BRPI0610701A2 - dìmero de peptìdeo saep ii, composição que o contém, seu uso, complexo de lps-peptìdeo, seu uso, composição farmacêutica e processo para a sua preparação, processo para a desintoxicação de um lps de bactérias gram-negativas e processo para a preparação de um dìmero de peptìdeo paralelo e antiparalelo saep ii - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a dímeros de peptídeo SAEP II que imitam polimixina B entre outros em sua habilidade em se ligar não-covalentemente ao lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram-negativas com alta afinidade, e então desintoxicar LPS como a polimixina B faz. A estrutura dimérica é mantida por um par de ligações dissulfeto envolvendo os dois resíduos cisteina presentes na seqUência de peptídeo, que não excede 17 aminoácidos e compreende essencialmente resíduos de aminoácido catiónicos e hidrofóbicos. Nos dímeros da invenção, os peptídeos podem ter uma orientação paralela ou antiparalela. Como uma questão de exemplo, um dimero da invenção é constituído por um peptídeo da fórmula NH2-Lys-Thr-Lys-Cys 1 -Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH, ou em uma forma d imérica paralela ou antiparalela. Dimeros de SAEP II são úteis para tratamento ou prevenção de choque séptico e distúrbios relacionados gerados por infecção por bactérias Gram-negativas. A invenção refere-se também a complexos de LPS-peptideo onde LPS e dimeros de SAEP II são não-covalentemente ligados. Esses complexos são úteis como agentes de vacina contra infecção por bactérias Gram-negativas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLOGOSDE POLIMIXINA B PARA DESINTOXICAÇÃO DE LPS".

A presente invenção refere-se a análogos de peptídeo de polimi-xina B que são úteis para desintoxicação de LPS. No campo farmacêutico,eles podem ser usados (i) tais como são, entre outros para tratar distúrbiosfatais, tal como choque séptico, causado por infecção por bactéria Gram-negativa; ou (ii) não-covalentemente ligados a LPS que é então desintoxica-do; o seu complexo sendo útil como agente de vacina contra infecção porbactérias Gram-negativas.

Lipopolissacarídeo (LPS) é um constituinte principal da membra-na externa da parede celular de bactérias Gram-negativas. LPS é altamentetóxico em mamíferos, particularmente seres humanos e com relação à suaatividade biológica tem sido chamado endotoxina. Ele é responsável pelos- efeitos derivados de endotoxicose em choque séptico, um caso ameaçador àvida que acontece quando da infecção aguda (sepsia) por bactérias Gram-negativas.

A estrutura do LPS é constituída por uma porção de lipídeo,chamada lipídeo A, covalentemente ligada a uma porção de polissacarídeo.

O lipídeo A é responsável pelo efeito tóxico do LPS, em particu-lar através da interação com células B e macrófagos. A interação induz asecreção de citocinas pró-inflamatórias. A condição inflamatoria pode atingirum estado fatal de choque endotóxico.

O lipídeo A é altamente hidrofóbico e prende PLS na camadaexterna da parede da célula bacteriana. O lipídeo A é composto de (i) regiãode dissacarídeo bis-fosforilada conservada (mais freqüentemente, N,0-acilbeta-1,6-D-glucosamina 1,4'-bifosfato com (ii) ácidos graxos, que substituemvários átomos de hidrogênio pertencentes às dissacarídeo hidroxilas. O nú-mero de ácidos graxos e sua composição são variáveis interespécie. Comouma questão de exemplo, cada uma das duas glucosaminas simétricas(GlcN1 e GlcN2) do lipídeo A Neisseria meningitidis carrega os ácidos gra-xos que seguem: 2N-C14.30H; C12; e 30-C12.30H.

A porção de polissacarídeo de LPS é constituída por cadeias decarboidrato, responsáveis pela antigenicidade. A estrutura da cadeia de car-boidrato é composta de (i) um núcleo interno conservado chamado a regiãoKDO (ácido 2-ceto, 3-desóxi cotulosônico) ligada ao lipídeo A e (ii) um nú-cleo externo variável ligado à região KDO, que é geralmente definida comoincluindo vários sacarídeos, e a primeira unidade de repetição (que podecompreender até dez sacarídeos) de (iii) às cadeias O específicas externas.

Em bactérias não-entéricas, Gram-negativas, tal como Neisseria,Bordetellas, Haemophilus e Moraxellas, cadeias O específicas não existem(o que é definido como a primeira unidade de repetição de fato não é repeti-da). Deste modo, os LPS dessas bactérias são freqüentemente referidoscomo lipooligossacarídeo (LOS).

LPS não é apenas tóxico, mas também altamente imunogênico.Em mamíferos, anticorpos anti-LPS são induzidos durante a infecção e car-regamento, e podem ser protetores. Em vista disso, já foi proposto desintoxi-car LPS e usar a sua forma desintoxicada na profilaxia de infecções bacteri-anas Gram-negativas e doenças relacionadas.

Vários métodos de desintoxicação já são conhecidos. Em parti-cular, é possível desintoxicar LPS enquanto usando polimixina B ou maisapropriadamente, seus análogos de peptídeo.

A polimixina B é uma molécula que se liga a Lipídeo A com altaafinidade de modo que LPS é significantemente desintoxicado. Quando dadaterapeuticamente em modelos de animal, a polimixina B pode prevenir cho-que séptico. No entanto, a polimixina B é um antibiótico policatiônico quepode ser um pouco tóxico para seres humanos por causa de sua não-biodegradabilidade e a conseqüente tendência em acumular nos rins. Destemodo, ele não é recomendado para uso em produtos profiláticos ou terapêu-ticos.

Para superar esta limitação, análogos de peptídeo de polimixinaB foram desenvolvidos. Eles não retêm a toxidez da polimixina B mas ape-nas imitam as estruturas primária e secundária da polimixina B e se ligam alipídeo A no mesmo sítio que a polimixina B faz, de modo que o complexo deLPS-peptídeo é formado. Como resultado, LPS é desintoxicado. Análogosde peptídeo são em particular descritos na US 5.358.933, no WO 93/14115, noWO 95/03327, no WO 96/38163, na EP 842 666 e na EP 976 402. Um deles, omonômero cíclico SAEP2 (peptídeo antiendotoxina sintético 2) da fórmulaKTKCKFLKKC foi mais particularmente estudado (Rustici e outros, 1993,Science 259:361 e Velucchi e outros, 1997, J. Endotox. Res. 4(4):261).

Foi agora constatado que o peptídeo SAEP2 bem como peptí-deos similares incluindo em sua seqüência vários aminoácidos polares não-carregados circundados por dois resíduos cisteína adjacentes e contra-equilibrados por uma cauda externa curta feita de aminoácidos catiônicos(daqui em diante referido genericamente como peptídeos SAEP II) são deinteresse particular quando eles estão em forma dímérica; o dímero sendoconformacionalmente feito e mantido por um par de ligações dissulfeto entreos resíduos cisteína. Os dímeros do peptídeo SAEP II exibem propriedadesde desintoxicação aumentadas sobre os monômeros correspondentes.

Deste modo, a invenção refere-se a um dímero do peptídeo SA-EP II da fórmula (I)

NH2-A-Cys1-B-Cys2-C-COOHNH2-A'-Cys1 -B'-Cys2-C'-COOH

onde os dois resíduos cisteína Cys1 são ligados através de uma ligação dis-sulfeto e dois resíduos cisteína Cys2 são ligados através de uma ligaçãodissulfeto; ou fórmula (II)

NH2-A-Cys1-B-Cys2-C-COOHCOOH-C'-Cys2-B'-Cys1 -A'-NH2

onde os resíduos Cys1 são ligados aos resíduos Cys2 através de uma liga-ção dissulfeto;

onde A e A' são independentemente uma porção peptídeo de apartir de 2 a 5, de preferência 3 ou 4 resíduos de aminoácido, onde pelo me-nos 2 resíduos de aminoácido são independentemente selecionados de Lys,Hyl (hidróxi-Lisina), Arg e His;

onde BeB' são independentemente uma porção peptídeo de apartir de 3 a 7, de preferência 4 ou 5 resíduos de aminoácido, que compre-ende pelo menos dois, de preferência três resíduos de aminoácido indepen-cientemente selecionados de Vai, Leu, He, Phe, Tyr e Trp; e

onde CeC são opcionalmente (essas posições podem estarvazias ou não) e são independentemente um resíduo de aminoácido ou umaporção peptídeo de a partir de 2 a 3 resíduos de aminoácido;contanto que a razão de resíduos de aminoácido catiônicos/resí-duos de aminoácido hidrofóbicos (razão de cat/hidrof) seja de a partir de 0,4a 2, vantajosamente de a partir de 0,5 a 1,2 ou 1,5, de preferência de a partirde 0,6 a 1; com mais preferência de a partir de 0,6 a 0,8; por exemplo, 0,75.

Vantajosamente, A e A' são independentemente uma porção depeptídeo de a partir de 2 a 5, de preferência 3 ou 4 resíduos de aminoácido,onde pelo menos um, de preferência 2 resíduos de aminoácidos, é/são sele-cionado^) independentemente de Lys, Hyl, Arg e His; aquele que não sãoselecionados de Lys, Hysl, Arg e His ("os resíduos de aminoácido restan-tes"), se algum, sendo selecionados do grupo consistindo em resíduos deaminoácidos polares e não-polares não-carregados; de preferência Thr, Sere Gly; com mais preferência Thr.

Quando as porções de peptídeo A e A' compreendem 3 resíduosde aminoácido, cada um deles pode ser um resíduo catiônico; ou, alternati-vamente, dois de três resíduos são aminoácidos catiônicos, enquanto o resí-duo restante é selecionado do grupo consistindo em resíduos de aminoáci-dos polares ou não-polares; de preferência Thr, Ser e Gly; com mais prefe-rência Thr.

Quando as porções de peptídeo A e A' compreendendo 4 resí-duos de aminoácido, é preferido que dois ou três de quatro resíduos sejamselecionados dos grupos de resíduos de aminoácido catiônicos conformeacima definido, enquanto o(s) resíduo(s) restante(s) é/são selecionado(s) dogrupo consistindo em resíduos de aminoácidos polares e não-polares não-carregados conforme acima definido.

Quando as porções de peptídeo A e A' compreendem 5 resíduosde aminoácido, é preferido que três ou quatro de cinco resíduos sejam sele-cionados dos grupos de resíduos de aminoácido catiônicos conforme acimadefinido, enquanto o(s) resíduo(s) restante(s) é/são selecionados do grupoconsistindo em resíduos de aminoácidos polares e não-polares não-carrega-dos conforme acima definido.

Vantajosamente, B e B' são independentemente uma porçãopeptídeo de a partir de 3 a 7, de preferência 4 ou 5, resíduos de aminoácidoque compreende pelo menos dois, de preferência três, resíduos de aminoá-cido independentemente selecionados de Vai, Leu, Me, Phe, Tyr e Trp; depreferência de a partir de Leu, He e Phe; aqueles que não são selecionadosde Vai, Leu, lie, Phe, Tyr e Trp ("os resíduos de aminoácido restantes"), sealgum, sendo independentemente selecionados do grupo consistindo emLys, Hyl, Arg e His. Como pode ser facilmente compreendido, as porções depeptídeo BeB' podem compreender até 7 resíduos de aminoácido indepen-dentemente selecionados de Vai, Leu, lie, Phe, Tyr e Trp.

Vantajosamente, as porções de peptídeo BeB' compreendem aseqüência-X1- X2 -X3-onde X1 e X2; X2 e X3; ou X1, X2 e X3 são inde-pendentemente selecionados de Vai, Leu, He, Phe, Tyr e Trp; de preferênciade Leu, lie e Phe. Em uma modalidade preferida, a seqüência - X1 - X2- X3 - compreende o motivo Phe-Leu.

Modalidades particulares de porções de peptídeo BeB' incluem:

(i) a seqüência - X1 - X2 - X3 - onde:

X1 é Lys, Hyl, His ou Arg, de preferência Lys ou Arg; com maispreferência Lys;

X2 é Phe, Leu, lie, Tyr, Trp ou Vai; de preferência, Phe ou Leu;com mais preferência, Phe; e

X3 é Phe, Leu, lie, Tyr, Trp ou Vai; de preferência, Phe ou Leu;com mais preferência Leu; e

(ii) resíduos de aminoácido, se algum, cada um sendo indepen-dentemente selecionado do grupo consistindo em Vai, Leu, He, Phe, Tyr,Trp, Lys, Hyl, Arg e His; de preferência Vai, Leu, lie, Phe, Tyr e Trp; commais preferência Leu, lie e Phe.

Quando BeB' compreendem mais de 4 resíduos de aminoácidonão-polares, A e A' compreendem de preferência pelo menos 3 resíduos deaminoácido positivamente carregados.Nas porções de peptídeo Ce C\ o(s) resíduo(s) de aminoácidopode(m) ser quaisquer resíduos de aminoácido contanto que a razão de re-síduos de aminoácido catiônicos/resíduos de aminoácido hidrofóbicos per-maneça dentro da faixa especificada. Vantajosamente, eles são independen-temente selecionados de resíduos de aminoácido não-carregados polares enão-polares, esses últimos sendo preferidos. No entanto, de uma maneirapreferida, CeC são posições vazias.

Deste modo, uma classe preferida de dímeros são da fórmula

<formula>formula see original document page 7</formula>

onde A, A', B e B' são conforme acima descrito; contanto que a razão deresíduos de aminoácido catiônicos/resíduos de aminoácido hidrofóbicos sejade a partir de 0,4 a 1, vantajosamente de a partir de 0,5 a 1,2 ou 1,5, de pre-ferência de a partir de 0,6 a 1; com mais preferência de a partir de 0,6 a 0,8;por exemplo, 0,75.

Dímeros da fórmula (I) ou (III), isto é com peptídeos na orienta-ção paralela, são referidos como dímeros paralelos. Dímeros da fórmula (II)ou (IV), isto é com peptídeos na orientação antiparalela, são referidos comodímeros antiparalelos.

Nas fórmulas (I) a (IV), A e A' são de preferência idênticos. Omesmo é verdadeiro para B e B'; e C e C Um dímero de peptídeo da fórmu-la (I), (II), (III) ou (IV), onde A e A'; B e B' e Ce C são idênticos dois-por-dois, é referido como dímero homólogo. Na verdade, neste caso, as subuni-dades de peptídeo incluídas nos dímeros são idênticas.

Como uma questão de exemplo, os peptídeos que seguem sãocitados como sendo adequados para uso em dímeros da invenção:

NH2-Lys-Arg-His-Hyl-Cys-Lys-Arg-lle-Val-Leu-Cys-COOH;

NH2-Lys-Arg-His-Cys-Val-Leu-lle-Trp-Tyr-Phe-Cys-COOH;NH2-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys-COOH; eNH2-Hyl-Arg-His-Lys-Cys-Phe-Tyr-Trp-Val-lle-Leu-Cys-COOH.

As respectiva razões de cat/hidrof dos dímeros homólogos cor-respondentes são 2,00, 0,50, 0,75 e 0,67.

Um exemplo particular dos dímeros descritos acima é constituí-do por um peptídeo da fórmula (V) NH2-Lys-Thr-Lys-Cys1-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH. Este peptídeo é daqui em diante referido como o peptídeoSAEP2-L2. Conforme acima descrito, ele pode também estar em forma di-mérica paralela ou antiparalela.

Os peptídeos envolvidos na ou dímeros da invenção podem serconvenientemente sintetizados através de métodos clássicos usando, porexemplo, um sintetizador automático dirigido por computador. Está dentrodas habilidades de praticantes profissionais na técnica de síntese de peptí-deo saber como planejar procedimentos de modo que um peptídeo particularseja obtido. Desnecessário dizer que durante a fase de síntese, os gruposcisteína tiol podem ser protegidos. Uma vez a síntese estando completa,eles são desprotegidos e oxidação do grupo tiol é conseguida a fim de geraro monômero cíclico, dímero paralelo ou antiparalelo.

Quando ambos os resíduos cisteína presentes no peptídeo sãodesprotegidos simultaneamente, é teoricamente possível gerar cada umadas três formas quando da oxidação. Então cada uma das três formas podeser separada uma da outra através de métodos de purificação bioquímicaconvencionais. Cromatografia líquida de alta performance de fase reversapreparativa (RP-HPLC) é citada como um exemplo adequado. Na verdade,uma pessoa pode esperar que cada uma das três formas elua em um tempode retenção diferente. Deste modo, uma preparação contendo o monômerocíclico purificado ou os dímeros paralelos e antiparalelos purificados podeser simplesmente obtida agrupando as respectivas frações de pico.

As respectivas proporções de cada uma das três formas geradasquando da oxidação dependem entre outros da seqüência de aminoácidoespecífica e importante, da concentração do peptídeo. Pode acontecer deuma ou duas das três formas serem predominantemente criadas; e na ver-dade, a prevalência de uma ou duas formas pode ser tal de modo que a(s)outra(s) não são formadas mesmo.

Como uma questão de exemplo, o peptídeo SAEP2-L2 oxidaespontaneamente em monômero cíclico e dimero paralelo, em proporções, oque depende da concentração do peptídeo em. solução. O impedimento es-férico interno das "cadeias laterais" (a porção NH2-Lys-Thr-Lys-) do dimeroantiparalelo é obviamente menor do que aquele do dimero paralelo e umapessoa pode esperar que uma energia mínima inferior seja responsável pelaformação privilegiada do dimero antiparalelo em solventes aquosos atravésde comparação com o dimero paralelo. Como uma conseqüência direta des-te processo direcionado pela concentração, a formação do dimero antipara-lelo e a um grau menor do monômero cíclico é favorecida até a exclusão dodimero paralelo do equilíbrio.

Quando o dimero paralelo não pode ser espontaneamente gera-do quando da oxidação, é necessário adotar medidas particulares para fazero peptídeo associar dentro da orientação paralela. Essas medidas estãodentro das habilidades dos praticantes profissionais na técnica de síntese depeptídeo. Não obstante e como uma questão de exemplo apenas, é indicadoque proteção diferencial dos aminoácido Cys1 e Cys2 seguido por desprote-ção seletiva é um modo conveniente de se conseguir djmerização com orien-tação paralela. Então o dimero pode ser purificado através de métodos con-vencionais, incluindo, RP-HPLC.

Peptídeos que são quimicamente sintetizados e purificados sãogeralmente obtidos em forma de sal devido ao fato de que ácidos e sais sãousados durante as etapas de síntese química e purificação. Acetato é um salgeralmente usado. Deste modo, deve ser compreendido que o termo "peptí-deo" conforme usado na presente descrição compreende a forma de saltambém.

Peptídeos para uso nos dímeros da invenção podem ser carac-terizados por várias técnicas, incluindo, entre outros lon Cyclotron Resonace(ICR), espectrometria de Mass Assisted Laser Desorption lonisation - Timeof Flights (MALDI-ToF) e espectrofotometria de Nuclear Magnetic Resonan-ce (RMN). Em particular, é possível discriminar cada uma das três formas(monômero cíclico, dímero paralelo e antiparalelo) através de análise deRMN. Espectrometria de massa MALDI-ToF permite discriminação entremonômero e dímeros apenas.

A pureza de compostos da invenção pode ser avaliada atravésde RP-HPLC. Resumidamente, uma preparação de composto é submetida àRP-HPLC. O grau de pureza relativo é calculado através da integração dassuperfícies de pico. Ele é expresso como a superfície/superfícies pico decomposto de todos os picos. É comum preparar compostos da invenção queexibem, cada um, um grau de pureza de pelo menos 95%, freqüentementepelo menos 97%.

A invenção refere-se também a composições compreendendo:um peptídeo SAEP II, em que o peptídeo está essencialmen-te em forma paralela dimérica;

- um peptídeo SAEP II, em que o peptídeo está essencialmen-te em forma dimérica antiparalela; ou

misturas dos mesmos.

Por "essencialmente" se quer dizer que nas composições umaforma particular é pelo menos 95%, de preferência pelo menos 97%, commais preferência 98%, pura.

Composições mistas onde o peptídeo SAEP II está presente sobvárias formas (formas paralela dimérica, antiparalela dimérica e/ou monomé-rica) podem resultar espontaneamente da evolução de uma composiçãocompreendendo uma única entidade, por exemplo, a forma paralela diméri-ca, mantida em uma temperatura apropriada durante um certo período detempo. Isto pode ser revelado, por exemplo, através de análise RP-HPLC.

As respectivas quantidades das várias formas de peptídeo podem ser quan-tificadas da mesma maneira.

Os dímeros de SAEP II são úteis como tal agente de desintoxi-cação de LPS bacteriano Gram-negativo in vitro bem como in vivo. Destemodo, eles podem ser usados para prevenir ou tratar condições patológicasdevido à liberação de LPS na circulação sistêmica, por exemplo, no sangue,como um resultado de infecções por bactérias Gram-negativas. Essas condi-ções incluem entre outros endotoxicose, sepsia bacteriana e choque séptico.

Deste modo, a invenção compreende:

- o uso farmacêutico de um composto ou composição da in-venção;

uma composição farmacêutica compreendendo um compostoou uma composição da invenção junto com um diluente ou vículo farmaceu-ticamente aceitável;

- o uso de um composto ou composição da invenção na prepa-ração de um medicamento para tratar ou prevenir choque séptico; e

- um método para tratamento ou prevenção de choque séptico,o qual compreende administração de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um composto ou composição da invenção a umindivíduo com necessidade.

Um composto ou composição da invenção pode ser administra-do a mamíferos, isto é, seres humanos, quando uma infecção por bactériaGram-negativa é diagnosticada que pode levar à endotoxicose, sepsia bac-teriana e/ou choque séptico. Bactérias gram-negativas que podem ser res-ponsáveis por esses distúrbios fatais incluem entre outros, N. meningitidis,E. coli, Salmonella typhi, Bordetella pertussis e Pseudomonas aeruginosa.Um composto ou composição da invenção pode ser administrado a um indi-víduo com necessidade através de uma via sistêmica, de preferência atravésda via intravenosa. A dose a ser administrada depende de vários fatores,incluindo, entre outros, a idade, peso, condição fisiológica do paciente bemcomo o estado da infecção. Ela pode ser administrada uma vez ou váriasvezes até que o risco de caso fatal seja evitado.

Uma vez que dímeros de SAEP II e o peptídeo SAEP-L2 sãotambém capazes de desintoxicar LPS in vitro, a invenção refere-se tambéma um complexo de LPS-peptídeo compreendendo (i) uma porção de LPS debactérias Gram-negativas e (ii) um dímero de peptídeo SAEP II ou o peptí-deo SAEP2-L2; em que a porção LPS e o dímero de peptídeo SAEP II ou opeptídeo SAEP2-L2 são não-covalentemente ligados um ao outro.Desintoxicação de LPS pode ser avaliada em vários ensaios re-feridos na European Pharmacopoeia. Eles incluem o ensaio Limulus Ame-bocyte Lysate (LAL); o teste de pirogênio em coelhos e o ensaio de toxidezaguda em camundongos sensibilizados por D-galactosamina. Esses ensaiossão ilustrados abaixo nos exemplos. Em cada um dos ensaios, o efeito deLPS e aquele do complexo de LPS-peptídeo são medidos em paralelo demodo que uma razão de desintoxicação seja estabelecida.

No ensaio de LAL, a razão de desintoxicação é expressa pelarazão de LPS/complexo de LPS-peptídeo. No teste de pirogênio e no ensaiode toxidez aguda, a razão de desintoxicação é expressa pela razão comple-xo de LPS-peptídeo/LPS.

Desintoxicação significante é conseguida quando a razão de de-sintoxicação medida no:

(i) ensaio LAL é pelo menos de 100, de preferência 500, commais preferência 1000;

(ii) o teste de pirogênio é pelo menos de 50, de preferência de100, com mais preferência 500; ou

(iii) camundongos de D-galactosamina é pelo menos de 50, depreferência de 100, com mais preferência de 200.

A desintoxicação pode ser também avaliada enquanto compa-rando o efeito de LPS e complexo de LPS-peptídeo sobre a liberação de ci-tocinas pró-inflamatórias tal como IL6-, IL8 e TNFa, em ensaio in vitro ou invivo. Esses ensaios são ilustrados a seguir nos exemplos. Desintoxicaçãosignificante é conseguida quando o complexo de LPS-peptídeo permite pelomenos diminuição de 25 vezes, de preferência pelo menos 50 vezes, commais preferência pelo menos 75 vezes, com mais preferência pelo menos100 vezes de diminuição na secreção de IL6 no ensaio in vivo conformedescrito nos exemplo, seção 5.4.1.

Complexo de LPS-peptídeo da invenção é vantajosamente ca-racterizado pela razão de LPS molar:peptídeo de a partir de 1:15, a 1:05, depreferência 1:1,2 a 1:0,8, com mais preferência de 1:1,1 a 1:0,9, com maispreferência 1:1.Para uso no complexo da invenção, o LPS é vantajosamente umLPS de N. meningitidis; E. coli; Salmonella typhi; Salmonella paratyphi; Shi-gella flexneri; Haemophilus influenzae; Helicobacter pylori; Chlamydia tra-chomatis; Bordetella pertussis; Brucella; Legionella pneumophia; Vibrio cho-lera; Moraxella catharralis; Pseudomonas aeruginosa; Yersinia; e Kiebsiellapneumonia.

Conforme mencionado na introdução, LPS desintoxicado podeser útil como agente de vacina contra infecção por bactéria Gram-negativa.

A meningite é uma doença ameaçadora à vida de origem ou viralou bacteriana. H. influenza e N. meningitidis são respectivamente responsá-veis por cerca de 40 e 50% de meningite bacteriana. Embora uma vacinacontra H. influenza esteja no mercado há mais de dez anos, há ainda a ne-cessidade de uma vacina contra N. meningitidis.

Doenças invasivas meningocócicas podem ser manifestar oucomo uma inflamação das meninges do cérebro e cordão espinhal (meningi-te) ou uma infecção sistêmica do sangue (sepsia meningocócica ou menin-gocemia).

Meningocócicos são classificados usando métodos sorológicoscom base na estrutura da cápsula de polissacarídeo. Treze cápsulas de po-lissacarídeo antigenicamente e quimicamente distintas foram descritas.Quase todas as doenças meningocócicas invasivas são causadas por cincosorogrupos: A, B, C, Y e W-135. A importância relativa de cada sorogrupodepende da localização geográfica. O sorogrupo B é responsável pela maio-ria das doenças meningocócicas em países temperados.

Enquanto vacinas de polissacarídeo conjugadas já existem con-tra os sorogrupos A, C, Y e W-135, atualmente não há nenhuma vacina dis-ponível contra o sorogrupo que é prevalente nos Estados Unidos e Europa.Na verdade, o uso de polissacarídeo capsular como um agente de vacinapara prevenção de doenças menB tem sido problemático.

Deste modo, o uso de LPS de N. meningitidis como um agentede vacina, em uma forma completamente antigênica e desintoxicada ad hoc,é uma alternativa promissora que pode oferecer uma cobertura de vacinadesejável, em particular para o sorogrupo B.

Conforme acima mencionado na introdução, o constituinte prin-cipal da parede celular de bactérias não-entéricas, Gram-negativas, tal comoNeisseria, Bordetella, Haemophilus e, Moraxellas, é um lipooligossacarídeo(LOS) ao invés de PLS verdadeiro. Não obstante, para o propósito do pre-sente pedido, o termo LPS deve ser compreendido como compreendendoLOS. LOSs constituem uma subclasse particular de LPS. Os termos "LPSmeningocócico" e "LOS meningocócico" são usados daqui em diante inter-cambiavelmente.

A figura 1 mostra um esquema da estrutura de um LOS de N.meningitidis. LOS é constituído por um oligossacarídeo ramificado compostode 5 a 10 monossacarídeos ligados a lipídeo A através de KDO. Lipídeo A eo núcleo interno constituídos por dois KDO, duas heptoses (HEP I e II) euma glucosamina N-acetilada (GlcNAc), são interespécie conservadas. Orestante das cadeias de oligossacarídeo que constituem o núcleo externo(cadeia a ligada a Hepl; cadeia (3 ligada na posição 3 de Hepll; e cadeia yligada à posição 2 de Hepll) é variável de acordo com os imunotipos (ITs).

LPS de N. meningitidis pode ser classificado em 13 imunotipos,com base em sua reatividade com uma série de anticorpos monoclonais (A-chtman e outros, 1992, J. Infect. Dis. 165:53-68). Diferenças entre imunoti-pos vêm da variação na composição e conformação das cadeias de oligos-sacarídeo. Isto deve ser visto na tabela abaixo.<table>table see original document page 15</column></row><table>Conforme indicado na tabela acima, uma fosfo etanol amina(PEA) substitui o Glc da cadeia (3 na posição 3 de Hepll em LOS L1, L3, L7 eL8. Uma PEA está ligada na posição 6 ou 7 em LOS L2, L4 e L6. LOS L2,L3, L4, L5, L5, L7 podem ser também sialilados com ácido N-acetil neurami-nídico na galactose terminal (Gal) da cadeia a.

Os imunotipos L1-L8 estão essencialmente associados aos so-rogrupos B e C, enquanto imunotipos L9-L12 são encontrados predominan-temente dentro do sorogrupo A.

Embora qualquer LOS possa ser igualmente desintoxicado, podeser vantajoso empregar LOS L8 nos complexos da invenção uma vez queesses últimos são pretendidos ainda para uso de vacina. Na verdade, a es-trutura completa da cadeia a de LOS L8 é comum para todos os imunotipospara os quais a estrutura foi identificada até agora (Kahler & Stephens, 1988,Crit. Rev. Microbiol. 24:281).

Cepas meningocócicas freqüentemente expressam vários imu-notipos, cuja presença pode ser influenciada pelas condições de cultura. Sehouver interesse especial em LOS L8, pode ser desejável extrair este LOSde uma cepa sabida expressar predominantemente o imunotipo L8, ou atémelhor, exclusivamente expressá-lo. A cepa A1 (também chamada 2E) dosorogrupo A, cepa M978 do sorogrupo B (Mandrell & Zollinger, 1977, Infect.Immun. 16:471; Gu e outros, 1992, J. Clin. Microbiol., 30:2047-2053; Zhu eoutros, 2001, FEMS Microbiol Lett. 203:173), cepa 8680 do sorogrupo B(Dominique Caugeant Collection) e cepa 8532 (US 6.476.201) são adequa-das para esta finalidade. Essas cepas podem ser obtidas da comunidadecientífica (US 6.531.131).

Monoclonais que são específicos para LOS L8 incluem Mab 2-1-18 (Moran e outros, 1994 Infect. Immun. 62:5290-5295; Mandrell e outros,1986, Infect. Immun. 54:63-69) Mab 6E7-10 (Braun e outros, 2004, Vaccine22:898-908) Mab 4387A5 e 4385G7 (Anderson e outros, 1995, Microb. Pa-thog. 19:159-168; Gu e outros {supra)).

Para uso nos complexos da invenção, LPS pode ser obtido atra-vés de meios convencionais; em particular ele pode ser extraído de uma cul-tura bacteriana Gram-negativa e então purificado de acordo com procedi-mentos clássicos. Várias descrições de tais procedimentos podem ser en-contradas na literatura. Isto inclui entre outros Gu & Tsaí, 1993, Infect. Immun.,61(5):1873, Wu e outros, 1987, Anal. Biochem. 160:281 e US 6.531.131 todosaqui citados a título de ilustração apenas. Uma preparação de LPS pode sertambém quantificada de acordo com procedimentos bem conhecidos na téc-nica. Um método conveniente é a dosagem de KDO com cromatografia detroca de ânion de alta performance (HPAEC) PAD.

LPS pode ser complexado para os compostos da invenção comoé ou em uma forma conjugada. Conjugados de LPS podem ser convenien-temente preparados através de ligação covalente de LPS a uma moléculacarreadora, por exemplo, um polipeptídeo ou um peptídeo; ou através deuma ligação covalente direta ou usando moléculas espaçadoras/ligantesquímicas. Exemplos de moléculas vículos incluem a coqueluche, difteria outoxóide do tétano e proteínas de membrana externa (OMP) tal como OMP1 eOMP2/3 de N. meningitidis. Várias descrições de tais processos de conjuga-ção podem ser encontradas na literatura. US 6.531.131 é citada a título deilustração apenas.

Quando usado em uma forma conjugada, o LPS é vantajosa-mente conjugado antes de ser complexado para os compostos da invenção.Isto quer dizer, LPS não-conjugado é adequado também.

A invenção refere-se também a:

um processo para desintoxicação de LPS de bactérias Gram-negativas, o qual compreende misturar (i) um LPS de bactérias Gram-nega-tivas e (ii) um composto da invenção; e

um processo para preparação de um complexo de LPS-peptí-deo, o qual compreende misturar (i) um LPS de bactérias Gram-negativas e(ii) um composto da invenção.

Para uso no processo da invenção, ambos constituintes estãovantajosamente em um meio líquido, adequadamente água. Soluções deLPS e composto são vantajosamente esterilizadas antes da mistura. O pro-cesso de preparação é vantajosamente obtido sob condições estéreis.Quando da mistura, um precipitado contendo o complexo é formado. Ele po-de ser recuperado entre outros através de centrifugação e submetido a umaou várias etapas de lavagem, se necessário.

Conforme acima mencionado, complexos de LPS-péptídeo dainvenção são úteis pelo fato de que eles podem ser administrados com se-gurança a mamíferos. Na verdade, LPS é desintoxicado para tal pontos quecasos adversos não devem acontecer quando da administração. Como umaquestão de exemplo, um complexo de LPS-peptídeo que exibe um limiarpirogênio superior a 1, de preferência dose de 10 ng/mL/kg IV no ensaio depirogênio de coelho, é adequado. Alternativamente ou adicionalmente, umapessoa pode se referir ao ensaio LAL. Como vacinas contendo LPS perfa-zendo 3.000-5.000 unidades de endotoxina LAL já foram autorizadas paraadministração humana (Frederiksen e outros, 1991, NIPH Annals 14(2):67),é possível prever que uma dose de vacina da invenção possa exibir segura-mente 5.000 unidades de endotoxina LAL ou menos, por exemplo, menos doque 3.000, 2.000, 1.000 ou 500 unidades de endotoxina LAL.

Como uma questão de exemplo, um complexo que exibe, porexemplo, 100 unidades de endotoxina (EU)/ (iig no ensaio de LAL, pode serentão aceitável para administração em uma dose de 20 \xg. Isto é consegui-do com os complexos da invenção uma vez que eles podem exibir uma ati-vidade de LAL inferior a 50 EU/|ig, freqüentemente inferior a 20 EU/u,g.

Ainda, complexos de LPS-peptídeo da invenção são estáveis,até mesmo em condições fisiológicas. Por "estável" se quer dizer que o es-tado de desintoxicação de LPS nos complexos permanece constante com otempo, pelo menos 3, 6, 12 ou 18 meses. Isto pode ser monitorado atravésda avaliação da razão de desintoxicação em intervalos, isto é, em pelo me-nos um dos ensaios listados acima. Nenhuma diferença significante é obser-vada na razão de desintoxicação com o tempo.

Complexos de LPS-peptídeos da invenção são também úteispelo fato de que eles são capazes de induzir uma resposta imune contrabactérias Gram-negativas. Isto pode ser mostrado quando da administraçãode complexos a mamíferos, por exemplo, coelhos, camundongos ou sereshumanos, seguido por análise ELISA dos soros para revelar a presença deanticorpos {entre outros imunoglobulinas G ou M) específicas para LPS.Vantajosamente, a resposta imune (induzida por anticorpos) pode ter ativi-dade bactericida e/ou opsônica.

A habilidade da resposta imune induzida pelos complexos dainvenção em proteger contra infecção de bactérias Gram-negativas pode seravaliada em modelos de animal apropriados que são atualmente específicospara uma espécie bacteriana ou doença. Está dentro das habilidades do pro-fissional na técnica de vacinas selecionar um modelo animal conhecido comrelação a uma bactéria ou doença particular.

Como uma questão de exemplo, a habilidade da resposta imuneinduzida pelos complexos da invenção em proteger contra N. meninigitidispode ser avaliada no modelo de infecção intraperitoneal de camundongo(Schryvers e outros, 1989, Infect. Immun. 57(8):2425 e Danve e outros,1993, Vaccine 11 (12): 1214). Ela pode ser também avaliada em seres hu-manos através de medição da atividade bactericida do soro humano apósum complexo ser administrado. Na verdade, este teste foi proposto para ser-vir como um teste substituto de proteção pelo menos para o sorogrupo B deN. meningitidis (Holst e outros, 2003, Vaccine, 21:734). Um título de ativida-de bactericida de soro humano (SBA) superior ou igual a 4 mostrou estarrelacionado com proteção.

Em vista disto, a invenção refere-se também a:

(i) ao uso de um complexo de LPS-peptídeo da invenção paratratamento ou prevenção de uma infecção por bactérias Gram-negativas;

(ii) uma composição farmacêutica (de vacina) compreendendoum complexo de LPS-peptídeo da invenção e um diluente ou vículo farma-ceuticamente aceitável;

(iii) uso de um complexo de LPS-peptídeo da invenção napreparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma in-fecção bacteriana Gram-negativa;

(iv) um método para indução de uma resposta imune em ummamífero contra uma LPS de bactérias Gram-negativas ou uma bactériaGram-negativa, o qual compreende administrar uma quantidade eficaz deum complexo de LPS-peptídeo da invenção ao mamífero; e

(v) um método para tratamento ou prevenção de uma infecçãobacteriana Gram-negativa, o qual compreende administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um complexo de LPS-peptídeo da invenção a umindivíduo com necessidade.

Uma composição de vacina da invenção pode ser administradaatravés de qualquer via convencional, em particular através de via sistêmicaou intramuscular; como uma dose única ou como uma dose repetida uma ouvárias vezes, por exemplo, duas ou três vezes em intervalos de, por exem-plo, em intervalos de 1, 2, 3, 6, 10, 12 meses. Uma composição de vacina dainvenção pode ser convenientemente formulada, vantajosamente em formalíquida. Se necessário, um adjuvante pode ser adicionado à composição devacina da invenção; no entanto, é indicado que os complexos da invençãopodem ser suficientemente imunogênicos de modo que a presença de adju-vante nas composições de vacina não é requerida.

A dosagem apropriada depende de vários parâmetros, por e-xemplo, do indivíduo tratado (adulto ou criança), do modo e freqüência deadministração e do estado de desintoxicação de LPS, como pode ser deter-minado por pessoas de habilidade na técnica. Em geral, é indicado que umadose para administração a um ser humano adulto não deve exceder 10.000;vantajosamente 8.000; preferência 5.000; com mais preferência 1.000; commais preferência 500 Unidades de Endotoxina LAL. No ensaio de LAL, o va-lor medido para um complexo da invenção pode ser geralmente tão baixoquanto 10-20 EU/jig. Deste modo/uma dose pode conter de a partir de 1 a500, vantajosamente de a partir de 2,5 a 100, de preferência de a partir de10 a 50, com mais preferência de a partir de 15 a 30 \ig.

É lembrado que, por convenção, quantidades de complexo sãosempre expressas como teor de LPS. Deste modo e a título de exemplo a-penas, "50 fig de complexo" realmente significam 50 |ig de LPS na prepara-ção do complexo.

Os exemplos descritos a seguir ilustram mais a invenção atravésde referência às figuras que seguem.

A figura 1A mostra a estrutura do LPS L8 de N. meningitidis. Kdosignifica ácido 2-ceto, 3-desóxi octulsônico; Hep significa heptose; Glc significaglicose; Gal significa galactose; e GlcNAc significa glucosamina N-acetilada.

A figura 1B mostra a reação que acontece quando do tratamentode LPS com ácido acético.

As figuras 2A-2C mostram o cromatograma de HPLC obtido em214 nm com uma composição compreendendo essencialmente o peptídeoSAEP-L2 em forma monomérica (2A), em forma dimerica paralela (2B) eforma dimerica antiparalela (2C). Coordenadas são: tempos (min) e unidadede absorbância (AU).

A figura 3 mostra o cromatograma de HPLC obtido em 214 nmcom uma composição compreendendo o peptídeo SAEP-L2 em forma mo-nomérica, forma dimerica paralela e forma dimerica antiparalela.

As figuras 4A-4C mostram os espectros de 1H RMN obtidos comuma composição compreendendo essencialmente o peptídeo SAEP-L2 emforma monomérica (4A), em forma dimerica paralela (4B) e forma dimericaantiparalela (3C). Em todas elas, o pico em 1,9 ppm indica que o peptídeoestá em uma forma de sal de acetato.

As figuras 5A-5C mostram um aumento da região dos espectrosde 1H RMN de figuras 4A-4C compreendidos entre 6,5 e 7,5 ppm.

A figura 6 mostra a região de 6,5-7,5 ppm do espectro de 1HRMN obtido com uma composição compreendendo o peptídeo SAEP2-L2 emforma monomérica, forma dimerica paralela e forma dimerica antiparalela.

As figuras 7A-7C mostram os espectros de MALDI-ToF do pa-drão de calibragem (7A), dímero paralelo (7B) e o dímero antiparalelo (7C).

A figura 8 mostra o cromatograma de HPEAC-PAD de LPS hi-drolisada por tratamento com ácido acético.

Exemplo 1: Preparação do dímero paralelo de SAEP-L2

1.1. 1.1. Síntese

A síntese do monômero linear correspondente é conseguida emfase sólida usando um sintetizador automático direcionado por computadorMilligen 9050 (Millipore Inc.) operando com colunas contendo apoios de re-sina, por exemplo, poliestireno ativado com polioxietileno glicol, ou poliacri-lamida ativada, que são apropriadamente ativados de acordo com a escolhado primeiro aminoácido da seqüência de peptídeo selecionada conformedescrito por Atheron & Shepard: em Solid Phase peptide synthesis, 1989,ILR Press, Oxford U.

O ciclo de síntese prossegue etapa por etapa, de acordo com aseqüência linear descrita. Ele é realizado em dimetilformamida solvente pura(DMF). Aminoácidos ativos, protegidos no lado são usados.

O grupo tiol do resíduo Cys na posição 10 (Cys-10) é protegidocom o grupo ácido- lábil Tritil (derivado de trifenil-metila, Trt). O grupo tiol doresíduo Cys na posição 4 (Cys-10) é protegido com o grupo resistente a áci-do de S-acetamido-metila (Acm).

Todos os aminoácidos são ativados no lado-COOH por ésteresde O-penta-fluorfenilfosfato (derivados de O-Pfp). Eles são temporariamenteprotegidos no lado -NH2 por ésteres de 9-fluorenil-metilóxi-carbonila (deriva-dos Fmoc).

Uma vez sintetizado, o peptídeo protegido é clivado a partir doapoio de resina usando TFA a 95% na presença do seqüestrante etanoditiola 2-5% (v/v). Nessas condições, o grupo tiol de Cys-10 é desprotegido, en-quanto o grupo tiol de Cys-4 permanece protegido por Acm. O peptídeo Acmprotegido, livre, é concentrado através de evaporação a vácuo e então recu-perado através de precipitação com éter em concentração final de 80% (v/v).

O peptídeo Cys-4 protegido, Cys-10 desprotegido é seco sobvácuo, então solubilizado em água na concentração de 1 para 10 mg/mL eajustado em pH 7,50 com amônia aquosa a 0,1 M. A fim de obter dimeriza-ção através dos resíduos Cys 10, oxidação é então realizada através de agi-tação vigorosa da solução aquosa a 4°C, sob uma pressão de 1 Atm, por 18-24 horas. Oxidação completa do grupo tiol é determinada através do ensaiocolorimétrico Elman.

O peptídeo parcialmente oxidado em solução na concentraçãode 1 a 10 mg/mL é então processado para desproteção das funções de Cys-4 S-Acm restantes. Para esta finalidade, a solução de peptídeo é adicionadacom acetato mercúrico em uma concentração final de 0,1 M, usando fenol a2,5% (v/v) como seqüestrante. A solução é novamente vigorosamente agita-da a 20°C, sob uma pressão de 1 Atm, por 18-24 horas. Oxidação completado grupo tiol é determinada através do ensaio colorimétrico Elman.

1.2. Purificação

A fim de remover as moléculas de peso molecular baixo contidasna preparação de peptídeo (seqüestrante, acetato mercúrico, etc), esta últi-ma é aplicada em uma coluna de fase reversa Sep-Pack (Millipore) operadasob pressão de 1 Atm. Em um solvente aquoso, o peptídeo é retido na colu-na através de forças hidrofóbicas, enquanto todas as moléculas de baixopeso molecular, hidrossolúveis, vão com o fluxo. O peptídeo é então eluídopor uma mistura de metanol-água 50-70% (v/v). O peptídeo eluído no sol-vente alcoólico é recuperado através de concentração a vácuo e solubilizadonovamente em água na concentração desejada.

Purificação final é obtida em coluna C18 de fase reversa opera-da por HPLC (dimensões = 250 x 4 mm) usando um gradiente linear a 0-100% de Solvente A (TFA a 0,1% (ácido trifluoracético) em água) e SolventeB (acetato de nitrila a 80% em água). Nessas condições, o dímero paraleloelui como um pico definido único. Frações de pico são recuperadas.

A preparação é mantida em forma liofilizada, a +2 - +6°C, sobum gás neutro, argônio ou nitrogênio.

1.3. Caracterização do peptídeo purificado

1.3.1. Composição do aminoácido

A composição de aminoácido é analisada através do métodoPico-Tag (Millipore). Os resultados são relatados na tabela abaixo.

<table>table see original document page 23</column></row><table>1.3.2. Massa molecular

A massa molecular é medida através de lon Cyclotron Resonan-ce (ICR). O valor encontrado é 2.387,33±0,3 AMU, um valor coerente com aestrutura elementar Cn0 H190 024 N2e S4 da fórmula de peptídeo.

Exemplo 2: Preparação do monômero e dímero antiparalelo de SAEP2-L2

2.1. Síntese

A síntese do monômero linear é realizada como no Exemplo 1,exceto que uma metodologia diferente é usada para proteção dos grupostióis do resíduo cisteína: Ambos Cys-4 e -10 são protegidos em seu grupo -SH pelo grupo ácido-lábil Tritil (trifenil-metila,

O peptídeo protegido é clivado do apoio de resina por TFA a95% na presença do seqüestrante Etanoditiol a 2-5% ( v/v). Nessas condi-ções, os grupos tióis de ambos os resíduos Cys-4 e -10 são desprotegidos.

O peptídeo clivado e desprotegido é então concentrado sob evaporação comvácuo e recuperado através de precipitação com éter a 80% (v/v).

O peptídeo desprotegido é solubilizado em água na concentraçãode 1 a 10 mg/ml_ e o pH é ajustado para 7,50 com amônia aquosa a 0,1 M,

Oxidação é então realizada através de agitação vigorosa da so-lução aquosa por 18-24 horas, a 4°C, sob pressão de 1 Atm. Oxidação com-pleta do grupo tiol é determinada através do ensaio colorimétrico Elman.

2.2. Purificação dos peptídeos

Os peptídeos em solução realmente constituem uma mistura demonômero cíclico (cerca de 40%) e dímero antiparalelo (cerca de 60%). Ca-da forma é purificada através de cromatografia de HPLS de Fase reversapreparativa. Na verdade, é possível separar o monômero cíclico do dímeroantiparalelo uma vez que essas formas eluem, cada uma como um pico de-finido único, em tempos de retenção diferentes. O dímero antiparalelo eluiem um tempo de retenção menor. Isto está de acordo com a simetria mole-cular diferente dos dois dímeros. O peptídeo antiparalelo pode assumir umaenergia mínima menor em solventes aquosos em virtude de seu impedimen-to estérico interno menor das cadeias laterais, similarmente à conformação"trans" vs "eis" de quaisquer outras entidades isoméricas.Todas as preparações são mantidas em forma liolifizada, a+2 - +6°C, sob um gás neutro, argônio ou nitrogênio.

2.3. Caracterização do dímero antiparalelo

2.3.1. Composição de aminoácido

A composição do aminoácido é analisada através do métodoPico-Tag (Millipore). Os resultados são relatados na tabela abaixo.

<table>table see original document page 25</column></row><table>

2.3.2. Massa molecular

A massa molecular é medida através de lon Cyclotron Resonan-ce (ICR). O valor encontrado é 2.387,30±0,3 AMU, um valor coerente com aestrutura elementar Cno Hi90 024 N26 S4 da fórmula de peptídeo.

Exemplo 3: Caracterização adicional do monômero, dímeros paralelos e an-tiparalelos através de espectrometria de massa de fase reversa-HPLC, RMNe MALDI-ToF

O peptídeo paralelo dimérico conforme preparado no Exemplo 1e os peptídeos monoméricos e diméricos antiparalelos conforme preparadono Exemplo 2 são caracterizados por HPLC de fase reversa (Figuras 2A-2C)e MR (Figuras 4A-4C e 5A-5C).

3.1. Caracterização através de HPLC de fase reversa

Condições experimentais

Esta técnica é realizada em uma cadeia de HPLC (Waters®) u-sando um software Millenium 32 V30501 (Waters®) para aquisição de dados.

A coluna analítica Macherey Nagel® ref. 720014.6 (Nucleosil 5 |nm C18 100

Angstrõm 250x4,6 mm) é operada a 25°C.

30-40 |ig de cada peptídeo liofilizado são diluídos primeiro em 30 uJde água; à qual são adicionados 30 jllI de ácido trifluoracético (TFA) a 0,1%em água.

Uma mistura de peptídeos monoméricos, diméricos paralelos eantiparalelos é também preparada misturando 40 |a,g de uma preparação empó de cada peptídeo em 60 jil de água; à qual são adicionados 60 |il de TFAa 0,1% em água.

A coluna é equilibrada usando 20% de fase móvel B (TFA a0,1%, CH3CN a 80% em água). Uma vez as amostras tendo sido aplicadas àcoluna equilibrada, o gradiente da fase B vai de 20 para 60% dentro de 40minutos (1% B/min), em uma taxa de fluxo de 1 mL/min.

Detecção é conseguida em 214 nm. Os resultados devem servistos nas Figuras 2A-2C.

Resultados

Cada peptídeo é eluído em um tempo de retenção diferente. Nascondições experimentais descritas acima, eluição acontece no tempo de re-ação que segue ( RT):

monômoero: RT = 28,283 min

dímero paralelo: RT = 29,708 min

dímero antiparalelo: RT = 22,059 min

A técnica de HPLC-RP é usada para verificar a pureza de cadapreparação de peptídeo. O grau de pureza relativo de cada peptídeo é calcu-lado integrando as superfícies de pico. Ele é expresso como a superfí-cie/superfícies de pico de peptídeo de todos os picos.

Nas figuras 2A-2C, pode ser visto que preparações monômero ede dímero paralelo e antiparalelo exibem um grau de pureza de 98, 96,9 e97%, respectivamente.

A figura 3 mostra o cromatograma de HPLC da mistura.

3.2. Caracterização através de RMN

Condições experimentais

Análise de 1H RMN (500 MHz, 25°C, pré-saturação de HOD) érealizada usando amostras de peptídeos diluídas em mistura de H20/D20(9/10 v/v). Um espectrômetro Bruker® DRX500 e software associado paraaquisição de dados são usados.Em mais detalhes, preparações de peptídeos mantidas a -70°Csão usadas para análise. Soluções de peptídeo diméricas a 0,5 mM são pre-paradas enquanto diluindo 1,33 g em 1 mL de h20. 144jj.I das soluções sãomisturados com 16 (il de D20 a 99,9% D em tubos de RMN de 3 mm. Paracalibragem, uma solução externa de sal de sódio de ácido TSP-d4 (3-(trime-tilsilil)propiônico-2,2,3,3,-d4; Aldrich ref. 29304-0) 0,075% (p/p) em misturade H20/D20 (90/10 v/v) é usada. O espectrômetro é calibrado de modo queo sinal de ressonância único de TSP-d4 esteja a 0 ppm.

Resultados

Nas condições experimentais usadas, espectros de 1H RMN domonômero e dímeros cobrem uma faixa de a partir de 0 a 9,5 ppm e sãocompostos de 3 regiões principais:

- de a partir de 6,5 a 7,5 ppm;

- de a partir de 5,5 a 2,5 ppm; e

- de a partir de 2 a 0,3 ppm.

Isto deve ser visto nas Figuras 4A-4G.

Espectro de 1H RMN do monômero é caracterizado por um pa-drão de RMN de 5 prótons aromaticos que são esperados entre 7,25 e 7,45ppm, nas condições experimentais relatadas acima. No experimento relatadona Figura 5A, este padrão de RMN é composto de uma primeira forma multi-pleto de 7,25 a 7,35 ppm com uma curva integral correspondendo a 3H e umsegundo multipleto (pseudo-tripleto), centrado em 7,39 ppm com uma curvaintegral de 2H. Este último sinal é característico de monômero apenas.

Espectro de 1H RMN do dímero paralelo é caracterizado por umsinal dupleto entre 7,10 e 7,25 ppm correspondendo a 4 prótons aromaticose um multipleto entre 7,25 e 7,40 ppm com uma curva integral de 6H. Noexperimento relatado na Figura 5B, o dupleto 4H é encontrado centrado em7,185 ppm (picos em 7,18 e 7,19 ppm).

Espectro de 1H RMN do dímero antiparalelo é caracterizado porum sinal dupleto de 4 prótons aromaticos entre 6,95 e 7,10 ppm correspon-dendo e um multipleto entre 7,10 e 7,30 ppm com uma curva integral de 6H.

No experimento relatado na Figura 5C, o dupleto 4H é encontrado centradoem 7,025 ppm (picos em 7,02 e 7,03 ppm).

Conforme mostrado na Figura 4C, o espectro de 1H RMN do dí-mero antiparalelo é também caracterizado por duas ressonâncias metílicas amontante que são esperadas entre (i) 0,40 e 0,65 (dupleto) e (ii) 0,70 e 0,85ppm (dupleto). Em um experimento, esses dupletos são encontrados centra-dos em 0,42 e 0,68 ppm. Eles não são observados nem no monômero nemno dímero paralelo.

3.3. Identificação através de espectrometria de massa MALDI-ToF

Análise através de espectrometria de massa MALDI-ToF (loni-zação por Dessorção a Laser Assistida por Massa - Tempo-de-vôo) permitea determinação de massa monoisotrópica do peptídeo. Esta técnica não dis-crimina os dímeros antiparalelos e paralelos.

Condições experimentais

Análise MALDI-ToF é obtida usando o espectrômetro de massaBiflex III (Bruker®) e softwares associados, em um modo refletor positivo.Peptídeos são misturados com uma matriz (ácido alfa ciano-4-hidróxi cinâ-mico) que absorve energia de laser.

O espectrômetro é externamente calibrado com uma mistura depeptídeos sintéticos (fragmento 18-39 ACTH (adenocorticotrópico 18-39))bombesina e somatostatina 28.

Uma solução de matriz de HCCA saturada é preparada enquan-to diluindo 50 mg de HCCA em 300 uJ de ACN a 70% (acetonitrila) e TFA a0,1% (ácido trifluoracético) em água.

Uma solução de HCCA Vz saturada é ainda preparada enquantodiluindo vohvol com ACN a 30%, TFA a 0,1% em água.

Para calibragem, soluções padrão primárias são primeiro prepa-radas em 0,1% de TFA. Elas são como segue:

- fragmento adenocorticotrópico 18-39 (ACTH 18-39):100 pmols/^J(0,247 mg/mL);

- Bombesina: 100 pmols/^l (0,160 mg/mL); e

- Somatostatina 28: 100 pmols/nl (0,31 mg/mL).Uma solução padrão secundária é preparada como segue:- ACTH 100 pmols/uJ 2

- Bombesina 100 pmols/nJ 4 jlxI

- Somatostatina 100 pmols/(i.l 4 uJ

- ACN 30%, TFA 0,1% 50 |xl

Soluções de peptídeo a 1 mg/mL. em água são diluídas para0,02 mg/mL com ACN a 30%, TFA a 0,1 % em água.

Amostras de calibragem e peptídeo são diluídas vokvol com a V2solução de HCCA saturada. Gotículas de cerca de 1 |xl são depositadas emum destino de aço (Bruker®) e secas através de evaporação.

Resultados

Os resultados devem ser vistos nas Figuras 7A-7C.As massa monoisotrópicas teóricas calculadas pelo softwarebaseado nas seqüências de aminoácido são:

ACTH 28 M+H+ = 2465,199 Da

Bombesina M+H+ = 1619,823 Da

Somatostatina 28 M+H+ = 3147,471 Da

SAEP2-L2 M+H+ = 2388,35 Da.

O critério de retenção para o controle é fixado a ± 2 Da em rela-ção a massa teórica.

Conforme mostrado na Figura 7A, os valores experimentais encon-trados para os peptídeos de calibragem são 2465,225, 1619,814 e 3147,454 Darespectivamente. O desvio de medida interna é então (0,026+0,009+0,017)/7232,493=7,2 ppm. (autorizado < 50 partes por milhão).

Conforme mostrado nas Figuras 7B e 7C, os valores experimen-tais encontrados para as preparações de dimero paralelo e antiparalelo são2388,449 e 2388,532 Da. Esses valores estão dentro da faixa de identidade(+2 Da) centrados na faixa de valores teóricos. Isto significa que as amostrascontêm o que é esperado.

Exemplo 4: Preparação de complexo/agregado de LPS L8/peptídeo I"

4.1. Preparação de LPS L8

4.1.1. Cultura de Meninqe

Pré-cultura: Amostras congeladas de 2 ml de semente de traba-lho de uma cepa A de N. meningitidis para expressar LPS exclusivamentesob a forma L8 são usadas para inocular em um erlen de 2 I contendo 200ml_ de caldo Mueller-Hinton (Merck) complementado com 4 ml_ de uma solu-ção de glicose em água (500 g/l). Esta operação é repetida 4 vezes. Erlenssão incubados a 36 ± 1°C por 10 ± 1 hora enquanto agitando (100 rpm).

Cultura: Os conteúdos do erlen são reunidos e a pré-cultura écomplementada com 400 ml_ de uma solução de glicose em água (500 g/l) e800 ml_ de uma solução de aminoácido. Esta preparação é usada para ino-cular o caldo Mueller-Hinton, em um fermentador de 30 I (B. Braun®) em umOD6oo nm inicial próximo de 0,05. Fermentação é realizada da noite para o diaa 36°C, pH 6,8 ± 0,2, 100 rpm, p02 a 30% e taxa de fluxo inicial do ar 0,75l/min/L de cultura. Após 7 ± 1 hora, (OD6oo nm de cerca de 3), a cultura éalimentada pelo caldo de MH em uma taxa de fluxo de 440 g/h. Quando aconcentração de glicose é menor do que 5 g/l, a fermentação é parada. Ge-ralmente, o OD6oonm final é compreendido entre 20 e 40. As células são cole-tadas através de centrifugação por 1 h e 30 min a 7000 g a 4°C. Péletes sãomantidos congelados a -35°C.

4.1.2. Purificação de LPS

Primeira extração de fenol

Péletes são derretidos e suspensão com 3 volumes de fenol a4,5% (v/v) e agitados vigorosamente por 4 horas no mínimo em cerca de 5°C.

A suspensão bacteriana é aquecida a 65°C e então misturadav/v com fenol a 90% a 65°C. A suspensão é agitada vigorosamente, a 65°C,por 50-70 minutos e então esfriada para cerca de 20°C.

A suspensão é centrifugada por 20 minutos, a 11.000 g, em cer-ca de 20°C. A fase aquosa é coletada e guardada. A fase de fenol e a inter-fase são recuperadas e submetidas a uma segunda extração.Segunda extração de fenol

A fase de fenol de interfase são aquecidas a 65°C e misturadascom um volume de água equivalente ao volume da fase aquosa que foi ante-riormente coletada. A mistura é agitada vigorosamente por 50-70 minutos a65°C e então esfriada para cerca de 20°C. A mistura é centrifugada por 20minutos, a 11.000 g, em cerca de 20°C. A fase aquosa é coletada e guarda-da. A fase de fenol e a interfase são recuperadas e submetidas a uma tercei-ra extração.

Terceira extração de fenol: Procedimento para a segunda extraçãoé repetido.

Diálise

A 3 fases aquosas são dialisadas da noite para o dia e separa-damente contra 40 I de água. Os dialisatos são agrupados. O grupo de diali-sato é ajustado com Tris a 20 mM, MgCI2 a 2 mM (um volume por 9 volumesdo grupo de dialisato). O pH é ajustado para 8,0 ± 0,2 com NaOH a 4N.

Tratamento de DNAse

250 Ul de DNAse são adicionadas por grama de pélete bacteria-no tratado (peso líquido). A preparação é agitada a 37 ± 2°C por 55-65 minu-tos. O pH é ajustado a 6,8 ± 0,2. A preparação é filtrada em membranas de0,22 u.m.

Filtragem em gel: A preparação é purificada em uma coluna Se-phacryl S-300 (5,0 x 90 cm; Pharmacia®).

Primeira precipitação alcoólica

Pó de MgCI2, 6H20 é adicionado às frações contendo LPS agru-padas, para atingir uma concentração de MgCI2 de 0,5 M e dissolvido en-quanto agitando.

Enquanto agitando a 5 ± 3°C, álcool absoluto desidratado é adi-cionado para uma concentração final de 55°C (v/v). Agitação é realizada danoite para o dia a 5 ± 3°C, seguido por centrifugação a 5.000 g por 30 minu-tos a 5 ± 3°C. Os sobrenadantes são descartados e os péletes são submeti-dos a uma segunda extração.

Segunda precipitação alcoólica

Os péletes são ressuspensos com pelo menos 100 ml_ de Mg-Cl2, 0,5 M, enquanto agitando. O procedimento anterior é repetido. Péletessão ressuspensos com pelo menos 150 ml_ de água.

Etapa final: Filtragem em gel é repetida e as frações contendoLPS agrupadas são finalmente esterilizadas através de filtragem (0,8-0,22um) e mantidas a 5 + 3°C.

Como um controle preliminar, a preparação de LPS é analisadaatravés de eletroforese de SDS-PAGE. Quando do fingimento com nitrato deprata, uma faixa larga única é revelada. Isto indica pelo menos que a prepa-ração não contém nenhuma entidade que não LPS L8.

O processo de purificação conforme descrito permite a obtençãode cerca de 150 mg de LPS L8 por litro de cultura (rendimento de cerca de50%).

4.1.3. Quantificação de LPS L8: dosagem de KDO com HPAEC-PAD

A referência bibliográfica para esta técnica é Kiang e outros(1997) Determination of 2-keto-3-deoxyoctulosonic acid (KDO) with high per-formance anion exchange chromatography (HPAEC): Survey os stability ofKDO and optimal hvdrolvtic conditions Anal. Biochem. 245:7.

Conforme mostrado nas Figuras 1A-1B, LPS compreende emsua estrutura 2 unidades de KDO, uma estando em uma posição lateral.

Quantificação de LPS é obtida através da dosagem da unidadede KDO lateral liberada quando da hidrólise de ácido mole (Vide Figura 1B).Hidrólise de ácido

Amostras da preparação de LPS obtidas após a última diafiltra-gem de seção 4.1.2. são recuperadas e diluídas com água sob um volumefinal de 400 jxl em frascos Dionex® de 1,5 mL de modo que a concentraçãode LPS das amostras cai abaixo da faixa do etalon (1,4-72,1 n.g/mL).

Amostras a serem quantificadas bem como a faixa de etalon deKDO são procedidas como segue: 100 jllI da solução de hidrólise (ácido acé-tico a 5%; ácido glucurônico (GlcA) 20 |ig/mL) são adicionados. Hidrólise érealizada por 1 hora a 100°C. Os frascos são então secos a 40°C sob nitro-gênio e enchidos com 400 jxl de água.

Dosagem

Esta técnica é realizada em uma cadeia HPAEC (Dionex®) u-sando o software Chromeleon Dionex® para aquisição de dados. A colunaanalítica Carbopac PA1 4 x 250 mm (Dionex®) é operada a 30°C.A coluna é equilibrada com a solução de eluição (NaOH a 75mM, AcONa a 90 mM). 100 |a.l de amostra são injetados na coluna. Então acoluna é submetida a uma taxa de fluxo de eluiçãode 1 mL/min por 22 minutos.

Cromatograma de amostra de LPS deve ser visto na Figura 8. Aquantidade de KDO presente na amostra é determinada através da integra-ção do pico de KDO. Como um mol de KDO liberado através de hidrólisecorresponde a um mol de LPS, é possível determinar a concentração deLPS da preparação inicial.

4.2. Preparação de peptídeos: Peptídeos são preparados de acordo com oprocesso descrito nos Exemplos 1 e 2 acima.

4.3. Preparação do complexo/agregado de LPS L8/peptídeo I"

LPS purificado é usado como uma pseudossolução a 1 mg/mLem água livre de pirogênio, estéril, (qualidade Milli Q, ajustada para pH 7,2Limulus negativo). A pseudossolução translúcida é esterilizada através defiltragem usando uma membrana de 0,22 fim.

Uma solução de peptídeo SAEP2-L2 em 1 mg/mL em água livrede pirogênio, estéril, (qualidade Milli Q, ajustada para pH 7,2 Limulus negativo)é também esterilizada através de filtragem em uma membrana de 0,22 fim.

Todas as próximas etapas são obtidas sob condições estéreis.

Um volume da pseudossolução de LPS é adicionado a um volu-me da solução de peptídeo SAEP2-L2. Um precipitado (complexo de endo-toxina) imediatamente aparece. Agitação é realizada por 5 minutos em tem-peratura ambiente. A preparação é deixada descansar a +4°C da noite parao dia.

O precipitado (Endotoxina) é então recuperado através de centri-fugação a 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante é descartado.

O pélete é lavado com um volume de água livre de pirogênio,estéril, (qualidade Milli Q, ajustada para pH 7,2 Limulus negativo). Etapas decentrifugação/lavagem são repetidas cinco vezes.

Por último, o pélete é ressuspenso em água livre de pirogênio,estéril, (qualidade Milli Q) pH = 7,2, em concentração de cerca de 1 mg/mL,com base no peso úmido do precipitado. A suspensão é armazenada a+4°C. Uma dosagem de KDO é obtida para determinar o teor de LPS e asuspensão é ajustada para, por exemplo, 0,50 mg/mL de complexo (expres-so como teor de LPS).

O complexo de LPS-peptídeo testado nos exemplos que seguemé o complexo de LPS- dímero antiparalelo conforme obtido na seção 4.3, amenos que de outro modo indicado. Deste modo, o complexo específico ésimplesmente referido como complexo de LPS-peptídeo.

De uma maneira similar, o LPS conforme obtido na seção 4.2 ésimplesmente referido como LPS.

Comparação de LPS e complexo de LPS-peptídeo é conseguidausando o lote de LPS também usado para a preparação do complexo.

Exemplo 5: Avaliação da desintoxicação do complexo de LPS-peptídeo

Vários ensaios são usados para avaliar a desintoxicação.

5.1. Ensaio de Lisato de Amebócito Limulus (LAL)

Neste ensaio, a habilidade dos dímeros antiparalelo e paralelode SAEP2-L2 e do monômero cíclico de SAEP2-L2 de LPS desintoxicado écomparada. Para esta finalidade, os complexos de LPS-peptídeo envolvendoo dímero paralelo ou o monômero são preparados exatamente como é des-crito no Exemplo 4 para o complexo de LPS-peptídeo antiparalelo.

LAL é um teste muito sensível usado para detectar e quantificarendotoxinas de bactérias gram-negativas. O teste é baseado na propriedadeda proteína de lisato de amebócito de límulo {Limulus polyphemus) em indu-zir coagulação na presença de endotoxina.

A avaliação da atividade da endotoxina LPS é realizada usandoa técnica cromogênica de ponto final, de acordo com a European Pharma-copoeia [conforme descrito nas técnicas da European Pharmacopoeia (Edi-ção 5.0, parágrafo 2.6.14)]. Para esta finalidade, o estojo QCL-1000 ref. 50-647 U (Cambrex-BioWhittaker®) é usado (zona linear do estojo: 0,1 a 1UI/mL) bem como um controle positivo (endotoxina E. coli, 4 103 EU/mL,Sigma).

Diluições de (i) amostras a serem testadas, (ii) controle padrão e(iii) positivo são conseguidas com tampão de diluição (Cambrex-BioWhittaker®)para cobrir as respectivas faixas: 1/10 a 1/105; 0,5 a 0,031 EU/mL e 1/104 a1,8 104.

50 ul de diluições de amostra, padrão e de controle positivo sãodispensados por cavidade de placa de ELISA de 96 cavidades de fundo pla-no. Cinqüenta uJ de lisato são adicionados por cavidade. Incubação é conti-nuada por 10 minutos a 37°C. Então 100 (xl do substrato cromogênico de p-nitroanilina são adicionados. Incubação é continuada por 6 minutos a 37°C.A reação cromogênica é parada enquanto adicionando 100 uJ de ácido acé-tico congelado a 25% em água. A placa é lida através de espectrometria a405 nm.

Os resultados são expressos em Unidade de Endotoxina (EU)/ug de complexo. Eles são mostrados na tabela abaixo. A razão de desintoxi-cação pode ser estabelecida pela razão de LPS/complexo de LPS-peptídeoe expressa em unidade log.

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Como pode ser visto, as formas diméricas do peptídeo SAEP2-L2 são mais eficazes na desintoxicação de LPS do que a forma de monôme-ro cíclico.

5.2. Teste de piroqênio em coelhos

O coelho é sabido ser a espécie animal com sensibilidade aosefeitos pirogênicos de LPS equivalente em seres humanos. O teste de piro-gênio consiste em medição do aumento da temperatura do corpo evocadaem três coelhos através da injeção intravenosa (IV) de uma solução estérildas substâncias a serem examinadas. O teste, leitura e cálculos são realiza-dos de acordo com a European Pharmacopoeia, (Edição 5.0, parágrafo2.6.8). O aumento de temperatura é interpretado dependendo da respostasomada das temperaturas: conformidade é satisfeita quando a resposta so-mada não excede 1,15°C; e não-conformidade, quando a resposta somadaexcede 2,65°C. No presente caso, o limiar pirogênico é ajustado abaixo, en-tre 1,15°C e 2,65°C.

Conforme verificado, a dose de pirogênio limite (IV) em coelhocorresponde a 0,025 ng/kg (LPS) e 10-25 ng/kg (complexo de LPS-peptí-deo). Esses resultados mostram que o complexo de LPS-peptídoe é menospirogênio do que LPS, quando dado através da via intravenosa. Conformemedido nesse teste, a razão de desintoxicação (complexo de LPS-peptí-deo/LPS) está entre 400 e 1.000.

5.3. Ensaio de toxidez aguda: LD50 em camundongos sensibilizados por D-galactosamina

Referências para este ensaio incluem entre outros Galanos eoutros, 1979, PNAS 76:5939; Baumgartner e outros, 1990, J. Exp. Med. 171(3):889e US 6.531.131.

Grupos de camundongos fêmea consangüíneos (inbred) de oitosemanas de vida são injetados através da via intraperitoneal (IP) (0,5 mL)com doses em aumento de LPS ou complexo de LPS-peptídeo, um poucoapós serem tratados com D-galactosamina (15 mg, 0,2 mL) através de via IP(a toxidez do LPS é aumentada de cerca de 1.000 vezes com o tratamentode D-galactosamina que torna o modelo muito sensível). A taxa de morte éentão acompanhada durante quatro dias.

A LD50 observada com o LPS é 3,6 ng/camundongo (1,91-6,70ng/camundongo); enquanto aquela observada com o complexo de LPS-peptídeo é 1 fig/camundongo (0,25 fig/camundongo), indicando que a razãode desintoxicação (complexo de LPS-peptídeo/LPS) é cerca de 2500 (100-1000).5.4. Atenuação dos efeitos pró-inflamatórios de LPS guando complexadocom peptídeo

A fim de avaliar até qual ponto o complexo de LPS-peptídeo podeatenuar efeitos tóxicos induzidos por LPS, o efeito do complexo de LPS-peptí-deo sobre a liberação de citocinas pró-inflamatórias é monitorado (avaliado)em ensaios in vitro e in vivo.

m In vivo: Liberações de citocina (IL6 e TNFa) nos soros de ca-mundongos imunizados ou com LPS ou complexo de LPS-peptídeo sãocomparadas através de ELISA. Amostras de soro são recuperadas 90 minu-tos após imunização SC, que é o tempo ótimo para a liberação dessas cito-cinas. Cepas de camundongo C3H/HeOuJ, TLR4--/--, C3H/HeN e CD1 sãotestadas. As duas primeiras não são sensíveis nem a LPS nem complexo deLPS-peptídeo. As terceira e quarta são ambas verificadas ser sensíveis aLPS. Camundongos CD1 são verificados ser mais sensíveis a complexo deLPS-peptídeo do que os outros e então selecionados para quatro experimen-tos retendo as condições mais severas.

In vitro: Liberações de citocina (IL6, IL8 e TNFa) de culturas decélula de sangue integral humano estimuladas por 24 horas a 37°C, comconcentrações diferentes de LPS ou complexo de LPS-peptídeo, são compa-radas.

5.4.7. 5.4.1. Ensaio in vivo

Camundongos CD1 são administrados subcutaneamente (SC)ou com 10 |i.g de LPS ou (ii) 10 |a.g de complexo de LPS-peptídeo. Eles so-frem sangria 90 minutos após injeção. Liberações de IL6 e TNFa são medi-das nos soros através de ELISA.

Detecção por ELISA de secrecão de citocina

ELISAs são realizados usando os conjuntos de IL6 e TNFAa decamundongo OptEIA (Pharmingen), cada um incluindo o anticorpo de captu-ra (citocina anticamundongo), o anticorpo de detecção (citocina anticamun-dongo biotinilada), conjugado de avidina-peroxidase de rábano silvestre e opadrão (citocina recombinante), todos da Pharmingen.

Anticorpos IL6 e TNFa anticamundongo são diluídos 1/250 emtampão de carbono a 0,1 M pH 9,5 (Sigma). Para cada ensaio, 100 jlx! deuma diluição de anticorpo são distribuídos por cavidade de uma placa deELISA de 96 cavidades de fundo plano Maxisorp NUNC. As placas são incu-badas da noite para o dia a +4°C.

As placas são lavadas em Tween 20 PBS a 0,05%. 200 jxl dePBS, tampão de saturação de albumina de soro bovino (BSA) a 0,5%, sãoentão adicionados por cavidade. Incubação é continuada por uma hora emtemperatura ambiente. As placas são lavadas em Tween 20 PBS a 0,05%.

Diluições de citocina IL6 ou TNFa recombinante são preparadasem meio RPMI 1% FCS 10%, dentro da faixa de (i) 4.000 pg/mL - 62,5pg/mL padrão. 100 jlxI de cada diluição são distribuídos por cavidade, paraestabelecer a curva padrão.

Diluições de soro são preparadas no meio RPMI P.S. glu 1%FCS 10%. Soros de camundongos injetados com LPS são diluídos 1/25 e1/125. Soros de camundongos injetados com complexo de LPS-peptídeosão diluídos 1/5 e 1/25. 100 uJ de cada diluição são distribuídos por cavidade.

Incubação é continuada por 2 horas em temperatura ambiente.

As placas são lavadas em Tween 20 PBS 0,05%. Anticorpos decitocina anticamundongo biotinilados e as enzimas são cada um diluídos1/250 em soro bovino fetal PBS 10%. 100 fil de cada diluição são adiciona-dos por cavidade. Incubação é continuada por uma hora em temperaturaambiente.

As placas são lavadas em Tween 20 PBS 0,05%. 100 desubstrato de tetrametilbenzidina (TMB) (soluções de TMB A e B (KPL) mistu-radas vol/vol) são distribuídos em cavidades. A incubação é continuada por10-30 minutos em temperatura ambiente.

A reação é parada através da adição de 100 |xl de MH3P04 a 1Mpor cavidade. As placas são lidas a 450 nm. Os resultados devem ser vistosna tabela abaixo.<table>table see original document page 39</column></row><table>

O peptídeo sozinho não induz IL6 ou TNFa. O complexo de LPS-peptídeo permite cerca de 100 vezes de desintoxicação (diminuição de 100vezes na secreção de IL6).

5.4.2. Ensaio In vitro

Preparação das substâncias de teste

Preparação de LPS (1 mg/mL) e complexo de LPS-peptídeo(500 u.g/mL) são diluídos cada um em Tris a 10 mM, NaCI a 150 mM, Tween20 a 0,05%, sacarose a 5% para uma concentração de 50 |ig/mL. Eles sãodiluídos mais em solução salina fisiológica para uma concentração de 5 ug/mL.

Diluições seriais 1/5 são realizadas em meio AIM-V (Gibco (Invi-trogen)) para cada sustância de teste para uma concentração menor do que2,56 10"3pg/mL.

Estimulacão

Sangue humano coletado em heparina de sódio (25.000 U/5 mL;sanofi-synthelabo) é diluído 1:4 (vohvol) em meio AIM-V e distribuído emtubos Micronics® (400 u.g/tubo). 100 jil de uma diluição das substâncias deteste são adicionados. Controles de peptídeo e tampão são testados em di-luição 1/20. Tubos são incubados por 24 horas a 37°C em uma atmosferaúmida de C02 a 5%.

Recuperação de plasma

Tubos são então centrifugados por 10 minutos a 500 g. Pelomenos 200 jllI de sobrenadante são recuperados de cada tubo e mantidoscongelados a -80°C sob titulação.Detecção por ELISA de secrecão de citocina

ELISAs são realizados usando os conjuntos de IL6, IL8 e TNFahumanos OptEIA da Pharmingen, cada um incluindo o anticorpo de captura(citocina anti-humana de camundongo), o anticorpo de detecção (citocinaanti-humana de camundongo biotinilada), conjugado de avidina-peroxidasede rábano silvestre e o padrão (citocina recombinante).

Anticorpos de IL6, IL8 e TNFa anti-humanos são diluídos 1/250vezes em um tampão de carbonato a 0,1 M pH 9,5 (Sigma). Para cada en-saio, 100 [i\ de diluição de anticorpo são distribuídos por cavidade de umaplaca ELISA de 96 cavidades de fundo plano Maxisorp NUNC. As placas sãoincubadas da noite para o dia a +4°C.

As placas são lavadas em Tween 20 PBS 0,05%. 200 \ú de PBS,tampão de saturação de albumina de soro bovino (BSA) 0,5%, são entãoadicionados por cavidade. A incubação é continuada por uma hora em tem-peratura ambiente. As placas são lavadas em Tween 20 PBS 0,05%.

Diluições de citocina IL6, IL8 ou TNFa recombinante são prepa-radas em meio AIM-V dentro da respectiva faixa de (i) 1.200 pg/mL - 18,75pg/mL; (ii) 800 pg/mL - 12,5 pg/mL; e (iii) 1.000 pg/mL - 15,87 pg/mL pa-drão. 100 uJ de cada diluição são distribuídos por cavidade, para estabelecera curva padrão.

Diluições de plasma são preparadas no AIM-V. Plasmas recupe-rados de sangue estimulado com LPS são diluídos 1/25 e 1/125. Aquelesrecuperados de sangue em contato com o complexo de LPS-peptídeo sãodiluídos 1/5 e 1/25. 100 uJ de cada diluição são distribuídos por cavidade.

A incubação é continuada por 2 horas em temperatura ambiente.

As placas são lavadas em Tween 20 PBS 0,05%. Anticorpos decitocina anti-humano biotinilados e a enzima são cada um diluídos 1/250 emsoro bovino fetal PEB 10%. 100 jil de cada diluição são adicionados por ca-vidade. Incubação é continuada por uma hora em temperatura ambiente.

Placas são lavadas em Tween 20 PBS 0,05%. 100 |j,l de substra-to de tetrametilbenzidina (TMB) (soluções de TMB A e B (KPL) misturadasvol/vol) são distribuídos em cavidades. Incubação é continuada por 10-30minutos em temperatura ambiente.

A reação é parada adicionando 100 (il de H3P04 a 1M por cavi-dade. As placas são lidas a 450 nm.

Resultados

Os resultados brutos e as curvas de liberação de citocina = f(Concentrações de LPS ou complexo) não permitem comparação de amos-tras diferentes. O cálculo da razão de desintoxicação pode eliminar variabili-dade inter-sangue e inter-teste. Apenas as partes lineares das curvas sãolevadas em consideração para cálculo da razão de desintoxicação. A libera-ção de IL6 máxima além da qual uma progressão linear não é mais observa-da é determinada e então, a quantidade de substância requerida para induzir50% desta máxima é calculada através de regressão linear.

A razão de desintoxicação é expressa como a razão da concen-tração do complexo de LPS-peptídeo induzindo 50% de liberação de IL6máxima (ED50 expressa em pg/mL) sobre aquela observada com LPS.Quanto maior a razão, mais forte a desintoxicação é. Como a razão de de-sintoxicação é sistematicamente medida usando sangue integral de váriosdoadores independentes, é feita uma média dos resultados.

A razão de desintoxicação observada com o complexo de LPS-peptídeo é medida várias vezes. Dados médios de seis valores obtidos noensaio de liberação de IL6: 64 ±20.

A liberação de IL6 se relaciona com as secreções de TNFa eIL8. Deste modo, o ensaio de liberação de IL6 é selecionado para avaliarrotineiramente a diminuição de inflamação observada com o complexo deLPS-peptídeo.

5.5. Conclusão

A razão de desintoxicação é medida entre 102 e 103, dependen-do do teste. Os valores de desintoxicação são sumarizados na tabela que segue.<table>table see original document page 42</column></row><table>

Exemplo 6: Estudo da estabilidade do complexo de LPS-peptídeo

A estabilidade do complexo de LPS-peptídeo é estudada por 6meses e avaliada através da medição da razão de desintoxicação em doisensaios (LAL e liberação de IL6 in vitro através de huPBMC humana). Testede pirogênio em coelhos pode ser também realizado.

6.1. Estabilidade in vitro do complexo de LPS peptídeo-formulado

A estabilidade do complexo de LPS-peptídeo formulado é acom-panhada a 5°C, por 6 meses. Medições são feitas nos dias = 0,90 e 180 (6meses). Os resultados são como segue.<table>table see original document page 43</column></row><table>

C*: conforme

A razão de desintoxicação em teste de liberação de IL6 não ésignificantemente diferente após 3 e 6 meses, indicando a estabilidade docomplexo de LPS-peptídeo: LPS complexado com peptídeo permanece de-sintoxicado após 6 meses a 5°C.

6.2. Estabilidade in vitro do complexo de LPS-peptídeo em líquido fisiológico

O objetivo do experimento é verificar que LPS não é liberadoquando o complexo é administrado e que a taxa de desintoxicação não dimi-nui após um contato com um líquido fisiológico.

Um ml do complexo de LPS-peptídeo, misturado com 1 mL desoro humano, é incubado a 37°C. A taxa de desintoxicação é avaliada após1 e 24 horas. Soro humano e o complexo de LPS-peptídeo conforme prepa-rado na seção 4.3 são também testados em paralelo.

Nenhuma diferença significante da desintoxicação avaliada atra-vés de ambos ensaios é observada após um contato de 1 hora e 24 horasdo complexo de LPS-peptídeo com soro humano a 37°C e resultados sãosimilares ao controle de complexo de LPS-peptídeo.

Exemplo 7. Imunogenicidade do complexo de LPS-peptídeo

7.1. Atividade bactericida de anticorpos anti-LPS induzida emcoelhos pelo complexo de LPS-peptídeo

Imunização de três coelhos adultos da Nova zelândia é realizadacom 100 u,g do complexo de LPS-peptídeo através de vias intramuscular(IM) e subcutânea (SC) (2 x 0,5 mL e 5 x 0,2 mL, respectivamente) na pre-sença de adjuvante. Eles recebem três injeções em 3 semanas de intervalo;a primeira com adjuvante Freund (FA), as segunda e terceira com adjuvanteFreund incompleto. Eles sofrem sangria duas semanas após a última inje-ção. Um grupo de controle é imunizado com o peptídeo com adjuvante (71ng, equivalente à quantidade de peptídeo em 100 [ig de complexo de LPS-peptídeo) usando o mesmo protocolo.

A atividade bactericida das amostras de soro (SBA) é avaliadacontra a cepa N. meningitidis usada para produção de LPS conforme descri-to no Exemplo 5 na presença de soro de coelho bebê como fonte exógenade complemento.

Ensaio de SBA

Soros são inativados com calor durante 30 minutos a 56°C. Nascavidades de uma microplaca de 96 cavidades, soros inativados com calorsão então duas vezes serialmente diluídos (10 vezes) em solução salinatamponada com fosfato da Dulbecco contendo Ca++ e Mg++ (volume por ca-vidade: 50

Vinte e cinco uJ de uma cultura de fase log de N. meningitidiscultivada em caldo Mueller-Hinton (4,103 CFU/mL) e 25 |il de soro de coelhobebê são adicionados a cada cavidade. A placa é incubada uma hora a37°C, sob agitação.

Cinqüenta uJ da mistura de cada cavidade são postos em placaem ágar Mueller-Hinton. Placas de Petri são incubadas da noite para o dia a+37°C em uma atmosfera de C02 a 10%.

Em cada experimento, controles incluíam (i) bactérias e a fontede complemento sem anticorpos (controle de complemento), (ii) bactérias ecomplemento ativado com calor e (iii) bactérias e complemento inativadocom calor, na presença de anticorpos.

Título bactericida é relatado como a diluição de soro recíprocamais alta na qual > 50% de morte de bactérias são observados conformecomparado com o controle de complemento.

Resultados de SBA

Os resultados devem ser vistos na tabela abaixo. Títulos de SBAaltos são obtidos com o complexo. A especificidade da resposta de SBA éconfirmada com a extinção da resposta, quando os soros (pós-dose 3) sãoabsorvidos em LPS.<table>table see original document page 45</column></row><table>

7.2. Resposta imune induzida em camundongos com o complexo de LPS-peptídeo

Camundongos fêmea não-consangüíneos (outbred) CD1 de seissemanas de vida são imunizados com uma dose de 10 u,g de complexo deLPS-peptídeo através de via subcutânea (0,2 mL). Eles recebem duas inje-ções em intervalos de 3 semanas. Eles sofrem sangria antes de cada inje-ção e exsangüinados 14 dias após a última injeção. Um grupo de controle éinjetado com tampão.

Em um primeiro experimento, a resposta de anticorpo é avaliadaatravés de ELISA e a atividade bactericida das 2 amostras de soro pós-doseé avaliada contra a cepa N. meningitidis usada para produção de LPS con-forme descrito no Exemplo 4 (cepa homóloga) e uma cepa de N. meningitidisheteróloga [cepa do grupo B de N. meningitidis RH873 (imunotipos L4, 7, 8)].

Em um segundo experimento, a resposta de anticorpo é avaliadaatravés de ELISA e a atividade opsônica das 2 amostras de pós-dose é ava-liada através de FACS.

7.2.1. Imunogenicidade de complexo de LPS-peptídeo em camundongosTitulação de ELISA de anticorpos anti-LPS

As cavidades de uma microplaca de 96 cavidades são revesti-das com 100 uJ de uma solução de LPS a 10 u.g/mL em tampão 1 (PBS +MgCI2 a 10 mM). A placa é incubada 2 horas a +37°C; então da noite para odiaa+5°C.

A solução de LPS é removida da placa e as cavidades são satu-radas com 150 uJ de tampão 2 (PBS + leite a 1% + Tween 20 a 0,05%). Aplaca é incubada uma hora a 37°C; então lavada com tampão 3 (PBS +Tween 20 a 0,05%).

Soros são serialmente diluídos 12 vezes, diretamente nas cavi-dades usando tampão 2 (volume: 100 uJ por cavidade). A placa é incubadapor 90 minutos a +37°C; então lavada com tampão 3.

Cem nl de um conjugado de peroxidase de IgG anticamundongode cabra diluído (específico de cadeia y) ou IgM (específico de cadeia n) sãoadicionados a cada cavidade. A placa é incubada 90 minutos a 37°C e entãolavada com tampão 3.

A reação é desenvolvida através da adição de 100 |jJ de umasolução de substrato de tetrametilbenzidina em cada cavidade. A placa éincubada 20 minutos a 37°C. A reação é parada através da adição de HCI a1M e absorbância é medida a 450 nm.

Resultados de ELISA

Os resultados são expressos em Unidade/mL de ELISA arbitrá-rio (EU/mL) através de comparação com um soro de referência.

Em um experimento de imunização preliminar, o ensaio ELISA éobtido usando um grupo de 10 soros. Conforme mostrado na tabela que se-gue, o complexo de LPS-peptídeo é capaz de induzir títulos de IgG anti-LPSaltos em camundongos e IgM anti-LPS após uma injeção (ELISA). Um refor-ço de IgG significante é observado após a segunda injeção, enquanto ne-nhum aumento de IgM significante é observado.

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Em um experimento de imunização adicional, o ensaio ELISA éobtido individualmente. Após a segunda injeção, sete de dez camundongosexibem títulos de IgG e IgM altos. Títulos médios globais expressos em logsão cerca de 3,7 e 2,8 respectivamente.7.2.2. Atividade bactericida de soros de camundongo

A atividade bactericida é medida conforme descrito na seção 7.1.

Quarenta % do soro da pós-dose 2 exibem uma atividade bacte-ricida (título de SBA > 16) contra a cepa homóloga de N. meningitidis. Quatrosão bactericidas contra a cepa heteróloga.

7.2.3. Atividade opsônica de soros de camundongo

Ensaio de opsonizacão

A atividade opsônica é medida através de tecnologia de citome-tria de fluxo (FACS) usando células HL60 promielocíticas diferenciadas hu-manas como efetoras e contas fluorescentes de látex revestidas com LPScomo alvo.

Células efetoras são diferenciadas em granulócitos após trata-mento com dimetilformamida a 100 mM, As células resultantes são lavadas,ressuspensas em solução salinada equilibrada de Hanks e sua concentraçãoé ajustada para 2,5x107 células/mL.

Soros são inativados com calor durante 30 minutos a 56°C. Emuma microplaca de 96 cavidades, soros inativados com calor são serialmen-te diluídos cinco vezes (3 vezes) em tampão de sal equilibrado de Hankscontendo Ca++ e Mg++ (volume por cavidade: 300 |il).

Vinte ul de contas fluorescentes de látex revestidas com LPS e10 ul de soro de coelho bebê como fonte de complemento exógena são adi-cionados a cada cavidade. A placa é incubada 30 minutos a +37°C, sob agi-tação.

Cinqüenta ul da suspensão de célula efetora são adicionados acada cavidade. A placa é incubada 30 minutos a +37°C, sob agitação.

Cento e cinqüenta ul de cada cavidade são transferidos parauma segunda cavidade profunda e a reação é parada através da adição de400 ul de PBS + EDTA a 0,02%. A placa é centrifugada e lavada duas vezescom tampão de PBS+BSA.

A fagocitose de contas revestidas com LPS por células efetoras,na presença de anti-soro e fonte de complemento exógena, é medida atra-vés de FACS.

A atividade opsonica é expressa como o inverso de diluição desoro dando um produto de fagocitose (PP) = 200. PP é medido como a razãode número de contas/células fagocíticas x número de células fluorescentes.

Cavidades de controle sem anti-soro e um anti-soro monoclonalpositivo são incluídas em cada experimento.

Resultados de opsonização

Oito de dez camundongos exibiram alta atividade opsonica(> 350).

Claims (32)

1. Dímero de peptídeo SAEP II da fórmula (I)NH2-A-Cys1-B-Cys2-C-COOHNH2-A'-Cys1'-B'-Cys2-C'-COOHem que os dois resíduos cisteína Cys1 são ligados através de uma ligaçãodissulfeto e dois resíduos cisteína Cys2 são ligados através de uma ligaçãodissulfeto; ou fórmula (II)NH2-A-Cys1-B-Cys2-C-COOHHOOC-C'-Cys2-B'-Cys1-A'-NH2em que os resíduos Cys1 são ligados aos resíduos Cys2 através de umaligação dissulfeto;em que A e A' são independentemente uma porção peptídeo dea partir de 2 a 5, de preferência 3 ou 4 resíduos de aminoacido, onde pelomenos 2 resíduos de aminoacido são independentemente selecionados deLys, Hyl (hidróxi-Lisina), Arg e His;em que B e B' são independentemente uma porção peptídeo dea partir de 3 a 7, de preferência 4 ou 5 resíduos de aminoacido, que com-preende pelo menos dois, de preferência três resíduos de aminoacido inde-pendentemente selecionados de Vai, Leu, lie, Phe, Tyr e Trp; eem que CeC são opcionais e são independentemente um resí-duo de aminoacido ou uma porção de peptídeo de a partir de 2 a 3 resíduosde aminoacido;contanto que a razão de resíduos de aminoacido catiônicos/resí-duos de aminoacido hidrofóbicos (razão de cat/hidrof) seja de a partir de 0,4a 2.

2. Dímero de peptídeo SAEP II de acordo com a reivindicação 1,o qual é da fórmula (I) ou (II) em que a razão de cata/hidrof é de a partir de 0,5 a 1,2 ou 1,5.

3. Dímero de peptídeo SAEP II de acordo com a reivindicação 2,o qual é da fórmula (I) ou (II) em que a razão de cata/hidrof é de a partir de 0,6 a 1.

4. Dímero de peptídeo SAEP II de acordo com a reivindicação 3,o qual é da fórmula (I) ou (II) em que a razão de cata/hidrof é de a partir de 0,6 a 0,8.

5. Dímero de peptídeo SAEP II de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, o qual é da fórmula (I) ou (II), em que as porções depeptídeo BeB' compreendem a seqüência - X1- X2 - X3 -, em que X1 eX2; X2 e X3; ou X1, X2 e X3 são independentemente selecionados de Vai,Leu, lie, Phe, Tyr e Trp; de preferência de a partir de Leu, He e Phe.

6. Dímero de peptídeo SAEP II de acordo com a reivindicação 5,o qual é da fórmula (I) ou (II) em que as porções de peptídeo BeB' compreendem:(i) a seqüência - X1 - X2 - X3 - onde:X1 é Lys, Hyl, His ou Arg, de preferência Lys ou Arg; com maispreferência Lys;X2 é Phe, Leu, lie, Tyr, Trp ou Vai; de preferência, Phe ou Leu;com mais preferência, Phe; eX3 é Phe, Leu, Ne, Tyr, Trp ou Vai; de preferência, Phe ou Leu;com mais preferência Leu; e(ii) resíduos de aminoácido, se algum, cada um sendo indepen-dentemente selecionado do grupo consistindo em Vai, Leu, lie, Phe, Tyr,Trp, Lys, Hyl, Arg e His; de preferência Vai, Leu, Ne, Phe, Tyr e Trp; commais preferência Leu, lie e Phe.

7. Dímero de peptídeo SAEP II de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, o qual é da fórmula (III)NH2-A-Cys1-B-Cys2-COOHNH2-A'-Cys1-B'-Cys2-COOHem que os dois resíduos Cis1 são ligados entre si através de uma ponte dedissulfeto e os dois resíduos cys2 são ligadas entre sí através de uma pontede dissulfeto; da fórmula (IV)NH2-A-Cys1-B-Cys2-COOHCOOH-Cys2-B'-Cys1-A'-NH2em que os resíduos Cys1 são ligados aos resíduos Cys2 através de umaligação dissulfeto;e em que A, A', BeB' são conforme definidos nas reivindicaçõesanteriores.

8. Dímero de peptídeo SAEP II de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 7, o qual é um dímero de peptídeo homólogo.

9. Dímero de peptídeo SAEP II de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, o qual é um dímero àntiparalelo da fórmula (VI)NH2-Lys-Thr-Lys-Cys1-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOHCOOH-Cys2-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Cys1 -Lys-Thr-Lys-NH2em que os resíduos Cys1 são ligados ao resíduos Cys2 através de uma ligação dissulfeto.

10. Dímero de peptídeo SAEP II de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 8, o qual é um dímero paralelo da fórmula (VII)NH2-Lys-Thr-Lys-Cys1-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOHNH2-Lys-Thr-Lys-Cys1-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOHem que os dois resíduos Cys1 estão ligados através de uma ligação dissulfe-to e os dois resíduos Cys2 são ligados através de uma ligação dissulfeto.

11. Composição compreendendo um dímero de peptídeo de a-cordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o peptídeo estáessencialmente em forma paralela dimérica.

12. Composição compreendendo um dímero de peptídeo de a-cordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o peptídeo estáessencialmente em forma antiparalela dimérica.

13. Uso de um dímero de peptídeo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 10, como um agente de desintoxicação de lipo-polissacarídeo (LPS) bacteriano Gram-negativo.

14. Composição farmacêutica compreendendo (i) um dímero depeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou umacomposição de acordo com a reivindicação 11 ou 12 e (ii) um diluente ouvículo farmaceuticamente aceitável.

15. Uso de um dímero de peptídeo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 10, ou uma composição como definida na reivin-dicação 11 ou 12, na preparação de um medicamento para tratamento ouprevenção de choque séptico.

16. Método para tratamento ou prevenção de choque séptico, oqual compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz deum dímero de peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 10, ou uma composição como definida na reivindicação 11 ou 12, a umindivíduo com necessidade.

17. Complexo de LPS-peptídeo compreendendo (i) uma entida-de (porção) de LPS de bactérias Gram-negativas e (ii) um dímero de peptí-deo SAEP II como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, emque a porção de LPS e o dímero de peptídeo SAEP II são não-covalentemente ligados um ao outro.

18. Complexo de LPS-peptídeo de acordo com a reivindicação 17, no qual o LPS é um LPS de N. meningitidis; E. coli; Salmonella typhi;Salmonella paratyphi; Shigella flexneri; Haemophilus influenzae; Helicobac-ter pylori; Chlamydia trachomatis; Bordetella pertussis; Brucella; Legionellapneumophia; Vibrio cholera; Moraxella catharralis; Pseudomonas aerugino-sa; e Kiebsiella pneumonia.

19. Complexo de LPS-peptídeo de acordo com a reivindicação 18, onde o LPS é um LPS de Neisseria meningitidis.

20. Complexo de LPS-peptídeo de acordo com a reivindicação 19, onde o LPS é LPS L8.

21. Complexo de LPS-peptídeo de acordo com qualquer umadas reivindicações 17 a 20, caracterizado por uma razão de LPS:peptídeomolar de a partir de 1:1,5 a 1:0,5, de preferência de a partir de 1:1,2 a 1:0,8.

22. Complexo de LPS-peptídeo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por uma razão de LPS:peptídeo molar de 1:1.

23. Uso de um complexo de LPS-peptídeo coo definido em qual-quer uma das reivindicações 17 a 22, para tratamento ou prevenção de in-fecção bacteriana Gram-negativa.

24. Composição farmacêutica compreendendo um complexo deLPS-peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 17.a 22, eum diluente ou vículo farmaceuticamente aceitável.

25. Uso de um complexo de LPS-peptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 17 a 22, na preparação de um medicamen-to para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana Gram-negativa.

26. Método para tratamento ou prevenção de uma infecção bac-teriana Gram-negativa, o qual compreende administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um complexo de LPS-peptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 17 a 22, a um indivíduo em necessidade.

27. Processo para preparação de um complexo de LPS-peptí-deo, o qual compreende mistura de (i) um LPS de bactérias Gram-negativase (ii) um dímero de peptídeo como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1 a 10.

28. Processo de acordo com a reivindicação 27, em que o LPS eo peptídeo ou um sal do mesmo são misturados em razão molar deLPS:peptídeo de a partir de 1:1,2 a 1:0,8.

29. Processo de acordo com a reivindicação 29, em que o LPS eo peptídeo ou sal do mesmo são misturados em uma razão molar deLPS:peptídeo de 1:1.

30. Processo para desintoxicação de um LPS de bactériasGram-negativas, o qual compreende misturar (i) o LPS e (ii) o dímero depeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

31. Processo de acordo com a reivindicação 30, em que o LPS eo peptídeo ou sal do mesmo são misturados em uma razão molar deLPS:peptídeo de a partir de 1:1,2 a 1:0,8.

32. Processo de acordo com a reivindicação 31, em que o LPS eo peptídeo ou sal do mesmo são misturados em uma razão molar deLPS:peptídeo de 1:1.