CN108743958B - 药物分子与阀门分子联合作用的gsh响应型介孔硅纳米载药颗粒及其制备方法 - Google Patents

药物分子与阀门分子联合作用的gsh响应型介孔硅纳米载药颗粒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，由表面接枝了荷负电且具有疏水性短肽的介孔硅纳米颗粒和药物分子组成，药物分子为荷正电且含有苯环结构的疏水药物分子，表面接枝了荷负电且具有疏水性短肽的介孔硅纳米颗粒中，荷负电且具有疏水性的短肽通过谷胱甘肽响应型功能基团接枝在介孔硅纳米颗粒表面，部分药物分子位于表面接枝了荷负电且具有疏水性短肽的介孔硅纳米颗粒的孔道中，部分药物分子通过与荷负电且具有疏水性的短肽之间的疏水作用和静电作用结合形成封堵阀门，封堵阀门封堵住表面接枝了荷负电且具有疏水性短肽的介孔硅纳米颗粒的孔道结构的孔口。

Description

药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药 颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于药物载体材料领域，涉及一种药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒及其制备方法。
背景技术
目前，治疗肿瘤的方法有多种，如手术，化疗，放疗和靶向治疗等，其中，化疗是治疗许多肿瘤的首选方法。但化疗本身存在许多缺陷，如大多数化疗药物在杀死癌细胞的同时会严重伤害人体正常细胞和药物利用率低等，为解决上述问题，研究者开发了多种药物控释系统。理想的药物控释系统要求将药物特异性递送至病灶部位后再释放，以增加药物的生物利用度，降低药物对全身的毒副作用。介孔硅具有孔径连续可调，骨架结构稳定，比表面积和孔体积大，内外表面易修饰，无生理毒性等特点，适合作为药物分子载体使用。介孔硅有内外不同的两个表面，可用于通过pH、酶、光、氧化还原、磁场、超声波等刺激响应来控制药物的定时、定点和定量释放，以控制病灶部位的药物浓度，减少对正常细胞、组织或器官的不良反应，因而引起学界越来越多的关注。
在氧化还原刺激响应的控释体系构建中，由于二硫键具有氧化还原敏感性而被引入介孔硅药物控释系统。谷胱甘肽(GSH)是一种含巯基的三肽，具备较强的还原性，很容易切断二硫键。研究表明，人类细胞内GSH浓度(2～10mM)显著高于其在细胞外的浓度(2～10μM)。此外，大多数肿瘤细胞的细胞内GSH浓度比正常细胞高几倍。这种明显的差异性为氧化还原刺激响应体系的构建提供了必要的条件。
目前，基于GSH氧化还原响应的介孔硅控释体系通常包含：作为药物载体的介孔硅纳米颗粒、作为GSH响应的二硫键及作为孔封堵材料的大分子，它们都是利用长链“封堵”的原理将药物分子封堵在介孔硅的孔道内部，再通过刺激响应实现药物的控释。高分子聚合物由于其高聚物的长链分子及大的分子基团具有优良的封堵效果，常常被用来作为孔封堵的分子。但是，高聚物修饰会带来一些不利的因素，例如，高聚物合成的复杂性，修饰了高聚物分子的载体在载药后的洗涤过程冗长，以及由于高聚物分子降解引起的局部过酸导致的二次伤害等。因此，若能设计出以生物相容性的小分子和药物分子联合作用来构建阀门实现对药物分子的封堵的GSH响应型介孔硅纳米载药体系，来避免高聚物修饰引起的一系列弊端，对于简化这类载药体系的制备工艺和提高这类载药体系的安全性都将产生积极的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒及其制备方法，以解决现有基于GSH氧化还原响应的介孔硅控释体系采用高分子聚合物作为孔封堵分子存在的制备和载药工艺复杂和药物载体安全性有待提高的问题。
本发明提供的药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，由表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒和药物分子组成，所述药物分子为荷正电且含有苯环结构的疏水药物分子，所述表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒中，短肽通过谷胱甘肽响应型功能基团接枝在介孔硅纳米颗粒表面，短肽为荷负电且具有疏水性的短肽，连接了短肽的谷胱甘肽响应型功能基团的结构式如式(Ⅰ)所示，
Figure GDA0003084128270000021
部分药物分子位于表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒的孔道中，部分药物分子通过与短肽之间的疏水作用和静电作用结合形成封堵阀门，封堵阀门封堵住表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒的孔道结构的孔口；该纳米载药颗粒中的二硫键能被谷胱甘肽切断，二硫键被切断后，封堵阀门脱落，从而实现孔道中的药物分子的释放。
上述纳米载药颗粒的技术方案中，式(Ⅰ)所示的结构式中，与Si相连的O与介孔硅纳米颗粒表面的Si相连形成Si—O键。
上述纳米载药颗粒的技术方案中，表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒中，连接了短肽的谷胱甘肽响应型功能基团的含量优选为20wt.％～25wt.％。
上述纳米载药颗粒的技术方案中，表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒的粒径优选为80～150nm。
上述纳米载药颗粒的技术方案中，对于药物分子的选择只要满足荷正电且含有苯环结构的疏水药物分子这一原则即可，常见的这类药物分子包括药物分子为阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星以及丝裂霉素C等。
上述纳米载药颗粒的技术方案中，作为表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒改性基础的介孔硅纳米颗粒可以采用MCM-41型介孔硅纳米颗粒。
上述纳米载药颗粒的技术方案中，表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒的孔径优选为3～5nm。
本发明还提供了上述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒的制备方法，步骤如下：
(1)制备介孔硅纳米颗粒
调节十六烷基三甲基溴化铵水溶液的pH值至11.0～11.5，在搅拌下加热至70～80℃，滴加硅酸四乙酯，在70～80℃反应2～3h，将反应产物用水和乙醇洗涤，即得介孔硅纳米颗粒；
十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为2～2.5mg/mL，硅酸四乙酯与十六烷基三甲基溴化铵水溶液的体积比为(1～1.1):100；
(2)制备巯基修饰的介孔硅纳米颗粒
将介孔硅纳米颗粒分散于无水乙醇中形成分散液A，在氮气保护下向分散液A中滴加巯丙基三甲氧基硅烷，回流反应10～14h，将反应产物用水和乙醇洗涤，然后加入浓盐酸-无水乙醇混合液中加热回流1～2h，将反应产物用乙醇洗涤，再加入20～40g/L的硝酸铵乙醇溶液中，在搅拌下加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵，用水和乙醇洗涤后得到巯基修饰的介孔硅纳米颗粒；
巯丙基三甲氧基硅烷的滴加总量与介孔硅纳米颗粒的质量比为(0.58～1.92):1；
(3)制备二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒
将2,2'-二硫二吡啶溶解于无水乙醇中，将巯基修饰的介孔硅纳米颗粒分散于无水乙醇中形成分散液B，将2,2'-二硫二吡啶溶液与分散液B混合，搅拌反应10～14h，将反应产物用乙醇洗涤，即得二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒；
2,2'-二硫二吡啶与巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为(1～1.2):1；
(4)制备氨基酸修饰的介孔硅纳米颗粒
将N-乙酰基-L-半胱氨酸溶解于pH值为8.00～8.07的PBS缓冲液中，将用pH值为8.00～8.07的PBS缓冲液冲洗后的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒加入N-乙酰基-L-半胱氨酸中，搅拌反应10～14h，将反应产物用去离子水洗涤，即得N-乙酰基-L-半胱氨酸修饰的介孔硅纳米颗粒；N-乙酰基-L-半胱氨酸与二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为(2.5～3):1；
(5)制备短肽修饰的介孔硅纳米颗粒
将D-色氨酸分散于MES缓冲液中，然后加入二甲基亚砜至D-色氨酸溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，搅拌反应20～40min，再加入用pH值为7.2～7.4的PBS缓冲液洗后的N-乙酰基-L-半胱氨酸修饰的介孔硅纳米颗粒，搅拌反应10～14h，将反应产物用水洗涤，即得短肽修饰的介孔硅纳米颗粒；
D-色氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐以及N-乙酰基-L-半胱氨酸修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为(1～1.5):(1～1.5):(0.5～0.75):1；
(6)负载药物
将短肽修饰的介孔硅纳米颗粒加入药物水溶液中，在50～60℃的水浴中加热2～4h以使药物分子进入短肽修饰的介孔硅纳米颗粒的孔道中，然后在室温静置10～14h，固液分离，洗涤除去未进入孔道中以及与短肽结合不稳定的药物分子，即得GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒。
上述方法的步骤(2)中，浓盐酸-无水乙醇混合液中浓盐酸与无水乙醇的体积比优选为(1～2):(8～9)，分散液A中介孔硅纳米颗粒的浓度优选为6～8mg/mL。
上述方法的步骤(3)中，2,2'-二硫二吡啶溶液的浓度优选为30～50mg/mL，分散液B中巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的浓度优选为8～15mg/mL。
上述方法的步骤(4)中，最好是将N-乙酰基-L-半胱氨酸溶解于pH值为8.00～8.07的PBS缓冲液中使N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度为25～30mg/mL。
上述方法的步骤(5)中，最好是将D-色氨酸分散在MES缓冲液中使D-色氨酸的浓度为20～30mg/mL。
上述方法中，MES缓冲液的pH值为6.0、浓度为50～100mmol/L，PBS缓冲液的浓度为50～100mmol/L。
本发明的技术方案是基于以下思路和原理设计出来的：由前期研究可知，一般MCM-41型介孔硅纳米颗粒的孔道直径在4nm左右，而我们希望通过表面修饰来作为阀门分子的短肽的分子长度最长约为2nm，考虑到分子在水溶液的自由伸缩性，修饰的阀门分子不足以对孔道起到良好的封堵作用，因此，本发明联合运载分子来实现对孔口的封堵，考虑到修饰短肽分子的荷电性，选取荷正电且含有苯环结构的药物分子运载分子，以运载分子为桥梁，借助运载分子本身的苯环与肽段上的苯环以疏水作用力结合在一起，这使得孔道口周围的肽段之间通过药物分子桥接在一起，形成更为严密的封堵结构，将药物封堵在孔道内。此外，短肽的肽链上的羧基与苯环的距离很近，并且带有负电，能够通过电荷作用有效吸引带正电的运载分子，这就为桥接作用提供了更强的作用力。
与现有技术相比，本发明产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了一种药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，与现有基于GSH氧化还原响应的介孔硅控释体系以高分子聚合物作为孔封堵分子不同的是，本发明提供的载药颗粒依靠药物分子与短肽阀门分子的联合作用形成封堵阀门，将药物分子负载于介孔硅纳米颗粒的孔道结构中，短肽具有生物相容性好、易修饰、易生物降解、降解产物对机体无二次伤害、抗免疫应答和生物识别能力好等特点。由此就避免了采用高分子聚合物作为封堵分子存在的合成修饰工艺复杂、载药操作冗长、高分子聚合物降解引起的局部过酸和二次伤害等一系列问题，对简化基于GSH氧化还原响应的介孔硅控释体系的制备工艺和提高其安全性都将产生积极的意义。
2.本发明提供的药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒中，由于短肽的分子结构及其在介孔硅纳米颗粒表面的接枝量恰当，同时连接介孔硅二氧化硅和短肽分子的谷胱甘肽响应型功能基团的结构和长度适当，因此短肽分子能与荷正电且含有苯环结构的疏水药物分子联合作用形成阀门分子，并且能响应谷胱甘肽实现纳米载药颗粒中药物分子的释放，具有良好的控释能力。以亚甲基蓝为模拟药物研究了纳米载药颗粒在GSH刺激响应下的控释性能，结果表明，本发明提供的纳米载药颗粒的封堵阀门在无GSH及2μmol/LGSH(与人体细胞外的GSH浓度相当)环境中能保持良好的封堵效果，在10mmol/L GSH刺激下，能快速释放出负载的药物，同时，该纳米载药颗粒对孔道的封堵能力不因药物负载量的增加而减弱，始终保持着良好的封堵能力，且该纳米载药颗粒对不同浓度的药物均有良好的释放能力。
3.体外细胞实验证实了本发明提供的纳米载药颗粒的载体本身具有良好的生物相容性，同时负载阿霉素的纳米载药颗粒对HeLa细胞有明显的抑制作用。细胞吞噬实验结果表明，负载阿霉素的纳米载药颗粒能快速被HeLa细胞吞噬，并在细胞质内释放出阿霉素，负载阿霉素的纳米载药颗粒在HeLa细胞内有良好的控释性能。
4.本发明还提供了制备药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒的方法，该方法接枝修饰短肽的工艺简单，载药操作也简单易行，无须使用特殊的试剂和设备，具有容易推广应用的特点。
附图说明
图1是本发明中短肽修饰的介孔硅纳米颗粒的合成路线图。
图2是MCM-41和MCM41-S-S-NAC-Trp的TEM图，其中，a、b两图分别为MCM-41和MCM41-S-S-NAC-Trp的TEM图。
图3是实施例1制备的纳米颗粒的红外光谱，其中，a～d图依次为MCM41-SH、MCM41-S-S-pridine、MCM41-S-S-NAC和MCM41-S-S-NAC-Trp的红外光谱。
图4是实施例1制备的纳米颗粒的动态光散射测量结果。
图5是MCM-41、MCM41-SH和MCM41-S-S-NAC-Trp的N2吸附-脱附等温曲线(图a)h和BJH孔径分布。
图6是MCM41-SH、MCM41-S-S-pridine、MCM41-S-S-NAC和MCM41-S-S-NAC-Trp的热重分析结果。
图7是MB@MCM41-S-S-NAC-Trp响应10mmol/LGSH的药物释放曲线。
图8是MB@MCM41-S-S-NAC-Trp响应不同浓度的GSH的药物释放曲线。
图9是MB@MCM41-S-S-NAC-Trp负载不同浓度MB的药物释放曲线。
图10是L929细胞与不同浓度的MCM41-S-S-NAC-Trp培养48h后的细胞成活率测定结果(图a)与HeLa细胞与不同浓度的MCM41-S-S-NAC-Trp和DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp培养48h后的细胞成活率测定结果(图b)。
图11是HeLa细胞与DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp分别培养3h(a)，12h(b)和24h(c)的CLSM图像，标尺为20μm，每行从左到右的图像依次是：明场的细胞(1)，Hoechst 33342染色的细胞核(2，蓝色)和DOX(3，绿色)染色，2和3的叠加(4)以及1,2和3的叠加(5)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
以下具体实施方式中采用的化学试剂的信息如表1所示，采用的仪器和设备信息如表2所示。
表1化学试剂信息
Figure GDA0003084128270000061
Figure GDA0003084128270000071
表2仪器和设备信息
Figure GDA0003084128270000072
实施例1
本实施例中，药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，步骤如下：
(1)制备介孔硅纳米颗粒
该步骤采用模板法制备MCM-41型介孔硅纳米颗粒。
将表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于去离子水形成浓度为2.08mg/mL的CTAB水溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节CTAB水溶液的pH值至11，在搅拌下采用油浴加热至80℃，待温度温度后，按照TEOS与CTAB水溶液的体积比为1:100的比例滴加硅酸四乙酯(TEOS)，在搅拌条件下于80℃反应2h，停止加热，冷却至室温，以10000r/min的转速离心10min，收集颗粒，用去离子水和无水乙醇分别洗3遍，得到的白色颗粒即为MCM-41型介孔硅纳米颗粒，记作MCM-41。
(2)制备巯基修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-SH)
将MCM-41加入无水乙醇中，充分超声分散得到分散液A，分散液A中，MCM-41的浓度为6mg/mL，在氮气保护下向分散液A中滴加巯丙基三甲氧基硅烷，在80℃回流反应10h，然后冷却至室温，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，分别用去离子水和乙醇洗涤2次，得到未脱模板剂(CTAB)的巯基修饰的介孔硅纳米颗粒。巯丙基三甲氧基硅烷的滴加总量与MCM-41的质量比为0.58:1。
对未脱模板剂的巯基修饰的介孔硅纳米颗粒进行脱模板：将未脱模板剂的巯基修饰的介孔硅纳米颗粒分散在浓盐酸-无水乙醇混合液中，浓盐酸-无水乙醇混合液中浓盐酸与无水乙醇的体积比为1:9，加热回流1h，然后冷却至室温，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用乙醇洗涤2次，将洗涤后的颗粒分散在20g/L的硝酸铵乙醇溶液中，在搅拌下加热回流1h以除去CTAB，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，分别用去离子水和乙醇洗涤2次，得到MCM41-SH。
(3)制备二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-S-S-pridine)
将2,2'-二硫二吡啶溶解于无水乙醇中形成浓度为40mg/mL的2,2'-二硫二吡啶溶液，将MCM41-SH分散于无水乙醇中形成分散液B，分散液B中MCM41-SH的浓度为15mg/mL，将2,2'-二硫二吡啶溶液与分散液B混合，搅拌反应10h，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用乙醇洗涤3次，即得MCM41-S-S-pridine；2,2'-二硫二吡啶与巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为1:1。
(4)制备氨基酸修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-S-S-NAC)
首先用NaOH溶液调节pH＝7.4、浓度为100mmol/L的PBS缓冲液至pH＝8.00～8.07，将N-乙酰基-L-半胱氨酸溶解于pH＝8.00～8.07的PBS缓冲液中使N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度为27mg/mL，将用pH＝8.00～8.07的PBS缓冲液冲洗3遍后的MCM41-S-S-pridine加入N-乙酰基-L-半胱氨酸中，搅拌反应12h，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用去离子水洗涤3次，即得MCM41-S-S-NAC。N-乙酰基-L-半胱氨酸与MCM41-S-S-pridine的质量比为2.7:1。
(5)制备短肽修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-S-S-NAC-Trp)
将D-色氨酸(Trp)分散于pH＝6.0、浓度为100mmol/L的MES缓冲液中使Trp的浓度为20mg/mL，然后加入二甲基亚砜至Trp恰好溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(SULFO-NHS)，搅拌反应30min，再加入用pH值为7.4的PBS缓冲液洗3遍后的MCM41-S-S-NAC，搅拌反应12h，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用去离子水洗涤3次，即得MCM41-S-S-NAC-Trp。
Trp、EDC.HCl、SULFO-NHS以及MCM41-S-S-NAC的质量比为1:1:0.5:1。
步骤(2)～(5)的合成路线如图1所示。MCM41-S-S-NAC-Trp中，短肽通过谷胱甘肽响应型功能基团接枝在介孔硅纳米颗粒表面，连接了短肽的谷胱甘肽响应型功能基团的结构式如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)所示基团中与Si相连的O与MCM-41型介孔硅纳米颗粒上的Si相连形成Si—O键。
Figure GDA0003084128270000091
(6)负载药物
亚甲基蓝(MB)具有水溶性好，理化性质稳定，不易水解，便于检测，价格低廉等优点，其直径约为1.1～1.2nm，在水溶液中带正电荷，因此，本实施例中选择MB作为模拟药物。
配制浓度为1×10-3mol/L的MB水溶液，取MB水溶液750μL与10mg MCM41-S-S-NAC-Trp，加入2mL离心管中并混合均匀，然后置于50℃水浴中加热2h，然后在室温静置过夜，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用去离子水洗涤4次，除去未进入到纳米颗粒孔道内以及与短肽结合不稳定的MB，即得负载MB的GSH响应型介孔硅纳米颗粒，记作MB@MCM41-S-S-NAC-Trp。
实施例2
本实施例对实施例1中各步骤制备的产物进行性能测试。
1.形貌分析
采用高倍率透射电子显微镜(TEM)对步骤(1)制备的MCM-41和步骤(5)制备的MCM41-S-S-NAC-Trp的形貌进行观察，结果如图2所示，图2中，a、b两图分别为MCM-41和MCM41-S-S-NAC-Trp的TEM图。由图2a可以看出，MCM-41呈球形，表面光滑且孔道明显，颗粒间分散性良好，粒径在80～150nm之间。从图2b可以看出，MCM41-S-S-NAC-Trp仍为球形，表面有明显的介孔，粒子尺寸大小也在80～150nm之间，说明在经过改性后介孔硅的主体结构没有被破坏。但在图2b中可明显观察到粒子表面具有包覆层，并且看到粒子间出现交联现象，这是因为粒子表面修饰了短肽，粒子与粒子表面的短肽之间通过非共价键相互作用而产生的交联现象。
2.修饰基团的结构鉴定
为了证实每一步的反应是否成功，对每一步反应制得的纳米粒子分别进行了傅立叶红外光谱(FT-IR)分析，如图3所示，图3中，a～d图依次为MCM41-SH、MCM41-S-S-pridine、MCM41-S-S-NAC和MCM41-S-S-NAC-Trp的红外光谱。
由图3可知，MCM-41在修饰不同基团前后，对应的红外谱图都出现了不同的峰位变化，但是作为本体的MCM-41的特征峰没有发生很大变化。在波数3000-3700cm-1之间，都存在着一个较宽的吸收峰，这是硅羟基(Si-OH)的伸缩振动峰。由于巯丙基三甲氧基硅烷与MCM-41表面的硅羟基(Si-OH)发生反应后形成Si-O-Si键，使得MCM-41表面的硅羟基数量减少，所以在波数为3000-3700cm-1之间的吸收峰强度不高；在波数1081cm-1附近的一个相对较宽又较尖锐的吸收峰，应是MCM-41内、外表面上的硅氧四面体(SiO4)反对称伸缩振动峰；波数在500-1000cm-1之间的几个吸收峰，归属于硅氧四面体的骨架振动谱带。以上结果说明在对MCM-41改性的过程中并没有破坏其主体结构。从图3a可知，将巯基接枝到二氧化硅表面后，其FTIR光谱显示出1450cm-1和2935cm-1的新谱带，这分别属于-CH2-中的C-H伸缩振动和C-H不对称弯曲振动特征峰。这个结果表明MCM-41被有机物官能化。希望出现的巯基吸收带能表明修饰成功，但S-H伸缩振动吸收带较弱，尽管如此，C-H的吸收带只能从与巯基结合的亚甲基上出现，这从侧面证明巯基(-SH)修饰成功。从图3b可知，在1584cm-1和1564cm-1处出现两个新的峰，这归属于芳环(骨架谱带)的伸缩振动，并且2933cm-1处的峰表明CH2的存在，这表明成功引入二硫键。由图3c可知，在进行二硫化物交换反应生成MCM41-S-S-NAC后，1584cm-1和1564cm-1处的两条谱带消失。与此同时，在1562cm-1处出现了新谱带，这属于C-N伸缩振动，表明成功的二硫化物交换反应。由图3d可知，在修饰色氨酸后出现了几个新的谱带。在1766cm-1和1683cm-1处出现的谱带属于羰基伸缩振动，1642cm-1处的新谱带归属于酰胺的N-H键，此外，在1458cm-1和1579cm-1处有两个新的谱带是由苯环中的C＝C骨架振动引起的，这说明MCM41-S-S-NAC中的羧基与色氨酸中的氨基酰化反应成功，制得MCM41-S-S-NAC-Trp。
3.Zeta电位与粒径分析
不同的化学基团所表现出来的电负性是不同的，在MCM-41表面引入不同的化学基团后，会导致纳米颗粒表面的电位发生变化。通过Zeta电位分析仪来检测每一步反应所得到的纳米颗粒的电位值，通过Zeta电位值得变化来判断反应是否成功进行。通过Zeta电位分析仪分别测定了MCM41-SH、MCM41-S-S-pridine、MCM41-S-S-NAC和MCM41-S-S-NAC-Trp分散在纯水中的Zeta电位值，结果如表3所示。
表3 MCM-41接枝化学基团后的Zeta电位值
Figure GDA0003084128270000111
MCM41-SH因修饰了巯基，巯基在水溶液中带负电荷，因此Zeta电位值为-24.6mV，当进一步与2，2'-二硫二吡啶反应引入二硫键和吡啶环之后，MCM41-S-S-pridine的电负性增大至-27.9mV，这是由于吡啶环上的氮原子的电负性较大所致。N-乙酰基-L-半胱氨酸的氨基被保护，只有羧基裸露，其本身表现为强电负性，因此当其与MCM41-S-S-pridine进行二硫交换反应制得MCM41-S-S-NAC后电负性进一步增加至-30.8mV，而MCM41-S-S-NAC-Trp电负性减弱至-24.2mV，这是由于引入的色氨酸含有能质子化的N-H键而使整体电负性减弱。
利用动态光散射(DLS)测定MCM41-SH、MCM41-S-S-pridine、MCM41-S-S-NAC和MCM41-S-S-NAC-Trp分散在纯水中的粒径分布，结果如图4所示。由图4可知，MCM41-SH的粒径分布主要集中在200nm左右，其粒径平均值为255.2nm，这与图2TEM测的值相差较大，其可能的原因是：TEM下看到的是分散的单个颗粒，能直观反应颗粒尺寸，而在DLS中的样品由于分散在水中，颗粒表面会出现水化层，使得测试粒径偏大，此外，粒子间不可避免的的团聚现象也会导致粒径差异较大。MCM41-S-S-pridine的粒径分布主要集中在250nm左右，且分布集中，其粒径平均值为272.1nm，这与MCM41-SH的粒径相比增大了约20nm，这主要是修饰的二硫键以及吡啶环使得粒子表面链长增加，从而导致粒径增大，这也从侧面反应了反应的成功。MCM41-S-S-NAC的粒径分布也主要集中在250nm左右，且分布集中，其粒径平均值为278.7nm，这与MCM41-S-S-pridine的粒径相差不大，主要原因是修饰的N-乙酰基-L-半胱氨酸分子与吡啶环的长度较接近，因此，二者粒径较接近。MCM41-S-S-NAC-Trp的粒径分布较为集中，主要在300nm左右，其粒径平均值为335.3nm，粒径的增加主要是修饰色氨酸使得粒子表面的分子链长增加，从而表现为粒径增大，这也进一步说明了反应的成功。
4.介孔性质表征
在改性前后MCM-41的比表面积、孔容积和孔径大小及分布情况主要通过N2吸附-脱附法测定，相关数据见表4和图5。
如图5a所示，MCM-41、MCM41-SH和MCM41-S-S-NAC-Trp的吸附平衡等温曲线属IUPAC分类中的IV型，H1滞后环，与典型的MCM-41型介孔材料相同，三者在低压段吸附量平缓增加，此时N2分子经历了从单层到多层吸附在介孔的内表面，随着相对压力P/P0的不断增加，N2的吸附量也在增加。MCM-41，MCM41-SH在相对压力P/P0在0.3～0.4之间以及MCM41-S-S-NAC-Trp在相对压力P/P0在0.4～0.6之间时，吸附曲线与脱附曲线出现比较明显的突跃且两条曲线距离很窄，表明含有介孔结构，且孔的均一性很好，这也与图5b中的孔径分布相一致。此时相对压力继续增大，N2会在介孔硅的孔道中出现凝聚现象，产生H1型回滞环，其反映的是两端开口的管径分布均匀的圆筒状孔，可在孔径分布相对较窄的介孔材料，和尺寸较均匀的球形颗粒聚集体中观察到，这说明实施例1制备的材料是孔径和尺寸都分布均匀的圆形贯通孔道，这与MCM-41型介孔硅相符，说明修饰肽后介孔结构仍然存在。
表4 MCM-41、MCM41-SH和MCM41-S-S-NAC-Trp的比表面积、孔容积和孔径值
Figure GDA0003084128270000121
由表4可知，MCM41和MCM41-SH的比表面积、孔容积和孔径值都很接近，在考虑到仪器测量误差后可认为修饰巯基不会对MCM41的表面积、孔容积和孔径造成较大影响，MCM41-S-S-NAC-Trp的表面积和孔容积值明显变小，这很可能是孔道口存在着巯基(-SH)，在后面的改性中修饰的肽大量存在于孔道口，这些肽在室温下是自组装在一起的，而我们的测试温度为110℃，该温度下肽已经失活堵在孔道口，而且粒子之间本身存在粘连现象，粒子与粒子之间会有相互堵塞，影响测试结果，但即便如此，这个比表面积仍然足够作为载体进行药物负载和控释。MCM41-S-S-NAC-Trp的孔径有所变大，这可能是在修饰肽的过程中，反应条件偏碱性，而介孔硅对碱十分敏感，碱会使得孔道略微变大。
5.热重分析
通过热失重分析法(TGA)对MCM41-SH、MCM41-S-S-pridine、MCM41-S-S-NAC和MCM41-S-S-NAC-Trp表面修饰的有机基团进行定量测定，结果如图6所示。由图6可知，巯基(-SH)修饰的MCM41-SH在测试区间失重约为7.6％，这主要是修饰在介孔硅表面的硅烷偶联剂引起的，硅烷偶联剂末端为巯基。对于MCM41-S-S-pridine而言，其在测试区间的失重增加至10.8％，这与其结构增加了硫和吡啶，有机物含量增加有关。MCM41-S-S-NAC在测试区间的失重值较MCM41-S-S-pridine明显增多，达到了16.4％，这是因为修饰的N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)增加了纳米颗粒的有机物比重，当温度上升后有机物大量失重，造成失重增加。MCM41-S-S-NAC-Trp在测试区间的失重值进一步增加至23％，这是因为在MCM41-S-S-NAC上接枝了色氨酸，纳米颗粒的有机物比重进一步增加。
以上通过TEM、IR、Zeta电位、DLS、N2吸附-脱附和TGA表征反应产物，结果表明MCM41-S-S-NAC-Trp构建成功。
实施例3
为了研究MCM41-S-S-NAC-Trp对MB的负载能力及封堵阀门对孔道的封堵能力，以等量的(5mg)药物控释载体MCM41-S-S-NAC-Trp分别与不同浓度(1,2,5mmol/L)的MB进行负载，负载操作与实施例1的步骤(6)相同，并进行最大载药量及包封率的测定，载药量(Drugloading content，DLC)与包封率(Entrapment efficiency，EE)计算公式如下，结果如表5所示。
Figure GDA0003084128270000131
Figure GDA0003084128270000132
表5 MCM41-S-S-NAC-Trp负载不同浓度MB的载药量与包封率
Figure GDA0003084128270000133
负载1mmol/L的MB时，载药量为10.56％，包封率为94.28％，可见，封堵阀门对孔道拥有良好的封堵能力；当负载2mmol/L的MB时，载药量进一步提高，而包封率略有提高，说明封堵阀门能有效封堵孔道；当负载的MB浓度升至5mmol/L时，载药量大大增加，但是包封率下降，说明有较多的游离MB无法进入到孔道内，意味着载药体系的载药能力已趋近最大值。该结果表明MCM41-S-S-NAC-Trp能负载大量的药物，并且封堵阀门具有良好的封堵能力。
实施例4
本实施例中，对实施例1制备的MB@MCM41-S-S-NAC-Trp进行药物释放实验，以验证其控制-释放性能。
(1)取5mg负载亚甲基蓝的GSH响应型介孔硅纳米颗粒，用200μL去离子溶解，然后装入两端被截留分子量为14kDa的半透膜封堵的管状容器中，将此容器放入25mL烧瓶中后加入15mL去离子水缓慢磁力搅拌，每天换3次水，搅拌2天，最后一次换水后加15mL去离子水过夜。
释放实验时先取3mL烧瓶内的液体作1h的基线数据，每隔10min取一个点，取6个点，测量完吸光度后马上倒入烧瓶内，基线完成后(即60min后)加入称量好的GSH粉末(溶液中GSH浓度为10mmol/L)，盖盖磁力搅拌，然后每10min取释放液测试吸光度，测量完尽快倒回体系中，连续5h(第一小时每10min测量一次，第二小时每20min测量一次，此后每30min测量一次)。最后通过作标准曲线将吸光度值换算成浓度值。MB@MCM41-S-S-NAC-Trp的药物释放曲线如图7所示。
图7中，0～60min内的6个点属于加入GSH之前的平衡数据，在测量的1h内，MB的浓度值没有明显变化，说明MB被牢牢封堵在孔道内，几乎无泄漏。当在第60min加入GSH使释放体系中的GSH浓度达到10mmol/L后，MB的浓度值明显升高，第70min时的浓度值已达前60min的4倍，此后，MB的浓度值继续升高，在第300min以后，释放曲线趋于平缓，说明MB的释放接近结束，在第360min时MB的浓度值到达最初的19.3倍。这说明GSH加速了控释系统MB@MCM41-S-S-NAC-Trp的药物释放，结合其控释机理，只有连接肽链的二硫键因还原而切断，使得封堵孔口的药物分子和肽链被移除后，孔道内的MB才能快速释放出来。以上结果表明MB@MCM41-S-S-NAC-Trp在无GSH环境中能有效封堵孔口，而当处于10mmol/L的GSH环境中时，连接肽的二硫键被打断，使孔口打开，孔道内的MB得以释放，实现了对药物的可控释放。
(3)在明确了MB@MCM41-S-S-NAC-Trp能有效响应GSH刺激后，以下采用与前一步骤相同的方法研究MB@MCM41-S-S-NAC-Trp对不同浓度的GSH(2μmol/L,2mmol/L,10mmol/L)刺激响应情况，结果如图8所示。由图8可知，当MB@MCM41-S-S-NAC-Trp处于2μmol/LGSH环境(与人体细胞外的GSH浓度相当)时，释放液中MB浓度仅在刚加入GSH时略微增加，随着时间的增加，MB浓度保持不变，说明MB@MCM41-S-S-NAC-Trp没有进一步释放出MB。当MB@MCM41-S-S-NAC-Trp所处环境中GSH浓度增加至2mmol/L时，释放液中的MB浓度明显增加，释放结束时MB浓度为0.5μmol/L，达到无GSH环境中的5倍。当MB@MCM41-S-S-NAC-Trp处于为10mmol/LGSH环境中时，释放液中MB浓度大大高于2mmol/L GSH环境中的浓度，最终浓度为1.83μmol/L，为无GSH环境中的18倍。
以上结果说明，MB@MCM41-S-S-NAC-Trp在与人体体液中的GSH浓度相当的环境中能有效封堵介孔硅孔道，不会提前释放，而当处于部分正常细胞内常见的2mmol/L GSH环境时，封堵阀门即能有效响应GSH刺激而释放出孔道内负载的部分模拟药物MB，当该控释系统处于癌细胞内常见的10mmol/L GSH环境时，即会立即响应GSH的刺激而释放出负载的大量MB，具有优异的GSH刺激响应性。
(3)为了进一步研究载药量与释药量之间的关系，采用不同浓度(1，2，5mmol/L)的MB进行了载药和释放实验，药物释放率(Release efficiency,RE)如表6所示，释放曲线如图9所示。
表6 MCM41-S-S-NAC-Trp负载不同浓度MB的释药率
Figure GDA0003084128270000151
由图9可知，在不同的药物负载量下，当无GSH刺激时，MB@MCM41-S-S-NAC-Trp均能做到有效封堵孔道而几乎无泄漏，当MB@MCM41-S-S-NAC-Trp处于10mmol/L GSH环境时，能快速响应刺激而释放出MB。可见，随着负载药物的浓度增加，控释系统释放出的药物浓度也随之增加。由表6可知，当负载1mmol/L的MB时，释药率为7.4％，当负载2mmol/L的MB时，释药率提高至8.4％，而当负载5mmol/L的MB时，释药率并没有进一步提高，而是降低为7.0％，这可能是当释放液中的MB浓度达到一定值时，会导致纳米颗粒孔道内外的浓度差降低，使得推动MB释放的推动力减小，从而出现释药率与负载量不成正比的现象。但这并不影响我们在杀死癌细胞方面的实际应用，由图9可知，释放液中的MB浓度可根据载药量来调控且浓度已经足够高，这表示本发明提供的纳米载药颗粒向肿瘤组织输送药物时，可根据不同肿瘤组织的需要来选择不同的载药量，从而实现最佳疗效。此外，以上结果表明，本发明提供的纳米载药颗粒对孔道的封堵能力不因药物负载量的增加而减弱，始终保持着良好的封堵能力，且该纳米载药颗粒对不同浓度的药物均有良好的释放能力。
实施例5
本实施例中，药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，步骤如下：
(1)制备介孔硅纳米颗粒
将CTAB溶解于去离子水形成浓度为2.5mg/mL的CTAB水溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节CTAB水溶液的pH值至11.5，在搅拌下采用油浴加热至70℃，待温度温度后，按照TEOS与CTAB水溶液的体积比为1.1:100的比例滴加硅酸四乙酯(TEOS)，在搅拌条件下于70℃反应3h，停止加热，冷却至室温，以10000r/min的转速离心10min，收集颗粒，用去离子水和无水乙醇分别洗3遍，得到的白色颗粒即为MCM-41型介孔硅纳米颗粒，记作MCM-41。
(2)制备巯基修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-SH)
将MCM-41加入无水乙醇中，充分超声分散得到分散液A，分散液A中，MCM-41的浓度为8mg/mL，在氮气保护下向分散液A中滴加巯丙基三甲氧基硅烷，在80℃回流反应14h，然后冷却至室温，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，分别用去离子水和乙醇洗涤2次，得到未脱模板剂(CTAB)的巯基修饰的介孔硅纳米颗粒。巯丙基三甲氧基硅烷的滴加总量与MCM-41的质量比为1.92:1。
对未脱模板剂的巯基修饰的介孔硅纳米颗粒进行脱模板：将未脱模板剂的巯基修饰的介孔硅纳米颗粒分散在浓盐酸-无水乙醇混合液中，浓盐酸-无水乙醇混合液中浓盐酸与无水乙醇的体积比为2:8，加热回流1h，然后冷却至室温，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用乙醇洗涤2次，将洗涤后的颗粒分散在40g/L的硝酸铵乙醇溶液中，在搅拌下加热回流1h以除去CTAB，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，分别用去离子水和乙醇洗涤2次，得到MCM41-SH。
(3)制备二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-S-S-pridine)
将2,2'-二硫二吡啶溶解于无水乙醇中形成浓度为30mg/mL的2,2'-二硫二吡啶溶液，将MCM41-SH分散于无水乙醇中形成分散液B，分散液B中MCM41-SH的浓度为8mg/mL，将2,2'-二硫二吡啶溶液与分散液B混合，搅拌反应12h，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用乙醇洗涤3次，即得MCM41-S-S-pridine；2,2'-二硫二吡啶与巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为1.1:1。
(4)制备氨基酸修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-S-S-NAC)
首先用NaOH溶液调节pH＝7.4、浓度为100mmol/L的PBS缓冲液至pH＝8.00～8.07，将N-乙酰基-L-半胱氨酸溶解于pH＝8.00～8.07的PBS缓冲液中使N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度为25mg/mL，将用pH＝8.00～8.07的PBS缓冲液冲洗3遍后的MCM41-S-S-pridine加入N-乙酰基-L-半胱氨酸中，搅拌反应10h，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用去离子水洗涤3次，即得MCM41-S-S-NAC。N-乙酰基-L-半胱氨酸与MCM41-S-S-pridine的质量比为2.5:1。
(5)制备短肽修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-S-S-NAC-Trp)
将Trp分散于pH＝6.0、浓度为50mmol/L的MES缓冲液中使Trp的浓度为30mg/mL，然后加入二甲基亚砜至Trp恰好溶解，然后加入EDC.HCl和SULFO-NHS，搅拌反应40min，再加入用pH值为7.4的PBS缓冲液洗3遍后的MCM41-S-S-NAC，搅拌反应14h，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用去离子水洗涤3次，即得MCM41-S-S-NAC-Trp。
Trp、EDC.HCl、SULFO-NHS以及MCM41-S-S-NAC的质量比为1.5:1.5:0.75:1。
步骤(2)～(5)的合成路线如图1所示。MCM41-S-S-NAC-Trp中，短肽通过谷胱甘肽响应型功能基团接枝在介孔硅纳米颗粒表面，连接了短肽的谷胱甘肽响应型功能基团的结构式如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)所示基团中与Si相连的O与MCM-41型介孔硅纳米颗粒上的Si相连形成Si—O键。
Figure GDA0003084128270000171
(6)负载药物
配制浓度为1×10-3mol/L的阿霉素(DOX)水溶液，取DOX水溶液750μL与10mgMCM41-S-S-NAC-Trp，加入2mL离心管中并混合均匀，然后置于50℃水浴中加热4h，然后在室温静置过夜，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用去离子水洗涤4次，除去未进入到纳米颗粒孔道内以及与短肽结合不稳定的DOX，即得负载DOX的GSH响应型介孔硅纳米颗粒，记作DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp。
实施例6
本实施例中，对实施例5中制备的MCM41-S-S-NAC-Trp和DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp进行体外细胞毒性评价。
(1)以每孔5000-6000个细胞的量，将小鼠成纤维细胞L929接种到96孔板中，每孔培养液体积200μL，培养24h以使细胞附着，然后加入不同浓度(0.0,6.25,12.5,25.0,50.0,100.0和200.0μg/mL)的MCM41-S-S-NAC-Trp，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。培养结束后，除去含有MCM41-S-S-NAC-Trp的培养基，并加入MTT溶液(20μL，在培养基中稀释至终浓度为5mg/mL)。于37℃在黑暗中孵育4h，向每个孔中加入100μL酸化异丙醇，并用酶标仪在570nm波长处检测吸光度。设三组复孔，以加入0.0μg/mL的MCM41-S-S-NAC-Trp的实验组作为对照组，以其他实验组作为测试组，按照下式计算细胞活性：
细胞活性(％)＝[A]测试/[A]对照×100％
(2)以每孔5000-6000个细胞的量，将宫颈癌细胞(cervical carcinoma cells，HeLa细胞)接种到96孔板中，每孔培养液体积200μL，培养24h以使细胞附着，然后分别加入不同浓度(0.0,1.25,2.5,5.0,10,25.0,50.0,100.0和200.0μg/mL)的MCM41-S-S-NAC-Trp和DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。培养结束后，除去含有MCM41-S-S-NAC-Trp和DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp的培养基，并加入MTT溶液(20μL，在培养基中稀释至终浓度为5mg/mL)。于37℃在黑暗中孵育4h，向每个孔中加入100μL酸化异丙醇，并用酶标仪在570nm波长处检测吸光度。设三组复孔，以加入0.0μg/mL的MCM41-S-S-NAC-Trp和DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp的实验组作为对照组，以其他实验组作为测试组，计算细胞活性。
结果如图10所示，不同浓度的MCM41-S-S-NAC-Trp与小鼠成纤维细胞L929培养48h后，在测试浓度范围为6.25～200μg/mL内，MCM41-S-S-NAC-Trp对正常细胞L929细胞无明显毒性。不同浓度的MCM41-S-S-NAC-Trp与HeLa细胞培养48h后，在测试浓度范围1.25～200μg/mL内，MCM41-S-S-NAC-Trp对HeLa细胞无明显毒性。说明本发明提供的短肽修饰的介孔硅纳米颗粒具有良好的生物相容性。对DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp而言，随着浓度的增大，细胞存活率不断下降，当浓度达到200μg/mL时，HeLa细胞的存活率仅为12％，说明DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp能够在Hela细胞环境中释放出DOX，对HeLa细胞具有有效的杀死效果。
实施例7
本实施例中，考察HeLa细胞对实施例5制备的DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp的吞噬情况。
使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进行活HeLa细胞成像，首先将HeLa细胞接种于35mm共聚焦培养皿中，补加20％胎牛血清(FBS)，在37℃下、5％CO2的潮湿条件下培养24h，然后在新鲜培养基中用DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp处理，在处理3，12和24h后，将HeLa细胞用Hoechst 33342染色10min。之后，用PBS洗涤培养皿三次除去多余的染料，然后在CLSM下成像。选择488nm激光来激发DOX，405nm激光用于激发Hoechst 33342。结果如图11所示。
由图11a1～a5可知，当DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp与HeLa细胞培养3h后，就能很明显的观察到细胞质内DOX发出的荧光，说明Hela细胞对DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp有良好的吞噬作用，且DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp负载的DOX能在细胞内释放出来。由图11b1～b5、c1～c5可知，随着培养时间的增加，细胞质内的DOX荧光强度越来越高，说明细胞内的DOX含量越来越高。以上结果表明，DOX@MCM41-S-S-NAC-Trp能够很快地被HeLa细胞吞噬到细胞内，并在细胞内释放出孔道内负载的DOX，具有良好的控释效果。
实施例8
本实施例中，制备药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，步骤如下：
(1)制备介孔硅纳米颗粒
将CTAB溶解于去离子水形成浓度为2.2mg/mL的CTAB水溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节CTAB水溶液的pH值至11.2，在搅拌下采用油浴加热至80℃，待温度温度后，按照TEOS与CTAB水溶液的体积比为1:100的比例滴加硅酸四乙酯(TEOS)，在搅拌条件下于80℃反应2h，停止加热，冷却至室温，以10000r/min的转速离心10min，收集颗粒，用去离子水和无水乙醇分别洗3遍，得到的白色颗粒即为MCM-41型介孔硅纳米颗粒，记作MCM-41。
(2)制备巯基修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-SH)
将MCM-41加入无水乙醇中，充分超声分散得到分散液A，分散液A中，MCM-41的浓度为7mg/mL，在氮气保护下向分散液A中滴加巯丙基三甲氧基硅烷，在80℃回流反应12h，然后冷却至室温，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，分别用去离子水和乙醇洗涤2次，得到未脱模板剂(CTAB)的巯基修饰的介孔硅纳米颗粒。巯丙基三甲氧基硅烷的滴加总量与MCM-41的质量比为0.9:1。
对未脱模板剂的巯基修饰的介孔硅纳米颗粒进行脱模板：将未脱模板剂的巯基修饰的介孔硅纳米颗粒分散在浓盐酸-无水乙醇混合液中，浓盐酸-无水乙醇混合液中浓盐酸与无水乙醇的体积比为1:9，加热回流1h，然后冷却至室温，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用乙醇洗涤2次，将洗涤后的颗粒分散在30g/L的硝酸铵乙醇溶液中，在搅拌下加热回流1h以除去CTAB，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，分别用去离子水和乙醇洗涤2次，得到MCM41-SH。
(3)制备二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-S-S-pridine)
将2,2'-二硫二吡啶溶解于无水乙醇中形成浓度为50mg/mL的2,2'-二硫二吡啶溶液，将MCM41-SH分散于无水乙醇中形成分散液B，分散液B中MCM41-SH的浓度为13.3mg/mL，将2,2'-二硫二吡啶溶液与分散液B混合，搅拌反应14h，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用乙醇洗涤3次，即得MCM41-S-S-pridine；2,2'-二硫二吡啶与巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为1:1.2。
(4)制备氨基酸修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-S-S-NAC)
首先用NaOH溶液调节pH＝7.4、浓度为100mmol/L的PBS缓冲液至pH＝8.00～8.07，将N-乙酰基-L-半胱氨酸溶解于pH＝8.00～8.07的PBS缓冲液中使N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度为30mg/mL，将用pH＝8.00～8.07的PBS缓冲液冲洗3遍后的MCM41-S-S-pridine加入N-乙酰基-L-半胱氨酸中，搅拌反应14h，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用去离子水洗涤3次，即得MCM41-S-S-NAC。N-乙酰基-L-半胱氨酸与MCM41-S-S-pridine的质量比为3:1。
(5)制备短肽修饰的介孔硅纳米颗粒(MCM41-S-S-NAC-Trp)
将Trp分散于pH＝6.0、浓度为100mmol/L的MES缓冲液中使Trp的浓度为25mg/mL，然后加入二甲基亚砜至Trp恰好溶解，然后加入EDC.HCl和SULFO-NHS，搅拌反应20min，再加入用pH值为7.4的PBS缓冲液洗3遍后的MCM41-S-S-NAC，搅拌反应10h，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用去离子水洗涤3次，即得MCM41-S-S-NAC-Trp。
Trp、EDC.HCl、SULFO-NHS以及MCM41-S-S-NAC的质量比为1.2:1:0.6:1。
步骤(2)～(5)的合成路线如图1所示。MCM41-S-S-NAC-Trp中，短肽通过谷胱甘肽响应型功能基团接枝在介孔硅纳米颗粒表面，连接了短肽的谷胱甘肽响应型功能基团的结构式如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)所示基团中与Si相连的O与MCM-41型介孔硅纳米颗粒上的Si相连形成Si—O键。
Figure GDA0003084128270000201
(6)负载药物
分别配制浓度为3mmol/L的柔红霉素、吡柔比星、表柔比星和丝裂霉素C水溶液，分别将MCM41-S-S-NAC-Trp加入上述四种药物溶液中，装入离心管中并混合均匀，然后置于60℃水浴中加热4h，然后在室温静置过夜，以10000r/min的转速离心15min，收集颗粒，用去离子水洗涤4次，除去未进入到纳米颗粒孔道内以及与短肽结合不稳定的药物分子，即得负载上述药物分子的GSH响应型介孔硅纳米颗粒，分别为柔红霉素@MCM41-S-S-NAC-Trp，吡柔比星@MCM41-S-S-NAC-Trp，表柔比星@MCM41-S-S-NAC-Trp和丝裂霉素C@MCM41-S-S-NAC-Trp。

Claims (10)

1.药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，其特征在于，该纳米载药颗粒由表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒和药物分子组成，所述药物分子为荷正电且含有苯环结构的疏水药物分子，所述表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒中，短肽通过谷胱甘肽响应型功能基团接枝在介孔硅纳米颗粒表面，短肽为荷负电且具有疏水性的短肽，连接了短肽的谷胱甘肽响应型功能基团的结构式如式(Ⅰ)所示，
Figure FDA0001681529160000011
部分药物分子位于表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒的孔道中，部分药物分子通过与短肽之间的疏水作用和静电作用结合形成封堵阀门，封堵阀门封堵住表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒的孔道结构的孔口；该纳米载药颗粒中的二硫键能被谷胱甘肽切断，二硫键被切断后，封堵阀门脱落，从而实现孔道中的药物分子的释放。
2.根据权利要求1所述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，其特征在于，表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒中，连接了短肽的谷胱甘肽响应型功能基团的含量为20wt.％～25wt.％。
3.根据权利要求1或2所述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，其特征在于，表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒的粒径为80～150nm。
4.根据权利要求1或2所述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，其特征在于，药物分子为阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星或者丝裂霉素C。
5.根据权利要求1或2所述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒，其特征在于，作为表面接枝了短肽的介孔硅纳米颗粒改性基础的介孔硅纳米颗粒为MCM-41型介孔硅纳米颗粒。
6.权利要求1至5中任一权利要求所述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)制备介孔硅纳米颗粒
调节十六烷基三甲基溴化铵水溶液的pH值至11.0～11.5，在搅拌下加热至70～80℃，滴加硅酸四乙酯，在70～80℃反应2～3h，将反应产物用水和乙醇洗涤，即得介孔硅纳米颗粒；
十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为2～2.5mg/mL，硅酸四乙酯与十六烷基三甲基溴化铵水溶液的体积比为(1～1.1):100；
(2)制备巯基修饰的介孔硅纳米颗粒
将介孔硅纳米颗粒分散于无水乙醇中形成分散液A，在氮气保护下向分散液A中滴加巯丙基三甲氧基硅烷，回流反应10～14h，将反应产物用水和乙醇洗涤，然后加入浓盐酸-无水乙醇混合液中加热回流1～2h，将反应产物用乙醇洗涤，再加入20～40g/L的硝酸铵乙醇溶液中，在搅拌下加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵，用水和乙醇洗涤后得到巯基修饰的介孔硅纳米颗粒；
巯丙基三甲氧基硅烷的滴加总量与介孔硅纳米颗粒的质量比为(0.58～1.92):1；
(3)制备二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒
将2,2'-二硫二吡啶溶解于无水乙醇中，将巯基修饰的介孔硅纳米颗粒分散于无水乙醇中形成分散液B，将2,2'-二硫二吡啶溶液与分散液B混合，搅拌反应10～14h，将反应产物用乙醇洗涤，即得二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒；
2,2'-二硫二吡啶与巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为(1～1.2):1；
(4)制备氨基酸修饰的介孔硅纳米颗粒
将N-乙酰基-L-半胱氨酸溶解于pH值为8.00～8.07的PBS缓冲液中，将用pH值为8.00～8.07的PBS缓冲液冲洗后的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒加入N-乙酰基-L-半胱氨酸中，搅拌反应10～14h，将反应产物用去离子水洗涤，即得N-乙酰基-L-半胱氨酸修饰的介孔硅纳米颗粒；
N-乙酰基-L-半胱氨酸与二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为(2.5～3):1；
(5)制备短肽修饰的介孔硅纳米颗粒
将D-色氨酸分散于MES缓冲液中，然后加入二甲基亚砜至D-色氨酸溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，搅拌反应20～40min，再加入用pH值为7.2～7.4的PBS缓冲液洗后的N-乙酰基-L-半胱氨酸修饰的介孔硅纳米颗粒，搅拌反应10～14h，将反应产物用水洗涤，即得短肽修饰的介孔硅纳米颗粒；
D-色氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐以及N-乙酰基-L-半胱氨酸修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为(1～1.5):(1～1.5):(0.5～0.75):1；
(6)负载药物
将短肽修饰的介孔硅纳米颗粒加入药物水溶液中，在50～60℃的水浴中加热2～4h以使药物分子进入短肽修饰的介孔硅纳米颗粒的孔道中，然后在室温静置10～14h，固液分离，洗涤除去未进入孔道中以及与短肽结合不稳定的药物分子，即得GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒。
7.根据权利要求6所述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，浓盐酸-无水乙醇混合液中浓盐酸与无水乙醇的体积比为(1～2):(8～9)，分散液A中介孔硅纳米颗粒的浓度为6～8mg/mL。
8.根据权利要求6或7所述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，2,2'-二硫二吡啶溶液的浓度为30～50mg/mL，分散液B中巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的浓度为8～15mg/mL。
9.根据权利要求6或7所述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中将N-乙酰基-L-半胱氨酸溶解于pH值为8.00～8.07的PBS缓冲液中使N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度为25～30mg/mL。
10.根据权利要求6或7所述药物分子与阀门分子联合作用的GSH响应型介孔硅纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(5)中将D-色氨酸分散在MES缓冲液中使D-色氨酸的浓度为20～30mg/mL。
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