CN118005912A - 一种聚氨基酸杂化纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种聚氨基酸杂化纳米材料及其制备方法和应用，涉及生物医用材料技术领域。本申请的聚氨基酸杂化纳米材料包括：内部为中空介孔的无机纳米粒子；外部为聚氨基酸修饰，且外部上矿化有具备刺激响应性的无机物。本申请提供的聚氨基酸杂化纳米材料的内部为中空介孔结构无机纳米粒子，具有更大的表面积、更多的催化活性位点，并且能够提供内部空隙空间以供底物进入，可以为相关化学反应的发生提供反应场所；外部的聚氨基酸不仅能提高纳米材料的分散性，同时聚氨基酸提供矿化活性位点，可以矿化具备刺激响应性的钙基无机物作为门控，引入具备刺激响应性的钙基无机物能够避免活性分子提前泄露和失活。
Description
技术领域
本申请涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种聚氨基酸杂化纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
有机-无机杂化纳米材料广泛存在于自然界中，例如软体动物的壳和牙齿。有机-无机杂化纳米材料不仅保留了有机组分可降解性和可修饰性以及无机组分独特的理化特性，也表现出协同的作用，呈现出新的功能，这引起了生物医学领域的强烈关注。实心的无机纳米粒子用作药物载体时，载药量有限且药物分子大多分布在表面，药物递送过程中不可避免地会造成药物流失和失活，大大影响治疗效果。此外，无机纳米粒子本身分散性差，易聚集，因此，应用于生物体内时，无机纳米粒子需要使用有机物如小分子、生物分子和聚合物等进行表面修饰，以提高纳米粒子的分散性、稳定性和生物相容性。常用的修饰配体如聚乙二醇等，可以显著提高无机纳米粒子的分散性，但其进一步功能化受到限制。
聚氨基酸具有良好的生物相容性和生物降解性，利用其多种多样的活性侧基反应位点可得到性能可控的功能材料，此外，基于其主链和侧链之间的氢键和静电相互作用，聚氨基酸可以折叠成不同的二级结构，如α螺旋，β折叠等，这些结构具有pH、温度、溶剂变化和表面活性剂的响应。因此，聚氨基酸作为无机纳米粒子的修饰配体具有极大的优势。目前，聚氨基酸作为配体修饰的无机纳米粒子研究较少，现有的纳米材料体系存在药物包载率低、缺乏门控开关、容易暴释等问题，并且大多数体系合成较为复杂，需要使用有机溶剂等，这不仅影响其生物安全性，且对其临床转化造成巨大的阻碍。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述技术问题，本申请提供了一种聚氨基酸杂化纳米材料及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本申请实施例的技术方案是：
本申请的第一方面提供一种聚氨基酸杂化纳米材料，包括如下结构：
内部为中空介孔的无机纳米粒子；外部为聚氨基酸修饰，且外部上矿化有具备刺激响应性的无机物。
结合第一方面优选地，所述无机纳米粒子为贵金属、金属氧化物、金属硫化物、二氧化硅和碳中的一种或几种。
结合第一方面优选地，所述聚氨基酸为带电荷的聚氨基酸；和/或，所述聚氨基酸的聚合度为10~100。
结合第一方面优选地，所述具备刺激响应性的无机物为钙基无机物。
结合第一方面优选地，所述贵金属为金、银、铂和钯中的一种或几种；和/或，所述金属氧化物为黑色二氧化钛、二氧化锆、二氧化铈、氧化锌、氧化铁和四氧化三铁中的一种或几种；和/或，所述金属硫化物为硫化铜、硫化镍、硫化钴和硫化锌中的一种或几种。
结合第一方面优选地，所述带电荷的聚氨基酸为含有羧基和磷酸基团的聚氨基酸。
结合第一方面优选地，所述钙基无机物为磷酸钙和碳酸钙。
结合第一方面优选地，所述贵金属为银、铂和钯中的一种或几种；和/或，所述金属氧化物为黑色二氧化钛和氧化锌中的一种或几种；和/或，所述金属硫化物为硫化锌。
本申请的第二方面提供一种第一方面所述的聚氨基酸杂化纳米材料的制备方法，该制备方法包括：
制备氨基修饰的无机纳米粒子；
使所述氨基修饰的无机纳米粒子分散于弱碱性水溶液中形成分散液，加入氨基酸环内酸酐进行反应后，得到中间产物；
使所述中间产物的水溶液和钙盐水溶液混匀，加入无机盐水溶液混匀后，得到聚氨基酸杂化纳米材料。
本申请的第三方面提供一种第一方面所述的聚氨基酸杂化纳米材料或第二方面所述方法制备的聚氨基酸杂化纳米材料用于制备生物医用材料中的应用。
与现有技术相比，本申请实施例的优点或有益效果至少包括：
本申请实施例制备的聚氨基酸杂化纳米材料，一方面，该聚氨基酸杂化纳米材料的内部为中空介孔结构无机纳米粒子，与实心的无机纳米粒子相比，中空介孔的无机纳米粒子有更大的表面积、更多的催化活性位点，并且能够提供内部空隙空间以供底物进入，可以为相关化学反应的发生提供反应场所；另一方面，外部的聚氨基酸不仅能提高纳米材料的分散性，同时聚氨基酸提供矿化活性位点，可以矿化具备刺激响应性的钙基无机物作为门控，引入具备刺激响应性的钙基无机物能够避免活性分子提前泄露和失活，同时，还能够实现特异性分解，暴露出包载于中空介孔无机纳米粒子内的活性分子，发挥药性，同时，分解的钙离子也能对线粒体造成损伤，达到肿瘤协同治疗的目的；第三方面，水相无机纳米粒子界面限域催化超快聚合，反应高效可控，后处理简单，无需使用有机溶剂，绿色环保；第四方面，由于主链和侧链之间的氢键和静电相互作用，聚氨基酸可以折叠成不同的二级结构，如α螺旋，β折叠等，有利于纳米材料的入胞以及构象相关疾病的诊断和治疗。
附图说明
图1为实施例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的红外光谱图；
图2为实施例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的X射线衍射图；
图3为应用例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料和对比例1实心黑色二氧化钛纳米材料的载药量图；
图4为应用例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料、对比例2聚乙二醇杂化纳米材料和对比例3无矿化层聚氨基酸杂化纳米材料的药物释放图；
图5为应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的钙离子释放图；
图6为应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的过氧化氢生成图；
图7为应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的pH变化图；
图8为实施例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的红外成像图；
图9为应用例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的细胞毒性图；
图10为应用例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的死活细胞染色图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请作进一步地详细描述，所描述的实施例不应视为对本申请的限制，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。
在以下的描述中，涉及到“一些实施例”，其描述了所有可能实施例的子集，但是可以理解，“一些实施例”可以是所有可能实施例的相同子集或不同子集，并且可以在不冲突的情况下相互结合。除非另有定义，本申请实施例所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请实施例的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本申请实施例所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。
在本实施例以下描述中，术语“包括”、“包含”、“具有”和“含有”等均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
需要说明的是，本申请实施例中的所有原料/试剂均可在市场上购买或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备获得；本申请实施例中的术语“和/或”仅用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B表示单独存在A、单独存在B、同时存在A和B的三种情况，其中，A、B可以为单数或复数，字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本实施例以下描述中，术语“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项（个）”或其类似表达是指的这些项中的任意组合，包括单项（个）或复数项（个）的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项（个）”，或，“a，b和c中的至少一项（个）”，均可以表示：a，b，c，a-b（即a和b），a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。
本领域技术人员应当理解，在本申请实施例以下描述中，序号的先后并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本领域技术人员应当理解，在本申请实施例中的数值范围应理解为具体公开该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值和陈述范围内的中间值以及其他任何陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本申请内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的技术/科学术语具有本申请所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本申请仅描述优选的方法和材料，但在本申请的实施例或测试例中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通常引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本申请书的内容为准。
需要说明的是，本申请实施例中的所有原料和/或试剂均是在市场上购买或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备获得。
第一方面，本申请实施例提供一种聚氨基酸杂化纳米材料，包括如下结构：
内部为中空介孔的无机纳米粒子；外部为聚氨基酸修饰，且外部上矿化有具备刺激响应性的无机物。
具体实施例中，本申请实施例的无机纳米粒子优选为贵金属、金属氧化物、金属硫化物、二氧化硅和碳中的一种或几种。
其中，该些无机纳米粒子的结构为中空介孔，其具备较大的表面积和催化活性位点，该独特的中空介孔结构能提供内部空隙空间，以供底物自由进入，为相关化学反应的发生提供反应场所。
具体实施例中，本申请实施例的聚氨基酸优选为带电荷的聚氨基酸。
其中，该些带电荷的聚氨基酸起到提高材料的分散性和提供矿化活性位点的作用。
具体实施例中，本申请实施例的聚氨基酸的聚合度优选为10~100。
具体实施例中，本申请实施例的具备刺激响应性的无机物优选为钙基无机物。
需要说明的是，本申请实施例中具备刺激响应性能对内部刺激（如ROS、GSH和pH）、生物刺激（如酶）及外部刺激（如激光和超声波）中的一种或几种产生相应反应，增强治疗效果。
具体实施例中，本申请实施例的贵金属优选为金、银、铂和钯中的一种或几种；进一步，更优选为银、铂和钯中的一种或几种。
具体实施例中，本申请实施例的金属氧化物优选为黑色二氧化钛、二氧化锆、二氧化铈、氧化锌、氧化铁和四氧化三铁中的一种或几种；进一步，更优选为黑色二氧化钛和氧化锌中的一种和几种。
具体实施例中，本申请实施例的金属硫化物优选为硫化铜、硫化镍、硫化钴和硫化锌中的一种或几种；进一步，更优选为硫化锌。
具体实施例中，本申请实施例的带电荷的聚氨基酸优选为含有羧基和磷酸基团的聚氨基酸。
具体实施例中，本申请实施例的钙基无机物优选为磷酸钙和碳酸钙。
本申请实施例提供的聚氨基酸杂化纳米材料，一方面，该聚氨基酸杂化纳米材料的内部为中空介孔结构无机纳米粒子，与实心的无机纳米粒子相比，中空介孔的无机纳米粒子具有更大的表面积、更多的催化活性位点，并且能够提供内部空隙空间以供底物进入，可以为相关化学反应的发生提供反应场所；另一方面，外部的聚氨基酸不仅能提高纳米材料的分散性，同时聚氨基酸提供矿化活性位点，可以矿化具备刺激响应性的钙基无机物作为门控，引入具备刺激响应性的钙基无机物能够避免活性分子提前泄露和失活，同时，还能够实现特异性释放，暴露出包载于中空介孔无机纳米粒子内的活性分子，发挥药性，同时，分解的钙离子也能对线粒体造成损伤，达到肿瘤协同治疗的目的；第三方面，水相无机纳米粒子界面限域催化超快聚合，反应高效可控，后处理简单，无需使用有机溶剂，绿色环保；第四方面，由于主链和侧链之间的氢键和静电相互作用，聚氨基酸可以折叠成不同的二级结构，如α螺旋，β折叠等，有利于纳米材料的入胞以及构象相关疾病的诊断和治疗。
第二方面，本申请实施例提供一种第一方面所述的聚氨基酸杂化纳米材料的制备方法，该制备方法包括：
制备氨基修饰的无机纳米粒子；
使所述氨基修饰的无机纳米粒子分散于弱碱性水溶液中形成分散液，加入氨基酸环内酸酐进行反应后，得到中间产物；
使所述中间产物的水溶液和钙盐水溶液混匀后，加入无机盐水溶液混匀，得到聚氨基酸杂化纳米材料。
第三方面，本申请实施例提供一种第二方面所述方法制备的聚氨基酸杂化纳米材料用于制备纳米反应器、药物递送、催化、生物成像和诊断以及治疗疾病中的应用。
下面将结合具体实施例对本申请的技术方法作进一步地阐述。
实施例1
本实施例1提供一种聚氨基酸杂化纳米材料1的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备氨基修饰的无机纳米粒子：
将10 mg盐酸多巴胺溶于10 mL去离子水中，得到盐酸多巴胺溶液；取100 mg中空介孔的黑色二氧化钛纳米粒子装入单口烧瓶，随后加入溶解好的盐酸多巴胺溶液，搅拌反应2 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得氨基修饰的无机纳米粒子。
（2）使氨基修饰的无机纳米粒子分散于弱碱性水溶液中形成分散液，加入氨基酸环内酸酐进行反应后，得到中间产物：
将100 mg氨基修饰的无机纳米粒子分散在3 mL 0.05 M碳酸氢钠溶液中，并将其放入Schlenk瓶中，在氩气保护下称取140 mg谷氨酸环内酸酐装入Schlenk瓶，在冰水浴中搅拌反应12 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得聚氨基酸聚合度为10的中间产物。
（3）使中间产物的水溶液和钙盐水溶液混匀，加入无机盐水溶液混匀后，得到聚谷氨酸黑色二氧化钛杂化纳米材料，即聚氨基酸杂化纳米材料1。
为了验证实施例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的相关性能，采用红外光谱仪和X射线衍射分析仪对实施例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料进行表征，结果如图1和2所示。图1为实施例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的红外光谱图。图2为实施例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的X射线衍射图。
根据图1可知，在1655 cm-1和1548 cm-1处显示酰胺键的吸收特征峰，在1732 cm-1处为羧酸羰基的吸收特征峰。
根据图2可知，制备的纳米材料的峰和峰强与JCPDS no 21-1272的XRD图谱匹配良好，并且新峰出现在2θ=32°。以上表征均可证明聚谷氨酸黑色二氧化钛杂化纳米材料成功合成。
实施例2
本实施例2提供一种聚氨基酸杂化纳米材料2的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备氨基修饰的无机纳米粒子：
将10 mg盐酸多巴胺溶于10 mL去离子水中，得到盐酸多巴胺溶液；取100 mg中空介孔的钯纳米粒子装入单口烧瓶，随后加入溶解好的盐酸多巴胺溶液，搅拌反应2 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得氨基修饰的无机纳米粒子。
（2）使氨基修饰的无机纳米粒子分散于弱碱性水溶液中形成分散液，加入氨基酸环内酸酐进行反应后，得到中间产物：
将上述100 mg氨基修饰的无机纳米粒子分散在3 mL 0.05 M碳酸钠溶液中，并将其放入Schlenk瓶中，在氩气保护下称取1.292 g天冬氨酸环内酸酐装入Schlenk瓶，在冰水浴中搅拌反应12 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得聚氨基酸聚合度为40的中间产物。
（3）使中间产物的水溶液和钙盐水溶液混匀，加入无机盐水溶液混匀后，得到聚天冬氨酸钯杂化纳米材料，即聚氨基酸杂化纳米材料2。
为了验证实施例2制备的聚氨基酸杂化纳米材料的相关性能，采用红外光谱仪和动态光散射仪对实施例2制备的聚氨基酸杂化纳米材料进行表征。红外光谱图中，在1655cm-1和1548 cm-1处显示酰胺键的吸收特征峰，在1730 cm-1处为羧酸羰基的吸收特征峰。修饰上氨基后以及矿化后的无机纳米粒子的粒径分别为180.8 nm和422.5 nm。在此过程中，其zeta电位从正变为负。以上表征均可证明聚天冬氨酸钯杂化纳米材料成功合成。
实施例3
本实施例3提供一种聚氨基酸杂化纳米材料3的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备氨基修饰的无机纳米粒子：
将100 mg1-丁硫醇改性后的中空介孔金纳米粒子，将其分散在二氯甲烷中，然后加入10 mg半胱胺进行配体交换反应，即得氨基修饰的金纳米粒子。
（2）使氨基修饰的无机纳米粒子分散于弱碱性水溶液中形成分散液后，加入氨基酸环内酸酐单体进行反应后，得到中间产物：
将上述100 mg氨基修饰的无机纳米粒子分散在3 mL 0.05 M碳酸钠溶液中，并将其放入Schlenk瓶中，在氩气保护下称取1.459 g磷酸苏氨酸环内酸酐装入Schlenk瓶，在冰水浴中搅拌反应12 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得聚氨基酸聚合度为50的中间产物。
（3）使中间产物的水溶液和钙盐水溶液混匀，加入无机盐水溶液混匀后，得到聚磷酸苏氨酸金杂化纳米材料，即聚氨基酸杂化纳米材料3。
为了验证实施例3制备的聚氨基酸杂化纳米材料的相关性能，采用红外光谱仪和动态光散射仪对实施例3制备的聚氨基酸杂化纳米材料进行表征。红外光谱图中，在1655cm-1和1550 cm-1处显示酰胺键的吸收特征峰，在1731 cm-1处为羧酸羰基的吸收特征峰。在合成过程中，聚氨基酸杂化纳米材料的zeta电位从正变为负。以上表征均可证明聚磷酸苏氨酸金杂化纳米材料成功合成。
实施例4
本实施例4提供一种聚氨基酸杂化纳米材料4的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备氨基修饰的无机纳米粒子：
将10 mg 3-氨丙基三乙氧基硅烷溶于10 mL去离子水中，得到3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液；取100 mg中空介孔的氧化锌纳米粒子装入单口烧瓶，随后加入溶解好的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液，搅拌反应2 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得氨基修饰的无机纳米粒子。
（2）使氨基修饰的无机纳米粒子分散于弱酸性水溶液中形成分散液后，加入氨基酸环内酸酐进行反应后，得到中间产物：
将100 mg氨基修饰的无机纳米粒子分散在3 mL 0.05 M碳酸钾溶液中，并将其放入Schlenk瓶中，在氩气保护下称取819 mg磷酸丝氨酸环内酸酐装入Schlenk瓶，在冰水浴中搅拌反应12 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得聚氨基酸聚合度为70的中间产物。
（3）使中间产物的水溶液和钙盐水溶液混匀，加入无机盐水溶液混匀后，得到聚磷酸丝氨酸氧化锌杂化纳米材料，即聚氨基酸杂化纳米材料4。
为了验证实施例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料的相关性能，采用红外光谱仪和动态光散射仪对实施例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料进行表征。红外光谱图中，在1655cm-1和1546 cm-1处显示酰胺键的吸收特征峰，在1730 cm-1处为羧酸羰基的吸收特征峰。修饰上氨基后以及矿化后的无机纳米粒子的粒径分别为237.2 nm和501.3 nm，此过程中，zeta电位显示负值。以上表征均可证明聚磷酸丝氨酸氧化锌杂化纳米材料成功合成。
实施例5
本实施例5提供一种聚氨基酸杂化纳米材料5的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备氨基修饰的无机纳米粒子：
将10 mg盐酸多巴胺溶于10 mL去离子水中，得到盐酸多巴胺溶液；取100 mg中空介孔硫化锌纳米粒子装入单口烧瓶，随后加入溶解好的盐酸多巴胺溶液，搅拌反应2 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得氨基修饰的无机纳米粒子。
（2）使氨基修饰的无机纳米粒子分散于弱碱性水溶液中形成分散液后，加入氨基酸环内酸酐进行反应后，得到中间产物：
将100 mg氨基修饰的无机纳米粒子分散在3 mL 0.05 M碳酸钠溶液中，并将其放入Schlenk瓶中，在氩气保护下称取1.87 g磷酸酪氨酸环内酸酐装入Schlenk瓶，在冰水浴中搅拌反应12 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得聚氨基酸聚合度为100的中间产物。
（3）使中间产物的水溶液和钙盐水溶液混匀，加入无机盐水溶液混匀后，得到聚磷酸酪氨酸硫化锌杂化纳米材料，即聚氨基酸杂化纳米材料5。
为了验证实施例5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的相关性能，采用红外光谱仪和动态光散射仪对实施例5制备的聚氨基酸杂化纳米材料进行表征。红外光谱图中，在1655cm-1和1548 cm-1处显示酰胺键的吸收特征峰，在1730 cm-1处为羧酸羰基的吸收特征峰。修饰上氨基后以及矿化后的无机纳米粒子的粒径分别为237.2 nm和531.6 nm，其zeta电位的负值增加。以上结果证明了聚磷酸酪氨酸硫化锌杂化纳米材料的成功合成。
应用例1
本应用例1提供一种包载葡萄糖氧化酶（GOx）的聚氨基酸杂化纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
称取7.5 mg实施例1的中间产物、2.5 mg GOx溶解在10 mL的去离子水中，搅拌12h，收集反应好的溶液，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次；将2.2 mg氯化钙超声溶解于10 mL去离子水中，将上述产物（1 mg/mL）取1 mL在振荡下逐滴加入，混合物超声30 min；之后，再加入500μL磷酸氢二钠溶液（10 mg/mL），搅拌溶液过夜，收集反应体系，10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，得到包载GOx，矿化层为磷酸钙的聚氨基酸杂化纳米材料。
应用例2
本应用例2提供一种包载辣根过氧化物酶（HRP）的聚氨基酸杂化纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
称取7.5 mg实施例2的中间产物、2.5 mg HRP溶解在10 mL的去离子水中，搅拌12h，收集反应好的溶液，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次；配置25 mM氯化钙溶液和25 mM碳酸钠溶液；将上述中间产物（1 mg/mL）取1 mL在振荡下逐滴加入5 mL的氯化钙溶液中，在磁力搅拌下向溶液中滴加5 mL的碳酸钠溶液，在室温下搅拌1 h，收集反应体系，10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，得到包载HRP，矿化层为碳酸钙的聚氨基酸杂化纳米材料。
应用例3
本应用例3提供一种包载阿霉素（DOX）的聚氨基酸杂化纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
称取7.5 mg实施例3的中间产物、2.5 mg DOX溶解在10 mL的去离子水中，搅拌12h，收集反应好的溶液，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次；将2.2 mg氯化钙超声溶解于10 mL去离子水中，将上述产物（1 mg/mL）取1 mL在振荡下逐滴加入，混合物超声30 min；之后，再加入168 μL磷酸氢二钠溶液（10 mg/mL），搅拌溶液过夜。收集反应体系，10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，得到包载DOX，矿化层为羟基磷灰石的聚氨基酸杂化纳米材料。
应用例4
本应用例4提供一种包载DOX的聚氨基酸杂化纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
称取7.5 mg实施例4的中间产物、2.5 mg DOX溶解在10 mL的去离子水中，搅拌12h，收集反应好的溶液，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次；将2.2 mg氯化钙超声溶解于10 mL去离子水中，将上述产物（1 mg/mL）取1 mL在振荡下逐滴加入，混合物超声30 min；之后，再加入168 μL磷酸氢二钠溶液（10 mg/mL），搅拌溶液过夜。收集反应体系，10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，得到包载DOX，矿化层为羟基磷灰石的聚氨基酸杂化纳米材料。
应用例5
本应用例5提供一种包载核糖核酸酶A（RNase A）的聚氨基酸杂化纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
称取7.5 mg实施例5的中间产物、2.5 mg RNase A溶解在10 mL的去离子水中，搅拌12 h，收集反应好的溶液，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次；将2.2 mg氯化钙超声溶解于10 mL去离子水中，将上述产物（1 mg/mL）取1mL在振荡下逐滴加入，混合物超声30 min；之后，再加入500 μL磷酸氢二钠溶液（10 mg/mL），搅拌溶液过夜，收集反应体系，10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，得到包载RNase A，矿化层为磷酸钙的聚氨基酸杂化纳米材料。
对比例1
本对比例1提供一种实心的黑色二氧化钛纳米材料。
对比例2
本对比例2提供一种聚乙二醇杂化纳米材料，具体步骤如下：
将10 mg氨基聚乙二醇溶于10 mL去离子水中，得到氨基聚乙二醇溶液；取100 mg中空介孔黑色二氧化钛纳米粒子装入单口烧瓶，随后加入溶解好的氨基聚乙二醇溶液，搅拌反应24 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10 min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，得到聚乙二醇杂化纳米材料。
对比例3
本对比例3提供一种无矿化层的聚氨基酸杂化纳米材料，具体步骤如下：
将10 mg盐酸多巴胺溶于10 mL去离子水中，得到盐酸多巴胺溶液；取100 mg中空介孔的黑色二氧化钛纳米粒子装入单口烧瓶，随后加入溶解好的盐酸多巴胺溶液，搅拌反应2 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，即得氨基修饰的无机纳米粒子。
将100 mg氨基修饰的无机纳米粒子分散在3 mL 0.05 M碳酸氢钠溶液中，并将其放入Schlenk瓶中，在氩气保护下称取140 mg谷氨酸环内酸酐装入Schlenk瓶，在冰水浴中搅拌反应12 h，收集反应好的体系，以10000 r/min离心10min，除去上层液体，加入去离子水，重复上述操作3次，得到无矿化层的聚氨基酸杂化纳米材料。
为了验证制备的聚氨基酸杂化纳米材料的载药释药能力，取应用例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料、对比例1-3的纳米材料进行性能表征，结果如图3和4所示。图3为应用例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料和对比例1的实心黑色二氧化钛纳米材料的载药量图，其中，分别示出了对比例1的实心黑色二氧化钛纳米材料组和应用例4的聚氨基酸杂化纳米材料组。图4为应用例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料和对比例2-3的纳米材料的药物释放图，其中，分别示出了对比例2的聚乙二醇杂化纳米材料组、对比例3的无矿化层的聚氨基酸杂化纳米材料组和应用例4的聚氨基酸杂化纳米材料组。
取对比例1的实心黑色二氧化钛纳米材料，称取7.5 mg实心黑色二氧化钛纳米材料、2.5 mg DOX溶解在10 mL的去离子水中，搅拌12 h，收集反应好的溶液，以10000 r/min离心10min，收集上层液体，检测液体中DOX的含量。
根据图3可知，应用例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料的载药量为25%，而对比例1的实心黑色二氧化钛纳米材料的载药量仅为11%，证明了空心介孔结构的存在赋予了聚氨基酸杂化纳米材料优异的载药能力。此外，实心黑色二氧化钛纳米材料在水中一段时间后易团聚并沉在底部，而聚氨基酸杂化纳米材料在水中分散性良好，一段时间后，未观察到团聚现象。
取对比例2的聚乙二醇杂化纳米材料和对比例3的无矿化层的聚氨基酸杂化纳米材料，按照同样的方法包载上DOX，取上述包载DOX的纳米材料和应用例4的聚氨基酸杂化纳米材料各5 mg，分散在2 mL PBS溶液中，随后装入透析袋中，将透析袋浸入20 mL的PBS溶液中，检测DOX的释放情况。
根据图4所示，对比例2的聚乙二醇杂化纳米材料和对比例3的无矿化层的聚氨基酸杂化纳米材料的DOX释放速率高于应用例4的聚氨基酸杂化纳米材料，表明在没有矿化层的保护下，药物分子易暴释。取对比例2的聚乙二醇杂化纳米材料，加入钙盐水溶液和无机盐溶液，反应12 h，洗涤，冻干，并进行X射线衍射分析，没有出现明显的矿化层特征峰。以上实验结果证明了聚氨基酸杂化纳米材料空心介孔结构介导的优异的载药能力和矿化层介导的防止药物泄漏的能力。
为了验证应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的催化性能，对应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料进行性能表征，结果如图5至7所示。图5为应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的钙离子释放图。图6为应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的过氧化氢生成图。图7为应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料的pH变化图。
取应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料分散在5 mL不同pH（5.5、6.8和7.4）的PBS中，加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖溶液，检测180 min内过氧化氢的生成情况，如图5和6所示。其中，在pH=5.5的条件下，显示出最大的钙离子释放率和最高的H2O2浓度，表明在酸性环境下，聚氨基酸杂化纳米材料的外壳分解，暴露出GOx，催化葡萄糖产生H2O2。根据图7可知，在葡萄糖的存在下溶液的pH在340 min内从7.06下降至4.46，进一步验证该材料可以消耗葡萄糖并产生葡萄糖酸。以上实验结果证明了合成的纳米材料的Ca2+释放和GOx的催化能力。
为了验证实施例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的光热及成像诊断能力，对实施例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料进行性能表征，结果如图8所示。图8为实施例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的红外成像图。其中，分别示出了PBS组、实施例1的聚氨基酸杂化纳米材料组、实施例2的聚氨基酸杂化纳米材料组、实施例3的聚氨基酸杂化纳米材料组、实施例4的聚氨基酸杂化纳米材料组和实施例5的聚氨基酸杂化纳米材料组。
取实施例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料1 mg，分散于1 mL的去离子水中，在808 nm近红外光照射5 min，记录下不同组的温度变化情况。根据图8可知，实施例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料红外图像呈亮黄色，升温明显，证明了聚氨基酸杂化纳米材料优异的成像及诊断能力。
为了验证应用例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的体外抗肿瘤性能，对应用例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料进行性能表征，结果如图9和10所示。图9为应用例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的细胞毒性图，其中，分别示出了PBS组、应用例1制备的聚氨基酸杂化纳米材料组、应用例2制备的聚氨基酸杂化纳米材料组、应用例3制备的聚氨基酸杂化纳米材料组、应用例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料组和应用例5制备的聚氨基酸杂化纳米材料组。图10为应用例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的死活细胞染色图，其中，分别示出了PBS组、应用例1聚氨基酸杂化纳米材料组、应用例2制备的聚氨基酸杂化纳米材料组、应用例3制备的聚氨基酸杂化纳米材料组、应用例4制备的聚氨基酸杂化纳米材料组和应用例5制备的聚氨基酸杂化纳米材料组。
取应用例1-5的聚氨基酸杂化纳米材料进行抗肿瘤研究。将4T1细胞作为模型研究聚氨基酸杂化纳米材料的胞内行为。通过CCK8法评估了纳米粒子的细胞毒性。进一步，利用PI和calcein-AM对与纳米材料共培养的4T1细胞进行染色。根据图9可知，PBS组细胞状态良好，聚氨基酸杂化纳米材料组细胞死亡率达一半以上，表现出显著的细胞毒性。根据图10可知，通过荧光显微镜观察到聚氨基酸杂化纳米材料组显示出红色荧光，表明存在大量死亡的细胞，这与细胞毒性实验结果一致。取应用例1-5的聚氨基酸杂化纳米材料进行线粒体膜电位测试，结果显示，与PBS组相比，聚氨基酸杂化纳米材料组的线粒体膜电位明显下降。以上结果证明聚氨基酸纳米材料具有优异的抗肿瘤能力。
为了验证应用例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料的体内抗肿瘤性能，对应用例1-5制备的聚氨基酸杂化纳米材料进行性能表征。
取应用例1-5的纳米材料进行体内的肿瘤抑制研究。将小鼠4T1细胞接种于BALB/c小鼠左侧皮下，构建原位肿瘤模型。在第0、2和4天瘤内注射生理盐水和相应的纳米粒子。每2天用数字卡尺记录肿瘤大小。生理盐水组原位肿瘤快速生长，第18天时，其体积达到了678mm3，而聚氨基酸杂化纳米材料组原位肿瘤的生长被明显抑制。以上结果显示，聚氨基酸杂化纳米材料在体内具有显著的肿瘤抑制效果。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种聚氨基酸杂化纳米材料，其特征在于，包括如下结构：
内部为中空介孔的无机纳米粒子；外部为聚氨基酸修饰，且外部上矿化有具备刺激响应性的无机物。
2.根据权利要求1所述的聚氨基酸杂化纳米材料，其特征在于，所述无机纳米粒子为贵金属、金属氧化物、金属硫化物、二氧化硅和碳中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的聚氨基酸杂化纳米材料，其特征在于，所述聚氨基酸为带电荷的聚氨基酸；
和/或，所述聚氨基酸的聚合度为10~100。
4.根据权利要求1所述的聚氨基酸杂化纳米材料，其特征在于，所述具备刺激响应性的无机物为钙基无机物。
5.根据权利要求2所述的聚氨基酸杂化纳米材料，其特征在于，所述贵金属为金、银、铂和钯中的一种或几种；
和/或，所述金属氧化物为黑色二氧化钛、二氧化锆、二氧化铈、氧化锌、氧化铁和四氧化三铁中的一种或几种；
和/或，所述金属硫化物为硫化铜、硫化镍、硫化钴和硫化锌中的一种或几种。
6.根据权利要求3所述的聚氨基酸杂化纳米材料，其特征在于，所述带电荷的聚氨基酸为含有羧基和磷酸基团的聚氨基酸。
7.根据权利要求4所述的聚氨基酸杂化纳米材料，其特征在于，所述钙基无机物为磷酸钙和碳酸钙。
8.根据权利要求5所述的聚氨基酸杂化纳米材料，其特征在于，所述贵金属优选为银、铂和钯；
和/或，所述金属氧化物优选为黑色二氧化钛和氧化锌；
和/或，所述金属硫化物优选为硫化锌。
9.一种权利要求1-8所述的聚氨基酸杂化纳米材料的制备方法，其特征在于，包括：
制备氨基修饰的无机纳米粒子；
使所述氨基修饰的无机纳米粒子分散于弱碱性水溶液中形成分散液，加入氨基酸环内酸酐进行反应后，得到中间产物；
使所述中间产物的水溶液和钙盐水溶液混匀，加入无机盐水溶液混匀后，得到聚氨基酸杂化纳米材料。
10.一种权利要求9所述方法制备的聚氨基酸杂化纳米材料用于纳米反应器、药物递送、催化、生物成像和诊断以及治疗疾病中的应用。
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