，来提高和/或维持溶液中不稳定分子M在溶液中的药理和/或营养和/或美容和/或诊断试剂的诊断活性。

如果分子M是药物活性物质，则溶液中分子M的药理活性的维持优选地对应于在1小时间在至少1℃的温度下相对于初始药理活性，药理学活性变化至少5％。

根据变型例，本发明还涉及至少一种PLL缀合物的用途，所述PLL缀合物包括：

PLL的线性主链，和

至少一个分子F，其平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿，且共价键合到所述主链上，并且

所述用途为，在含有所述溶液中不需要的溶液中不稳定分子M的亲水溶液中，用于通过非共价键形成根据本发明的分子复合物，并使所述溶液去污。

本发明还涉及用于实施这些用途的试剂盒。所述试剂盒包含至少一种亲水溶液，其包含至少一种PLL缀合物，所述缀合物包含：

PLL的线性主链，和

至少一个分子F，其平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿，且共价键合到所述主链上。

鉴定方法

本发明还涉及一种用于鉴定至少一种PLL缀合物的方法，该PLL缀合物能够非共价地连接在溶液中不稳定的具有药理活性的分子M，并维持所述分子M在亲水溶液中的药理活性，所述方法包括：

a)提供在溶液中不稳定的具有药理活性的分子M；

b)提供至少一种包含根据本发明的所述分子M的分子复合物；

c)比较所述的一种或多种包含分子M的分子复合物的初始药理活性与药理活性；

d)鉴定一种或多种分子复合物，其溶解后在液相溶液中的药理活性得到维持；

e)鉴定允许所述药理活性的维持的PLL缀合物或多种PLL缀合物的组合。

分子M的分子量优选大于1000道尔顿。

优选地，比较步骤c)在分子M的初始药理活性和分子复合物的药理活性之间进行，所述分子复合物的药理活性在从形成复合物开始以确定的时间间隔至少每24小时测量数次。

优选地，鉴定复合物的步骤d)还包括：

-对每种分子复合物的药理活性根据时间的变化进行比较；

-复合物的鉴定，在至少1℃的温度下在至少1小时间其药理活性的变化为相对于所述大分子的至少为5％。

因此，根据本发明的鉴定方法优选包括至少三个步骤：

-研究缀合的大分子复合物在溶液中的溶解度，

-验证大分子很好地保留其原始药理活性，以及

-监测可溶的缀合大分子复合物的药理活性，也就是说随着时间的推移已经“验证”了上一步。

如上所述的经计算机模拟的分析是非强制的，但在大多数情况下是有利的，因为其允许相对快速地限制可形成可溶性复合物的缀合物的数量，并且因此简化随后的鉴定分析。

在液体溶液中研究了大分子在缀合物或其混合物(任选通过计算机模拟分析方法选定)的存在下的溶解度。用于确定这种溶解度的方法是标准方法并且是本领域技术人员已知的。然而，可以提及通过测量光密度的分析以及本领域技术人员已知的任何药典方法。

用于实施根据本发明的方法的优选溶剂是生理上相容的溶剂，优选亲水溶剂，还优选水性溶剂，例如蒸馏水、磷酸盐缓冲液和生理盐水。可以存在其它溶剂如C₁-C₃醇或二甲基亚砜(DMSO)，其总量通常不超过相对于复合物溶液的总体积的10体积％。

通常，在某些情况下，分子在溶液中的不溶性在几秒钟到几分钟的时间内是肉眼快速可见的。因此，对溶液中不同复合物的样品的简单视觉研究可能足以确定复合物的溶液能够适合于第二步骤的活性的时间分析。

然而，例如光密度分析允许获得对该现象的更精确的测量。

首先确定可溶性复合物的原始活性，然后从所述复合物形成开始以不同的时间间隔，优选每小时，更优选每24小时，然后每3-4天，测量活性。

对于治疗性分子，可以使用任何合适的分析方法进行药理活性的测量，而没有任何限制。这些分析方法是本领域技术人员公知的，它们的用途主要取决于目标治疗性大分子的性质。例如，当大分子是抗体时，可以使用允许评价其与其抗原及其类似物的亲和力的任何方法，例如酶免疫测定法。当大分子是例如DNA或RNA序列时，可以使用MALDI-TDF光谱法、电泳或高效液相色谱(HPLC)。

当分子M不具有特定的治疗用途时，例如天然或合成聚合物、树脂和其它聚合物添加剂，当然不可能谈到药理或生物活性，但是如上所述的方法将是通过用分子M的特征或性质替换药理活性来实现。本申请中所述的涉及治疗性大分子的药理活性的所有这些也参考非治疗目的的分子M的特征或性质来适用。

根据另一方面，本发明涉及用于测定缀合物或多种缀合物的组合的试剂盒，所述缀合物允许维持一种或多种大分子在溶液中优选在液相中的药理活性，所述试剂盒包含至少两种相同或不同的单官能或多官能缀合物或相同或不同的单官能或多官能缀合物的至少两种混合物，并且其中每个所述缀合物包含α型线性PLL主链和一种或多种分子，每种分子具有至少50道尔顿和至多1000道尔顿的分子量并共价键合到所述主链。

根据本发明的试剂盒可以包含至少两种如上定义的PLL缀合物或缀合物的混合物，优选在2种至10种之间。

可以包含在根据本发明的试剂盒中的PLL缀合物的化学性质如本申请所述。

根据一个变型例，根据本发明的试剂盒包含包封在分开的容器中的PLL缀合物或缀合物的混合物。可以使用的容器例如是一次性的小瓶或剂量单元(dose)。

该试剂盒允许由实验室进行快速筛选，以选择出最适合于稳定性研究的PLL-F1和PLL-F2化合物。

稳定性和有效性测定将使分析完全，并将允许验证大分子是否可以用PLL-F化合物“处理”，并引导出待被非共价键接枝的化合物。

实施例和实验

根据本发明的复合物的显著性质已通过下文所述的实验证实。

仪器与方法

计算机模拟研究

“计算机模拟”分析是一种完全通过计算机和Pymol软件进行的分析。它允许根据极性氨基酸分布、因此也就是根据分子M的电荷，确定并选择能够与给定分子M相互作用的特定PLL缀合物。

使用的来源如下：

-人类蛋白质：Pubmed/蛋白质数据库/Uniprot

-同种型免疫球蛋白G：Saphire EOet al.Crystal structure of aneutralizing human IGG against HIV-1:a template for vaccine design(针对HIV-1的中和人IGG的晶体结构：用于疫苗设计的模板).Science.2001

-凝血因子VIII：Ngo JCet al.Crystal structure of human factor VIII:implications for the formation of the factor IXa-factor VIIIa complex(人因子VIII的晶体结构：对因子IXa-因子VIIIa复合物的形成的影响).Structure.2008

-凝血因子IX：Wang,S.et al.Studies of benzothiophene template as potentfactor IXa(FIXa)inhibitors in thrombosis(在血栓形成中苯并噻吩模板作为有效因子IXa(FIXa)抑制剂的研究).J.Med.Chem.2010

-血红蛋白：Safo,M.K.et al.The enigma of the liganded hemoglobin endstate:a novel quaternary structure of human carbonmonoxy hemoglobin(配体血红蛋白终止状态的谜团：人类碳单氧化血红蛋白的新型四元结构).Biochemistry 2005.

-白蛋白：Bhattacharya,A.A.et al.Binding of the generalanestheticspropofol and halothane to human serum albumin.Highresolution crystalstructures(将普通麻醉剂异丙酚和氟烷与人血清白蛋白结合。高分辨率晶体结构).2000)J.Biol.Chem.

用于蛋白质结构研究的软件是Pymol(http://www.pymol.org/)。

“沉降”

在生物化学中，沉降是在高离心场中具有沉降能力的溶液中的蛋白质的分离。

实施超速离心，在这种情况下，分子由于其密度高于溶剂的密度而移动并沉降。因此可以确定不同的大分子及其摩尔质量以及在Svedberg(S)中测量的它们的沉降常数。

“离心”

离心是通过使其经受离心力根据其密度差来从混合物中分离化合物的方法。

所使用的仪器是称为离心机的高速旋转机。

在该分离操作期间，位于离旋转轴线一定距离r处的流体中的化合物受到不同的力：

·向下的重力Fp

·向上的阿基米德推力Fa

·摩擦力Fv

·向心力F'c

·离心力Fc

分离是通过离心力Fc对化合物的作用来实现的。以牛顿表示的离心力由以下关系给出：Fc＝mγc，其中γc＝rω²，以m/s²为单位，其中：

·待分离的化合物的质量m

·从离心管到离心机旋转轴线的距离r

·角速度ω，以弧度/秒或转/分钟表示。

离心力Fc与重量Fp的比值称为人造重力的强度，并以“G”3表示。离心时使用的值约为400至10000G，根据转子半径对应于约2000至10000转/分钟的转速。

某些应用，如生物大分子(蛋白质、核酸)的分离，需要由Svedberg开发的超速离心法，该方法使用约为200000G的非常高的人造重力强度，因此需要几十万转每分钟的转速。

“光密度”

吸光度或光密度测量介质对通过介质的光的吸收能力。

吸光度根据被研究物质的性质、其分析的波长以及该物质在其通过的介质中的浓度而不同。该介质可以是固体、液体或气体，只要它是透明的。用分光光度计测量吸光度。Beer-Lambert定律建立了溶液中化学实体的浓度(或气相中该实体的分压)、实体的吸光度和溶液中光行进的路径的长度之间的比例。

浓度以mol.L^-1或mol.m^-3表示。

“ELISA”

ELISA是使用一种或两种抗体的生化技术。其中一种对抗原是特异性的，而另一种则与免疫复合物(抗原-抗体)反应并与酶偶联。该二次抗体还可以通过显色或荧光团底物引起信号的发射。

本发明范围内的“ELISA”方案如下：

“滴定度”和“亲和力”的实验

-“maxisorp”井的敏化：

每个孔接受200μl含有浓度为10μg/ml的抗原的0.05M碳酸盐缓冲溶液(pH＝9.6)。对照孔用相同浓度的偶联剂改性的载体蛋白进行。将板在4℃下搅拌16小时。

-饱和：

将板倒空，然后用200μl的“PBS-Tw牛血清白蛋白(BSA)2.5g/l”缓冲液填充。将板在37℃下孵育1小时。

-洗涤：

将板倒空并用PBS-Tw洗涤3次。

-抗体孵育：

将抗体在不同的缓冲液中稀释：

·对照缓冲液：与饱和缓冲液相同

·“测试”缓冲液：其是含有PLL-F化合物的饱和缓冲液。

因此，通过PLL-F缀合物测试三种溶液，即三种不同浓度(10^-4M、10^-5M和10^-6M)。

测试的PLL-F如下：

蛋氨酸-G-PLL

谷胱甘肽-G-PLL

牛磺酸-G-PLL

半胱氨酸-G-PLL

将如此稀释的抗体以每孔200μl沉积在板上。该测试包括抗体稀释研究(1:2500至1:80000)和亲和力研究(1.10-6M至1.10^-12M的抗原稀释度30)。

抗体稀释研究允许确定抗体浓度，由此确定用于亲和力和特异性研究的抗体稀释度。

[Mangas et al.Chapter 1.Brain Molecules:From Vit to molecules foraxonal guidance(第1章。脑分子：从维生素到用于轴突引导的分子).2008].

在ELISA结束时无信号(A)表明所有抗体位点识别靶标，即对靶标具有高亲和力。在测试结束时的高信号(B)被解释为抗体对抗原的低亲和力。

-洗涤：

将板清空并用PBS-Tw(Tw＝Tween)洗涤3次，

-孵育二抗：

孔中加入200μl含有免疫球蛋白的“PBS-Tw，BSA 2.5g/l”缓冲液，该免疫球蛋白针对用过氧化物酶标记的宿主物种的IgG，并稀释至1/10000。将板在37℃下孵育1小时。

-洗涤：

将板倒空并用PBS-Tw(Tw＝吐温)洗涤3次。

-显影：

孔中加入200μl的添加有0.2％邻苯二胺的显影缓冲液(50mM柠檬酸盐、100mM磷酸盐、0.03％H₂O₂，pH5)。

使其着色，在黑暗中显色10分钟，每孔用50μl的2N HCl停止反应。

然后在492nm处读取光密度。

“斑点杂交”

在斑点杂交中，将核酸(DNA或RNA)或蛋白质从液体培养基直接转移到膜上，而无需预先分离。转移可以通过简单扩散、电场扩散(电扩散)或真空抽吸进行。

检测类似于分离转移中使用的检测：例如DNA或RNA的核苷酸序列或蛋白质的抗体。

在本发明范围内的“斑点杂交”方案：

作为示例，将小鼠单克隆抗体(Mab)作为模型：抗11-脱氢凝血噁烷B2(11DHTB2-BSA)，克隆2E1-B4(IgG1，K)(细胞上清液)。

相应的抗原化合物：抗11-脱氢凝血噁烷B2-BSA。

-硝化纤维素膜的敏化：

通过真空抽吸将抗原从液体介质直接转移到膜上。每个孔接受200μl含有抗原的1X Tri-NaCl(TBS)缓冲溶液。对照孔用相同浓度的偶联剂改性的载体蛋白进行。

系统在室温下抽真空1小时。

-饱和：

取出膜并进行轻微的切割，以划分出未来的“沉积带”。在室温下，将膜在饱和缓冲液“TBS 1X-Tw，BSA 1％1”中在搅拌下浸泡1小时。

-洗涤：

然后用1×TBS洗涤膜一次。

-抗体孵育：

将膜切成沉积带。在4℃下将每条带浸入以给定的稀释度含有抗体的溶液中16小时。也就是说，抗体在不同的缓冲液中稀释：

·对照缓冲液：与饱和缓冲液相同

·“测试”缓冲液：这是含有PLL-F化合物的饱和缓冲液。因此，通过PLL-F化合物测试三种溶液，即三种不同浓度(10^-4M、10^-5M和10^-6M)。

测试的PLL-F如下：

蛋氨酸-G-PLL

谷胱甘肽-G-PLL

牛磺酸-G-PLL

半胱氨酸-G-PLL

该测试允许根据斑点印迹的“斑点”密度来研究PLL-F化合物对Ag/Ac相互作用的影响。

-洗涤：

用TBS1X-TW 0.005％将带洗涤3次。

-二抗孵育：

将带浸入含有针对标记有过氧化物酶的宿主物种的IgG的免疫球蛋白的TBS1XTW(0.005％)-BSA(0.1％)缓冲液中，并在室温于搅拌下稀释至1/5000，持续1小时。

-洗涤：

用TBS1X-TW 0.005％将带洗涤3次，最后用TBS1X洗涤以除去泡沫。

-显影：

将带浸在显影缓冲液中。在黑暗中显色10分钟，每条带使用50μl2N HCl来停止反应。

斑点的强度由实验人员估计。

“细胞计数”

使用的方法是Malassez计数板(cellule de Malassez)和台盼蓝计数的方法。

台盼蓝是发色团试剂(蓝色)，带有负电荷，如果膜是完整的，则不与膜相互作用。因此，它将仅对损坏的细胞进行着色，允许确定样品的存活率。将样品稀释，然后与台盼蓝混合。一旦放置在常规的计数细胞(Malassez计数板)上，确定细胞总数，然后依次对呈现蓝色的细胞(具有损伤的膜的细胞)进行计数。生物量是根据细胞总数确定的，而存活率由下式确定：

存活率＝[n(蓝色细胞)/n(总)].100％

Malassez计数板是一种特殊的网格板，允许对不同类型的细胞进行计数。

整个Malassez计数板由100个矩形组成，尺寸为：长＝0.25mm/宽＝0.20mm/深＝0.20mm。计数板的总容积为1mm³(100×2.5×0.2×0.20)。因此，网格由10个竖直带(0.25mm)和10个水平带(0.20mm)组成，从而形成100个矩形。

在从单元格中随机选择的25个非连续矩形中，仅对其中的10个进行细胞计数。

对每个矩形中存在的细胞数进行合计。

任意地，适当的是只考虑位于右侧和下侧的细胞。

计算每个矩形的平均细胞数(在10个矩形中观察到的细胞总数除以计数的矩形数)。所获得的数乘以100，从而得知每mm³的单位细胞数。

“FTIR”

傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)是广泛用于鉴定和定量分子和蛋白质的分析工具。振动光谱的主要区域是电磁光谱的红外( )区域。波数由波长的倒数定义，以厘米表示。光谱可以定义为电磁波与物质的相互作用的研究。因此，这种技术使得可以通过其化学键的振动特性来识别任何分子的化学官能团。获得的结果是在透射模式或吸光度模式下研究的分子的IR光谱，其中借助于价态振动频率的关联表格来解析峰。对聚-L-赖氨酸缀合物进行的分析允许验证PLL上的小分子的接枝(PLL的酰胺峰上的位移)并确定接枝小分子的特征峰。与PLL-F缀合物和分子M的原始光谱进行对比，观察到PLL-F和分子M的混合物的光谱图的变化。

根据本发明的缀合物的合成

根据本发明的缀合物的合成是根据专利申请WO9615810中所述的方案和指示来实施。

在下文中，与PLL的主链共价连接的分子量至少为50道尔顿且至多为1000道尔顿的分子将被称为“分子F”。

为了简化符号，根据本发明的缀合物由缩写“分子F”-“耦合类型”-PLL来表示。

例如，“半胱氨酸-G-PLL”缀合物对应于通过戊二醛型间隔臂(或英语术语的连接体(linker))接枝到PLL上的半胱氨酸。对于其部分，“乳清基-PLL”缀合物对应于通过酰氯类型的连接体接枝到PLL上的乳清酸。

总合成方案

通常，根据其分子家族(氨基酸或其他)，分子F涉及到两种类型的活化，即通过戊二醛活化合成和通过酰氯活化合成。

通过戊二醛的合成路线活化并接枝到PLL上的分子F遵循以下反应：

-第一步：缩合反应和亚胺形成

-第二部：不稳定的亚胺的还原

每个分子F被戊二醛(G)活化，其通过活化小分子的胺基而作为偶联剂起作用。缩合反应形成亚胺。该中间体化合物、小分子和偶联剂与聚-L-赖氨酸的赖氨酰残基的ε胺基键合，形成酰胺键。不稳定的亚胺由硼氢化钠终止。该产物通过在缓冲溶液中透析而纯化。

作为实例，可以提及半胱氨酸-G-PLL化合物的合成。该方法包括实施以下步骤：

-称取400mg半胱氨酸

-在20ml乙酸盐缓冲液中溶解

-用6ml的5％戊二醛活化

-在10ml PLL上进行接枝

-用2ml的5M NaBH₄还原亚胺

-透析纯化

通过氯甲酸乙酯的合成途径活化并接枝到PLL上的分子F遵循以下反应：

每个分子F由氯甲酸乙酯(ECF)活化，其通过活化小分子的羧基而作为偶联剂起作用。该中间体化合物、小分子和偶联剂与聚-L-赖氨酸的赖氨酰残基的ε胺基键合，形成酰胺键。该产物通过在缓冲溶液中透析而纯化。

作为示例，可以提及化合物乳清基-PLL的合成。该方法包括实施以下步骤：

-称取400mg乳清酸

-在20ml甲醇中溶解

-加入0.4ml三乙胺

-用0.25ml氯甲酸乙酯活化

-在10ml PLL上接枝：

-透析纯化

根据本发明的缀合物的表征

根据本发明的缀合物的表征通过傅里叶变换红外(FTIR)分析技术进行。这种光谱技术允许鉴定PLL上的小分子的接枝和特征峰。虽然这种方法通常非常有效，但也可以使用其它方法，例如NMR，或光动力学或结晶学。

根据本发明的缀合物的表征的实例显示在图1A和图1E中。

本发明复合物的形成

总方案

根据针对分子M特定的方案(参见4)，在反应器中，必要时在氮气的惰性反应条件下，加入在前述步骤中合成的根据本发明的缀合物和目标大分子。

包含小鼠单克隆抗体(AcM)的根据本发明的复合物的形成

在该实施例中，分子M是小鼠单克隆抗体(AcM)。

体外研究的条件如下：

AcM(细胞上清液)：抗-11-脱氢凝血噁烷B2(11DHTB2-BSA)，克隆2E1-B4(IgG1，K)

相应的抗原化合物：抗-11-脱氢凝血噁烷B2-BSA。

AcM稀释缓冲液：

TBS1X对照缓冲液

测试的PLL-F化合物：即对照缓冲液+PLL-F

-半胱氨酸-G-PLL(10^-4M、10^-5M和10^-6M)

-甲硫氨酸-G-PLL(同上)

-谷胱甘肽-G-PLL(同上)

-牛磺酸-G-PLL(同上)

包含因子VIII的根据本发明的复合物的形成

在该实施例中，分子M是因子VIII。

因子VIII在凝血中起核心作用。其涉及因子IX的辅因子。由凝血酶活化的因子VIII成为在钙离子和磷脂存在下通过活化的因子IX激活因子X的反应的催化剂。在因子VIII的存在下，因子X的活化反应加速约20万倍。

活化的因子X获得使其能够将凝血酶原转化为凝血酶的催化活性。这会使纤维蛋白原降解成纤维蛋白。如此形成的凝块将被因子XIII稳定，使得停止出血。

因子IX也称为克里斯马斯(Christmas)因子或抗血友病因子B，是血液凝固中不可或缺的参与者之一。由F9基因编码的蛋白质(57-kDa维生素K依赖性促凝血糖蛋白)在血液循环处于无活性状态。当血管受损时，外来元素会渗透进入。一旦它们与其中一个蛋白接触，它会激活并允许合成酶，即促凝血酶，其介入随后的导致形成血块的凝血反应。在没有该因子IX的情况下，人会患有血友病B。

-计算机模拟研究

因子VIII的蛋白质结构如图2所示。

该软件允许在图2所示的3D结构上以彩色显示：

·无酸碱官能团的极性侧链氨基酸：丝氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、谷氨酰胺

·含阴离子酸碱官能团的极性侧链氨基酸：天冬氨酸盐、谷氨酸盐

·含阳离子酸碱官能团的极性侧链氨基酸：赖氨酸、精氨酸

·含中性酸碱官能团的极性侧链氨基酸：半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸

下表示出了通过此方法鉴定的官能团数量

包含血红蛋白的根据本发明的复合物的形成

在该实施例中，分子M是血红蛋白。

血红蛋白的活性由氧饱和度测定。人血红蛋白由两两相同的四条链组成：各有141个氨基酸的两条α链和各有146个氨基酸的两条β链(血红蛋白共计有574个氨基酸)。这些链中的每一个与非朊基组(groupement prosthétique)血红素相关联。将其表示为“Hb”。血红素分子由卟啉络合铁离子组成。

-计算机模拟研究

血红蛋白的蛋白质结构如图3所示。

该软件允许在图3所示的3D结构上以彩色显示。

·含阳离子酸碱官能团的极性侧链氨基酸：赖氨酸、精氨酸

下表示出了通过此方法鉴定的官能团数量：

包含白蛋白的根据本发明的复合物的形成

在该实施例中，分子M是白蛋白。

人血清白蛋白是循环系统中最丰富的蛋白质之一。它在脂肪酸、代谢物和药物的运输中发挥关键作用，并强烈刺激药物在体内的分布。若没有用于分配如抗生素等药物的蛋白质，则对抗疾病就会更加困难；人白蛋白使某些活性物质结合并被运送到整个身体。人白蛋白的结构呈四元模型。蛋白质的分子量为67000，具有585个氨基酸。蛋白质具有约67％的α螺旋，令人惊讶的是没有β折叠。

其结构使得可以结合多种天然和合成分子。人白蛋白参与维持胶体渗透压。胶体渗透压是防止过量的水通过半透膜而必须施加的压力形式。

-计算机模拟研究

白蛋白的蛋白质结构如图4所示。

该软件允许在图4所示的3D结构上以彩色显示：

·含阳离子酸碱官能团的极性侧链氨基酸：赖氨酸、精氨酸

下表示出了通过此方法鉴定的官能团数量：

在溶液和细胞培养中的稳定性和溶解度分析的实例

a.免疫球蛋白(Ig)在用于治疗应用的不同缓冲液中的水溶液中的稳定性

为此，使用PLL-F化合物。应用两种方法：

通过文献检索和Ig结构的研究进行“计算机模拟”研究

使用ELISA/斑点杂交技术进行体外研究：

·直接“结合”

·亲和力

·特异性

b.单克隆杂交瘤在不同“培养基”中的水溶液中的稳定性

为此，使用PLL-F化合物。评价是通过“体外”研究进行的，其包括：

-用不同的“培养基”观察细胞的外观(aspect)

-细胞计数以进行生长监测

应用

根据本发明的复合物可用于许多治疗或非治疗应用。

对于因子VIII，例如：现今，在有需要的情况下，血友病患者必须将其冻干溶液水合，然后制备正确的剂量并最后进行注射。通过本发明，患者只需要取出预先填充的注射器，并注入正确数量的单位。不再有剂量过低或过量的风险，不再有准备过程中污染的风险，因此患者获得总体的安全。

在诊断领域中，根据本发明的复合物的使用允许更容易地给药，并且在营养品中，例如可以将稳定的活性物质溶解在酸奶等中。

Claims

1.一种分子复合物，包含：

-至少一种聚赖氨酸缀合物(PLL)，其包含：

-PLL线性主链，和

-至少一种在溶液中不稳定的分子M，

所述缀合物和所述分子M通过非共价键连接。

2.根据权利要求1所述的分子复合物，其特征在于，所述分子M是有机分子。

3.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，所述分子M是蛋白质。

4.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，所述缀合物的摩尔浓度与所述分子M的摩尔浓度之比为1至30。

5.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，所述F分子和所述主链之间的分子量比和峰面积(通过FTIR方法测定)为约10至约20。

6.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，与所述主链共价连接的所述F分子选自半胱氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、谷胱甘肽和硫辛酸。

7.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，与所述PLL缀合物非共价连接的至少一个M分子是具有药理和/或营养和/或美容活性的分子，和/或是诊断试剂。

8.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，每个分子M的分子量大于1000道尔顿。

9.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，PLL包含155至394个赖氨酸。

10.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，其包含缀合物和分子M之间的至少一个非共价键。

11.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，所述缀合物的PLL是α线性链。

12.根据前述权利要求之一所述的分子复合物，其特征在于，每个PLL的分子量为3000道尔顿至50000道尔顿。

13.包含至少一种根据权利要求1至12中的一项所述的复合物的组合物，其在亲水溶剂的溶液中。

14.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，除了所述分子复合物之外，其还包含至少一种其它化合物。

15.根据权利要求1至12中的一项所述的分子复合物的获得方法，包括以下步骤：

-提供一种或多种PLL缀合物，包含：

-PLL线性主链，和

-提供一种或多种分子M，

-在允许所述缀合物和所述分子M之间形成非共价键的条件下使所述缀合物与所述分子M接触。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述接触步骤在约4℃至25℃的温度下并在缓冲溶液中进行。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于，提供所述缀合物的步骤包括提供在亲水溶剂中包含所述缀合物的溶液。

18.根据权利要求15至17中的一项所述的方法，其特征在于，所述提供分子M的步骤包括提供在亲水溶剂中包含分子M的溶液。

19.根据权利要求15至18中的一项所述的方法，其特征在于，所述缀合物与所述分子M的接触时间为1小时至24小时。

20.根据权利要求1至12中的一项所述的分子复合物，其作为药物的用途，所述分子M是药物活性物质。

21.根据权利要求20所述用途的复合物，其特征在于，所述分子复合物在根据权利要求13或14所述的组合物内施用。

22.根据权利要求20或21所述用途的复合物，其特征在于，所述分子复合物通过静脉内、皮下或口腔下IM、鼻喷雾、口腔或心房或皮肤的途径以及眼用溶液来施用。

23.至少一种PLL缀合物在亲水溶液中通过形成权利要求1-12中的一项所述的分子复合物，以提高溶液中不稳定分子M的亲水性的用途，所述PLL缀合物包括：

-PLL线性主链，和

-至少一种分子F，其平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿，且共价键合到所述主链。

24.至少一种PLL缀合物在亲水溶液中通过形成权利要求1-12中的一项所述的分子复合物，以提高溶液中不稳定分子M在溶液中的稳定性的用途，所述PLL缀合物包括：

-PLL线性主链，和

25.至少一种PLL缀合物在亲水溶液中通过形成权利要求1-12中的一项所述的分子复合物，以提高溶液中不稳定分子M在溶液中的药理和/或营养和/或美容活性和/或诊断试剂的诊断活性的用途，所述PLL缀合物包括：

-PLL线性主链，和

26.根据权利要求23的用途，其特征在于，将分子M在溶液中的药理活性维持在相当于在至少1℃的温度下在1小时间，相对于初始药理活性M，其药理活性变化至少5％。

27.至少一种PLL缀合物在含有不期望的溶液中不稳定分子M的亲水溶液中用于形成根据权利要求1至12中的一项所述的分子复合物，并对所述溶液进行纯化的用途，所述PLL缀合物包括：

-PLL线性主链，和

28.用于实施根据权利要求23至27中的一项所述的用途的试剂盒，其特征在于，其包含亲水溶液，其包含如权利要求1至12中的一项所述的至少一种PLL缀合物。

29.一种用于鉴定能够非共价结合溶液中不稳定分子M并维持所述分子M在亲水溶液中的药理活性的至少一种PLL缀合物的方法，所述方法包括：

a)提供在溶液中不稳定的具有药理活性的分子M；

b)提供包含如权利要求1至12中的一项所定义的所述分子M的至少一种分子复合物；

c)比较所述一种或多种包含分子M的分子复合物的初始药理活性与药理活性；

d)鉴定溶解后在液相溶液中维持药理活性的一种或多种分子复合物；

e)鉴定允许维持所述药理活性的一种PLL缀合物或多种PLL缀合物的组合。

30.根据权利要求29所述的鉴定方法，其特征在于，所述分子M的分子量大于1000道尔顿。

31.根据权利要求29或30所述的鉴定方法，其特征在于，步骤c)的比较在所述分子M的初始药理活性与一种或多种分子复合物的药理活性之间进行，所述药理活性是从一种或多种复合物的形成开始以确定的时间间隔至少每24小时一次经几次所测定的。

32.根据权利要求29至31中的任一项所述的鉴定方法，其特征在于，鉴定所述一种或多种复合物的步骤d)还包括：

-将每个所测定的分子复合物的药理活性的变化作为时间的函数进行比较；

-鉴定一种或多种复合物，其相对于参照物，所述大分子在至少1℃的温度下在至少1小时间的药理活性的变化至少为5％。

33.一种用于实施根据权利要求27至31中的一项所述的方法的试剂盒，其特征在于，其至少包括：

-一种或多种PLL缀合物，包括：

PLL线性主链，和

至少一种分子F，其平均分子量为50道尔顿至1000道尔顿，且共价键合到所述主链，

-水溶液，

-用于实施所述方法的支撑物。