TWI829949B - 用於免疫治療的二氧化矽奈米球 - Google Patents

用於免疫治療的二氧化矽奈米球 Download PDF

Info

Publication number
TWI829949B
TWI829949B TW109124259A TW109124259A TWI829949B TW I829949 B TWI829949 B TW I829949B TW 109124259 A TW109124259 A TW 109124259A TW 109124259 A TW109124259 A TW 109124259A TW I829949 B TWI829949 B TW I829949B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
hsn
silica
tumor
neoantigen
antigen
Prior art date
Application number
TW109124259A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202116292A (zh
Inventor
牟中原
吳政勳
吳思翰
陳奕平
Original Assignee
奈力生醫股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 奈力生醫股份有限公司 filed Critical 奈力生醫股份有限公司
Publication of TW202116292A publication Critical patent/TW202116292A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI829949B publication Critical patent/TWI829949B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0001—Archaeal antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0002—Fungal antigens, e.g. Trichophyton, Aspergillus, Candida
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本發明係關於空心二氧化矽奈米球領域。確切地說，本發明係關於作為佐劑以誘導或增強免疫反應或作為載劑以將抗原遞送到身體的二氧化矽奈米顆粒。

Description

用於免疫治療的二氧化矽奈米球
本發明係關於空心二氧化矽奈米球領域。確切地說，本發明係關於作為佐劑以誘導或增強免疫反應或作為載劑以將抗原遞送到身體的二氧化矽奈米顆粒。
介孔二氧化矽奈米顆粒(mesoporous silica nanoparticles)由於其化學/熱穩定性、大表面積、高負載能力、可調的表面性質和優異的生物相容性而被認為具有作為藥物遞送系統的巨大潛力。在各種二氧化矽奈米材料中，空心二氧化矽奈米球(HSN)的形態和特性與普通的介孔二氧化矽奈米顆粒的不同之處在於具有空心的內部空間和薄的多孔殼，使得它們能夠包封大分子(諸如生物活性成分)並且由於內部空間大而表現出更高的負載能力；這樣的目的可以例如通過調節殼的孔徑來實現。當孔徑小於大分子時，殼可以防止大分子在血液中的迴圈期間洩漏出去。HSN的形態和特性很大程度上取決於合成策略，而合成策略因應用而異。本發明探索了HSN作為載劑和佐劑以增強醫學應用(例如，疫苗接種)的功效的潛力。
本發明人驚奇地發現，HSN本身可在受試者中誘導免疫反 應，因此可以用作免疫治療中的抗原/佐劑。此外，HSN還可以在免疫治療中用作攜帶抗原(諸如新抗原(neoantigen))的載劑。
因此，本發明係關於在其中包封小生物活性成分的HSN和其在治療，特別是免疫治療中的應用。特別地，小生物活性成分為新抗原，諸如腫瘤特異性新抗原、肽、DNA、RNA等。
因此，本發明內容提供了一種用於抑制有需要的受試者中的腫瘤生長的方法，其包含向該受試者施用空心二氧化矽奈米球(HSN)，從而增加腫瘤中的腫瘤浸潤免疫細胞，其中HSN包含單層或多層二氧化矽殼，其中每個殼具有介孔並包封封閉空心空間，最內封閉空心空間任選地具有固體二氧化矽核，其中該空間由任意兩個二氧化矽殼或固體二氧化矽核之間的距離界定，並且其中通過動態光散射(DLS)測量的於介質中的HSN的流體動力學尺寸(hydrodynamic size)不大於150nm，其中該介質在生物學上類似於或等同於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一些具體實例中，腫瘤浸潤免疫細胞包含，但不限於，T細胞、B細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞等等。
本發明還提供了一種用於誘導有需要的受試者中的免疫反應的方法，其包含向該受試者施用空心二氧化矽奈米球(HSN)，其中該HSN包含單層或多層二氧化矽殼，其中每個殼具有介孔並包封封閉空心空間，最內封閉空心空間任選地具有固體二氧化矽核，其中該空間由任意兩個二氧化矽殼或固體二氧化矽核之間的距離界定，並且其中通過動力學光散射(DLS)測量的於介質中的HSN的流體動力學尺寸不大於200nm，其中該介質在生物學上類似於或等同於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
本發明還提供了一種空心二氧化矽奈米球(HSN)共軛物，其包含HSN和包封於HSN中的小生物活性成分，其中該HSN包含單層或多層二氧化矽殼，其中每個殼具有介孔並包封封閉空心空間，最內封閉空心空間任選地具有固體二氧化矽核，其中該空間由任意兩個二氧化矽殼或固體二氧化矽核之間的距離界定，並且其中通過動力學光散射(DLS)測量的於介質中的HSN的流體動力學尺寸不大於200nm，其中該介質在生物學上類似於或等同於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
圖1顯示了具有靶向淋巴結能力的50nm HSN。
圖2顯示了抗原(蛋白)@HSN在小鼠中誘導抗原特異性抗體的作用。
圖3顯示了Her2_ECD@HSN的免疫治療抗腫瘤功效。
圖4顯示了HSN的抗腫瘤功效。
圖5顯示了CD8 T細胞、樹突細胞和巨噬細胞，由於存在HSN而在腫瘤中局部增加，但無全身免疫反應。
圖6顯示了用NeoAg@HSN疫苗接種後第20天CD8 T細胞中IFN-r表現的結果。
為了便於理解本文的公開內容，本文使用的術語在此定義如下。
在說明書和申請專利範圍的上下文中，單數形式“一個”、“一種”和“該”包括複數指示物，除非另外特別指出。除非另有說明，否則本文提供的任何和所有實例或示例性語言(例如，“諸如”)僅 用於更好地說明本發明，而不是限制本發明的範圍。
應理解，本說明書中列舉的任何數值範圍旨在包括其中涵蓋的所有子範圍。例如，“50至70℃”的範圍包括所述最小值50℃和所述最大值70℃之間的所有子範圍和具體值，包括端值，例如從58℃至67℃，以及從53℃至62℃，60℃或68℃。由於所公開的數值範圍是連續的，它們包含最小值和最大值之間的每個數值。除非另外指明，否則本說明書中指出的各種數值範圍均為近似值。
在本發明中，術語“約”是指本發明所屬領域中具有通常知識者測量的給定值的可接受偏差，部分取決於如何測量或測定所述值。
在本發明中，除非特別指明，否則如本文所用的前綴詞“奈米”意指約300nm或更小的尺寸。除非特別指明，否則與IUPAC提出的定義不同，本文所用的前綴詞“中間/介(meso-)”意指約5nm或更小的尺寸。
在本發明中，本文所用的術語“矽烷”是指SiH4的衍生物。通常，四個氫的至少一個被如下所述的取代基諸如烷基、烷氧基、胺基等替代。如本文所用，術語“烷氧基矽烷”是指具有至少一個直接鍵合到矽原子上的烷氧基取代基的矽烷。如本文所用，術語“有機烷氧基矽烷”是指具有直接鍵合到矽原子的至少一個烷氧基取代基和至少一個烴基取代基的矽烷。如本文所用，術語“矽酸鹽源”是指可以被認為是正矽酸的鹽形式或酯形式的物質，例如正矽酸鈉、偏矽酸鈉、正矽酸四乙酯(四乙氧基矽烷，TEOS)、正矽酸四甲酯、正矽酸四丙酯。烴基取代基可以任選地進一步被雜原子取代或中斷。
在本發明中，如本文所用的術語“烴基”是指衍生自烴的 單價基團。如本文所用，術語“烴”是指僅由碳原子和氫原子組成的分子。烴的實例包括但不限於(環)烷烴、(環)烯烴、二烯烴、芳族化合物等。當烴基如上所述被進一步取代時，取代基可以為鹵素、胺基、羥基、巰基等。當烴基被上述雜原子中斷時，雜原子可以為S、O或N。在本發明中，烴基較佳包含1-30個C原子。
在本發明中，術語“烷基”是指飽和的、直鏈或支鏈烷基，其較佳包含1-30個碳原子，且更佳包含1-20個碳原子。烷基的實例包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、2-乙基丁基、正戊基、異戊基、1-甲基戊基、1,3-二甲基丁基、正己基、1-甲基己基、正庚基、異庚基、1,1,3,3-四甲基丁基、1-甲基庚基、3-甲基庚基、正辛基、2-乙基己基、1,1,3-三甲基己基、1,1,3,3-四甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、1-甲基十一烷基、十二烷基、1,1,3,3,5,5-六甲基己基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等。
在本發明中，如本文所用的術語“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”是指具有式“-O-烷基”的基團，其中該式中的“烷基”的定義具有如上所述的“烷基”的含義。
在本發明中，如本文所用的術語“環烷基”是指飽和或部分不飽和的環狀碳基團，其含有3至10個環碳原子並且更佳3至8個環碳原子，以及任選的在環上的烷基取代基。環烷基的實例包括但不限於環丙基、環丙烯基、環丁基、環戊基、環己基、2-環己烯-1-基等。
在本發明中，術語“鹵素”或“鹵代”表示氟、氯、溴或碘。
在本發明中，如本文所用的術語“胺基”是指式-NR1R2的官能團，其中R1和R2各自獨立地表示氫或如上定義的烴基。
在本發明中，本文所用的術語“水相”是指基本上可與水混溶的相。水相的實例包括但不限於水本身、水性緩衝液、二甲亞碸(DMSO)水溶液、烷醇水溶液等。基於合成的需要和/或水相中存在的物質的穩定性，可將水相調節為酸性、中性或鹼性。
在本發明中，如本文所用的術語“油相”是指與上述水相基本上不混溶的相。油相的實例包括但不限於液體，取代或未取代的(環)烷烴，諸如己烷、癸烷、辛烷、十二烷、環己烷等；取代或未取代的芳族溶劑，諸如苯、甲苯、二甲苯等。
在本發明中，如本文所用的術語“生物活性成分”是指在生物體中具有活性的物質。生物活性成分的實例包括但不限於酶、蛋白質藥物、抗體、疫苗、抗原、抗生素或核苷酸藥物。
在本發明中，如本文所用的術語“新抗原(neoantigen)”是指具有較小尺寸的生物活性成分，諸如肽、DNA、RNA、核苷酸等。
空心二氧化矽奈米球(HSN)的醫學應用
本發明人驚奇地發現，除了用作藥物遞送劑之外，空心二氧化矽奈米球(HSN)本身可表現出可用於醫學應用，特別是免疫治療的某些特性。
在一個方面，本發明提供了一種用於抑制有需要的受試者中的腫瘤生長的方法，其包含向該受試者施用空心二氧化矽奈米球(HSN)，從而增加腫瘤中的腫瘤浸潤免疫細胞，其中該HSN包含單層或多層二氧化矽殼，其中每個殼具有介孔並包封封閉空心空間，最內封閉空心 空間任選地具有固體二氧化矽核，其中該空間由任意兩個二氧化矽殼或固體二氧化矽核之間的距離界定，並且其中通過動態光散射(DLS)測量的於介質中的HSN的流體動力學尺寸不大於150nm，其中該介質在生物學上類似於或等同於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一個具體實例中，腫瘤浸潤免疫細胞包含，但不限於，T細胞、B細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞等等。
在一些具體實例中，HSN的尺寸在30至150nm，較佳40至100nm的範圍內。
應當注意，HSN的尺寸，例如，流體動力學尺寸等對於確定它們是否適合於應用可能是至關重要的。穿透式電子顯微術(TEM)是一種用於測量奈米顆粒的“原始”尺寸的常規手段，而流體動力學尺寸可更接近地反映存在於介質中的奈米顆粒的“表觀”尺寸。特別地，HSN的流體動力學尺寸可直接確定它們是否可以應用於活體受試者。如果HSN的流體動力學尺寸太大，它們將容易在介質中聚集或生長。這種現象，即聚集，不僅妨礙了輸送效率，而且還可能在醫學應用中產生負面影響，例如循環系統堵塞、免疫系統快速清除等。流體動力學尺寸可以通過動態光散射(DLS)測量。
在另一方面，一種用於誘導有需要的受試者中的免疫反應的方法，其包含向該受試者施用空心二氧化矽奈米球(HSN)，其中該HSN包含單層或多層二氧化矽殼，其中每個殼具有介孔並包封封閉空心空間，最內封閉空心空間任選地具有固體二氧化矽核，其中該空間由任意兩個二氧化矽殼或固體二氧化矽核之間的距離界定，並且其中通過動力學光散射(DLS)測量的於介質中的HSN的流體動力學尺寸不大於200nm，其中該介 質在生物學上類似於或等同於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
在一個具體實例中，在USSN 15/681,207中描述的HSN和其製備方法可適用於本發明，其以引用形式整體併入本文中。
包封於HSN中的小生物活性成分/新抗原
本發明還提供了一種空心二氧化矽奈米球(HSN)共軛物，其包含HSN和包封於HSN中的小生物活性成分，其中HSN包含單層或多層二氧化矽殼，其中每個殼具有介孔並包封封閉空心空間，最內封閉空心空間任選地具有固體二氧化矽核，其中該空間由任意兩個二氧化矽殼或固體二氧化矽核之間的距離界定，並且其中通過動力學光散射(DLS)測量的於介質中的HSN的流體動力學尺寸不大於200nm，其中該介質在生物學上類似於或等同於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
不受理論的約束，當HSN具有不大於100nm的尺寸(例如，通過TEM測量的)和不大於200nm，特別是不大於150nm的流體動力學尺寸(例如，通過DLS測量的)時，它們表現出優異的分散性和靶向淋巴結和腫瘤的特性。鑒於此，HSN適於攜帶生物活性成分，諸如抗原、新抗原等。特別地，生物活性成分被包封於孔內，使得它們在受試者中的遞送期間不會洩漏出去。這確保了生物活性成分不會被存在於受試者中的蛋白酶降解並且到達免疫細胞存在的相同位置，從而增強免疫反應。該結構還允許生物活性成分在每單位體積HSN中處於更高水準。
HSN的殼的孔徑可以調節；當孔徑小於生物活性成分(例如，大分子)的尺寸時，殼可以防止生物活性成分(例如，大分子)在血液中的迴圈期間洩漏出去。HSN的形態和特性很大程度上取決於合成策略，而合成策略因應用而異。因此，本發明人基於HSN可以作為載劑和佐劑施 用的效果進行應用，從而增強疫苗接種的功效等。
本發明人還驚奇地發現，當使用微乳液方法生產包封某些生物活性成分(諸如肽)的HSN時，HSN負載的生物活性成分的多寡可能不足或低於其它類型的生物活性成分。不受理論的約束，原因可能是在過程中形成反相微乳液，因為肽可能對在形成HSN的微乳液法中使用的表面活性劑具有親和力。為了解決這一問題，本發明人發現，生物活性成分可以被修飾以在生物活性成分與表面活性劑和二氧化矽的親和力之間產生差異，即更傾向於二氧化矽，使得生物活性成分可以更容易地被HSN包封。另一種方法是引入對生物活性成分具有高親和力的分子。
因此，在一些具體實例中，小生物活性成分被修飾為具有如下結構：Y(n)-X-SBI-[X-Y(m)](r)，其中Y為帶正電荷的肽，X為酶可裂解的序列，SBI為小生物活性成分，且n、m和r中每一個均為整數，其中n和m×r中至少一個不為零。在一個具體實例中，n為不為零的整數且r為0。在一個具體實例中，m和r中每一個均為不為零的整數且n為0。在一個具體實例中，n、m和r中每一個均為不為零的整數。
在一些具體實例中，將小生物活性成分修飾為具有如下結構：Y(n)-X(a)-SBI-X(b)-Y(m)，其中Y為帶正電荷的肽，X為酶可裂解序列，SBI為小生物活性成分，並且b、n、m和a中的每一個均為整數，其中n和m中至少一個不為零。在一個具體實例中，b和m中的每一個均為不為零的整數，且n和a為0。在一個具體實例中，n和a中的每一個均為不為零的整數，且b和m為0。在一個具體實例中，b、n、m和a中每一個均為不為零的整數。
在一些具體實例中，生物活性成分被修飾為具有如下結 構：Z(c)-Y(n)-X(a)-SBI-X(b)-Y(m)-Z(d)，其中Z為含有巰基的分子，Y為帶正電荷的肽，X為酶可裂解序列，SBI為小生物活性成分，並且a、b、c、d、m和n中的每一個均為整數，其中c、d、m和n中至少一個不為零。在一個具體實例中，b、m和d中的每一個均為不為零的整數，且n、a和c為0。在一個具體實例中，b和m中的每一個均為不為零的整數，且n、a、c和d為0。在一個具體實例中，b和d中的每一個均為不為零的整數，且n、a、c和m為0。在一個具體實例中，n、a和c中的每一個均為不為零的整數，且b、m和d為0。在一個具體實例中，n和a中的每一個均為不為零的整數，且b、m、d和c為0。在一個具體實例中，c和a中的每一個均為不為零的整數，且b、m、d和n為0。
在這種情況下，Y和Z可以提供對HSN的親和力，HSN通常在表面X(酶可裂解序列)上帶有微量負電荷，X，酶可裂解的序列，可被存在於施用HSN的受試者中的酶(諸如蛋白酶)裂解，使得SBI可以釋放到環境中。這些基團的細節也在本發明的其它地方描述。
在一些具體實例中，小生物活性成分為新抗原。新抗原是先前未被免疫系統識別的新形成的抗原。免疫治療中係關於基於肽新抗原的疫苗的新方法有望使治療精度達到個體患者中個體腫瘤的水準。新抗原可以由腫瘤突變形成的改變的腫瘤蛋白或由病毒蛋白產生。新抗原的實例包括但不限於腫瘤特異性新抗原、腫瘤新表位、新抗原肽、新抗原DNA和新抗原RNA。
在一些具體實例中，小生物活性成分為衍生自病毒、細菌或微生物的抗原。
包含已知腫瘤特異性突變的肽以及突變多肽或腫瘤表位的 片段。這些肽和多肽在本文中稱為“新抗原肽”或“新抗原多肽”。
最近，已經報導了二氧化矽奈米顆粒作為疫苗中的潛在免疫佐劑。疫苗通常含有兩種主要成分：抗原和佐劑。抗原可以衍生自被抗原特異性受體識別的致病生物的片段或癌細胞的表面蛋白。然而，當單獨使用抗原時，用於疫苗的大多數抗原通常具有差的免疫原性、弱的免疫反應和差的免疫記憶。佐劑是誘導、增強、加速和延長針對抗原的特異性免疫反應的物質。對於疫苗，佐劑在產生針對抗原的強大且持久的適應性免疫反應中起關鍵作用。此外，理想的佐劑應同時充當抗原遞送媒介物和免疫增強劑，因為單個顆粒中的抗原和佐劑應促進相同的抗原遞呈細胞(APC)的攝取並導致更有效的免疫反應。
使用二氧化矽奈米顆粒作為疫苗接種的佐劑和載劑的優點包括：(1)保護抗原免於降解和變性；(2)有效靶向和啟動抗原遞呈細胞；(3)提高每體積抗原分子的濃度；以及(4)調節抗原遞呈途徑。二氧化矽奈米顆粒顯示出固有的佐劑活性，並且可以有效地增強細胞和體液免疫。二氧化矽奈米顆粒的理化性質影響其與免疫系統的相互作用。因此，不同種類的二氧化矽奈米顆粒將誘導不同的免疫反應。用於增強免疫原性或免疫治療功效的二氧化矽奈米顆粒必須完成兩項關鍵工作：(1)有效地將抗原遞送到APC或淋巴結，和(2)隨後在APC內或附近釋放抗原並啟動免疫反應。二氧化矽奈米顆粒可以通過粒徑和表面官能團修飾促進APC攝取和淋巴結靶向。與帶負電的奈米顆粒相比，帶正電或帶中性電荷的奈米顆粒可以被樹突細胞(DC)更有效地攝取。奈米顆粒以尺寸依賴性方式轉運至淋巴結。當通過皮下注射施用大顆粒(>200nm)時，顆粒依賴於細胞運輸通過DC遷移從皮膚傳輸至淋巴結，但認為這種途徑效率較低。相反，小顆 粒(<200nm)能夠直接引流至淋巴結並且被淋巴結駐留細胞攝取。因此，小顆粒具有潛在的淋巴結靶向能力和更高的抗原遞送效率。為了改善抗原特異性免疫反應的啟動，由奈米顆粒遞送的抗原應被保護免受蛋白酶的影響並且保持完整直到APC攝取。此外，當抗原被吸附、包封或摻入到奈米顆粒中時，與游離抗原相比，其產生更高的局部抗原濃度，並導致更強的免疫反應。奈米顆粒結合抗原的常見方式是通過共價鍵或非共價鍵(諸如疏水/親水相互作用，凡得瓦爾力，靜電相互作用或氫鍵)將抗原附著在顆粒表面或顆粒的孔的內表面上。然而，附著在顆粒表面上的抗原可在原液或生理溶液中引起顆粒聚集，使得難以產生穩定懸浮液以進行應用。通過非共價鍵附著在顆粒上的抗原在注射入體內時可能洩漏；洩漏的抗原將被降解，而遞送到APC的有效抗原的數量將減少。通過共價鍵將抗原與顆粒接合可以解決抗原洩漏問題。然而，當抗原顆粒被APC攝取時，抗原不能被釋放；顆粒將干擾抗原與APC抗原受體的相互作用，並降低誘導免疫反應的可能性。利用二氧化矽奈米顆粒作為抗原載劑和佐劑的能力，二氧化矽奈米顆粒具有解決傳統疫苗開發中免疫原性差、免疫反應弱和免疫記憶差的問題的潛力。因此，本發明提供了一種服克上述問題並開發(空心)二氧化矽奈米球的方法，該二氧化矽奈米球具有單分散粒徑，並為疫苗應用提供抗原保護和良好的免疫原性和免疫治療功效。
如上所述，新抗原可能未被HSN正確或有效包封。新抗原可以是肽、DNA、RNA等。在它們的序列中具有不超過200個胺基酸，較佳不超過100個胺基酸，更佳不超過50個胺基酸的肽可被認為是新抗原。具有不超過1200個核鹼基，較佳不超過600個核鹼基，且更佳不超過300個核鹼基的DNA或RNA序列可被認為是新抗原。
包封於HSN中的小生物活性成分的應用
因此，在另一方面，本發明提供了一種包含本發明的HSN共軛物的疫苗組合物。
在另一方面，本發明提供了一種將小生物活性成分遞送到受試者的方法，其包含向受試者施用本發明的HSN共軛物。
在另一方面，本發明提供了一種在免疫治療中將新抗原遞送到受試者的方法，其包含向受試者施用其中包封新抗原的HSN。
包封小生物活性成分的HSN的製備
本發明還提供了一種產生於其中包含生物活性成分的空心二氧化矽奈米顆粒的方法：(a)提供包含油相、表面活性劑、烷氧基矽烷和/或矽酸鹽源、含有一或多種生物活性成分的水相以及任選的助表面活性劑的組合物，(b)由步驟(a)所述的組合物形成油包水(W/O)微乳液；(c)向(b)的W/O微乳液中加入起始劑，以形成封裝生物活性成分的HSN；(d)執行去穩定條件以使W/O微乳液不穩定並收集由該微乳液如此形成的所得顆粒；以及(e)將步驟(d)中收集的顆粒分散在含水洗滌相中，以得到二氧化矽奈米顆粒。
在另一方面，該方法包含以下特徵中的至少一個：(i)表面活性劑為離子型的；或者表面活性劑為非離子型的並且不存在氧化烯單元； (ii)生物活性成分在使用前被胺基酸序列修飾，其中該序列中的胺基酸為可以帶正電荷或含有巰基的胺基酸；以及(iii)將對生物活性成分具有親和力的物質引入步驟(a)的水相中。
用於形成W/O微乳液的表面活性劑是本領域中常用的和習知的。較佳地，在本發明中使用不具有氧乙烯單元的離子表面活性劑和非離子表面活性劑。不具有氧化烯單元的非離子表面活性劑的實例包括但不限於葡糖苷烷基醚、甘油烷基酯、椰油醯胺單乙醇胺(椰油醯胺MEA)、椰油醯胺二乙醇胺(椰油醯胺DEA)、月桂基二甲基氧化胺等。
如上所述，本發明人發現生物活性成分可以被修飾，使得生物活性成分可以更容易地被HSN包封，和/或對生物活性成分具有高親和力的分子可以在製備HSN的微乳液法中引入水相中。
在一個具體實例中，小生物活性成分用胺基酸序列修飾。特別地，序列中的胺基酸是可以帶正電荷的胺基酸。可以帶正電荷的胺基酸的實例包括但不限於精胺酸(R)、離胺酸(K)、組胺酸(H)，具有可帶正電荷的位置的非天然胺基酸等。
在一個具體實例中，胺基酸序列通過連接子與小生物性活成分連接。連接子較佳為酶可裂解的，諸如酶可裂解的胺基序列或酶可裂解的核苷酸序列。
在一個具體實例中，小生物活性成分用含巰基的分子修飾。
對要在微乳液法中引入到水相中的生物活性成分具有高親和力的物質、分子或顆粒的實例包括但不限於具有雙硫鍵的物質、分子或 顆粒，例如鄰二硫吡啶(OPSS)基團，例如OPSS-PEG-NHS，3-(2-吡啶基二硫)丙醯肼，磺基-LC-SPDP(磺基琥珀醯亞胺基6-(3'-(2-吡啶基二硫代)丙醯胺基)己酸酯)，具有巰基氯基團(thiolcholoride group)、芳烴亞磺醯胺基、硫脲鹽或巰基的物質、分子或顆粒等。
實施例
提供以下實施例以使本發明對本發明所屬技術領域的通常知識而言更容易理解，但並不意圖限制本發明的範圍。
材料、方法和測試模型
穿透式電子顯微鏡法(TEM)
使用穿透式電子顯微鏡法(TEM)直接檢查並驗證二氧化矽奈米顆粒的外觀。在75-100kV的加速電壓下運行的Hitachi H-7100穿透式電子顯微鏡上拍攝TEM照片。將分散在乙醇或水中的樣品滴在碳塗覆的銅網格上，並在空氣中乾燥以進行TEM觀察。
動態光散射(DLS)
在瑪律文奈米細微性電位儀(Malvern Zetasizer Nano SZS)(瑪律文，英國)上，使用動態光散射(DLS)進行二氧化矽奈米顆粒在不同溶液環境中的尺寸測量。在室溫下分析在不同溶液中形成的(溶劑化的)粒徑：H2O，含有10% FBS的達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)，PBS緩衝液(pH 7.4)和5%葡萄糖。
OPSS-二氧化矽奈米顆粒
合成過程：在第一步，將85.2μL APTMS+253.2μL OPSS-連接子(50mg OPSS-PEG-NHS，200/mL，在DMSO中)混合在一起，然後在37℃下攪拌過夜。為了分離APTMS-連接子-OPSS，將 ProElutTM C18管用3-5mL甲醇沖洗，然後用3-5mL去離子水沖洗。將混合物從100% DMSO稀釋至10% DMSO溶液。將APTMS/APTMS-連接子-OPSS混合物裝載至管的頂部，然後用1mL 10% ACN洗滌以除去游離的APTMS試劑。用1.5mL甲醇洗脫樣品，得到APTMS-連接子-OPSS。最後，通過旋轉蒸發濃縮APTMS-連接子-OPSS溶液，並通過HPLC定量原液。
將20mL癸烷、3.5mL Igepal CO-520和1.1mL己醇混合在一起，然後加入1.2mL DI水。將混合物在20℃下攪拌20分鐘，以形成反相微乳液體系。引入50μL稀釋的APTMS(用DI水8X稀釋)和200μL TEOS，然後攪拌20分鐘。之後，向體系中加入500μL 28% NH4OH。將溶液在20℃下混合11分鐘，然後加入65μL稀釋的APTMS(用去離子水8X稀釋)和260μL TEOS，然後在20℃下攪拌過夜。為了在顆粒表面修飾APTMS-連接子-OPSS，向體系中加入15μL TEOS和ATMPS-連接子-OPSS(4.2mg)，並將體系攪拌過夜。將10mL乙醇引入溶液中以破壞微乳液體系，然後以14000rpm離心15分鐘，得到OPSS-二氧化矽奈米顆粒。將沉澱用乙醇洗滌兩次，然後離心以除去洗滌溶劑。用80mL去離子水在50℃下將OPSS-二氧化矽奈米顆粒洗滌1小時，以除去殘留試劑並使顆粒變為空心。將沉澱用水洗滌兩次，然後離心以除去洗滌溶劑。在上述合成過程之後，獲得OPSS-二氧化矽奈米顆粒。
HSN中蛋白質的定量
通過兩種方法定量HSN中的蛋白質的量：(1)酶活性或(2)螢光相關光譜法。
通過酶活性方法定量蛋白質@HSN：如果包封於HSN中的 蛋白質為酶，HSN中的蛋白質的量可以從蛋白質@HSN的酶活性推導。
ASNase@HSN定量：通過納氏(Nessler)試劑測定ASNase活性，該試劑購自默克公司(Merck)。首先，將100μL的0.05M Tris-HCl(pH=8.6)和850μL的0.02M L-天冬醯胺混合，加入50μL 1.5M三氯乙酸(TCA)作為空白，並加入50μL D.I水作為樣品。接著，將50μL的ASNase@HSN原液加入到混合物中，在37℃下溫育50分鐘。之後，取50μL溫育的樣品與100μL納氏試劑混合，再加入2.5μL TCA用於測試樣品以淬滅反應，並將混合物在室溫下靜置10分鐘。最後，通過在480nm處的吸光度測定100μL樣品的活性。
過氧化氫酶@HSN定量：通過H2O2測定法測定過氧化氫酶活性。將約40μg CAT@HSN分散在50μL D.I水中並與50μL的25μM H2O2混合。將它們在黑暗中在37℃溫育12分鐘以進行反應。之後，將混合物離心以收集上清液，並與由5μL AmplexRed試劑、10μL 10單位/mL HRP和485μL 50mM磷酸鹽緩衝液(pH=7.4)構成的100μL稀釋的AmplexRed®試劑(A22188，英傑公司(Invitrogen))在室溫下混合10分鐘，以檢測剩餘的H2O2。然後通過在530nm激發後在585nm的螢光發射來測量樣品。根據已知的H2O2濃度，用標準曲線估算過氧化氫酶@HSN活性。
辣根過氧化物酶(HRP)@HSN定量：通過過氧化物酶測定法測定HRP活性。在室溫下將50μL HRP@HSN與700μL磷酸鈉緩衝液(SPB)(0.05M，pH=7.8)和750μL鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)溶液(50mL SPB中的20mgOPD，與167μL H2O2，pH=7.8)混合1小時。然後，將100μL樣品與1M磷酸充分混合以終止反應，並通過在490nm處的吸光度測 量混合物溶液以用於活性測定。
通過螢光相關光譜法(FCS)的蛋白質@HSN定量：利用具有543nm綠鐳射的共焦鐳射掃描顯微鏡(PicoQuant Microtime 200)，還通過FCS測定HSN中包封的蛋白質的數量。螢光染料接合蛋白質用於蛋白質@HSN的合成和隨後的檢測。將體積為100μL的樣品溶液置於載玻片上，然後用543nm鐳射激發螢光染料，並通過光電二極體檢測螢光計數率。測量過程可以分為三個階段。首先，測量FCS鐳射的焦體積是擬合相關函數的一個因素。在此，使用具有已知擴散係數(共焦體積中的平均停留時間)的游離染料R6G來測量計數率，然後測定543nm鐳射的焦體積。基於以上內容，檢測RITC的計數率以知曉RITC被激發時釋放的光子數。其次，通過測量不同濃度的RITC接合蛋白質，推導出RITC接合蛋白質的計數率，以確定濃度與計數率之間的相關性。其應該是線性相關的。最後，通過543nm鐳射對RITC蛋白質@HSN進行了測量，得到計數率，從而估算HSN中包封了多少蛋白質。
蛋白酶耐受性測定
將400μL 2x10-3mg/mL蛋白酶混合物溶解在10mM NaOAc和5mM CaOAc(pH=7.5)中。然後，將蛋白質@HSN溶解在1mL H2O中並與蛋白酶溶液混合。在30下溫育30分鐘後，取反應溶液用於通過酶活性測定法測定溶液中剩餘蛋白質的量。
通過ELISA測定抗原@HSN誘導的IgG抗體
採用酵素免疫法(ELISA)檢測抗原@HSN誘導的抗原特異性抗體。將96孔板在4℃下用0.05M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(pH=9.5)中的100μL 10μg/mL抗原溶液包被20小時。接下來，將孔中的溶液排出，向 孔中加入300μL含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的0.1M PBS(pH=7.2)，並將96孔板在室溫下在定軌搖床上振搖1.5小時以洗去未吸附的抗原。之後，將100μL在0.05%Tween-20 PBS中的1600倍稀釋的小鼠血漿加入板中，並在室溫下溫育1小時或在4℃溫育過夜。溫育後，將孔用PBS洗滌兩次，然後加入100μL稀釋的第二抗體(1：10000[HRP接合的第二抗體]或1：200[螢光染料接合的第二抗體])並在室溫下溫育1小時。如果使用螢光染料接合的第二抗體進行檢測，則通過在560nm激發下在660nm處的螢光發射來測量樣品。如果用HRP接合的第二抗體進行檢測，則將樣品與100μL新鮮底物溶液混合，該新鮮底物溶液含有在0.1M檸檬酸鹽緩衝液(pH=6.0)和167μL H2O2中的20mg OPD，並在室溫下溫育30分鐘，之後，加入100μL 1M磷酸以終止反應，並取100μL樣品用於通過分光光度計在490nm下測量吸光度。
Her2_4T1細胞系構建
通過慢病毒顆粒感染，利用luc_4T1細胞構建表現Her2的4T1細胞。將慢病毒載體CHL0042(其對博來黴素(zeocin)和具有EcoRI-AmCyan-XhoI的pcDNA3.1(+)_NheI-HER2-HindIII具有抗性)消化，並通過限制性內切酶和連接酶將其與慢病毒載體連接，產物命名為plenti-zeo-HER2。按照標準磷酸鈣轉染方案進行病毒包裝：將10μg plenti-zeo-HER2質粒、9μg pCMV-△8.91質粒和2.5μg水皰性口炎病毒G蛋白(VSVG)質粒與含有2.5M CaCl2的HEBS(HEPES，NaCl，右旋糖，KCl和Na2HPO4)混合，在室溫下溫育20分鐘，並在10cm培養皿中逐滴加入製備的2x106 HEK293T細胞中以製備慢病毒顆粒。20小時後用新鮮培養基替換培養基，轉染72小時後收集含有病毒的上清液。接下來，收集病毒溶 液並將其加入到製備的靶細胞(luc-4T1)中，在8ng/ml聚凝胺的存在下溫育48小時以感染靶細胞。最後，將細胞與100μg/mL博來黴素溫育14天以選擇Her2-luc轉染的4T1細胞系。以抗Her2/ERBB2(cat.10004-RP04，義翹神州(Sino Biological))作為第一抗體和Alex fluor 488山羊抗小鼠IgG作為第二抗體的，通過IFC染色確認Her2蛋白表現。
Her2_ECD蛋白表現
從金斯瑞(Genescript)購買Her2表現載體pET24-hHER2ECD op的胞外結構域，並將其轉化至BL21細胞中以產生Her2_ECD蛋白。在37℃用0.5mM的IPTG誘導大腸桿菌(E.coli)(BL21)中Her2_ECD蛋白過表現4小時。溫育後，通過離心收集BL21。接下來，將細胞在10%甘油PBS中在4℃下進行超聲處理以破碎細胞，並將溶液離心以收集沉澱，沉澱中富含Her2_ECD蛋白包涵體。向沉澱中加入1.5%肌胺酸以溶解Her2_ECD蛋白，並在4℃下振盪過夜，然後通過離心收集富含蛋白質的上清液。將蛋白質溶液過濾並利用His-tag柱(HisTrap FF，通用電氣(GE))通過FPLC(AKTA純，通用電氣)用200mM咪唑磷酸鹽緩衝液(0.05M NaH2PO4，0.3M NaCl，pH=8)在4℃下純化。純化的蛋白質通過SDS-PAGE和使用抗Her2/ERBB2抗體(10004-RP04，義翹神州)的蛋白質印跡進行表徵，並通過奈米光度計(N60，IMPLEN)進行定量。
CD8+T細胞分析方法中的IFN-γ表現
在第1天、第8天和第15天，用相同量的新抗原(NeoAg)或NeoAg@HSN免疫雌性C57BL/6小鼠(6-8周)。在不同的天數從經過疫苗接種的小鼠收集約300μL的外周血。外周血單個核細胞(PBMC)通過Histopaque®1083分離並轉移至96孔板中的200μL T細胞培養基(補充有 10% FBS、100UmL-1青黴素/鏈黴素(penn/strep)、55μM β-巰基乙醇、1 x MEM非必需胺基酸溶液和1mM丙酮酸鈉的RPMI 1640)。為了進行肽再刺激，將PBMC用各種抗原表位(20μg/mL)處理2小時。隨後，通過向培養液中加入GolgePlug來終止細胞因數分泌，再溫育4小時。將細胞沉澱並用抗CD16/CD32在室溫下染色10分鐘，然後將細胞用抗CD8-FITC或抗CD4-FITC在室溫下染色20分鐘。洗滌細胞，隨後使用50μL 2%甲醛溶液固定過夜。第二天，將細胞洗滌並在室溫下在50μL 0.5%皂苷中滲透15分鐘，然後將細胞洗滌並用抗IFNγ-APC染色20分鐘。最後，將染色的細胞沉澱並重懸於200μL緩衝液中，並使用流式細胞術(貝登(BD)FACSCanto II)進行分析。
合成實施例1
蛋白質@HSN的合成
天冬醯胺酶(ASNase)@HSN的合成：將作為油的20mL癸烷、作為表面活性劑的3.5mL CO-520、作為助表面活性劑的1.1mL己醇和2mg ASNase溶解在700μL 1.43mg/mL NaF和500μL 10mg/mL NaF中。將上述所有物質混合以產生反相微乳液體系。然後，將一部分二氧化矽源、50μL用乙醇稀釋8倍的APTMS和200μL TEOS加入到體系中，將其在20℃連續攪拌。1小時後，將另一部分二氧化矽源、50μL稀釋的APTMS和200μL TEOS加入到體系中，在20℃下連續攪拌20小時。攪拌過夜後，將500μL氫氧化銨(aq)(2.24-2.4重量%)緩慢加入到混合物中，同時攪拌20分鐘。接下來，向混合物中逐滴加入50μL TEOS，將其攪拌4小時，然後加入250μL PEG-矽烷和25μL TEOS，並在20℃下攪拌20小時以修飾顆粒表面。之後，加入95%乙醇以使微乳液體系不穩定，並通過 在14000rpm下離心20分鐘收集顆粒。將顆粒用95%乙醇洗滌一次，並用D.I水洗滌兩次，並轉移到80mL D.I水中。然後，將溶液保持在40℃下並攪拌1小時以獲得ASNase@HSN。最後，通過離心收集ASNase@HSN，用D.I水洗滌兩次，並儲存在4℃的D.I水中。
辣根過氧化物酶(HRP)@HSN合成：HRP@HSN的合成過程與ASNase@HSN的描述相同，但是用2.67mg HRP代替酶2mg ASNase。
過氧化氫酶@HSN合成：將作為油的20mL癸烷、作為表面活性劑的3.5mL CO-520、作為助表面活性劑的1.1mL己醇以及50000單位過氧化氫酶溶解在1200μL 10mg/mL NaF中。將上述所有物質混合以產生反相微乳液體系。然後，將一部分二氧化矽源、50μL用D.I水稀釋8倍的APTMS和200μL TEOS加入體系中，在20℃下連續攪拌。2小時後，加入250μL 8.5mM氫氧化銨(aq)並攪拌20分鐘；然後，將另一部分二氧化矽源、50μL稀釋的APTMS和200μL TEOS加入體系中，將其在20℃下攪拌20小時。攪拌過夜後，將100μL氫氧化銨(aq)(5.6-6重量%)緩慢地引入到混合物中，同時攪拌10分鐘。接下來，向混合物中逐滴加入50μL TEOS並攪拌2小時，然後加入250μL PEG-矽烷和25μL TEOS並在20℃下攪拌20小時以修飾顆粒表面。之後，加入95%乙醇以使微乳液體系不穩定，並通過在14000rpm下離心20分鐘收集顆粒。將顆粒用95%乙醇洗滌一次，並用D.I水洗滌兩次，並轉移到80mL D.I水中。然後，將溶液保持在40℃並攪拌1小時以獲得過氧化氫酶@HSN。最後，通過離心收集過氧化氫酶@HSN，用D.I水洗滌兩次，並儲存在4℃的D.I水中。
TEM和DLS測量
對實施例1中合成的蛋白質@HSN奈米顆粒進行TEM測量，結果表明，所有蛋白質@HSN具有約50至95nm的平均粒徑和小的細微性標準差，這反映了顆粒的均勻性。通過動態光散射(DLS)測量了蛋白質@HSN在不同溶液環境中的粒徑。DLS結果顯示，蛋白質@HSN在水、PBS和含血清的培養基中在約60至約100nm的範圍內良好分散。
蛋白質@HSN的定量
包封於二氧化矽奈米顆粒中的蛋白質的量為約1%-7%(重量百分比)。使用上述方法學，定量結果源自酶活性或螢光相關光譜法。
蛋白酶耐受性測定
為了確定本文公開的HSN對包封於其中的ASNase免受蛋白酶降解的保護作用，對游離的ASNase或包封於HSN(NTT3_39)中的ASNase進行蛋白酶消化，並通過ASNase活性測定法來確定剩餘的ASNase活性。因此，進行蛋白酶耐受性測試以評估HSN對包封於其中的ASNase的保護作用。
將游離ASNase和包封於HSN(NTT3_39)中的ASNase(均含有相同量的ASNase)離心並分散在1mL PBS緩衝液(pH7.5)中，與400μL蛋白酶溶液(2×10-3mg蛋白酶/mL，在10mM NaOAc+5mM CaOAc(pH7.5)中)混合，並在37℃下進行蛋白酶消化30分鐘。在消化後，通過ASNase活性測定法測定樣品中的ASNase活性。可以清楚地觀察到，在用蛋白酶混合物降解30分鐘後，游離ASNase的活性降低至低於原始活性的20%。然而，包封ASNase的NTT3_39表現出優異的保護作用。結果表明，一旦懸浮於溶液中，蛋白質(抗原)將被蛋白酶快速降解。因此，如果蛋白質通過非共價鍵附著於奈米顆粒，一旦顆粒被注射到體內，蛋白質將 開始從顆粒洩漏出來，導致降解。HSN內包封的抗原能夠提供優異的蛋白酶保護。
HSN淋巴結靶向
誘導適應性免疫的效率在很大程度上取決於免疫系統特別是淋巴結的適當靶向。淋巴結是抗原特異性T細胞被啟動和致敏的部位。使用奈米顆粒將抗原直接遞送到淋巴結將改善抗原特異性免疫反應的功效和安全性。對於開發具有淋巴結靶向能力的HSN，HSN的大小和在溶液中的懸浮很重要。將近紅外螢光發射染料(cy5.5)接合的HSN(尺寸為約50-100nm(通過TEM檢測)，並且在水和緩衝液中單分散)皮下注射到小鼠的後足墊中，並通過IVIS在不同時間點檢測HSN的生物分佈以探索HSN的淋巴結靶向能力。Cys5.5-HSN首先集中在注射部位，並在淋巴結中持續長達7天。在給藥後第7天，將小鼠解剖，並且在腹股溝淋巴結、膕窩淋巴結、髂淋巴結和腎淋巴結處存在顯著的螢光信號(圖1)。這一結果表明，HSN的較小尺寸和良好的懸浮表現出淋巴結靶向能力，這對於疫苗的抗原遞送媒介物是有利的。
蛋白質@HSN誘導免疫反應
用天冬醯胺酶包封的HSN(ASNase@HSN)(尺寸較小(約65nm)且在溶液中懸浮良好)來測試抗原特異性免疫反應。小鼠分別靜脈注射、皮下注射或肌肉注射20μg ASNase或具有相同蛋白量的ASNase@HSN的200μL PBS溶液，每週一次，共3周；在第17天收穫75-100μL血液，並通過ELISA測定法檢測血清的ASNase特異性抗體水準。ASNase免疫小鼠的血清未顯示ASNase特異性抗體信號。即使ASNase劑量是四倍時，也僅檢測到少量抗體。相反，與ASNase相比， ASNase@HSN誘導顯著量的ASNase特異性抗體(圖2)。不同的ASNase@HSN給藥途徑顯示相似水準的ASNase特異性抗體誘導。此外，與僅有抗原的組相比，用其它蛋白質諸如過氧化氫酶和辣根過氧化物酶作為抗原代替ASNase仍然顯示出強烈的免疫反應。因此，被HSN包封的抗原顯著增強了抗原的免疫原性，並允許各種給藥途徑。
Her2_4T1@HSN和HSN免疫治療
為了證明抗原@HSN作為癌症疫苗的潛力，選擇Her2胞外結構域蛋白作為抗原並包封於HSN中。為了證明Her2_ECD@HSN可以誘導免疫反應並抑制Her2相關的腫瘤細胞增殖，將Her2過表現的乳腺癌細胞皮下(s.c.)植入免疫活性BALB/c小鼠的脅腹中來構建動物模型。通過用編碼人Her2 cDNA的逆轉錄病毒載體轉導乳腺癌細胞系4T1，產生過表現Her2的乳腺癌細胞系(Her2_4T1)。BALB/c小鼠每隔一周靜脈內接種Her2_ECD@HSN三次。在第三次疫苗接種後一天，將Her2_4T1細胞皮下植入小鼠的脅腹，並且每週兩次監測腫瘤大小。與對照組相比，接種Her2_ECD@HSN的小鼠顯示出對腫瘤生長的顯著抑制(圖3)，且血漿中抗Her2_ECD抗體的量也高於對照組。這一結果表明，Her2_ECD@HSN可以成功誘導Her2特異性適應性免疫反應，以抑制腫瘤增殖。這證實了HSN包封的抗原可以提高免疫原性和免疫治療功效。
根據上述免疫治療結果，抗原@HSN可以顯著增強免疫反應，因為HSN可以同時為載劑和自身佐劑。本發明中HSN的較小尺寸和良好懸浮給予諸如淋巴結靶向、腫瘤靶向(EPR作用)和自身免疫原性(自身佐劑)之類的特性。這些特性允許HSN潛在地用於另一種抗腫瘤生長的治療方法中，其中將HSN顆粒(無抗原包封)靜脈內施用到體內；顆粒能夠在 淋巴結和腫瘤中積累。之後，因為具有自身佐劑性質的HSN在腫瘤中積累，HSN將局部誘導免疫反應，並同時調節腫瘤微環境。增強免疫反應可激發抗腫瘤免疫，以抑制腫瘤生長。為了證明這一概念，在腫瘤植入後的第3、10、17天，在脅腹給小鼠皮下植入Her2_4T1細胞，並通過靜脈內施用HSN進行治療。與對照組相比，用HSN治療的小鼠腫瘤體積較小。還測試了HSN在4T1腫瘤動物模型中的抗腫瘤功效，其顯示HSN可抑制4T1腫瘤生長(圖4)。相反，根據先前的實驗，在僅用MSN(無藥物)治療的小鼠中腫瘤生長未被抑制。這些結果表明，HSN具有不同於其它二氧化矽奈米顆粒的一些特殊且獨特的特性，使得HSN表現出更高的免疫原性和免疫治療功效。
HSN在腫瘤中誘導局部免疫反應
攜帶4T1腫瘤的小鼠接種不同種類的HSN，每隔一周接種一次，接種三次，最後一次接種後一天，收集脾、淋巴結和腫瘤並消化用於後續的免疫細胞染色。接種HSN的小鼠脾和淋巴結中的免疫表型與對照組小鼠相似，相反，腫瘤中的CD8a+細胞、F4/80細胞和CD11c細胞數量增加，這說明細胞毒性T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞在腫瘤周圍募集(圖5)。這些結果表明，HSN的較小尺寸和良好的懸浮可以通過EPR效應在腫瘤中積累並募集腫瘤周圍的免疫細胞，從而增強腫瘤部位的腫瘤浸潤免疫細胞並抑制腫瘤生長，而無全身性不良反應。
新抗原@HSN的合成和提高包封肽的二氧化矽奈米顆粒的負載能力的方法
新抗原是一類由腫瘤特異性突變產生的HLA結合肽。它們可用作癌細胞從正常細胞分化的生物標誌物。因此，新抗原肽是開發腫瘤 免疫治療抗原@HSN的良好抗原。用上述合成蛋白質@HSN的方法並將蛋白質替換為新抗原肽，來合成NeoAg@HSN。然而，出人意料地發現，肽不能有效地包封於HSN中。在微乳液去穩定化過程中，大多數新抗原肽懸浮在上清液中，而在HSN中幾乎檢測不到。這種出人意料的結果可能是由於以下事實：肽通常由疏水性和親水性胺基酸殘基組成；肽的兩親性可導致肽與含有聚乙二醇的表面活性劑(諸如IGEPAL®CO520，Triton X-100和Tween20)之間發生強烈的相互作用。這些類型的非離子表面活性劑通常用於反相微乳液體系中。為了解決這一問題，提出了三種提高二氧化矽奈米顆粒的肽負載能力的方法：(1)將反相微乳液中使用的含聚乙二醇的表面活性劑替換為不含氧化烯單元的表面活性劑或離子型表面活性劑(諸如磺基琥珀酸二辛酯鈉鹽(AOT)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB))；(2)設計該肽是為了降低肽的兩親性，並增加肽與二氧化矽分子之間的相互作用，以使肽更易於被二氧化矽分子包圍，並易於被二氧化矽奈米顆粒包裹。通過在肽序列之前、之後或兩側添加多電荷基序，並在多電荷基序與肽序列之間插入酶可裂解序列來設計肽；(3)將對新抗原肽具有親和力的分子或顆粒加入微乳液的水相中，以提高肽的包封效率，諸如1、帶正電荷的新抗原與帶負電荷的分子之間的靜電相互作用；2、疏水性新抗原與帶電荷較少或不帶電荷的分子之間的凡得瓦爾相互作用；以及3、在新抗原和分子之間的可裂解共價鍵，包括二硫鍵、酶可裂解序列、酸可裂解部分。在加入到微乳液的水相中之前，分子和新抗原可以是單獨的或預先混合的。分子可以是矽烷、聚合物、樹枝狀大分子或二氧化矽奈米顆粒。利用設計的新抗原肽可以成功合成NeoAg@HSN(在一個具體實例中，在原始新抗原肽的N末端添加聚精胺酸序列和酶可裂解序列。在一個具體實例 中，在原始新抗原肽的N末端添加巰基胺基酸)且NeoAg@HSN中肽的量是可檢測的。
正電荷修飾的新抗原@HSN的合成
合成過程：將20mL癸烷、3.5mL CO-520和1.1mL己醇混合，然後將溶解於350μL D.I水、250μL 10mg/mL NaF和25μL稀釋的APTMS中的1-2mg正電荷部分修飾的新抗原的水相溶液加入油相，同時攪拌30分鐘，得到微乳液體系；然後向體系中加入100μL TEOS並攪拌1小時。之後，加入25μL稀釋的APTMS和100μL TEOS並在20℃下攪拌18小時。第二天，加入500μL 28-30重量%NH3(aq)和100μL TEOS並在20℃下攪拌4小時，然後，加入250μL PEG-矽烷、25μL TEOS並在20℃下攪拌16-18小時。第三天，通過加入2倍體積的95%乙醇使微乳液體系不穩定並在14000rpm下離心20分鐘來收集顆粒。將顆粒用95%乙醇洗滌兩次，並用D.I水洗滌一次，並轉移至80mL D.I水中。然後，將溶液保持在40℃下並攪拌1小時以除去多餘的殘餘物。最後離心收集新抗原@HSN並用D.I水洗滌兩次。新抗原@HSN中新抗原的負載量高於1%重量百分比，並且通過TE和MDLS測量的粒徑示於表1中。
Figure 109124259-A0305-02-0029-1
巰基部分修飾抗原@HSN的合成
合成方法有兩個步驟。1、巰基部分修飾的抗原與含有鄰 二硫吡啶(OPSS)的二氧化矽奈米顆粒混合，以在抗原和二氧化矽顆粒之間產生二硫鍵。2、將Ag-二氧化矽奈米顆粒溶液作為水相引入微乳液體系中合成抗原@HSN。
1.抗原和OPSS-二氧化矽奈米顆粒的混合物
將50mg OPSS-二氧化矽奈米顆粒分散在6.3-7mL DI水中，然後向溶液中加入375μL乙酸鹽緩衝液(100mM，pH4.2)酸性緩衝液或375μL NaH2PO4(100mM，pH6.5)和750μL NaOH(25mM)鹼性緩衝液。將溶液攪拌至均勻，並加入75-150μL抗原溶液(10-20mg/mL)。在4℃或室溫下保持攪拌1-3天。之後，用含有0.025%TFA和水的20% ACN/DMSO洗滌顆粒。將溶液離心以獲得顆粒，並通過HPLC分析上清液以測定抗原負載量。
2.巰基部分修飾抗原@HSN的合成
將37.5mL癸烷、6.56mL Igepal CO-520和2.06mL己醇混合在一起，並在20℃下攪拌。向混合物中加入2250μL抗原-二氧化矽奈米顆粒(50mg/2250μL)作為水相，然後在20℃下攪拌10分鐘。將37.6μL 8倍稀釋的APTMS、150μL TEOS和83.34μL 28% NH4OH引入混合物中，在20℃℃攪拌10分鐘。之後，向混合物中加入37.6μL 8倍稀釋的APTMS、150μL TEOS和83.34μL 28% NH4OH，在20℃下攪拌4小時。然後，向混合物中加入37.6μL TEOS和375.2μL PEG-矽烷，並在20℃下攪拌過夜。向溶液中引入20mL乙醇以破壞微乳液體系，並在14000rpm下離心15分鐘以獲得抗原@HSN顆粒。將顆粒用乙醇和水洗滌兩次，並儲存在水中。粒徑(TEM)小於100nm，並且在PBS中通過DLS測量的顆粒的流體動力學尺寸小於150nm。
NeoAg@HSN免疫原性(在CD8+T細胞中的IFN-γ表現)和免疫治療
在第1天、第8天和第15天，分別用NeoAg溶液(含有50μg MC38_mS或MC38_mL新抗原肽，有或沒有50μg聚IC)和NeoAg@HSN溶液(MC38_mS@HSN或MC38mL@HSN溶液，其含有50μg新抗原肽，有或沒有50μg聚IC)免疫雌性C57BL/6小鼠(6-8周)。在第28天和第35天，從經過疫苗接種的小鼠收集約300μL外周血。檢測CD8 T細胞中IFN-γ表現的方法如上所述。與用MC38_mS或MC38_mL肽免疫的小鼠相比，用MC38_mS@HSN或MC38_mL@HSN免疫的小鼠在CD8 T細胞中顯示出顯著更高的IFN-γ表現(圖6)。這一結果表明，HSN可以作為載劑和自身佐劑，以增強新抗原肽的免疫原性。免疫接種結果顯示，每隔一周用NeoAg@HSN免疫，免疫三次的小鼠中抑制了MC38腫瘤的生長，而用NeoAg肽+聚IC(佐劑)免疫的小鼠中腫瘤大小與對照組相近。

Claims (19)

  1. 一種空心二氧化矽奈米球(HSN)用於製備抑制有需要的受試者(subject)中的腫瘤生長的藥劑之用途，其中該藥劑係用於該受試者，從而增加腫瘤中的腫瘤浸潤免疫細胞，其中該HSN包含單層或多層二氧化矽殼，其中每個殼具有介孔並包封封閉空心空間，最內封閉空心空間任選地具有固體二氧化矽核，其中該空間由任意兩個二氧化矽殼或該固體二氧化矽核之間的距離界定，並且其中通過動態光散射DLS測量的於介質中的HSN的流體動力學尺寸不大於150nm，其中該介質在生物學上類似於或等同於磷酸鹽緩衝鹽水PBS。
  2. 如請求項1之用途，其中該HSN的流體動力學尺寸不大於100nm。
  3. 如請求項1之用途，其中HSN的施用途徑為全身施用或局部施用。
  4. 如請求項3之用途，其中該全身施用為靜脈內注射或輸注。
  5. 一種空心二氧化矽奈米球(HSN)用於製備誘導有需要的受試者(subject)中的免疫反應的藥劑之用途，其中該藥劑係用於該受試者，其中該HSN包含單層或多層二氧化矽殼，其中每個殼具有介孔並包封封閉空心空間，最內封閉空心空間任選地具有固體二氧化矽核，其中該空間由任意兩個二氧化矽殼或該固體二氧化矽核之間的距離界定，並且其中通過動態光散射DLS測量的於介質中的HSN的流體動力學尺寸不大於200nm，其 中該介質在生物學上類似於或等同於磷酸鹽緩衝鹽水PBS。
  6. 如請求項5之用途，其中該HSN係作為佐劑使用。
  7. 如請求項5之用途，其中該HSN包含包封於該HSN中的小生物活性成分，其中該生物活性成分被修飾以具有結構Z(c)-Y(n)-X(a)-SBI-X(b)-Y(m)-Z(d)，其中Z為含有巰基的分子，Y為帶正電荷的肽，X為酶可裂解序列，SBI為小生物活性成分，並且a、b、c、d、m和n中的每一個均為整數，其中c、d、m和n中至少一個不為零。
  8. 一種空心二氧化矽奈米球(HSN)共軛物，其包含HSN和包封於該HSN中的小生物活性成分，其中該HSN包含單層或多層二氧化矽殼，其中每個殼具有介孔並包封封閉空心空間，最內封閉空心空間任選地具有固體二氧化矽核，其中該空間由任意兩個二氧化矽殼或該固體二氧化矽核之間的距離界定，及其中該介孔之孔徑小於該小生物活性成分之尺寸，並且其中通過動態光散射DLS測量的於介質中的HSN的流體動力學尺寸不大於200nm，其中該介質在生物學上類似於或等同於磷酸鹽緩衝鹽水PBS，及其中該小生物活性成分為抗原或新抗原(neoantigen)。
  9. 如請求項8之HSN共軛物，其中該小生物活性成分為新抗原(neoantigen)。
  10. 如請求項9之HSN共軛物，其中該新抗原為腫瘤特異性新抗原。
  11. 如請求項9之HSN共軛物，其中該新抗原為腫瘤特異性新抗原、腫瘤新表位、腫瘤特異性新抗原、腫瘤新表位、新抗原肽、新抗原DNA或新抗原RNA。
  12. 如請求項8之HSN共軛物，其中該小生物活性成分被修飾以具有結構Y(n)-X-SBI-[X-Y(m)](r)，其中Y為帶正電荷的肽，X為酶可裂解序列，SBI為小生物活性成分，並且m、n和r中的每一個均為整數，其中n和m×r中至少一個不為零。
  13. 如請求項8之HSN共軛物，其中該小生物活性成分被修飾以具有結構Y(n)-X(a)-SBI-X(b)-Y(m)，其中Y為帶正電荷的肽，X為酶可裂解序列，SBI為小生物活性成分，並且n、m、b和a中的每一個均為整數，其中n和m中至少一個不為零。
  14. 如請求項8之HSN共軛物，其中該小生物活性成分被修飾以具有結構Z(c)-Y(n)-X(a)-SBI-X(b)-Y(m)-Z(d)，其中Z為含有巰基的分子，Y為帶正電荷的肽，X為酶可裂解序列，SBI為小生物活性成分，並且a、b、c、d、m和n中的每一個均為整數，其中c、d、n、m中至少一個不為零。
  15. 一種疫苗組合物，其包含如請求項8至14中任一項之HSN共軛物。
  16. 一種如請求項8至14中任一項之HSN共軛物之用途，其係用於製備將 小生物活性成分遞送到受試者(subject)的藥劑或載劑，其中該藥劑或載劑係用於該受試者。
  17. 一種如請求項8至14中任一項之HSN共軛物之用途，其係用於製備在免疫治療中將抗原或新抗原遞送到受試者(subject)的藥劑或載劑，其中該藥劑或載劑係用於該受試者，其中抗原或新抗原被包封於該HSN中。
  18. 如請求項17之用途，其中該新抗原為腫瘤特異性新抗原、腫瘤新表位、腫瘤特異性新抗原、腫瘤新表位、新抗原肽、新抗原DNA或新抗原RNA，其中該抗原為病毒抗原、細菌抗原或微生物抗原。
  19. 一種用於產生於其中包含一或多種小生物活性成分的空心二氧化矽奈米顆粒的方法，其包含以下步驟：(a)提供包含油相、表面活性劑、烷氧基矽烷和/或矽酸鹽源、含有一或多種小生物活性成分的水相以及任選的助表面活性劑的組合物，其中該小生物活性成分為抗原或新抗原(neoantigen)；(b)由步驟(a)中所描述的組合物形成油包水W/O微乳液；(c)向(b)的該W/O微乳液中加入起始劑，以形成封裝該一或多種生物活性成分的HSN；(d)執行去穩定條件以使該W/O微乳液不穩定，並收集由該微乳液如此形成的所得顆粒；以及(e)將步驟(d)中所收集的該顆粒分散於含水洗滌相中，得到該二氧化矽奈米顆粒；及 該方法進一步包含以下特徵中的至少一個：(i)該表面活性劑為離子型；(ii)該一或多種生物活性成分在使用前被胺基酸序列修飾，其中該序列中的胺基酸為帶正電荷或含有巰基的胺基酸；以及(iii)將對該一或多種生物活性成分具有親和力的物質引入步驟(a)中的該水相中。
TW109124259A 2019-07-18 2020-07-17 用於免疫治療的二氧化矽奈米球 TWI829949B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962875842P 2019-07-18 2019-07-18
US62/875,842 2019-07-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202116292A TW202116292A (zh) 2021-05-01
TWI829949B true TWI829949B (zh) 2024-01-21

Family

ID=71670078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109124259A TWI829949B (zh) 2019-07-18 2020-07-17 用於免疫治療的二氧化矽奈米球

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210015943A1 (zh)
EP (1) EP3766515A1 (zh)
JP (1) JP2021042193A (zh)
CN (1) CN112237627A (zh)
CA (1) CA3087227A1 (zh)
TW (1) TWI829949B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114377120B (zh) * 2022-01-10 2023-09-22 大连理工大学 一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统的构建及其应用
CN114601817B (zh) * 2022-02-11 2023-01-10 国家纳米科学中心 一种可降解中空有机硅纳米粒子及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI611812B (zh) * 2014-08-07 2018-01-21 國立臺灣大學 氧化矽型生物分子載體、包含其之醫藥組成物、其製備方法及用途
TW201811370A (zh) * 2016-08-19 2018-04-01 國立臺灣大學 囊封有生物活性成分的空心二氧化矽奈米粒子、其製備方法和應用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009023697A2 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 The Regents Of The University Of California Hollow silica nanospheres and methods of making same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI611812B (zh) * 2014-08-07 2018-01-21 國立臺灣大學 氧化矽型生物分子載體、包含其之醫藥組成物、其製備方法及用途
TW201811370A (zh) * 2016-08-19 2018-04-01 國立臺灣大學 囊封有生物活性成分的空心二氧化矽奈米粒子、其製備方法和應用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
期刊 Dellacherie, Maxence O., et al. "Covalent conjugation of peptide antigen to mesoporous silica rods to enhance cellular responses." Bioconjugate chemistry 29 .3 (2018): 733-741. *
期刊 Wang, Xiupeng, et al. "Stimulation of in vivo antitumor immunity with hollow mesoporous silica nanospheres." Angewandte Chemie 128 .5 (2016): 1931-1935.; *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202116292A (zh) 2021-05-01
US20210015943A1 (en) 2021-01-21
CA3087227A1 (en) 2021-01-18
CN112237627A (zh) 2021-01-19
EP3766515A1 (en) 2021-01-20
JP2021042193A (ja) 2021-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6716600B2 (ja) Ｒｎａ及び水溶性の治療有効化合物を標的細胞に送達するための脂質粒子製剤
TWI705828B (zh) 囊封有生物活性成分的空心二氧化矽奈米粒子、其製備方法和應用
Meng et al. Two‐Pronged Intracellular Co‐Delivery of Antigen and Adjuvant for Synergistic Cancer Immunotherapy
TWI829949B (zh) 用於免疫治療的二氧化矽奈米球
FR2676072A1 (fr) Vecteur de delivrance d&#39;arn.
EA023397B1 (ru) Комбинированные вакцины с синтетическими наноносителями
EP2755680B1 (en) Particulate vaccine formulations
US20100143456A1 (en) Model membrane systems
Zhang et al. Nanovaccine’s rapid induction of anti-tumor immunity significantly improves malignant cancer immunotherapy
Cui et al. Coating of mannan on LPD particles containing HPV E7 peptide significantly enhances immunity against HPV-positive tumor
CN105792843B (zh) 佐剂组合物及包含其的疫苗组合物、以及它们的制造方法
KR20230002300A (ko) 지질 나노입자
CN109364243B (zh) 一种抗原热稳定乳液及其制备方法和应用
Zhou et al. Liposome-mediated cytoplasmic delivery of proteins: an effective means of accessing the MHC class I-restricted antigen presentation pathway
WO2016104690A1 (ja) 高密度リポタンパク質およびその細胞親和性ペプチドを融合した高密度リポタンパク質の点眼による後眼部薬物デリバリー
JP2023545886A (ja) 脂質ナノ粒子
JP7409594B2 (ja) 医薬組成物、規定のサイズの脂質ベシクル粒子を使用する調製物のための方法、及びそれらの使用
Chen et al. Smart combination of aluminum hydroxide and MF59 to induce strong cellular immune responses
Zhang et al. Self-adjuvanting photosensitizer nanoparticles for combination photodynamic immunotherapy
Liu et al. Exploiting immunostimulatory mechanisms of immunogenic cell death to develop membrane-encapsulated nanoparticles as a potent tumor vaccine
Hartmeier et al. Immune cells activating biotin-decorated PLGA protein carrier
Zamani et al. Improving potency of Nanoliposomal AE36 peptide vaccine by adding CD4+ T cell helper epitope and MPL in TUBO breast cancer mice model
US20220378936A1 (en) Delivery system complexes comprising a precipitate of an active agent and methods of use
Qin et al. Biogenetic Vesicle‐Based Cancer Vaccines with Tunable Surface Potential and Immune Potency
US11446390B2 (en) Antigen capturing nanoparticles for use in cancer immunotherapy