CN103272241A - 一种pH敏感释药特性的靶向SERS探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有pH敏感释药特性的靶向SERE探针，所述探针从内到外依次包括标记有拉曼分子的金纳米粒子核心、二氧化硅中间层、介孔二氧化硅层、pH敏感聚合物层的壳层以及壳层表面的靶向配体，所述pH敏感聚合物层为壳聚糖/聚甲基丙烯酸层，所述靶向配体为转铁蛋白。本发明还公开了所述的靶向SERE探针的制备方法。本发明提供的探针及其制备方法的优点是：将pH敏感释药系统与SERS相结合，同时连接靶向配体靶向肿瘤细胞；可以根据环境的pH值调节和控制纳米粒子内药物的扩散和释放速率；纳米药物载体中的SERS信号使跟踪纳米药物载体粒子更加精准；靶向配体用来增加药物在肿瘤部位的积蓄，增加药物向肿瘤细胞内的转运。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种pH敏感释药特性的靶向SERS探针及其制备方法。
背景技术
随着纳米材料制备技术的不断发展，纳米药物载体正逐渐成为国内外研究者们关注的热点。其中，介孔硅纳米材料由于其较大的孔容和比表面积，好的生物相容性、无毒性和无药理活性，无论是水溶性药物还是难溶性药物，介孔硅材料都可以实现高的药物负载量，是一种理想的药物载体材料。
智能药物载体是能够响应外界环境刺激，如温度、溶剂组成、pH值、应力、电场和特异分子或离子的微小变化，其体积产生不连续的变化，即体积相转变。人体是一个复杂的环境体系，各个部位有不同的pH值，能特异性识别靶位组织，定时、定量的将所需剂量的药物导入人体病灶部位，针对病变细胞实行定向爆破，提高药物的疗效，减少药物积累中毒和毒副作用。常用的pH响应型聚合物的溶胀度可以随环境pH值的变化而变化，它们根据环境pH值变化夺取或释放质子，从而很好地控制药物的释放。
目前，活体成像中，常用的方法是荧光成像。尤其是新型荧光成像材料的出现，大大提高了荧光成像的灵敏度和信噪比，荧光成像被广泛地应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。荧光成像具有高速、操作方便、易于观察等优点，同时各种荧光染料可复用标记。Hayashi等用双色荧光标记(RFP标记细胞质，H2B-GFP标记细胞核)人纤维肉瘤细胞HT-1080并注射到小鼠腹股沟淋巴结，在淋巴管中几乎无这种细胞的存在；他们还利用荧光标记肿瘤细胞建立的小动物肿瘤模型和OlympusOV100实时荧光成像系统，开展了一系列实验，研究肿瘤细胞在淋巴管中的移行和淋巴节转移。但是，荧光成像仍存在着发射谱宽导致的光谱重叠、光漂白等问题，制约了其在某些领域内的应用。
表面增强拉曼散射（SERS）成像技术作为荧光成像的替代品在免疫检测、细胞和细菌检测、生物传感等方面越来越受到人们的重视。相对于荧光标记，SERS具有以下的优点：SERS谱峰的宽度窄，分辨率高，能减少标记分子谱峰和药物分子谱峰的重叠；SERS中的标记分子不会出现自淬灭现象，可以通过增加标记分子的量来增强SERS信号；SERS检测的灵敏度高。最常用的SERS活性基底是金属凝胶，尤其以金胶和银胶最为广泛。同时可通过在金属纳米粒子表面包裹聚合物或者二氧化硅，实现SERS探针的稳定性。
转铁蛋白受体（TfR）能够介导细胞内铁的摄取和参与细胞生长调节，正常细胞有低水平的TfR表达，而肿瘤细胞（如肝癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱移行细胞癌、神经胶质瘤、肺腺癌、慢性淋巴等）TfR过表达，因此转铁蛋白被广泛应用于靶向配体，与肿瘤细胞表面的受体相结合，用于各类恶性肿瘤的靶向治疗。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种具有pH敏感释药特性的靶向SERS探针。
本发明的另一目的在于提供制备上述SERS探针的方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种具有pH敏感释药特性的靶向SERE探针，具有核壳结构，所述探针从内到外依次包括标记有拉曼分子的金纳米粒子核心、二氧化硅中间层、介孔二氧化硅层、pH敏感聚合物层的壳层以及壳层表面的靶向配体，所述pH敏感聚合物层为壳聚糖/聚甲基丙烯酸层，所述靶向配体为转铁蛋白。
优选地，所述拉曼分子为4-巯基苯甲酸分子、5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)分子或其它含巯基和苯环结构的有机分子中的一种或几种。
优选地，所述介孔二氧化硅层中装载有多柔比星或米托蒽醌或其它抗肿瘤有机小分子药物中的一种或几种。
优选地，所述靶向SERE探针结构呈球状，其粒径为120～160nm，其壳层厚度为80～120nm。
所述的靶向SERE探针的制备方法，包括以下步骤：
1） 制备金胶即金纳米粒子核心：将100mL的0.01%氯金酸溶液加热至沸腾后，在剧烈搅拌下向溶液中加入4mL1%的柠檬酸钠溶液，在沸腾状态下持续剧烈搅拌加热20min，制成的金胶呈现为酒红色，避光、密闭保存备用；
2） 在步骤1）中的金纳米粒子上标记拉曼分子，同时包裹二氧化硅层；
3） 在2）中得到的二氧化硅包裹的金纳米粒子上继续包裹一层介孔二氧化硅层；
4） 在3）中得到的包裹金纳米粒子的介孔二氧化硅层上再包裹一层pH敏感聚合物层得到pH敏感释药特性的SERE探针；
5） 将药物装载进步骤4）得到的pH敏感释药特性的SERE探针的金纳米粒子内，并在其表面连接靶向配体。
优选地，所述的靶向SERE探针的制备方法，所述步骤2）中标记拉曼分子通过化学键吸附到金纳米粒子表面，将10mL的标记有拉曼分子的金纳米粒子分散在5mL的酒精中，加入10μL0.1M的4-巯基苯甲酸（4MBA）剧烈搅拌15min，再加入100～150μL25%的氨水，10～15μL正硅酸四乙酯（TEOS）溶液搅拌10～12h，即制成二氧化硅包裹的金纳米粒子，离心清洗并收集反应液中的二氧化硅包裹的金纳米粒子，最后将该二氧化硅包裹的金纳米粒子分散在10mL去离子水中；
优选地，所述步骤3）中介孔二氧化硅通过以下方法生长，首先将10～15mg的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）加入到步骤2）中的10mL二氧化硅包裹的金纳米粒子中，搅拌30～40min后加入100～200μL 0.1M的氢氧化钠，20～35μL TEOS并搅拌48h以上，然后离心并用酒精清洗5-10次以收集反应液中的粒子，加入3mL去离子水，得到分散在3mL去离子水中的介孔二氧化硅包裹的金纳米粒子。
优选地，所述步骤4）pH敏感释药特性的SERE探针制备步骤如下：通过采用原位聚合方法生长一层壳聚糖/聚甲基丙烯酸层，将30～40mg甲基丙烯酸，10～15mg壳聚糖加入到3mL的介孔二氧化硅包裹的金纳米粒子中，室温下搅拌30min并加热到80℃，加入3～5mg的过硫酸钾反应1～2h，降温至50℃，加入5～10μL戊二醛，反应2h，然后离心并用去离子水清洗3次，得到具有pH敏感释药特性的SERS探针；
优选地，所述步骤5）中药物通过静电作用进入金纳米粒子内，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为交联剂，将靶向配体转铁蛋白连接到纳米粒子表面，在步骤4）中得到的纳米粒子装载药物后，离心分散于2mL水中，依次加入100～200μL 10mM的EDC和20～40μL 100mM的NHS，搅拌30～40min，再加入50～100μL 10mg/mL的转铁蛋白并搅拌2～3h，离心得到具有pH敏感释药特性的靶向SERS探针。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供的一种具有pH敏感释药特性的靶向SERS探针及其制备方法的优点是：与传统的纳米药物载体相比，将pH敏感释药系统与SERS相结合，同时连接靶向配体靶向肿瘤细胞。pH敏感的释药系统可以根据环境的pH值调节和控制纳米粒子内药物的扩散和释放速率；利用金纳米粒子作SERS基底，与传统荧光示踪方式相比，纳米药物载体中的SERS信号使跟踪纳米药物载体粒子更加精准；靶向配体用来增加药物在肿瘤部位的积蓄，增加药物向肿瘤细胞内的转运。
附图说明
图1为pH敏感释药特性的靶向SERS探针的结构示意图；
图2为pH敏感释药特性的靶向SERS探针的SERS信号光谱示意图；
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1：
一种具有pH敏感释药特性的靶向SERE探针，具有核壳结构，所述探针从内到外依次包括标记有拉曼分子的金纳米粒子核心、二氧化硅中间层、介孔二氧化硅层、pH敏感聚合物层的壳层以及壳层表面的靶向配体，所述pH敏感聚合物层为壳聚糖/聚甲基丙烯酸层，所述靶向配体为转铁蛋白。所述拉曼分子为4-巯基苯甲酸（4MBA）分子。所述介孔二氧化硅层中装载有药物多柔比星（DOX）。所述靶向SERE探针结构呈球状，其粒径为120nm，其壳层厚度为80nm。
图1所示的是具有pH敏感释药特性的靶向SERS探针具有核壳行结构，核体为金纳米粒子，中间二氧化硅层和介孔二氧化硅层，外层聚合物。其中所述金纳米粒子为标记了拉曼分子的；二氧化硅层是为包裹拉曼分子，优化SERS信号的；介孔二氧化硅层为了装载药物；最外层的聚合物具有pH敏感特性，不同的pH值下聚合物溶胀度变化会导致药物的释放量不同。最后，通过连接靶向配体使得该SERS探针更好的靶向受体过表达的癌细胞。以4-巯基苯甲酸（4MBA）分子为SERS标记物，以多柔比星（DOX）为药物分子，以转铁蛋白为靶向配体识别肿瘤细胞，靶向SERE探针的制备方法，包括以下步骤：
1）制备金胶。将100mL的0.01%氯金酸溶液加热至沸腾后，在剧烈搅拌下向溶液中加入4mL 1%的柠檬酸钠溶液,在沸腾状态下持续剧烈搅拌加热20min，制成的金胶呈现为酒红色,避光、密闭保存备用。
2）将金纳米粒子表面连接上4MBA分子，同时包裹二氧化硅层，制备二氧化硅包裹的金纳米粒子。采用改进的方法（W.
and A.Fink,Controlled growth ofmonodisperse silica spheres in the micron size range,J.Colloid Interface Sci.1968,26,62-69.），将10mL的金胶离心分散在5mL的酒精中，加入10μL0.1M的4-巯基苯甲酸（4MBA）剧烈搅拌15min，再加入100μL25%的氨水，10μL正硅酸四乙酯（TEOS）溶液搅拌10h，即制成二氧化硅包裹的金纳米粒子，离心清洗并收集反应液中的纳米粒子，最后将该纳米粒子分散在10mL去离子水中。
3）将二氧化硅包裹的金纳米粒子通过Matsuura方法(I.Gorelikov and N.Matsuura,Single-Step coating of mesoporous silica on cetyltrimethyl ammonium bromide-cappednanoparticles.Nano Lett.2008,8,369-373.)生长一层介孔二氧化硅层。首先将10mg的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）加入到步骤2）中的10mL二氧化硅包裹的金纳米粒子中，搅拌30min后加入100μL 0.1M的氢氧化钠，20μL TEOS并搅拌48h以上，然后离心并用酒精反复清洗以收集反应液中的粒子，得到分散在3mL去离子水中的介孔二氧化硅包裹的金纳米粒子。
4）采用原位聚合方法包裹聚合物壳聚糖/聚（甲基丙烯酸），将30mg甲基丙烯酸，10mg壳聚糖加入到3mL的介孔二氧化硅包裹的金纳米粒子中，室温下搅拌30min并加热到80℃，加入3mg的过硫酸钾反应1h，降温至50℃，加入5μL戊二醛，反应2h，然后离心并用去离子水清洗3次，得到具有pH敏感释药特性的SERS探针。
5）装载药物DOX，并采用EDC和NHS为交联剂，将转铁蛋白连接到聚合物表面。DOX通过静电作用进入纳米粒子内，在步骤4）中得到的纳米粒子装载药物后，离心分散于2mL水中，依次加入100μL 10mM的EDC和20μL 100mM的NHS，搅拌30min，再加入50μL 10mg/mL的转铁蛋白并搅拌2～3h，离心得到具有pH敏感释药特性的靶向SERS探针。
图2所示的是该实施例中制备出的pH敏感释药特性的靶向SERS探针的SERS信号光谱图，该探针的SERS信号强，容易实现通过SERS信号对纳米粒子进行精确示踪。
实施例2：
一种具有pH敏感释药特性的靶向SERE探针，具有核壳结构，所述探针从内到外依次包括标记有拉曼分子的金纳米粒子核心、二氧化硅中间层、介孔二氧化硅层、pH敏感聚合物层的壳层以及壳层表面的靶向配体，所述pH敏感聚合物层为壳聚糖/聚甲基丙烯酸层，所述靶向配体为转铁蛋白。所述拉曼分子为5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)分子。所述介孔二氧化硅层中装载有药物米托蒽醌。所述靶向SERE探针结构呈球状，其粒径为160nm，其壳层厚度为120nm。
以5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)分子为SERS标记物，以米托蒽醌为药物分子，以转铁蛋白为靶向配体识别肿瘤细胞，靶向SERE探针的制备方法，包括以下步骤：
1）制备金胶。将100mL的0.01%氯金酸溶液加热至沸腾后，在剧烈搅拌下向溶液中加入4mL 1%的柠檬酸钠溶液,在沸腾状态下持续剧烈搅拌加热20min,制成的金胶呈现为酒红色,避光、密闭保存备用。
2）将金纳米粒子表面连接上5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)分子，同时包裹二氧化硅层，制备二氧化硅包裹的金纳米粒子。采用改进的
方法，将10mL的金胶离心分散在5mL的酒精中，加入10μL0.1M的5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)分子剧烈搅拌15min，再加入150μL25%的氨水，15μL正硅酸四乙酯（TEOS）溶液搅拌12h，即制成二氧化硅包裹的金纳米粒子，离心清洗并收集反应液中的纳米粒子，最后将该纳米粒子分散在10mL去离子水中。
3）将二氧化硅包裹的金纳米粒子通过Matsuura方法生长一层介孔二氧化硅层。首先将15mg的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）加入到步骤2）中的10mL二氧化硅包裹的金纳米粒子中，搅拌40min后加入200μL0.1M的氢氧化钠，35μL TEOS并搅拌48h以上，然后离心并用酒精反复清洗以收集反应液中的粒子，得到分散在3mL去离子水中的介孔二氧化硅包裹的金纳米粒子。
4）采用原位聚合方法包裹聚合物壳聚糖/聚（甲基丙烯酸），将40mg甲基丙烯酸，15mg壳聚糖加入到3mL的介孔二氧化硅包裹的金纳米粒子中，室温下搅拌30min并加热到80℃，加入5mg的过硫酸钾反应2h，降温至50℃，加入10μL戊二醛，反应2h，然后离心并用去离子水清洗3次，得到具有pH敏感释药特性的SERS探针。
5）装载药物米托蒽醌，并采用EDC和NHS为交联剂，将转铁蛋白连接到聚合物表面。米托蒽醌通过静电作用进入纳米粒子内，在步骤4）中得到的纳米粒子装载药物后，离心分散于2mL水中，依次加入200μL 10mM的EDC和40μL 100mM的NHS，搅拌40min，再加入100μL 10mg/mL的转铁蛋白并搅拌3h，离心得到具有pH敏感释药特性的靶向SERS探针。
实施例3
与实施例1基本一样，所不同的在于所述靶向SERE探针结构呈球状，其粒径为140nm，其壳层厚度为100nm。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种具有pH敏感释药特性的靶向SERE探针，具有核壳结构，其特征在于，所述探针从内到外依次包括标记有拉曼分子的金纳米粒子核心、二氧化硅中间层、介孔二氧化硅层、pH敏感聚合物层的壳层以及壳层表面的靶向配体，所述pH敏感聚合物层为壳聚糖/聚甲基丙烯酸层，所述靶向配体为转铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的靶向SERE探针，其特征在于，所述拉曼分子为4-巯基苯甲酸分子、5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)分子或其它含巯基和苯环结构的有机分子中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的靶向SERE探针，其特征在于，所述介孔二氧化硅层中装载有多柔比星或米托蒽醌或其它抗肿瘤有机小分子药物中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的靶向SERE探针，其特征在于，所述靶向SERE探针结构呈球状，其粒径为120～160nm，其壳层厚度为80～120nm。
5.权利要求1所述的靶向SERE探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1） 制备金胶即金纳米粒子核心：将100mL的0.01%氯金酸溶液加热至沸腾后，在剧烈搅拌下向溶液中加入4mL 1%的柠檬酸钠溶液，在沸腾状态下持续剧烈搅拌加热20min，制成的金胶呈现为酒红色，避光、密闭保存备用；
2） 在步骤1）中的金纳米粒子上标记拉曼分子，同时包裹二氧化硅层；
3） 在2）中得到的二氧化硅包裹的金纳米粒子上继续包裹一层介孔二氧化硅层；
4） 在3）中得到的包裹金纳米粒子的介孔二氧化硅层上再包裹一层pH敏感聚合物层得到pH敏感释药特性的SERE探针；
5） 将药物装载进步骤4）得到的pH敏感释药特性的SERE探针的金纳米粒子内，并在其表面连接靶向配体。
6.根据权利要求5所述的靶向SERE探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中标记拉曼分子通过化学键吸附到金纳米粒子表面，将10mL的标记有拉曼分子的金纳米粒子分散在5mL的酒精中，加入10μL 0.1M的4-巯基苯甲酸剧烈搅拌15min，再加入100～150μL 25%的氨水，10～15μL正硅酸四乙酯溶液搅拌10～12h，即制成二氧化硅包裹的金纳米粒子，离心清洗并收集反应液中的二氧化硅包裹的金纳米粒子，最后将该二氧化硅包裹的金纳米粒子分散在10mL去离子水中；
所述步骤3）中介孔二氧化硅通过以下方法生长，首先将10～15mg的十六烷基三甲基溴化铵加入到步骤2）中的10mL二氧化硅包裹的金纳米粒子中，搅拌30～40min后加入100～200μL 0.1M的氢氧化钠，20～35μL正硅酸四乙酯并搅拌48h以上，然后离心并用酒精清洗5-10次以收集反应液中的粒子，加入3mL去离子水，得到分散在3mL去离子水中的介孔二氧化硅包裹的金纳米粒子。
所述步骤4）pH敏感释药特性的SERE探针制备步骤如下：通过采用原位聚合方法生长一层壳聚糖/聚甲基丙烯酸层，将30～40mg甲基丙烯酸，10～15mg壳聚糖加入到3mL的介孔二氧化硅包裹的金纳米粒子中，室温下搅拌30min并加热到80℃，加入3～5mg的过硫酸钾反应1～2h，降温至50℃，加入5～10μL戊二醛，反应2h，然后离心并用去离子水清洗3次，得到具有pH敏感释药特性的SERS探针；
所述步骤5）中药物通过静电作用进入金纳米粒子内，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂，将靶向配体转铁蛋白连接到纳米粒子表面，在步骤4）中得到的纳米粒子装载药物后，离心分散于2mL水中，依次加入100～200μL 10mM的乙基碳二亚胺和20～40μL 100mM的N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌30～40min，再加入50～100μL 10mg/mL的转铁蛋白并搅拌2～3h，离心得到具有pH敏感释药特性的靶向SERS探针。
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