JP2021042193A - 免疫療法用シリカナノスフェア - Google Patents

Abstract

【課題】免疫応答を誘導または増強するためのアジュバントとして、または抗原を身体に送達するための担体としてのシリカナノ粒子を提供する。【解決手段】それを必要とする対象において腫瘍増殖の阻害に使用するための中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）であって、ＨＳＮが対象に投与され、それにより腫瘍中の腫瘍浸潤免疫細胞が増加し、ＨＳＮが単層または多層シリカシェルを含み、各シェルがメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で最も内側の中空閉鎖空間が中実シリカコアを有し、空間が任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的大きさが１５０ｎｍ以下であり、媒体がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）である。【選択図】なし

Description

本開示は、中空シリカナノスフェアの分野に関する。特に、本開示は、免疫応答を誘導または増強するためのアジュバントとして、または抗原を身体に送達するための担体としてのシリカナノ粒子に関する。

メソポーラスシリカナノ粒子はそれらの化学的／熱的安定性、広い表面積、高い負荷能力、調節可能な表面特性、および優れた生体適合性のために、薬物送達システムとして大きな可能性を有すると考えられる。種々シリカナノ材料の中で、中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）の形態および特性は中空内部空間および薄い多孔質シェルを有する点で、一般的なメソポーラスシリカナノ粒子とは異なり、これは、それらが巨大分子（生物活性の成分など）をカプセル化することを可能にし、大きな内部空間のためにより高い負荷能力を示すことを可能にし、そのような目的は例えば、シェルの粒子サイズを調節することによって達成され得る。粒子サイズが高分子よりも小さい場合、シェルは、血液中の循環中に高分子が漏出するのを防ぐことができる。ＨＳＮの形態および特性は、用途ごとに異なる合成戦略に大きく依存する。本発明は、担体およびアジュバントとして作用するＨＳＮが医学的適用（例えば、ワクチン接種）の効力を増強する可能性を探求する。

本発明者らは驚くべきことに、ＨＳＮ自体が、対象において免疫応答を誘導し得、したがって、免疫療法における抗原／アジュバントとして使用され得ることを見出した。さらに、ＨＳＮはまた、免疫療法において抗原（例えば、ネオアンチゲン）を有する担体として使用され得る。

従って、本開示は、その中に小型の生物活性成分を内包するＨＳＮ、および治療、特に免疫療法におけるその適用に関する。特に、小型の生物活性成分は、腫瘍特異的ネオアンチゲンなどのネオアンチゲン、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等である。

したがって、本開示は、それを必要とする対象における腫瘍増殖を阻害する方法であって、該方法は、対象への中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）の投与を含み、それにより腫瘍中の腫瘍浸潤免疫細胞が増加し、ＨＳＮは単層または多層シリカシェルを含み、各々のシェルはメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で最も内側の中空閉鎖空間は中実シリカコアを有し、空間は任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的大きさは１５０ｎｍ以下であり、媒体はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、方法を提供する。一実施形態において、腫瘍浸潤性免疫細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球などを含むが、これらに限定されない。

本開示は、また、中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、ＨＳＮは単層または多層シリカシェルを含み、各シェルはメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で、最も内側の中空閉鎖空間は中実シリカコアを有し、空間は任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的大きさは２００ｎｍ以下であり、媒体はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、方法を提供する。

本発明は、また、中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）と、ＨＳＮ内に内包された小型の生物活性成分とを含むＨＳＮコンジュゲートであって、ＨＳＮは単層または多層シリカシェルを含み、各シェルはメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で、最も内側の中空閉鎖空間は中実シリカコアを有し、空間は任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的大きさは２００ｎｍ以下であり、媒体はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、ＨＳＮコンジュゲートを提供する。

図１は、リンパ節を標的とする能力を有する５０ｎｍのＨＳＮを示す。 図２は、マウスで抗原特異的抗体を誘導する抗原（タンパク質）＠ＨＳＮの効果を示す。 図３は、免疫療法の抗腫瘍効果のＨｅｒ２＿ＥＣＤ＠ＨＳＮを示す。 図４は、ＨＳＮの抗腫瘍効果を示す。 図５は、全身性免疫応答なしに、ＨＳＮの存在により腫瘍内で局所的に増加するＣＤ８ Ｔ細胞、樹状細胞、およびマクロファージを示す。 図６は、ＮｅｏＡｇ＠ＨＳＮによるワクチン接種後２０日目のＣＤ８ Ｔ細胞におけるＩＦＮ−ｒ発現の結果を示す。

本明細書の開示の理解を容易にするために、本明細書で使用される用語は、以下で定義される。
明細書及び特許請求の範囲の文脈において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は特に明記しない限り、複数の指示対象を含む。特に明記しない限り、本明細書で提供される任意のおよびすべての例または例示的な言語（例えば、「そのような（such as）」）は、本発明の範囲を限定するのではなく、単に本発明をより良く例示するために使用されるにすぎない。

本明細書に列挙される任意の数値範囲は、その中に包含される全てのサブ範囲を含むことが意図されることが理解されるべきである。例えば、「５０〜７０℃」の範囲には、５０℃の規定最小値と７０℃の規定最大値との間のすべてのサブ範囲および特定値（例えば５８℃〜６７℃、５３℃〜６２℃、６０℃または６８℃）が含まれる。開示された数値範囲は連続的であるので、それらは最小値と最大値との間の各数値を含む。特に明記しない限り、本明細書に示される様々な数値範囲はおおよそのものである。

本発明において、「約」という用語は当業者によって測定された所与の値の許容可能な偏差を指し、これは、部分的にはその値をどのように測定または決定するかに依存する。

本発明において、特に指定しない限り、本明細書で使用される接頭語「ナノ−」は約３００ｎｍ以下のサイズを意味し、特に指定しない限り、本明細書で使用される接頭語「メソ−」はＩＵＰＡＣによって示唆される定義とは異なり、約５ｎｍ以下のサイズを意味する。

本発明において、本明細書で使用される「シラン」という用語は、ＳｉＨ４の誘導体を意味する。通常、４つの水素のうちの少なくとも１つは、後述するように、アルキル、アルコキシル、アミノなどの置換基で置換されている。本明細書で使用される用語「アルコキシシラン」は、ケイ素原子に直接結合した少なくとも１つのアルコキシル置換基を有するシランを指す。本明細書で使用される用語「オルガノアルコキシシラン」は、ケイ素原子に直接結合した少なくとも１つのアルコキシル置換基および少なくとも１つのヒドロカルビル置換基を有するシランを指す。本明細書で使用される「シリケート源」という用語は、オルトケイ酸の塩の形態またはエステルの形態とみなすことができる物質、例えば、オルトケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、テトラエチルオルトケイ酸（テトラエトキシシラン、ＴＥＯＳ）、テトラメチルオルトケイ酸、テトラプロピルオルトケイ酸を指す。場合により、ヒドロカルビル置換基はヘテロ原子でさらに置換されていてもよいし、中断されていてもよい。

本発明において、本明細書で使用される「ヒドロカルビル」という用語は、炭化水素に由来する１価のラジカルを意味する。本明細書で使用される「炭化水素」という用語は、炭素原子と水素原子のみからなる分子を指す。炭化水素の例としては（シクロ）アルカン、（シクロ）アルケン、アルカジエン、芳香族化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。ヒドロカルビルが上記のようにさらに置換される場合、置換基は、ハロゲン、アミノ基、水酸基、チオール基などであり得る。ヒドロカルビルが上記のようにヘテロ原子で中断される場合、ヘテロ原子はＳ、ＯまたはＮであり得る。本発明において、ヒドロカルビルは好ましくは１〜３０のＣ原子を含む。

本発明において、用語「アルキル」は、好ましくは１〜３０の炭素原子、より好ましくは１〜２０の炭素原子を含む飽和、直鎖または分岐アルキルを指す。アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−エチルブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、１−メチルペンチル、１，３−ジメチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、１，１，３，３−テトラメチルブチル、１−メチルヘプチル、３−メチルヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、１，１，３−トリメチルヘキシル、１，１，３，３−テトラメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、１−メチルウンデシル、ドデシル、１，１，３，３，５，５−ヘキサメチルヘキシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等を含むが、これらに限定されない。

本発明において、本明細書で使用される「アルコキシル」または「アルコキシ」という用語は式「−Ｏ−アルキル」を有する基を意味し、前記式中の「アルキル」の定義は、上記の「アルキル」の意味を有する。

本発明において、用語「シクロアルキル」は、本明細書中で使用される場合、３〜１０個の環状炭素原子およびより好ましくは３〜８個の環状炭素原子、ならびに場合により環上のアルキル置換基を含有する、飽和または部分的に不飽和の環状炭素ラジカルを意味する。シクロアルキルの例としてはシクロプロピル、シクロプロペニル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、２−シクロヘキセン−１−イルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において、「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。

本発明において、本明細書で使用される「アミノ」という用語は式−ＮＲ_１Ｒ_２の官能基を意味し、式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して、水素または上で定義されたヒドロカルビル基を表す。

本発明において、用語「水相」は、本明細書中で使用される場合、水と実質的に混和性である相を意味する。水相の例としては水それ自体、水性緩衝液、水性ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、水性アルカノール溶液などが挙げられるが、これらに限定されない。水相は、合成の要求および／または水相中に存在する物質の安定性に基づいて、酸性、中性またはアルカリ性であるように調整することができる。

本発明において、用語「油相」は、本明細書中で使用される場合、上記のような水相と実質的に非混和相を意味する。油相の例としては液体、置換または非置換（シクロ）アルカン（例えば、ヘキサン、デカン、オクタン、ドデカン、シクロヘキサンなど）；置換または非置換芳香族溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明において、本明細書中で使用される「生物活性成分」という語は、生物において活性を有する物質を指す。生物活性成分の例としては酵素、タンパク質薬物、抗体、ワクチン、抗原、抗生物質またはヌクレオチド薬物が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中でいう「ネオアンチゲン」とは、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドなど、より小さなサイズの生物活性成分をいう。

中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）の医療用途
本発明者らは、驚くべきことに、中空シリカナノスフェアー（ＨＳＮ）自体が、薬物送達剤として機能するだけでなく、医療用途、特に免疫療法において有用な特定の特性を示す可能性があることを見出した。

一態様において、本開示は、それを必要とする対象における腫瘍増殖を阻害する方法であって、該方法は、対象への中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）の投与を含み、それにより腫瘍中の腫瘍浸潤免疫細胞が増加し、ＨＳＮは単層または多層シリカシェルを含み、各々のシェルはメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で最も内側の中空閉鎖空間は中実シリカコアを有し、空間は任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的大きさは１５０ｎｍ以下であり、媒体はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、方法を提供する。一実施形態において、腫瘍浸潤性免疫細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球などを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＨＳＮのサイズが３０〜１５０ｎｍ、好ましくは４０〜１００ｎｍの範囲である。

ＨＳＮのサイズ、例えば流体力学的サイズなどは、それらが用途に適しているかどうかを決定するために重要であることに留意されたい。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）はナノ粒子の「元の」サイズを測定するための１つの従来の手段であるが、流体力学的サイズは媒体中に存在するナノ粒子の「見かけの」サイズをより厳密に反映し得る。特に、ＨＳＮの流体力学的サイズは、それらが生きている対象に適用され得るかどうかを直接的に決定し得る。ＨＳＮの流体力学的サイズが大きすぎる場合、それらは容易に凝集するか、または媒体中で増殖する。この現象、すなわち凝集は送達効率を妨げるだけでなく、医療用途において負の効果、例えば、循環系の詰まり、免疫系による迅速なクリアランスなどをもたらし得る。流体力学的サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定できる。

別の態様は、中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、ＨＳＮは単層または多層シリカシェルを含み、各シェルはメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で、最も内側の中空閉鎖空間は中実シリカコアを有し、空間は任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的大きさは２００ｎｍ以下であり、媒体はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、方法である。

一実施形態では、USSN 15/681,207（その全記載は参照により本明細書に援用される）に記載されているＨＳＮおよびその調製方法を本発明に適用することができる。

ＨＳＮに内包された小型の生物活性成分／ネオアンチゲン
本発明は、また、中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）と、ＨＳＮ内に内包された小型の生物活性成分とを含むＨＳＮコンジュゲートであって、ＨＳＮは単層または多層シリカシェルを含み、各シェルはメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で、最も内側の中空閉鎖空間は中実シリカコアを有し、空間は任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的サイズは２００ｎｍ以下であり、媒体はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、ＨＳＮコンジュゲートを提供する。

理論に縛られることなく、ＨＳＮのサイズ（例えば、ＴＥＭによって測定される）が１００ｎｍ未満、流体力学的サイズ（例えば、ＤＬＳによって測定される）が２００ｎｍ未満、特に１５０ｎｍ未満のとき、ＨＳＮは、優れた分散性を示し、リンパ節や腫瘍を標的とする特性を有する。これを考慮すると、ＨＳＮは、抗原、ネオアンチゲンなどのような生物活性成分を運ぶのに適している。特に、生物活性成分は対象内での送達の間に漏出しないように、細孔内に内包される。これは、生物活性成分が対象中に存在するプロテアーゼによって分解されず、免疫細胞が存在する同じ位置に到達し、それにより免疫応答を増強することを確実にする。本構造はまた、生物活性成分がＨＳＮの単位体積当たり、より高濃度であることを可能にする。

ＨＳＮのシェルの細孔サイズは調節することができ、細孔サイズが生物活性成分（例えば高分子）のサイズよりも小さい場合、シェルは、生物活性成分（例えば高分子）が血液中で循環している間に漏出するのを防ぐことができる。ＨＳＮの形態および特性は、用途ごとに異なる合成戦略に大きく依存する。したがって、本発明者らはＨＳＮを担体およびアジュバントとして適用することができ、それによりワクチン接種などの効力を高めることができるという効果に基づいて適用を行う。

本発明者らはまた、驚くべきことに、ペプチドなどの特定の生物活性成分を内包するＨＳＮを生成するためにマイクロエマルジョン工程を使用する場合、ＨＳＮによって負荷される生物活性成分のレベルが、他のタイプの生物活性成分よりも不十分であるか、または低くなり得ることを見出した。理論に拘束されることなく、原因は、ペプチドがＨＳＮを形成するマイクロエマルジョン工程で使用される界面活性剤に対して親和性を有している可能性があるため、工程中に逆マイクロエマルジョンを形成している可能性がある。この問題を解決するために、本発明者らは生物活性成分がＨＳＮによってより容易に内包され得るように、生物活性成分を修飾して、界面活性剤に対する生物活性成分の親和性とシリカに対する生物活性成分の親和性との間の差、すなわち、シリカに対するより多くの傾向を作り出すことができることを見出した。他のアプローチは、生物活性成分に対して高い親和性を有する分子を導入することである。

したがって、いくつかの実施形態では小型の生物活性成分がＹ_（ｎ）−Ｘ−ＳＢＩ−［Ｘ−Ｙ_（ｍ）］_（ｒ）の構造を有するように修飾され、ここで、Ｙは正電荷を有するペプチドであり、Ｘは酵素切断可能配列であり、ＳＢＩは小型の生物活性成分であり、ｎ、ｍおよびｒの各々は整数であり、ここで、ｎおよびｍ×ｒのうちの少なくとも１つは０ではない。一実施形態では、ｎは０以外の整数であり、ｒは０である。一実施形態では、ｍおよびｒの各々が０以外の整数であり、ｎは０である。一実施形態ではｎ、ｍ、およびｒの各々は０以外の整数である。

いくつかの実施形態において、小型の生物活性成分はＹ_（ｎ）−Ｘ_（ａ）−ＳＢＩ−Ｘ_（ｂ）−Ｙ_（ｍ）の構造を有するように改変され、ここで、Ｙは正電荷を有するペプチドであり、Ｘは酵素切断可能配列であり、ＳＢＩは小型の生物活性成分であり、そしてｂ、ｎ、ｍおよびｒの各々は整数であり、ここでｎおよびｍのうちの少なくとも１つは０ではない。一実施形態では、ｂおよびｍの各々が０以外の整数であり、ｎおよびａは０である。一実施形態では、ｎおよびａの各々が０以外の整数であり、ｂおよびｍは０である。一実施形態ではｎ、ｍ、およびｒの各々は０以外の整数である。

いくつかの実施形態において、生理活性成分はＺ_（ｃ）−Ｙ_（ｎ）−Ｘ_（ａ）−ＳＢＩ−Ｘ_（ｂ）−Ｙ_（ｍ）−Ｚ_（ｄ）の構造を有するように修飾され、ここで、Ｚはチオール基含有分子であり、Ｙは正電荷を有するペプチドであり、Ｘは酵素切断可能な配列であり、ＳＢＩは小型の生物活性成分であり、そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｍおよびｎの各々は整数であり、ここでｃ、ｄ、ｍおよびｎのうちの少なくとも１つは０ではない。一実施形態では、ｂ、ｍおよびｄの各々が０以外の整数であり、ｎ、ａおよびｃは０である。一実施形態では、ｂおよびｍの各々が０以外の整数であり、ｎ、ａ、ｃおよびｄは０である。一実施形態では、ｂおよびｄの各々が０以外の整数であり、ｎ、ａ、ｃおよびｍは０である。一実施形態では、ｎ、ａ、およびｃの各々が０以外の整数であり、ｂ、ｍ、およびｄは０である。一実施形態では、ｎおよびａの各々が０以外の整数であり、ｂ、ｍ、ｄおよびｃは０である。一実施形態では、ｃおよびａの各々が０以外の整数であり、ｂ、ｍ、ｄおよびｎは０である。

このような場合、ＹおよびＺはＨＳＮに対する親和性を提供し得、これは通常、表面Ｘ（酵素切断可能配列）上に軽度の負電荷を有し、これはＨＳＮが投与される対象中に存在する酵素（例えば、プロテアーゼ）によって切断され得、その結果、ＳＢＩは周囲に放出され得る。これらのグループの詳細は、本開示の他の箇所にも記載されている。

いくつかの実施形態では、小型の生物活性成分はネオアンチゲンである。ネオアンチゲンは、これまで免疫系によって認識されていなかった新たに形成された抗原である。ペプチドネオアンチゲンに基づくワクチンを用いた免疫療法の新たな手法は、個々の症例の個々の腫瘍のレベルに応じた治療精度をもたらすことが期待される。ネオアンチゲンは、腫瘍突然変異の結果として形成される腫瘍タンパク質の変化から、またはウイルスタンパク質から生じうる。ネオアンチゲンの例としては腫瘍特異的ネオアンチゲン、腫瘍ネオエピトープ、ネオアンチゲン性ペプチド、ネオアンチゲン性ＤＮＡ、およびネオアンチゲン性ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、小型の生物活性成分がウイルス、細菌、または微生物に由来する抗原である。

既知の腫瘍特異的変異からなるペプチド、および変異ポリペプチドまたは腫瘍エピトープの断片からなるペプチド。これらのペプチドおよびポリペプチドは、本明細書において「ネオアンチゲン性ペプチド」または「ネオアンチゲン性ポリペプチド」と呼ばれる。

近年、シリカナノ粒子は、ワクチンにおける潜在的な免疫アジュバントとして報告されている。ワクチンは、典型的には２つの主成分：抗原およびアジュバントを含有する。抗原は、疾患を引き起こす微生物の断片または抗原特異的受容体によって認識されるがん細胞の表面タンパク質に由来することができる。しかしながら、ワクチンに使用されるほとんどの抗原は、抗原を単独で使用した場合、免疫原性が乏しく、免疫応答が弱く、免疫記憶が乏しいのが典型的である。アジュバントは、抗原に対する特異的免疫応答を誘導、増強、加速、および延長する物質である。ワクチンの場合、アジュバントは抗原に対する強固で長期にわたる適応免疫応答を生み出す上で重要な役割を果たす。さらに、単一粒子中の抗原およびアジュバントは同じ抗原提示細胞（ＡＰＣ）による取り込みを促進し、より強力な免疫応答をもたらすはずであるため、理想的なアジュバントは、抗原送達ビヒクルおよび免疫増強剤の両方として作用すべきである。

ワクチン接種のためのアジュバントおよび担体としてシリカナノ粒子を使用する利点には、（１）抗原を分解および変性から保護すること；（２）抗原提示細胞を効率的に標的化および活性化すること；（３）体積あたりの抗原分子の濃度を増加させること；（４）抗原提示経路を調節することが含まれる。シリカナノ粒子は固有のアジュバント活性を示し、細胞性免疫および体液性免疫の両方を効果的に増強することができる。シリカナノ粒子の物理化学的性質は、粒子と免疫系との間の相互作用に影響を及ぼす。従って、異なる種類のシリカナノ粒子は、異なる免疫応答を誘導する。免疫原性または免疫療法の効力を増強するためのシリカナノ粒子は２つの重要な仕事を行わなければならない：（１）ＡＰＣまたはリンパ節に抗原を効率的に送達すること、および（２）続いて、ＡＰＣの内部または近くに抗原を放出し、免疫応答を活性化すること。シリカナノ粒子は、粒子サイズおよび表面官能基修飾を介してＡＰＣ取り込みおよびリンパ節標的化を促進することができる。正に荷電したナノ粒子や中性に荷電したナノ粒子は、負に荷電したナノ粒子よりも効果的に樹状細胞（ＤＣ）に取り込まれる可能性がある。リンパ節へのナノ粒子輸送量は、サイズ依存的に生じる。大きな粒子（＞２００ｎｍ）が皮下注射によって投与される場合、粒子は皮膚からのＤＣ移入による細胞輸送に依存してリンパ節に輸送されるが、この経路は効率が低いと考えられる。対照的に、小さな粒子（２００ｎｍ未満）はリンパ節に直接流出し、リンパ節常在細胞に取り込まれることができる。したがって、小さい粒子は、リンパ節標的化能力およびより高い抗原送達効率の可能性を有する。抗原特異的免疫応答の活性化を改善するために、ナノ粒子によって送達される抗原は、プロテアーゼから保護され、ＡＰＣ取り込みまで無傷のままであるべきである。さらに、抗原がナノ粒子に吸着され、カプセル化され、または組み込まれる場合、それは、より高い、局在化抗原濃度を生成し、遊離の抗原よりも強い免疫応答を駆動することにつながる。ナノ粒子が抗原に結合する一般的な方法は、疎水性／親水性相互作用、ファンデルワールス力、静電相互作用、または水素結合などの共有結合または非共有結合を介して、粒子表面または粒子中の細孔の内表面に抗原を付着させることによる。しかしながら、粒子表面に付着した抗原はストック溶液または生理溶液中で粒子凝集を引き起こし、適用のための安定な懸濁溶液を製造することを困難にする。非共有結合を介して粒子に付着した抗原は身体への注射時に漏出することがあり、漏出した抗原は分解され、ＡＰＣに送達される有効抗原の数は減少する。共有結合を介して抗原を粒子と結合させることにより、抗原漏出の課題を解決することができる。しかし、抗原粒子がＡＰＣに取り込まれると抗原は放出されない。この粒子は、ＡＰＣの抗原と抗原レセプターとの相互作用を妨げ、免疫応答を誘導する可能性を減少させる。抗原担体およびアジュバントの両方として働くシリカナノ粒子の能力を利用することによって、シリカナノ粒子は、伝統的なワクチン開発における問題（乏しい免疫原性、弱い免疫応答、および不良な免疫記憶）を解決する可能性を有する。従って、本発明は、上述の問題を克服し、単分散粒子サイズを有する（中空）シリカナノスフェアを開発し、ワクチン適用のための抗原保護および良好な免疫原性および免疫療法効力を提供する。

上述のように、ネオアンチゲンは、ＨＳＮによって適切にまたは効率的にカプセル化されないことがある。ネオアンチゲンは、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであってもよい。配列中に２００アミノ酸以下、好ましくは１００アミノ酸以下、より好ましくは５０アミノ酸以下を有するペプチドは、ネオアンチゲンであると考えることができる。１２００核酸塩基以下、好ましくは６００核酸塩基以下、より好ましくは３００核酸塩基以下を有するＤＮＡまたはＲＮＡ配列がネオアンチゲンであると考えられる。

ＨＳＮに内包された小型の生物活性成分の用途
従って、別の態様において、本開示は、本開示のＨＳＮコンジュゲートを含むワクチン組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、本開示のＨＳＮコンジュゲートを対象に投与することを含む、小型の生物活性成分を対象に送達する方法を提供する。

別の態様において、本開示は免疫療法において対象にネオアンチゲンを送達する方法を提供し、該方法は、その中にネオアンチゲンを内包するＨＳＮを対象に投与することを含む。

小型の生物活性成分を内包するＨＳＮの調製
本発明は、また、生物活性成分を含む中空シリカナノ粒子の製造方法を提供する：
（ａ）油相、界面活性剤、アルコキシシランおよび／またはシリケート源、１つ以上の生物活性成分を含む水相、および任意選択で共界面活性剤を提供すること；
（ｂ）工程（ａ）に記載の組成物から油中水型（Ｗ／Ｏ）マイクロエマルジョンを形成すること；
（ｃ） （ｂ）のＷ／Ｏマイクロエマルジョンに開始試薬を添加して、生物活性成分をカプセル化するＨＳＮを形成すること；
（ｄ）Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンを不安定化させるために不安定化条件を実施し、このようにしてマイクロエマルジョンから形成された、結果として生じる粒子を回収すること；並びに
（ｅ）工程（ｄ）で回収された粒子を水性洗浄相中に分散させてシリカナノ粒子を得ること。

さらなる態様において、該方法は、以下の特徴の少なくとも１つを含む：
（ｉ）界面活性剤がイオン性であるか；または界面活性剤が非イオン性でありオキシアルキレン単位を欠く；
（ｉｉ）生物活性成分が使用前にアミノ酸配列で修飾されており、配列中のアミノ酸は正に荷電しているか、またはチオール基を含んでいてもよい；および
（ｉｉｉ）生物活性成分と親和性を有する物質は、工程（ａ）において水相に導入される。

Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンを形成するために使用される界面活性剤は、一般的に使用され、当技術分野で容易に知られている。好ましくは、イオン性界面活性剤およびオキシエチレン単位を有さない非イオン性界面活性剤が本発明において使用される。オキシアルキレン単位を有さない非イオン性界面活性剤の例としてはグルコシドアルキルエーテル、グリセロールアルキルエステル、コカミドモノエタノールアミン（コカミドＭＥＡ）、コカミドジエタノールアミン（コカミドＤＥＡ）、ラウリルジメチルアミンオキシドなどが挙げられるが、これらに限定されない。

上記のように、本発明者らは生理活性成分がＨＳＮによってより容易に封入され得るように、および／または生物活性成分に対して高い親和性を有する分子がＨＳＮを製造するためのマイクロエマルジョンプロセスの間に水相に導入され得るように、生物活性成分を修飾することができることを見出した。

一実施形態では、小型の生物活性成分がアミノ酸配列で修飾される。特に、配列中のアミノ酸は、正に荷電され得るアミノ酸である。正に荷電し得るアミノ酸の例としてはアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、正に荷電し得る位置を有する非天然アミノ酸などが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、アミノ酸配列は、リンカーを介して小型の生物活性成分と連結する。リンカーは、好ましくは酵素切断可能であり、例えば酵素切断可能なアミノ配列または酵素切断可能なヌクレオチド配列である。
一実施形態では、小型の生物活性成分がチオール基含有分子で修飾される。

マイクロエマルジョンプロセス中に水相に導入される生物活性成分に対して高親和性を有する物質、分子、または粒子の例にはジスルフィド結合を有する物質、分子または粒子、例えば、オルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）基、例えば、ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−（３´−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート）、チオールコロリド（thiolcholoride）基、アレンスルフェンアミド基、チオウロニウム塩またはチオール基を有する物質、分子または粒子が含まれるが、これらに限定されない。

以下の実施例は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者にとって本発明をより理解しやすくするために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

材料、方法および試験モデル
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、シリカナノ粒子の外観を直接調べ、検証した。ＴＥＭ像は、７５〜１００ｋＶの加速電圧で作動する日立Ｈ‐７１００透過電子顕微鏡で撮影した。エタノールまたは水中に分散した試料を炭素被覆銅グリッド上に滴下し、ＴＥＭ観察のために空気中で乾燥した。

動的光散乱（ＤＬＳ）
異なる溶液環境におけるシリカナノ粒子のサイズ測定を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）上で動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて行った。種々の溶液中で形成された（溶媒和された）粒子径を分析した：Ｈ_２Ｏ、１０％ ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）および５％グルコースを室温で用いた。

ＯＰＳＳ−シリカナノ粒子
合成過程：最初の工程で、８５．２μＬ ＡＰＴＭＳ ＋ ２５３．２μＬ ＯＰＳＳ−リンカー５０ｍｇ ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ，２００／ｍｌ ＤＭＳＯ中）を一緒に混合し、次に３７℃で一晩攪拌する。ＡＰＴＭＳ−リンカー−ＯＰＳＳを単離するために、ＰｒｏＥｌｕｔ（登録商標）Ｃ１８チューブをメタノール３〜５ｍＬですすぎ、次いで脱イオン水３〜５ｍＬを加えた。混合物を１００％ ＤＭＳＯから１０％ ＤＭＳＯ溶液に希釈した。ＡＰＴＭＳ／ＡＰＴＭＳ−リンカー−ＯＰＳＳ混合物をチューブの上部に装填し、次いで１ｍＬの１０％ ＡＣＮで洗浄して遊離ＡＰＴＭＳ試薬を除去する。メタノール１．５ｍＬを用いて試料を溶出し、ＡＰＴＭＳ−リンカー−ＯＰＳＳを得る。最後に、ＡＰＴＭＳ−リンカー−ＯＰＳＳ液をロータリーエバポレーターで濃縮し、ＨＰＬＣでストック溶液を定量した。

２０ｍＬのデカン、３．５ｍＬのイゲパールＣＯ−５２０、および１．１ｍＬのヘキサノールを一緒に混合し、続いて１．２ｍＬのＤＩ水を用いた。混合物を２０℃で２０分間撹拌し、逆マイクロエマルジョン系とする。５０ｕＬ希釈ＡＰＴＭＳ （ＤＩ水で８Ｘ希釈されたもの）と２００ｕＬ ＴＥＯＳを導入し、その後２０分間攪拌する。その後、５００ｕＬ ２８％ ＮＨ４ＯＨを系に追加する。２０℃で１１分間混合し、その後、６５ｕＬ希釈ＡＰＴＭＳ （ＤＩ水で８Ｘ希釈されたもの）と２６０ｕＬ ＴＥＯＳを加え、その後、２０℃でオーバーナイトで攪拌した。粒子表面上のＡＰＴＭＳ−リンカー−ＯＰＳＳを修飾するために、１５ｕＬ ＴＥＯＳおよびＡＴＭＰＳ−リンカー−ＯＰＳＳ （４．２ｍｇ）を系に添加し、系を一晩撹拌したままにする。マイクロエマルジョン系を破壊するために１０ｍＬのエタノールを溶液に導入し、次いで１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してＯＰＳＳ−シリカナノ粒子を得た。ペレットをエタノールで２回洗浄した後、遠心分離して洗浄溶媒を除去した。ＤＩ−水８０ｍＬを用いてＯＰＳＳ−シリカナノ粒子を５０℃で１時間洗浄し、残留試薬を除去し、中空とする。ペレットを水で２回洗浄し、次いで遠心分離して洗浄溶媒を除去する。上記合成プロセスの後、ＯＰＳＳ‐シリカナノ粒子を得た。

ＨＳＮにおけるタンパク質の定量
ＨＳＮ中のタンパク質量は、（１）酵素活性または（２）蛍光相関分光法の２つの方法によって定量した。
酵素活性法によるタンパク質＠ＨＳＮ定量：ＨＳＮに封入されたタンパク質が酵素である場合、ＨＳＮ中のタンパク質の量は、タンパク質＠ＨＳＮの酵素活性に由来することができる。

ＡＳＮａｓｅ＠ＨＳＮ定量：ＡＳＮａｓｅ活性は、メルクから購入したネスラー試薬によって測定した。まず、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ＝８．６）の１００μＬと８５０μＬの０．０２Ｍ−アスパラギンを混ぜ、ブランクに１．５Ｍトリクロロ酸（ＴＣＡ）の５０μＬを加え、試料に５０μＬのＤ．Ｉ水を加えた。次にＡＳＮａｓｅ＠ＨＳＮストック溶液５０μＬを混合物に加え、３７℃で５０分間インキュベートした。その後、５０μＬのインキュベートしたサンプルを採取し、１００μＬのネスラー試薬と混合し、試験試料に２．５μＬのＴＣＡを追加して反応を停止し、その混合物を室温で１０分間置いた。最後に、１００μＬ試料を活性決定のために４８０ｎｍでの吸光度を測定した。

カタラーゼ＠ＨＳＮ定量：カタラーゼ活性をＨ_２Ｏ_２アッセイにより決定した。約４０μｇのＣＡＴ＠ＨＳＮを５０μＬのＤ．Ｉ．水中に分散し、５０μＬの２５μＭのＨ_２Ｏ_２と混合した。それらを暗所で３７℃で１２分間インキュベートして反応させた。その後、混合物を遠心分離して上清を回収し、５μＬのＡｍｐｌｅｘＲｅｄ試薬、１０μＬの１０ｍＬ／ユニットＨＲＰおよび４８５μＬの５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）で構成された１００μＬの希釈ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（登録商標）試薬（Ａ２２１８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と室温で１０分間混合し、残存Ｈ_２Ｏ_２を検出した。次に、５３０ｎｍでの励起に続く５８５ｎｍでの蛍光発光で試料を測定した。カタラーゼ＠ＨＳＮ活性は、既知のＨ_２Ｏ_２の濃度に従って標準曲線を用いて推定した。

西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）＠ＨＳＮ定量：ペルオキシダーゼアッセイによりＨＲＰ活性を測定した。５０μＬのＨＲＰ＠ＨＳＮは、７００μＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ＳＰＢ）（０．０５Ｍ、ｐＨ＝７．８）と７５０μＬのフェニレンジジアミンジ塩酸塩（ＯＰＤ）溶液（１６７μＬのＨ_２Ｏ_２を有する５０ｍのＳＰＢ中に２０ｍｇのＯＰＤ、ｐＨ＝７．８）を室温で１時間混合した。そして、１００μＬの試料と１Ｍのリン酸をよく混合して反応を止め、混合溶液を４９０ｎｍの吸光度で測定し活性を決定した。

蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によるタンパク質＠ＨＳＮ定量化：ＨＳＮ中の封入タンパク質数も共焦点レーザ走査顕微鏡（ＰｉｃｏＱｕａｎｔ Ｍｉｃｒｏｔｉｍｅ ２００）を通して５４３ｎｍグリーンレーザーでＦＣＳにより決定した。蛍光色素結合タンパク質をタンパク質＠ＨＳＮ合成およびその後の検出に使用した。１００μＬ容量のサンプル液をガラススライド上に置き、その後、蛍光染料を５４３ｎｍレーザーで励起し、蛍光カウント率をフォトダイオードで検出した。測定プロセスは３段階に分けることができた。まず、ＦＣＳレーザの焦点体積を測定し、フィッティング相関関数の係数とした。ここでは、既知の拡散係数（共焦点ボリュームでの平均滞留時間）を持つ遊離色素Ｒ６Ｇを使用してカウント率を測定し、５４３ｎｍレーザーの焦点ボリュームを確認した。以上に基づいて、ＲＩＴＣのカウント率を検出し、それが励起されたときにＲＩＴＣから放出される光子数を知った。第２に、ＲＩＴＣ結合タンパク質のカウント率を、濃度とカウント率との間の相関を決定するために、ＲＩＴＣ結合タンパク質の様々な濃度を測定することによって誘導した。それは線形相関であるはずである。最後に、５４３ｎｍレーザーを通してＲＩＴＣ−タンパク質＠ＨＳＮを測定し、ＨＳＮにどのくらいのタンパク質が封じ込められているかを推定するためのカウント率を得た。

プロテアーゼ耐性アッセイ
２ｘ１０ｍｇ^−３／ｍｌのプロテアーゼ混合物４００μＬを１０ｍＭ ＮａＯＡｃおよび５ｍＭ ＣａＯＡｃに溶解した（ｐＨ＝７．５）。次いで、タンパク質＠ＨＳＮを１ｍＬのＨ_２Ｏに溶解し、プロテアーゼ溶液と混合した。３０℃で３０分間インキュベートした後、反応液を採取し、酵素活性法により液中の残存タンパク質の量を測定した。

抗原＠ＨＳＮ誘発ＩｇＧ抗体の測定
抗原＠ＨＳＮで誘導した抗原特異的抗体を酵素免疫測定法で検出した。９６ウェルプレートを０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝９．５）の１００μＬの１００μｇ／ｍＬ抗原溶液で４℃で２０時間コーティングした。次に、ウェルの液体を排出し、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む３００μＬ ０．１Ｍ ＰＢＳ （ｐＨ＝７．２）をウェルに加え、９６ウェルプレートを室温で１．５時間、軌道シェーカー上で振盪して非吸着抗原を洗い出す。その後、０．０５％ ｔｗｅｅｎ‐２０ ＰＢＳ中の１６００倍希釈マウス血漿１００μＬをプレートに添加し、室温で１時間または４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１００μＬ希釈二次抗体を添加し（１：１００００［ＨＲＰコンジュゲート−２^ｎｄ抗体］または１：２００［蛍光色素コンジュゲート−２^ｎｄ抗体］）、室温で１時間インキュベートした。蛍光染料結合２^ｎｄ抗体を検出に使用した場合、試料は５６０ｎｍで励起して６６０ｎｍの蛍光発光で測定した。検知にＨＲＰ結合二次抗体を用いた場合、試料に０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０及び１６７μＬのＨ_２Ｏ_２中、２０ｍｇのＯＰＤを含む１００μＬの新鮮な基質溶液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、１００μＬの１Ｍリン酸を加えて反応を止め、４９０ｎｍの分光光度計で吸光度を測定するための１００μＬ試料を採取した。

Ｈｅｒ２＿４Ｔ１細胞株構築
レンチウイルス粒子感染によりｌｕｃ＿４Ｔ１細胞からＨｅｒ２発現４Ｔ１細胞を構築した。ゼオシンに耐性を有するレンチウイルスベクターＣＨＬ００４２およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿ＮｈｅＩ−ＨＥＲ２−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｗｉｔｈ ＥｃｏＲＩ−ＡｍＣｙａｎ−ＸｈｏＩを制限酵素とリガーゼにより消化しレンチウイルスベクターに連結し、生成物をｐｌｅｎｔｉ‐ｚｅｏ‐ＨＥＲ２と命名した。ウイルスパッケージングは、標準リン酸カルシウムトランスフェクションプロトコルに従った：１０μｇのｐｌｅｎｔｉ−ｚｅｏ−ＨＥＲ２プラスミド、９μｇのｐ‐ＣＭＶ‐Δ８．９１プラスミドおよび２．５μｇの水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶＧ）プラスミドを、２．５Ｍ ＣａＣｌ_２を含むＨＥＢＳ （ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、デキストロース、ＫＣｌおよびＮａ_２ＨＰＯ_４）と混合し、室温で２０分間インキュベートし、レンチウイルス粒子生成のために１０ｃｍディッシュ中の２ｘ１０^６ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に滴下で加えて調製した。培地を２０時間後に新鮮な培地で置き換え、ウイルス含有上清を、７２時間のトランスフェクション後に回収した。次に、ウイルス溶液を回収し、調製した標的細胞、ｌｕｃ−４Ｔ１に添加し、８ｎｇ／ｍＬポリブレンの存在下で４８時間インキュベートして、標的細胞を感染させた。最後に、細胞を１００μｇ／ｍＬゼオシンと共に１４日間インキュベートして、Ｈｅｒ２−ｌｕｃトランスフェクト４Ｔ１細胞株を選択した。Ｈｅｒ２タンパク質発現は、最初の抗体として抗Ｈｅｒ２／ＥＲＢＢ２（ｃａｔ．１０００４−ＲＰ０４、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）および二次抗体としてＡｌｅｘｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧを用いたＩＦＣ染色によって確認した。

Ｈｅｒ２＿ＥＣＤタンパク質発現
Ｈｅｒ２発現ベクターの細胞外ドメイン、ｐＥＴ２４‐ｈＨＥＲ２ ＥＣＤ ｏｐをＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔから購入し、ＢＬ２１に形質転換してＨｅｒ２＿ＥＣＤタンパク質を産生した。Ｈｅｒ２＿ＥＣＤタンパク質過剰発現は、大腸菌（ＢＬ２１）において３７℃で４時間０．５ｍＭのＩＰＴＧにより誘導された。インキュベーション後、ＢＬ２１を遠心分離により回収した。次に、細胞を１０％グリセロールＰＢＳ中で４℃で超音波処理して細胞を破壊し、その溶液を遠心分離してペレットを回収したが、このペレットはＨｅｒ２＿ＥＣＤタンパク質封入体に富んでいた。ペレットに１．５％サルコシンを加え、４℃で一晩振盪しながらＨｅｒ２＿ＥＣＤタンパク質を溶液に溶解し、次いで、タンパク質に富む上清を遠心分離によって回収した。タンパク質液を濾過し、４℃下で２００ｍＭイミダゾールリン酸緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，０．３Ｍ ＮａＣｌ， ｐＨ＝８）を用いたＦＰＬＣ （ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ、ＧＥ）によりＨｉｓ‐タグカラム（ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ， ＧＥ）を通して精製した。精製したタンパク質を、抗Ｈｅｒ２／ＥＲＢＢ２抗体（１０００４−ＲＰ０４、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって特徴付け、ナノフォトメーター（Ｎ６０、ＩＭＰＬＥＮ）によって定量した。

ＣＤ８＋Ｔ細胞分析法におけるＩＦＮ−γ発現
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週間）に、１日目、８日目および１５日目に同量のネオアンチゲン（ＮｅｏＡｇ）またはＮｅｏＡｇ＠ＨＳＮを接種した。ワクチン接種を施したマウスから末梢血約３００μＬを異なった日に採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０８３で分離し、２００μＬのＴ細胞培養培地（ＲＰＭＩ １６４０は１０％ ＦＢＳ、１００ＵｍＬ^−１ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ，、５５μＭ β−メルカプトエタノール、１ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムで補充した）に９６ウェルプレートに移した。ペプチド再刺激を行うために、ＰＢＭＣを種々の抗原エピトープ（２０μｇ／ｍＬ）で２時間処理した。その後、培養液にＧｏｌｇｅＰｌｕｇを加えてサイトカイン分泌を停止させ、さらに４時間インキュベートした。細胞をペレット化し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２で１０分間室温で染色し、次いで細胞を抗ＣＤ８−ＦＩＴＣまたは抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで２０分間室温で染色した。細胞を洗浄し、続いて５０μＬの２％ホルムアルデヒド溶液を用いて一晩固定した。翌日、細胞を洗浄し、５０μＬの０．５％サポニン中に室温で１５分間浸透させ、次いで細胞を洗浄し、抗ＩＦＮγ−ＡＰＣで２０分間染色した。最後に、染色細胞をペレット化し、２００μＬ緩衝液で再懸濁し、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）を用いて分析した。

合成例１
タンパク質＠ＨＳＮの合成
アスパラギナーゼ（ＡＳＮａｓｅ）＠ＨＳＮ合成：油として２０ｍＬデカン、界面活性剤として３．５ｍＬのＣＯ−５２０、共界面活性剤として１．１ｍＬ ヘキシルアルコール、ＡＳＮａｓｅ２ｍｇを７００μＬの１．４３ｍｇ／ｍｌ ＮａＦおよび５００μＬの１０ｍｇ／ｍｌ ＮａＦに溶解した。上記の全てを混合し、逆マイクロエマルジョン系を生成した。次いで、シリカ源の一部、エタノールによる５０μＬの８倍希釈ＡＰＴＭＳとＴＥＯＳの２００ｕＬを系に添加し、これを２０℃で連続攪拌した。１時間後、シリカ源の別の部分である５０μＬ希釈ＡＰＴＭＳと２００μＬを系に加え、２０℃で２０時間連続攪拌した。一晩の攪拌後、混合物に５００μＬの水酸化アンモニウム（ａｑ） （２．２４〜２．４ｗｔ％）をゆっくりと導入し、２０分間攪拌した。次いで、５０μＬ ＴＥＯＳを滴下で混合物に加え、４時間攪拌し、その後、２５０μＬ ＰＥＧ−シランと２５μＬ ＴＥＯＳを加え、２０時間２０℃で攪拌して粒子表面を修飾した。その後、９５％のエタノールをマイクロエマルジョン系を不安定化するために加え、２０分間１４，０００ｒｐｍで遠心法により粒子を回収した。粒子を９５％エタノールで１回およびＤ．Ｉ水で２回洗浄し、８０ｍＬ Ｄ．Ｉ水に移した。その後、溶液を４０℃に保ち、１時間攪拌してＡＳＮａｓｅ＠ＨＳＮを得た。最後に、遠心分離によりＡＳＮａｓｅ＠ＨＳＮを採取し、ＤＩ水で２回洗浄し、ＤＩ水中に４℃で保存した。

西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）＠ＨＳＮ合成：ＨＲＰ＠ＨＳＮの合成過程はＡＳＮａｓｅ＠ＨＳＮの記載と同じであったが、酵素２ｍｇのＡＳＮａｓｅを２．６７ｍｇのＨＲＰに置き換えた。

カタラーゼ＠ＨＳＮ合成：油としてデカン２０ｍＬ、界面活性剤として３．５ｍＬのＣＯ−５２０、共界面活性剤として１．１ｍＬのヘキシルアルコール、および５０，０００ユニットカタラーゼを１２００μＬ の１０ｍｇ／ｍＬ ＮａＦに溶解した。上記の全てを混合し、逆マイクロエマルジョン系を生成した。次いで、シリカ源の一部、ＤＩ水で８倍希釈したＡＰＴＭＳを５０μＬ 、２００μＬのＴＥＯＳを系に加え、２０℃で連続攪拌した。２時間後には、２５０μＬの８．５ｍＭの水酸化アンモニウム（ａｑ）を加え、２０分間攪拌した後、シリカ源のもう１つの部分、５０μＬの希釈ＡＰＴＭＳおよび２００ｕＬのＴＥＯＳを系に加え、２０℃で２０時間攪拌した。一晩の攪拌後、混合物に徐々に水酸化アンモニウム（ａｑ）１００μＬ（５．６〜６ｗｔ％）を導入し、１０分間攪拌した。次いで、５０μＬ ＴＥＯＳを混合物に滴下で加え、２時間攪拌し、次いで２５０μＬ ＰＥＧ−シランと２５μＬ ＴＥＯＳを加え、２０℃で２０時間攪拌して粒子表面を修飾した。その後、９５％のエタノールをマイクロエマルジョン系を不安定化するために加え、２０分間１４，０００ｒｐｍで遠心法により粒子を回収した。粒子を９５％エタノールで１回およびＤ．Ｉ水で２回洗浄し、８０ｍＬ Ｄ．Ｉ水に移した。その後、溶液を４０℃に保ち、１時間攪拌してカタラーゼ＠ＨＳＮを得た。最後に、遠心分離によりカタラーゼ＠ＨＳＮを回収し、Ｄ．Ｉ水で２回洗浄し、Ｄ．Ｉ水中に４℃で保存した。

ＴＥＭおよびＤＬＳ測定
実施例１で合成したタンパク質＠ＨＳＮナノ粒子をＴＥＭ測定に供したところ、その結果は、全てのタンパク質＠ＨＳＮは平均粒子サイズが５０〜９５ｎｍであり、粒径の標準偏差が小さく、粒子の均一性を反映していることが示唆された。タンパク質＠ＨＳＮの粒子サイズは、種々の溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。ＤＬＳの結果は、タンパク質＠ＨＳＮが、水、ＰＢＳおよび血清を含む媒体中で約６０〜約１００ｎｍの範囲内で十分に分散していることを示した。

タンパク質＠ＨＳＮの定量
シリカナノ粒子中に封入されたタンパク質の量は、約１％〜７％（質量％）であった。定量結果は、上述の方法論を用いて、酵素活性または蛍光相関分光法に由来する。

プロテアーゼ耐性アッセイ
プロテアーゼ分解からその中に封入されたＡＳＮａｓｅに対する本明細書中に開示されたＨＳＮの保護作用を決定するために、ＨＳＮ （ＮＴＴ３＿３９）中に封入された遊離ＡＳＮａｓｅまたはＡＳＮａｓｅをプロテアーゼ消化に供し、残りのＡＳＮａｓｅ活性をＡＳＮａｓｅ活性アッセイによって決定した。従って、プロテアーゼ耐性試験を実施して、その中に封入されたＡＳＮａｓｅに対するＨＳＮの保護作用を評価した。

すべて同じ量のＡＳＮａｓｅを含むＨＳＮ （ＮＴＴ３＿３９）中に封入された遊離ＡＳＮａｓｅおよびＡＳＮａｓｅを遠心分離し、１ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．５）中に分散させ、４００ ｕＬプロテアーゼ溶液（１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ＋ ５ｍＭ ＣａＯＡｃ（ｐＨ ７．５）中２ｘ１０−３ｍｇプロテアーゼ／ｍＬ）と混合し、３７℃で３０分間プロテアーゼ消化に供した。消化後、試料中のＡＳＮａｓｅ活性をＡＳＮａｓｅ活性分析によって測定した。３０分間のプロテアーゼ混合物による分解後、遊離ＡＳＮａｓｅの活性が元の活性の２０％未満に減少したことが明らかに観察され得る。しかし、ＡＳＮａｓｅを封入したＮＴＴ３＿３９は優れた保護効果を示した。タンパク質（抗原）は、いったん溶液中に懸濁されると、プロテアーゼによって迅速に分解されることが明らかになった。したがって、タンパク質が非共有結合を介してナノ粒子に結合している場合、一旦粒子が体内に注入されると、タンパク質は粒子から漏出し始め、分解をもたらす。ＨＳＮ内部に封入された抗原は、優れたプロテアーゼ保護を提供することができる。

ＨＳＮリンパ節標的化
適応免疫を誘導する効率は、免疫系、特にリンパ節の適切な標的化に大きく依存している。リンパ節は、抗原特異的Ｔ細胞が活性化され、プライミングされる部位である。リンパ節に抗原を直接送達するためにナノ粒子を使用することは、抗原特異的免疫応答の有効性および安全性の両方を改善する。リンパ節標的化能を有するＨＳＮを開発するためには、ＨＳＮの溶液中の大きさおよび懸濁液が重要である。大きさ約５０〜１００ｎｍの近赤外蛍光発光色素（ｃｙ５．５）共役ＨＳＮ（ＴＥＭにより検出）および水および緩衝溶液中の単分散をマウスの後足パッドに皮下注射し、ＨＳＮの生体内分布をＩＶＩＳにより異なる時点で検出して、ＨＳＮのリンパ節標的化能を検出した。Ｃｙ５．５−ＨＳＮはまず注射部位に集中し、７日までリンパ節に持続した。投与７日後、マウスを切開し、鼠径ＬＮ、膝窩ＬＮ、腸骨ＬＮおよび腎臓ＬＮに有意な蛍光シグナルがあった（図１）。このことから、ＨＳＮのサイズが小さく良好な懸濁液はリンパ節標的化能を示すことが明らかとなり、ワクチン用の抗原送達ビヒクルに有利である。

タンパク質＠ＨＳＮ免疫応答を誘導する
より小さな大きさ（約６５ｎｍ）のアスパラギナーゼ封入ＨＳＮ（ＡＳＮａｓｅ＠ＨＳＮ）および溶液中の良好な懸濁溶液を用いて、抗原特異的免疫応答を試験した。マウスに、２００μＬのＰＢＳ中２０μｇのＡＳＮａｓｅまたは同タンパク質量のＡＳＮａｓｅ＠ＨＳＮを、週１回、３週間、個別に静脈内、皮下または筋肉内注射した；７５〜１００μＬの血液を１７日目に採取し、血清のＡＳＮａｓｅ特異的抗体レベルをＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。ＡＳＮａｓｅ免疫マウスの血清はＡＳＮａｓｅ特異的抗体シグナルを示さなかった。ＡＳＮａｓｅの投与量は４倍であったが、わずかな抗体しか検出されなかった。対照的に、ＡＳＮａｓｅ＠ＨＳＮはＡＳＮａｓｅと比較して有意な量のＡＳＮａｓｅ特異的抗体を誘導する（図２）。異なるＡＳＮａｓｅ＠ＨＳＮ投与経路は、同様の水準のＡＳＮａｓｅ特異的抗体誘発を示す。さらに、抗原としてＡＳＮａｓｅをカタラーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼのような他のタンパク質で置換することは、抗原のみの群と比較して、依然として強い免疫応答を示す。したがって、ＨＳＮによって封入された抗原は、抗原の免疫原性を有意に増強し、種々の投与経路を可能にする。

Ｈｅｒ２＿４Ｔ１＠ＨＳＮおよびＨＳＮ免疫療法
がんワクチンとしての抗原＠ＨＳＮの可能性を実証するために、Ｈｅｒ２細胞外ドメインタンパク質を抗原として選択し、ＨＳＮに封入した。Ｈｅｒ２＿ＥＣＤ＠ＨＳＮが免疫応答を誘導し、Ｈｅｒ２関連がん増殖を抑制することを証明するために、Ｈｅｒ２過剰発現乳がん細胞を免疫適格ＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）移植することにより、動物モデルを構築した。Ｈｅｒ２過剰発現乳がん細胞株（Ｈｅｒ２＿４Ｔ１）は、ヒトＨｅｒ２のｃＤＮＡをコードするレトロウイルスベクターを用いた乳がん細胞株４Ｔ１の形質導入により作製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＨｅｒ２＿ＥＣＤ＠ＨＳＮを１週間間隔で３回静脈内ワクチン接種した。３回目のワクチン接種１日後、Ｈｅｒ２＿４Ｔ１細胞をマウスの側腹部皮下に移植し、腫瘍の大きさを週２回モニターした。Ｈｅｒ２＿ＥＣＤ＠ＨＳＮを接種したマウスでは、対照群と比較して有意な腫瘍増殖の抑制が認められ（図３）、血漿中の抗Ｈｅｒ２＿ＥＣＤ抗体量も対照群より高値であった。この結果は、Ｈｅｒ２＿ＥＣＤ＠ＨＳＮがＨｅｒ２特異的適応免疫応答を成功裡に誘導し、腫瘍増殖を抑制することを示している。このことは、ＨＳＮによって封入された抗原が免疫原性および免疫療法効果を増強できることを実証する。

以上の免疫療法結果によれば、ＨＳＮは担体となり、同時に自己アジュバントとなりうるため、抗原＠ＨＳＮは免疫応答を有意に増強することができる。本発明におけるＨＳＮのより小さいサイズおよび良好な懸濁液は、リンパ節標的化、腫瘍標的化（ＥＰＲ効果）、および自己免疫原性（自己アジュバント）などの特性を与える。これらの特性は、ＨＳＮが抗腫瘍増殖のための別の治療法において潜在的に使用されることを可能にし、ここで、ＨＳＮ粒子（抗原封入なし）は、体内に静脈内投与され；粒子は、リンパ節および腫瘍中に蓄積され得る。その後、自己アジュバント特性を有するＨＳＮが腫瘍に蓄積したため、ＨＳＮは局所的に免疫応答を誘導し、腫瘍微小環境を同時に調節するであろう。増強された免疫応答は、腫瘍増殖を抑制する抗腫瘍免疫の引き金となる可能性がある。その概念を実証するために、マウスに側腹部皮下にＨｅｒ２＿４Ｔ１細胞を移植し、腫瘍移植後３、１０、１７日目にＨＳＮを静脈内投与した。ＨＳＮで処理したマウスは、対照群と比較して小さな腫瘍サイズを示した。また、４Ｔ１腫瘍動物モデルでＨＳＮの抗腫瘍効果を検証したところ、ＨＳＮが４Ｔ１腫瘍増殖を阻害できることが明らかになった（図４）。対照的に、著者らの以前の実験によれば、腫瘍増殖はＭＳＮのみ（薬物なし）で処置したマウスでは阻害されなかった。これらの結果は、ＨＳＮが他のシリカナノ粒子とは異なるいくつかの特別でユニークな特性を有し、ＨＳＮがより高い免疫原性および免疫療法有効性を示すことを表す。

ＨＳＮは腫瘍に局所免疫応答を誘導する
異なる種類のＨＳＮをワクチン接種した４Ｔ１担癌マウスを、最終ワクチン接種の１日後から１週間隔で３回、脾臓、リンパ節および腫瘍を採取し、その後の免疫細胞染色のために消化した。ＨＳＮでワクチン接種したマウスの脾臓およびリンパ節における免疫表現型は、対照群マウスと同様であり、対照的に、腫瘍中のＣＤ８ａ^＋、Ｆ４／８０およびＣＤ１１ｃ細胞の集団が増加し、これは、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞が腫瘍の周囲に動員されることを意味する（図５）。これらの結果は、ＨＳＮのより小さなサイズおよび良好な懸濁液がＥＰＲ効果を介して腫瘍内に蓄積し、腫瘍周囲の免疫細胞を動員することが、腫瘍部位における腫瘍浸潤性免疫細胞の増強および全身性有害作用なしでの腫瘍増殖の抑制につながることを示した。

ペプチド封入シリカナノ粒子のネオアンチゲン＠ＨＳＮ合成および負荷能力を改善する方法
ネオアンチゲンは、腫瘍特異的変異から生じるＨＬＡ結合ペプチドの一種である。それらは、正常細胞からがん細胞を分化させるバイオマーカーとして使用することができる。したがって、ネオアンチゲン性ペプチドは、がん免疫療法のための抗原＠ＨＳＮを開発するための良好な抗原である。上記のタンパク質＠ＨＳＮ合成法によりＮｅｏＡｇ＠ＨＳＮを合成し、タンパク質をネオアンチゲン性ペプチドに置換した。しかしながら、予想外に、ペプチドをＨＳＮ中に効率的にカプセル化することができないことが見出された。マイクロエマルジョン不安定化のプロセスで、ほとんどのネオアンチゲン性ペプチドは上清中に懸濁され、ＨＳＮ中にかろうじて検出される。この予想外の結果は、ペプチドが通常、疎水性および親水性アミノ残基から構成されるという事実に起因し得る；ペプチドの両親媒性特性は、ペプチドと、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ５２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびｔｗｅｅｎ２０などのポリ（エチレングリコール）含有界面活性剤との間の強い相互作用をもたらし得る。これらの種類の非イオン性界面活性剤は、通常、逆マイクロエマルジョン系において使用される。この問題を解決するために、シリカナノ粒子のペプチド負荷能力を高めるための３つの方法を提案した：（１）逆マイクロエマルジョンに使用されるポリ（エチレングリコール）含有界面活性剤を、オキシアルキレン単位が存在しない界面活性剤、またはジオクチルスルホコハク酸ナトリウム塩（ＡＯＴ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などのイオン性界面活性剤である界面活性剤で置き換えた；（２）ペプチドがシリカ分子によってより容易に取り囲まれ、シリカナノ粒子に容易にケージ化されるように、ペプチドの両親媒性を減少させ、ペプチドとシリカ分子との間の相互作用を増加させるようにペプチドを設計した。ペプチドは、ペプチド配列の前、後、または両側にポリチャージモチーフを追加し、ポリチャージモチーフとペプチド配列の間に酵素切断可能な配列を挿入することによって設計された。（３）ネオアンチゲン性ペプチドに対して親和性を有する分子または粒子をマイクロエマルジョンの水相に添加して、以下のようにペプチドカプセル化効率を高めた。１.正に帯電した新抗原と負に帯電した分子との間の静電相互作用。２．疎水性ネオアンチゲンと低荷電または非荷電分子とのファンデルワールス相互作用；３．ジスルフィド結合、酵素切断可能な配列、ネオアンチゲンと分子の間の酸切断可能な部分を含む切断可能な共有結合。分子およびネオアンチゲンは、個々に、または予め混合してから、マイクロエマルジョンの水相に添加することができる。分子は、シラン、ポリマー、デンドリマー、またはシリカナノ粒子であり得る。ＮｅｏＡｇ＠ＨＳＮは、設計されたネオアンチゲン性ペプチド（一実施形態では、ポリアルギニン配列および酵素切断可能配列を元のネオアンチゲン性ペプチドのＮ末端に添加する。実施形態では、元のネオアンチゲン性ペプチドのＮ末端にチオール基アミノ酸を添加する）を使用することによってうまく合成され得、ＮｅｏＡｇ＠ＨＳＮ中のペプチドの量は、検出可能である。

正電荷部分修飾ネオアンチゲン＠ＨＳＮの合成
合成プロセス：２０ｍｌのデカン、３．５ｍｌのＣＯ−５２０、１．１ｍｌのヘキシルアルコールを混合し、その後、３５０μＬのＤＩ水中に溶解した１〜２ｍｇの正電荷部分修飾ネオアンチゲン、２５０μＬ １０ｍｇ／ｍｌ ＮａＦおよび２５μＬの希釈ＡＰＴＭＳの水相溶液を油相に加え、３０分攪拌してマイクロエマルジョン系を作製した後、１００μＬ ＴＥＯＳを系に添加し、１時間攪拌した。その後、２５μＬ希釈ＡＰＴＭＳと１００μＬ ＴＥＯＳを加え、２０℃で１８時間攪拌した。２日目は５００μＬ ２８−３０ｗｔ％ ＮＨ_{３（ａｑ）}と１００μＬ ＴＥＯＳを２０℃で４時間攪拌し、次に２５０μＬ ＰＥＧ−シラン、２５μＬ ＴＥＯＳを加え、２０℃で１６から１８時間攪拌した。３日目に、マイクロエマルジョン系を不安定化するために２倍容量の９５％エタノールを添加することによって粒子を回収し、１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。粒子を９５％エタノールで２回、ＤＩ水で１回洗浄し、８０ｍＬ ＤＩ水に移した。次いで、溶液を４０℃に保ち、１時間撹拌して、過剰な残渣を除去した。最後に、ネオアンチゲン＠ＨＳＮを遠心分離法で回収し、ＤＩ水により２回洗浄した。ネオアンチゲン＠ＨＳＮ中のネオアンチゲンの負荷量は１重量％より高く、ＴＥＭおよびＤＬＳを介して測定された粒子径を表１に示す。

チオール部分修飾抗原＠ＨＳＮの合成
合成プロセスには２つの工程がある。１．チオール部分修飾抗原はオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）含有シリカナノ粒子と混合し、抗原とシリカ粒子との間にジスルフィド結合を生成する。２．水相としてのＡｇ‐シリカナノ粒子溶液をマイクロエマルジョン系に導入して抗原＠ＨＳＮを合成する。

１．抗原とＯＰＳＳ−シリカナノ粒子の混合物
５０ｍｇのＯＰＳＳ‐シリカナノ粒子を６．３〜７ｍＬのＤＩ水中に分散させ、次に３７５ｕＬ酢酸塩緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ４．２）酸性緩衝液または３７５ｕＬ ＮａＨ２ＰＯ４（１００ｍＭ， ｐＨ６．５）および７５０ｕＬ ＮａＯＨ （２５ｍＭ）アルカリ性緩衝液を溶液中に添加した。均質になるまで液を攪拌し、７５−１５０ｕＬ抗原溶液（１０−２０ｍｇ／ｍｌ）を加える。４℃または室温で１〜３日間攪拌し続ける。その後、０．０２５％ＴＦＡおよび水で２０％ ＡＣＮ／ＤＭＳＯで粒子を洗浄する。溶液を遠心して粒子を得、上清を分析して、ＨＰＬＣによる抗原負荷量を決定した。

２．チオール部分修飾抗原＠ＨＳＮの合成
デカン３７．５ｍＬ、イゲパールＣＯ−５２０ ６．５６ｍＬ、ヘキサノール２．０６ｍＬを一緒に混合し、２０℃で攪拌した。２２５０ｕＬ抗原−シリカナノ粒子（５０ｍｇ／２２５０ ｕＬ）を水相として混合物に加えた後、２０℃で１０分間攪拌する。３７．６ｕＬの８倍希釈ＡＰＴＭＳ、１５０ｕＬのＴＥＯＳおよび８３．３４ｕＬの２８％ ＮＨ４ＯＨを混合物に導入し、２０℃で１０分間撹拌する。その後、３７．６ｕＬ ８倍希釈ＡＰＴＭＳ、１５０ｕＬ ＴＥＯＳ、８３．３４ｕＬ ２８％ ＮＨ４ＯＨを混合物に加え、２０℃で４時間攪拌する。次に、３７．６ｕＬ のＴＥＯＳと３７５．２ｕＬのＰＥＧ−シランを混合物に加え、一晩２０℃で攪拌する。マイクロエマルジョンを破壊するために、２０ｍＬのエタノールを溶液に導入し、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心して抗原＠ＨＳＮ粒子を得る。粒子をエタノールと水で２回洗浄し、水中に保存する。粒子サイズ（ＴＥＭ）は１００ｎｍ未満であり、ＰＢＳ中でＤＬＳにより測定された粒子の流体力学的直径は１５０ｎｍ未満である。

ＮｅｏＡｇ＠ＨＳＮ免疫原性（ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ発現）と免疫療法
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週間）に、ＮｅｏＡｇ溶液（５０ｕｇポリＩＣを含むまたは含まない、５０ｕｇのＭＣ３８＿ｍＳまたはＭＣ３８＿ｍＬのネオアンチゲン性ペプチドを含む）およびＮｅｏＡｇ＠ＨＳＮ溶液（５０ｕｇのポリＩＣを含むまたは含まない、５０μｇのネオアンチゲン性ペプチドを含むＭＣ３８＿ｍＳ＠ＨＳＮまたはＭＣ３８ｍＬ＠ＨＳＮ溶液）を、１日目、８日目および１５日目にそれぞれ接種した。２８日目および３５日目に、ワクチン接種したマウスから末梢血約３００μＬを採取した。ＣＤ８ Ｔ細胞中のＩＦＮ−ｒ発現の検出法は、上記に記載された。ＭＣ３８＿ｍＳ＠ＨＳＮまたはＭＣ３８＿ｍＬ＠ＨＳＮを接種されたマウスは、ＭＣ３８＿ｍＳまたはＭＣ３８＿ｍＬペプチドを接種されたマウスと比較して、ＣＤ８ Ｔ細胞において有意に高いＩＦＮ−ｒ発現を示した（図６）。このことは、ＨＳＮがネオアンチゲン性ペプチドの免疫原性を増強するための担体および自己アジュバントであり得ることを示す。免疫療法の結果、１週間間隔で３回ＮｅｏＡｇ＠ＨＳＮを接種したマウスはＭＣ３８腫瘍増殖を抑制されたが、ＮｅｏＡｇペプチド＋ポリＩＣ（補助剤）を接種したマウスの腫瘍サイズは対照群と同様であった。

Claims (21)

1. それを必要とする対象において腫瘍増殖の阻害に使用するための中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）であって、ＨＳＮが対象に投与され、それにより腫瘍中の腫瘍浸潤免疫細胞が増加し、ＨＳＮが単層または多層シリカシェルを含み、各シェルがメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で最も内側の中空閉鎖空間が中実シリカコアを有し、空間が任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的大きさが１５０ｎｍ以下であり、媒体がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）。
2. ＨＳＮの流体力学的大きさが１００ｎｍ以下である、請求項１に記載の使用のためのＨＳＮ。
3. ＨＳＮの投与経路が全身投与または局所投与であり得る、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＨＳＮ。
4. 全身投与が静脈内注射または注入である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＨＳＮ。
5. それを必要とする対象において免疫応答の誘導に使用するための中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）であって、ＨＳＮが対象に投与され、ＨＳＮが単層または多層シリカシェルを含み、各シェルがメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で、最も内側の中空閉鎖空間が中実シリカコアを有し、空間が任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的大きさが２００ｎｍ以下であり、媒体がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）。
6. ＨＳＮがアジュバントとして使用され得る、請求項５に記載の使用のためのＨＳＮ。
7. ＨＳＮがＨＳＮに包まれた小型の生物活性成分を含み、前記生物活性成分がＺ_（ｃ）−Ｙ_（ｎ）−Ｘ_（ａ）−ＳＢＩ−Ｘ_（ｂ）−Ｙ_（ｍ）−Ｚ_（ｄ）の構造を有するように修飾され、ここで、Ｚがチオール基含有分子であり、Ｙが正電荷を有するペプチドであり、Ｘが酵素切断可能配列であり、ＳＢＩが小型の生物活性成分であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｍおよびｎの各々が整数であり、ｃ、ｄ、ｍおよびｎの少なくとも１つが０ではない、請求項５または６に記載の使用のためのＨＳＮ。
8. 中空シリカナノスフェア（ＨＳＮ）と、ＨＳＮ内に内包された小型の生物活性成分とを含むＨＳＮコンジュゲートであって、ＨＳＮが単層または多層シリカシェルを含み、各シェルがメソ孔を有し且つ閉鎖中空空間を内包し、任意選択で、最も内側の中空閉鎖空間が中実シリカコアを有し、空間が任意の２つのシリカシェル間の距離または中実シリカコアによって規定され、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中のＨＳＮの流体力学的サイズが２００ｎｍ以下であり、媒体がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である、ＨＳＮコンジュゲート。
9. 前記小型の生物活性成分がネオアンチゲンである、請求項８に記載のＨＳＮコンジュゲート。
10. 前記ネオアンチゲンが腫瘍特異的ネオアンチゲンである、請求項９に記載のＨＳＮコンジュゲート。
11. 前記ネオアンチゲンが、腫瘍特異的ネオアンチゲン、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的ネオアンチゲン、腫瘍ネオエピトープ、ネオアンチゲン性ペプチド、ネオアンチゲン性ＤＮＡ、またはネオアンチゲン性ＲＮＡである、請求項９に記載のＨＳＮコンジュゲート。
12. 前記小型の生物活性成分がＹ_（ｎ）−Ｘ−ＳＢＩ−［Ｘ−Ｙ_（ｍ）］_（ｒ）の構造を有するように修飾され、ここで、Ｙが正電荷を有するペプチドであり、Ｘが酵素切断可能配列であり、ＳＢＩが小型の生物活性成分であり、ｍ、ｎおよびｒの各々が整数であり、ｎおよびｍ×ｒの少なくとも一つが０ではない、請求項８に記載のＨＳＮコンジュゲート。
13. 前記小型の生物活性成分がＹ_（ｎ）−Ｘ_（ａ）−ＳＢＩ−Ｘ_（ｂ）−Ｙ_（ｍ）の構造を有するように修飾され、ここで、Ｙが正電荷を有するペプチドであり、Ｘが酵素切断可能配列であり、ＳＢＩが小型の生物活性成分であり、ｂ、ｎ、ｍおよびｒの各々が整数であり、ｎおよびｍの少なくとも一つは０ではない、請求項８に記載のＨＳＮコンジュゲート。
14. 小型の生物活性成分がＺ_（ｃ）−Ｙ_（ｎ）−Ｘ_（ａ）−ＳＢＩ−Ｘ_（ｂ）−Ｙ_（ｍ）−Ｚ_（ｄ）の構造を有するように修飾され、ここで、Ｚがチオール基含有分子であり、Ｙが正電荷を有するペプチドであり、Ｘが酵素切断可能配列であり、ＳＢＩが小型の生物活性成分であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｍおよびｎの各々が整数であり、ｃ、ｄ、ｍおよびｎの少なくとも１つが０ではない、請求項８に記載のＨＳＮコンジュゲート。
15. 請求項８〜１４のいずれか一項に記載のＨＳＮコンジュゲートを含むワクチン組成物。
16. 小型の生物活性成分の対象への送達に使用するための、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の高分子コンジュゲート。
17. 抗原またはネオアンチゲンがＨＳＮに内包されている、免疫療法において抗原またはネオアンチゲンの対象への送達に使用するための、請求項８〜１４のいずれか一項に記載のＨＳＮコンジュゲート。
18. ネオアンチゲンが腫瘍特異的ネオアンチゲン、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的ネオアンチゲン、腫瘍ネオエピトープ、ネオアンチゲン性ペプチド、ネオアンチゲン性ＤＮＡ、またはネオアンチゲン性ＲＮＡであり、抗原がウイルス抗原、細菌抗原、または微生物抗原である、請求項１７に記載の使用のＨＳＮ。
19. 生物活性成分を含む中空シリカナノ粒子の製造方法であって、以下の工程を含む方法。
    （ａ）油相、界面活性剤、アルコキシシランおよび／またはシリケート源、１つ以上の生物活性成分を含む水相、および任意選択で共界面活性剤を提供すること；
    （ｂ）工程（ａ）に記載の組成物から油中水型（Ｗ／Ｏ）マイクロエマルジョンを形成すること；
    （ｃ） （ｂ）のＷ／Ｏマイクロエマルジョンに開始試薬を添加して、生物活性成分をカプセル化するＨＳＮを形成すること；
    （ｄ）Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンを不安定化させるために不安定化条件を実施し、このようにしてマイクロエマルジョンから形成された、結果として生じる粒子を回収すること；並びに
    （ｅ）工程（ｄ）で回収された粒子を水性洗浄相中に分散させてシリカナノ粒子を得ること。
20. 以下の特徴の少なくとも１つをさらに含む、請求項１９に記載の方法：
    （ｉ）界面活性剤がイオン性であるか；または界面活性剤が非イオン性でありオキシアルキレン単位を欠く；
    （ｉｉ）生物活性成分が使用前にアミノ酸配列で修飾されており、配列中のアミノ酸が正に荷電しているか、またはチオール基を含んでいてもよい；および
    （ｉｉｉ）生物活性成分と親和性を有する物質が、工程（ａ）において水相に導入される。
21. 請求項１９または２０に記載の方法によって調製された中空シリカナノ粒子。
    

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