TW201705986A - 氧化矽型生物分子載體、包含其之醫藥組成物、其製備方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種氧化矽型生物分子載體、包含其之組成物及其製備方法與用於遞送生物分子至細胞中的用途。該氧化矽型生物分子載體包含一多孔性核；一第一生物活性部分；與該第一生物活性部分功能上相關聯的一第二生物活性部分；以及用於將該第一生物活性部分與第二生物活性部分分別接合至該多孔性核的連接子。

Description

氧化矽型生物分子載體、包含其之醫藥組成物、其製備方法及用途
大體而言，本發明係關於一種生物分子載體，特別是關於氧化矽型生物分子載體、包含其之組成物及其製備方法及用途。
為了要解決藥物及生物分子之溶解度不佳及其他遞送問題，過去十年間已研發出各種載體，希望能遞送治療藥劑至身體中的目標位置。例如，空心氧化矽奈米球(HSNs)及中孔洞氧化矽奈米粒子(MSNs)等氧化矽型載體，因其有利的化學特性、熱安定性及生物相容性而適於遞送試劑。
衍生自HSNs或MSNs的經藥物或生物分子接合之氧化矽型材料是癌症治療及各種挑戰性疾病治療中最有希望的方法之一。此外，氧化矽型載體亦可用於酵素替代療法(ERT)，其為一種在不具有或僅具有不充足的特定酵素的病患中替代該酵素的療法。
然而，由於某些現有作法的限制，特別是關於細胞攝入、標定和遞送等問題，有必要探索更令人滿意的解決方案。
根據本發明具體例，提供一種用於遞送生物分子進入細胞的載體。該生物分子載體包含氧化矽型多孔性核，例如中孔洞氧化矽奈米粒子(MSNs)，及經由連接子接合至氧化矽型多孔性核的生物分子，從而形成具有第一生物活性部分(moiety)和第二生物活性部分的氧化矽型生物分子載體。該第一生物活性部分與第二生物活性部分彼此不相同，但在功能上相關聯，並可各自獨立選自酵素、抗體、催化性模擬物、配體、激素、生物分子結合蛋白及彼等之功能性片段，如胜肽或多肽。
根據本發明具體例，揭示一種包含複數個前述氧化矽型生物分子載體的醫藥組成物。
根據本發明具體例，揭示一種製備前述組成物的方法，該方法包含：提供一具有多孔性核之氧化矽型載體；在該多孔性核上形成連接子；經由該連接子之至少一部分將第一生物分子接合至該多孔性核；及經由該連接子之至少一部分將與第一生物分子在功能上相關聯的第二生物分子接合至該多孔性核。
再者，根據本發明具體例，揭示一種使用包含前述氧化矽型生物分子載體之組成物於製備藥物的方法，其中該藥物係用於治療與細胞異常有關之疾病或狀況，包括但不限於酵素缺乏、酵素缺陷、癌症和代謝異常。例如，首先，製備並提供氧化矽型生物分子載體，該氧化矽型生物分子載體包含多孔性核及至少兩種不同但功能相關聯的生物活性部分，該生物活性部分係經由連接子將生物分子與多孔性核接合而形成。然後藉由將細胞與該氧化矽型生物分子載體培養，而使該載體與該細胞接觸。因此，兩個不同但功能上相關聯的生物分子同時被共同遞送至細胞中。
為了使本發明前述及其它特徵與優點更容易理解，以下以數個具體例伴隨圖式進行詳細說明。
此處詳細參照本發明較佳具體例，其實例說明於附隨之圖式中。在以下具體例中，說明一或多種氧化矽型生物分子載體。在實施例中所說明之實例、成分、反應條件或參數僅僅是用於說明目的，而並非意圖藉由本文中所述之例示性具體例來限制該材料或製備方法。
在某些具體例中，例如一第一生物分子和一第二生物分子的至少兩個不同生物分子與氧化矽型多孔性核接合，以作為所形成的氧化矽型生物分子載體的至少兩種不同的生物活性部分，例如第一生物活性部分和第二生物活性部分。這兩種生物分子或生物活性部分彼此並不相同，但功能上相關聯，且藉由一或多種連接子與多孔性核接合。
於本文中，術語「生物分子載體」意指一微米或奈米級粒子、球體或生物載體，例如多孔性核，用以攜帶功能性生物分子。於本文中，術語「生物分子」包括任何分子，亦即(1)存在於活的生物體中，包括大型高分子，如蛋白質、碳水化合物、脂質及核酸，也包括小分子，例如初級代謝產物、次級代謝產物和天然產物；或(2)不存在於活的生物體中，包括人造或合成產物，如修飾的天然分子、藥物或生物活性材料。
於本文中，術語「生物活性部分」(bioactive moiety)係指生物分子載體的生物活性單元、部分，區塊、區域或功能區域(domain)，其藉由將生物分子接合至多孔性核所形成。該生物活性部分可例如是對於活的生物體、組織或細胞具有功效的生物活性、診斷、治療及預防性分子。該生物活性部分可藉由多孔性核及生物分子之間的接合而形成，該生物分子例如為酵素、抗體、催化性模擬物、配體、激素、生物分子結合蛋白及其功能性片段。例如，生物活性部分可由合成、重組或單離的胜肽及蛋白質所形成，例如抗體、抗原、合成小分子擬肽物(peptidomimetics)、受體配體、酵素、黏附胜肽、核苷酸、如DNA和反義核酸分子之多核酸、活化糖類和多醣、及有機藥物分子。
在一具體例中，該生物活性部分為一種治療性部分，是由一多孔性核與眾多不同可直接或間接地有效治療或預防疾病或臨床狀況的生物分子接合而形成。適當的治療性部分可基於氧化矽型生物分子載體的應用來選擇。例如，適當的治療性部分可見於抗癌物質中。較佳地，治療性部分是當接合至多孔性核時可保留其治療/生物活性穩定的適當物質，包括在活體外和活體內的條件下。合適的治療性部分的實例為小分子、蛋白質、胜肽、醣類、類固醇、抗體(包括其片段及變體)、融合蛋白、反義多核苷酸、核酶、小干擾RNA等。
當二或多個生物分子接合至多孔性核時，較佳地該氧化矽型生物分子載體的生物活性部分彼此在功能上相關聯。在本文中，術語「功能上相關聯」應該被廣義地解釋，且意指一個部分就執行其生物功能而言對其他部分是有利的或有用的。例如，若攜帶兩個生物分子，第一部分係與第二部分功能上相關聯可指，若第一部分提供了一種功能，例如細胞穿透或標定，來促進第二部分更有效或更有效率地執行其功能。或者，第一部分與第二部分功能上相關聯可指，若該第一部分與第二部分涉及生物級聯反應的不同步驟。
較佳地，該第一部分可以源自細胞攝入促進分子，例如細胞穿透型胜肽、帶正電荷之多肽或聚乙烯亞胺；核定位序列胜肽；胞內體(endosome)標定型胜肽；胞器標定型分子；癌細胞標靶分子，包括配體、胜肽、抗體和適配體(aptamer)；及涉及級聯反應的酵素。
較佳地，該第二部分可以衍生自具有細胞調節活性之生物分子，例如涉及級聯反應的酵素。較佳地，第二部分可衍生自涉及代謝異常之生物分子，包括但不限於溶酶體貯積症，包括法布瑞氏症(Fabry disease)、辛德勒氏症(Schindler disease)、高雪氏症(Gaucher disease)(第1型、第2型及第3型)、龐貝氏症(Pompe disease)、佳能氏症MPS I (Danon disease MPS I) (赫爾利(Hurler)、赫爾利-施艾氏(Hurler-Scheie)或施艾氏症候群(Scheie syndrome) )、MPS II(韓特氏症(Hunter disease))，MPS III(A、B、C及D型)、MPS IV(A及B型)、MPS VI(馬洛托-拉米氏症候群)(Maroteaux-Lamy Syndrome))、MPS VII(史萊氏症候群(Sly syndrome)、MPS IX(透明質酸酶缺乏症)、克拉貝氏症(Krabbe disease)、法伯氏症(Farber disease)、半乳糖唾液酸貯積症(Galactosialidosis)、GM1神經節苷脂儲積症(Gangliosidosis)、GM2神經節苷脂儲積症AB變化型、山德霍夫氏症(Sandhoff disease)、戴薩克斯症(Tay-Sachs disease) 、溶酶體酸脂酶缺乏症、尼曼匹克症(Niemann-Pick disease)(A型、B型及C型)、異染性腦白質退化症(Metachromatic Leukodystrophy，MLD)、多發性硫酸酯酶缺乏症、黏脂貯積病(mucolipidosis) (I型、II型、III型及IV型)、神經元蠟樣脂褐質沉著症(neuronal ceroid lipofuscinoses)(第1型至第10型)、伍爾曼氏症(Wolman disease)、α-甘露糖苷貯積症(α-mannosidosis) 、β-甘露糖苷貯積症、天門冬醯葡糖胺尿症(aspartylglucosaminuria)、岩藻糖血症(fucosidosis)、胱胺酸症(cystinosis)、緻密成骨不全症(pycnodysostosis)、唾液酸儲存症、小兒游離唾液酸儲存症(ISSD)、膽固醇酯儲存症(cholesteryl ester storage disease)、半乳糖血症(galactosemia)、楓糖尿症、苯丙酮尿症(PKU)、肝糖儲積症、線粒體異常、富來德瑞克氏共濟失調症(Friedreich ataxia)、過氧化物酶體異常(peroxisomal disorders)，包括柴爾維格氏症候群(Zellweger syndrome)及腎上腺腦白質退化症(adrenoleukodystrophy)、金屬代謝異常、包括威爾森氏症 (Wilson's disease)及血色病、有機酸血症和尿素循環異常。
在某些具體例中，該第二部分可衍生自涉及腫瘤的生物分子，包括並不限於PCT專利申請案公開WO 2015/042279 Al中所列者，其全文併於本案作為參考。
在一具體例中，該第一生物活性部分為一種轉錄因子抗體，而該第二生物活性部分為一種核標定生物分子或為一種細胞穿透型生物分子。在一具體例中，第一生物活性部分和第二生物活性部分為涉及活性含氧物(ROS)代謝反應之不同的酵素或酵素片段。在另一具體例中，該第一生物活性部分及第二生物活性部分在投與接受者(例如人類)前可為變性狀態或部分活性狀態，且在投予後可再折疊。
在一具體例中，第一生物活性部分及第二生物活性部分至少一者含有細胞穿透區域。
在某些具體例中，適於被氧化矽型生物分子載體攜帶的生物分子包括含半胱胺酸(硫醇基)、離胺酸(胺基)、天冬胺酸或麩胺酸(羧基)之酵素、含半胱胺酸(硫醇基)、離胺酸(胺基)、天冬胺酸或麩胺酸(羧基)之胜肽、或含半胱胺酸(硫醇基)、離胺酸(胺基)、天冬胺酸或麩胺酸(羧基)之抗體。或者，適於被氧化矽型生物分子載體攜帶的生物分子可包括含多組胺酸標記(His-tag)之酵素、含多組胺酸標記(His-tag)之胜肽或含多組胺酸標記(His-tag)之抗體。此處的多組胺酸標記由至少六個組胺酸(His)殘基組成。
該酵素可為抗氧化酵素，包括山葵過氧化酶(HRP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、麩胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase)、麩胱甘肽還原酶及彼等之酶催化模擬物或片段。或者，該酵素可為涉及生化酶催化級聯反應之酵素，此係指一系列涉及酵素之生化反應，例如血液凝固、代謝反應路徑及信號傳導路徑。
根據本文之揭示，可由氧化矽型生物分子載體攜帶之生物分子接合至多孔性核。於本文中，術語「接合至」、「與…接合」「接合」或類似表述意指兩個或多個化學或生物實體藉由一直接或間接的共價或非共價相互作用而連接。在某些具體例中，該結合為共價的。在某些具體例中，共價結合是藉由連接子部分達成。在某些具體例中，結合是非共價的，例如親和性相互作用、電荷相互作用、疏水性相互作用、金屬配位、氫鍵相互作用，凡德瓦相互作用、磁力相互作用、靜電相互作用或偶極-偶極相互作用，彼等皆由連接子所導致或中介。藉由連接子將生物分子接合至氧化矽型多孔性核的例示性方法可見於“Bioconjugate Techniques” ，作者Greg T. Hermanson，第三版 (2013年9月2日)，Academic Press出版，其全文併於本案作為參考。
根據本發明，連接子被用於接合生物分子與該多孔性核。在一具體例中，複數個同型連接子被用於形成接合，且第一生物活性部分及第二生物活性部分可藉由相同連接子或藉由同型之不同連接子連接。在一具體例中，二或多種不同型之連接子被用於形成接合，且不同生物活性部分可藉由不同連接子隨機地或以控制的方式連接。
於本文中，術語「連接子」也稱為「分隔物」或「交聯劑」，應被廣義地解釋為包括核與由其攜帶之生物分子間的任何型式的化學或物理連結。例如，氧化矽型多孔性核可以被功能化或修飾而在其上形成連接子。多孔性核的表面性質可在製備過程中改變，或在製備後可使用後合成方案以形成連接子。活性表面能使氧化矽型多孔性核連接生物分子。該多孔性核的功能化表面具有細胞識別或其他位點導向的生物分子，可產生作為細胞追蹤或標靶的理想藥劑。例如，以標靶配體(例如葉酸)表面修飾或功能化，相較於非癌症細胞，可用於增強癌症細胞之特異性吸收。有用的氧化矽型多孔性核的修飾或功能化方法可見“Biocompatibility and Biofunctionalization of Mesoporous Silicon Particles”，Luis Maria Bimbo之博士論文，University of Helsiniki (2012)，其全文併於本案作為參考。
除了連接功能外，揭示於本發明之連接子較佳地具有一或多種功能性區段以提供氧化矽型生物分子載體所欲之特性，例如純化可行性、生物可利用性、生物分佈、標靶特異性、細胞攝入等。
在一具體例中，生物分子藉由連接子接合至氧化矽型多孔性核。首先，以例如3-胺丙基三甲氧基矽烷(APTMS)之試劑將該多孔性核功能化，以提供一反應性胺基於該多孔性核之表面上。然後，該胺基與具有例如琥珀醯亞胺基及馬來醯亞胺基之聚乙二醇(PEG)衍生物共價鍵結，從而此PEG連接子透過琥珀醯亞胺基與胺基間之反應被接枝於該多孔性核上，且透過連接子之馬來醯亞胺基與生物分子之硫基間的作用，該馬來醯亞胺基可用於與生物分子形成連結。在此具體例中，將異雙功能化PEG衍生物作為連接子以提供連接子例如水溶解度、生物相容性及長度可變化性的優點。一般而言，異雙功能化PEG衍生物可具有X-PEG-Y之一般性結構，其中X及Y為二個不同的功能性或反應性基團。某些有用的PEG連接子包括但不限於HO-PEG-COOH、HO-PEG-NHS、HS-PEG-SGA、NH2 -PEG-COOH、MAL-PEG-NHS、生物素-PEG-MAL及炔-PEG-MAL。不同的X及Y可根據多孔性核及欲攜帶之生物分子之特性加以選擇。此外，該PEG連接子之長度或分子量可根據多孔性核及生物分子之類型與所形成的氧化矽型生物分子載體的最終用途或應用加以選擇。
在另一具體例中，使用含二價金屬離子(例如鎳或鈷離子)之分子作為連接子。例如，多孔性核可以含氮基三醋酸之矽烷(NTA-矽烷)處理，然後以NiCl2 處理以提供鎳離子於多孔性核之表面，用於結合具有多組胺酸標記之生物分子。當固定於多孔性核上的生物分子為遺傳修飾之蛋白或多肽時，此二價金屬離子方式較為有利。或者，該多孔性核亦可以Ni2+ :NTA-PEG衍生物處理以形成具有PEG區段及二價金屬離子之連接子。
在另一具體例中，該連接子可包括一連接至該多孔性核之第一端、一連接至該第一或該第二生物活性部分之第二端以及一介於該第一端及該第二端之間並用於促進細胞攝入之功能性區段。選擇存在於氧化矽型生物分子載體之連接子的類型、分子量及生物特性以達到所欲的遞送功能係無需過度實驗即可確定。
於本文中， 術語「多孔性核」 或「核」一般係指能攜帶功能性生物分子的奈米級粒子、球體或生物載體。除另有特別指明外，術語「多孔性核」或「核」 可與「中孔洞氧化矽奈米粒子」(MSN)互換使用，係指中孔洞型式之氧化矽粒子。該多孔性核的大表面積可使該粒子有助於生物分子遞送。
迄今已有各種氧化矽型多孔性核的大量成功合成被發表。例如，MSNs可經由將矽酸四乙酯與微胞桿所作成的模板反應而合成。結果是一種充滿整齊排列之小孔的奈米級球體或桿體集合。然後可藉由經調整成適當pH之溶劑洗滌以去除模板。在另一方法中，可使用簡單的溶膠凝膠法或噴霧乾燥法合成MSNs。矽酸四乙酯亦可與額外的聚合物單體(作為模板)搭配使用。其他方法包括快速自我組裝、軟硬模製、改良型Stöber法、溶解重建及修正氣凝膠法。製備多孔性核的許多不同的合成方法可見於例如“Synthesis of Mesoporous Silica Nanoparticles,” Si-Han Wu et. al., Chem. Soc. Rev., 2013,42, 3862-3875及“Mesoporous Silica Nanoparticles in Target Drug Delivery System：A review,” Charu Bharti et. al., Int J Pharm Investig. 2015 Jul-Sep; 5(3)：124–133，其全文併於本案作為參考。較佳地，可選擇適當的合成方法，從而可達成形態、粒徑、均一性及/或分散性的良好控制。
在一具體例中，該多孔性核具有2至50 nm之平均孔徑，例如5至50 nm、10至50 nm、20至50 nm、2至5 nm或2至10 nm。在一具體例中，該多孔性核具有少於300 nm之粒徑或直徑，例如少於250 nm、少於200 nm、少於150 nm或少於100 nm，例如2至300 nm之間、2至200 nm之間、10至200 nm之間或50至100 nm之間。
依據不同的需求或應用，可控制多孔性核的大小。此孔徑可調性有利於攜帶小分子藥物至高分子(例如蛋白質及酵素)範圍的生物分子。
在一具體例中，已觀察到氧化矽奈米粒子之於細胞系中的尺寸依賴性吸收及組織分佈。粒子在活體中的生物分布及清除高度地依賴其物理及化學特性。氣體(例如氮)吸附技術可用於量測材料的小孔大小分佈。穿透式電子顯微鏡(TEM)及動態光散射儀(DLS)可個別用於量測乾燥介質及水性介質中的奈米粒子大小。
較佳地，在製備期間或製備之後，可將多孔性核功能化以根據需求提供所欲之性質。例如該多孔性核可以胺基、氮基三醋酸、聚乙二醇、螢光標記或其組合加以功能化。因此，根據本發明所製之氧化矽型生物分子載體可用於醫藥組成物之製備，其中有效量之氧化矽型生物分子載體分散於生物性介質中，例如用於投予接受者之醫藥或生理可接受性稀釋劑，例如水或生理食鹽水。
或者，在另一具體例中，中孔洞氧化矽奈米粒子(MSN)材料被合成並功能化以攜帶胜肽及/或抗體。該胜肽可為任何含半胱胺酸或多組胺酸標記之胜肽，包括核定位序列(NLS)胜肽、癌症標靶胜肽及溶小體標靶胜肽。該抗體可為任何含半胱胺酸或多組胺酸標記之抗體，包括訊息傳導抗體及癌症標靶抗體。
本發明提供由具有NF-κB (核因子-κB) p65抗體與TAT轉導胜肽(即，HIV轉錄活化子(TAT)蛋白質轉導區域)之表面功能化之中孔洞氧化矽奈米粒子(MSN)所組成之奈米粒子。TAT轉導胜肽之序列：CGRKKRRQRRR。這些奈米粒子可移近核膜並阻斷激活的p65之核轉位。
圖1說明將NF-κB p65抗體及Cys-TAT胜肽接合至表面功能化MSN的反應流程。為了合成功能化MSN，藉由與3-胺丙基三甲氧基矽烷(APTMS)反應，於MSN表面形成胺基，以形成MSN-APTMS，經元素分析，其具有2.6 wt %之APTMS氮含量之平均負載。為了在MSN上固定p65抗體，選擇二個具有不同長度的聚乙二醇(PEG)連接子MAL-PEG2k -SCM與MAL-PEG3.4k -SCM，與MSN-APTMS反應。於此，先解釋縮寫，MAL：馬來醯亞胺，PEG2k 或PEG3.4k ：具有平均分子量2000或3400之聚乙二醇(PEG)，SCM：琥珀醯亞胺基 羧甲基。該MAL-PEG-SCM連接子含有一琥珀醯亞胺基部分，其經由活性琥珀醯亞胺基連接與MSN-APTMS之胺基反應，以獲得MSN-PEGs (MSN-PEGs：MSN-PEG2k , MSN-PEG3.4k )。MSN-PEG之MAL-端與抗體及Cys-TAT 胜肽之硫醇基反應。 綠色螢光中孔洞氧化矽奈米粒子(MSN)之合成
將C16 TABr (0.58 g，1.64×10-3 mole)及5 mL之0.226 M四乙氧基矽烷之乙醇溶液(TEOS，含1 mL TEOS之20 mL 99.5%乙醇)溶於300 g之0.17 M氨水溶液。將儲備溶液於40℃攪拌5小時。添加5 mL之1.13 M TEOS乙醇溶液(含5 mL TEOS之20 mL 99.5%乙醇)並添加FITC-APTMS激烈攪拌1小時，然後於40℃靜置24小時。藉由將異硫氰酸螢光素 (FITC，1 mg)及3-胺丙基三甲氧基矽烷(APTMS，100 μL)於5 mL乙醇(99%)中於室溫攪拌24小時，預先製備FITC-APTMS (N-1-(3-三甲氧基矽烷基丙基)-N’-茀基硫脲)。然後以12000 rpm離心20分鐘收集合成之樣品，並以99%乙醇洗滌五次。將200 mg所合成之樣品以0.5 g之37 wt % HCl再分散於25 mL的95%乙醇中。藉由於60℃加熱乙醇懸浮液24小時，以萃取出表面活性劑。將稱為FITC-MSN之產物離心收集並以乙醇洗滌數次並儲存於乙醇中。 經胺功能化MSN (MSN-APTMS)之製備
藉由APTMS的處理，以胺基將MSN的表面功能化。先將MSN(200 mg)分散於50 mL乙醇中，然後添加500 μL APTMS，再將該溶液回流18小時。離心並以乙醇洗滌後，將經胺功能化MSN再分散於乙醇中。為了移除表面活性劑，將經胺功能化的MSN懸浮於酸性乙醇(含1克HCl之50mL EtOH)，並回流24小時。離心並以乙醇洗滌後，將經胺功能化MSN (MSN-APTMS)再分散於乙醇中。 穿透式電子顯微鏡(TEM)
使用75 KV操作電壓的Hitachi H-7100儀器擷取TEM影像。使用超音波震盪將樣品分散於乙醇，並滴加10 μL懸浮液以固定在微柵上。
關於免疫效力評估，將p65抗體與MSN-PEG3.4k 之MAL端以不同比例藉由C-S鍵共價固定(1：6、1:12、1:24)。在P65抗體接合後，將Cys-TAT胜肽接合以填補MSN-PEG3.4k 的游離MAL端。無抗體結合的MSN-PEG3.4k 亦直接與Cys-TAT接合作為對照組。以氮吸附-脫附等溫線、粉末X射線繞射(XRD)、FT-IR、TEM、動態光散射(DLS)和Zeta電位分析奈米粒子的物理性質。圖2A-2D顯示各種功能化MSN的穿透式電子顯微鏡(TEM)影像。由TEM影像，可觀察到MSN粒子具有良好有序的中孔洞結構，且由TEM影像獲得之平均粒徑為約40 nm。 細胞存活率及生長抑制分析
應用WST-1分析法量測細胞存活率及生長抑制分析：以每小孔2x104 個HeLa細胞於24孔盤接種16小時，用於HeLa細胞存活率分析。將HeLa細胞培養於含不同MSN-PEG3.4k -Ab-TAT (100 mg/mL)量之無血清介質中4小時。關於頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)生長抑制分析，將HNSCC細胞以4x104 細胞/孔之密度於24孔盤接種16小時，並在無血清介質中與200 mg/mL之MSN-PEG3.4k -Ab(1:24)-TAT、MSN-PEG3.4k -TAT或抗TNF抗體(100 ng/mL)培養4小時。隨後以培養介質置換介質，進一步培養HNSCC細胞72小時。關於WST-1分析，使HeLa細胞或HNSCC細胞於含WST-1 (Clontech)之培養介質於37℃生長4小時。由活細胞中產生的暗紅色甲䐶(formazan)染料與活細胞數成正比，並使用微量盤讀取器量測450nm處之吸光率(Bio-Rad，型號680)。
使用WST-1分析法量測MSN-PEG3.4k -Ab-TAT之細胞存活率，且MSN-PEG3.4k -Ab-TAT顯示無顯著細胞毒性。 西方墨點法分析
將細胞裂解物於10％SDS-PAGE分離，然後將蛋白質電泳轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，並在室溫下於阻斷緩衝液[1×Tris-緩衝生理食鹽水(TBS)-0.1％ Tween 20，5％w/v 脫脂奶粉]中阻斷1小時。於4℃將膜與初級抗體[購自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)之NF-kB p65、TNF-a、Lamin B及GAPDH，與購自Cayman (Cayman, Ann Arbor, MI, USA)之COX-2]培養過夜。所有初級抗體在阻斷緩衝液中稀釋(NF-κB p65：1:500，TNF-a：1:500，Lamin B：1:3500，GAPDH：1:5000、COX-2：1:500稀釋)。將該PVDF膜充分洗滌，並在室溫下用經山葵過氧化酶接合之二級免疫球蛋白G抗體(1：2000稀釋，Santa Cruz Biotechnology)培養1小時。根據製造商的說明書以增強的化學發光基質套組(Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare UK Ltd, Bucks, UK)將免疫反應帶可視化。 在MSN-PEGs之NF-kB的細胞反應及MSN-PEG3.4k -Ab-TAT的活體外蛋白質沉澱分析
將100 mg/mL之MSN-APTMS、MSN-PEG2k 及MSN-PEG3.4k 於HeLa細胞中處理4小時，然後採用或不採用TNF-α(50 ng/mL)作為NF-κB活化劑另培養0.5小時。在收取細胞後，分離細胞質蛋白及細胞核蛋白，以西方墨點法實驗測定在細胞質或核中p65的表現量。關於活體外蛋白質沉澱分析，將MSN-PEG3.4k -Ab-TAT(100 mg/mL )與HeLa細胞之總溶胞產物混合並於4℃活體外培養18小時。然後，將混合物於12,000rpm下離心20分鐘，並將上清液(10μL)以西方墨點法分析游離p65的表現量。
圖3A-3C顯示各種功能化MSN奈米粒子之活體外蛋白質沉澱的分析結果。MSN-PEG3.4k -Ab-TAT阻斷NF-kB p65的核轉位(nuclear translocation)，從而抑制NF-kB p65下游的蛋白質表現。將HeLa細胞以不同劑量之MSN-PEG3.4k -TAT或MSN-PEG3.4k -Ab-TAT處理4小時(圖3B為100 mg/mL，圖3C為50-200 mg/mL)。在遞送後，將細胞以或不以50 ng/mL TNF-α另外刺激0.5小時。阻斷效應之劑量依賴性研究顯示於圖3C，其指出核P65量因MSN-PEG3.4k -Ab(1:24)-TAT之濃度增加而降低。
如圖3B所示，進行西方墨點法以定量p65在HeLa細胞中的量。在處理後，收取細胞溶胞產物用於測量細胞核和細胞質中的p65含量。西方墨點法結果顯示，在無TNF-α時，MSN-PEG3.4k -Ab-TATs並未誘導任何的p65核轉位。然而，在以TNF-α處理下，MSN-PEG3.4k -Ab-TATs不存在時，在細胞核中出現的p65量顯著地增加。一旦添加MSN-PEG3.4k -Ab-TATs及不同量的接合抗體，核p65量依抗體的增加量而逐漸減少。MSN-PEG3.4k -Ab(1:12)-TAT及MSN-PEG3.4k -Ab(1:24)-TAT二者顯示顯著抑制P65轉位至細胞核，而MSN-PEG3.4k -TAT並不阻止TNF-α誘導核p65轉位。因此，MSN-PEG3.4k -Ab-TAT顯示出對於經由免疫性結合而阻斷NF-κB p65核轉位的特異性及有效性。
於此，奈米粒子/抗體複合物標靶NF-kB被用來捕捉核周區域的Rel蛋白p65，因而阻斷核孔通道閘門附近的轉位。接合於中孔洞氧化矽奈米粒子(MSN)上的TAT胜肽協助非胞吞作用的細胞膜轉導並集中朝向核周區域，其中p65特異性抗體對於NF-kB p65進行有效地標定及捕捉。
在另一具體例中，已研發出結合MSN奈米粒子載體和一或多個變性融合蛋白的蛋白遞送系統。此種奈米材料和一或多種融合蛋白的組合不僅能解決蛋白遞送的問題，包括化學溶劑、穩定性和滲透性，而且還提供了一種蛋白療法的新方向。
於此，對於自由基清除具有類似功能的二種抗氧化酵素蛋白，即超氧化物歧化酶(SOD)及麩胱甘肽過氧化酶(GPx)，被用來說明奈米粒子攜帶之共遞送酵素。
對於TAT-SOD和CAT-GPx蛋白接合，構建並過表現His-標記人類Cu、Zn-超氧化物歧化酶(SOD)和人類麩胱甘肽過氧化酶(GPx)，其含有人類免疫缺陷病毒(HIV)轉導區域(TAT，殘基49-57)。TAT轉導胜肽序列：RKKRRQRRR。TAT-SOD及TAT-GPx的基因被選殖並插入pQE-30的原核蛋白表現載體，以形成pQE-TAT-SOD及pQE-TAT-GPx。將該載體轉形至JM109大腸桿菌中，並在LB肉湯培養基培養以IPTG蛋白誘導1小時及3小時。在10％SDS-PAGE電泳中， TAT-SOD及TAT-GPx隨增加誘導時間顯示具有高蛋白過度表現。最後，嘗試將表現TAT-SOD或TAT-GPx的大腸桿菌粗製溶胞產物顆粒之上清液在8M尿素進一步直接接合。 螢光中孔洞氧化矽奈米粒子 (FMSN)之合成
藉由共聚合方法合成染劑功能化MSN。以溶解1 mg FITC於5 ml無水乙醇來製備FITC溶液。添加100μL APTMS並於室溫下在黑暗中快速攪拌24小時。將0.58 g C16 TAB溶於300 g 0.172M之NH3 溶液中，並添加5 mL稀釋的TEOS溶液(5％v/v TEOS/乙醇)，並攪拌5小時。在逐滴添加5 mL濃縮TEOS溶液(25％v/v TEOS/乙醇)並劇烈攪拌1小時之前先添加FITC-APTMS溶液。然後將溶液於40℃靜置24小時以完成氧化矽聚合。離心收集所合成的產物，並以95％乙醇洗滌三次。產物FITC-MSN(FMSN)儲存於絕對乙醇中。 NTA-矽烷及Ni (II)與FMSN之接合
將100 mg FMSN懸浮於含50 mg NTA-矽烷之50 mL甲苯中，並回流18小時。產物以乙醇清洗以去除多餘的矽烷。為了移除C16 TABr模板，將該粒子分散於酸性溶液(含1 g鹽酸之50 mL乙醇)中，並在60℃下攪拌24小時。隨後，在水性ρ-TsOH(0.266克，pH值= 2.0)存在下，於65℃攪拌6小時，以達成NTA連接子上的甲氧基羰基之水解。在以乙醇清洗後，將粒子與50 mM NiCl2 水溶液在室溫下反應6小時。接著上述相同的清潔過程，以獲得FMSN-NTA-Ni，並保存於絕對乙醇中。藉由ICP-MS分析，具有Ni含量平均負載之FMSN-NTA-Ni為0.6 wt％。 FMSN-PEG/PEI奈米粒子之合成
藉由共聚合方法合成染劑功能化MSN。以溶解1 mg FITC於5 ml無水乙醇來製備FITC溶液。添加100μL APTMS，並於室溫下在黑暗中快速攪拌24小時。將0.58 g C16 TAB溶於300 g 0.172M之NH3 溶液中，並添加5 mL稀釋的TEOS溶液(5％v/v TEOS/乙醇)，並攪拌5小時。在逐滴添加5 mL濃縮TEOS溶液(25％v/v TEOS/乙醇)並劇烈攪拌1小時之前，先添加FITC-APTMS溶液。添加900 μL PEG-矽烷及40 μL PEI-矽烷並攪拌30分鐘。然後將溶液於40℃靜置24小時以完成氧化矽聚合。在水熱化條件下，將該溶液於90℃熟化24小時及在70℃熟化24小時。離心收集所合成的產物，並以95％乙醇洗滌。將該粒子再分散於具有1g 37wt％ HCl的50 mL 95％乙醇中1小時，然後將酸溶劑改成具有50μL 37wt％ HCl之50 mL 95％乙醇以去除CTAB。離心收集經FITC接合之MSN(FMSN)-PEG/PEI粒子並以95％乙醇洗滌三次。 定性
於120 kV操作JEOL JSM-1200 EX II以取得穿透式電子顯微鏡(TEM)影像。樣品的鎳含量係使用Agilent 7700e儀器以感應耦合電漿質譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry；ICP-MS)測定。在Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK)使用動態光散射(DLS)進行尺寸測量。藉由電泳遷移率之後在Malven Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK)上應用Henry方程式來測定Zeta電位。表1顯示對於在不同溶液中FMSN-PEG/PEI奈米粒子之平均粒徑的動態光散射(DLS)數據。                                 表1
圖4A說明FMSN-PEG/PEI奈米粒子的接合，而圖4B顯示FMSN-PEG/PEI奈米粒子的TEM影像。該TEM影像顯示，這些FMSN-PEG/PEI粒子具有約60〜70 nm平均粒徑之良好有序的中孔洞結構。經DLS測定之大小則顯示在生物溶液(表1)中僅有非常少的凝集。 NTA及Ni (II)與FMSN-PEG/PEI之接合
將20 mg FMSN-PEG/PEI分散於2.5 mL PBS緩衝液中，然後將6.8 mg NHS-PEG-MAL(3.4k)溶於2.5 mL PBS中，然後加入FMSN-PEG/PEI溶液中。將該溶液在室溫攪拌2小時。藉由添加400 μL之Traut氏試劑(100μM)及5.24 mg Nα,Nα-雙(羧甲基)-L-離胺酸水合物於5mL PBS緩衝液中並攪拌30分鐘來製備硫醇化Nα,Nα-雙(羧甲基)-L-離胺酸水合物(BCLH)溶液。將該硫醇化BCLH溶液添加至FMSN-PEG/PEI溶液中並在4℃下攪拌過夜。隨後，在水性ρ-TsOH(0.133克，pH值= 2.0)存在下，於65℃下攪拌6小時以達成NTA連接子上的甲氧基羰基之水解。在以乙醇清洗後，將粒子與50 mM NiCl2 水溶液在室溫下反應6小時。接著上述相同的清潔過程，獲得FMSN-PEG/PEI-NTA-Ni，並保存於絕對乙醇中。 His-TAT-蛋白與FMSN-NTA-Ni之固定
將含有His-TAT-SOD或His-TAT-GPx的大腸桿菌溶胞產物於4℃與FMSN-NTA-Ni混合隔夜。基於Ni (II)與His標記蛋白間的金屬親和力以非常低的解離常數提供緊密連接，在8M尿素下，不經純化直接將該FMSN-NTA-Ni與源自大腸桿菌粗製溶胞產物小粒上清液之TAT-SOD或TAT-GPx蛋白混合。離心分離經蛋白接合之粒子，並以乙醇洗滌。該經蛋白功能化之粒子被表示為FMSN-TAT-SOD或FMSN-TAT-GPX 。 SOD及GPx活性之測定
針對SOD，製備300 µL樣品並使用微量盤讀取器(Bio Tek, Synergy™ H1)監測。首先，製備含有EDTA(10-4 M)、細胞色素c(10-5 M)及黃嘌呤(5×10-5 M)之1 mL 50 mM K3 PO4 的雞尾酒試劑儲液。然後，將280 µL雞尾酒試劑加入各種樣品、黃嘌呤氧化酶(10 μL 58 mU/mL)，並以去離子水加至總體積300 µL。最後，將200µL的各樣品轉移至微量盤讀取器並偵測550nm之吸光度。為了量測SOD活性，使用t=0秒到t=180秒之間的吸光度斜率，比較天然SOD和SOD樣品之間的細胞色素c還原的抑制率。SOD比活性表示為總溶胞產物蛋白之每毫克(U /mg)單位(The Journal of Biological Chemistry, 1969, 244, 6049-6055)。
使用基於Paglia與Valentine之方法的麩胱甘肽過氧化酶分析套組(Cayman Chemical)，以過氧化氫作為基質，量測HeLa細胞中之GPx活性。該方法係基於NADPH偶合反應，其中GPx還原過氧化氫同時將GSH氧化為GSSG。所生成的GSSG被GR還原成GSH且消耗NADPH。於340 nm下量測酵素活性，並以每mL樣品每分鐘之1 μmole NADPH氧化為單位表示酵素活性。GPx之比活性表示為每毫克蛋白(U/mg)單位。
細胞存活率分析：以每孔3×104 個細胞接種於24孔盤中用於增殖分析。在與懸浮於無血清培養基之不同數量的奈米粒子分別培養4小時後，將500 μM的二氯化N,N'-二甲基-4,4'-雙吡啶 (巴拉刈；paraquat)添加至培養基中24小時。然後將經粒子處理的細胞以PBS洗滌兩次，並與含200 μL WST-1(10％)之DMEM培養。藉由活細胞所產生的甲䐶染料評估細胞存活率，並使用微量盤讀取器 (Bio-Rad，型號680)量測450 nm之吸光度。
圖5A-C顯示TAT-SOD與TAT-GPx共同遞送至Hela細胞的保護作用。圖5A顯示使用WST-1分析之各種奈米粒子之增強的細胞存活率的結果。圖5B顯示各種奈米粒子之ROS偵測結果。ROS之濃度以DHE分析染色並以流式細胞儀定量。圖5C顯示西方墨點法分析之結果，其顯示COX II及p-p38的含量。PQ的濃度及FMSN-TAT-SOD與FMSN-TAT-GPx(1：1之比例)之共同遞送分別為500 μM及25 µg/mL。
於此，其顯示變性的TAT-SOD或TAT-GPx融合蛋白可被共同遞送至Hela細胞中，且該變性融合蛋白在遞送進入細胞後可重新折疊並展現特定酶活性。根據本文所示之結果，該TAT-SOD或TAT-GPx融合蛋白功能化FMSN，稱為FMSN-TAT-SOD或FMSN-TAT-GPx，藉由細胞的重新折疊機制仍然具有酶活性。
總言之，藉由使用MSNs，某些具體例的氧化矽型生物分子載體依需要可遞送胜肽、蛋白質、酵素或催化性模擬物進入細胞，並在輸送至細胞中可維持該胜肽、蛋白質、酵素或催化性模擬物之天然活性。該氧化矽型生物分子載體可做為細胞內的奈米反應器，且該遞送之胜肽、蛋白質、酵素或催化性模擬物可共同作用以提供多種功能。
在不脫離本發明的範圍或精神下，對於本發明架構進行各種修改及變化對於熟悉本領域之技術人員而言是顯而易見的。鑑於上述，本發明欲涵蓋此一發明之修改及變化，只要彼等落入後述之申請專利範圍或其均等之範圍內。
無
本文包括附隨之圖式以提供對本發明的進一步理解，且該圖式被併入並構成本說明書之一部分。該圖式說明本發明之具體例，並與發明說明一起用於解釋本發明的原理。
圖1說明將NF-κB p65抗體及Cys-TAT胜肽接合至表面功能化多孔性核之反應流程。
圖2A-2D顯示各種功能化MSNs之穿透式電子顯微鏡(TEM)影像。
圖3A-3C顯示各種功能化MSNs之活體外蛋白質沉澱分析(pull-down assay)結果。
圖4A說明FMSN-PEG/PEI奈米粒子之接合結構。
圖4B顯示FMSN-PEG/PEI奈米粒子之TEM影像。
圖5A-5C說明TAT-SOD及TAT-GPx共同遞送至Hela細胞之保護效果。

Claims (19)

  1. 一種氧化矽型生物分子載體，包括： 一多孔性核； 一第一生物活性部分； 一第二生物活性部分，與該第一生物活性部分在功能上相關聯；以及 連接子，用以將該第一生物活性部分及該第二生物活性部分分別接合至該多孔性核。
  2. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中該第一生物活性部分係選自於由酵素、抗體、催化性模擬物、配體、激素、生物分子結合蛋白及其功能性片段所組成之群組。
  3. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中該第一生物活性部分為轉錄因子抗體，而該第二生物活性部分為胞器標定型生物分子或細胞穿透型生物分子。
  4. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中該第一生物活性部分及該第二生物活性部分為級聯反應中的不同酵素或酵素片段。
  5. 如請求項4所述之氧化矽型生物分子載體，其中該第一生物活性部分及該第二生物活性部分為活性含氧物代謝反應中的不同酵素或酵素片段。
  6. 如請求項4所述之氧化矽型生物分子載體，其中該第一生物活性部分及該第二生物活性部分係以變性狀態或部分活性狀態存在。
  7. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中該第一生物活性部分及該第二生物活性部分之至少一者包含可穿透細胞之區域。
  8. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中該第一生物活性部分及該第二生物活性部分之至少一者包含一多組胺酸標記。
  9. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中連接子之至少一者包括聚乙二醇區段。
  10. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中連接子之至少一者包括二價鎳或鈷離子。
  11. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中連接子之至少一者係透過共價鍵結合至該第一生物活性部分、該第二生物活性部分或二者。
  12. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中連接子之至少一者包括一連接至該多孔性核之第一端、一連接至該第一或該第二生物活性部分之第二端以及一介於該第一端及該第二端之間並用於促進細胞攝入之功能性區段。
  13. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中該多孔性核係經由聚乙烯亞胺、胺基、氮基三醋酸、聚乙二醇、螢光標記或其組合進行功能化。
  14. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中該多孔性核之平均孔徑為2至50 nm。
  15. 如請求項1所述之氧化矽型生物分子載體，其中該多孔性核之粒徑小於300 nm。
  16. 一種醫藥組成物，包括複數個如請求項1至15中任一項所述之氧化矽型生物分子載體分散於一生物性介質中。
  17. 一種製備組成物之方法，包括： 提供一具有多孔性核之氧化矽型載體； 於該多孔性核上形成連接子； 經由連接子之至少一部分將第一生物分子接合至該多孔性核；以及 經由連接子之至少一部分將第二生物分子接合至該多孔性核，其中該第二生物分子與該第一生物分子在功能上相關聯。
  18. 一種利用包括請求項1至15中任一項所述之氧化矽型生物分子載體之組成物製備藥物的方法，該藥物係用於治療與細胞異常有關之疾病或狀況。
  19. 如請求項18所述之方法，其中該疾病或狀況係選自於由酵素缺乏、酵素缺陷及代謝異常所組成之群組。
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