ES2292446T3 - Formas epitopes para asociacion no-covalente de conjugados. - Google Patents
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Abstract
Un método para el escrutinio de composiciones para la interacción con un ligando diana, cuyo método comprende: (a) proporcionar una pluralidad de distintos conjugados, comprendiendo cada conjugado un grupo cabeza y un grupo cola, en donde los conjugados son formadores de micelas, los grupos cabeza son hidrofílicos y los grupos cola son lipofílicos; y (b) formar de la pluralidad de conjugados una asociación no covalente de los mismos, la cual comprende una micela, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente y en la cual los conjugados son movibles, de tal forma que, en presencia de un ligando, al menos dos de los grupos cabeza son posicionados adecuadamente para formar un epítope capaz de interactuar con el ligando con más fuerza que lo haría cada uno de los grupos cabeza por separado, en donde la fase de facilitamiento de la pluralidad de conjugados comprende: (i) seleccionar un grupo de conjugados con un conjunto de grupos cabeza; (ii) formar una asociación no covalente de los mismos, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente y en la cual los conjugados son movibles; (iii) someter a ensayo para determinar la interacción entre la asociación no covalente y el ligando; (iv) repetir opcionalmente las fases (i) a (iii) utilizando un grupo de conjugados con un conjunto modificado de grupos cabeza; y (v) encontrando la interacción en la fase (iii), seleccionar el grupo de conjugados como la pluralidad de conjugados en la fase (a).
Description
Formas epítopes para asociación
no-covalente de conjugados.
La presente invención está relacionada con un
método de escrutinio de una composición para la interacción con un
ligando.
Se sabe que usualmente los receptores
proteínicos se unen a sus ligandos diana por medio de epítopes, los
cuales constituyen una pequeña parte de la molécula proteínica
completa. Para una unión o interacción máximas, la estructura del
epítope precisa de ser mantenida en una conformación rígida, con el
fin de formar un sitio de unión conteniendo próximos entre sí todos
los componentes necesarios del epítope. Los intentos para producir
un péptido análogo, construido únicamente con los aminoácidos que
comprenden el sitio de unión, fallan a menudo, debido a que estos
péptidos no poseen la misma actividad biológica que el receptor
proteínico. Esto es atribuido a que el péptido posee una
conformación distinta en solución libre a la del receptor proteínico
completo. Además, donde el sitio de unión de una proteína es
construido con oligopéptidos procedentes de partes distintas, no
contiguas, de una cadena proteínica, la mezcla de oligopéptidos
aislados en solución libre no da como resultado la reconstitución
del sitio de unión activo.
El estar constreñidos a utilizar tales proteínas
grandes para presentar epítopes de sitio de unión da lugar a varios
problemas a la hora de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas
específicas para receptores. Uno de los problemas es que tales
proteínas grandes pueden fácilmente evocar una respuesta inmune. Un
segundo problema es que las cadenas peptídicas largas son
susceptibles de ser atacadas por endopeptidasas, tales como las
existentes en el lumen del intestino. Finalmente, estas proteínas
grandes pueden ser caras en cuanto a su producción, purificación y
mantenimiento en forma estable.
La
US-A-5.882.645 revela un sistema de
anclaje basado en un aminoácido lipídico, el cual puede aumentar en
gran medida la antigenicidad de un péptido sintético corto. Este
documento proporciona también un proceso para la producción de
estos compuestos por medio de síntesis peptídica secuencial,
preferiblemente por síntesis peptídica secuencial en fase
sólida.
La EP-A-0338437
revela una vacuna sintética contra la enfermedad de pie y boca,
producida por medio del conjugado de, al menos, un compuesto de
anclaje a membrana con, al menos, una secuencia parcial de una
proteína del virus de la enfermedad de pie y boca.
La
US-A-5.580.563 revela un sistema
peptídico antigénico múltiple que comprende un núcleo dendrítico y
un péptido, y un resto de anclaje lipofílico. Esta combinación
posee la ventaja de que elimina la necesidad de incluir adyuvantes,
de los cuales se ha descubierto que son tóxicos para los humanos, y
facilita la amplificación exponencial del potencial antigénico de
una vacuna preparada del mismo, ya que es posible la amplificación
no covalente en forma liposómica o micelar.
La presente invención está dirigida a superar
las desventajas que presentan los precedentes en este campo.
En un primer aspecto, la invención proporciona
un método para el escrutinio de composiciones que interaccionan con
un ligando diana, cuyo método comprende:
(a) proporcionar una pluralidad de conjugados
diferentes, comprendiendo cada conjugado un grupo cabeza y un grupo
cola, en donde los conjugados son formadores de micelas, los grupos
cabeza son hidrofílicos y los grupos cola son lipofílicos; y (b)
formar con la pluralidad de conjugados una asociación no covalente
de los mismos, la cual comprende una micela, en la cual los grupos
cola se agregan hidrofóbicamente, y en la cual los conjugados son
movibles de tal forma que, en presencia de un ligando, al menos dos
de los grupos cabeza se encuentran adecuadamente posicionados para
formar un epítope capaz de interactuar con el ligando de una manera
más fuerte que cada uno de los grupos cabeza individualmente, en
donde la fase de proporcionar una pluralidad de conjugados
comprende:
- (i)
- seleccionar un grupo de conjugados con un conjunto de grupos cabeza;
- (ii)
- formar una asociación no covalente de los mismos, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente, y en la cual los conjugados son movibles;
- (iii)
- someter a ensayo para determinar la interacción entre la asociación no covalente y el ligando;
- (iv)
- repetir opcionalmente las fases (i) a (iii) utilizando un grupo de conjugados con un conjunto modificado de grupos cabeza; y
- (v)
- si se encuentra interacción en la fase (iii), seleccionar el grupo de conjugados como la pluralidad de conjugados de la fase (a).
Cada conjugado es, preferiblemente, conforme se
define más abajo.
En el método de la presente invención, la
composición para interactuar con un ligando comprende una asociación
no covalente, la cual comprende una micela de una pluralidad de
conjugados distintos, comprendiendo cada conjugado un grupo cabeza
y un grupo cola, en donde los grupos cola de los conjugados son
formadores de micela y los conjugados poseen libertad de movimiento
entre sí dentro de la asociación de tal forma que, en presencia de
un ligando, al menos dos de los grupos cabeza (los cuales son el
mismo o diferente) se encuentran posicionados adecuadamente para
formar un epítope capaz de interactuar con el ligando más
fuertemente que lo haría cada uno de los grupos cabeza
individualmente. Los grupos cabeza son hidrofílicos y los grupos
cola lipofílicos, e.g. están compuestos de cadenas de hidrocarburo,
halofílicas, construidas con cadenas de fluorocarbono, o con base de
silano.
Al construir conjugados con un grupo cabeza y un
grupo cola de acuerdo con la presente invención, los grupos cola
pueden asociarse para formar un agregado hidrofóbico, el cual es una
micela, en la cual los conjugados se encuentran orientados, por lo
que los grupos cabeza se aproximan entre sí cuando se encuentran en
una fase acuosa. Debido a que los conjugados son movibles dentro de
la asociación, los grupos cabeza son capaces de adoptar un número
de posiciones distintas dentro de la asociación. Los grupos cabeza
-los cuales usualmente no son idénticos- son por lo tanto libres de
moverse dentro de la asociación y, sorprendentemente, de interactuar
cooperando para inducir consecuencias biológicas, las cuales los
grupos cabeza no son capaces de provocar cuando se encuentran
solos. Un descubrimiento inesperado adicional es que las
asociaciones compuestas por combinaciones de diferentes grupos
cabeza son capaces de provocar respuestas biológicas, o de
participar en la unión con receptores biológicos, mientras que las
asociaciones compuestas por grupos cabeza únicos no son capaces de
actuar de esta forma.
Conforme es indicado anteriormente, estas
asociaciones son usualmente de naturaleza particulada o coloidal,
comprendiendo usualmente muchos cientos de subunidades (los
conjugados) todas ellas orientadas con los grupos cabeza dirigidos
hacia fuera desde el centro de la partícula, conforme es mostrado en
la Figura 1a. Cada uno de los conjugados puede cambiar su situación
dentro de la asociación, siendo libre de intercambiar puesto con
los conjugados adyacentes por medio de un proceso de movimiento
browniano y, de esta forma, pueden migrar por toda la superficie de
la asociación. Otras manifestaciones de asociaciones son las fases
cúbicas y las superficies revestidas.
Cada conjugado en la asociación puede tener un
grupo cabeza seleccionado de entre una clase química o biológica, o
un número de clases diferentes, tales como un aminoácido o péptido;
un análogo peptídico; un mono-, di- o polisacárido; un mono-, di- o
polinucleótido; un esterol; un alcaloide; un isoprenoide; un
derivado de inositol; un núcleo aromático fusionado o individual;
una vitamina soluble en agua; un núcleo de porfirina o hemo; una
ftalocianina; un ión metálico quelado; un fármaco soluble en agua;
una hormona; o un sustrato enzimático.
En una realización preferida, cada grupo cabeza
comprende un aminoácido u oligopéptido, el cual puede ser la parte
terminal de una cadena peptídica. Es deseable mantener la longitud
del péptido en un mínimo, con el fin de evitar provocar una
respuesta inmune cuando la composición va a ser utilizada in
vivo. Por consiguiente, se prefiere que el péptido no tenga más
de 6 aminoácidos de longitud.
Los aminoácidos utilizados pueden ser cualquiera
de los aminoácidos naturales, derivados sustituidos, análogos y
formas D de los mismos.
Los grupos cola de los conjugados pueden ser
todos el mismo, o pueden ser una mezcla de diferentes grupos cola,
cada uno de los cuales comprende un grupo lipofílico seleccionado de
entre un constructo lineal, ramificado, cíclico, policíclico,
saturado o insaturado, con o sin heteroátomos incluidos en la
estructura, el cual puede ser sustituido o insustituido, por
ejemplo, un análogo de aminoácido lipídico; una prostaglandina; un
leucotrieno; un mono- o diglicérido; un esterol; un derivado de
esfingosina o ceramida; y una silicona o derivado sustituido con
halógeno de un grupo hidrofóbico de este tipo. El grupo cola posee,
preferiblemente, de 6 a 24 átomos de carbono y, más
preferiblemente, comprende de 10 a 14 átomos de carbono. Puede
encontrarse presente más de un grupo cola en cada conjugado. Por
ejemplo, pueden formar parte de cada conjugado uno o más aminoácidos
lipídicos con cadenas laterales de hidrocarbono, ligados a uno o más
aminoácidos en el grupo cabeza.
Puede ser utilizado cualquier método químico
para ligar el grupo cabeza al grupo cola. Por ejemplo, cada
conjugado puede comprender adicionalmente un grupo espaciador
ligando el grupo cabeza con el grupo cola, con el fin de facilitar
la presentación del grupo cabeza sobre la superficie de la
asociación no covalente. Tales grupos espaciadores son de sobra
conocidos e incluyen, por ejemplo, aminoácidos, hidroxiácidos,
azúcares y polietileno glicol.
La composición sometida a escrutinio por medio
del método de la presente invención puede ser utilizada como un
medicamento, un profiláctico o un diagnóstico.
Una ventaja de la composición es que pueden ser
conseguidas fuertes interacciones de unión específica con los
conjugados en los que los grupos cabeza sean pequeños en comparación
con los receptores biológicos convencionales. Si el grupo cabeza es
un oligopéptido, por ejemplo, entonces la longitud de la cadena
peptídica no excedería normalmente de diez aminoácidos y,
preferiblemente, sería de seis o menos. Por consiguiente, las
composiciones pueden ser preparadas con una inmunogenicidad mucho
menor que sus contrapartidas proteínicas.
\newpage
La composición puede ser formulada no solo para
interactuar con un ligando in vitro, sino que la composición
también puede ser utilizada in vivo, siendo formulada
opcionalmente con un diluyente, excipiente o portador adecuados,
conforme a una ruta de administración adecuada.
Los conjugados pueden ser dispersados en fase
acuosa por medio de una variedad de metodologías conocidas para la
preparación de vesículas lipídicas, incluyendo la mezcla mecánica,
la exposición a altas fuerzas de corte, la sonicación, la
dispersión en solvente o la codisolución con detergentes.
Usualmente, las asociaciones no covalentes formadas de esta manera
estarán compuestas de varios conjugados diferentes mezclados entre
sí. Pueden ser añadidos opcionalmente materiales lipídicos
adicionales con el fin de alterar las propiedades de la superficie,
para ayudar en la dispersión de los conjugados, para estabilizar la
asociación no covalente de conjugados, para ayudar en la
presentación de los grupos cabeza de los conjugados, o para permitir
la construcción de vehículos que puedan ser convertidos en diana
por los epítopes formados en base al movimiento aleatorio de los
conjugados y al adecuado posicionamiento de los grupos cabeza dentro
de la asociación.
La fase de facilitamiento de la pluralidad de
conjugados incluye el sometimiento a ensayo para determinar la
interacción entre la asociación no covalente y el ligando.
Ejemplos de ensayos para determinar la
"interacción" suficiente pueden incluir ensayos de unión tales
como aquéllos que utilizan el principio ELISA para la detección de
asociación entre anticuerpo y antígeno. Otros ensayos adecuados
in vitro incluyen la modificación de fluorescencia de sondas
fluorescentes unidas a membrana respetuosas con el medio ambiente,
reacciones de precipitación, aumento o inhibición de actividad
enzimática, etc. Los ensayos que se basan en la habilidad de los
materiales para alterar el comportamiento de células cultivadas
in vitro pueden ser también adecuados, tales como ensayos
para determinar la muerte celular, la proliferación celular, la
apoptosis, la inhibición o estimulación de contacto célula con
célula, la secreción de citoquinas o de otros productos solubles,
la síntesis de ARNm específico, el transporte vesicular
intracelular, la alteración de los procesos señalizadores en la
célula, etc. Pueden ser llevados también a cabo ensayos in
vivo en animales o humanos, por ejemplo por medio de la
incorporación de radiomarcaje en los ensamblajes supramoleculares,
seguido de la investigación de su subsiguiente distribución después
de la administración a través de varias rutas.
Conforme al método de la presente invención es
utilizado un enfoque combinatorio, en el cual es preparado un rango
de distintas asociaciones no covalentes (o "sondas"), cada una
de ellas conteniendo una combinación diferente de conjugados
seleccionados de entre un banco sintetizado previamente. La
selección de los conjugados adecuados puede basarse en las
propiedades conocidas del ligando diana, o simplemente puede
comprender la utilización de un rango muy amplio de grupos cabeza,
con el fin de incrementar la probabilidad de que dos o más de los
grupos cabeza formen un epítope para el ligando. De esta manera,
siguiendo el ensayo para determinar una interacción suficiente
entre la sonda y el ligando, conforme es indicado más arriba, la
combinación de conjugados que se encuentre más efectiva puede ser
modificada añadiendo grupos cabeza adicionales, retirando algunos
de los grupos cabeza, o ambas cosas, y sometiendo a ensayo las
sondas resultantes de nuevo para determinar una interacción
suficiente. Finalmente, la combinación más favorable de grupos
cabeza puede ser identificada y seleccionada para su utilización en
la composición.
Por lo tanto, la presente invención presenta una
ventaja muy clara sobre la química combinatoria tradicional. En la
química combinatoria, la identificación de la secuencia más
favorable para la unión a un receptor específico debe ser llevada a
cabo por medio de la síntesis de cientos de combinaciones posibles
de diferentes grupos, tales como los aminoácidos, en diferentes
órdenes, cada uno de ellos teniendo que ser sometido a prueba para
determinar su eficacia. Este proceso requiere de mucho tiempo, es
caro y se ve limitado por la naturaleza de la química que puede ser
llevada a cabo en el ligado de los diferentes componentes. En
cambio, la presente invención simplemente se basa en la proximidad
de los grupos cabeza para proporcionar epítopes derivados de la
asociación. Una vez que un grupo de conjugados ha sido sintetizado,
no se precisa de química sintética adicional, únicamente es
necesario mezclar simplemente los conjugados para formar las
diferentes sondas por medio de asociación no covalente.
En una realización simple preferida, el presente
método utiliza conjugados que poseen un único aminoácido terminal
ligado por medio de un espaciador a un grupo cola lipídico, que
puede ser combinado simplemente mezclándose en medio acuoso para
formar micelas, en las cuales serían presentadas a la vez distintas
cadenas laterales de aminoácidos en una multiplicidad de distintas
configuraciones. Por consiguiente, se evita la necesidad de
presentar los aminoácidos en un orden específico, o con un espaciado
u orientación específicos. Estadísticamente, una proporción de las
subunidades aminoacídicas individuales estará asociada siempre en
una configuración ideal.
En una colocación, cada uno de los conjugados
presentaría la estructura lineal:
X-espaciador-espaciador-lípido-lípido,
donde X representa un único aminoácido diferente para cada uno de
los distintos conjugados empleados.
Cuando se busca construir epítopes compuestos de
aminoácidos naturales, es posible simplificar adicionalmente el
número de grupos cabeza a seleccionar. Se pueden categorizar los
residuos aminoacídicos encontrados en materiales proteináceos
naturales en seis clases fundamentales, usando preferiblemente en
cualquiera de las clases un aminoácido en lugar de todos los
miembros de esa clase, debido al incremento en flexibilidad espacial
de los aminoácidos en la posición terminal del grupo cabeza. Esto
tiene el efecto de reducir considerablemente el número total de
aminoácidos que se precisan para construir el banco sintetizado
previamente de conjugados y, de este modo, el número total de
grupos cabeza utilizados. Las clases principales de aminoácidos son
indicadas en la Tabla 1 más abajo.
Clase | Representante | Abreviatura |
Hidrofóbico | Leucina | L |
Hidroxílico | Serina | S |
Acídico | Glutamato | E |
Amida | Glutamina | Q |
Básico | Histidina | H |
Aromático | Tirosina | Y |
Se encuentran disponibles un número de
estrategias para identificar combinaciones activas de conjugados
conteniendo aminoácidos.
En una realización, es utilizado un número
restringido de conjugados con el fin de formar un rango de distintas
sondas, donde cada sonda es una suspensión acuosa de ensamblajes
supramoleculares, consistiendo cada ensamblaje en conjugados
seleccionados mezclados entre sí, y cada uno de ellos difiriendo de
los demás como resultado de la inclusión de un conjugado adicional
diferente, conforme es mostrado más abajo, donde cada una de las
letras dadas representa un conjugado con un aminoácido terminal
diferente:
Sonda 1 | A B C | D |
Sonda 2 | A B C | E |
Sonda 3 | A B C | F |
Sonda 3 | A B C | G |
............ | ||
............ | ||
Sonda x | A B C | Z |
Cada una de las sondas es testada por separado
en los ensayos biológicos para determinar la unión suficiente,
conforme es descrito más arriba.
En una segunda realización simple, puede ser
construida una sonda inicial, la cual contiene un gran número de
distintos conjugados del banco, siendo comparada su eficacia con
sondas a las que les falta a cada una de ellas por turno un
conjugado diferente, con el fin de determinar cuales de los grupos
cabeza en el banco son esenciales, y cuales sobran en cuanto a la
interacción biológica en estudio. Este enfoque es ilustrado más
abajo:
Sonda 1 | A B C D E | . . . | Z |
Sonda 2 | A C D E | . . . | Z |
Sonda 3 | A B D E | . . . | Z |
............ | |||
Sonda x | A B C D E | . . . |
Pueden ser preparadas combinaciones de los
enfoques alternativos, conforme es descrito más arriba.
Puede ayudar un conocimiento del ligando diana a
la hora de diseñar un grupo de inicio adecuado. Por ejemplo, si se
sabe que el ligando es básico, tendría sentido el impartir un
carácter acídico a los conjugados, presentándoles en la forma donde
se encuentre expuesto un grupo carboxilo libre del aminoácido
terminal. El introducir funcionalidad adicional por medio del
empleo de un aminoácido determinado, como un grupo espaciador
adyacente al aminoácido terminal, puede conferir también un aumento
de la especificidad. Donde una secuencia oligopéptida corta, de
estructura conocida, se ha visto implicada en la unión al ligando
diana, tal secuencia puede ser incorporada a un conjugado a ser
incluido en el grupo de conjugados que forman la composición.
La composición proporcionada en el método de la
presente invención puede ser utilizada en un método para producir
una molécula que interactúa con un ligando. El método comprende la
producción de una composición conforme a uno de los métodos
definidos más arriba; la identificación de, al menos, los dos grupos
cabeza que forman un epítope para el ligando en la composición; y
la producción de una molécula que incorpore los grupos funcionales
de, al menos, los dos grupos cabeza, opcionalmente espaciados entre
sí por uno o más grupos ligandos, de tal modo que la molécula sea
capaz de interactuar con el ligando con mayor fuerza que lo haría
cada uno de los grupos cabeza individualmente.
Aunque las composiciones utilizadas en el método
de la presente invención pueden ser útiles por sí mismas en
sistemas in vitro o in vivo, quizás para inducir una
respuesta biológica en un método terapéutico, profiláctico o
diagnóstico, en algunas circunstancias una molécula puede ser
producida basándose en la estructura de las anteriores
composiciones. Por medio de la identificación de los grupos
funcionales de, al menos, los dos grupos cabeza que forman el
epítope para el ligando, puede ser producida una nueva molécula
análoga a la composición, conteniendo el mismo epítope o uno
similar. Los grupos funcionales pueden ser incorporados, por
ejemplo, a un único oligopéptido lineal, posiblemente con uno o más
grupos ligando para espaciar entre sí los grupos funcionales.
La invención será descrita ahora con mayor
detalle, únicamente a modo de ejemplo, en relación con lo siguientes
Ejemplos y los dibujos anexos, en los cuales:
La Figura 1 muestra una representación
esquemática de la superficie de un ensamblaje supramolecular, y de
cómo una composición tal, utilizada en el método conforme a la
presente invención, se une a un ligando diana; y
La Figura 2 muestra una representación
esquemática de la superficie de un ensamblaje supramolecular,
compuesto de dos conjugados no idénticos, cuyos grupos cabeza
consisten en péptidos lineales de cadena corta.
En relación con la Figura 1, es mostrada una
sección 1 de una composición utilizada en el método conforme a la
presente invención, en forma de una micela, en la cual los grupos
cabeza 2 y los grupos cola 3 forman juntos los conjugados 4 (Fig.
1A). Un ligando diana 5 es presentado a la composición 1. Debido a
que los conjugados son movibles, tiene lugar un reagrupamiento
(Fig. 1B) con el fin de permitir el posicionamiento de los grupos
cabeza 2 para unirse al ligando diana 5.
En relación con la Figura 2, es mostrada una
sección de una composición, utilizada en el método conforme a la
presente invención, en forma de un ensamblaje supramolecular, en el
cual la unión de un ligando a la superficie del ensamblaje se
consigue a través de la creación de un epítope construido por medio
de la asociación no covalente de dos conjugados compuestos de
péptidos de cadena corta (A), siendo capaz este epítope de
interactuar con el ligando con mayor fuerza que lo haría ninguno de
los conjugados individuales aislados (B). Los mismos principios son
de aplicación para los grupos cabeza que contienen estructuras
distintas de las aminoacídicas.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos dados más abajo, es utilizado el
modo estándar de representación de aminoácidos por medio de letras
individuales del alfabeto, a excepción de que en todos los casos la
letra se refiere a los conjugados, conforme son descritos más
arriba, en los cuales ese aminoácido determinado ocupa la posición
terminal en la cadena peptídica. En los ejemplos aquí descritos, el
lípido comprende dos aminoácidos ligados por medio de una unión
peptídica, en la cual los dos aminoácidos son análogos de la
glicina, donde en cada caso el hidrógeno alfa ha sido reemplazado
por una cadena de hidrocarbono lineal conteniendo 12 o 14 carbonos.
Las uniones entre el grupo cabeza y el espaciador, y el espaciador
y el lípido son todas ellas a través de uniones peptídicas. El
grupo cabeza lleva un grupo amino libre, y el extremo libre del
lípido lleva un grupo CONH_{2}. De esta forma, la estructura de
cada conjugado es: NH_{2}-grupo
cabeza-espaciador-aminoácido (cadena
lateral C_{14})-aminoácido (cadena lateral
C_{12})-CONH_{2}.
- 1.
- Fueron preparados los conjugados individuales E, Y, Q, S & H (ligados a lípido por medio de un espaciador de serina-glicina) como soluciones en metanol/diclorometano 1:1, en una concentración de 5 mg/ml.
- 2.
- Las soluciones de los conjugados fueron dispensadas en viales de vidrio de 7 ml en proporciones iguales, para proporcionar un volumen final de 400 ul (2 mg de sólido) en todos los viales, conforme es mostrado en el ejemplo más adelante. En los casos donde el volumen de solución orgánica disponible fue insuficiente, fue hecho un ajuste en una fase posterior, cuando la cantidad de agua añadida para la reconstitución fue reducida conforme a ello, según es mostrado.
- 3.
- Los contenidos de todos los viales fueron secados bajo una corriente de nitrógeno, a continuación expuestos a un vacío de, al menos, 1 mbar durante la noche en un liofilizador.
- 4.
- Al día siguiente, fue añadida agua destilada en volúmenes, conforme es indicado en la tabla a continuación, para proporcionar una concentración final en todos los viales de 1 mg/ml. Los viales fueron tapados, calentados hasta los 37ºC y sometido a sonicación en baño hasta que se consiguió que se volvieran transparentes.
- 5.
- A continuación, las muestras fueron aplicadas a pocillos de multiplacas de 24 pocillos, en los cuales habían sido colocadas células de la línea celular macrófaga J774A-1 (5 x 10^{4} células/ml/pocillo). Fueron añadidos volúmenes de 100 ul y 10 ul de muestra a los pocillos individuales, y las células fueron incubadas durante la noche a 37ºC en una atmósfera de 5% CO_{2}/aire.
- 6.
- Al día siguiente, fueron tomados volúmenes duplicados de 50 ul de sobrenadante de cada pocillo y medidos para determinar la concentración de TNF en un método ELISA de captura. Los resultados obtenidos son mostrados en la tabla más abajo.
Puede apreciarse que algunas, aunque no todas,
las combinaciones de los diferentes grupos cabeza desencadenan
fuertes respuestas biológicas, indicando que la respuesta es
específica para aquéllas combinaciones en particular. El ejemplo
ilustra la manera en la que los conjugados descritos pueden ser
utilizados en el enfoque combinatorio para identificar
combinaciones eficaces, con el fin de provocar una respuesta
biológica deseada.
Las muestras fueron preparadas conforme es
descrito en el Ejemplo 1, con o sin la inclusión de materiales
lipídicos adicionales, según es descrito más abajo. Fue escogida la
combinación de los conjugados Y, S y L, debido a que esta
combinación funcionó bien en el experimento descrito en el Ejemplo
1.
Fueron preparadas sondas conteniendo fosfatidil
colina, en una proporción de fosfolípido y conjugado de 2:1
peso/peso.
Fueron preparadas sondas conteniendo octil
glucósido, en una proporción de glicolípido y conjugado de 1:1
peso/peso.
Los resultados mostrados en la tabla más abajo
son densidades ópticas a 450 nm de los ELISAs TNF llevados a cabo en
sobrenadantes de cultivo de 18 horas. La concentración del conjugado
en los pocillos fue de 10 ug/ml.
Este ejemplo muestra que las combinaciones de
los conjugados pueden provocar respuestas biológicas bien cuando
están presentes por separado, o cuando están presentes en conjunción
con otros lípidos, tales como fosfolípidos o azúcares lípidos.
También muestra que para que se manifieste su eficacia, es
importante para todos los conjugados el que se encuentren presentes
en combinación en el mismo ensamblaje supramolecular, y no se
observa actividad si los mismos conjugados son presentados juntos
al mismo tiempo, pero separados en diferentes ensamblajes
supramoleculares. Esto sugiere que es importante presentar los
conjugados cercanos entre sí, con el fin de permitir la formación
de epítopes formados por medio de la asociación no covalente de los
conjugados, los cuales pueden participar en la unión específica con
los receptores de la superficie celular.
- 1.
- Fueron preparados los conjugados individuales L, S, E & Q (conjugados con lípido por medio de un espaciador de tirosina-glicina) como soluciones en alcohol de bencilo, en una concentración de 10 mg/ml.
- 2.
- Fueron dispensadas 75 ul de ^{14}C-oleato de colesterol (3,7 MBq/ml en tolueno) en cuatro viales de vidrio tapados a rosca de 7 ml, y secados bajo una corriente de nitrógeno.
- 3.
- Fueron añadidas 400 ul de cada una de las soluciones en (1) a uno de los viales en (2) y fueron agitados durante la noche a temperatura ambiente.
- 4.
- Las soluciones de los conjugados fueron dispensadas en viales de vidrio de 7 ml en proporciones iguales, para proporcionar un volumen final de 80 ul (0,8 mg de sólido) en todos los viales, conforme es mostrado en el ejemplo más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
- 5.
- Fueron añadidos 2 ml de agua destilada a cada uno de los viales agitando en vórtex. A continuación, los viales fueron tapados y sometidos a sonicación por baño durante 20 minutos.
- 6.
- Las muestras fueron congeladas entonces en nitrógeno líquido y liofilizadas durante la noche.
- 7.
- Al día siguiente, cada vía fue reconstituido con 2 ml de agua destilada y sometido de nuevo a sonicación hasta que fueron conseguidas dispersiones transparentes.
- 8.
- Las muestras fueron administradas por medio de alimentación por sonda oral a ratones hembra Balb/c (20-25 g de peso - cuatro ratones por grupo) en una dosis de 0,3 ml por animal.
- 9.
- Fueron tomadas muestras sanguíneas heparinizadas de 75 ul por medio de pinchazo en la vena de la cola a los 45, 90 y 180 minutos de la administración.
- 10.
- Cada muestra fue diluida en 0,5 ml de PBS, la cual fue entonces centrifugada, y fueron transferidos 0,4 ml del sobrenadante a un vial de escintilación, al cual le fueron añadidos mezclándolos 2 ml de Optiphase Hisafe 3 (Wallac).
- 11.
- Fue medida la actividad en las muestras en un contador de escintilación.
\vskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de absorción fue estimado sobre la
base de un volumen sanguíneo de 2 ml, de los cuales se asumió que 1
ml era plasma.
Los resultados son mostrados en la tabla más
abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede apreciarse que algunas de las
combinaciones, pero no todas, de los diferentes grupos cabeza
aumentan la absorción del marcador a través de la ruta oral,
indicando que la respuesta es específica de aquéllas combinaciones
en particular. El ejemplo ilustra la manera en la cual los
conjugados descritos pueden ser utilizados en el enfoque
combinatorio, con el fin de identificar las combinaciones eficaces
capaces de actuar como los ligandos diana.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Fueron añadidas 100 ul de IgG de cabra (1 mg/ml) a 20 ml de PBS y fueron colocadas 100 ul en cada pocillo de una placa de microtítulos de fondo plano.
- 2.
- La placa fue incubada durante varios días a +4ºC.
- 3.
- Fueron pesados 2 mg de cada uno de los conjugados Y, F, W, L, S, E, Q & R (cada uno ligado a lípido por medio de un espaciador de serina-glicina) y depositados en viales de vidrio de 1 ml, y fueron añadidas 200 ul de alcohol de bencilo para proporcionar soluciones de cada conjugado en una concentración de 10 mg/ml.
- 4.
- Las soluciones fueron dispensadas en viales de vidrio tapados a rosca de 7 ml, conforme sigue:
- 5.
- Los contenidos de cada vial fueron bien mezclados por medio de agitado en vórtex, a continuación fueron añadidos a cada vial 1,5 ml de agua destilada.
- 6.
- Los viales fueron tapados y sometidos a sonicación por baño durante cinco minutos para proporcionar dispersiones transparentes.
- 7.
- La placa de la fase (2) fue lavada en PBS/0,02% Tween 20 y, a continuación, bloqueada por medio de incubación durante una hora con BSA 1% en PBS (300 ul/pocillo).
- 8.
- A continuación, la placa fue lavada igual que antes, y fueron añadidas 100 ul de muestra de cada uno de los viales de la fase (6) a los pocillos en la columna (1) de las filas (1) a (7). La fila (8) fue dejada como un control en blanco.
- 9.
- Fueron realizadas diluciones dobles en toda la placa por medio de la transferencia de 100 ul de los pocillos en la columna (1) al pocillo adyacente de la misma fila en la columna (2) y mezclándolos, a continuación, transfiriendo 100 ul a la siguiente columna igual que antes, etc.
- 10.
- La placa fue incubada entonces durante la noche a +4ºC.
- 11.
- Al día siguiente, la placa fue lavada igual que antes y fueron añadidas 100 ul del conjugado comercial IgG-peroxidasa de rábano picante (diluido 1/1000 en PBS) a cada pocillo, y fue incubada a temperatura ambiente durante 40 minutos.
- 12.
- A continuación, la placa fue lavada de nuevo, y fueron añadidas 100 ul de sustrato OPD para peroxidasa a cada pocillo, y fueron incubados a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- 13.
- Entonces fueron añadidas 20 ul de ácido sulfúrico 3M a cada pocillo para detener la reacción.
- 14.
- Fue medida la densidad óptica de cada uno de los pocillos a 450 nm en un lector de placa, y los resultados obtenidos después del ajuste del fondo, son recogidos más abajo.
Puede apreciarse que la unión máxima es
conseguida con las muestras 2, 3 y 4 (ie, combinaciones YFL, YWL y
FWL).
Puede apreciarse que algunas de las
combinaciones, pero no todas, de los diferentes grupos cabeza entran
en fuertes interacciones de unión, indicando que la respuesta es
específica de aquéllas combinaciones en particular. El ejemplo
ilustra la manera en la cual los conjugados descritos pueden ser
utilizados en el enfoque combinatorio, con el fin de identificar las
combinaciones eficaces a efectos de provocar una interacción de
unión deseada.
Claims (15)
1. Un método para el escrutinio de composiciones
para la interacción con un ligando diana, cuyo método comprende:
(a) proporcionar una pluralidad de distintos
conjugados, comprendiendo cada conjugado un grupo cabeza y un grupo
cola, en donde los conjugados son formadores de micelas, los grupos
cabeza son hidrofílicos y los grupos cola son lipofílicos; y
(b) formar de la pluralidad de conjugados una
asociación no covalente de los mismos, la cual comprende una micela,
en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente y en la cual
los conjugados son movibles, de tal forma que, en presencia de un
ligando, al menos dos de los grupos cabeza son posicionados
adecuadamente para formar un epítope capaz de interactuar con el
ligando con más fuerza que lo haría cada uno de los grupos cabeza
por separado, en donde la fase de facilitamiento de la pluralidad de
conjugados comprende:
- (i)
- seleccionar un grupo de conjugados con un conjunto de grupos cabeza;
- (ii)
- formar una asociación no covalente de los mismos, en la cual los grupos cola se agregan hidrofóbicamente y en la cual los conjugados son movibles;
- (iii)
- someter a ensayo para determinar la interacción entre la asociación no covalente y el ligando;
- (iv)
- repetir opcionalmente las fases (i) a (iii) utilizando un grupo de conjugados con un conjunto modificado de grupos cabeza; y
- (v)
- encontrando la interacción en la fase (iii), seleccionar el grupo de conjugados como la pluralidad de conjugados en la fase (a).
2. Un método conforme a la reivindicación 1, en
donde cada conjugado posee un grupo cabeza seleccionado de entre: un
aminoácido o péptido; un análogo peptídico; un mono- o polisacárido;
un mono- o polinucleótido; un esterol; una vitamina soluble en agua;
un núcleo de porfirina o hemo; un ión metálico quelado; un fármaco
soluble en agua; una hormona y un sustrato enzimático.
3. Un método conforme a la reivindicación 2, en
donde cada grupo cabeza comprende un aminoácido.
4. Un método conforme a la reivindicación 3, en
donde cada grupo cabeza comprende un péptido comprendiendo el
aminoácido.
5. Un método conforme a la reivindicación 3 o a
la reivindicación 4, en donde los grupos cabeza que forman el
epítope comprenden aminoácidos terminales seleccionados de entre, al
menos, dos de los siguientes: aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos
hidroxílicos, aminoácidos acídicos, aminoácidos amida, aminoácidos
básicos y aminoácidos aromáticos.
6. Un método conforme a reivindicación 3 o a la
reivindicación 4, en donde el aminoácido es seleccionado de entre
aminoácidos naturales, derivados sustituidos, análogos y formas D de
los mismos.
7. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde cada grupo cola es el mismo o
diferente, y comprende un grupo lipofílico seleccionado de entre un
ácido graso, alcohol o aldehído de cadena recta o ramificada,
poseyendo, al menos, 8 átomos de carbono; un análogo de aminoácido
lipídico; una prostaglandina; un leucotrieno; un mono- o
diglicérido; un esterol; un derivado de esfingosina o ceramida; y
una silicona o derivado sustituido con halógeno de un grupo
lipofílico de este tipo.
8. Un método conforme a la reivindicación 7, en
donde cada grupo lipofílico comprende un hidrocarbono C_{10} a
C_{14}.
9. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde cada conjugado comprende
adicionalmente un grupo espaciador ligando el grupo cabeza al grupo
cola.
10. Un método conforme a la reivindicación 9, en
donde el grupo espaciador es hidrofílico.
11. Un método conforme a la reivindicación 9 o a
la reivindicación 10, en donde el grupo espaciador es seleccionado
de entre aminoácidos, hidroxiácidos, azúcares y glicol de
polietileno.
12. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones de la 9 a la 11, en donde cada uno de los
conjugados presenta la estructura:
x-espaciador-espaciador-lípido-lípido,
en la cual x representa un aminoácido único, diferente en cada uno
de los conjugados utilizados.
13. Un método conforme a la reivindicación 1, en
donde cada conjugado incluye uno o más aminoácidos lipídicos, los
cuales poseen una cadena lateral comprendiendo el hidrocarbono
C_{10} a C_{14}.
14. Un método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la asociación no covalente
comprende adicionalmente material lipídico adicional.
15. Un método conforme a la reivindicación 14,
en donde el material lipídico adicional comprende un fosfolípido o
un azúcar lípido.
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