RU2259194C2 - Эпитопы, образованные нековалентным связыванием конъюгатов - Google Patents

Эпитопы, образованные нековалентным связыванием конъюгатов Download PDF

Info

Publication number
RU2259194C2
RU2259194C2 RU2002101927/15A RU2002101927A RU2259194C2 RU 2259194 C2 RU2259194 C2 RU 2259194C2 RU 2002101927/15 A RU2002101927/15 A RU 2002101927/15A RU 2002101927 A RU2002101927 A RU 2002101927A RU 2259194 C2 RU2259194 C2 RU 2259194C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
amino acids
conjugates
group
head
groups
Prior art date
Application number
RU2002101927/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2002101927A (ru
Inventor
Роджер НЬЮ (GB)
Роджер НЬЮ
Истван ТОТ (AU)
Истван Тот
Original Assignee
Проксима Консептс Лимитед
Мозаик Дискавери Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Проксима Консептс Лимитед, Мозаик Дискавери Лимитед filed Critical Проксима Консептс Лимитед
Publication of RU2002101927A publication Critical patent/RU2002101927A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2259194C2 publication Critical patent/RU2259194C2/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/525—Tumor necrosis factor [TNF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической химии, в частности к композиции для взаимодействия с лигандом, причем композиция включает в себя нековалентный ассоциат множества отдельных конъюгатов, каждый из которых содержит головную группу и хвостовую группу, где хвостовые группы конъюгатов образуют гидрофобный агрегат, и конъюгаты подвижны в пределах ассоциата, так что в присутствии лиганда по меньшей мере две из головных групп размещаются способом, соответствующим формированию эпитопа, способного взаимодействовать с лигандом сильнее, чем каждая из головных групп по отдельности. Изобретение обеспечивает применение конъюгатов в комбинаторном подходе для выявления эффективных сочетаний с целью индукции желаемого взаимодействия связывания в рецептор-специфическом лечении. 4 н. и 27 з.п. ф-лы, 2 ил., 10 табл.

Description

Описание
Настоящее изобретение относится к композиции для взаимодействия с лигандом, способу получения такой композиции и способу получения молекулы на основе композиции.
Известный уровень техники
Известно, что рецепторы белков обычно взаимодействуют со своими лигандами-мишенями через эпитопы, которые составляют небольшую часть суммарной молекулы белка. Для максимального связывания или взаимодействия необходимо, чтобы структура эпитопа поддерживалась в строго закрепленной конформации для образования связывающего сайта, содержащего в непосредственной близости все необходимые компоненты эпитопа. Попытки получения пептидного аналога, созданного исключительно из аминокислот, составляющих связывающий сайт, часто оканчивались неудачей, так как такие пептиды не обладают той же биологической активностью, что и белковый рецептор. Это связано с тем, что пептид имеет в свободном растворе конформацию, отличную от таковой целого белкового рецептора. Кроме того, когда связывающий сайт белка создают из олигопептидов из различных, несоприкасающихся частей белковой цепи, смешивание выделенных олигопептидов в свободном растворе не ведет к воссозданию активного связывающего сайта.
Вынужденная необходимость использовать такие большие белки для представления эпитопов со связывающими сайтами ведет к возникновению нескольких проблем при разработке новых стратегий в рецептор-специфическом лечении. Одна проблема состоит в том, что такие большие белки легко могут вызывать иммунный ответ. Вторая проблема заключается в том, что длинные пептидные цепи восприимчивы к действию эндопептидаз, таких как те, которые находятся в просвете пищеварительного тракта. Наконец, указанные большие белки могут быть дорогостоящими для производства, очистки и поддержания в стабильной форме.
Краткое изложение существа изобретения
Целью настоящего изобретения является преодоление недостатков предшествующего уровня техники.
В первом варианте в изобретении предлагается композиция для взаимодействия с лигандом, причем композиция включает в себя нековалентный ассоциат множества отдельных конъюгатов, причем каждый конъюгат содержит головную группу и хвостовую группу, где хвостовые группы конъюгатов образуют гидрофобный агрегат, и конъюгаты имеют свободу движения в отношении друг друга внутри ассоциата, такую, что в присутствии лиганда по меньшей мере две головные группы (которые являются одинаковыми или отличающимися) располагаются подходящим образом для образования эпитопа, способного взаимодействовать с лигандом более прочно, чем каждая из головных групп по отдельности. Головные группы являются обычно гидрофильными, а хвостовые группы являются обычно гидрофобными, например, липофильными, состоящими из углеводородных цепей, галоидофильными, созданными из фторкарбоновых цепей, или созданными на основе силанов.
При конструировании конъюгатов с головной и хвостовой группой в соответствии с настоящим изобретением хвостовые группы могут ассоциировать с образованием гидрофобного агрегата, который представляет собой обычно надмолекулярный ассоциат, такой как мицелла, многослойная структура, липосома или другая липидная структура, причем конъюгат ориентирован таким образом, что головные группы находятся в тесном соседстве при существовании в водной фазе. Так как конъюгаты способны двигаться внутри ассоциата, головные группы способны адаптироваться к большому числу различных положений внутри ассоциата. Головные группы, которые обычно не идентичны, следовательно, свободны двигаться внутри ассоциата и неожиданно взаимодействовать кооперативно, вызывая биологические последствия, которые головные группы не способны вызвать по отдельности. Другой неожиданный результат заключается в том, что ассоциаты, состоящие из сочетаний различных головных групп, способны вызывать биологические ответы или участвовать в связывании с биологическими рецепторами, в то время как ассоциаты, состоящие из одинаковых головных групп, не способны действовать таким способом.
Как указывалось выше, данные надмолекулярные комплексы обычно являются состоящими из частиц или коллоидными по природе, причем обычно включают в себя многие сотни субъединиц (конъюгатов), причем все ориентированы головными группами по направлению кнаружи от центра частицы, как показано на фигуре 1а. Каждый из конъюгатов может менять свою локализацию в ассоциате, будучи свободным менять места по отношению к соседним конъюгатам в процессе броуновского движения, и, делая это, может мигрировать через всю поверхность ассоциата. Другими проявлениями надмолекулярных ассоциатов являются объемные фазы и покрытые поверхности.
Каждый конъюгат в ассоциате может иметь головную группу, выбранную из одного химического или биологического класса или из ряда различных классов, таких как аминокислота или пептид; пептидный аналог; моно-, ди- или полисахарид; моно-, ди- или полинуклеотид; стерин; алкалоид; изопреноид; производное инозита; единичное или слитое ароматическое ядро; водорастворимый витамин; порфирин или ядро гема; фталоцианин; хелат иона металла; водорастворимое лекарство; гормон или субстрат фермента.
В одном предпочтительном осуществлении каждая головная группа включает в себя аминокислоту или олигопептид, который может быть концевой частью пептидной цепи. Желательным является сведение длины пептида к минимуму, так чтобы избежать индукции иммунного ответа при использовании композиции in vivo. Соответственно, предпочтительно, чтобы пептид состоял в длину не более чем из шести аминокислот.
Применяемые аминокислоты могут быть природными аминокислотами, замещенными производными, аналогами и их D-формами.
Хвостовые группы конъюгатов могут быть все одними и теми же или могут представлять собой смесь различных хвостовых групп, каждая из которых предпочтительно содержит гидрофобную группу, выбранную из линейного, разветвленного, циклического, полициклического, насыщенного или ненасыщенного конструкта в присутствии или в отсутствие гетероатомов, включенных в структуру, которая может быть насыщенной или ненасыщенной, например, липидный аналог аминокислоты; простагландин; лейкотриен; моно- или диглицерид; стерин; производное сфингозина или керамида; и кремний- или галоген-замещенное производное такой гидрофобной группы. Хвостовая группа предпочтительно имеет от 6 до 24 атомов углерода и - более предпочтительно - включает в себя от 10 до 14 атомов углерода. В каждом конъюгате может присутствовать более одной хвостовой группы. Например, один или более липидных аналогов аминокислот с углеводородными боковыми цепями могут формировать часть каждого конъюгата, соединенную с одной или более аминокислотами в головной группе.
Любой химический способ может быть применен для связывания головной группы с хвостовой группой. Например, каждый конъюгат может дополнительно включать в себя спейсерную группу, соединяющую головную группу с хвостовой группой, так, чтобы ускорять представление головной группы на поверхности нековалентного ассоциата. Такие спейсерные группы хорошо известны и содержит, например, аминокислоты, оксикислоты, сахара и полиэтиленгликоль.
В другом варианте в настоящем изобретении предлагается композиция, определяемая выше, для применения в качестве лекарства, профилактического или диагностического средства.
Преимущество изобретения состоит в том, что может быть достигнуто сильное специфическое связывание с конъюгатами, в которых головные группы являются маленькими по сравнению с обычными биологическими рецепторами. Если, например, головная группа представляет собой олигопептид, тогда длина пептидной цепи обычно не должна превышать десяти аминокислот и должна предпочтительно составлять шесть или менее аминокислот. Соответственно, композиции согласно настоящему изобретению могут быть намного менее иммуногенными, чем их белковые варианты.
В соответствии с данным вариантом изобретения композиция согласно изобретению может быть составлена не только для взаимодействия с лигандом in vitro, но также композиция может быть применена in vivo, необязательно в составе с подходящими разбавителем, наполнителем или носителем, в соответствии с подходящим способом доставки.
В еще одном варианте в настоящем изобретении предлагается применение конъюгата, включающего в себя головную группу и хвостовую группу, для получения композиции, определяемой выше.
Дополнительно предлагается способ получения композиции для взаимодействия с лигандом, при этом данный способ включает в себя
(а) обеспечение множественности различных конъюгатов, причем каждый конъюгат включает в себя головную группу и хвостовую группу; и (b) образование из множества конъюгатов путем их нековалентной ассоциации ассоциата, в котором хвостовые группы агрегируют гидрофобным образом и в котором конъюгаты проявляют свободу движения по отношению друг к другу так, что в присутствии лиганда по меньшей мере две головные группы размещаются способом, соответствующим формированию эпитопа, способного взаимодействовать с лигандом сильнее, чем каждая из головных групп по отдельности. Каждый конъюгат является предпочтительно таким, как определено выше.
Конъюгаты могут быть диспергированы в водной фазе множеством из известных методологий для получения липидных везикул, включая механическое смешивание, обработку высокими усилиями сдвига, сонификацию, дисперсию в растворителе или сорастворение с детергентами. Обычно образованные таким образом нековалентные надмолекулярные ассоциаты должны состоять из нескольких различных конъюгатов, смешанных вместе. Необязательно могут быть добавлены дополнительные липидные материалы для изменения поверхностных свойств, как вспомогательные средства для дисперсии конъюгатов, для стабилизации нековалентно связанного ассоциата конъюгатов, для способствования презентации головных групп конъюгатов или для возможности создания везикул, которые могут направляться эпитопами, образованными в результате случайного движения конъюгатов и соответствующего позиционирования головных групп в ассоциате.
Важный аспект способа в соответствии с настоящим изобретением включает в себя стадию идентификации множества конъюгатов, которые имеют желаемую биологическую активность. В предпочтительном осуществлении данная стадия включает в себя
(i) выбор набора конъюгатов с набором головных групп;
(ii) образование из них нековалентного ассоциата, в котором хвостовые группы агрегируют гидрофобным образом и в котором конъюгаты проявляют свободу движения по отношению друг к другу;
(iii) анализ достаточности взаимодействия между некова-лентным ассоциатом и лигандом;
(iv) необязательное повторение стадий с (i) по (iii) с применением набора конъюгатов с модифицированным набором головных групп; и
(v) отбор набора конъюгатов в качестве множества конъюгатов стадии (а) при выявлении достаточного взаимодействия на стадии (iii).
Примеры тестов на "достаточное взаимодействие" могут включать в себя анализ связывания, наподобие анализа с применением принципа ИФА (ELISA) для определения взаимодействия между антителом и антигеном. Другие подходящие тесты in vitro включают в себя модификацию флуоресценции чувствительных к окружению связанных мембраной флуоресцентных зондов, реакции преципитации, увеличение или торможение активности ферментов и т.п. Подходящими также могут быть тесты, основанные на способности материалов изменять поведение клеток, культивируемых in vitro, такие как тесты на клеточную смерть, клеточную пролиферацию, апоптоз, торможение или стимуляцию межклеточных контактов, секрецию цитокинов или других растворимых продуктов, синтез специфических мРНК, внутриклеточный везикулярный транспорт, изменение процессов клеточной сигнализации и т.п. Могут выполняться также тесты in vivo на целых животных или человеке, например, по включению радиоактивной метки в надмолекулярные ассоциаты, за которым следует изучение ее последующего распределения после введения различными способами.
В соответствии с данным способом применяют комбинаторный подход, в котором получают диапазон различных надмолекулярных ассоциатов (или "зондов"), каждый из которых содержит различное сочетание конъюгатов, выбранных из банка предварительно синтезированных. Выбор подходящих конъюгатов может быть основан на известных свойствах лиганда-мишени или может просто включать в себя применение очень широкого спектра головных групп для увеличения вероятности того, что две или более головные группы будут образовывать эпитоп для лиганда. Таким образом, после теста на достаточное взаимодействие между зондом и лигандом, как описано выше, сочетание конъюгатов, определяемое как наиболее эффективное, может быть модифицировано путем добавления дополнительных головных групп, удаления некоторых головных групп, или обоими способами, и полученные зонды тестируют еще раз на достаточное взаимодействие. В конечном счете, может быть идентифицировано и выбрано для применения в композиции наиболее благоприятное сочетание головных групп.
Настоящее изобретение, следовательно, имеет весьма явное преимущество по сравнению с традиционной комбинаторной химией. В комбинаторной химии идентификация наиболее благоприятной последовательности для связывания со специфическим рецептором должна быть осуществлена с помощью синтеза сотен возможных сочетаний различных групп, таких как аминокислоты, в различном порядке, каждое из которых должно быть протестировано в отношении эффективности. Данный процесс требует времени, дорог и ограничен природой химических подходов, которые могут быть выполнены для присоединения различных компонентов друг к другу. В отличие от этого, настоящее изобретение просто полагается на близость головных групп для обеспечения эпитопов ассоциативного происхождения. Как только синтезирован набор конъюгатов, никакой дополнительной химии синтеза не требуется, только простое смешивание конъюгатов для образования различных зондов путем нековалентной ассоциации.
В предпочтительном простом осуществлении настоящий способ использует конъюгаты, имеющие единственную аминокислоту, соединенную через спейсер с липидной хвостовой группой, которые могут легко сочетаться путем смешивания в водной среде с образованием мицелл, в которых боковые цепи различных аминокислот должны быть представлены вместе во множестве различных конфигураций. Соответственно, отпала необходимость представлять аминокислоты в конкретном порядке или со специфическим спейсером, или в специфической ориентации. На основании статистики правильное соотношение индивидуальных аминокислотных субъединиц всегда должно приводить к ассоциации с идеальной конфигурацией.
В одном приготовлении каждый из конъюгатов должен иметь линейную структуру: Х-спейсер-спейсер-липид-липид, где Х представляет собой единственную аминокислоту, отличную для каждого из отдельно применяемых конъюгатов.
При желании создать эпитопы, состоящие из природных аминокислот, возможно дополнительно упростить число головных групп для отбора. Можно систематизировать аминокислотные остатки, найденные в природных белковых материалах, как шесть основных классов, предпочтительно применяя в любом одном классе одну аминокислоту, наиболее предпочтительную по сравнению со всеми членами данного класса, благодаря повышенной пространственной гибкости аминокислот в концевом положении головной группы. Это создает эффект значительного снижения суммарного количества аминокислот, требуемых для создания предварительно синтезированного банка конъюгатов, и в результате этого суммарного числа применяемых головных групп. Главные классы аминокислот представлены ниже в таблице 1.
Таблица 1
Обозначение класса Типичные представители  
Гидрофобные Лейцин L
Гидроксильные Серин S
Кислые Глутамат Е
Амидные Глутамин Q
Основные Гистидин Н
Ароматические Тирозин Y
Для выявления активных сочетаний содержащих аминокислоты конъюгатов пригоден ряд подходов.
В одном из осуществлении ограниченное количество конъюгатов применяют для образования набора из отдельных зондов, в котором каждый зонд представляет собой водную суспензию надмолекулярных ассоциатов, причем каждый надмолекулярный ассоциат состоит из смешанных вместе отобранных конъюгатов и отличается от других за счет включения дополнительного различающегося конъюгата как показано ниже, где каждая данная буква представляет собой конъюгат с различными концевыми аминокислотами:
Зонд 1 ABCD
Зонд 2 АВСЕ
Зонд 3 ABCF
Зонд 4 ABCG
...  
...  
Зонд х ABCZ
Каждый из зондов тестировали отдельно с помощью биологических тестов на предмет достаточного связывания, как описано выше.
Во втором простом осуществлении для определения того, какие из головных групп из имеющегося набора являются существенными, а какие из них являются избыточными для исследуемого биологического взаимодействия, можно сконструировать исходный зонд, содержащий большое количество различных конъюгатов из имеющегося набора, и его эффективность может быть сопоставлена с зондами, каждый из которых не содержит отдельный конъюгат. Данный подход проиллюстрирован ниже:
Зонд 1 ABCDE...Z
Зонд 2 ACDE...Z
Зонд 3 ABDE... Z
Зонд х ABCDE...
Допустимы сочетания описанных выше альтернативных подходов.
Созданию подходящего исходного набора могут способствовать знания о лигандемишени. Например, если известно, что лиганд является основным, имело бы смысл придать конъюгатам кислые свойства путем их предоставления в форме, в которой экспонирована свободная карбоксильная группа концевой аминокислоты. Повышенную специфичность может также обеспечить введение дополнительной функциональной группы путем применения конкретной аминокислоты в виде спейсерной группы по соседству с концевой аминокислотой. В тех случаях, когда, например, участие короткой олигопептидной последовательности с известной структурой в связывании с лигандом-мишенью уже было показано, такую последовательность можно включать в конъюгат, входящий в набор конъюгатов, составляющих композицию.
В последнем варианте в настоящем изобретении предлагается способ получения молекулы для взаимодействия с лигандом. Способ включает в себя получение композиции, в соответствии с одним из способов, определяемых выше; выявление по меньшей мере двух головных групп, которые образуют эпитоп для лиганда в композиции; и создание молекулы, включающей в себя функциональные группы по меньшей мере двух головных групп, не обязательно в пространственно отделенных друг от друга одной или более линкерными группами, таким образом, что молекула способна взаимодействовать с лигандом сильнее, чем каждая из головных групп по отдельности.
В то время как композиции согласно настоящему изобретению могут быть сами по себе полезны в системах in vitro или in vivo для возможной индукции биологического ответа в лечебном, профилактическом или диагностическом способе, в некоторых случаях молекула может быть получена на основе структуры указанных выше композиций. Путем выявления функциональных групп, по меньшей мере двух головных групп, которые образуют эпитоп для лиганда, может быть получена новая, аналогичная композиции молекула, содержащая тот же самый или сходный эпитоп. Функциональные группы могут, например, быть включены в единственный неразветвленный олигопептид, возможно, с помощью одной или более линкерных групп для пространственного разделения функциональных групп.
Краткое описание чертежей
Теперь изобретение будет описано с дополнительными подробностями лишь с помощью примера со ссылкой на примеры и прилагаемые чертежи, на которых:
фиг.1 дает схематическое изображение поверхности надмолекулярного ассоциата и то, каким образом такая композиция в соответствии с изобретением связывается с лигандом-мишенью; и
фиг.2 дает схематическое изображение поверхности надмолекулярного ассоциата, состоящего из двух неодинаковых конъюгатов, головные группы которых состоят из короткоцепочечных неразветвленных пептидов.
Подробное описание изобретения
Ссылаясь на фиг.1, часть 1 композиции в соответствии с настоящим изобретением изображена в форме мицелл, в которых головные группы 2 и хвостовые группы 3 совместно образуют конъюгаты 4 (фиг.1А). Лиганд-мишень 5 представлен композиции 1. Поскольку конъюгаты подвижны, происходит реорганизация (фиг.1В), обеспечивающая позиционирование головных групп 2 для связывания лиганда-мишени 5. Ссылаясь на фиг.2, часть композиции согласно настоящему изобретению изображена в форме надмолекулярного ассоциата, в котором связывание лиганда с поверхностью ассоциата вызывается созданием эпитопа, возникающего посредством нековалентной ассоциации двух конъюгатов, состоящих из короткоцепочечных пептидов (А), причем данный эпитоп способен взаимодействовать с лигандом сильнее, чем любой из индивидуальных конъюгатов по отдельности (В). Тот же принцип применим к головным группам, содержащим структуры, отличные от аминокислот.
Примеры
В представленных ниже примерах применяется стандартное однобуквенное обозначение аминокислот, за исключением того, что во всех случаях буква относится к описанным выше конъюгатам, в которых данная конкретная аминокислота находится на конце пептидной цепи. В описанных здесь примерах липид содержит две аминокислоты, соединенные посредством пептидной связи, где обе аминокислоты представляют собой аналоги глицина, в которых в каждом случае водород в положении альфа был заменен неразветвленной углеводородной цепью, содержащей 12 или 14 атомов углерода. Все связи между головной группой и спейсером и между спейсером и липидом осуществляются посредством пептидных связей. Головная группа содержит свободную аминогруппу, а свободный конец липида несет группу CONH2. Структура каждого конъюгата является следующей: NH2-головная группа-спейсер-аминокислота (боковая цепь C14)-аминокислота (боковая цепь C12)-CONH2.
Пример 1. Стимуляция секреции TNF макрофагами
1. Индивидуальные конъюгаты Е, Y, Q, S и Н (присоединенные к липиду посредством серин-глицинового спейсера) были получены в виде растворов в смеси метанол/дихлорметан 1:1 с концентрацией 5 мг/мл.
2. Растворы конъюгатов разливали в 7-мл стеклянные сосуды в равных соотношениях для получения конечного объема 400 мкл (2 мг твердого вещества) во всех сосудах, как показано в таблице к примеру 1. В случаях, когда объем имеющегося органического раствора был незначительным, доведение объема проводили на более поздней стадии, когда, как показано, соответственно снижали объем воды, добавляемой для восстановления.
3. Содержимое всех сосудов высушивали под струей азота, после чего экспонировали в вакууме, составляющем по меньшей мере 1 мбар, в течение ночи в лиофилизаторе.
4. На следующий день добавляли дистиллированную воду в объемах, указанных в таблице к примеру 1, для получения конечной концентрации во всех сосудах 1 мг/мл. Сосуды закрывали крышками, нагревали до 37°С и озвучивали до достижения прозрачности.
5. После этого образцы вносили в лунки 24-луночных кластерных планшет, в которые предварительно помещали клетки клеточной линии макрофагов J774A-1 (5×104 клеток/мл/лунку). В отдельные лунки добавляли образец в объеме 100 мкл и 10 мкл, и клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в атмосфере 5% СО2/воздух.
6. На следующий день отбирали дважды по 50 мкл супернатанта из каждой лунки и измеряли в них концентрацию TNF с помощью тестирования ИФА с поглощением. Полученные результаты показаны в таблице ниже.
Figure 00000002
Figure 00000003
Можно видеть, что некоторые, хотя и не все, сочетания различных головных групп вызывают сильные биологические ответы, что указывает на то, что ответ специфичен по отношению к данным конкретным сочетаниям. Пример иллюстрирует направление, в котором описанные конъюгаты могут быть применены в комбинаторном подходе для выявления эффективных сочетаний с целью индукции желаемого биологического ответа.
Пример 2. Секреция TNF макрофагами
Сравнение надмолекулярных ассоциатор, содержащих смесь конъюгатов, со смесью надмолекулярных ассоциатов, каждый из которых содержит один конъюгат.
Образцы готовили, как описано в примере 1 с включением или без него дополнительных липидных материалов, как описано ниже. Сочетание конъюгатов Y, S и L было выбрано потому, что данное сочетание давало хороший ответ в эксперименте, описанном в примере 1.
Образцы, содержащие фосфатидилхолин, получали при соотношении фосфолипида к конъюгату, равном 2:1 вес/вес.
Образцы, содержащие октилглюкозид, получали при соотношении гликолипида к конъюгату, равном 1:1 вес/вес.
Показанные в таблице ниже результаты представляют собой оптическую плотность при 450 нм ИФА TNF, проведенного на супернатантах 18-часовой культуры. Концентрация конъюгата в лунках составляла 10 мкг/мл
  ОП450 ИФА TNF
EYS 0,390
E+Y+S 0,059
контроль среды 0,000
 
EYS:OG 0,559
(E+Y+S):OG 0,193
контроль OG 0,228
 
EYS: PC 0,320
(E+Y+S):PC 0,130
контроль PC 0,081
Данный пример показывает, что сочетания конъюгатов могут вызывать биологические ответы как в отдельности, так и при их сочетании с другими липидами, такими как фосфолипиды или липосахара. Пример также показывает, что для проявления эффективности важно, чтобы все конъюгаты находились в сочетании в одном надмолекулярном ассоциате, и что активность не наблюдается в том случае, если те же самые конъюгаты присутствуют вместе в одно и то же время, но в разных надмолекулярных ассоциатах. Это позволяет предполагать важность нахождения конъюгатов в близком соседстве друг с другом для обеспечения образования эпитопов, формируемых путем нековалентной ассоциации конъюгатов, которые могут участвовать в специфическом связывании с рецепторами клеточной поверхности.
Пример 3. Повышение перорального захвата
1. Индивидуальные конъюгаты L, S, Е и Q (присоединенные к липиду посредством тирозин-глицинового спейсера) были получены в виде растворов в бензиловом спирте с концентрацией 10 мг/мл.
2. В 7-мл стеклянные сосуды с закручивающимися крышками вносили по 75 мкл 14С-холестеринолеата (3,7 MBq/мл в толуоле) и высушивали под струей азота.
3. 400 мкл каждого из растворов (1) добавляли в один из сосудов (2) и встряхивали в течение ночи при комнатной температуре.
4. Растворы конъюгатов переносили в 7-мл стеклянные сосуды в равных соотношениях для получения конечного объема 80 мкл (0,8 мг твердого вещества) во всех сосудах, как показано в примере ниже
Figure 00000004
5. В каждый из сосудов добавляли по 2 мл дистиллированной воды при перемешивании. Сосуды затем закрывали крышками и озвучивали в течение 20 минут.
6. После этого образцы замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в течение ночи.
7. На следующий день каждый сосуд восстанавливали 2 мл дистиллированной воды и вновь озвучивали до получения прозрачных дисперсий.
8. Образцы вводили с помощью перорального желудочного зонда самкам мышей Balb/c (масса тела 20-25 г - по четыре мыши на группу) в дозе 0,3 мл на животное.
9. Через 45, 90 и 180 минут после введения с помощью пункции хвостовой вены отбирали 75-мкл образцы гепаринизированной крови.
10. Каждый образец разводили в 0,5 мл ЗФР, после чего центрифугировали/ и 0,4 мл супернатанта переносили в сцинтилляционный сосуд, в который при перемешивании добавляли 2 мл Optiphase Hisafe 3 (Wallac).
11. Активность в образцах измеряли на сцинтилляционном счетчике.
Процент захвата определяли, основываясь на объеме крови 2 мл, из которых 1 мл принимался за объем плазмы.
Результаты показаны в таблице ниже.
  % захвата в кровяное русло
  45 мин 90 мин 180 мин
L 0,90 1,39 0,61
S 1,12 1,14 0,81
Е 0,85 1,55 0,79
Q 1,40 3,00 0,81
LS 2,87 2,38 0,66
LE 2,59 2,22 0,49
LQ 5,05 2,15 0,45
SE 4,21 1,66 0,70
SQ 4,67 1,45 0,67
EQ 3,72 2,65 0,59
LSE 1,91 1,20 0,97
LSQ 6,23 1,90 0,80
LEQ 2,77 1,73 0,98
SEQ 3,06 1,52 0,63
LSEQ 2,45 1,74 0,81
Можно видеть, что некоторые, хотя и не все, сочетания различных головных групп повышают захват метки при применении перорального пути, что указывает на то, что ответ специфичен по отношению к данным конкретным сочетаниям. Пример иллюстрирует направление, в котором описанные конъюгаты могут быть применены в комбинаторном подходе для выявления эффективных сочетаний, способных действовать в качестве направляющих для лигандов.
Пример 4. ИФА связывания Fc
1. К 20 мкл ЗФР добавляли 100 мкл IgG козы (1 мг/мл) и 100 мкл переносили в каждую лунку планшета для микротитрования с плоским дном.
2. Планшет инкубировали в течение нескольких дней при 4°С.
3. В 1-мл стеклянных сосудах отвешивали по 2 мг каждого из конъюгатов Y, F, W, L, S, Е, Q и R (каждый из которых был присоединен к липиду посредством серин-глицинового спейсера), и добавляли 200 мкл бензилового спирта для получения растворов каждого конъюгата с концентрацией 10 мг/мл.
4. Растворы переносили в 7-мл стеклянные сосуды с завинчивающимися крышками следующим образом:
Figure 00000005
5. Содержимое каждого сосуда тщательно перемешивали встряхиванием, после чего в каждый сосуд добавляли 1,5 мл дистиллированной воды.
6. Сосуды закрывали крышками и озвучивали в течение пяти минут для получения полностью прозрачных дисперсий.
7. Планшет стадии (2) промывали ЗФР/0,02% Твин 20, после чего проводили блокирование путем инкубации в течение одного часа с 1% БСА в ЗФР (300 мкл/лунку).
8. После этого планшет промывали, как указано выше, и добавляли 100 мкл образца из каждого сосуда стадии (6) в лунки колонки (1), ряды с (1) по (7). Ряд (8) оставляли в качестве контроля в виде холостой пробы.
9. В планшете готовили двойные разведения путем переноса 100 мкл из лунок колонки (1) в соседние лунки того же ряда колонки (2) и перемешивания с последующим переносом 100 мкл в следующую колонку как описано выше, и т.д.
10. Планшет далее инкубировали в течение ночи при 4°С.
11. На следующий день планшет промывали, как описано выше, и в каждую лунку добавляли 100 мкл имеющегося в продаже конъюгата пероксидаза хрена-IgG (разведенного 1/1000 в ЗФР), и инкубировали при комнатной температуре в течение 40 минут.
12. Затем планшет вновь промывали и в каждую лунку добавляли 100 мкл OPD субстрата пероксидазы, и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.
13. В каждую лунку добавляли 20 мкл ЗМ серной кислоты для остановки реакции.
14. Оптическую плотность каждой лунки измеряли при 450 нм на планшетном ридере, и полученные результаты после вычитания фона представлены ниже.
Образец 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
1 YFW 0,001 0,039 0,048 0,053 0,083
2 YFL 1, 504 1, 484 1,325 0,723 0,051
3 YWL 0,803 0,192 0,022 0,023 0,060
4 FWL 1,034 0,778 0,208 0,031 0,034
5 SEQ 0,029 0,041 0,055 0,057 0,091
6 SER 0,013 0,030 0,044 0,062 0,075
7 SQR 0,000 0, 045 0,031 0,054 0,065
Можно видеть, что максимальное связывание достигается в образцах 2, 3 и 4 (т.е. при сочетаниях YFL, YWL и FWL).
Можно видеть, что некоторые, хотя и не все, сочетания различных головных групп вступают в сильные взаимодействия связывания, что указывает на то, что ответ специфичен по отношению к данным конкретным сочетаниям. Пример иллюстрирует направление, в котором описанные конъюгаты могут быть применены в комбинаторном подходе для выявления эффективных сочетаний с целью индукции желаемого взаимодействия связывания.

Claims (31)

1. Композиция для взаимодействия с лигандом, содержащая нековалентную ассоциацию множества отдельных конъюгатов, каждый из которых содержит головную группу и хвостовую группу, причем конъюгаты являются мицеллообразующими, головные группы являются гидрофильными, а хвостовые группы являются липофильными, где хвостовые группы конъюгатов образуют гидрофобный агрегат, и конъюгаты подвижны в ассоциате таким образом, что в присутствии лиганда по меньшей мере две головные группы располагаются таким образом, что образуется эпитоп, способный взаимодействовать с лигандом сильнее, чем каждая из головных групп по отдельности.
2. Композиция по п.1, где каждый конъюгат содержит головную группу, выбранную из аминокислоты или пептида, пептидного аналога, моно- или полисахарида, моно- или полинуклеотида, стерина, водорастворимого витамина, порфирина или ядра гема, хелата иона металла, водорастворимого лекарства, гормона и субстрата фермента.
3. Композиция по п. 2, где каждая головная группа содержит аминокислоту.
4. Композиция по п. 3, где каждая головная группа содержит пептид, включающий в себя аминокислоту.
5. Композиция по п.3 или 4, где головные группы, которые образуют эпитоп, содержат концевые аминокислоты, выбранные по меньшей мере из двух из следующих: гидрофобных аминокислот, гидроксильных аминокислот, кислых аминокислот, амидов аминокислот, основных аминокислот и ароматических аминокислот.
6. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой каждая хвостовая группа является одинаковой или различается и содержит липофильную группу, выбранную из жирной кислоты с линейной или разветвленной цепью, спирта или альдегида, содержащего по меньшей мере 8 атомов углерода, липидного аналога аминокислоты, простагландина, лейкотриена, моно- или диглицерида, стерина, производного сфингозина или керамида и производного такой липофильной группы, замещенного кремнием или галогеном.
7. Композиция по п.6, где каждая липофильная группа содержит жирную кислоту от С10 до С14.
8. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где каждый конъюгат дополнительно содержит спейсерную группу, соединяющую головную группу с хвостовой группой.
9. Композиция по п.8, где спейсерная группа является гидрофильной.
10. Композиция по п.8 или 9, где спейсерная группа содержит аминокислоту, гидроксикислоту, сахар или полиэтиленгликоль.
11. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где нековалентная ассоциация содержит многослойную структуру, мицеллу или липосому.
12. Композиция по любому из предшествующих пунктов для применения в качестве лекарства, профилактического или диагностического средства.
13. Применение конъюгата, содержащего головную группу и хвостовую группу, для получения композиции по любому из предшествующих пунктов.
14. Применение по п.13, где головную группу выбирают из аминокислоты или пептида, пептидного аналога, моно- или полисахарида, моно- или полинуклеотида, стерина, водорастворимого витамина, порфирина или ядра гема, хелата иона металла, водорастворимого лекарства, гормона и субстрата фермента.
15. Применение по п.14, где головная группа содержит аминокислоту.
16. Применение по п.15, где головная группа содержит пептид, содержащий аминокислоту.
17. Применение по п.15 или 16, где аминокислота включает в себя концевую аминокислоту, выбранную из гидрофильных аминокислот, гидроксильных аминокислот, кислых аминокислот, амидов аминокислот, основных аминокислот и ароматических аминокислот.
18. Применение по любому из пп.13-17, где хвостовая группа содержит липофильную группу, выбранную из жирной кислоты с линейной или разветвленной цепью, спирта или альдегида, содержащего по меньшей мере 8 атомов углерода, аналога жирной аминокислоты, простагландина, лейкотриена, моно- или диглицерида, стерина, производного сфингозина или керамида и производного такой липофильной группы, замещенного кремнием или галогеном.
19. Применение по п.18, где липофильная группа включает в себя жирную кислоту от С10 до С14.
20. Применение по любому из пп.13-19, где конъюгат дополнительно включает в себя спейсерную группу, соединяющую головную группу с хвостовой группой.
21. Применение по п.20, где спейсерная группа является гидрофильной.
22. Применение по п.21, где спейсерная группа содержит аминокислоту, гидроксикислоту, сахар или полиэтиленгликоль.
23. Способ получения композиции для взаимодействия с лигандом по п.1, включающий в себя
(a) обеспечение множества различных конъюгатов, где каждый конъюгат содержит головную группу и хвостовую группу, причем конъюгаты являются мицеллообразующими, головные группы являются гидрофильными, а хвостовые группы являются липофильными; и
(b) образование из множества конъюгатов их нековалентного ассоциата, в котором хвостовые группы агрегируют гидрофобным образом и в котором конъюгаты подвижны так, что в присутствии лиганда по меньшей мере две головные группы располагаются таким образом, что образуется эпитоп, способный взаимодействовать с лигандом сильнее, чем каждая из головных групп по отдельности.
24. Способ по п. 23, где каждый конъюгат имеет свойства, указанные в любом из пп.13-22.
25. Способ по п.23 или 24, при котором нековалентный ассоциат содержит многослойную структуру, мицеллу или липосому.
26. Способ по любому из пп.23-25, при котором стадия обеспечения множеством конъюгатов включает в себя
(i) выбор набора конъюгатов с набором головных групп;
(ii) образование из них нековалентного ассоциата, в котором хвостовые группы агрегируют гидрофобным образом и в котором конъюгаты подвижны;
(iii) анализ достаточности взаимодействия между нековалентным ассоциатом и лигандом;
(iv) необязательное повторение стадий с (i) по (iii) с применением набора конъюгатов с модифицированным набором головных групп; и
(v) при выявлении достаточного взаимодействия на стадии (iii) отбор набора конъюгатов в качестве множества конъюгатов на стадии (а).
27. Способ по п.26, при котором набор головных групп содержит (i) по меньшей мере одну концевую аминокислоту из каждого из следующих классов аминокислот: гидрофобных аминокислот, гидроксильных аминокислот, кислых аминокислот и амидов аминокислот; и (ii) по меньшей мере двух дополнительных концевых аминокислот, включающих в себя по меньшей мере одну основную аминокислоту и по меньшей мере одну ароматическую аминокислоту, или по меньшей мере две основные аминокислоты или ароматические аминокислоты.
28. Способ по п.27, при котором модифицированный набор головных групп, применяемых на стадии (iv), включает в себя набор головных групп, применяемых на стадиях с (i) по (iii), в которых по меньшей мере две дополнительные концевые аминокислоты отличны от тех, которые применяются на стадиях с (i) по (iii).
29. Способ по п.26, при котором набор головных групп включает в себя (i) по меньшей мере одну концевую аминокислоту каждого из следующих классов аминокислот: гидрофобных аминокислот, гидроксильных аминокислот, кислых аминокислот, амидов аминокислот, основных аминокислот и ароматических аминокислот.
30. Способ по п.29, где модифицированный набор головных групп, применяемых на стадии (iv), включает в себя набор головных групп, применяемых на стадиях с (i) no (iii), в которых по меньшей мере одна концевая аминокислота одного из классов аминокислот либо отсутствует, либо заменена на ее заряженный вариант.
31. Способ получения молекулы для взаимодействия с лигандом, включающий в себя
(1) получение композиции способом по любому из пп.23-30;
(2) выявление по меньшей мере двух головных групп, которые образуют эпитоп для лиганда в композиции; и
(3) получение молекулы, включающей в себя функциональные группы по меньшей мере двух головных групп, необязательно разделенных в пространстве одной или более линкерными группами таким образом, что молекула способна взаимодействовать с лигандом сильнее, чем каждая из головных групп по отдельности.
RU2002101927/15A 1999-06-28 2000-06-27 Эпитопы, образованные нековалентным связыванием конъюгатов RU2259194C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9915074.0A GB9915074D0 (en) 1999-06-28 1999-06-28 Ligand-binding composition
GB9915074.0 1999-06-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2002101927A RU2002101927A (ru) 2003-09-10
RU2259194C2 true RU2259194C2 (ru) 2005-08-27

Family

ID=10856190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2002101927/15A RU2259194C2 (ru) 1999-06-28 2000-06-27 Эпитопы, образованные нековалентным связыванием конъюгатов

Country Status (18)

Country Link
US (2) US7413538B1 (ru)
EP (2) EP1190255B1 (ru)
JP (1) JP4754136B2 (ru)
KR (1) KR100917285B1 (ru)
CN (1) CN100354628C (ru)
AT (2) ATE371190T1 (ru)
AU (1) AU775310B2 (ru)
BR (1) BR0012002A (ru)
CA (1) CA2377783C (ru)
DE (2) DE60036106T2 (ru)
DK (1) DK1190255T3 (ru)
ES (1) ES2292446T3 (ru)
GB (1) GB9915074D0 (ru)
HK (1) HK1045369A1 (ru)
IL (2) IL147249A0 (ru)
PT (1) PT1190255E (ru)
RU (1) RU2259194C2 (ru)
WO (1) WO2001001140A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2496789C2 (ru) * 2006-09-20 2013-10-27 Лексикон Лимитед Пептиды
RU2500813C1 (ru) * 2012-10-15 2013-12-10 Федеральное казенное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ получения липосомально-иммунопероксидазного конъюгата

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7504364B2 (en) 2002-03-01 2009-03-17 Receptors Llc Methods of making arrays and artificial receptors
WO2005003326A2 (en) * 2003-03-28 2005-01-13 Receptors Llc. Artificial receptors including reversibly immobilized building blocks and methods
US7469076B2 (en) 2003-09-03 2008-12-23 Receptors Llc Sensors employing combinatorial artificial receptors
US7504365B2 (en) 2004-09-03 2009-03-17 Receptors Llc Combinatorial artificial receptors including tether building blocks
WO2006029383A2 (en) 2004-09-11 2006-03-16 Receptors Llc Combinatorial artificial receptors including peptide building blocks
KR100840619B1 (ko) * 2006-12-19 2008-06-24 한양대학교 산학협력단 표면개질된 리포좀, 이를 포함하는 바이오칩 및 그제조방법
WO2009090650A2 (en) * 2008-01-16 2009-07-23 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Vaccine for alzheimer's disease
EP2391370B1 (en) 2009-02-02 2015-06-03 Galmed Research and Development Ltd. Methods and compositions for treating alzheimer's disease
KR101491728B1 (ko) * 2012-12-14 2015-02-11 주식회사 휴메딕스 비타민 c와 비타민 b3의 컨쥬게이트 및 그를 포함하는 항산화제

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6024964A (en) 1985-06-24 2000-02-15 Hoechst Aktiengesellschaft Membrane anchor/active compound conjugate, its preparation and its uses
US6074650A (en) 1985-06-24 2000-06-13 Hoechst Aktiengesellschaft Membrane anchor/active compound conjugate, its preparation and its uses
DE3813821A1 (de) * 1988-04-22 1989-11-02 Hoechst Ag Synthetische vakzine gegen die maul- und klauenseuche und verfahren zu deren herstellung
DE3546150A1 (de) * 1985-06-24 1987-01-22 Hoechst Ag Membrananker-wirkstoffkonjugat, seine herstellung sowie seine verwendung
JP3220180B2 (ja) * 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
DK0548024T3 (da) * 1991-12-19 1997-01-27 Ciba Geigy Ag Aminosulfonsyrederivater samt fremgangsmåder til deres fremstilling
WO1993022343A1 (en) * 1992-05-01 1993-11-11 The Rockfeller University Multiple antigen peptide system having adjuvant properties and vaccines prepared therefrom
GB9215780D0 (en) * 1992-07-24 1992-09-09 Univ London Pharmacy Peptide compounds
JP2579730B2 (ja) * 1993-01-22 1997-02-12 株式会社ディ・ディ・エス研究所 ペプチド−脂質誘導体及びリポソーム
HUT73100A (en) * 1993-07-16 1996-06-28 Harvard College Regulated apoptosis
JP3759759B2 (ja) * 1994-03-04 2006-03-29 日本油脂株式会社 リポソームおよび薬物運搬体
EP0706799B1 (en) * 1994-09-16 2001-11-14 MERCK PATENT GmbH Immunoconjugates II
US6214388B1 (en) * 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5741899A (en) * 1995-02-02 1998-04-21 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptors comprising janus kinase for regulating cellular pro liferation
US5851536A (en) * 1995-11-22 1998-12-22 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
US6344436B1 (en) * 1996-01-08 2002-02-05 Baylor College Of Medicine Lipophilic peptides for macromolecule delivery
WO1997049425A1 (en) * 1996-06-25 1997-12-31 Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Vaccine comprising antigens bound to carriers through labile bonds
JPH10234372A (ja) * 1997-02-27 1998-09-08 Boehringer Mannheim Corp キメラ受容体を有する細胞とその作成方法、並びに その利用
US6217886B1 (en) * 1997-07-14 2001-04-17 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Materials and methods for making improved micelle compositions
FR2774687B1 (fr) * 1998-02-06 2002-03-22 Inst Nat Sante Rech Med Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon gamma, et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques
FR2776926B1 (fr) * 1998-04-07 2003-10-24 Inst Nat Sante Rech Med Lipopeptides inducteurs de cytotoxicite t lymphocytaire portant au moins un epitope t auxiliaire, et leurs utilisations pour la vaccination
CA2327367A1 (en) * 1998-04-07 1999-10-14 Roche Diagnostics Gmbh New compounds for dna-transfection
WO2000054807A1 (fr) * 1999-03-17 2000-09-21 Mitsubishi Chemical Corporation Complexe lie par un ligand
WO2000061114A1 (fr) * 1999-04-08 2000-10-19 Mitsubishi Chemical Corporation Particules fines ciblant des cellules, et procede de production correspondant
IL146055A0 (en) * 1999-04-23 2002-07-25 Alza Corp Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
AU766570B2 (en) * 1999-04-23 2003-10-16 Mitsubishi Chemical Corporation Antibody and polyalkylene glycol-bonded liposome

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2496789C2 (ru) * 2006-09-20 2013-10-27 Лексикон Лимитед Пептиды
RU2500813C1 (ru) * 2012-10-15 2013-12-10 Федеральное казенное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ получения липосомально-иммунопероксидазного конъюгата

Also Published As

Publication number Publication date
KR100917285B1 (ko) 2009-09-11
DE60036106T2 (de) 2008-05-15
ATE457460T1 (de) 2010-02-15
PT1190255E (pt) 2007-09-18
CN1359469A (zh) 2002-07-17
EP1190255A1 (en) 2002-03-27
JP4754136B2 (ja) 2011-08-24
AU5692300A (en) 2001-01-31
CN100354628C (zh) 2007-12-12
JP2003503424A (ja) 2003-01-28
EP1190255B1 (en) 2007-08-22
EP1722227A2 (en) 2006-11-15
EP1722227A3 (en) 2007-02-28
EP1722227B1 (en) 2010-02-10
CA2377783C (en) 2010-03-23
DE60036106D1 (de) 2007-10-04
IL147249A0 (en) 2002-08-14
US7413538B1 (en) 2008-08-19
IL147249A (en) 2007-08-19
DE60043830D1 (de) 2010-03-25
ES2292446T3 (es) 2008-03-16
WO2001001140A1 (en) 2001-01-04
ATE371190T1 (de) 2007-09-15
US20080152703A1 (en) 2008-06-26
BR0012002A (pt) 2002-03-12
CA2377783A1 (en) 2001-01-04
GB9915074D0 (en) 1999-08-25
HK1045369A1 (en) 2002-11-22
DK1190255T3 (da) 2007-12-10
KR20020042537A (ko) 2002-06-05
AU775310B2 (en) 2004-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20080152703A1 (en) Epitopes formed by non-covalent association of conjugates
AU580136B2 (en) A second-step virus binding receptor
CN101970460B (zh) 功能性脂类构造物
JPH01503464A (ja) インフルエンザウイルスの感染の診断及び予防のための合成ペプチド並びにそれらの使用
Grogan et al. Synthesis of lipidated green fluorescent protein and its incorporation in supported lipid bilayers
HU195620B (en) Process for producing conjugates with immunogenic effect and built up from haptenes and muramylpeptides and pharmaceutics comprising these conjugates
Rubas et al. Incorporation of the reovirus M cell attachment protein into small unilamellar vesicles: incorporation efficiency and binding capability to L929 cells in vitro
Hossany et al. Synthesis and immunochemical characterization of protein conjugates of carbohydrate and carbohydrate-mimetic peptides as experimental vaccines
JPH05506657A (ja) マクロファージ活性化用組成物
WO2023093303A1 (zh) 靶向p53的多肽及其在制备用于治疗癌症的药物中的应用
JP2010540488A (ja) 糖タンパク質及びグリコシル化細胞及びそれらの調製方法
Sims et al. Avanti lipid tools: connecting lipids, technology, and cell biology
AU2007298717B2 (en) Peptides
CN107530438A (zh) Pll用于改善溶液中分子的稳定性的用途
EP4123307A1 (en) Methods for structure determination and drug design using salipro particles
WO2023001912A1 (en) Methods for structure determination and drug design using salipro particles
US20220096391A1 (en) Unidirectional presentation of membrane proteins in nanoparticle-supported liposomes
CN116947967A (zh) 靶向hdac5的多肽及其在制备治疗或预防个体肿瘤的制剂上的应用
Freie ed-Coil P

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Invention patent assignment

Effective date: 20060811

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20110628

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20140910

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150628