ES2292446T3 - Formas epitopes para asociacion no-covalente de conjugados. - Google Patents

Abstract

Un método para el escrutinio de composiciones para la interacción con un ligando diana, cuyo método comprende: (a) proporcionar una pluralidad de distintos conjugados, comprendiendo cada conjugado un grupo cabeza y un grupo cola, en donde los conjugados son formadores de micelas, los grupos cabeza son hidrofílicos y los grupos cola son lipofílicos; y (b) formar de la pluralidad de conjugados una asociación no covalente de los mismos, la cual comprende una micela, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente y en la cual los conjugados son movibles, de tal forma que, en presencia de un ligando, al menos dos de los grupos cabeza son posicionados adecuadamente para formar un epítope capaz de interactuar con el ligando con más fuerza que lo haría cada uno de los grupos cabeza por separado, en donde la fase de facilitamiento de la pluralidad de conjugados comprende: (i) seleccionar un grupo de conjugados con un conjunto de grupos cabeza; (ii) formar una asociación no covalente de los mismos, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente y en la cual los conjugados son movibles; (iii) someter a ensayo para determinar la interacción entre la asociación no covalente y el ligando; (iv) repetir opcionalmente las fases (i) a (iii) utilizando un grupo de conjugados con un conjunto modificado de grupos cabeza; y (v) encontrando la interacción en la fase (iii), seleccionar el grupo de conjugados como la pluralidad de conjugados en la fase (a).

Description

Formas epítopes para asociación no-covalente de conjugados.

La presente invención está relacionada con un método de escrutinio de una composición para la interacción con un ligando.

Antecedentes de la invención

Se sabe que usualmente los receptores proteínicos se unen a sus ligandos diana por medio de epítopes, los cuales constituyen una pequeña parte de la molécula proteínica completa. Para una unión o interacción máximas, la estructura del epítope precisa de ser mantenida en una conformación rígida, con el fin de formar un sitio de unión conteniendo próximos entre sí todos los componentes necesarios del epítope. Los intentos para producir un péptido análogo, construido únicamente con los aminoácidos que comprenden el sitio de unión, fallan a menudo, debido a que estos péptidos no poseen la misma actividad biológica que el receptor proteínico. Esto es atribuido a que el péptido posee una conformación distinta en solución libre a la del receptor proteínico completo. Además, donde el sitio de unión de una proteína es construido con oligopéptidos procedentes de partes distintas, no contiguas, de una cadena proteínica, la mezcla de oligopéptidos aislados en solución libre no da como resultado la reconstitución del sitio de unión activo.

El estar constreñidos a utilizar tales proteínas grandes para presentar epítopes de sitio de unión da lugar a varios problemas a la hora de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas específicas para receptores. Uno de los problemas es que tales proteínas grandes pueden fácilmente evocar una respuesta inmune. Un segundo problema es que las cadenas peptídicas largas son susceptibles de ser atacadas por endopeptidasas, tales como las existentes en el lumen del intestino. Finalmente, estas proteínas grandes pueden ser caras en cuanto a su producción, purificación y mantenimiento en forma estable.

La US-A-5.882.645 revela un sistema de anclaje basado en un aminoácido lipídico, el cual puede aumentar en gran medida la antigenicidad de un péptido sintético corto. Este documento proporciona también un proceso para la producción de estos compuestos por medio de síntesis peptídica secuencial, preferiblemente por síntesis peptídica secuencial en fase sólida.

La EP-A-0338437 revela una vacuna sintética contra la enfermedad de pie y boca, producida por medio del conjugado de, al menos, un compuesto de anclaje a membrana con, al menos, una secuencia parcial de una proteína del virus de la enfermedad de pie y boca.

La US-A-5.580.563 revela un sistema peptídico antigénico múltiple que comprende un núcleo dendrítico y un péptido, y un resto de anclaje lipofílico. Esta combinación posee la ventaja de que elimina la necesidad de incluir adyuvantes, de los cuales se ha descubierto que son tóxicos para los humanos, y facilita la amplificación exponencial del potencial antigénico de una vacuna preparada del mismo, ya que es posible la amplificación no covalente en forma liposómica o micelar.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida a superar las desventajas que presentan los precedentes en este campo.

En un primer aspecto, la invención proporciona un método para el escrutinio de composiciones que interaccionan con un ligando diana, cuyo método comprende:

(a) proporcionar una pluralidad de conjugados diferentes, comprendiendo cada conjugado un grupo cabeza y un grupo cola, en donde los conjugados son formadores de micelas, los grupos cabeza son hidrofílicos y los grupos cola son lipofílicos; y (b) formar con la pluralidad de conjugados una asociación no covalente de los mismos, la cual comprende una micela, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente, y en la cual los conjugados son movibles de tal forma que, en presencia de un ligando, al menos dos de los grupos cabeza se encuentran adecuadamente posicionados para formar un epítope capaz de interactuar con el ligando de una manera más fuerte que cada uno de los grupos cabeza individualmente, en donde la fase de proporcionar una pluralidad de conjugados comprende:

(i)

seleccionar un grupo de conjugados con un conjunto de grupos cabeza;

(ii)

formar una asociación no covalente de los mismos, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente, y en la cual los conjugados son movibles;

(iii)

someter a ensayo para determinar la interacción entre la asociación no covalente y el ligando;

(iv)

repetir opcionalmente las fases (i) a (iii) utilizando un grupo de conjugados con un conjunto modificado de grupos cabeza; y

(v)

si se encuentra interacción en la fase (iii), seleccionar el grupo de conjugados como la pluralidad de conjugados de la fase (a).

Cada conjugado es, preferiblemente, conforme se define más abajo.

En el método de la presente invención, la composición para interactuar con un ligando comprende una asociación no covalente, la cual comprende una micela de una pluralidad de conjugados distintos, comprendiendo cada conjugado un grupo cabeza y un grupo cola, en donde los grupos cola de los conjugados son formadores de micela y los conjugados poseen libertad de movimiento entre sí dentro de la asociación de tal forma que, en presencia de un ligando, al menos dos de los grupos cabeza (los cuales son el mismo o diferente) se encuentran posicionados adecuadamente para formar un epítope capaz de interactuar con el ligando más fuertemente que lo haría cada uno de los grupos cabeza individualmente. Los grupos cabeza son hidrofílicos y los grupos cola lipofílicos, e.g. están compuestos de cadenas de hidrocarburo, halofílicas, construidas con cadenas de fluorocarbono, o con base de silano.

Al construir conjugados con un grupo cabeza y un grupo cola de acuerdo con la presente invención, los grupos cola pueden asociarse para formar un agregado hidrofóbico, el cual es una micela, en la cual los conjugados se encuentran orientados, por lo que los grupos cabeza se aproximan entre sí cuando se encuentran en una fase acuosa. Debido a que los conjugados son movibles dentro de la asociación, los grupos cabeza son capaces de adoptar un número de posiciones distintas dentro de la asociación. Los grupos cabeza -los cuales usualmente no son idénticos- son por lo tanto libres de moverse dentro de la asociación y, sorprendentemente, de interactuar cooperando para inducir consecuencias biológicas, las cuales los grupos cabeza no son capaces de provocar cuando se encuentran solos. Un descubrimiento inesperado adicional es que las asociaciones compuestas por combinaciones de diferentes grupos cabeza son capaces de provocar respuestas biológicas, o de participar en la unión con receptores biológicos, mientras que las asociaciones compuestas por grupos cabeza únicos no son capaces de actuar de esta forma.

Conforme es indicado anteriormente, estas asociaciones son usualmente de naturaleza particulada o coloidal, comprendiendo usualmente muchos cientos de subunidades (los conjugados) todas ellas orientadas con los grupos cabeza dirigidos hacia fuera desde el centro de la partícula, conforme es mostrado en la Figura 1a. Cada uno de los conjugados puede cambiar su situación dentro de la asociación, siendo libre de intercambiar puesto con los conjugados adyacentes por medio de un proceso de movimiento browniano y, de esta forma, pueden migrar por toda la superficie de la asociación. Otras manifestaciones de asociaciones son las fases cúbicas y las superficies revestidas.

Cada conjugado en la asociación puede tener un grupo cabeza seleccionado de entre una clase química o biológica, o un número de clases diferentes, tales como un aminoácido o péptido; un análogo peptídico; un mono-, di- o polisacárido; un mono-, di- o polinucleótido; un esterol; un alcaloide; un isoprenoide; un derivado de inositol; un núcleo aromático fusionado o individual; una vitamina soluble en agua; un núcleo de porfirina o hemo; una ftalocianina; un ión metálico quelado; un fármaco soluble en agua; una hormona; o un sustrato enzimático.

En una realización preferida, cada grupo cabeza comprende un aminoácido u oligopéptido, el cual puede ser la parte terminal de una cadena peptídica. Es deseable mantener la longitud del péptido en un mínimo, con el fin de evitar provocar una respuesta inmune cuando la composición va a ser utilizada in vivo. Por consiguiente, se prefiere que el péptido no tenga más de 6 aminoácidos de longitud.

Los aminoácidos utilizados pueden ser cualquiera de los aminoácidos naturales, derivados sustituidos, análogos y formas D de los mismos.

Los grupos cola de los conjugados pueden ser todos el mismo, o pueden ser una mezcla de diferentes grupos cola, cada uno de los cuales comprende un grupo lipofílico seleccionado de entre un constructo lineal, ramificado, cíclico, policíclico, saturado o insaturado, con o sin heteroátomos incluidos en la estructura, el cual puede ser sustituido o insustituido, por ejemplo, un análogo de aminoácido lipídico; una prostaglandina; un leucotrieno; un mono- o diglicérido; un esterol; un derivado de esfingosina o ceramida; y una silicona o derivado sustituido con halógeno de un grupo hidrofóbico de este tipo. El grupo cola posee, preferiblemente, de 6 a 24 átomos de carbono y, más preferiblemente, comprende de 10 a 14 átomos de carbono. Puede encontrarse presente más de un grupo cola en cada conjugado. Por ejemplo, pueden formar parte de cada conjugado uno o más aminoácidos lipídicos con cadenas laterales de hidrocarbono, ligados a uno o más aminoácidos en el grupo cabeza.

Puede ser utilizado cualquier método químico para ligar el grupo cabeza al grupo cola. Por ejemplo, cada conjugado puede comprender adicionalmente un grupo espaciador ligando el grupo cabeza con el grupo cola, con el fin de facilitar la presentación del grupo cabeza sobre la superficie de la asociación no covalente. Tales grupos espaciadores son de sobra conocidos e incluyen, por ejemplo, aminoácidos, hidroxiácidos, azúcares y polietileno glicol.

La composición sometida a escrutinio por medio del método de la presente invención puede ser utilizada como un medicamento, un profiláctico o un diagnóstico.

Una ventaja de la composición es que pueden ser conseguidas fuertes interacciones de unión específica con los conjugados en los que los grupos cabeza sean pequeños en comparación con los receptores biológicos convencionales. Si el grupo cabeza es un oligopéptido, por ejemplo, entonces la longitud de la cadena peptídica no excedería normalmente de diez aminoácidos y, preferiblemente, sería de seis o menos. Por consiguiente, las composiciones pueden ser preparadas con una inmunogenicidad mucho menor que sus contrapartidas proteínicas.

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La composición puede ser formulada no solo para interactuar con un ligando in vitro, sino que la composición también puede ser utilizada in vivo, siendo formulada opcionalmente con un diluyente, excipiente o portador adecuados, conforme a una ruta de administración adecuada.

Los conjugados pueden ser dispersados en fase acuosa por medio de una variedad de metodologías conocidas para la preparación de vesículas lipídicas, incluyendo la mezcla mecánica, la exposición a altas fuerzas de corte, la sonicación, la dispersión en solvente o la codisolución con detergentes. Usualmente, las asociaciones no covalentes formadas de esta manera estarán compuestas de varios conjugados diferentes mezclados entre sí. Pueden ser añadidos opcionalmente materiales lipídicos adicionales con el fin de alterar las propiedades de la superficie, para ayudar en la dispersión de los conjugados, para estabilizar la asociación no covalente de conjugados, para ayudar en la presentación de los grupos cabeza de los conjugados, o para permitir la construcción de vehículos que puedan ser convertidos en diana por los epítopes formados en base al movimiento aleatorio de los conjugados y al adecuado posicionamiento de los grupos cabeza dentro de la asociación.

La fase de facilitamiento de la pluralidad de conjugados incluye el sometimiento a ensayo para determinar la interacción entre la asociación no covalente y el ligando.

Ejemplos de ensayos para determinar la "interacción" suficiente pueden incluir ensayos de unión tales como aquéllos que utilizan el principio ELISA para la detección de asociación entre anticuerpo y antígeno. Otros ensayos adecuados in vitro incluyen la modificación de fluorescencia de sondas fluorescentes unidas a membrana respetuosas con el medio ambiente, reacciones de precipitación, aumento o inhibición de actividad enzimática, etc. Los ensayos que se basan en la habilidad de los materiales para alterar el comportamiento de células cultivadas in vitro pueden ser también adecuados, tales como ensayos para determinar la muerte celular, la proliferación celular, la apoptosis, la inhibición o estimulación de contacto célula con célula, la secreción de citoquinas o de otros productos solubles, la síntesis de ARNm específico, el transporte vesicular intracelular, la alteración de los procesos señalizadores en la célula, etc. Pueden ser llevados también a cabo ensayos in vivo en animales o humanos, por ejemplo por medio de la incorporación de radiomarcaje en los ensamblajes supramoleculares, seguido de la investigación de su subsiguiente distribución después de la administración a través de varias rutas.

Conforme al método de la presente invención es utilizado un enfoque combinatorio, en el cual es preparado un rango de distintas asociaciones no covalentes (o "sondas"), cada una de ellas conteniendo una combinación diferente de conjugados seleccionados de entre un banco sintetizado previamente. La selección de los conjugados adecuados puede basarse en las propiedades conocidas del ligando diana, o simplemente puede comprender la utilización de un rango muy amplio de grupos cabeza, con el fin de incrementar la probabilidad de que dos o más de los grupos cabeza formen un epítope para el ligando. De esta manera, siguiendo el ensayo para determinar una interacción suficiente entre la sonda y el ligando, conforme es indicado más arriba, la combinación de conjugados que se encuentre más efectiva puede ser modificada añadiendo grupos cabeza adicionales, retirando algunos de los grupos cabeza, o ambas cosas, y sometiendo a ensayo las sondas resultantes de nuevo para determinar una interacción suficiente. Finalmente, la combinación más favorable de grupos cabeza puede ser identificada y seleccionada para su utilización en la composición.

Por lo tanto, la presente invención presenta una ventaja muy clara sobre la química combinatoria tradicional. En la química combinatoria, la identificación de la secuencia más favorable para la unión a un receptor específico debe ser llevada a cabo por medio de la síntesis de cientos de combinaciones posibles de diferentes grupos, tales como los aminoácidos, en diferentes órdenes, cada uno de ellos teniendo que ser sometido a prueba para determinar su eficacia. Este proceso requiere de mucho tiempo, es caro y se ve limitado por la naturaleza de la química que puede ser llevada a cabo en el ligado de los diferentes componentes. En cambio, la presente invención simplemente se basa en la proximidad de los grupos cabeza para proporcionar epítopes derivados de la asociación. Una vez que un grupo de conjugados ha sido sintetizado, no se precisa de química sintética adicional, únicamente es necesario mezclar simplemente los conjugados para formar las diferentes sondas por medio de asociación no covalente.

En una realización simple preferida, el presente método utiliza conjugados que poseen un único aminoácido terminal ligado por medio de un espaciador a un grupo cola lipídico, que puede ser combinado simplemente mezclándose en medio acuoso para formar micelas, en las cuales serían presentadas a la vez distintas cadenas laterales de aminoácidos en una multiplicidad de distintas configuraciones. Por consiguiente, se evita la necesidad de presentar los aminoácidos en un orden específico, o con un espaciado u orientación específicos. Estadísticamente, una proporción de las subunidades aminoacídicas individuales estará asociada siempre en una configuración ideal.

En una colocación, cada uno de los conjugados presentaría la estructura lineal: X-espaciador-espaciador-lípido-lípido, donde X representa un único aminoácido diferente para cada uno de los distintos conjugados empleados.

Cuando se busca construir epítopes compuestos de aminoácidos naturales, es posible simplificar adicionalmente el número de grupos cabeza a seleccionar. Se pueden categorizar los residuos aminoacídicos encontrados en materiales proteináceos naturales en seis clases fundamentales, usando preferiblemente en cualquiera de las clases un aminoácido en lugar de todos los miembros de esa clase, debido al incremento en flexibilidad espacial de los aminoácidos en la posición terminal del grupo cabeza. Esto tiene el efecto de reducir considerablemente el número total de aminoácidos que se precisan para construir el banco sintetizado previamente de conjugados y, de este modo, el número total de grupos cabeza utilizados. Las clases principales de aminoácidos son indicadas en la Tabla 1 más abajo.

TABLA 1

Clase	Representante	Abreviatura
Hidrofóbico	Leucina	L
Hidroxílico	Serina	S
Acídico	Glutamato	E
Amida	Glutamina	Q
Básico	Histidina	H
Aromático	Tirosina	Y

Se encuentran disponibles un número de estrategias para identificar combinaciones activas de conjugados conteniendo aminoácidos.

En una realización, es utilizado un número restringido de conjugados con el fin de formar un rango de distintas sondas, donde cada sonda es una suspensión acuosa de ensamblajes supramoleculares, consistiendo cada ensamblaje en conjugados seleccionados mezclados entre sí, y cada uno de ellos difiriendo de los demás como resultado de la inclusión de un conjugado adicional diferente, conforme es mostrado más abajo, donde cada una de las letras dadas representa un conjugado con un aminoácido terminal diferente:

Sonda 1	A B C	D
Sonda 2	A B C	E
Sonda 3	A B C	F
Sonda 3	A B C	G
............
............
Sonda x	A B C	Z

Cada una de las sondas es testada por separado en los ensayos biológicos para determinar la unión suficiente, conforme es descrito más arriba.

En una segunda realización simple, puede ser construida una sonda inicial, la cual contiene un gran número de distintos conjugados del banco, siendo comparada su eficacia con sondas a las que les falta a cada una de ellas por turno un conjugado diferente, con el fin de determinar cuales de los grupos cabeza en el banco son esenciales, y cuales sobran en cuanto a la interacción biológica en estudio. Este enfoque es ilustrado más abajo:

Sonda 1	A B C D E	. . .	Z
Sonda 2	A C D E	. . .	Z
Sonda 3	A B D E	. . .	Z
............
Sonda x	A B C D E	. . .

Pueden ser preparadas combinaciones de los enfoques alternativos, conforme es descrito más arriba.

Puede ayudar un conocimiento del ligando diana a la hora de diseñar un grupo de inicio adecuado. Por ejemplo, si se sabe que el ligando es básico, tendría sentido el impartir un carácter acídico a los conjugados, presentándoles en la forma donde se encuentre expuesto un grupo carboxilo libre del aminoácido terminal. El introducir funcionalidad adicional por medio del empleo de un aminoácido determinado, como un grupo espaciador adyacente al aminoácido terminal, puede conferir también un aumento de la especificidad. Donde una secuencia oligopéptida corta, de estructura conocida, se ha visto implicada en la unión al ligando diana, tal secuencia puede ser incorporada a un conjugado a ser incluido en el grupo de conjugados que forman la composición.

La composición proporcionada en el método de la presente invención puede ser utilizada en un método para producir una molécula que interactúa con un ligando. El método comprende la producción de una composición conforme a uno de los métodos definidos más arriba; la identificación de, al menos, los dos grupos cabeza que forman un epítope para el ligando en la composición; y la producción de una molécula que incorpore los grupos funcionales de, al menos, los dos grupos cabeza, opcionalmente espaciados entre sí por uno o más grupos ligandos, de tal modo que la molécula sea capaz de interactuar con el ligando con mayor fuerza que lo haría cada uno de los grupos cabeza individualmente.

Aunque las composiciones utilizadas en el método de la presente invención pueden ser útiles por sí mismas en sistemas in vitro o in vivo, quizás para inducir una respuesta biológica en un método terapéutico, profiláctico o diagnóstico, en algunas circunstancias una molécula puede ser producida basándose en la estructura de las anteriores composiciones. Por medio de la identificación de los grupos funcionales de, al menos, los dos grupos cabeza que forman el epítope para el ligando, puede ser producida una nueva molécula análoga a la composición, conteniendo el mismo epítope o uno similar. Los grupos funcionales pueden ser incorporados, por ejemplo, a un único oligopéptido lineal, posiblemente con uno o más grupos ligando para espaciar entre sí los grupos funcionales.

Breve descripción de los dibujos

La invención será descrita ahora con mayor detalle, únicamente a modo de ejemplo, en relación con lo siguientes Ejemplos y los dibujos anexos, en los cuales:

La Figura 1 muestra una representación esquemática de la superficie de un ensamblaje supramolecular, y de cómo una composición tal, utilizada en el método conforme a la presente invención, se une a un ligando diana; y

La Figura 2 muestra una representación esquemática de la superficie de un ensamblaje supramolecular, compuesto de dos conjugados no idénticos, cuyos grupos cabeza consisten en péptidos lineales de cadena corta.

Descripción detallada de la invención

En relación con la Figura 1, es mostrada una sección 1 de una composición utilizada en el método conforme a la presente invención, en forma de una micela, en la cual los grupos cabeza 2 y los grupos cola 3 forman juntos los conjugados 4 (Fig. 1A). Un ligando diana 5 es presentado a la composición 1. Debido a que los conjugados son movibles, tiene lugar un reagrupamiento (Fig. 1B) con el fin de permitir el posicionamiento de los grupos cabeza 2 para unirse al ligando diana 5.

En relación con la Figura 2, es mostrada una sección de una composición, utilizada en el método conforme a la presente invención, en forma de un ensamblaje supramolecular, en el cual la unión de un ligando a la superficie del ensamblaje se consigue a través de la creación de un epítope construido por medio de la asociación no covalente de dos conjugados compuestos de péptidos de cadena corta (A), siendo capaz este epítope de interactuar con el ligando con mayor fuerza que lo haría ninguno de los conjugados individuales aislados (B). Los mismos principios son de aplicación para los grupos cabeza que contienen estructuras distintas de las aminoacídicas.

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Ejemplos

En los ejemplos dados más abajo, es utilizado el modo estándar de representación de aminoácidos por medio de letras individuales del alfabeto, a excepción de que en todos los casos la letra se refiere a los conjugados, conforme son descritos más arriba, en los cuales ese aminoácido determinado ocupa la posición terminal en la cadena peptídica. En los ejemplos aquí descritos, el lípido comprende dos aminoácidos ligados por medio de una unión peptídica, en la cual los dos aminoácidos son análogos de la glicina, donde en cada caso el hidrógeno alfa ha sido reemplazado por una cadena de hidrocarbono lineal conteniendo 12 o 14 carbonos. Las uniones entre el grupo cabeza y el espaciador, y el espaciador y el lípido son todas ellas a través de uniones peptídicas. El grupo cabeza lleva un grupo amino libre, y el extremo libre del lípido lleva un grupo CONH_{2}. De esta forma, la estructura de cada conjugado es: NH_{2}-grupo cabeza-espaciador-aminoácido (cadena lateral C_{14})-aminoácido (cadena lateral C_{12})-CONH_{2}.

Ejemplo 1 Estimulación de secreción TNF en los macrófagos

1.

Fueron preparados los conjugados individuales E, Y, Q, S & H (ligados a lípido por medio de un espaciador de serina-glicina) como soluciones en metanol/diclorometano 1:1, en una concentración de 5 mg/ml.

2.

Las soluciones de los conjugados fueron dispensadas en viales de vidrio de 7 ml en proporciones iguales, para proporcionar un volumen final de 400 ul (2 mg de sólido) en todos los viales, conforme es mostrado en el ejemplo más adelante. En los casos donde el volumen de solución orgánica disponible fue insuficiente, fue hecho un ajuste en una fase posterior, cuando la cantidad de agua añadida para la reconstitución fue reducida conforme a ello, según es mostrado.

3.

Los contenidos de todos los viales fueron secados bajo una corriente de nitrógeno, a continuación expuestos a un vacío de, al menos, 1 mbar durante la noche en un liofilizador.

4.

Al día siguiente, fue añadida agua destilada en volúmenes, conforme es indicado en la tabla a continuación, para proporcionar una concentración final en todos los viales de 1 mg/ml. Los viales fueron tapados, calentados hasta los 37ºC y sometido a sonicación en baño hasta que se consiguió que se volvieran transparentes.

5.

A continuación, las muestras fueron aplicadas a pocillos de multiplacas de 24 pocillos, en los cuales habían sido colocadas células de la línea celular macrófaga J774A-1 (5 x 10^{4} células/ml/pocillo). Fueron añadidos volúmenes de 100 ul y 10 ul de muestra a los pocillos individuales, y las células fueron incubadas durante la noche a 37ºC en una atmósfera de 5% CO_{2}/aire.

6.

Al día siguiente, fueron tomados volúmenes duplicados de 50 ul de sobrenadante de cada pocillo y medidos para determinar la concentración de TNF en un método ELISA de captura. Los resultados obtenidos son mostrados en la tabla más abajo.

1

2

Puede apreciarse que algunas, aunque no todas, las combinaciones de los diferentes grupos cabeza desencadenan fuertes respuestas biológicas, indicando que la respuesta es específica para aquéllas combinaciones en particular. El ejemplo ilustra la manera en la que los conjugados descritos pueden ser utilizados en el enfoque combinatorio para identificar combinaciones eficaces, con el fin de provocar una respuesta biológica deseada.

Ejemplo 2 Secreción de TNF por los macrófagos Comparación de ensamblajes supramoleculares conteniendo una mezcla de conjugados con una mezcla de ensamblajes supramoleculares conteniendo cada uno de ellos un único conjugado

Las muestras fueron preparadas conforme es descrito en el Ejemplo 1, con o sin la inclusión de materiales lipídicos adicionales, según es descrito más abajo. Fue escogida la combinación de los conjugados Y, S y L, debido a que esta combinación funcionó bien en el experimento descrito en el Ejemplo 1.

Fueron preparadas sondas conteniendo fosfatidil colina, en una proporción de fosfolípido y conjugado de 2:1 peso/peso.

Fueron preparadas sondas conteniendo octil glucósido, en una proporción de glicolípido y conjugado de 1:1 peso/peso.

Los resultados mostrados en la tabla más abajo son densidades ópticas a 450 nm de los ELISAs TNF llevados a cabo en sobrenadantes de cultivo de 18 horas. La concentración del conjugado en los pocillos fue de 10 ug/ml.

3

Este ejemplo muestra que las combinaciones de los conjugados pueden provocar respuestas biológicas bien cuando están presentes por separado, o cuando están presentes en conjunción con otros lípidos, tales como fosfolípidos o azúcares lípidos. También muestra que para que se manifieste su eficacia, es importante para todos los conjugados el que se encuentren presentes en combinación en el mismo ensamblaje supramolecular, y no se observa actividad si los mismos conjugados son presentados juntos al mismo tiempo, pero separados en diferentes ensamblajes supramoleculares. Esto sugiere que es importante presentar los conjugados cercanos entre sí, con el fin de permitir la formación de epítopes formados por medio de la asociación no covalente de los conjugados, los cuales pueden participar en la unión específica con los receptores de la superficie celular.

Ejemplo 3 Mejora de la Absorción Oral

1.

Fueron preparados los conjugados individuales L, S, E & Q (conjugados con lípido por medio de un espaciador de tirosina-glicina) como soluciones en alcohol de bencilo, en una concentración de 10 mg/ml.

2.

Fueron dispensadas 75 ul de ^{14}C-oleato de colesterol (3,7 MBq/ml en tolueno) en cuatro viales de vidrio tapados a rosca de 7 ml, y secados bajo una corriente de nitrógeno.

3.

Fueron añadidas 400 ul de cada una de las soluciones en (1) a uno de los viales en (2) y fueron agitados durante la noche a temperatura ambiente.

4.

Las soluciones de los conjugados fueron dispensadas en viales de vidrio de 7 ml en proporciones iguales, para proporcionar un volumen final de 80 ul (0,8 mg de sólido) en todos los viales, conforme es mostrado en el ejemplo más abajo.

4

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5.

Fueron añadidos 2 ml de agua destilada a cada uno de los viales agitando en vórtex. A continuación, los viales fueron tapados y sometidos a sonicación por baño durante 20 minutos.

6.

Las muestras fueron congeladas entonces en nitrógeno líquido y liofilizadas durante la noche.

7.

Al día siguiente, cada vía fue reconstituido con 2 ml de agua destilada y sometido de nuevo a sonicación hasta que fueron conseguidas dispersiones transparentes.

8.

Las muestras fueron administradas por medio de alimentación por sonda oral a ratones hembra Balb/c (20-25 g de peso - cuatro ratones por grupo) en una dosis de 0,3 ml por animal.

9.

Fueron tomadas muestras sanguíneas heparinizadas de 75 ul por medio de pinchazo en la vena de la cola a los 45, 90 y 180 minutos de la administración.

10.

Cada muestra fue diluida en 0,5 ml de PBS, la cual fue entonces centrifugada, y fueron transferidos 0,4 ml del sobrenadante a un vial de escintilación, al cual le fueron añadidos mezclándolos 2 ml de Optiphase Hisafe 3 (Wallac).

11.

Fue medida la actividad en las muestras en un contador de escintilación.

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El porcentaje de absorción fue estimado sobre la base de un volumen sanguíneo de 2 ml, de los cuales se asumió que 1 ml era plasma.

Los resultados son mostrados en la tabla más abajo.

5

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Puede apreciarse que algunas de las combinaciones, pero no todas, de los diferentes grupos cabeza aumentan la absorción del marcador a través de la ruta oral, indicando que la respuesta es específica de aquéllas combinaciones en particular. El ejemplo ilustra la manera en la cual los conjugados descritos pueden ser utilizados en el enfoque combinatorio, con el fin de identificar las combinaciones eficaces capaces de actuar como los ligandos diana.

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Ejemplo 4 ELISA de unión Fc

1.

Fueron añadidas 100 ul de IgG de cabra (1 mg/ml) a 20 ml de PBS y fueron colocadas 100 ul en cada pocillo de una placa de microtítulos de fondo plano.

2.

La placa fue incubada durante varios días a +4ºC.

3.

Fueron pesados 2 mg de cada uno de los conjugados Y, F, W, L, S, E, Q & R (cada uno ligado a lípido por medio de un espaciador de serina-glicina) y depositados en viales de vidrio de 1 ml, y fueron añadidas 200 ul de alcohol de bencilo para proporcionar soluciones de cada conjugado en una concentración de 10 mg/ml.

4.

Las soluciones fueron dispensadas en viales de vidrio tapados a rosca de 7 ml, conforme sigue:

6

5.

Los contenidos de cada vial fueron bien mezclados por medio de agitado en vórtex, a continuación fueron añadidos a cada vial 1,5 ml de agua destilada.

6.

Los viales fueron tapados y sometidos a sonicación por baño durante cinco minutos para proporcionar dispersiones transparentes.

7.

La placa de la fase (2) fue lavada en PBS/0,02% Tween 20 y, a continuación, bloqueada por medio de incubación durante una hora con BSA 1% en PBS (300 ul/pocillo).

8.

A continuación, la placa fue lavada igual que antes, y fueron añadidas 100 ul de muestra de cada uno de los viales de la fase (6) a los pocillos en la columna (1) de las filas (1) a (7). La fila (8) fue dejada como un control en blanco.

9.

Fueron realizadas diluciones dobles en toda la placa por medio de la transferencia de 100 ul de los pocillos en la columna (1) al pocillo adyacente de la misma fila en la columna (2) y mezclándolos, a continuación, transfiriendo 100 ul a la siguiente columna igual que antes, etc.

10.

La placa fue incubada entonces durante la noche a +4ºC.

11.

Al día siguiente, la placa fue lavada igual que antes y fueron añadidas 100 ul del conjugado comercial IgG-peroxidasa de rábano picante (diluido 1/1000 en PBS) a cada pocillo, y fue incubada a temperatura ambiente durante 40 minutos.

12.

A continuación, la placa fue lavada de nuevo, y fueron añadidas 100 ul de sustrato OPD para peroxidasa a cada pocillo, y fueron incubados a temperatura ambiente durante 30 minutos.

13.

Entonces fueron añadidas 20 ul de ácido sulfúrico 3M a cada pocillo para detener la reacción.

14.

Fue medida la densidad óptica de cada uno de los pocillos a 450 nm en un lector de placa, y los resultados obtenidos después del ajuste del fondo, son recogidos más abajo.

7

Puede apreciarse que la unión máxima es conseguida con las muestras 2, 3 y 4 (ie, combinaciones YFL, YWL y FWL).

Puede apreciarse que algunas de las combinaciones, pero no todas, de los diferentes grupos cabeza entran en fuertes interacciones de unión, indicando que la respuesta es específica de aquéllas combinaciones en particular. El ejemplo ilustra la manera en la cual los conjugados descritos pueden ser utilizados en el enfoque combinatorio, con el fin de identificar las combinaciones eficaces a efectos de provocar una interacción de unión deseada.

Claims (15)

1. Un método para el escrutinio de composiciones para la interacción con un ligando diana, cuyo método comprende:

(a) proporcionar una pluralidad de distintos conjugados, comprendiendo cada conjugado un grupo cabeza y un grupo cola, en donde los conjugados son formadores de micelas, los grupos cabeza son hidrofílicos y los grupos cola son lipofílicos; y

(b) formar de la pluralidad de conjugados una asociación no covalente de los mismos, la cual comprende una micela, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente y en la cual los conjugados son movibles, de tal forma que, en presencia de un ligando, al menos dos de los grupos cabeza son posicionados adecuadamente para formar un epítope capaz de interactuar con el ligando con más fuerza que lo haría cada uno de los grupos cabeza por separado, en donde la fase de facilitamiento de la pluralidad de conjugados comprende:

(i)

seleccionar un grupo de conjugados con un conjunto de grupos cabeza;

(ii)

formar una asociación no covalente de los mismos, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente y en la cual los conjugados son movibles;

(iii)

someter a ensayo para determinar la interacción entre la asociación no covalente y el ligando;

(iv)

repetir opcionalmente las fases (i) a (iii) utilizando un grupo de conjugados con un conjunto modificado de grupos cabeza; y

(v)

encontrando la interacción en la fase (iii), seleccionar el grupo de conjugados como la pluralidad de conjugados en la fase (a).

2. Un método conforme a la reivindicación 1, en donde cada conjugado posee un grupo cabeza seleccionado de entre: un aminoácido o péptido; un análogo peptídico; un mono- o polisacárido; un mono- o polinucleótido; un esterol; una vitamina soluble en agua; un núcleo de porfirina o hemo; un ión metálico quelado; un fármaco soluble en agua; una hormona y un sustrato enzimático.

3. Un método conforme a la reivindicación 2, en donde cada grupo cabeza comprende un aminoácido.

4. Un método conforme a la reivindicación 3, en donde cada grupo cabeza comprende un péptido comprendiendo el aminoácido.

5. Un método conforme a la reivindicación 3 o a la reivindicación 4, en donde los grupos cabeza que forman el epítope comprenden aminoácidos terminales seleccionados de entre, al menos, dos de los siguientes: aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos hidroxílicos, aminoácidos acídicos, aminoácidos amida, aminoácidos básicos y aminoácidos aromáticos.

6. Un método conforme a reivindicación 3 o a la reivindicación 4, en donde el aminoácido es seleccionado de entre aminoácidos naturales, derivados sustituidos, análogos y formas D de los mismos.

7. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada grupo cola es el mismo o diferente, y comprende un grupo lipofílico seleccionado de entre un ácido graso, alcohol o aldehído de cadena recta o ramificada, poseyendo, al menos, 8 átomos de carbono; un análogo de aminoácido lipídico; una prostaglandina; un leucotrieno; un mono- o diglicérido; un esterol; un derivado de esfingosina o ceramida; y una silicona o derivado sustituido con halógeno de un grupo lipofílico de este tipo.

8. Un método conforme a la reivindicación 7, en donde cada grupo lipofílico comprende un hidrocarbono C_{10} a C_{14}.

9. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada conjugado comprende adicionalmente un grupo espaciador ligando el grupo cabeza al grupo cola.

10. Un método conforme a la reivindicación 9, en donde el grupo espaciador es hidrofílico.

11. Un método conforme a la reivindicación 9 o a la reivindicación 10, en donde el grupo espaciador es seleccionado de entre aminoácidos, hidroxiácidos, azúcares y glicol de polietileno.

12. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 11, en donde cada uno de los conjugados presenta la estructura: x-espaciador-espaciador-lípido-lípido, en la cual x representa un aminoácido único, diferente en cada uno de los conjugados utilizados.

13. Un método conforme a la reivindicación 1, en donde cada conjugado incluye uno o más aminoácidos lipídicos, los cuales poseen una cadena lateral comprendiendo el hidrocarbono C_{10} a C_{14}.

14. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la asociación no covalente comprende adicionalmente material lipídico adicional.

15. Un método conforme a la reivindicación 14, en donde el material lipídico adicional comprende un fosfolípido o un azúcar lípido.