CN114053434B - 基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒及其制备方法 - Google Patents

基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒及其制备方法，所述载药颗粒由表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒和药物分子组成，表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒中，阀门分子通过含二硫键的基团接枝在介孔硅纳米颗粒表面；部分药物分子位于表面接枝了阀门分子的介孔硅纳米颗粒的孔道中，部分药物分子与阀门分子通过疏水作用和静电作用结合形成封堵阀门，封堵阀门封堵住表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒的孔道结构的孔口；该载药颗粒中的二硫键能被谷胱甘肽切断，二硫键被切断后，封堵阀门脱落，实现孔道结构中负载的药物分子的释放，从孔道结构中释放的药物分子与封堵阀门脱落形成的2‑硝基‑5‑巯基硫苯甲酸起到协同抗肿瘤作用。

Description

基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于药物载体材料领域，涉及基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒及其制备方法。
背景技术
癌症仍然是人类面临的最大的健康问题，目前最常用的治疗手段为化疗。在传统的化疗过程中，由于化疗药物没有特异性，会对人体产生很大的副作用，因此，寻找靶向性的给药系统一直是本领域的研究热点。随着给药系统的快速发展，许多新型的药物递送系统已经被开发出来，例如，有将聚合物、脂质体、碳基材料、以及介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)等作为药物载体的报道。其中，单分散二氧化硅因具有良好的生物相容性、较大的比表面积和可调节的尺寸而被认为是一种理想的药物载体候选材料。
介孔硅作为药物载体，一般将抗癌药物负载于介孔二氧化硅载体的内部孔道，为了防止药物提前释放，通常在孔口枝接一些生物大分子，例如脂质体、多肽、高分子聚合物等来封堵孔口。虽然这些生物大分子具有优秀的封堵性能，但是合成方法复杂，并且，由于接枝的大分子与药物分子之间相互作用，导致载药后大量药物分子粘附于介孔硅的外表面上，需要繁杂冗长的洗涤过程。同时，大分子聚合物在体内的生物安全性也备受质疑，许多高分子聚合物在体内降解后会导致局部pH过酸，因而设计具有优良生物相容性的小分子阀门是近年来的研究热门。
现有的小分子阀门的设计思路基本都是通过接枝分子之间的相互作用来实现封堵的，但由于小分子阀门的尺寸过小，通过阀门小分子自身很难将药物分子有效地封堵在介孔硅的孔道内。为了解决这一问题，有将抗癌药物分子接枝在小分子阀门上制备载药颗粒的报道，在载药颗粒到达病灶部位后，通过特定的促发作用使连接药物分子的小分子阀门脱落而实现对癌细胞的毒杀作用，但脱落的小分子并不产生抗癌活性。若能对现有的小分子阀门介孔硅载药颗粒进行改进，利用小分子阀门完成对孔道的封堵，在载药颗粒到达病灶部位后通过小分子阀门脱落释放药物，并利用脱落的小分子阀门和释放的抗癌药物实现协同抗癌作用，这对于提高载药颗粒的抗癌效果将产生积极的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒及其制备方法，以在小分子阀门和药物分子对载体孔道结构的联合封堵的基础上，利用脱落的小分子阀门与释放的药物分子在病灶部位起到协同抗癌作用，提高载药颗粒的抗肿瘤效果。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，该载药颗粒由表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒和药物分子组成，所述药物分子为荷正电且含有苯环结构的亲水性抗肿瘤药物分子，所述表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒中，阀门分子为2-硝基苯甲酸，阀门分子通过含二硫键的基团接枝在介孔硅纳米颗粒表面，接枝阀门分子的含二硫键的基团的结构如式(Ⅰ)所示，
Figure BDA0003341468810000021
部分药物分子位于表面接枝了阀门分子的介孔硅纳米颗粒的孔道中，部分药物分子与阀门分子通过疏水作用和静电作用结合形成封堵阀门，封堵阀门封堵住表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒的孔道结构的孔口；该载药颗粒中的二硫键能被谷胱甘肽切断，二硫键被切断后，封堵阀门脱落，实现孔道结构中负载的药物分子的释放，从孔道结构中释放的药物分子与封堵阀门脱落形成的2-硝基-5-巯基硫苯甲酸起到协同抗肿瘤作用。
上述载药颗粒的技术方案中，表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒的粒径优选为105～120nm。
上述载药颗粒的技术方案中，表面接枝封堵阀门的介孔硅纳米颗粒中，结构如式(Ⅰ)所示的连接了阀门分子的含二硫键的基团的含量优选为13wt.％～15wt.％。
上述载药颗粒的技术方案中，载药颗粒所负载的药物分子在满足荷正电且含有苯环结构的亲水性抗肿瘤药物分子这一前提条件下，具体的药物分子及其负载量可根据实际应用需求进行确定，通常，载药颗粒的载药量至少为9％，常见的药物分子可以是阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星或者丝裂霉素C。
上述载药颗粒的技术方案中，作为表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒改性基础的介孔硅纳米颗粒可以是MCM41型介孔硅纳米颗粒。
本发明还提供了上述基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备巯基修饰的介孔硅纳米颗粒
将介孔硅纳米颗粒分散于无水乙醇中形成分散液A，在氮气保护下向分散液A中滴加3-巯丙基三甲氧基硅烷，加热回流10～14h，分离出反应产物并用水和乙醇洗涤，然后加入酸性乙醇溶液中，加热回流1～2h，将反应产物用乙醇洗涤后加入硝酸铵的乙醇溶液中，加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵，用水和乙醇洗涤后得到巯基修饰的介孔硅纳米颗粒；
3-巯丙基三甲氧基硅烷的滴加总量与介孔硅纳米颗粒的质量比为(0.6～1.9):1，硝酸铵的乙醇溶液浓度为20～40g/L；
(2)制备表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒
将5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶于无水乙醇，将巯基修饰的介孔硅纳米颗粒分散于乙醇中形成分散液B，将5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液与分散液B混合并搅拌反应10～14h，将反应产物用水和乙醇洗涤，即得表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒；
5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)与巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为(0.8～1.2):1；
(3)负载药物
将表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒加入药物溶液中，在避光条件下于50～60℃反应2～4h，再于常温搅拌20～25h，固液分离，洗涤除去未进入孔道中以及与2-硝基苯甲酸结合不稳定的药物分子，即得载药颗粒。
上述制备方法的技术方案的步骤(1)中，酸性乙醇溶液为浓盐酸-乙醇混合液，浓盐酸-乙醇混合液中浓盐酸与无水乙醇的体积比为(1～2):(8～9)，分散液A中介孔硅纳米颗粒的浓度为3～6mg/mL。所述浓盐酸为市售浓盐酸，其浓度为36％～38％。
上述制备方法的技术方案的步骤(2)中，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液的浓度为30～50mg/mL，分散液B中巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的浓度为10～15mg/mL。
上述制备方法的技术方案的步骤(3)中，药物溶液的浓度根据药物负载量、药物溶解性等进行确定，通常，药物溶液是指药物的水溶液，药物溶液中药物的浓度可为2～10mg/mL。
上述制备方法的技术方案中，所述介孔硅纳米颗粒可参照现有技术制备，一种可行的制备方法如下：
调节十六烷基三甲基溴化铵水溶液的pH值至11.0～11.5，在搅拌下加热至70～80℃，滴加原硅酸四乙酯，在70～80℃反应2～3h，将反应产物用水和乙醇洗涤，即得介孔硅纳米颗粒；十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为2～3mg/mL，原硅酸四乙酯与十六烷基三甲基溴化铵水溶液的体积比为(1～1.2):100。
本发明的技术方案是基于以下原理设计的：
本发明借助药物分子的苯环与接枝阀门分子的含二硫键的基团中阀门分子末端的苯环以疏水作用力结合在一起，使孔道口周围的阀门分子桥接在一起，荷负电的阀门分子与带正电的药物分子通过静电作用进一步增强结合力，形成更为严密的封堵，实现药物分子在孔道内的封堵。药物分子的释放则是通过二硫键响应谷胱甘肽来实现，谷胱甘肽切断二硫键后，封堵阀门脱落，释放出负载于孔道结构中的药物，并且脱落形成的2-硝基-5-巯基苯甲酸与释放的药物分子可起到协同抗癌作用的效果。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，将阀门分子2-硝基苯甲酸枝接在介孔硅纳米颗粒表面，以接枝阀门分子的含二硫键的基团作为支撑物，通过药物分子与接枝阀门分子的含二硫键的基团的相互作用架桥，将原本无法封堵孔道的阀门分子连接起来形成封堵阀门，实现对孔道的封堵。硝基苯甲酸是许多抗癌药物生成的中间体，具有良好的生物相容性，这一方面可避免现有技术以高分子聚合物作为封堵分子降解引起的局部过酸和二次伤害等问题，另一方面，载药颗粒响应谷胱甘肽后形成的2-硝基-5-巯基硫苯甲酸具有抗癌作用，可与载药颗粒释放的抗癌药物一起起到协同抗癌作用，改善载药颗粒的抗癌效果。
2.本发明通过体外控释实验证实，本发明提供的基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，在不含谷胱甘肽的条件下，所负载的药物无明显释放，而在谷胱甘肽触发下，载药颗粒可在短时间内释放大量药物，达到良好的药物控制释放作用，封堵阀门具有优异的封堵性能和谷胱甘肽响应性能。
3.本发明通过细胞毒性实验证实，在未载药时，表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒对L929细胞(正常细胞)无细胞毒性，具有良好的生物相容性，而对Hela细胞(癌细胞)增殖有明显的抑制作用，说明阀门分子的引入赋予了介孔硅纳米颗粒抗癌性能；载药后的表面接枝了2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒对Hela细胞的抑制作用更加明显，说明载药颗粒在响应谷胱甘肽后封堵阀门脱落形成的2-硝基-5-巯基硫苯甲酸可与载药颗粒释放出的药物分子起到协同抗癌作用。
4.本发明还提供了基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，该方法的工艺过程简单，可控性好，易于产业化生产，有利于推广应用。
附图说明
图1是表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒的合成路线图，图中，SilicaWall表示介孔硅纳米颗粒的表面。
图2是实施例1制备的MSN和MSN-SS-MNBA的透射电镜图和扫描电镜图，其中，a、b图分别为MSN和MSN-SS-MNBA的透射电镜图；c、d图分别为MSN和MSN-SS-MNBA的透射电镜图。
图3是实施例1制备的MSN、MSN-SH及MSN-SS-MNBA的红外光谱图，图中的曲线(a)(b)(c)分别代表MSN、MSN-SH及MSN-SS-MNBA。
图4是实施例1制备的MSN-SH及MSN-SS-MNBA的拉曼光谱图，图中的曲线(a)(b)分别代表MSN-SS-MNBA及MSN-SH。
图5是实施例1制备的MSN和MSN-SH的XPS光谱图，图中的曲线(a)(b)分别代表MSN-SH及MSN。
图6是实施例1制备的MSN-SH和MSN-SS-MNBA的接触角测试结果，其中的a、b两图代表MSN-SH，c、d两图代表MSN-SS-MNBA。
图7是实施例1制备的MSN、MSN-SH及MSN-SS-MNBA的Zeta电位值变化图(a图)和平均粒径图(b图)。
图8是实施例1制备的MSN和MSN-SS-MNBA的低温氮气吸附-脱附等温曲线以及BJH孔径分布图，其中，a图为MSN和MSN-SS-MNBA的低温氮气吸附-脱附等温曲线；b图为纳米颗粒的BJH孔径分布图。
图9是阿霉素的标准曲线。
图10是实施例3中DOX@MSN-SS-MNBA在不同GSH浓度触发下的释放曲线，其中方块、圆点、三角形标识的曲线分别表示GSH浓度为0、2和5mmol/L。
图11是实施例4中细胞存活率测定结果对比图，其中，a图表示L929细胞与不同浓度的MSN-SS-MNBA孵育48h的细胞存活率；b图表示Hela细胞与不同浓度的MSN-SS-MNBA、DOX@MSN-SS-MNBA和DOX孵育48h的细胞存活率，图中，每一组条状图中，从左至右依次代表MSN-SS-MNBA、DOX@MSN-SS-MNBA和DOX。
图12是实施例5中Hela细胞与DOX@MSN-SS-MNBA共培养0h和6h的荧光显微镜图像，从左到右依次是明场图像、DAPI通道、DOX通道和叠加通道(标尺为50um)。
图13是实施例6中DTNB对DOX的荧光淬灭Stern-Volmer曲线。
图14是实施例6中不同温度下DTNB淬灭DOX的双对数曲线。
图15是实施例6中MSN-SS-MNBA和SN-SS-MNBA载药前后zeta电位的变化图。
图16是实施例7中的热重分析图，其中，a图为MSN-SS-MNBA和DOX@MSN-SS-MNBA的热重分析图；b图为SN-SS-MNBA和DOX@SN-SS-MNBA的热重分析；两图中，上方的曲线均是未载药的情况，下方的曲线均为载药的情况。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒及其制备方法作进一步说明，以下描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的发明内容，本领域普通技术人员在未做出创造性劳动的前提下所得到的所有实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下述各实施例和对比例中采用的化学试剂的信息如表1所示，采用的仪器和设备信息如表2所示。
表1化学试剂信息
Figure BDA0003341468810000061
表2仪器和设备信息
Figure BDA0003341468810000062
实施例1
本实施例中，制备基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒的合成路线如图1所示，步骤如下：
(1)制备介孔硅纳米颗粒(MSN)
采用模板法合成MSN。将250mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和120mL水加入烧瓶形成CTAB水溶液，向烧瓶中加入2mol/L的NaOH溶液调节CTAB水溶液的pH值至11，超声30min使溶液澄清，将烧瓶转入油浴内加热至80℃，按照原硅酸四乙酯(TEOS)与CTAB水溶液的体积比为1:100的比例逐滴加入TEOS，在80℃回流反应2h，离心、收集颗粒，用纯水和乙醇分别洗涤3次，得到的白色颗粒即为MSN。
(2)制备巯基修饰的介孔硅纳米颗粒(MSN-SH)
将MSN分散在无水乙醇中形成分散液A，分散液A中MSN的浓度为6mg/mL，在氮气气氛下向分散液A中加入3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)，在80℃回流反应12h，反应期间持续通入氮气，反应结束后，将所得反应液冷却至室温，离心、收集颗粒，用纯水和乙醇分别洗涤3次；3-巯丙基三甲氧基硅烷的滴加总量与介孔硅纳米颗粒的质量比为0.6:1。
将所得颗粒分散于酸性乙醇溶液中，酸性乙醇溶液为浓盐酸-乙醇混合液，浓盐酸-乙醇混合液中浓盐酸(浓度37％)与无水乙醇的体积比为1:9，在80℃回流反应1h，离心、收集颗粒，用水和乙醇分别洗涤3次，将收集的颗粒分散于20g/L硝酸铵乙醇溶液中，在80℃回流反应1h，离心、收集颗粒，用纯水和乙醇分别洗涤3次，得到MSN-SH。
(3)制备表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒(MSN-SS-MNBA)
将5,5-二硫代双(2-硝基甲苯)(DTNB)溶于无水乙醇中形成浓度为40mg/mL的DTNB溶液，将MSN-SH分散于乙醇中形成的分散液B，将DTNB溶液与分散液B加入圆底烧瓶，室温搅拌反应12h，离心、收集颗粒，用纯水和乙醇分别洗涤3次，即得通过二硫键将2-硝基苯甲酸枝接在介孔硅纳米颗粒表面的MSN-SS-MNBA。
(4)负载药物
将10mgMSN-SS-MNBA加入0.8mL浓度为2mg/mL阿霉素溶液中，避光条件下于50℃加热2h，然后置于搅拌器中在常温震荡搅拌24h，固液分离、收集颗粒，用纯水洗涤除去未进入孔道及与2-硝基苯甲酸结合不稳定的药物分子，即得基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，命名为DOX@MSN-SS-MNBA。
对比例1
本对比例中，制备基于无孔二氧化硅纳米颗粒的载药颗粒，步骤如下：
(1)制备无孔硅纳米颗粒(SN)
采用
Figure BDA0003341468810000071
合成法合成SN。将100mL无水乙醇、8mL氨水、4mLTEOS加入烧瓶中，在室温反应24h，离心、收集颗粒，用纯水和乙醇分别洗涤3次，即得SN。
(2)制备巯基修饰的无孔硅纳米颗粒(SN-SH)
操作与实施例1的步骤(2)基本相同，不同之处仅在于以SN替代MSN，得到SN-SH。
(3)制备表面接枝2-硝基苯甲酸的无孔硅纳米颗粒(SN-SS-MNBA)
操作与实施例1的步骤(3)基本相同，不同之处仅在于以SN-SH替代MSN-SH，得到SN-SS-MNBA。
(4)负载药物
操作与实施例1的步骤(4)基本相同，不同之处仅在于以SN-SS-MNBA替代MSN-SS-MNBA，将得到的载药颗粒命名为DOX@SN-SS-MNBA。
实施例2
本实施例中，对实施例1中各步骤制备的产物进行性能测试。
1.测试手段及条件
透射电子显微镜(TEM)用来观察颗粒的孔道特征。制样方法：将样品溶于无水乙醇，滴于铜网上面，等铜网完全干燥后放入仪器中观察。
扫描电子显微镜(SEM)用来观察颗粒的表面性质。制样方法：将样品分散在无水乙醇中配制成1mg/mL的溶液，滴在硅片上，待硅片完全干燥后放入仪器中观察。
傅立叶红外光谱(FT-IR)的扫描范围为4000cm-1～500cm-1。制样方法：取1mg干燥后的样品与100mgKBr混合研磨，使用压片机压片，放入仪器测试。
Zeta电位和动态光散射(DLS)用来分析颗粒的表面电荷大小以及颗粒粒径。将样品分散于纯水中，超声30min，配制成浓度为0.1mg/mL的溶液，测试温度25℃。
X射线光电子能谱(XPS)用于检测样品表面元素组成，用单色Al KαX射线(hν＝1486.6eV)在120W的XSAM800光谱仪上进行检测。
激光拉曼光谱的测试范围为500cm-1～3000cm-1，测试步长为1cm-1。
氮气吸附脱附分析(BET)：将样品真空干燥后采用BET和BJH模型，计算比表面积、孔容积的大小及孔径大小、分布。
热重损失分析(TGA)的测试温度范围为25～800℃，升温速率为10℃/min。
2.形貌分析
通过TEM和SEM对观察MSN和MSN-SS-MNBA的形貌，结果如图2所示，其中的a、b两图分别为MSN和MSN-SS-MNBA的TEM图，c、d两图分别为MSN和MSN-SS-MNBA的SEM图。由图2可知，MSN呈大小均匀的类球形或椭球形，分散性良好，孔道贯通，经统计，MSN的平均粒径为107±3nm；MSN-SS-MNBA同样呈类球形，孔道清晰，说明MSN经过修饰，其主体结构依然保存完好，经统计，MSN-SS-MNBA的平均粒径为114±5nm。
3.修饰基团的结构鉴定
为证实每一步的反应是否成功，对步骤(1)～(3)制得的MSN、MSN-SH和MSN-SS-MNBA分别进行FT-IR分析，结果如图3所示，图3中的曲线(a)(b)(c)依次为MSN、MSN-SH及MSN-SS-MNBA的红外光谱图。由图3可知，未经修饰的MSN在3436cm-1处存在一个较宽的吸收峰，这是硅羟基(Si-OH)的吸收峰，在1081cm-1处存在的峰是硅氧四面体(Si-O)的反对称伸缩振动峰。MSN-SH主要由巯基和侧链上的亚甲基确定，相对于MSN，枝接巯基后，谱图上新增了2933cm-1和1480cm-1两个新谱带，分别是C-H的不对称弯曲振动峰和C-H的伸缩振动峰，说明巯基成功枝接在了MSN表面。在与DTNB反应后，红外光谱上增加了1458cm-1这个新的峰，这是由于苯环的引入而增加的碳碳双键的骨架震动峰，说明了2-硝基苯甲酸成功枝接。
由于巯基和二硫键在红外光谱上信号非常弱，因此进一步对MSN-SH和MSN-SS-MNBA进行了拉曼光谱测试，结果如图4所示，其中的曲线(a)(b)分别是MSN-SH及MSN-SS-MNBA的拉曼光谱图。由图4可知，MSN-SH在2580cm-1有非常明显的峰，这是巯基的特征峰，说明巯基被成功的修饰在了MSN表面。在枝接DTNB后，在509cm-1增加了明显的峰值，这是二硫键的特征峰，这是由于巯基发生硫醇-二硫化物交换反应后，巯基被二硫键取代，因此巯基的峰消失，二硫键的峰出现，说明2-硝基苯甲酸接枝成功。
采用XPS对MSN和MSN-SH进行分析，结果如图5所示，其中的曲线(a)(b)分别是MSN和MSN-SH的XPS光谱。由图5可知，MSN只含有O1s(532.5eV)，C 1s(284.6eV)，Si 2s(153.7eV)和Si 2p(103.3eV)元素的峰值，在接枝巯基后，谱图中增加了S 2s(227.3eV)和S2p(164.5eV)的峰值，且C1s的峰强度明显升高，这是由于接枝巯基时亚甲基的引入使得C元素的含量增加，说明了巯基成功接枝在了MSN表面。
将MSN-SH和MSN-SS-MNBA干燥、压片后进行接触角测试，结果见图6，其中的a、b两图表示MSN-SH的接触角表面，c、d两图表示MSN-SS-MNBA的接触角表面。MSN-SH的接触角为32.3°，MSN-SS-MNBA的接触角增大至42.4°，这是由于接枝MNBA后苯环的引入，增加了MSN-SH的疏水性，使得其表面的疏水作用力增强。二者的接触角都小于90°，说明二者都具有良好的亲水性，这有利于为MSN-SS-MNBA在生物体内的应用提供良好的流动性。
4.Zeta电位与粒径分析
纳米颗粒经不同的基团修饰后，表面的电位会发生改变，因此通过Zeta电位的变化可检测修饰过程是否成功。对MSN、MSN-SH以及MSN-SS-MNBA进行Zeta电位测试，结果如图7及表3所示。
表3不同基团修饰后的样品Zeta电位值
Figure BDA0003341468810000101
MSN表面富含大量硅羟基(Si-OH)，其在水溶液中Zeta电位值为-17.3mV。而MSN-SH的电负性进一步增强，导致Zeta电位值增加至-23.4mV，在与DTNB反应后，在颗粒表面引入了羧基，羧基带负电荷，因此MSN-SS-MNBA的zeta电位值增大至-27.8mV。
利用DLS测定MSN、MSN-SH以及MSN-SS-MNBA分散在纯水中之后的粒径分布，结果如图7及表4所示。MSN的平均粒径为262±5nm，这与采用TEM测试的结果有较大差距，主要原因是TEM测试的样品是处于干燥状态的，而DLS测试是在水溶液中进行的，样品表面会形成水化层，且在水溶液中颗粒之间难免会发生团聚。MSN-SH以及MSN-SS-MNBA的平均粒径分别为297±10nm和374±12nm。
表4不同基团修饰后的样品的平均粒径
Figure BDA0003341468810000102
5.介孔性质表征
通过氮气吸脱附对MSN和MSN-SS-MNBA的比表面积、孔容积、孔径大小分布情况进行测量，结果如图8及表5所示。图8中，a图为MSN和MSN-SS-MNBA的低温氮气吸附-脱附等温曲线，b图为MSN和MSN-SS-MNBA的BJH孔径分布。由图8可知，MSN的吸附曲线和脱附曲线符合国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)分类中的IV型，H1滞后环，是典型的MCM41型介孔材料。在相对压力P/P0为0.2～0.4时，可观察到样品的吸脱附曲线存在明显的滞后环，这是由于氮气吸附在介孔内部产生的毛细凝聚现象而产生的，表明颗粒存在均一的介孔结构。MSN的比表面积为1563.2m2/g，孔容和孔径分别为1.388cm3/g和2.84nm。MSN-SS-MNBA同样存在H1型滞后环，说明样品经修饰后仍然保有稳定的介孔结构。与MSN相比，MSN-SS-MNBA的比表面积，孔容积和孔径均有所下降，比表面积降为1288.9m2/g，这是由于接枝的小分子基团占据孔道，减小了部分孔道及孔容积。
表5MSN和MSN-SS-MNBA的比表面积，孔容和孔径值
Figure BDA0003341468810000103
Figure BDA0003341468810000111
实施例3
本实施例中，测试实施例1制备的DOX@MSN-SS-MNBA的药物体外释放行为。
(1)药物阿霉素标准曲线的绘制
配制不同浓度的阿霉素(DOX)水溶液，测试各溶液在481nm处的吸光度，绘制标准曲线，如图9所示，线性回归方程为y＝0.00816x+0.00753，线性相关系数为R2＝0.9985。
(2)载药量测试
取10mg实施例1制备的MSN-SS-MNBA加入0.8mL浓度为2mg/mL阿霉素溶液中，避光条件下于50℃加热2h，然后置于搅拌器中在常温震荡搅拌24h，固液分离、收集颗粒，用纯水洗涤除去未进入孔道及与2-硝基苯甲酸结合不稳定的药物分子。通过测定洗出液在481nm处的吸光度来计算溶液中的游离药物的量(记作游离量)，根据下式计算的载药量：
Figure BDA0003341468810000112
结果表明实施例1制备的DOX@MSN-SS-MNBA的载药量为9.8％，以同样的方法测试对比例1制备的DOX@SN-SS-MNBA的载药量，结果为0.5％。
(3)GSH响应释放性能研究
为了研究DOX@MSN-SS-MNBA对GSH的响应情况，测试了在不同浓度的GSH溶液(0，2和5mmol/L)中DOX@MSN-SS-MNBA的药物释放性能，释放曲线如图10所示，图10中的曲线，由下到上分别代表GSH浓度为0、2、5mmol/L的情况。在没有GSH的溶液中，阿霉素没有明显的释放，说明没有GSH的刺激，DOX@MSN-SS-MNBA的封堵阀门可以很好的把药物封堵在孔道内不泄露。当GSH浓度为2mmol/L时，DOX@MSN-SS-MNBA的药物在1h内快速释放，7h达到释放的最大值，释放率为13.5％；当GSH浓度增大至5mmol/L时，药物在1h内释放得的更快，7h累计释放量达到17.3％。这是由于GSH与二硫键作用导致二硫键断裂，使封堵阀门脱落而是否封堵于孔道内的药物。
以上实验结果表明，封堵阀门具有优良的封堵能力，在没有GSH刺激的条件下，几乎不释放药物，而在GSH触发下，DOX@MSN-SS-MNBA能在短时间内释放大量药物，达到良好的药物控制释放效果。
实施例4
本实施例中，测试实施例1制备的DOX@MSN-SS-MNBA、MSN-SS-MNBA以及MSN的体外细胞毒性。
选择小鼠成纤维细胞(L929 cells)和人宫颈癌细胞(Hela cells)来评估细胞毒性，通过MTT比色法按下式计算细胞活性：
Figure BDA0003341468810000121
L929细胞毒性实验方案：以每孔5000个细胞接种到96孔板，每个孔中的培养液体积为200μL，培养24h，以使细胞附着在孔板上，然后加入不同浓度(0.0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0和200.0μg/mL)的MSN-SS-MNBA，继续培养48h。培养结束后，除去含有MSN-SS-MNBA的培养基，加入MTT溶液。在37℃于黑暗中孵育4h后，向每个孔中加入100μL酸化异丙醇，用酶标仪在570nm波长处检测吸光度。设三组复孔，未处理的L929细胞用作对照样品。结果如图11的a图所示，与L929细胞共同孵育48h后，200μg/mL实验组的存活率为85％，说明MSN-SS-MNBA对于L929细胞毒性可忽略，具有良好的生物相容性，适合在药物控释系统中应用。
为了验证DOX@MSN-SS-MNBA对癌细胞的疗效，选用Hela细胞作为实验细胞进行测试。Hela细胞毒性实验方案：以每孔5000个细胞接种到96孔板，每个孔中的培养液体积为200μL，培养24h，以使细胞附着装置孔板上，然后分别加入不同浓度(0.0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0和200.0μg/mL)的MSN-SS-MNBA、DOX@MSN-SS-MNBA以及DOX，继续培养48h。培养结束后，除去含有MSN-SS-MNBA、DOX@MSN-SS-MNBA或DOX的培养基，并加入MTT溶液。测试过程与L929细胞一致。结果如图11的b图所示。
MSN-SS-MNBA的细胞毒性测试表明，MSN-SS-MNBA对Hela细胞有着明显的抑制增长作用，随着浓度的增加，Hela细胞的存活率逐渐降低，这与MSN-SS-MNBA在L929细胞中的实验结果有很大的差异性。当浓度为200μg/mL时，细胞的存活率仅为32％。说明MSN-SS-MNBA本身对Hela细胞具有细胞毒性。
DOX@MSN-SS-MNBA的细胞毒性测试表明，在相同浓度下，载药颗粒较未载药颗粒的Hela细胞的存活率进一步降低，如浓度为200μg/mL时，未载药颗粒细胞的存活率为32％，而载药颗粒的细胞存活率仅为11％。说明在Hela细胞基质环境中，可触发运载药物的释放，从而增加了细胞毒性。
上述实验结果说明，MSN-SS-MNBA在L929细胞实验组中没有细胞毒性，而在Hela细胞中表现出明显的细胞毒性。相对于L929细胞，Hela细胞中的GSH含量明显更高，高浓度的GSH切断MSN-SS-MNBA的二硫键后，封堵阀门脱落形成的2-硝基-5-巯基苯甲酸对癌细胞的增殖有明显的抑制作用。对于DOX@MSN-SS-MNBA实验组，Hela细胞的存活率进一步下降，这是由于二硫键被切断后，封堵阀门脱落，DOX从孔道中释放，从孔道中释放的DOX与封堵阀门脱落形成的2-硝基-5-巯基苯甲酸以及释放的DOX共同作用于Hela细胞，起到了协同抗癌的作用。
实施例5
本实施例中，使用荧光倒置显微镜观察DOX@MSN-SS-MNBA在Hela细胞中的细胞吞噬过程和药物释放行为。
将Hela细胞接种在35mm玻底培养皿中，培养24h，加入DOX@MSN-SS-MNBA，分别培养1h、6h，加入DAPI染料培养10min。用PBS缓冲液洗三次，用倒置荧光显微镜拍照。在488nm激光激发DOX，520nm至580nm的红色区域用来检测DOX，405nm激光激发DAPI(细胞核的染料DAPI最大激发是358nm)，425nm至475nm的蓝色区域用于检测DAPI。DOX@MSN-SS-MNBA与Hela细胞孵育不同时间的图像如图12所示。
在358nm处激发，细胞核呈现蓝色，DOX在488nm处激发，可观察到红色荧光。DOX@MSN-SS-MNBA刚与细胞混合(0h)时，DOX通道没有任何红色信号，而在6h时于DOX通道观察到了红色荧光，通过叠加通道可以观察到，红色荧光主要集中在细胞核内，细胞质中也能检测到DOX的红色荧光，说明DOX@MSN-SS-MNBA可以被Hela细胞摄取，并在细胞内释放DOX，作用于细胞核。
实施例6
本实施例中，研究实施例1制备的DOX@MSN-SS-MNBA中药物分子与阀门分子的相互作用。
为了分析DOX与阀门分子之间的相互作用力，测试了不同温度下DTNB对DOX的荧光淬灭。从机理上看，荧光淬灭主要分为动态淬灭和静态淬灭两类。对于纯动态或是纯静态荧光淬灭，作用机理均符合如下所示的Stern-Volmer方程：
F0/F＝1+Kqτ0[Q]＝1+KSV[Q]
式中：F和F0分别为加入和未加入DTNB时DOX的荧光强度，Kq为双分子淬灭过程速率常数；τ0为淬灭剂不存在时生物大分子内源性荧光寿命，约为10-8s；KSV为Stern-Volmer淬灭常数；[Q]为淬灭剂的浓度，在此处指代的是DTNB。通过Stern-Volmer方程绘制了288K和308K两个温度下的淬灭曲线，Kq，KSV和相关系数R1的值见表6和图13。
表6不同温度下DOX的淬灭常数
Figure BDA0003341468810000131
Figure BDA0003341468810000141
如图13所示，F0/F对Q有很好的线性关系，说明Stern-Volmer模型拟合良好。该实验还分析了不同温度下的荧光淬灭曲线。实验中，将温度从288K增加至308K，淬灭常数从1.84减小到1.27，这是静态淬灭的特征，通过计算得知Kq的值远大于动态淬灭的最大速率常数(2×1010)，说明DTNB与DOX形成了不发光的超分子配合物而引起DOX荧光的静态淬灭。
淬灭作用常用regression方程来描述，如下式所示：
lg[(F0-F)/F]＝lg K+n lg Q
其中，K为DOX与阀门分子的结合常数；n为结合位点数，使用lg[(F0-F)/F]对lg Q作图，K，n和相关系数R2的值见表7和图14。
表7不同温度下DTNB与DOX的结合参数
Figure BDA0003341468810000142
由表7可知，DOX与阀门分子的结合常数较大，说明DOX与阀门分子之间存在较强的作用力，不同温度下，n值都稍大于1，说明每个DOX分子至少可与一个阀门分子结合。同时，温度从288K升高至308K，结合常数K从4571增大至7161，说明温度升高利于阀门分子与DOX的结合。
有机小分子药物可通过氢键、范德华力、静电作用和疏水作用力与阀门分子结合，且作用力往往不止一种，可能是多种作用力协同。通过计算分子结合过程的热力学参数变化，可判断分子间的作用力类型，Rose指出疏水作用可使结合过程的ΔH和ΔS增大，氢键或范德华力可使体系的ΔH和ΔS减小，而静电作用会使体系的ΔH≈0，ΔS>0。通过以下三式计算DOX与阀门分子结合体系的ΔH，ΔS和ΔG，结果见表8。
Figure BDA0003341468810000143
ΔG＝-RTlnK
ΔS＝(ΔH-ΔG)/T
表8不同温度下DTNB和DOX体系的热力学相关参数
Figure BDA0003341468810000144
由表8可知，ΔG<0，说明在反应中，DOX与分子阀门的结合是自发进行的，ΔS>0，说明熵增过程有利于该结合反应的自发进行。ΔH>0，说明该反应是吸热反应，温度升高有利于DOX与阀门分子的结合，这与前面得到的结论一致。综上，本反应ΔH>0，ΔS>0，ΔG<0，熵增效应较大，故表现为熵驱动过程，疏水作用是熵驱动的主要作用力。DOX与阀门分子结合是以疏水作用为主要作用力。
进一步地，对实施例1制备的MSN-SS-MNBA以及对比例1制备的SN-SS-MNBA载药前后的Zeta电位进行分析，结果如图15所示。由图15可知，MSN-SS-MNBA和SN-SS-MNBA在载药后zeta电位值都有明显下降，这是因为原本MSN-SS-MNBA和SN-SS-MNBA末端带负电的小阀门分子与带正电的DOX结合，使得其表面负电荷减少，这也说明阀门分子与DOX之间存在静电作用。
实施例7
本实施例中，通过实验确认封堵阀门的封堵模式。
通过氮气吸脱附数据可知实施例1合成的MSN孔径为2.84nm，而接枝阀门分子(2-硝基苯甲酸)的含二硫键的基团在完全伸展状态下的长度为1.4nm，因此仅依靠接枝阀门分子(2-硝基苯甲酸)的含二硫键的基团自身无法将孔道封堵住。
实施例6已证实阀门分子与DOX存在较强的相互作用，DOX主要通过疏水作用和静电作用与阀门分子结合，因此这里提出了两种可能的载药模型，第一种是药物分子未进入孔道内部，通过疏水作用挂靠在阀门分子上，在GSH响应下，二硫键断裂药物从外部释放；第二种模型是阀门分子末端的疏水苯环和DOX结合形成封堵阀门，将DOX封堵在孔道内。
由于实心颗粒无孔道，因此对比例1制备的DOX@SN-SS-MNBA中，DOX只能通过疏水作用与静电作用与SN-SS-MNBA外表面的阀门分子结合，而这样的载药行为与第一种模型相同。对于两种模型的差异，最大的区别在于载药量的差异。参照实施例3的方法测试了对比例1制备的DOX@SN-SS-MNBA和实施例1制备的DOX@MSN-SS-MNBA的载药量，同时通过热重分析测试了DOX@SN-SS-MNBA、DOX@MSN-SS-MNBA、MSN-SS-MNBA和SN-SS-MNBA的质量损失情况。
载药量测试表明，DOX@SN-SS-MNBA的载药量仅为0.5％，而DOX@MSN-SS-MNBA的载药量达到了9.8％，二者的载药量差异很大，说明MSN-SS-MNBA在载药过程中，药物进入了孔道内部，而不是只通过静电作用挂靠在表面。
热重分析结果如图16所示，相对于MSN-SS-MNBA和SN-SS-MNBA，DOX@MSN-SS-MNBA和DOX@SN-SS-MNBA质量分别减少了9.5％和0.9％，这与载药量计算结果一致。同时DOX@MSN-SS-MNBA和DOX@SN-SS-MNBA的颜色也有明显的差距，相比于DOX@SN-SS-MNBA，DOX@MSN-SS-MNBA的颜色明显更深(呈红色)。由热重分析结果还可以看出，式(Ⅰ)所示的接枝阀门分子的含二硫键的基团占表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒，即-SS-MNBA部分在MSN-SS-MNBA中的含量约为13wt.％～15wt.％。
上述实验结果说明，若药物仅通过疏水作用力挂靠在阀门分子表面，载药量是非常小的，载药量及热重分析结果说明，DOX@MSN-SS-MNBA中，药物分子DOX进入了介孔孔道内部，通过阀门分子与药物分子的相互作用结合共同封堵孔道。

Claims (8)

1.一种基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，其特征在于，该载药颗粒由表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒和药物分子组成，所述药物分子为荷正电且含有苯环结构的抗肿瘤药物分子，药物分子为阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星或者丝裂霉素C，所述表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒中，阀门分子为2-硝基苯甲酸，阀门分子通过含二硫键的基团接枝在介孔硅纳米颗粒表面，接枝阀门分子的含二硫键的基团的结构如式（Ⅰ）所示，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）
部分药物分子位于表面接枝了阀门分子的介孔硅纳米颗粒的孔道中，部分药物分子与阀门分子通过疏水作用和静电作用结合形成封堵阀门，封堵阀门封堵住表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒的孔道结构的孔口；该载药颗粒中的二硫键能被谷胱甘肽切断，二硫键被切断后，封堵阀门脱落，实现孔道结构中负载的药物分子的释放，从孔道结构中释放的药物分子与封堵阀门脱落形成的2-硝基-5-巯基硫苯甲酸起到协同抗肿瘤作用。
2.根据权利要求1所述基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，其特征在于，表面接枝阀门分子的介孔硅纳米颗粒的粒径为105~120 nm。
3.根据权利要求1所述基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，其特征在于，表面接枝封堵阀门的介孔硅纳米颗粒中，结构如式（Ⅰ）所示的连接了阀门分子的含二硫键的基团的含量为13 wt.%~15 wt.%。
4.根据权利要求1所述基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒，其特征在于，该载药颗粒的载药量至少为9%。
5.权利要求1至4中任一权利要求所述基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备巯基修饰的介孔硅纳米颗粒
将介孔硅纳米颗粒分散于无水乙醇中形成分散液A，在氮气保护下向分散液A中滴加3-巯丙基三甲氧基硅烷，加热回流10~14 h，分离出反应产物并用水和乙醇洗涤，然后加入酸性乙醇溶液中，加热回流1~2 h，将反应产物用乙醇洗涤后加入硝酸铵的乙醇溶液中，加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵，用水和乙醇洗涤后得到巯基修饰的介孔硅纳米颗粒；
3-巯丙基三甲氧基硅烷的滴加总量与介孔硅纳米颗粒的质量比为（0.6~1.9）: 1，硝酸铵的乙醇溶液浓度为20~40 g/L；
（2）制备表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒
将5, 5 -二硫代双（2-硝基苯甲酸）溶于无水乙醇，将巯基修饰的介孔硅纳米颗粒分散于乙醇中形成分散液B，将5, 5 -二硫代双（2-硝基苯甲酸）溶液与分散液B混合并搅拌反应10~14 h，将反应产物用水和乙醇洗涤，即得表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒；
5, 5 -二硫代双（2-硝基苯甲酸）与巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的质量比为（0.8~1.2）:1；
（3）负载药物
将表面接枝2-硝基苯甲酸的介孔硅纳米颗粒加入药物溶液中，在避光条件下于50~60℃反应2~4 h，再于常温搅拌20~25 h，固液分离，洗涤除去未进入孔道中以及与2-硝基苯甲酸结合不稳定的药物分子，即得载药颗粒。
6.根据权利要求5所述基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，酸性乙醇溶液为浓盐酸-乙醇混合液，浓盐酸-乙醇混合液中浓盐酸与无水乙醇的体积比为（1~2）:（8~9），分散液A中介孔硅纳米颗粒的浓度为3~6 mg/mL。
7.根据权利要求5所述基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，5, 5 -二硫代双（2-硝基苯甲酸）溶液的浓度为30~50 mg/mL，分散液B中巯基修饰的介孔硅纳米颗粒的浓度为10~15 mg/mL。
8.根据权利要求5至7中任一权利要求所述基于介孔硅小分子阀门的协同给药的载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，药物溶液中药物的浓度为2~10 mg/mL。
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