JPH06502998A

JPH06502998A - Ｒｎａデリバリーベクター

Info

Publication number: JPH06502998A
Application number: JP4509832A
Authority: JP
Inventors: ムリアン　ピエール; クリシュナン　シバダサン; マーティノン　フレデリック
Original assignee: トランスジーンソシエテアノニム; パストゥール　メリュ　セラン　エ　ヴァクサン　ソシエテ　アノニム
Priority date: 1991-05-03
Filing date: 1992-04-30
Publication date: 1994-04-07
Also published as: CA2086510A1; AU1768192A; AU652831B2; EP0537326A1; WO1992019752A1; FR2676072A1; FR2676072B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＲＮＡデリバリ−ベクタ一本発明は、腫瘍又は病原性因子の特徴を有する抗原決定基をコードするＲＮＡフラグメントを、細胞内に移入することを目的とする手段及びそれらを含有する薬学的組成物に関する。本発明は特にワクチンの分野に適用される。

一般に、伝統的な予防接種は個人の免疫系に感染因子（バクテリア、ウィルス又は寄生虫（ｐａｒａｓｉｔｅ））を感作することからなる。この目的のために、ワクチンの３タイプが提案され多少とも経験的な方法により場合に応じて発展してきたニー化学的処理の力によって感染性を失ったバクテリア又はウィルス全体から得られる不活性な（又は死滅した）ワクチン；一突然変異又は変異を起こす種々の手段における継代接種によって病原力を減弱した感染性のあるバクテリア又はウィルスからなる生ワクチン（ｌｉｖｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　）　；−バクテリアトキシン又は精製された感染因子の抗原に基づくサブユニットワクチン。

更に、最近になってワクチンの原理を悪性の腫瘍の予防に応用することが提案されてきた。確かに、腫瘍のほとんどは、対応する正常細胞の表面に存在する抗原とは質的に又は量的に異なる抗原を表面に発現する。これら抗原は、腫瘍細胞にのみ発現した場合には特異的と言われる。それらが正常細胞および腫瘍細胞上に存在する場合には、これら抗原は腫瘍に関係があると言われ、この場合、腫瘍細胞においてより多量に又は異なった形態で存在している。

一度、ワクチンが投与されると、免疫系の細胞は、外来の微生物の抗原を認識し、特異的にこの侵入と反応し、これら抗原を記憶し続け、それらは次の感染中生物を保護する。

一般に、免疫応答には２つの主なタイプがある、即ち、８１２８球による抗体の産生によって特徴付けられる液性のタイプの応答及びエフェクター細胞、即ち、本質的にはＴ８１Ｊンパ球（細胞障害性リンパ球）を含む細胞介在性免疫応答である。これら応答は、最初に抗原提供細胞によって活性化され、制御細胞、即ち１４９２８球（ヘルパーニリン８球）及びサプレッサーニリン８球によって制御される。

非常に広い条件において、免疫応答は以下のように機能する：一りラスエ又は■の主要組織適合性複合体（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ）　（Ｍ　ＨＣ）の分子と共同して、抗原提供細胞（単球、マクロファージ及び８１２８球）は抗原を捕獲し、それを消化し、それらの表面上でそのフラグメントを改めて露出する。

−クラス■の主要組織適合性複合体に関係する抗原フラグメントを“見つける（ｓｅｅ　）”と、１４９２８球が、抗原産生Ｂリンパ球の増殖及びＴ８リンパ球（細胞障害性リンパ球又はＣＴＬ）の増殖を刺激する。

−８１２８球は、抗原を中和するために循環抗原と反応する抗体を産生ずる。

一最後に、Ｔ８リンパ球は、クラスエの主要組織適合性複合体に関係する抗原のフラグメントを認識すると、感染した細胞を破壊する。

ワクチンは、実体がある持続する免疫を与えるために、おそらく体液性及び細胞介在性応答を誘導すると現在考えられている。

上述したようなワクチンのタイプの中で、生ワクチンは、しばしば最も効果的である：それらは、十分なレベルの免疫性を与えることによって、ＢＸＴ４及びＴ８リンパ球を同時に活性化させる。更に、それらは生物中で増加するため、それらは低い量で作用し、一般にブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ　）を要求しない。不幸にも生きた状態を維持するため、これらワクチンは、一般に冷やして保存される。

運搬中コールドチェーン（ｃｏｌｄ　ｃｈａｉｎ）を維持することは、これらワクチンのコストを実質的に上げる因子である。最後に、それらの感染性は、減弱しているがゼロではなく、時々免疫抑制された被験者に、二次的な効果を誘導する。

より重大なことには、それらは引き続いた逆変異により感染力を回復することがあり、これは極めて希ではあるが絶対に耐えられないものである。

サブユニットワクチンは、これらの欠点は有してはいないが、一般に免疫細胞の刺激が弱く、アジュバント（免疫原性を促進する分子）を要求する。ウィルスの主な表面抗原からなるＢ型肝炎に対するワクチンは、組換えＤＮＡ技術によって得られ、首尾よく開発されたサブユニットワクチンの一例である。しかしながら、他の場合は、結果は失望するものであった。

サブユニットワクチンの成功を制限する一つの因子は、それらが十分に高い細胞のタイプの免疫応答を誘導することができない事実にあると考えられている。これはおそらく、ある抗原が正しく処理され、及び／又は、それらのフラグメントがクラスＩの主要組織適合性複合体（ＭＭＣ）の分子に接触することができないことによる。

確かに、（細胞タイプの免疫応答に参加する）クラスエＭＨＣ分子とペプチドフラグメントとの結合は、細胞の小胞体の中で起こる。このため、第一に抗原はこの細胞の区画の中に達することが必要となる。一般に、この区画に入ることは、蛋白質が対応するメツセンジャーＲＮＡ５の翻訳によって合成されるところの細胞質ゾルから起こる。

細胞質ゾルから小胞体への移動は以下の２つのタイプの機構点から起こるニー蛋白質がプレカーサー（シグナルペプチドを含む）の形態で合成される時の分泌機構、又は、 −ペプチド“ポンプ（ｐｕｍｐ）”機構。

これまで知られてきたワクチンのタイプは、クラス■ＭＨＣ分子とペプチドフラグメントとが関係する重要なパラメーターを、全く支配することができない。より頻繁に、感染要素（バクテリア、ウィルス、寄生虫又は抗原）は、事実エンドサイト−シス（又は食菌作用）機構に従う食細胞によって吸収される。このエンドサイト−シスの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）は、酵素の内容が食菌される物質の分解を確実なものにするリゾソームと融合する。これらエンドサイト−シスとリソソームの小胞は、小胞体とまったく区別して形成され、小胞体と接触していない。

結果的には、抗原がそれを中和する抗体の産生を誘導することができるとしても、その後サブユニットワクチンの発展に効果的であることを証明することは全く確かではない。

驚くべきことに、この抗原をコードするＲＮＡが適当な形態、例えば、リポソームの組成物の形態で投与すると、抗原の合成が、直接免疫された個々の抗原提供細胞中で行われる。この様に注射されたＲＮＡの運命は、その非常に短い半減期のため、事実非常に不確かである。更に、ＲＮＡが正しく細胞質ゾルに運搬され、翻訳過程に関与する（責任のある）細胞の機構によって、引き継がれることは明らかではない。

ワクチン化のこの新しい方法は、クラスＩ　ＭＨＣ分子と抗原の消化から得られるペプチドフラグメントとの結合を非常に促進する、というのは、この様に処理されたそれぞれが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む免疫応答を、発展させることができることが知られていたからである。

結論的には、本発明は、（ｉ）　リポソーム及び腫瘍又は病原性因子の特徴を有する抗原決定基をコードする少なくとも１種のＲＮＡフラグメントを含むＲＮＡデリバリ−ベクターであって、その少なくとも１種のＲＮＡフラグメントが該リポソーム内にカプセル化されていること、（ｉｉ）　予防及び治療の目的のために、腫瘍又は病原性因子によって誘導される疾患の治療を目的とする薬学的組成物であって、本発明のＲＮＡデリバリ−ベクターを治療物質として含有すること、（ｉｉｉ）予防又は治療手段として腫瘍又は病原性因子によって誘導される疾患を治療するための本発明のＲＮＡデリバリ−ベクターの使用、（ｉｖ）　腫瘍又は病原性因子によって誘導される疾患の予防又は治療処理を目的とした医薬物質の製造のための本発明のＲＮＡデリバリ−ベクターの使用、（Ｖ）　そのような治療を要求している患者に、本発明のＲＮＡデリバリ−ベクターを十分な量を投与することを含む腫瘍又は病原性因子によって誘導される疾患の治療又は予防処理方法、を提案する。

本発明の目的に有用なＲＮＡフラグメントは、本来メツセンジャータイプのみの感染しない（ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ）ＲＮＡフラグメントである。即ち、第一の複製又はＤＮＡへの転写をすることなしに、細胞に機構によって直接蛋白質に翻訳することができる。定義的には、それは細胞内にそれを複製することが可能な要素を含有していない。同様に、実質的に完全な病原性因子（例えば、バクテリア、ウィルス又は寄生虫）の再構成に要求される遺伝情報を含まない。

“抗原決定基”とは、腫瘍抗原又は病原性因子に特徴のある少なくとも１種のエピトープを含むペプチドを意味すると理解される。この抗原決定基は、それゆえ、完全な天然の抗原、そのプレカーサー又はそのアナログ、天然の抗原フラグメント又はこのフラグメントのアナログである。

“アナログとは、実質的に天然の分子とは異なるアミノ酸配列を有する分子を意味すると理解されている、例えば、そのアミノ酸配列が、天然の分子の配列と約８０％以上のホモロジーの程度を有するもの、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のものである。

一般に、抗原決定基は、い（つかのタイプの腫瘍又はい（つかの病原性因子の特徴がある。

上記を説明するために、以下の例示によって示すニーヒトに影響を及ぼすインフルエンザウィルスタイプＡのヌクレオカプシド蛋白（核蛋白又はＮＰ）、それに対応するｍＲＮＡ配列によって定義されている。この配列はハトレストン及びブラウンリー（Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ　＆　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　）　、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ、　Ｒｅｓ、（１９８２）、１０　（３）：１０２９によって発行されている。

〜麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ　）ウィルスの融合蛋白（Ｆ）、−配列　Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ　のエピトープを含有するペプチド、このエピトープは、インフルエンザウィルスタイプＡの核蛋白に特徴的である。

−配列：　Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−＾ｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ −Ｖａｌ−Ｔｈｒを含むペプチド。

−レシュナ−（Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ　）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９９０）　１８９：４６３に記載の、ヒトの乳癌に関連するＨ２３−ＥＴＡ腫瘍抗原。

一配列　Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘ　−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈ　Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｙ−Ａｒｇ− Ｐｒｏ−Ｘ　（但し、ＸはＰｒｏ又はＡｌａ及びＹ　はＴｈｒ又はＡｓｎである。）を有する抗原Ｈ２３−ＥＴＡの主要エピトープを含むペプチド。

本発明のＲＮＡデリバリ−ベクターは、種々のＲＮＡフラグメントを含み、これらフラグメントは各々特異的な抗原決定基をコードしている。例えば、本発明のＲＮＡデリバリ−ベクターは、インフルエンザの予防的処置を目的としておりニーインフルエンザウィルスタイプＡの核蛋白をコードするＲＮＡフラグメント及びインフルエンザウィルスタイプＢの核蛋白をコードするＲＮＡフラグメントの両方を含有するか又は、 −インフルエンザウイルスタイプＡの核蛋白をコードするＲＮＡフラグメント及び１種又はそれ以上のＲＮＡフラグメントの両方を含有し、後者の各々は、インフルエンザウイルスの特異的な株の血球凝集素をコードする。

本発明の目的のために、ＲＮＡフラグメントは、常法によって得られ、例えば、化学合成又は対応するＤＮＡフラグメントのインビトロ（ｌ’ｎｙｚ″ｔｒｏ）での転写によって得られる。

“リポソーム”は、脂質からなる２層の膜で実質的に作られている小胞を意味すると理解される。そのような小胞は、１又は２以上の膜の層を有することができる。第１の場合は、小胞は単層状（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　）と言われ、第２の場合は、小胞は、オリゴ−又は多層状（ｏｌｉｇｏ−ｏｒｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ　）と言われる。典型的には、リポソームの膜は、他の脂質構成物に関連又はそうでない燐脂質のような両親媒性の脂質からなる。適当な燐脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、カルシオリビン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸及びホスファチジルグリセロールが挙げられる。更に、ヒドロキシル、イミダゾール、アミン、アミド、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｉｄｒｙｌ　）基などの種々の基を含む、上述の燐脂質又はそれ以外から合成又はそうでない方法によって得られる合成燐脂質の使用も認識されている。

好ましくは、ステロイド、コレステロール及び脂肪族アミンのような他の脂質が、燐脂質に混合されるのがよい。

そのような脂質は、特に安定化剤又は抗酸化剤とし７て有用である。

本発明の目的のために、第一に有利な脂質の混合物は、適当な割合で混合したホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロール（ＣＨ）からなる。しかしながら、満足するＰＣ：ＣＨの割合は、５：１から５：５のオーダー（割合）である。等しい割合のその様な混合物が、特に好ましい。第２に有利な混合物は、適当な割合で混合したホスファチジルコリン、コレステロール及びホスファチジルセリン（Ｐ　Ｓ）からなる。例えば、ＣＨ／ＰＣ／ＰＳは、５：４：１の割合である。

リポソームの製造及びＲＮＡのパッケージングは、公知の技術によって行われる。特に、通常使用されるＤＮＡのパッケージング技術が、この場合に適用できる。

更に、膜は、膜に挿入された種々の蛋白質を含有することもでき、それは、直接、或いは結合剤を介して膜脂質に共有結合を通してくっついているか又は単純に燐脂質と相互作用して結合している。蛋白質が、共有結合を通して脂質と結合すると、好ましくは、ホスファチジルエタノールアミンのようなアミンの官能基を保有している脂質がよい。

これらの蛋白質は、特異的なカテゴリーの細胞でリポソームをターゲットとするための因子として、有利に使用できる。それらは例えば、モノクローナル抗体又はリンホカインである。

本発明の目的のために、腫瘍又は病原性因子のための抗原決定基をコードするＲＮＡフラグメントは、インターロイキン−１をコードするＲＮＡフラグメント、インターロイキン−４をコードするＲＮＡフラグメント又はインターロイキン− ２をコードするＲＮＡフラグメントによって、有利に付随され、特に、インターロイキン−２をコードするＲＮＡフラグメントが好ましい。

本発明によって追及される目的に従って、抗原決定基−又はインターロイキン− をコードするＲＮＡフラグメントは、コードする配列に加えて、後者を翻訳するのに要求されるすべての要素を含有する。

種々のＲＮＡフラグメントが、本発明のベクター又は薬学的組成物を構成するとき、少なくとも一つの多シストロン性のＲＮＡフラグメントを形成するために、部分的又は完全に互いに結合してもよい。

最後に、本発明の薬学的組成物は、通常の方法によって製造される。特に、本発明の治療剤は薬学的に許容される希釈剤又は担体を含有する。本発明の組成物は、ワクチンの分野で使用されている通常の投与形態で投与され、特に、注射用懸濁液の形態で皮下投与、訪中投与又は静脈投与によって投与される。皮下投与が、本発明の組成物を投与するには、特に、有利である。投与は、単回投与又は一定の間隔をおいて一度又は数回の投与を行う。適当な投与量は、種々のパラメーター、例えば、治療される個人又は投与モードによって変化する。

本発明を以下の図面を参照して例示する。

ＦＩＧ、１は、プラスミドｐＧＥＭ−３２を示す。

ＦＩＧ、２は、プラスミドｐＴＧ３００３　Ｃベース（ｂａｓｅ）ｐ　Ｇ　ＥＭ　−３Ｚ）　、ｐ　ＰＭ２　（ベースｐＵｃ１８）　、ｐＰＭ３　（ベースｐＵｃ１８）　、ｐＰＭ４　（ベースｐＵｃ１８）　、ｐＰＭ５　（ベースｐＧＥＭ −３Ｚ）及びｐＰＭ６（ベースｐ　Ｇ　ＥＭ−３Ｚ’）の挿入を図解的に示したものである。ＮＰ＝核蛋白、ＩＬ−２＝インターロイキン−２；Ｓ、シグナル＝ＩＬ−２のプレカーサーのシグナル配列；３−ＮＴＲβＧ＝ウサギβ−グロビン遺伝子の翻訳されていない３′末端。

ＦＩＧ、３は、プラスミドｐＰＭ９、ｐＰＭｌｏ、ｐＰＭｌｌ及びｐＰＭ１２（それぞれｐＧＥＭ−４Ｚをベースとしている）の挿入を図解的に示したものである。５−ＮＴＲｉ３Ｇ＝ウサギβ−グロビン遺伝子の翻訳されていない５′末端。

実施例　１：インフルエンザウィルスタイプＡの核蛋白をコードするＲＮＡを詰めたリポソームの製造ＬＡ、そのＲＮＡの製造インフルエンザウィルスタイプＡ１株Ａ／ＮＴ／６０／６８（ハトレストン及びブラウンリー（Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ　＆　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）　、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ、　Ｒｅｓ、（１９８２）、１０　（３）：１０２９　’）の核蛋白をコードするｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−８ａ　Ｉ　Ｉフラグメントを、プラスミドｐＮＰ２８　（ジョーンズ及びブラウンリー（Ｊｏｎｅｓ　＆　Ｂｒｏｖｎｌｅｅ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）　（１９８５）、３５：３３３）の消化によって得る。

Ｔ７フアージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターの支配下に、核蛋白をコードするｃＤＮＡを置くために、ＥｃｏＲＩ−８ａ　Ｉ　Ｉフラグメントを、Ｅｃ。

ＲＩ及び５ａｌＩで消化されたプラスミドｐＧＥＭ−３２（プロメガ　コープ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ）、ＦＩＧ、１）に挿入する。プラスミドｐＴＧ３００３がこのようにして得られる。

プラスミドｐＴＧ３００３を、その後、５ａｌＩで消化することによって直線化し、販売者の説明書に従って、インビトロ転写キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、カタログ番号　２００　３４１）を用いて転写する。このようにして得られたＲＮＡは、転写バッファー中にｍ７Ｇ　（５−）　Ｉ）Ｉ）ｐ（５”）　Ｇ　（７ｙルマシア、製品番号　２７−４６３５）の５ｍＭ溶液１０μｌを加えることによってキャップされる。

１Ｂ、リポソームの製造クロロホルム中に、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で粉末フロダクト（シグマ（Ｓｉｇｍａ）　）を溶解させることによって、コレステロール溶液を製造する。その後、３０−ｍｌのコルテックスチューブに、５８μｌのコレステロール溶液及び１１０μｌのホスファチジルコリン溶液（１００ｍ　ｇ　／　ｍｌ　（シグマ））。最終的な混合物は、約３０μｍｏｌの脂質を含む。

この混合物を、ポルテックス上で激しく攪拌する。その後、溶媒を４０℃で蒸発させる。乾燥操作は、約１時間凍結乾燥によって完了する。

チューブの底に沈殿した脂質の層を１ｍｌの水に移動させる。混合物を、ポルテックス上でホモジナイズし、ブラウンラブソニックＬソニケータ−（Ｂｒａｕｎ　Ｌａｂｓｏｎｉｃ　Ｌ　５ｏｎｉ（ａｔｏｒ）を用いて最小の振動数で超音波処理を行う。該操作は、１５秒間の間欠経過（ｉｎｔｅｒＩｌｉｔｔｅｎｔ　ｐａｓｓａｇｅｓ　）で１０分間行い、コールドの中で３０秒間放置することによって分離させた。このようにして得られた懸濁液を、チタニウム粒子及び最も大きい小胞（バイオフエージ／ヘラオス（Ｂｉｏｆｕｇｅ／Ｈｅｒａｅｕｓ）エッペンドルフチューブ中）を沈殿させるために、４℃、１５分間１６．００Ｏｒｐｍで遠心する。その後、大きさが直径約５０ミクロンの単層状の小胞をほとんど含む上滑を、１５　ｍ　ｌのコルテックスチューブ内に回収する。

Ｂ）で得られた小胞懸濁液に、Ａ）で得られた約４０μｇのＲＮＡに相当する１３５μｌのＲＮＡ調製物を加える。

垂直の状態に維持されたチューブを指の間で回しながら、混合物を液体窒素の中にゆっくり浸した。混合物が完全に凍った時に、終夜凍結乾燥にかける。

凍結乾燥した生成物を、徐々に１００μｌの蒸留水に再水和させる。その後、組成が１４０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＩ、０．７５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２０゜２５ｍＭ　ヘペス（Ｈｅｐｅｓ　）であるヘペスバッフ７−ｐＨ７，０５０，９ｍｌを、そこに滴下する。小胞の懸濁液を、ボアー（ｐｏｒｅ）の直径が４００　ｎｍと２００　ｎｍである第１と第２のフィルターを通して連続的に押し出すことにより、換算する（ｃａｌｉｂｒａｔｅ　）。この様に得られた懸濁液は、ＲＮＡをカプセル化した多層状の小胞を含有している。

カプセル化されていないＲＮＡを、実質的に取り除くために、懸濁液を、あらかじめヘペスバツフア−で平衡化したセファロース４Ｂカラム（１０ｍｌ、１ｃｍの横断面（ｃｒｏｓｓ　５ｅｃｔｉｏｎ　）を有するカラム）にかけた。溶出は、ヘペスバッファーで行った。溶出された画分は、外見は白く、小胞を含有し、共に集められる。これは約２ｍｌの容量に相当する。

実施例　２：インフルエンザウィルスタイプＡの核蛋白を、コードするＲＮＡを装填したリポソームによって開始されるＣＴＬ応答の誘導それぞれ、（ｉ）試験、（ｉｉ）ポジティブコントロール及び（ｉｉｉ）ネガティブコントロールに相当する３種のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、以下のように調製する。

（ｉ）試験：マウスは、実施例１で得られたリポソーム調製物２００μｍの静脈注射を受ける。

（ｉｉ）ポジティブコントロール：マウスは、インフルエンザウィルスタイプＡ１カニン株（ｓｔｒａｉｎ　Ｃａｅｎ　）（Ａ−Ｃａｅｎ）の１３０の血球凝集単位を腹腔内注射によって受ける。種々のタイプＡの株は、時々血球凝集素又はノイラミニダーゼにようなある蛋白質においてお互い異なるが、それは決して核蛋白でない。一方、バリエーションが核蛋白に関してタイプＡ及びＢウィルス間で存在する。

（ｉｉｉ）ネガティブコントロール：マウスは、ＲＮＡの添加が省略された実施例１と同様にして調製されたりポソームの調製物２００μｌを静脈注射によって受ける。

１５日後、（ｉ）と（ｉｉｉ）のマウスは、同じ条件下第１回目と同様な注射を受ける。

第２の注射の１５日後、マウスの牌臓を取り出し、切裂する。赤血球を浸透圧衝撃によって除去する。その後、牌細胞を、１０％牛脂児血清、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、５０μＭ　β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ　ヘペス、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、ｌＯ単位／ｍｌ　ペニシリン、１０μｇ　／　ｍ　１　ストレプトマイシン、２．５μｇ　／　ｍ　１　アンフォテリシン及び非必須アミノ酸（フローラボ（Ｆｌｏｗ　１ａｂｓ）　）を添加したＤＭＥＭ培養培地（ギブコ）中、２ｍｌの溶液中５．１０６細胞／ウエルの量で、マルチウェルプレート中で培養する。

この培地は、式：　Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ −Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−ＧｌｙのＮＰ　１４７−１５８Ｒペプチド　５μＭを更に含有する。このペプチドは、インフルエンザウィルスタイプＡで免疫される時、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴＬによってシステマティックに認識されるエピトープに相当する（ボッド７−　（Ｂｏｄｍｅｒ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）　（１９８８）　５２　：最初の培養培地を新鮮な培地に置き換える。それぞれのウェルに、免疫を受けていないＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの５１０６牌細胞をさらに加える、但し、これらの細胞は、４０００ラド（Ｒａｄ　）のガンマ放射線によって、照射されていた。

培養第１２日月に、ＣＴＬの活性を、特にマーチノン（Ｍａｒｔｉｎｏｎ）　ら、Ｊ　、Ｉ　ｍｍｕ　ｎ　ｏ　１．　（１９８９）　１４２．３４８９に記載の通常の５１Ｃｒ遊離試験によって検出する。詳細は以下の通りである。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（Ｐ　８１５細胞）と組織適合性のある（Ｈ−２ｄ）ＤＢＡ／２マウスの１から１０×１０６個の肥満細胞腫細胞を、ＤＭＥＭ培地中、１００μＣｉのＮａ　２　Ｃｒ　Ｏ４（ＣＥ　Ａ　１フランス）の存在下、３７℃で１時間インキュベートする。細胞を２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地に入れる。

インフルエンザウィルス　タイプＡ１パンコック株（ｓｔｒａｉｎ　Ｂａｎｇｋｏｋ）に感染したＰ８１５細胞（Ｐ８１５／Ａ−Ｂａｎ）、又はインフルエンザウィルス　タイプＢヤマガタ株（ｓｔｒａｉｎ　Ｙａｍａｇａｔａ　）に感染したＰ８１５細胞（Ｐ８１５／Ｂ−Ｙａｍ）を用いて操作を繰り返す。Ｐ８１５細胞の感染は、事前に以下のようにして行う。０．５ｍｌのＤＭＥＭ培地中培地中側０６個を、１００血球凝集単位のウィルスで感染させる。３７℃で９０分後、細胞を１０％ＦＣ３を添加したＤＭＥＭ培地２０ｍ１で洗浄し、感染を終了する。ウィルス蛋白質の発現は、細胞が細胞溶解試験に使用されるまで３７℃３時間で行う。

その後Ｐ８１５細胞（ターゲット細胞）を、ウェルあたり３０００細胞の量でマイクロタイタープレートのウェルに分散させる。（ｉ）　、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の３つの場合において、ＤＭＥＭ培地中の牌細胞（エフェクター細胞）を各ウェルに加え、約１００／１から０．３／１のエフェクター細胞／ターゲット細胞の種々の割合の形成を行う。ペプチドＮＰ１４７−１５８Ｒ−を最後に最終濃度２．５μＭとなるように加える。最終の容量は、各ウェルあたり２００μｌである。

プレートをその後３７℃で４時間インキユベートシ、遠心する。１００μｌの上清を各ウェルから除去する。それぞれの試料の放射活性を測定し、結果をＣＴＬ活性によるクロム遊離の割合で以下の表に示す：（観察された遊離−自発的な遊離）１００Ｘ□ （添加されたクロム総量−自発的な遊離）感染　エフェクター　Ｐ８１５／−Ｐ８１５　Ｐ８１５　Ｐ８１５／ターゲット　／ＮＰ　／Ａ−Ｂａｎ　／Ｂ−Ｙａｍポジティブ　４０　＜５　７１　６３　＜５コントロール　１３　＜５　５２　４６　＜５（Ａ−Ｃａｅｎ）　４．４　＜５　４５　４６　＜５１．５＜５　３２　２９　９ネガテイブ　２２　＜５　１０　１１　８コントロール　７．４＜５　＜５　７　＜５２．５＜５　＜５　８　＜５０．８＜５　＜５　１０　＜５試験２２　１０　５３　５０　１０７．４＜５　３９　２８　５２．５＜５　１８　２０　５０．８＜！５　＜５　１２　＜５実施例　３：インフルエンザウィルスタイプＡの核蛋白をコードするＲＮＡを装填したリポソームの第２の調製３Ａ、ＲＮＡは以前ＩＡ、に記載したようにして得る。

３Ｂ、リポソームの製造コレステロール溶液を、クロロホルム中に１００ｍｇ／ｍｌの濃度で粉末のプロダクトを溶解させることによって調製する。その後、３０−ｍｌのコルテックスチューブに、５８μｌのコレステロール溶液、１７６μｌのジパルミトイルホスファチジルコリン溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）及び２１９μｌのホスファチジルセリン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を混合する。最終的な混合物は、約３０μｍｏｌの脂質を含む。

チューブの底に沈殿した脂質の層（約３０μｍｏｌ　）を、３００μｒｎｏｌのオクチル−β−グルコシド中に入れる。該溶液は透明である。

３Ａで調製されたＲＮＡ約５０μｇを、この調製物に加える。界面活性剤を除去する為に、混合物を１５０ｍＭＮａＣ１及び２．７ｇの吸収性のバイオビーズ− ３Ｍ２（Ｂｉｏｂｅａｄｓ−３Ｍ２）　（９ｍ　ｇの吸収剤／界面活性剤μｍｏｌｅ）を含有する１０ｍＭ　へペス　バッファーｐＨ７，０５に対して透析する。透析は、室温で１６時間攪拌して行う。

小胞の懸濁液をポアーの直径が２００ｎｍである膜を通して４０℃で３回連続的に押し出すことにより換算する（ｃａｌｉｂｒａｔｅ　）。最後にセファロースＣＬ４Ｂカラムを用いて、ヘペスバツフア−で溶出する。

実施例　４　：　（ｉ）インフルエンザウィルスタイプＡの核蛋白及び（ｉｉ）ヒトインターロイキン−２をコードするＲＮＡ５を装填するリポソームの調製４Ａ、ＲＮＡの調製ＩＡ、に記載したプラスミドｐＴＧ３００３を、部分的に５ｐｈＩで消化し、フレノウポリメラーゼで処理する。

それを、Ｍ１ｕＩリンカ−を挿入することによって、再度連結し、３′のＮＰをコードする配列中に位置している５ｐｈＩ部位を失い、Ｍ　ｌ　ｕ　Ｉで置き代わったプラスミドが選択される。即ち、プラスミドｐＰＭ１である。

一方、ＩＬ〜２をコードする配列は、リファレンスＢＢＧ３の下で、ブリティッシュバイオテクノロジーによって販売されているファージＭ１３から、ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａエフラグメントの形態で回収される。このフラグメントを、ｐＵｃ１８　（ブイエラ　アンド　メッシング（Ｖｉｅｒａ　＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）　（１９８２）　１９　：　２５９　）に挿入し、プラスミドｐＰＭ２を得る。

ウサギβ−グロビン遺伝子（カファトス（Ｋａｆａｔｏｓ）ら、を含有するＸｂａＩ−Ｈｉｒ；＋ｄＩＩＩフラグメントを、プライマーＯＰＭＩ及びＯＰＭ２を用いてＰＣＲによって合成する。

５’　ＴＸＴＩ’？Ｃ？ｌ（！ＪＬＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡλＴＡＣＣＡＣｒＧＡＣ３’’　ＨｉｎｄエエエＭｌｕ工５′　入ん〜すｍテテλＣＧＣＣＡＡＴＧＡＡＪｉＡＴＡＡＡＴＴｒＣＣ３’このフラグメントを、事前にＸａｂＩ及びＨｉｎｄＩＩ工で消化したｐＰＭ２に挿入する。プラスミドｐＰＭ３をこのようにして得る。

ヒトＩ　Ｌ−２のシグナルペプチドをコードする配列を含有する合成したＤＮＡフラグメントを、あらかじめＥｃ。

ＲＩ及びＸｈｏＩで消化したｐ　Ｐ　Ｍ　３に挿入し、プラスミドｐ　Ｐ　Ｍ　４を得る。

この合成りＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成する。

ＥｃｏＲＩ　ＳａｌＩ５’　ＪＩＪｋ？ＴＣＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＡＧＧＣＣＴＡＴＣＣＡＣＣ５ＴＡＣＡＧＧ　ＡＴＣＣ入ＡＣＴＣＧＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＣＡＴ’ｒ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＡＧＴ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＣＴＴ　ＧＴＣＡＣＡ　ＡＡＣλＧＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＡＣＴ　ＡＧＣ３’Ｘｈｏ工０１’Ｍ４　：５１　テＣＧ１ＧＣＴ　ＡＧＴ　ＡＧＧ　入ＧＣＡＣＴ　ＧＴＴ　τＧＴ、、、にＡ（：　入ＡＧ　ＴＧＣ入ＡＧＡＣＴ　ＴＡＧ　ＴＧＣＭＴ　ＧＣＡ　ＴＧＡ　ＣＡＣＧＡＧ　ＴｒＧ　ＣＡＴ　−ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＣＡＴ最後に、ＩＬ−２プレカーサー及びウサギβ−グロビン遺伝子の翻訳されていない３′領域をコードするユニットを、予め、５ａｌＩ及びＭｌｕＩで消化したｐＰＭＩに挿入するためにＳａｌＩ−Ｍ１ｕＩフラグメントの形で９２Ｍ４から回収し、プラスミドｐＰＭ５を得る。

プラスミドｐＰＭ５を、Ｍ　１　ｕ　Ｉ消化によって直線にし、インビトロ転写キット（アンピオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガスクリプト（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ））を用いて転写する。このようにして得られたＲＮＡを転写溶液中、１０μｌのｍ７Ｇ　（５−）　ｐｐｐ（５−）Ｇ　（７ｙ／ｌｚ７シ７、製品番号２７− ４６３５）の５ｍＭ溶液を加えることによって、キャッピングを行う。

４Ｂ、リポソームの調製は、３Ｂの記載と同様にして行う。

４Ａで得られた約６６μｇのＲＮＡを脂質３０μｍｏｌあたり用いる。

コードするＲＮＡを装填した第３の調製５Ａ、ＲＮＡの調製プラスミドｐＰＭ５を、５ｔｕＩ及びＨｐａＩで消化し、実質的にＩＬ−２プレカーサーをコードする全領域を取り除く、その後、再度結合させて、プラスミドｐＰＭ６を得る。

ｐＰＭ６をその後、Ｍ１ｕＩ消化によって直線にし、インビトロ転写キット（アンピオンのメガスクリプト）を用いて転写する。このようにして得られたＲＮＡを転写溶液中、１０μｍのｍ７Ｇ　（５−）　ｐｐｐ（５−）Ｇ　（ファルマシア、製品番号２７−４６３５）の５ｍＭ溶液を加えることによって、キャッピングを行う。

５Ｂ、リポソームの調製は、３Ｂの記載と同様にして行う。

５Ａで得られた約６６μｇのＲＮＡを脂質３０μｍｏｌあたり用いる。

実施例　６：風疹（ｍｅａｓｌｅｓ　）ウィルスの融合蛋白をコードするＲＮＡを装填したリポソームの調製６Ａ、ＲＮＡの調製特許出願ＥＰＡ３０５．２０９に記載したプラスミドｐＴＧ２１４８は、融合蛋白（バックランド（Ｂｕｃｋｌａｎｄ）ら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、（１９８７）　６８：１６９５）をコードするＤＮＡフラグメントを含有する。ｐＴＧ２１４８を、融合蛋白をコードする遺伝子の翻訳されていない５′領域を除去するために、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨｐａＩで消化する。それは、オリゴヌクレオチドＯＰＭ５及び６のハイブリダイゼーションによって再構築されたウサギβ− グロビン遺伝子の翻訳されていない５′領域によって置き代えられる。プラスＨｉｎｄエエＩＨｐａＩＨｉｎｄＩＩＩ一方、プラスミドｐＧＥＭ−４２（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　）を、ＥｃｏＲＩで消化し、フレノウポリメラーゼで処理する。Ｍ　ｌ　ｕ　Ｉリンカ−を挿入することによって、再度結合させ、プラスミドｐＰＭ８を得る。

最後に、β−グロビン遺伝子の翻訳されていない５゛領域及び融合蛋白をコードする配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ−３ａｃＩフラグメントの形でｐＰＭ７から回収する。このフラグメントを、事前にＨｉｎｄＩＩＩ及び５ａｃＩで消化したｐＰＭ８に挿入する。プラスミドｐＰＭ９をこのようにして得、ここでは、融合蛋白をコードする配列はＴ７プロモーターの支配下に置かれている。

ｐＰＭ９をＭ　ｌ　ｕ　Ｉ消化によって直線化し、その後、インビトロ転写キット（アンピオンのメガスクリプト）を用いて転写する。このようにして得られたＲＮＡを転写溶液中、１０μｍのｍ７Ｇ　（５−）　ｐｐＩ）（５−）Ｇ　（７ｙルマシア、製品番号２７−４６３５）の５ｍＭ溶液を加えることによって、キャッピングを行う。

６Ｂ、リポソームの調製は、３Ｂに記載と同様にして行う。

６Ａで得られた約６０μｇのＲＮＡを脂質３０μｍｏｌあたり用いる。

実施例　７：風疹ウィルスの融合蛋白をコードするＲＮＡを装填したリポソームの第２の調製７Ａ、ＲＮＡの調製ここに、配列（２重鎖）が以下のようである調製された合成りＮＡフラグメントがある。

ＥｃｏＲＩ　ＸｂａＸ　Ｍｌｕ工５’　ＧＪｕＴＴｃｃＡｃＴｃＴｋＧｋｃｋｃλ　コ′コ′　丁ＣＧλＣＴＴ入入ＧＧＴＧλＧ入τＣテＧＴＧ’！’ＧＣＧＣ５１ＳａｌＩ粘着性の末端このＤＮＡフラグメントを、予め５ａｃＩ及びＭ　１　ｕ　Ｉて消化したｐＰＭ９に挿入し、５ａｃＩを含有しないプラスミドｐＰＭ１０を得る。

β−グロビン遺伝子の翻訳されていない３−末端を含有するｐＰＭ５のＸｂａＩ −Ｍ１ｕＩフラグメントを回収し、事前にＸｂａＩ及びＭ　ｌ　ｕ　Ｉで消化したｐＰＭｌｏに挿入し、プラスミドｐ　ＰＭＩ　１を得る。

ｐＰＭＩ　１をＭ１ｕＩ消化によって直線化し、その後、インビトロ転写キット（アンピオンのメガスクリプト）を用いて転写する。このようにして得られたＲＮＡを転写溶液中、１０μｌのｍ７Ｇ　（５−）　Ｉ）Ｉ）ｐ（５−）　Ｇ　（ファルマシア、製品番号２７−４６３５）の５ｍＭ溶液を加えることによって、キャッピングを行う。

７Ｂ、リポソームの調製は、３Ｂに記載と同様４こして行う。

７Ａで得られた約６０μｇのＲＮＡを脂質３０μｍｏｌあたり用いる。

実施例　８　：　（ｉ）風疹ウィルスの融合蛋白及び（ｉｉ）ヒトインターロイキン−２をコードするＲＮＡを装填したリポソームの調製８Ａ、ＲＮＡの調製ＩＬ−２プレカーサー及びプラスミドｐＰＭ４のβ−グロビン遺伝子の翻訳されていない３゛領域をコードするユニットを、ＥｃｏＲＩ−Ｍ１ｕＩフラグメントの形で回収する。このフラグメントを予め、ＥｃｏＲＩ及びＭｌｕＩで消化したｐＰＭｌｌに挿入し、プラスミドｐＰＭＩ２を得る。

ｐＰＭＩ２を、Ｍ１ｕＩ消化によって直線にし、インビトロ転写キット（アンピオンのメガスクリプト）を用いて転写する。このようにして得られたＲＮＡを転写溶液中、１０μｍのｍ７Ｇ　（５”）ｐｐｐ（５−）Ｇ　（ファルマシア、製品番号２７−４６３５）の５ｍＭ溶液を加えることによって、キャッピングを行う。

８Ｂ、リポソームの調製は、３Ｂに記載と同様にして行う。

８Ａで得られた約８７μｇのＲＮＡを脂質３０μｍｏｌあたり用いる。

実施例　９：実施例３．４及び５で調製されたリポソームによって開始されるＣＴＬ応答の誘導ＣＴＬ応答を、２つの修−を除いて実施例２と同様の方法によって検出し、分析する。即ち、実施例３．４及び５で得られた各リポソーム調製物５００μｍをマウスに注射するのに用いる（第１の注射及びブースター）及び注射は皮下注射で行う点に特徴がある。

数種の試験を第１の注射の後１５日目に行う。

一方、平行して行われる試験によって、（ｉ）リポソームと混合しているがカプセル化されていないＲＮＡ及び（ｉｉ）純粋なＲＮＡを試験することが可能となる。（ｉ）の場合、約３０μｍｏｌの脂質に相当するＲＮＡの添加以外は３Ｂに記載の方法に従って調製される空のリポソームが混合されたＩＡで調製されたＲＮＡ５０μｇを０．５−１ｍ１の容量で、注射される。（ｉｉ）の場合、ＩＡで調製されるＲＮＡ５０μｇを、約０．５−１ｍ１の容量で注射する。

結果を以下の表に示す。

（２＠注射）これらの結果より、特に以下のことが判るニーＲＮＡだけでは、免疫応答を誘導するには効果がない。

−リポソームと混合されてはいるが、リポソームにカプセル化されていないＲＮＡは、免疫応答を誘導するには効果がない。

一リポソーム中にカプセル化されているＮＰのみをコードするＲＮＡは、ブースター後のみ免疫応答を誘導することができる（比較試験１及び３）及び −リポソーム内にカプセル化されているＮＰ及びＩ　Ｌ−２をコードするＲＮＡは、単回注射後免疫応答を誘導することができる（比較試験２及び３）。

実施例　１０：実施例６．７及び８で調製されたリポソームを用いる風疹ウィルスの対するマウスの免疫化使用する動物モデルは、ドリリエン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ）ら、ＰＮ　Ａ　Ｓ　（１９８８）　８５　：　１２５２に、実質的に記載されている。

８匹のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを５バツチで形成されている。

一つのバッチは、ポジティブコントロールとして保存する。これらのマウスは、腹腔内に単回注射でワクシニアウィルス（ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ）　ＶＶ　Ｔ　Ｇ　Ｆ　Ｍ　１１７３の４×１０７プラークー形成単位（ｐｌａｑｕｅ −ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）を受ける。ＶＶＴＧＦＭＩ　１７３は、風疹ウィルスの融合蛋白遺伝子を含有する。それは、活性免疫原性物質として記載されていた（ドリリエンら、上記）。

一つのバッチは、ネガティブコントロールとして保存している。これらのマウスは、約３０ｍｏｌの脂質を３Ｂ（ＲＮＡの添加を除く）で記載した方法に従って調製した空のリポソームの形態で、皮下注射によって、第１の注射及び１５日後のブースターとして受ける。

他の３つのバッチは、試験用として保存する。マウスは、皮下投与で第１の注射及び１５日後のブースターを受ける。

第１の注射及びブースターは、それぞれ、実施例６．７及び８のリポソームの調製物の約０．４−０．６ｍｌに対応する。

ブースター後約１５日に、あらかじめ風疹ウィルスの５ＳＰＥ分離株（ｉｓｏｌａｔｅ　）を感染させた新生児マウスの脳細胞の１０％懸濁液５０　１を、大脳内に注射することによって、マウスを試験する（ワイルド（ＩＩ　ｉ　１　ｄ）ら、Ｊ、　Ｉｅｄ−Ｖｉｒｏｌ、（１９７９）　４：　１０３　）。

この試験によって、実施例６．７及び８のリポソームは、ＶＶＴＧＦＭ１１７３の免疫原性活性と同様の免疫原性活性を有することが判明する。

車Ｔｋ早開＠５２６フロントページの続き（７２）発明者　クリシュナン　シバダサンフランス国　６９００５　リョン　リュ　ドウアクデュック　２１（７２）発明者　マーティノン　フレデリックフランス国　９２１２０　モンルージュ　アへニュ　ドウ　ラ　レビュブリツク　２６　ビス

Claims

【特許請求の範囲】

１．リポソーム及び腫瘍又は病原性因子の特徴を有する抗原決定基をコードする少なくとも１種のメッセンジャーＲＮＡフラグメントを含有するＲＮＡデリバリーベクターであって、少なくとも１種の前記ＲＮＡフラグメントが該リポソーム内にカプセル化されているＲＮＡデリバリーベクター。
２．リポソーム、腫瘍又は病原性因子の特徴を有する抗原決定基をコードする少なくとも１種のＲＮＡフラグメント及びインターロイキン−２をコードするＲＮＡフラグメントを含有する請求項１に記載のＲＮＡデリバリーベクターであって、該少なくとも１種のＲＮＡフラグメント及びインターロイキン−２をコードするＲＮＡフラグメントが、該リポソーム内にカプセル化されているＲＮＡデリバリーベクター。
３．該少なくとも１種のＲＮＡフラグメント及びインターロイキン−２をコードするＲＮＡフラグメントが、多シストロン性のＲＮＡフラグメントを形成するように、互いに結合されている請求項２に記載のＲＮＡデリバリーベクター。
４．該少なくとも一種のＤＮＡフラグメントが、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシド蛋白及び該ウイルスの血球凝集素から選択されるインフルエンザウイルスに特徴的な抗原決定基をコードする請求項１から３のいずれかに記載のＲＮＡデリバリーベクター。
５．第１のＲＮＡフラグメントが、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシド蛋白をコードし、第２のＲＮＡフラグメントが、インフルエンザウイルスの血球凝集素をコードする請求項４に記載のＲＮＡデリバリーベクターであって、該第１及び第２のＲＮＡフラグメントが、該リポソーム内のカプセル化されて多シストロン性のＲＮＡフラグメントを形成するように、互いに結合されているＲＮＡデリバリーベクター。
６．腫瘍又は病原性因子によって誘導される疾患の治療又は予防を目的とする薬学的組成物であって、薬学的に許容される希釈剤又は担体と共に、請求項１から５のいずれかに記載のＲＮＡデリバリーベクターを、治療物質として含有する薬学的組成物。
７．腫瘍又は病原性因子によって誘導される疾患の、予防又は治療処理を目的とする医薬物質を調製するための請求項１から６のいずれかに記載のＲＮＡデリバリーベクターの使用。
８．腫瘍又は病原性因子によって誘導される疾患の治療又は予防処理方法であって、そのような治療を要求している患者に、請求項１から６のいずれかに記載のＲＮＡデリバリーベクターを十分な量を投与することを含む方法。