FR2676072A1 - Vecteur de delivrance d'arn. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un vecteur de délivrance d'ARN qui comprend un liposome et au moins un fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène, ledit au moins un fragment d'ARN étant encapsulé dans ledit liposome.
Description
La présente invention concerne des moyens destinés au transfert à l'intérieur d'une cellule d'un fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène ainsi qu'aux compositions pharmaceutiques les comprenant. La présente invention s'applique en particulier au domaine des vaccins.
D'une manière générale, la vaccination traditionnelle consiste à sensibiliser le système immunitaire d'un individu à un agent infectieux (bactérie, virus ou parasite). A cette fin, trois types de vaccins ont été proposés et développés selon les cas, de manière plus ou moins empirique: - Les vaccins inactivés (ou tués) obtenus à partir de bactéries ou de virus entiers qui
ont perdu leur infectivité grâce à des traitements chimiques; - Les vaccins vivants qui sont constitués par des bactéries ou des virus infectieux dont
ia virulence a été atténuée par mutagénèse ou par passages dans divers milieux qui
provoquent des mutations ; et - Les vaccins sous-unités, à base de toxines bactériennes ou d'antigènes d'agents
infectieux purifiés.
ont perdu leur infectivité grâce à des traitements chimiques; - Les vaccins vivants qui sont constitués par des bactéries ou des virus infectieux dont
ia virulence a été atténuée par mutagénèse ou par passages dans divers milieux qui
provoquent des mutations ; et - Les vaccins sous-unités, à base de toxines bactériennes ou d'antigènes d'agents
infectieux purifiés.
D'autre part' on a récemment proposé d'appliquer le principe des vaccins à la prévention des tumeurs malignes. En effet, la plupart des cellules tumorales expriment à leur surface des antigènes qui diffèrent soit qualitativement, soit quantitativement des antigènes présents à la surface des cellules normales correspondantes. Ces antigènes sont dits spécifiques lorsqu'ils sont uniquement exprimes par des cellules tumorales.
Lorsqu'ils sont présents à la fois sur des cellules normales et tumorales, ces antigènes
sont dits associés à la tumeur ; dans ce cas, ils sont présents soit en plus grande quantité,
soit sous une forme différente dans les cellules tumorales.
sont dits associés à la tumeur ; dans ce cas, ils sont présents soit en plus grande quantité,
soit sous une forme différente dans les cellules tumorales.
Une fois le vaccin administré, les cellules du système immunitaire reconnaissent les antigènes du germe étranger, réagissent spécifiquement à cette intrusion et gardent ces antigènes en mémoire ; elles protègeront l'organisme lors d'une infection ultérieure.
D'une manière générale il existe deux grands types de réponse immunitaire: la réponse de type humoral qui est caractérisée par la production d'anticorps par les lymphocytes B et la réponse immunitaire à médiation cellulaire qui met en jeu des cellules effectrices i.e., essentiellement les lymphocytes T8 (lymphocytes cytotoxiques). Ces réponses sont initialement activées par les cellules présentatrices d'antigènes et modulées par les cellules régulatrices i.e., les lymphocytes T4 (lymphocytes T helper) et les lymphocytes T suppresseurs.
Dans ses très grandes lignes, la réponse immunitaire fonctionne ainsi: - Les cellules présentatrices d'antigène (monocytes, macrophages et lymphocytes B)
capturent l'antigène, le digèrent et en réexposent des fragments à leur surface, en
association avec des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de
classe I ou II.
capturent l'antigène, le digèrent et en réexposent des fragments à leur surface, en
association avec des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de
classe I ou II.
- Les lymphocytes T4 stimulent la prolifération des lymphocytes B producteurs
d'anticorps et celle des lymphocytes T8 (lymphocytes T cytotoxiques ou CI L) quand
ils "voient" les fragrnents d'antigènes associés au complexe majeur
d'histocompatibilité de classe II.
d'anticorps et celle des lymphocytes T8 (lymphocytes T cytotoxiques ou CI L) quand
ils "voient" les fragrnents d'antigènes associés au complexe majeur
d'histocompatibilité de classe II.
- Les lymphocytes B produisent les anticorps qui vont interagir avec les antigènes
circulants de manière à les neutraliser.
circulants de manière à les neutraliser.
- Enfin les lymphocytes T8 détruisent les cellules infectées quand ils reconnaissent les
fragments d'antigènes associés au complexe majeur d'histocompatibilite de classe I.
fragments d'antigènes associés au complexe majeur d'histocompatibilite de classe I.
On pense actuellement que les vaccins doivent probablement induire à la fois une réponse humorale et à médiation cellulaire pour conférer une immunité solide et durable.
Parmi les types de vaccins cités ci-dessus, les vaccins vivants sont souvent les plus efficaces: ils activent simultanément les lymphocytes B, T4 et T8 en conférant un bon niveau d'immunité. De plus, comme ils se multiplient dans l'organisme, ils agissent à faibles doses et n'exigent généralement pas de rappel. Malheureusement, pour demeurer vivants, ces vaccins doivent généralement être conservés au froid. Le maintien de la chaîne du froid lors des transports est un facteur qui grève de façon nonnégligeable le coût de ces vaccins. Enfin, leur virulence qui est atténuée n'est pas nulle et ils induisent parfois des effets secondaires chez des sujets immunodéprimés. Plus grave encore, ils peuvent recouvrer leur virulence à la suite de mutations inverses, ce qui est rarissime mais proprement intolérable.
Les vaccins sous-unités n'ont pas ces défauts mais ils stimulent généralement moins bien les cellules immunitaires et nécessitent des adjuvants (des molécules qui renforcent leur pouvoir immunogène). Le vaccin contre l'hépatite B, constitué par l'antigène majeur de surface du virus, obtenu par la technologie de l'ADN recombinant, est un exemple de vaccin sous-unité développé avec succès. Toutefois, dans d'autres cas, les résultats ont été décevants.
On pense qu'un facteur limitant le succès des vaccins sous-unités réside dans le fait qu'ils ne sont pas capables d'induire une réponse immunitaire de type cellulaire suffisamment forte. Ceci résulte vraisemblablement de l'impossibilité pour certains antigènes d'être correctement processés et/ou pour leurs fragments, d'entrer en contact avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de classe L
En effet, I'association entre les molécules du MHC de classe I (qui participent à la réponse immunitaire de type cellulaire) et les fragments peptidiques a lieu dans le réticulum endoplasmique de la cellule. Pour cela, il faut donc, au préalable, que l'antigène parvienne jusque dans ce compartiment cellulaire.D'une façon générale, l'entrée dans ce compartiment se fait à partir du cytosol où les protéines sont synthétisées par traduction des ARN messagers correspondants. Le passage du cytosol au reticulum endoplasmique s'effectue grâce à deux types de mécanismes: - soit un mécanisme de sécrétion lorsque la protéine est synthétisée sous forme de
précurseur (mis en jeu d'un peptide signal), - soit un mécanisme de "pompe" à peptides.
En effet, I'association entre les molécules du MHC de classe I (qui participent à la réponse immunitaire de type cellulaire) et les fragments peptidiques a lieu dans le réticulum endoplasmique de la cellule. Pour cela, il faut donc, au préalable, que l'antigène parvienne jusque dans ce compartiment cellulaire.D'une façon générale, l'entrée dans ce compartiment se fait à partir du cytosol où les protéines sont synthétisées par traduction des ARN messagers correspondants. Le passage du cytosol au reticulum endoplasmique s'effectue grâce à deux types de mécanismes: - soit un mécanisme de sécrétion lorsque la protéine est synthétisée sous forme de
précurseur (mis en jeu d'un peptide signal), - soit un mécanisme de "pompe" à peptides.
Les types de vaccins connus jusqu'à présent ne permettent absolument pas de maîtriser cette donnée importante qu'est l'association des molécules du MHC de classe I et des fragments peptidiques. Le plus souvent, les éléments infectieux (bactéries, virus, parasites ou antigènes) sont en effet absorbés par les cellules phagocytaires selon le mécanisme d'endocytose (ou phagocytose). Les vésicules d'endocytose fusionnent avec des lysosomes dont le contenu enzymatique assure la dégradation du matériel phagocyté. Ces vésicules endocytaires et lysosomaies forment un ensemble distinct du réticulum endoplasmique et ne sont pas en contact avec ce dernier.
Par conséquent, même si un antigène est capable d'induire une production d'anticorps neutralisants à son encontre, il n'est absolument pas certain qu'il se révélera au bout du compte efficace pour la mise en oeuvre d'un vaccin sous-unité.
On a maintenant trouvé de manière surprenante que la synthèse d'un antigène pouvait être réalisée directement dans les cellules présentatrices d'antigènes de l'individu à immuniser, lorsque L'ART codant pour cet antigène était administré sous forme apropriée e.g., sous forme de composition liposomale. Le destin de l'ARN ainsi injecté était en effet hautement incertain compte-tenu de sa très courte demi-vie. De plus, il n'était absolument pas évident que 1'ARN soit correctement délivré dans le cytosol et qu'il soit pris en charge par la machinerie cellulaire assurant le processus de traduction.
Ce nouveau mode de vaccination favorise nettement l'association des molécules MHC de classe I avec les fragments peptidiques issus de la digestion de l'antigène puisqu'il a été montré que l'individu ainsi traité était capable de développer une réponse immunitaire mettant en jeu les lymphocytes T cytotoxiques (CTL).
En conséquence, l'invention propose: (i) Un vecteur de délivrance d'ARN qui comprend un liposome et au moins un
fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'une
tumeur ou d'un agent pathogène, ledit au moins un fragment d'ARN étant
encapsulé dans ledit liposome; (ii) Une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une tumeur ou
d'une maladie induite par un agent pathogène, à des fins préventives ou
curatives, qui comprend à titre d'agent thérapeutique un vecteur de délivrance
d'ARN selon l'invention; (iii) Une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une tumeur ou
d'une maladie induite par un agent pathogène, à des fins préventives ou
curatives, qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins un fragment
d'ARN codant au moins pour un déterminant antigénique caractéristique de
ladite tumeur ou dudit agent pathogène;; (iv) L'usage d'un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention pour traiter de
manière préventive ou curative, une tumeur ou une maladie induite par un
agent pathogène; (v) En vue de traiter, de manière préventive ou curative, une tumeur ou une
maladie induite par un agent pathogène, I'usage d'un fragment d'ARN codant
au moins pour un déterminant antigénique caractéristique de ladite tumeur ou
dudit agent pathogène.
fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'une
tumeur ou d'un agent pathogène, ledit au moins un fragment d'ARN étant
encapsulé dans ledit liposome; (ii) Une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une tumeur ou
d'une maladie induite par un agent pathogène, à des fins préventives ou
curatives, qui comprend à titre d'agent thérapeutique un vecteur de délivrance
d'ARN selon l'invention; (iii) Une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une tumeur ou
d'une maladie induite par un agent pathogène, à des fins préventives ou
curatives, qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins un fragment
d'ARN codant au moins pour un déterminant antigénique caractéristique de
ladite tumeur ou dudit agent pathogène;; (iv) L'usage d'un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention pour traiter de
manière préventive ou curative, une tumeur ou une maladie induite par un
agent pathogène; (v) En vue de traiter, de manière préventive ou curative, une tumeur ou une
maladie induite par un agent pathogène, I'usage d'un fragment d'ARN codant
au moins pour un déterminant antigénique caractéristique de ladite tumeur ou
dudit agent pathogène.
Un fragment d'ARN utile aux fins de la présente invention est par nature un fragment d'ARN non-infectieux Par définition, il ne contient pas les éléments qui lui permettraient de se répliquer à l'intérieur d'une cellule. De même il ne contient pas l'information génétique nécessaire à la reconstitution d'un agent pathogène (e.g., une bactérie, un virus, ou un parasite) substantiellement complet.
Par "déterminant antigénique", on entend n'importe quel peptide comportant au moins un épitope caractéristique d'un antigène de tumeur ou d'un agent pathogène. Ce déterminant antigénique peut donc être l'antigène natif complet, un précurseur ou un analogue de celui ci, un fragment de l'antigène natif ou un analogue de ce fragment. Par "analogue", on entend une molécule ayant une séquence en acides aminés sensiblement différente de celle de la molécule native e.g., dont la séquence en acides aminés présente un degré d'homologie au moins d'environ 80tu, de préférence d'au moins 90%, de manière tout à fait préférée d'au moins 95% avec la séquence de.la molécule native.
D'une manière générale, le déterminant antigénique peut être caratéristique de n'importe quel type de tumeur ou de n'importe quel agent pathogène.
Afin d'illustrer ce qui précède, on cite à titre d'exemple: - La protéine de la nucléocapside (nucléoprotéine) du virus de la grippe de type A
affectant les humains telle que définie par la séquence de l'ARNm qui lui
correspond. Cette séquence a été publiée dans Huddleston & Brownlee, Nucl. Ac.
affectant les humains telle que définie par la séquence de l'ARNm qui lui
correspond. Cette séquence a été publiée dans Huddleston & Brownlee, Nucl. Ac.
Res. (1982) 10 (3):1029.
- Un peptide comportant l'épitope de séquence : Thr-Tyr-Glu-Arg-Thr-Arg-Ala-Leu
Val-Arg. Cet épitope est caractéristique de la nucléoprotéine des virus de la grippe
type - Un peptide comportant la séquence : Thr-Tyr-Glu-Arg-Thr-Arg-Ala-Leu-Val-Thr.
Val-Arg. Cet épitope est caractéristique de la nucléoprotéine des virus de la grippe
type - Un peptide comportant la séquence : Thr-Tyr-Glu-Arg-Thr-Arg-Ala-Leu-Val-Thr.
- L'antigène de tumeur H23-ETA associé au cancer du sein chez les humains, tel que décrit dans Wreschner et al, J. Biochem. (1990) 189: 463.
- Un peptide comportant l'épitope majeur de l'antigène H23-ETA, ayant la séquence: Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-X-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Y-Arg-Pro-X,
dans laquelle X est Pro ou Ala et Y est Thr ou Asn.
dans laquelle X est Pro ou Ala et Y est Thr ou Asn.
Un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention ainsi qu'une composition pharmaceutique selon l'invention peuvent contenir différents fragments d'ARN chacuns de ces fragments codant pour un déterminant antigénique particulier. Par exemple, un vecteur de délivrance d'ARN selon l'invention destiné au traitement préventif de la grippe peut contenir à la fois: - Un fragment d'ARN codant pour la nucléoprotéine des virus de la grippe de type A
et un fragment d'ARN codant pour la nucléoprotéine des virus de la grippe de type B
ou bien, - Un fragment d'ARN codant pour la nucléoprotéine des virus de la grippe de type A
et un ou plusieurs fragment(s) d'ARN, chacun de ces derniers codant pour
l'hémaglutinine d'une souche particulière du virus de la grippe.
et un fragment d'ARN codant pour la nucléoprotéine des virus de la grippe de type B
ou bien, - Un fragment d'ARN codant pour la nucléoprotéine des virus de la grippe de type A
et un ou plusieurs fragment(s) d'ARN, chacun de ces derniers codant pour
l'hémaglutinine d'une souche particulière du virus de la grippe.
Aux fins de la présente invention, un fragment d'ARN peut être obtenu de manière conventionnelle e.g., par synthèse chimique ou par transcription in vitro du fragment d'ADN correspondant.
Par "liposome", on entend une vésicule essentiellement formée d'une membrane constituée de lipides en double couche. Une telle vésicule peut présenter une ou plusieurs strates membranaires. Dans le premier cas, on parle d'une vésicule unilamellaire tandis que dans le deuxième cas il s'agit d'une vésicule oligo- ou plurilamellaire. De manière typique, la membrane des liposomes est constituée de lipides amphiphyliques tels que les phospholipides, en association ou non avec d'autres consituants lipidiques. Des phospholipides appropriés sont par exemple, la phosphatidylcholine, la phosphatidylsérine, la phosphatidyléthanolamine, les sphingolipides, la cardiolipine, le phosphatidylinositol, l'acide phosphatidique et le phosphatidylglycérol.De plus, on peut aussi prévoir d'utiliser des phospholipides synthétiques dérivés ou non des phospholipides mentionnés ci-dessus, contenant par exemple, des groupements variés tels que des groupement hydroxyles, imidazoles, amine, amides, sulphydryles, etc.
De préférence, d'autres lipides tels que des stérides, le cholestérol, des amines aliphatiques, peuvent être mélangés aux phospholipides. De tels lipides sont en particulier utiles à titre d'agents stabilisants ou anti-oxydants.
Aux fins de la présente invention, un mélange lipidique avantageux est constitué de phosphatidylcholine (PC) et de cholestérol (CH) en proportion variable. On indique toutefois que des proportions PC: CH satisfaisantes sont de l'ordre (en terme de part) de 5:1 à 5 : 5. Un tel mélange à part égale convient particulièrement.
La préparation des liposomes ainsi que l'encapsidation de l'ARN peut être mises en oeuvre selon des techniques connues. En particulier, les techniques d'encapsidation de l'ADN qui sont couramment utilisées, sont applicables dans le cas présent.
En outre, la membrane peut aussi contenir diverses protéines insérées dans la membrane, attachées par liaison covalente à un lipide de la membrane, directement ou indirectement via un agent de liaison, ou simplement en interaction avec un phospholipide. Lorsque'une protéine est liée par liaison covalente à un lipide, ce dernier est de préférence un lipide possédant une fonction amine tel que par exemple, la phosphatidyléthanolamine. Avantageusement ces protéines peuvent être utilisées comme agent de ciblage des liposomes sur une classe particulière de cellules. Ce sont par exemple, des anticorps monoclonaux ou des lymphokines.
Afin de mettre en oeuvre une composition pharmaceutique selon l'invention, 1'ARN peut être de manière avantageuse, soit simplement mélangé à des liposomes mais non encapsidé, soit encapsidé dans des liposomes ; cette dernière alternative étant préférée.
Lorsque l'ARN se trouve simplement mélangé à des liposomes, ces derniers sont de préférence de type cationique. On entend par ce dernier terme, un liposome dont la surface est chargée positivement. De tels liposomes sont en particulier décrits dans Felgner et al, PNAS (1987) 84 :7413.
Aux fins de la présente invention, le (ou les) fragment(s) d'ARN codant pour un déterminant antigénique d'une tumeur ou d'un agent pathogène est (sont) avantageusement accompagné(s) d'un fragment d'ARN codant pour une interleukine- 1, d'un fragment d'ARN codant pour une interleukine4 ou d'un fragment d'ARN codant pour une interleukine-2 ; ce dernier étant tout particulièrement préféré.
Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, il doit être entendu qu'un fragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique ou une interleukine comporte outre la séquence codante, tous les éléments nécéssaires à la traduction de cette dernière
Lorsque différents fragments d'ARN composent un vecteur ou une composition pharmaceutique selon l'invention, ceux-ci peuvent être partiellement ou totalement liés les uns aux autres, de manière à former au moins un fragment d'ARN polycistronique.
Lorsque différents fragments d'ARN composent un vecteur ou une composition pharmaceutique selon l'invention, ceux-ci peuvent être partiellement ou totalement liés les uns aux autres, de manière à former au moins un fragment d'ARN polycistronique.
Enfin, une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier on associe le ou les agents thérapeutiques selon l'invention avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie souscutanée, par voie intra-musculaire ou par voie intra-veineuse, par exemple sous forme de suspension injectable. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration.
L'invention est illustrée ci-après en se référant à la Figure 1 qui représente le plasmide pGEM-3Z.
Exemple 1: Préparation de liposomes chargés en ARN codant pour la nucléoprotéine du virus de la grippe de type A
A) Préparation de l'ARN.
A) Préparation de l'ARN.
Un fragment EcoRI-SalI comprenant le cDNA codant pour la nucléoprotéine du
virus de la grippe de type A, souche A/NT/60/68 (Huddleston & Brownlee, Nucl.
virus de la grippe de type A, souche A/NT/60/68 (Huddleston & Brownlee, Nucl.
Ac. Res. (1982) 10 (3): 1029) est obtenu par digestion du plasmide pNP28 (Jones & BR<
Brownlee, Gene (1985) 35: 333).
Brownlee, Gene (1985) 35: 333).
Ce fragment EcoRI-SalI est inséré dans le plasmide pGEM-3Z (Promega Corp
Figure 1) digéré par EcoRI et Sall de manière à placer le cDNA codant pour la
nucléoprotéine sous le contrôle d'un promoteur reconnu par la RNA polymérase du
phage T7. On obtient ainsi le plasmide pTG3003.
Figure 1) digéré par EcoRI et Sall de manière à placer le cDNA codant pour la
nucléoprotéine sous le contrôle d'un promoteur reconnu par la RNA polymérase du
phage T7. On obtient ainsi le plasmide pTG3003.
Le plasmide pTG3003 est ensuite linéarisé par digestion avec Sali; puis transcrit en
utilisant un kit de transcription in vitro (Stratagène; ref. catalogue 200 341) selon
les instructions du fournisseur. L'ARN ainsi obtenu est cappé par adjonction dans le
tampon de transcription de 10ul d'une solution de m7G(5')ppp(5')G 5mM
(Pharmacia; n" produit 274635).
utilisant un kit de transcription in vitro (Stratagène; ref. catalogue 200 341) selon
les instructions du fournisseur. L'ARN ainsi obtenu est cappé par adjonction dans le
tampon de transcription de 10ul d'une solution de m7G(5')ppp(5')G 5mM
(Pharmacia; n" produit 274635).
B) Préparation des vésicules unilamellaires.
On prépare une solution de cholestérol en dissolvant le produit en poudre (Sigma)
dans du chloroforme à raison de 100mg/ml. Puis dans un tube Corex de 30ml, on
mélange 58yI de la solution de cholestérol et 11+1 d'une solution de
phosphatidylcholine à 100mg/ml (Sigma). Le mélange final a une concentration en
lipides de l'ordre de 30 moles.
dans du chloroforme à raison de 100mg/ml. Puis dans un tube Corex de 30ml, on
mélange 58yI de la solution de cholestérol et 11+1 d'une solution de
phosphatidylcholine à 100mg/ml (Sigma). Le mélange final a une concentration en
lipides de l'ordre de 30 moles.
Ce mélange est agité vigoureusement au vortex Puis on laisse le solvant s'évaporer
à 40"C. L'opération de séchage est complétée par lyophilisation pendant environ lh.
à 40"C. L'opération de séchage est complétée par lyophilisation pendant environ lh.
La couche Iipidique déposée au fond du tube est reprise dans lml d'eau. Le
mélange est homogénéisé au vortex et soniqué à la fréquence minimale en utilisant
un sonicateur Labsonic L de Braun. L'opération s'effectue pendant 10 min. par
passages intermittents de 15 secondes, espacés par 30 secondes de repos au froid.
mélange est homogénéisé au vortex et soniqué à la fréquence minimale en utilisant
un sonicateur Labsonic L de Braun. L'opération s'effectue pendant 10 min. par
passages intermittents de 15 secondes, espacés par 30 secondes de repos au froid.
La suspension ainsi obtenue est centrifugée à 16000 rpm, à 4"C pendant 15 min.
pour sédirnenter les particules de titane et les vésicules les plus grandes
(Biofuge/Heraeus en tube eppendorff). Puis le surnageant contenant une majorité
de vésicules unilamellaires ayant pour diamètre 50 microns environ, est récupéré
dans des tubes Corex de 15ml.
pour sédirnenter les particules de titane et les vésicules les plus grandes
(Biofuge/Heraeus en tube eppendorff). Puis le surnageant contenant une majorité
de vésicules unilamellaires ayant pour diamètre 50 microns environ, est récupéré
dans des tubes Corex de 15ml.
C) Préparation des vésicules oligolamellaires contenant l'ARN.
A la suspension vésiculaire obtenue en B), on ajoute 135nul de la préparation
d'ARN obtenue en A) ; soit 40 pg d'ARN environ. Le mélange est plongé
doucement dans l'azote liquide, en roulant entre ses doigts le tube maintenu
vertical. Lorsque le mélange est complètement congelé, on le lyophilise pendant
toute une nuit.
d'ARN obtenue en A) ; soit 40 pg d'ARN environ. Le mélange est plongé
doucement dans l'azote liquide, en roulant entre ses doigts le tube maintenu
vertical. Lorsque le mélange est complètement congelé, on le lyophilise pendant
toute une nuit.
Le Iyophilisat est réhydraté progressivement dans 100 vil d'eau distillée. Puis on
ajoute goutte à goutte 0,9 ml de tampon Hepes pH 7,05 de composition: NaCI 140
mM, KC1 SmM, Na2HPOq 2H20 0,75mM, Hepes 25mM. La suspension vésiculaire
est ensuite calibrée par extrusions successives au travers d'un premier et deuxième
filtre dont les pores ont respectivement un diamètre de 400nm et de 200nm. La
suspension ainsi obtenue contient une majorité de vésicules oligolamellaires qui ont
encapsulé l'ARN.
ajoute goutte à goutte 0,9 ml de tampon Hepes pH 7,05 de composition: NaCI 140
mM, KC1 SmM, Na2HPOq 2H20 0,75mM, Hepes 25mM. La suspension vésiculaire
est ensuite calibrée par extrusions successives au travers d'un premier et deuxième
filtre dont les pores ont respectivement un diamètre de 400nm et de 200nm. La
suspension ainsi obtenue contient une majorité de vésicules oligolamellaires qui ont
encapsulé l'ARN.
Afin d'éliminer de manière substantielle l'ARN non-encapsulé, la suspension est
déposée sur une colonne de Sepharose 4B (10ml ; colonne de section lcm)
prééqullibrée en tampon Hepes. L'élution est poursuivie en tampon Hepes. Les
fractions éluées d'aspect blanc qui contiennent les vésicules sont collectées
ensemble; ceci correspond à un volume d'environ 2ml.
déposée sur une colonne de Sepharose 4B (10ml ; colonne de section lcm)
prééqullibrée en tampon Hepes. L'élution est poursuivie en tampon Hepes. Les
fractions éluées d'aspect blanc qui contiennent les vésicules sont collectées
ensemble; ceci correspond à un volume d'environ 2ml.
Exemple 2: Induction d'une réponse CII initiée par des liposomes chargés en
ARN codant pour la nucléoprotéine du virus de la grippe de type AO
Trois séries de souris BALB/c correspondant respectivement (i) au test, (ii) contrôle positif et (iii) au contrôle négatif sont préparées comme suit:
(i) Test : les souris recoivent par voie intra-veineuse 21 de la préparation de liposomes obtenue à l'exemple 1.
ARN codant pour la nucléoprotéine du virus de la grippe de type AO
Trois séries de souris BALB/c correspondant respectivement (i) au test, (ii) contrôle positif et (iii) au contrôle négatif sont préparées comme suit:
(i) Test : les souris recoivent par voie intra-veineuse 21 de la préparation de liposomes obtenue à l'exemple 1.
(ii) Contrôle positif : les souris reçoivent par voie intra-péritonéale 130 unités hémaglutinantes du virus de la grippe de type A, souche Caen (A-Caen). Les différentes souches de type A diffèrent parfois entre elles pour certaines protéines comme l'hémaglutinine ou la neuraminidase mais jamais pour la nucléoprotéine. Par contre il existe des variations en ce qui concerne la nucléoprotéine entre les virus de typeAetB.
(iii) Contrôle négatif : les souris reçoivent par voie intra-veineuse 200ul d'une préparation de liposomes préparées comme à l'exemple 1, l'addition d'ARN ayant été ommise.
15 jours après, les souris de (i) et (iii) reçoivent une injection identique à la première et dans les mêmes conditions.
15 jours après la deuxième injection, la rate des souris est prélevée et dilacérée. Les hématies sont éliminées par choc osmotique. Puis les cellules spléniques sont mises en culture dans des plaques à godets à raison de 5.106 cellules/godets sous un volume de 2ml en milieu de culture DMEM (Gibco) complémenté à 10% de sérum de veau fétal, 2mM de L-glutamine, 50 uM de B-mercaptoethanol, 10mM d'Hepes,lmM de pyruvate de sodium, 10 unités/ml de pénicilline, 10ug/ml de streptomycine, 2,5 Jlg/ml d'amphotéricine et des acides aminés non-essentiels (Flow labs).
Ce milieu contient en outre 5pM du peptide NP 147-158R- de formule : Thr-Tyr-Glu Arg-Thr-Arg-Ala-Leu-Val-Thr-Giy Ce peptide correspond à un épitope systématiquement reconnu par les CIL des souris BALB/c lorsqu'elles sont immunisées avec le virus de la grippe de type A (Bodmer et al, Cell (1988) 52 : 253).
La culture est poursuivie à 37"C sous atmosphère à 7% de C02. Au bout de 7 jours, le milieu de culture initial est remplacé par du milieu frais. Dans chaque godet, on ajoute, de plus, 5 106 cellules de rate de souris BALB/c non soumises à immunisation, ces cellules ayant été irradiées par 4000 Rad de rayonnement gamma
Au 12ième jour de culture, l'activité des CIL est détectée par le test classique de relargage du 51Cr notamment décrit par Martinon et al, J. Immunol. (1989)142 ; 3489.
Au 12ième jour de culture, l'activité des CIL est détectée par le test classique de relargage du 51Cr notamment décrit par Martinon et al, J. Immunol. (1989)142 ; 3489.
Des précisions sont données comme suit: 1 à 10x106 cellules de mastocytome de souris DBA/2 (H-2d) histocompatible avec les souris BALB/c (cellules P815), en milieu DMEM, sont incubées en présence de 100 > uCi de Na2 51CrO4 (CEA, France) pendant lh. à 37"C. Les cellules sont lavées deux fois, puis reprises en milieu DMEM.
L'opération est répétée en utilisant des cellules P815 infectées par le virus de la grippe de type A, souche Bangkok (P815/A-Ban) ou par le virus de la grippe de type B souche
Yamagata (P815/B-Yam) L'infection des cellules P815 est au préalable menée comme suit : 106 cellules dans 0,5 ml de milieu DMEM sont infectées par 100 unités hémaglutinantes de virus. Après 90 min à 37C,les cellules sont lavées dans 20 ml de milieu DMEM complémenté avec 10% de SVF pour stopper l'infection. L'expression des protéines du virus est poursuivie 3h à 37 C avant que les cellules soient utilisées dans le test de cytolyse.
Yamagata (P815/B-Yam) L'infection des cellules P815 est au préalable menée comme suit : 106 cellules dans 0,5 ml de milieu DMEM sont infectées par 100 unités hémaglutinantes de virus. Après 90 min à 37C,les cellules sont lavées dans 20 ml de milieu DMEM complémenté avec 10% de SVF pour stopper l'infection. L'expression des protéines du virus est poursuivie 3h à 37 C avant que les cellules soient utilisées dans le test de cytolyse.
Les cellules P815 (cellules cibles) sont alors distribuées dans les puits d'une plaque de microtitration à raison de 3000 cellules par puits. Dans les trois cas (i), (ii) et (iii), les cellules spléniques (cellules effectrices), en milieu DMEM, sont ajoutées dans chaque puit de manière à constituer des séries formant une gamme de rapport cellules effectrices / cellules cibles comprise entre 100/1 et 0,3/1 approximativement. Le peptide NP 147-158R est enfin ajouté à la concentration finale de 2,5 pu. Dans chaque puit, le volume final est de 200ji1.
La plaque est ensuite incubée 4h à 37"C puis centrifugée. Dans chaque puit, on prélève 100 ul de surnageant. La radioactivité de chaque prélèvement est mesurée et les résultats sont exprimés dans le tableau ci-dessous, en pourcentage du relargage du chrome dû à l'activité des cn::
(relargage observé - relargage spontané) lOox ---------------- ---- ---------
(quantité totale de chrome incorporée - relargage spontané)
(relargage observé - relargage spontané) lOox ---------------- ---- ---------
(quantité totale de chrome incorporée - relargage spontané)
<tb> Infection <SEP> Effectrices <SEP> P815/- <SEP> P815 <SEP> P815 <SEP> PS15 <SEP>
<tb> <SEP> /cibles <SEP> /NP <SEP> /A-Ban <SEP> /B-Yam
<tb> Contrôle <SEP> 40 <SEP> < 5 <SEP> 71 <SEP> 63 <SEP> < 5
<tb> <SEP> positif <SEP> 13 <SEP> < 5 <SEP> 52 <SEP> 46 <SEP> < 5
<tb> (A-Caen) <SEP> 4,4 <SEP> < 5 <SEP> 45 <SEP> 46 <SEP> < 5
<tb> <SEP> 1,5 <SEP> < 5 <SEP> 32 <SEP> 29 <SEP> 9
<tb> Contrôle <SEP> 22 <SEP> < 5 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 8
<tb> <SEP> négatif <SEP> 7,4 <SEP> < 5 <SEP> < 5 <SEP> 7 <SEP> < s <SEP>
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> < 5 <SEP> < 5 <SEP> 8 <SEP> < 5
<tb> <SEP> Q8 <SEP> < 5 <SEP> < 5 <SEP> 10 <SEP> < 5
<tb> <SEP> Test <SEP> 22 <SEP> 10 <SEP> 53 <SEP> 50 <SEP> 10
<tb> <SEP> 7,4 <SEP> < 5 <SEP> 39 <SEP> 28 <SEP> 5
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> < 5 <SEP> 18 <SEP> 20 <SEP> 5
<tb> <SEP> Q8 <SEP> < 5 <SEP> < 5 <SEP> 12 <SEP> < 5
<tb>
<tb> <SEP> /cibles <SEP> /NP <SEP> /A-Ban <SEP> /B-Yam
<tb> Contrôle <SEP> 40 <SEP> < 5 <SEP> 71 <SEP> 63 <SEP> < 5
<tb> <SEP> positif <SEP> 13 <SEP> < 5 <SEP> 52 <SEP> 46 <SEP> < 5
<tb> (A-Caen) <SEP> 4,4 <SEP> < 5 <SEP> 45 <SEP> 46 <SEP> < 5
<tb> <SEP> 1,5 <SEP> < 5 <SEP> 32 <SEP> 29 <SEP> 9
<tb> Contrôle <SEP> 22 <SEP> < 5 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 8
<tb> <SEP> négatif <SEP> 7,4 <SEP> < 5 <SEP> < 5 <SEP> 7 <SEP> < s <SEP>
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> < 5 <SEP> < 5 <SEP> 8 <SEP> < 5
<tb> <SEP> Q8 <SEP> < 5 <SEP> < 5 <SEP> 10 <SEP> < 5
<tb> <SEP> Test <SEP> 22 <SEP> 10 <SEP> 53 <SEP> 50 <SEP> 10
<tb> <SEP> 7,4 <SEP> < 5 <SEP> 39 <SEP> 28 <SEP> 5
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> < 5 <SEP> 18 <SEP> 20 <SEP> 5
<tb> <SEP> Q8 <SEP> < 5 <SEP> < 5 <SEP> 12 <SEP> < 5
<tb>
Claims (14)
- encapsulé dans ledit liposome.tumeur ou d'un agent pathogène, ledit au moins un fragment d'ARN étantfragment d'ARN codant pour un déterminant antigénique caractéristique d'uneREVENDICATIONS 1.Un vecteur de délivrance d'ARN qui comprend un liposome et au moins un
- 2. Un vecteur de délivrance d'ARN selon la revendication 1, qui comprend unliposome, au moins un fragment d'ARN codant pour un déterminant antigéniquecaractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène et un fragment d'ARNcodant pour une interleukine-2 ; ledit au moins un fragment d'ARN et leditfragment d'ARN codant pour une interleukine-2 étant encapsulé dans leditliposome.
- 3. Un vecteur de délivrance d'ARN selon la revendication 2, dans lequel ledit aumoins un fragment d'ARN et ledit fragment d'ARN codant pour une interleukine2 étant lié l'un à l'autre de manière à former un fragment d'ARN polycistronique.
- 4. Un vecteur de délivrance d'ARN selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequelledit au moins un fragment d'ADN code pour un déterminant antigéniquecaractéristique d'un virus de la grippe qui est sélectionné parmi la protéine de lanucléocapside dudit virus et l'hémaglutinine dudit virus.
- 5. Un vecteur de délivrance d'ARN selon la revendication 4, dans lequel un premierfragment d'ARN code pour la protéine de la nucléocapside du virus de la grippe etun deuxième fragment d'ARN code pour l'hémaglutinine du virus de la grippelesdits premier et deuxième fragments d'ARN étant liés l'un à l'autre de manière àformer un fragment d'ARN polycistronique qui est encapsulé dans ledit liposome.
- 6. Une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention d'unetumeur ou d'une maladie induite par un agent pathogène, qui comprend à titred'agent thérapeutique un vecteur de délivrance d'ARN selon 1 ' une desrevendications 1 à 5, avec un diluent ou un support acceptable d'un point de vuepharmaceutique.
- 7. Une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention d'unetumeur ou d'une maladie induite par un agent pathogène, qui comprend à titred'agent thérapeutique au moins un fragment d'ARN codant au moins pour undéterminant antigénique caractéristique de ladite tumeur ou dudit agentpathogène , avec un diluent ou un support acceptable d'un point de vuepharmaceutique.
- 8. Une composition pharmaceutique selon la revendication 7, qui comprend à titred'agent thérapeutique un fragment d'ARN codant au moins pour un déterminantantigénique caractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène en associationavec un composant liposomal cationique et avec un diluent ou un supportacceptable d'un point de vue pharmaceutique.
- 9. Une composition pharmaceutique selon la revendication 8, dans laquelle leditfragment d'ARN code en outre pour une interleukine-2.
- 10. Une composition pharmaceutique selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle leditfragment d'ARN code au moins pour un déterminant antigénique caractéristiqued'un virus de la grippe qui est sélectionné parmi la protéine de la nucléocapsidedudit virus et l'hémaglutinine dudit virus.
- 11. Une composition pharmaceutique selon la revendication 10, dans laquelle leditfragment d'ARN code pour la protéine de la nucléocapside d'un virus de la grippeet pour l'hémaglutinine d'un virus de la grippe.
- 12. Une composition pharmaceutique selon la revendication 7, qui comprend à titred'agents thérapeutiques au moins un fragment d'ARN codant pour un déterminantantigénique caractéristique d'une tumeur ou d'un agent pathogène et un fragmentd'ARN codant pour une interleukine-2.
- 13. Une composition pharmaceutique selon la revendication 12, dans laquelle ledit aumoins un fragment d'ARN et ledit fragment d'ARN codant pour une interleukine2 sont liés l'un à l'autre de manière à former un fragment d'ARN polycistronique.
- 14. Une composition pharmaceutique selon la revendication 7, 12 ou 13, dans laquelleledit au moins un fragment d'ARN code pour un déterminant antigénique d'unvirus de la grippe qui est sélectionné parmi la protéine de la nucléocapside duditvirus et l'hémaglutinine dudit virus.Une composition pharmaceutique selon la revendication 14, dans laquelle un premier fragment d'ARN code pour la nucléocapside d'un virus de la grippe et un second fragment d'ARN code pour l'hémaglutinine d'un virus de la grippe; ledit premier et deuxième r pigments d'ARN étant liés l'un à l'autre de manière à former un fragment d'ARN polycistronique.
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|---|---|---|---|
| FR919105465A FR2676072B1 (fr) | 1991-05-03 | 1991-05-03 | Vecteur de delivrance d'arn. |
| JP4509832A JPH06502998A (ja) | 1991-05-03 | 1992-04-30 | Ｒｎａデリバリーベクター |
| EP92910885A EP0537326A1 (fr) | 1991-05-03 | 1992-04-30 | Vecteur de delivrance d'arn |
| PCT/FR1992/000393 WO1992019752A1 (fr) | 1991-05-03 | 1992-04-30 | Vecteur de delivrance d'arn |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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Family
ID=9412502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR919105465A Expired - Fee Related FR2676072B1 (fr) | 1991-05-03 | 1991-05-03 | Vecteur de delivrance d'arn. |
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| JP (1) | JPH06502998A (fr) |
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| CA (1) | CA2086510A1 (fr) |
| FR (1) | FR2676072B1 (fr) |
| WO (1) | WO1992019752A1 (fr) |
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| WO1999052503A2 (fr) * | 1998-04-16 | 1999-10-21 | John Wayne Cancer Institute | Vaccin d'arn contre le cancer et ses procedes de mise en application |
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| US6472375B1 (en) | 1998-04-16 | 2002-10-29 | John Wayne Cancer Institute | DNA vaccine and methods for its use |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| PL2590626T3 (pl) | 2010-07-06 | 2016-04-29 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Liposomy z lipidami o korzystnej wartości pka do dostarczania rna |
| DK2591114T3 (en) | 2010-07-06 | 2016-08-29 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunization of large mammals with low doses of RNA |
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