ES2214608T3 - Moleculas hidrofobas receptoras de sustancias antigenas y que comprenden complejos inmunoestimulantes o matrices complejas inmunoestimulantes. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN UNAS PARTICULAS QUE CONTIENE LIQUIDOS, COMO LOS ISCOM, LAS MATRICES - ISCOM O VESICULAS TALES COMO MICELAS O LIPOSOMAS, QUE COMPRENDEN UNA O MAS MOLECULAS RECEPTORAS HIDROFOBAS PARA BLANCO Y SUSTANCIAS ANTIGENICAS, CUYAS MOLECULAS RECEPTORAS HAN SIDO INTEGRADAS EN LA PARTICULA Y SE ELIGEN ENTRE RECEPTORES QUE CONTIENEN LIPIDOS O RECEPTORES QUE SON HIDROFOBOS, FIJANDOSE LAS MOLECULAS RECEPTORAS A LAS SUSTANCIAS ANTIGENICAS.

Description

Moléculas hidrófobas receptoras de sustancias antígenas y que comprenden complejos inmunoestimulantes o matrices complejas inmunoestimulantes.

La invención se relaciona con partículas que contienen lípidos, seleccionadas entre iscomes y matrices de iscomes, que contienen un(varios) componente(s) receptor(es) hidrofóbico(s) que se une(n) a antígenos de microorganismos tales como bacterias, virus o sus partes, es decir, las partes de unión a receptores, tales como toxinas o proteínas de superficie.

Más aún, la invención incluye procedimientos para producir dichas partículas que contienen lípidos y el uso preventivo y curativo en medicina humana o medicina veterinaria u otros usos preventivos y curativos farmacológicos, tales como el uso inmunoterapéutico, de estas partículas. La invención incluye, en particular, iscomes y matrices de iscomes cuyas superficies han sido preparadas con fragmentos de toxinas bacterianas, tales como la subunidad B de la toxina del cólera ("CTB").

Antecedentes de la invención

Se ha dicho que las estructuras que contienen lípidos en forma de micelas, liposomas y otras vesículas, los iscomes (complejo inmunoestimulador/partículas), las matrices de iscomes, etc. son vehículos efectivos de substancias o complejos de moléculas farmacológica y/o inmunológicamente activas. Véase, por ejemplo, WO-A1-90/03184 (Morein y col., Clin. Immunother. Review, 1995; Kersten y col., Iscom-Liposome Review, 1995). En muchos casos, la inmunización de animales de laboratorio con dichas estructuras que contienen lípidos, en donde se han incorporado varios antígenos, ha mostrado dar lugar a una mayor respuesta inmune a los antígenos citados en comparación con la respuesta inmune obtenida tras la inmunización usando un antígeno correspondiente en forma libre.

Los iscomes y las matrices de iscomes están documentados como vehículos efectivos de antígenos y moléculas adyuvantes para aumentar la inmunogenicidad de pequeñas y grandes moléculas (antígenos), es decir, para hacerlas fuertemente inmunogénicas cuando se aplican tanto parenteral como localmente (tópicamente) sobre superficies mucosas. El iscom tiene propiedades únicas que son efectivas tras administración intranasal mucosal. Está bien documentado (Morein y col., Clin. Immunother. 3, 1995, 461-475) que tanto los iscomes con antígenos incorporados (normalmente proteínas) como los iscomes como vehículos, por ejemplo pequeños antígenos tales como oligopéptidos o como, por ejemplo, la biotina, evocan de manera efectiva una respuesta inmune a estas grandes o pequeñas moléculas.

Las matrices de iscomes (y los iscomes) tienen actividad adyuvante bien documentada incorporada que potencia las respuestas inmunes mediadas por anticuerpos, así como las mediadas por células, a los antígenos coadministrados. El iscom evoca una respuesta inmune mediada por células bajo restricción tanto de Clase I como de Clase II.

El cólera es la más grave de todas las enfermedades diarreicas y está causada por la bacteria Vibrio cholera en el grupo 1. Estas bacterias colonizan el intestino delgado de los seres humanos y segregan una exotoxina que es una proteína conocida como toxina del cólera. Esta toxina se une a las células de las membranas mucosas y es absorbida por ellas y causa una intensa secreción de electrolitos y de agua por las células, que da lugar a los graves casos de diarrea, deshidratación y acidosis metabólica que caracterizan al cólera.

Enfermedades similares pueden estar causadas por la así llamada colibacteria "enterotóxica" (ET), pero los síntomas son normalmente más leves. Dichas bacterias producen con frecuencia diarrea en individuos jóvenes entre humanos y prácticamente todo tipo de animales, incluyendo los cerdos y las vacas. Estas diarreas, que pueden dar lugar a grandes pérdidas económicas para la industria ganadera, están causadas en parte por una toxina termolábil ("LT") similar a la toxina del cólera ("CT"). Estas toxinas son tan similares que se unen a los mismos receptores.

Las estructuras de CT y LT están bien definidas en cuanto a estructura y función. Son proteínas oligoméricas que constan de una parte que se une al receptor de la toxina del cólera, a saber, la parte B, que a su vez consiste en cinco subunidades que tienen cada una un peso molar aproximado de 11.600 y forman un anillo pentamérico. La subunidad A es un polipéptido proteolíticamente dividido con un peso molecular de aproximadamente 28.000, consistente en dos fragmentos conjugados por disulfuro. El fragmento mayor A1 contiene actividad de toxina-enzima, mientras que el fragmento menor A2 se une al fragmento A1 con el anillo B5. CT se une con alta afinidad a una clase de receptores que existen sobre la superficie de las así llamadas membranas con el borde en cepillo del intestino delgado, así como a la membrana plasmática de la mayoría de las células de mamífero. El gangliósido GM1 constituye el receptor para CT (Holmgren y col., Infect. Immun. 38, 424-433). LT se une también a GM1.

CT y LT son ambos, respectivamente, componentes importantes en las vacunas de subunidades que pretenden evocar protección frente al cólera y a la colibacteria enterotóxica. En el caso de infecciones intestinales, es de especial interés evocar protección local ejercida, entre otras cosas, por la IgG secretora en la membrana intestinal. CT y LT son ambas consideradas como adecuadas como moléculas de abordaje en formulaciones adyuvantes para vacunas destinadas a ser administradas en los tractos intestinal y respiratorio (Morein, Lovgren y Cox, 1966), con capacidad, entre otras cosas, para inducir una respuesta de IgA secretora, que es un componente importante en la protección. La subunidad B de CT y LT ha alcanzado un gran interés como moléculas vehiculizantes e incluso como sistemas vectores universales para vacunas orales (Mucosal Handbook Immunology, eds. Ogra, P.L.; Lamm Me, Mc Ghee Jr., Mestechy, J., Strober W., Bienen- stock J., 1994). El interés ha crecido aún más porque se ha visto que el conjugado entre CTB y otros antígenos no sólo da lugar a una inmunorrespuesta en las membranas mucosas intestinales locales, sino también en un grado limitado en otras membranas mucosas, tales como las glándulas salivares, los pulmones y el tracto genital y en la sangre (Handbook Mucosal, 1994). El problema de CTB y LTB es que tienen una baja capacidad (innata) para potenciar su propia fuerte inmunorrespuesta protectora frente a la toxina del cólera o frente a LT, o frente al antígeno para cuyo transporte están modificadas. Tienen, por lo tanto, una baja actividad adyuvante en relación al efecto inmunomodulador e inmunopotenciador (Morein, Lovgren y Cox, 1966).

CTB y LTB son usadas experimentalmente como vehículos de antígeno con el fin de evocar, por aplicación local (oral), una respuesta inmune local en las membranas mucosas del tracto digestivo, así como en otras membranas mucosas, a través del tráfico linfático asociado al intestino ("GALT") o a través de aplicación directa a otras membranas mucosas, tales como el tracto respiratorio. CTB y LTB tienen capacidad de abordaje, lo que significa que se considera que se dirigen y localizan tanto a sí mismas como a los antígenos que pueden llevar al sistema linfático del tracto intestinal, lo que significa a las células M de las placas de Peyer, a la lámina propia (LP) y al sistema linfático del intestino y de otras membranas mucosas a través del GALT o por aplicación directa sobre estas membranas mucosas, por ejemplo en el tracto respiratorio.

Existen las siguientes dificultades no resueltas en cuanto al uso de CTB y LTB para inmunización local:

1. CTB y LTB tienen por sí mismas una inmunogenicidad relativamente baja y una baja capacidad inmunoestimuladora, que requiere ser potenciada con un componente adyuvante para obtener un efecto óptimo. En otras palabras, esto implica tanto a su propia inmunogenicidad como a su efecto inmunoestimulador hacia los antígenos que pueden haber llevado consigo. Su valor como adyuvantes se limita al "abordaje", mientras que se requieren actividades adyuvantes suplementarias en forma de capacidades inmunomoduladoras e inmunoestimuladoras para conseguir una inmunogenicidad óptima.

2. Existen limitaciones en cuanto a la conjugación de antígenos a CTB y LTB con un rendimiento físico o económico particularmente alto, ya que sólo un número limitado de grupos amino y/o de grupos carboxi puede activarse sin reducir seriamente sus valores como antígeno o como vehículos en membranas mucosas y dirigirse ellos mismos y los antígenos acompañantes a los órganos y células linfáticas para evocar una respuesta inmune. Incluso si se dispone de un número suficiente de grupos copulantes sobre una molécula vehiculizante, es bien sabido que es difícil conseguir el rendimiento económico deseado con tales construcciones, debido al insuficiente rendimiento. Por ejemplo, con frecuencia se copulan no más de un 15-20% de los antígenos disponibles en reacción a la molécula vehiculizante.

3. CTB y LTB tienen un limitado espacio para la copulación química de moléculas de mayor tamaño, ya que pueden bloquear epitopos funcionales que son necesarios para dirigir los complejos a los órganos y células linfáticas.

Alving y col. describen liposomas como sistema transportador para el antígeno del esporozoide de la malaria y la toxina del cólera (CT).

Nabila y col. se refieren a liposomas que contienen lípido A como adyuvante y a la toxina del cólera como antígeno proteico.

Valdolas y col. se refieren a liposomas que contienen OVA y el componente B de la toxina del cólera, CTB. La presente invención, por el contrario, se relaciona con partículas iscom que incluyen receptores que contienen lípidos, por ejemplo el receptor GM1 para la toxina del cólera.

Scheepers y col. describen la inmunización peroral con una composición que contiene iscomes, lipopolisacárido ("LPS") bacteriano y NP de la influenza. El LPS es usado para hacer que el altamente hidrosoluble NP se vuelva anfipático mediante unión del lipopolisacárido LPS bacteriano. Estos iscomes no contienen ningún receptor que contenga lípidos.

Resumen de la invención

Se ha demostrado ahora que utilizando partículas que contienen lípidos, seleccionadas entre iscomes y matrices de iscomes que contienen una o más moléculas receptoras hidrofóbicas para substancias antigénicas o moléculas de abordaje, se contribuye a un nuevo sistema general para la unión de moléculas. Estos receptores pueden ser receptores que contienen lípidos o receptores que son proteínas hidrofóbicas. Mediante este nuevo sistema general, se une una mayor proporción de antígenos o de otras substancias a la partícula, con un rendimiento que empieza a aproximarse al 100%, lo cual es económicamente ventajoso, pero sobre todo el nuevo sistema hace posible, sin competir con los sistemas anteriores (que no utilizan el receptor) (EP 0.109.924 B1, EP 0.180.546 B1, EP 0.242.380 B1), la unión de antígenos y de moléculas o complejos de moléculas de abordaje. En consecuencia, la respuesta inmune es más eficientemente inducida por los antígenos que se unen al receptor. Sobre todo, se hace posible unir antígeno al receptor junto con los otros antígenos que son incorporados sin usar el receptor. Con esta invención, es más fácil unir tanto moléculas de abordaje que pueden, por ejemplo, penetrar en las membranas mucosas como antígenos viajeros que no pueden ser absorbidos por las membranas mucosas (véase la solicitud de patente Sueca 9600647-3). Una ventaja especial es que se pueden usar receptores que contienen lípidos como lípido integrado en los complejos, es decir, que pueden substituir a los lípidos que se utilizan para construir el complejo (pat. iscom lipídico).

Entre los componentes de unión a receptores abarcados por la invención están, por ejemplo, las toxinas bacterianas y sus partes de unión activas en forma de subunidades o fragmentos o diversas modificaciones o derivados de ellas, las fimbrias bacterianas u otras moléculas de adhesión y sus partes de unión activa y/o estructuras derivadas. En muchos casos, estas estructuras de abordaje son también antígenos vacunales relevantes y la presentación de dichos antígenos sobre la superficie de partículas que contienen lípidos, etc. para uso en vacunación forma también parte de la invención.

El iscom contiene al menos un glicósido, al menos un lípido y al menos un tipo de substancia antigénica, particularmente proteínas y péptidos. Estos complejos aumentan la inmunogenicidad de los antígenos incluidos y pueden contener también una o más substancias inmunomoduladoras (activas como adyuvantes) y están descritos en EP 0.109.924 B1, EP 0.242.380 B1 y EP 0.180.546 B1.

La matriz contiene al menos un glicósido, una substancia activa como adyuvante y al menos un lípido. La matriz tiene un efecto inmunoestimulador sobre substancias antigénicas coadministradas; véase EP 0.436.620 B1.

Se ha visto que los lípidos en estos complejos pueden ser parcialmente substituidos por receptores que contienen lípidos para substancias antigénicas de microorganismos. De esta forma, la cantidad de antígeno que se une a la partícula aumenta apreciablemente.

En aquellos casos en los que los complejos son iscomes, estos iscomes son preparados como se describe en la patente Europea EP 0.109.942 B1. Aquí, se mezclan virus, micoplasmas, bacterias, parásitos o células animales que contienen antígenos o determinantes antigénicos, especialmente proteínas o péptidos o ejemplos aislados que tienen regiones hidrofóbicas o anfipáticas, con uno o más agentes solubilizantes, mediante lo cual se forman complejos entre los antígenos o determinantes antigénicos y los agentes solubilizantes, tras de lo cual se separan los antígenos o determinantes del agente solubilizante en presencia de, o se separan del agente solubilizante y se transfieren directamente a, una solución de glicósido que contiene colesterol, fosfolípido y uno o más glicósidos (componentes Quillay) con dominios hidrofóbicos e hidrofílicos en una concentración de al menos la concentración crítica de unión a micelas, mediante lo cual se forma un complejo proteico, que es luego aislado y purificado.

Los lípidos usados son en particular los descritos en la patente del solicitante EP 0.109.942 B1, especialmente en la página 3, y el EP 0.436.620 B1, p. 7, líneas 7-24. En particular, se usan esteroles tales como colesterol y fosfolípidos tales como fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina.

Los lípidos pueden incluir también moléculas receptoras lipofílicas que se unen a componentes de unión a células, especialmente a antígenos. Dichos receptores son glicolípidos, por ejemplo el gangliósido receptor de la toxina del cólera, GM1, y antígenos de grupos sanguíneos fucosilados. Los componentes de unión a células pueden entonces funcionar como moléculas transportadoras. Se unen al receptor que contiene lípidos por una simple mezcla con el complejo que contiene el receptor. Se puede mezclar entonces el iscom o la molécula de matriz con el antígeno que se une al receptor.

Es posible proceder a partir de una matriz, que puede ser preparada por solubilización de al menos un esterol en un agente solvente y adición del glicósido o de las saponinas y de los otros lípidos, después de lo cual se puede eliminar el agente solvente si no es aceptable para el producto final. La matriz es habitualmente transferida a una solución acuosa en la que las partes por separado no son solubles. El agente solubilizante puede ser eliminado, por ejemplo, por filtración por gel, ultrafiltración, diálisis o electroforesis. La matriz puede ser entonces purificada de un excedente de esterol y saponina, por ejemplo, por ultrafiltración, a través de un gradiente de densidad o a través de filtración por gel. El agente solubilizante puede ser cualquiera de los mencionados en EP 0.436.629 B1, p. 5, filas 24-45. Los otros componentes y el procedimiento están también descritos en este documento.

Los glicósidos usados en el procedimiento pueden ser los descritos en EP 0.109.942 B1, p. 4, último párrafo. Especialmente, se usan saponinas, tales como triterpenosaponinas, especialmente las saponinas Quillay de Quillaja saponaria Molina o cultivos celulares de este árbol o subcomponentes de los mismos, especialmente los descritos en la patente Europea del solicitante EP 0.436.620 B1, p. 4, filas 19-46. Éstos pueden ser QHA, QHB, QHC u otras composiciones de saponinas Quillay. Los glicósidos son adyuvantes y elementos de construcción de la estructura en el iscom y en la matriz. Es también posible incorporar otros adyuvantes o componentes inmunomoduladores distintos de los glicósidos en los iscomes o en las matrices, como se menciona en EP 0.436.620 B1.

Es también posible mezclar la molécula transportadora y/o el antígeno viajero como entidad aparte con una partícula de iscom en la que se ha integrado el antígeno viajero o la molécula transportadora (de abordaje), o con un complejo de iscom y/o matriz sobre el que se ha copulado el antígeno viajero o la molécula transportadora, es decir, que son posibles muchas combinaciones. Por definición, una partícula de iscom contiene antígeno y una matriz de iscom carece de antígeno. Incluso se pueden mezclar otros adyuvantes o componentes inmunomoduladores con los complejos de iscom y/o matriz como entidades separadas, es decir, que no tienen necesariamente que integrarse en los complejos o copularse con éstos. Se facilitan ejemplos de dichos adyuvantes en Cox y col., CRS, 1992. Normalmente, se usan MDP, MTP y avridina. Es, sin embargo, ventajoso incorporar estos adyuvantes en iscomes y matrices cuando se requiere una menor dosificación de adyuvantes. Es también posible mezclar tanto la molécula transportadora como el antígeno viajero con complejos de iscomes o matrices. En estos casos, el complejo de iscomes contiene otra molécula antigénica.

Si la(s) molécula(s) transportadora(s) o el(los) antígeno(s) viajero(s) carecen de grupos hidrofóbicos o anfipáticos, pueden copularse químicamente con la partícula de iscom. Se pueden encontrar ejemplos de dicho procedimiento de copulación y de dichos grupos copulantes en EP 0.242.380 B1, p. 9, y en EP 0.436.620 B1, p. 6, fila 33-p. 7, fila 6, donde también se describe el método de copulación. Pueden ser lípidos, como en el ejemplo 7 que se dará más adelante.

Se pueden encontrar las cantidades relativas de colesterol, lípidos y antígeno que se pueden usar en las patentes antes mencionadas EP 0.109.942 B1, EP 0.180.564 B1, EP 0.242.380 B1 y EP 0.436.620 B1.

Cuando el receptor es una proteína hidrofóbica, tal como una glicoproteína, o un antígeno de grupo sanguíneo fucosilado, puede integrarse en la molécula lipídica con una interacción hidrofóbica. Puede también incluirse en el iscom como una parte proteica.

Además del antígeno que se une al receptor, se puede hacer que otros antígenos se unan al receptor por substitución de los grupos apropiados. Dichos grupos apropiados, que pueden unirse a esos otros antígenos, pueden ser partes del antígeno que se unen al receptor. Estas partes pueden unirse mediante métodos habituales, por ejemplo los mencionados en EP 0.436.620 B1. Es también posible por manipulación tecnológica génica construir proteínas o péptidos de fusión entre un antígeno y partes de él y el antígeno que se une al receptor. Se pueden unir así antígenos diferentes de los que proceden del cólera y de las colibacterias enterotóxicas al receptor GM1 por substitución con partes de CTB o de LTB. Se dan ejemplos de esto en Biochemia et Biophysica Acta 1223 (1994), 285-295, "Regeneration of active receptor recognition domains on the B subunit of cholera toxin by formation of hybrids from chemically inactivated derivatives", Marc J.S. De Wolf, Wilfried S.H. Dierick. De esta forma, antígenos que no penetran normalmente en una membrana mucosa pueden pasar a través de la membrana mucosa.

La CTB es, por lo tanto, un vehículo útil para antígenos producidos química y genéticamente. Sánchez y Holmgren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 481-485, 1989) y Sánchez, Johansson y col. (Res. Microbiol. 141, 971-979, 1990). Con ayuda de técnicas de ADN recombinante, se han unido antígenos extraños a los extremos amino o carboxi del antígeno de la subunidad CTB y se ha expresado un gen que, mediante sistemas de expresión, ha sido desarrollado para producir la proteína híbrida.

En los ejemplos descritos para ilustrar la invención, se ha usado una matriz iscom, tal como partículas que contienen lípidos, y la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) como estructuras de unión específica a receptores y como antígeno vacunal relevante.

La toxina del cólera consiste en una subunidad A, que ejerce la actividad de la toxina, y la subunidad B, que une la toxina a la membrana plasmática de una célula a través de un glicolípido (GM1). Para reducir la toxicidad, normalmente se usa sólo la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) como antígeno vacunal para evocar la respuesta inmune. La subunidad B no es tóxica y provoca una respuesta inmune relativamente débil en comparación con CT después de inmunización local (mucosal) intranasal o parenteral sistémica, por ejemplo de inmunización subcutánea o intramuscular, es decir, que la subunidad B tiene baja actividad adyuvante cuando la actividad se refiere a la actividad inmunomoduladora o inmunoestimuladora. La CTB puede ser también obtenida como un producto de ADN recombinante (rCTB) (EP 368.819).

Es difícil copular antígeno covalentemente con CTB o LTB con altos rendimientos físicos y económicos, ya que sólo un limitado número de grupos amino y/o de grupos carboxi pueden activarse sin reducir seriamente la actividad antigénica de CTB y LTB o sin dañar su capacidad como moléculas transportadoras en las membranas mucosas y dirigirse ellos y los antígenos acompañantes a tejidos y órganos y células linfáticas para provocar una respuesta inmune. Incluso si se dispone de un número suficiente de grupos para la conjugación química de un antígeno(s) sobre una molécula transportadora, es bien sabido que es difícil obtener rendimientos buenos y económicos de tales construcciones (Lovgren y col., J. Immunol. Methods 173, 237-243).

La utilización de proteínas transportadoras en iscomes tiene varias ventajas. Es especialmente evidente para la construcción de vacunas orales, nasales o rectales frente a infecciones. Dichas vacunas pueden contener una construcción transportadora con componente(s) antigénico(s) y adyuvante(s) suplementada, por ejemplo, con CTB o LTB para localizar la construcción en órganos y células linfáticas en el tracto intestinal y para dirigir la respuesta inmune a tejidos linfáticos de otras membranas mucosas a través de "GALT", "MALT" y "NALT" (Tejido Linfático Asociado al Intestino, a Mucosas y a la Nasofaringe, respectivamente), por ejemplo tras administración en el tracto respiratorio o por aplicación local directa en mucosas.

El iscom es más grande que moléculas transportadoras tales como CTB o LT y, por lo tanto, hay sitio para conjugar o de algún otro modo, por ejemplo a través de unión hidrofóbica o electrostática, incorporar antígenos viajeros seleccionados e incorporar componentes adyuvantes seleccionados.

Al producir la matriz, la razón de peso de esterol, segundo lípido y glicósido es de 0,2-10:0,2-10:1-100, preferiblemente de 1:1:5. Si se usa un receptor que contiene lípido, éste puede substituir al(a los) otro(s) lípido(s) completamente, de tal forma que la razón de esterol, receptor que contiene lípido y glicósido será como antes. Es también posible usar tanto el receptor que contiene lípido como un segundo lípido, preferiblemente fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina, y el receptor, de tal forma que la razón se convierte en esterol:segundo lípido:receptor:glicósido 0,2-10:0,2-10:0,1-1:5-10, preferiblemente 1:1:0,25:5. La cantidad de molécula receptora depende de la cantidad de moléculas de abordaje o antigénicas que se desee añadir.

Se pueden poner los constituyentes, en principio, en cualquier proporción. Se ha demostrado que el producto acabado obtiene la razón de peso preferida entre los componentes incluidos y que el sobrante no entra a formar parte. Si se usa una cantidad grande del segundo lípido, tal como un fosfolípido, el complejo se vuelve graso y frágil y se separa fácilmente. Demasiado poco del segundo lípido hace difícil la formación del complejo y se forman subunidades con forma de anillos anulares. Se puede determinar esto por microscopía electrónica.

Se puede confirmar si se ha formado un iscom o una matriz estudiando el producto por microscopía electrónica. Una matriz o iscom típicos tienen una estructura esférica característicamente abierta que contiene subunidades circulares o partes de la estructura esférica, como puede verse en la fig. 3 de EP 0.109.942 B1. Los iscomes tienen una constante de sedimentación inferior a la de las micelas correspondientes y frecuentemente una mayor constante de sedimentación que las correspondientes formas monoméricas de proteína o péptido. La matriz y el iscom tienen una constante de sedimentación de aproximadamente 20 S.

La ventaja de utilizar receptores que contienen lípidos para unir antígenos que buscan un blanco o vacunales es que es posible producir matriz a partir de glicósido, esterol, posiblemente un segundo lípido y un receptor que contiene lípido y luego simplemente mezclar la matriz dispuesta con la molécula de transporte (de abordaje). El procedimiento es más barato y simple que si se tuviera que preparar un iscom confeccionado que contuviera los ingredientes anteriores más un antígeno de transporte, o se tuviera que unir el antígeno a la matriz confeccionada usando métodos de conjugación química.

Cuando el antígeno se integra en el iscom o se copula químicamente con la matriz, se modifican los grupos amino o los grupos carboxilo, que pueden constituir determinantes antigénicos. Los determinantes antigénicos se desnaturalizan cuando el antígeno se activa para integración en el iscom o cuando se copula químicamente con la matriz o el iscom (cuando se usan dos antígenos, el iscom ya contiene al menos un antígeno). Esto significa que la cantidad de antígeno activo se reduce considerablemente. Más aún, la recuperación es baja en comparación con cuando se deja que el antígeno se una a un receptor que contiene lípido. Esto puede significar, por ejemplo, que en el proceso de preparación se requiere aproximadamente cinco veces más de antígeno en comparación con cuando se usa un receptor que contiene lípido. Cuando se usa un receptor que contiene lípido, el procedimiento es considerablemente más barato. Paralelamente a la menor incorporación, la cantidad de glicósido y el contenido en adyuvante por unidad de antígeno aumentan, lo que compensa parcialmente la menor cantidad de antígeno en cuanto a la respuesta inmune conseguida, pero al mismo tiempo la toxicidad puede aumentar debido al mayor porcentaje de adyuvante. La respuesta inmune, por otra parte, se hace mayor en principio cuando se usa la unión a receptores del antígeno, mientras que se conservan los determinantes antigénicos conformacionales originales.

Otra ventaja se presenta cuando es deseable unir una molécula de transporte (de abordaje) y un antígeno viajero a un iscom o matriz. Si se ha preparado el iscom o matriz con receptores que contienen lípidos, existe más espacio para integrar antígenos viajeros en el iscom o para copularlos químicamente con la matriz. Usando un receptor que contiene lípido, la unión del antígeno viajero no resulta influenciada. Resulta más fácil alcanzar condiciones óptimas. Mejora el control de la cantidad de antígeno viajero o de moléculas transportadoras (de abordaje) integrados en un iscom o unidos químicamente a un iscom o matriz. Si se prepara el iscom tanto con una molécula transportadora (de abordaje) como con un antígeno usando los mismos métodos, éstos pueden competir por las regiones de unión y no es posible controlar totalmente las incorporaciones de los dos antígenos.

Especialmente en cuanto al antígeno del cólera CTB, que tiene cinco subunidades de unión, es posible unir hasta 13 veces la cantidad en peso del receptor GM1. Aún quedan sitios de unión en CTB, que pueden unirse a receptores celulares en la mucosa y servir como moléculas de transporte (de abordaje).

La razón de peso de esterol, segundo lípido, proteína y glicósido es de 0,2-10:0,2-10:0,2-10:1-100, preferiblemente de 1:1:1:5-10, para uso mediante administración subcutánea. Con la administración oral o intranasal, la cantidad de glicósido puede ser mayor de la razón anterior, a saber, 1-200, preferiblemente 5-20.

Estas cantidades se aplican cuando se prepara primeramente la matriz y luego cuando se copulan químicamente los antígenos y cuando se preparan las partículas de iscom.

El procedimiento para preparar iscomes de CTB (o de LTB) conlleva la mezcla de Quil A o de componentes de Quil A con una mezcla de lípidos que contiene colesterol, fosfatidilcolina y Gal 1-3, Gal NAcb 1-4 (Neu Aca2-3) y gal(GM1), que es un receptor específico para la toxina del cólera (CT) y la toxina termolábil de la E. coli enterotóxica (LT), así como sus subunidades CTB y LTB. La fosfatidilcolina ("PC") puede ser substituida en todo o en parte con fosfatidiletanolamina ("PE"), mediante lo cual el grupo amino de PE constituye un grupo de copulación para antígeno u otros componentes deseados. A diferencia del colesterol, la PC y la PE no son esenciales para la composición del iscom, sino que pueden ser substituidas por otros lípidos "blandos".

Se puede preparar el iscom o la matriz de iscom en composiciones que contienen un agente solubilizante, tal como agua o solución salina fisiológica. Para el agente solubilizante, la composición puede también incluir el detergente con el que se hace el complejo si es aceptable para la medicina humana o veterinaria. Las composiciones pueden incluir también otros aditivos y rellenantes aceptables para la medicina humana o veterinaria.

Dicha composición puede contener, por ejemplo, un complejo de iscom y un rellenante, tal como suero fisiológico. También puede estar compuesta por matrices mezcladas con antígeno. La vacuna puede ser ofrecida en formas de administración que contienen una entidad con una matriz en una composición que contiene un rellenante y una unidad con el antígeno en una composición que contiene un rellenante. Estas dos composiciones están entonces destinadas a su administración en la misma ocasión.

La cantidad de iscom, matriz y antígeno es seleccionada de tal forma que sea farmacéuticamente efectiva y puede ser decidida por el experto. Para humanos, se deberá usar al menos 1 \mug, preferiblemente 1-200 \mug, de los antígenos, sobre lo cual la opinión económica establece el límite superior. Para animales, la dosificación puede ser de al menos 0,1 \mug de los antígenos, dependiendo del antígeno y del tamaño del individuo.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra que la rCTB (CTB recombinante) libre analizada en un gradiente de un 10 a un 50% de sacarosa después de ultracentrifugación se localiza en la parte superior del gradiente, es decir, en la fracción 12-14. Compárense las Figs. 2 y 3.

La Fig. 2 muestra iscomes con rCTB en un diagrama en el que las fracciones en un gradiente de sacarosa del 10-50% después de la centrifugación están representadas frente a 1) la absorbancia a 595 nm para la determinación de la concentración de rCTB usando el método Bradford y 2) las CPM del análisis de ^{3}H-colesterol, un componente de la matriz del iscom. Se hace la matriz del iscom con rCTB y GM1 En una proporción de pesos de 13:1 según el ejemplo 1 y se ultracentrifuga después. Los iscomes con rCTB se encuentran en las fracciones 6-9. Casi todas las rCTB se encontrarán en los iscomes.

La Fig. 3 muestra un diagrama del mismo tipo que la Figura 2. Al hacer iscomes en esta prueba, la concentración de rCTB era 100 veces mayor que la concentración de GM1 p/p. Las rCTB no incorporadas se encontrarán en la parte superior del Bradford, es decir, más arriba en el gradiente en las fracciones 10-12.

Las Figs. 4A y 4B son gráficos de barras que muestran el título ELISA en suero de ratones tras inmunización con rCTB libre y rCTB que ha sido incorporada en una matriz de iscom.

Las barras sólidas se refieren a la inmunización subcutánea, mientras que las barras diagonales se refieren a la inmunización intranasal. La Figura 4A muestra los títulos de anticuerpo en suero 5 semanas después de la primera inmunización, mientras que la Figura 4B muestra el título 6 semanas después de la segunda inmunización. El intervalo entre las inmunizaciones era de 6 semanas.

Las Figuras 5A y 5B son gráficos de barras del mismo tipo que las Figuras 4A y 4B. Se inmunizó a ratones subcutáneamente con 2 \mug de rCTB (barra sólida) o intranasalmente con 4 \mug de rCTB (barra diagonal). La Fig. 5A muestra los títulos de anticuerpo en suero 5 semanas después de la primera inmunización, mientras que la Fig. 5B muestra el título a las 6 semanas de la segunda inmunización. El intervalo entre las inmunizaciones era de 6 semanas.

La Fig. 6 muestra los títulos de anticuerpo después de diferentes inmunizaciones. La rCTB mezclada con matriz y la rCTB unida a un iscom provocan la aparición, tras inmunización subcutánea, de anticuerpos en el suero de las subclases IgG2a e IgG1, a diferencia de rCTB, que provoca casi únicamente la aparición de IgG1. La Fig. 6A muestra el resultado 14 días después de la primera inmunización de refuerzo el día 42, mientras que la Fig. 6B muestra los valores 4 días después de la segunda inmunización de refuerzo el día 110.

La Fig. 7 muestra el resultado tras la inmunización subcutánea de ratones con rCTB unida a matriz, rCTB mezclada con matriz y sólo rCTB. Se muestra la respuesta de anticuerpos en suero 14 días después de la primera inmunización y 14 días después de la segunda inmunización. El intervalo entre las inmunizaciones era de 42 días.

La Figura 8 muestra la respuesta de memoria celular después del segundo refuerzo el día 180 para la misma inmunización que en la Figura 6. Cuatro días después de la dosis de refuerzo, se tomaron muestras de suero para la determinación de anticuerpos.

La invención será ahora descrita con más detalle en relación a los siguientes ejemplos de procedimiento.

Ejemplo 1 Incorporación de GM1 y rCTB en iscomes

La toxina del cólera (CT) es un adyuvante efectivo, especialmente en la inmunización local a través de mucosas. Incluso la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) se clasifica como adyuvante debido a sus cualidades de búsqueda de un blanco en la inmunización local, pero esta actividad se limita, por lo tanto, a una función de guía para el antígeno hacia las células linfáticas del intestino. Si la CTB se une a una matriz de iscom o se incorpora en un iscom, se obtiene una formulación que aumenta la respuesta inmune y que es efectiva en inmunizaciones locales y parenterales. Este efecto es interesante en relación a las vacunas contra el cólera y en la elección de adyuvantes para los otros antígenos para inmunizaciones locales a través de mucosas o parenterales. La toxina del cólera recombinante, subunidad B (rCTB) (EP 0.368.819) se mezcla con diferentes preparaciones:

MEGA-10 (Bachem P1000 decanoil-n-metilglucamida), 20% en peso en H_{2}O; fosfatidilcolina (PC) (Sigma P 5763), 10 mg/ml disueltos en MEGA-10 al 20% en peso en H_{2}O.

Colesterol (C) (Sigma C 8667), 10 mg/ml disueltos en MEGA-10 al 20% en peso en H_{2}O; GM1 (Sigma G7641), 10 mg/ml disueltos en MEGA-10 al 20% en peso en H_{2}O; fosfatidiletanolamina (PE) (Sigma P2768), 10 mg/ml disueltos en MEGA-10 al 20% en peso en H_{2}O.

Quil A (Spikoside, Iscotec, Lule\ring{a}, 100 mg/ml en H_{2}O.

rCTB, 5 mg/ml en una solución tampón con TRIS 0,05 M (pH 7,5), NaCl 0,2 M, Na_{2}EDTA 0,0001 M, NaN_{3} 0,003 M.

Se mezcló fosfatidilcolina con colesterol más cantidades traza decolesterol radiactivo (^{3}H-colesterol, Amersham) en una proporción de 1:1 (100 mg de cada lípido en 10 ml de MEGA-10 al 20%) y con cantidades variables de GM1 desde 1 \mug hasta 75 \mug (1 \mug, 17 \mug, 25 \mug, 4 \mug, 5 \mug, 7,5 \mug) en 1,0 ml de PBS (solución fisiológica de NaCl tamponada con fosfatos), pH 7,2.

Se añadió a 1 ml de las seis diferentes variantes de solución de fosfatidilcolina/coleterol-GM1 Quil A a una concentración final del 0,2%. Se sonicaron las mezclas en un Sonorex TK 52 2x15 minutos y se dejaron a temperatura ambiente (TA) durante 1 hora. Se dializaron entonces las mezclas frente a PBS, primero durante veinticuatro horas a TA y luego durante veinticuatro horas en una sala fría (+4ºC). Se pudo ver que se formaba matriz por microscopía electrónica en cada una de las seis variantes de matriz diferentes, que diferían en cuanto al contenido en GM1. Se añadieron 100 \mug de rCTB. Se dejaron las mezclas durante dos horas a TA. Se purificaron las partículas de matriz con rCTB asociada, es decir, los iscomes, por centrifugación en un gradiente de sacarosa del 10 al 50% en PBS durante 18 horas en un rotor TST 41.14 (Kontron) a 39.000 rpm a 10ºC. Se recogió el gradiente en 16 a 18 fracciones. Se analizaron las fracciones en cuanto a la rCTB usando el método de determinación de proteínas según Bradford (Bradford, Analyt. Biochem., 72, 1976, 248-254) y se determinaron colorimétricamente a 595 nm, y en cuanto a los lípidos por detección del ^{3}H-colesterol, y por microscopía electrónica para estudiar la presencia de posibles estructuras de matriz o de iscomes. La Fig. 1 muestra las fracciones libres 12-14. Las Figs. 2 y 3 muestran las cantidades de lípidos (\blacksquare) y rCTB (\boxempty) en las fracciones cuando la razón de rCTB-GM1 es de 13,1 (Fig. 2), donde el iscom con rCTB sale en las fracciones 6-9, o de 100:1 (Fig. 3), donde la rCTB no incorporada está más arriba en el gradiente, es decir, en las fracciones 10-12.

Resultado

La mayor cantidad relativa (peso) de rCTB que se incorporó por completo en la matriz de GM1, es decir, en el iscom, era 13 veces mayor que la cantidad de GM1 (Fig. 2). En otros varios experimentos, hemos visto la misma proporción. Si se añade una cantidad mayor de rCTB, se encuentra el sobrante de rCTB más arriba en el gradiente sin asociarse al ^{3}H-colesterol, lo que muestra que esta rCTB no se incorpora. Si se añade una cantidad menor de rCTB, se forman agregados por entrecruzamiento, ya que la rCTB tiene cinco posibles sitios de unión a GM1. La matriz con la rCTB asociada, es decir, el iscom, se encontrará en las fracciones 6-9 (Fig. 2). Se obtienen resultados similares con fosfatidiletanolamina en la matriz o el iscom en lugar de fosfatidilcolina (resultados no presentados).

Conclusión

La rCTB puede unirse con efectividad a una matriz que contiene el glicolípido GM1. Una adición de una cantidad apropiada de GM1 durante la preparación de la matriz implica un método de procedimiento eficiente.

Ejemplo 2

En este ejemplo, se ve que la rCTB incorporada en el iscom provoca una mayor respuesta de anticuerpos que la rCTB libre.

Se preparó matriz GM1 del mismo modo que en el ejemplo 1. Se mezclaron fosfatidilcolina/colesterol y GM1 (PC/C/GM1 y Quil A) en una proporción de 1,1:0,25:5 con MEGA-10 (concentración final: 2%). Se dializó la mezcla del mismo modo que en el ejemplo 1. Se añadió rCTB en una cantidad (peso) 3 veces mayor que la cantidad de GM1. Del mismo modo que en el ejemplo 1, se analizó el complejo formado con ME y centrifugación en gradiente de sacarosa. Se analizaron las fracciones del gradiente como en el ejemplo 1 en cuanto al colesterol y a la proteína (rCTB). Se guardaron a continuación los iscomes con rCTB incorporada para uso en experimentos de inmunización.

Se inmunizaron seis grupos de ocho ratones cada uno subcutáneamente con 2 g de rCTB o con 4 g de rCTB intranasalmente en dos ocasiones en un intervalo de seis semanas (véanse las Figs. 4A y 4B). La rCTB esta presente en forma libre, es decir, mezclada con la matriz sin GM1, o unida a la matriz a través de GM1. Se usaron dos variantes de matriz GM1 según lo anterior en una proporción de peso de 13:1 o de 25:1 (rCTB:GM1 dependiendo del peso), es decir, saturada o excesivamente saturado en cuanto a la proporción de rCTB/GM1.

Grupo A: rCTB libre, 2 \mug de rCTB, iny. s.c., 0 \mug de Quil A.

Grupo B: rCTB libre, 4 \mug de rCTB, iny. i.n., 0 \mug de Quil A.

Grupo C: Iscom, 2 \mug de rCTB (13 x GM1), iny. s.c., 3 \mug de Quil A.

Grupo D: Iscom, 4 \mug de rCTB (13 x GM1), iny. i.n., 6,1 \mug de Quil A.

Grupo E: Iscom, 2 \mug de rCTB (25 x GM1), iny. i.n., 1,6 \mug de Quil A.

Grupo F: Iscom, 4 \mug de rCTB (25 x GM1), iny. i.n., 3,2 \mug de Quil A.

Se midieron los títulos de anticuerpo del suero usando ELISA a diferentes tiempos según las Figs. 4A y 4B.

En la prueba ELISA, se incubaron las placas ELISA (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con un tampón carbonato 50 mM, pH 9,5, que contenía 2 \mug de rCTB/ml. Se diluyeron muestras de suero de los ratones seriadamente. Se trataron las placas ELISA con las soluciones de suero diluido. Se detectaron los anticuerpos unidos de los ratones con conjugado de conejo-anti-ratón conjugado a peroxidasa (Dakopatts) y, como substrato, se usó TMB y H_{2}O_{2} (EC Diagnostics, Uppsala).

Resultado

Los resultados están expuestos en las Figs. 4A y 4B, que muestran los títulos de anticuerpo en suero medidos por ELISA 5 semanas después de las primeras inmunizaciones subcutáneas e intranasales con rCTB (A) y 6 semanas después de la segunda inmunización (B). El intervalo entre inmunizaciones era de 6 semanas. La rCTB incorporada en iscom en una proporción de 13:1 (rCTB:GM1 (peso)) provocaba, después de dos inmunizaciones subcutáneas con 2 \mug de rCTB, un título de 87.000 iscomes; con una proporción de rCTB:GM1 de 25:1, provocaba títulos de 50.000. Los títulos de anticuerpo en suero correspondientes para dos inmunizaciones subcutáneas con rCTB libre eran de 8.600.

Después de dos inmunizaciones intranasales con rCTB en iscom (13:1) (rCTB:GM1), se obtuvieron títulos en suero de 21.000, mientras que con 25:1 (rCTB:GM1) se provocaban títulos de anticuerpo en suero de 33.000. La rCTB libre provocaba, después de dos inmunizaciones intranasales, títulos ELISA en suero de 19.000.

Conclusión

La rCTB en iscom es, tras inmunización subcutánea, más inmunogénica que la rCTB libre, pero hubo diferencia significativa después de una inmunización intranasal.

Ejemplo 3

En este experimento, se usó la matriz como adyuvante con antígeno no incorporado en la inmunización subcutánea e intranasal.

Se preparó matriz sin GM1 básicamente como se ha descrito en el ejemplo 1, con la única diferencia de que se excluyó GM1. Las proporciones de los pesos de fosfatidilcolina/colesterol/Quillay eran de 1:1:5. Se disolvieron los lípidos en MEGA al 20%. Se llevó a cabo la diálisis como en el ejemplo 1. Se analizó la matriz y se caracterizó como en el ejemplo 1 usando ME y centrifugación analítica en gradiente de sacarosa. Se preparó matriz con GM1 como en el ejemplo 1 y se incorporó rCTB en una proporción de 13:1 (rCTB:GM1). Cuando se excluyó GM1 de la matriz, no se produjo ninguna unión de rCTB a la matriz.

Se inmunizaron ocho ratones por grupo subcutáneamente con 2 \mug de rCTB en iscomes o mezclada con matriz como adyuvante, o intranasalmente con 4 \mug de rCTB en iscomes o mezclada con matriz como adyuvante. Se realizaron dos inmunizaciones en un intervalo de seis semanas.

Grupo C: Iscom, 2 \mug de rCTB subcutáneamente, 3 \mug de Quil A.

Grupo D: Iscom, 4 \mug de rCTB intranasalmente, 6,1 \mug de Quil A.

Grupo G: Matriz mezclada con 2 \mug de rCTB subcutáneamente, 3,0 \mug de Quil A.

Grupo H: Matriz mezclada con 4 \mug de rCTB intranasalmente, 6,1 \mug de Quil A.

\newpage

Se midieron los títulos de anticuerpo en el suero usando ELISA y se dan los títulos como la dilución que da una absorbancia de 1,0.

Resultados

Los resultados están resumidos en la Fig. 5, que muestra la respuesta de anticuerpos en suero tras la inmunización con 2 \mug de rCTB administrados s.c. o con 4 \mug de rCTB administrados i.n., medida en ELISA 5 semanas después de la primera inmunización (A) y 6 semanas después de la segunda inmunización (B). El intervalo entre inmunizaciones era de 6 semanas. Después de dos inmunizaciones subcutáneas con rCTB mezclada con matriz como adyuvante, se indujo un título medio de 91.000 en comparación con 87.000 para rCTB en forma de iscom. Después de dos inmunizaciones intranasales, se indujo un título de 54.000 para rCTB mezclada con matriz, en comparación con 21.000 para rCTB en iscom.

Conclusión

Tras la inmunización subcutánea, los títulos de anticuerpo en suero inducidos por rCTB en forma de iscom eran casi tan altos como los inducidos por rCTB mezclada con matriz como adyuvante. Después de la inmunización intranasal, se indujeron títulos después de la inmunización con rCTB mezclada con matriz dos veces más altos que con rCTB en forma de iscom. Es interesante observar que la matriz en forma libre tiene un efecto adyuvante tan fuerte sobre la respuesta de anticuerpos como la forma de iscom de rCTB. En la fórmula de la matriz, se incluyó el doble de Quillay.

Sobre todo, es sorprendente que la matriz en forma libre tenga un efecto adyuvante después de la administración local a través de mucosas con rCTB, que tiene por sí misma un efecto adyuvante en forma de abordaje cuando se inmuniza a través de las membranas mucosas.

Ejemplo 4

Una de las funciones de un adyuvante es provocar una fuerte respuesta inmune, que puede ser medida como respuesta de anticuerpos o como respuesta inmune mediada por células. Otra de sus funcione es provocar el tipo deseado de respuesta inmune, que puede ser leída, por ejemplo, en subclases de IgG que reflejan la respuesta de células "T-helper" identificada con la producción de citokinas. En este experimento, se ve que la rCTB en forma libre sin adyuvante provoca una respuesta de anticuerpos en suero enfocada hacia la subclase IgG. Mezclando rCTB con matriz o incorporando rCTB en un iscom, también se producen anticuerpos séricos contra rCTB en la subclase IgG2a, que se asocia con una respuesta TH1.

Se inmunizaron ocho ratones por grupo (tres grupos) dos veces subcutáneamente en un intervalo de 6 semanas con 2 \mug de rCTB sin adyuvante, o con 2 \mug de rCTB mezclada con matriz, o con 2 \mug de iscom de rCTB.

Se midieron las respuestas de anticuerpos en suero usando ELISA según un programa temporal que puede verse en la Fig. 6. La distribución de los anticuerpos séricos en clases y subclases fue analizada usando ELISA mediante la utilización de antisueros específicos de clase y subclase (Dakopatts, Dinamarca).

Resultados

La rCTB libre sin adyuvante provocaba principalmente una respuesta de IgG1 frente a rCTB, mientras que no se pudo encontrar ningún anticuerpo de la subclase IgG2a. Tanto la rCTB-iscom como la rCTB mezclada con matriz provocaban anticuerpos tanto IgG1 como IgG2a frente a rCTB (Fig. 6A) 14 días después de la primera inmunización de refuerzo, el día 42. Incluso después de un segundo refuerzo el día 110, la rCTB libre sin adyuvante no provocaba una respuesta IgG2, mientras que el iscom y la rCTB mezclada con matriz dieron una clara respuesta de IgG2 (Fig. 6B) 4 días después de la 2ª inmunización de refuerzo.

Conclusión

Existen diferencias de calidad en cuanto a la respuesta de anticuerpos en suero en la rCTB en forma libre sin adyuvante en comparación con la rCTB provista de matriz como adyuvante o unida a iscom. Tanto la matriz como el iscom con rCTB provocan anticuerpos frente a rCTB de la subclase IgG2a, así como IgG1, a diferencia de la rCTB libre, que sólo es capaz de provocar la aparición de anticuerpos IgG1.

Ejemplo 5

El efecto de las vacunas frente a infecciones depende no sólo del efecto directo que tenga la respuesta inmune evocada, sino también de las células de memoria inducidas que son reclutadas en relación con infecciones. La función de las células de memoria es especialmente importante un largo tiempo después de la vacunación, cuando la inmunidad evocada habrá descendido. Es, por lo tanto, deseable, una fuerte respuesta de células de memoria, que puedan ser reclutadas rápidamente en el momento de la infección.

Se inmunizaron ocho ratones por grupo (3 grupos) dos veces subcutáneamente en un intervalo de 8 semanas con 2 \mug de rCTB sin adyuvante, con rCTB incorporada en iscom o con rCTB mezclada con matriz. Se midió la respuesta de anticuerpos usando un ELISA y se dividió cada grupo en dos subgrupos de 4 ratones cada uno. Se realizó una segunda inmunización de refuerzo el día 180 y se tomaron muestras de sangre para suero 4 días después.

Resultados

Se pueden ver los resultados en la Fig. 7. Después de la primera inmunización (día 14), las mayores respuestas inmunes fueron provocadas por rCTB mezclada con matriz (17.000) e iscom de rCTB (9.000). La rCTB sin adyuvante indujo títulos de aproximadamente 1.000. Dos semanas después de la segunda inmunización (el intervalo entre inmunizaciones fue de 42 días), los ratones de todos los grupos habían aumentado sus títulos de anticuerpos en suero apreciablemente. Se hallaron los títulos más altos en el grupo de la matriz (aproximadamente 57.000) y en el grupo del iscom (35.000), mientras que los títulos para el grupo vacunado con rCTB sin adyuvante tenía títulos de aproximadamente 6.000.

Después de la tercera inmunización (es decir, del segundo refuerzo) el día 180, es decir, 140 días después de la segunda inmunización, los ratones que habían sido inmunizados con rCTB libre tenían títulos de anticuerpo de aproximadamente 8.000, es decir, justo aproximadamente los mismos títulos que después de la segunda inmunización. Los ratones que habían sido inmunizados con iscom o con rCTB mezclada con matriz respondieron tras la 3ª inmunización el día 180 con un aumento en los títulos de anticuerpo en suero para la matriz (aproximadamente 90.000) y el iscom (aproximadamente 70.000) (Fig. 8). Se tomó suero 4 días después de la 3ª inmunización para las pruebas de anticuerpos.

Conclusión

El fuerte aumento de anticuerpos en el suero de ratones que habían sido inmunizados de nuevo mucho tiempo después de la anterior inmunización (140 días) con iscom de rCTB o con rCTB mezclada con matriz muestra que se ha evocado una fuerte respuesta de memoria con las inmunizaciones previas. La rCTB sin adyuvante, sin embargo, no mostró ninguna respuesta inmune que pueda ser reforzada después de un largo tiempo.

Ejemplo 6

Se preincubó rCTB a 20ºC durante 1 hora con matriz que contenía GM1 en proporciones que fueron estudiadas con anterioridad, de tal forma que la preparación (A) saturara la matriz con rCTB y de tal forma que la preparación (B) diera una sobresaturación, de manera que aproximadamente la mitad de la cantidad de rCTB no pudiera unirse a la matriz. Después de la incubación, se purificó la matriz de la rCTB no unida por centrifugación.

Se usaron entonces las preparaciones A y B para inmunización peroral, intranasal o intraperitoneal de ratones C57/B1 de 8-10 semanas de edad. Se dio a grupos de 3 ratones por grupo 3 dosis a intervalos de 2 semanas entre las dosis. Cada dosis contenía 17 \mug de rCTB y 26 \mug de Quillay para la inmunización peroral, la mitad de la dosis para la intranasal y una sexta parte para la inmunización intraperitoneal.

Se dieron inmunizaciones peroral, intranasal e intraperitoneal a tres grupos más de ratones, respectivamente, con cantidades correspondientes de matriz (que no contenía GM1) mezcladas con rCTB.

Una semana después de la tercera dosis, los animales fueron sacrificados, sangrados y perfundidos con PBS-heparina, tras de lo cual se tomó tejido pulmonar de ambos pulmones y se trituró. Se congeló el tejido a -30ºC y se descongeló después y suspendió en PBS-1% de saponina (1 ml por 1 mg de tejido) y se extrajo en frío (+4 a 10ºC) durante la noche. El extracto de tejido y los sueros fueron luego utilizados para obtener anticuerpos específicos frente a CTB usando GM1-ELISA.

En la Tabla 1 se pueden ver los resultados. Es evidente que todas las preparaciones A-C dan altas respuestas de anticuerpos en suero después de la inmunización intraperitoneal e intranasal y que la inmunización intranasal con (A) y (B) estimula buenos títulos de anticuerpo IgA locales en el extracto de tejido de células del tracto respiratorio.

TABLA 1

1

3 inmunizaciones: 3 ratones por grupo. Se muestran los títulos medios.

Se inmunizaron los ratones 3 x

A = PC/C + GM1 + rCTB 13x (saturada)

B = PC/C + GM1 + rCTB 25x (sobresaturada)

C = PC/C - GM1 + rCTB (PC/C y rCTB por separado)

D = rCTB

E = rCTB + toxina del cólera.

La dilución, expresada como 1/x es <5.

PO = administración peroral, 20 \mul (17 \mug de CTB y 26 \mug de QA).

IP = intraperitoneal, 3 \mul.

IN = intranasal, 10 \mul.

Ejemplo 7

Este ejemplo muestra que un iscom que contiene matriz con GM1 y al que ha se unido e incorporado rCTB junto con una ovoalbúmina (OVA) a la que se ha provisto de una cola lipídica provoca una respuesta de anticuerpos contra rCTB y contra OVA después de una inmunización intranasal (IN).

Lipidación de la OVA Reactivo

1 mg de OVA,

1 mg de fosfatidiletanolamina (PE), con pequeñas cantidades de PE marcada con ^{14}C,

14 mg de N-hidroxisulfosuccinimida,

384 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)car-bodiimida-HCl y

H_{2}O hasta un volumen de 2 ml.

Se incubó la mezcla durante 2 horas en una mesa vibrante a temperatura ambiente.

Se incorporó esta OVA en iscomes con y sin GM1, de forma análoga al método descrito anteriormente en el ejemplo 1. Se caracterizaron los iscomes por microscopía electrónica (ME) y centrifugación analítica en gradiente de sacarosa del mismo modo que en el ejemplo 1.

En la preparación de los iscomes se usaron los siguientes ingredientes:

2

Para la preparación, véase el ejemplo 1.

Cuando los iscomes debían contener también GM1, se usaron los siguientes ingredientes:

3

Al preparar iscomes de OVA-rCTB, se mezclaron iscomes de OVA-GM1 con cantidades 13 veces mayores (peso) de rCTB que de GM1. Se calcularon las cantidades del mismo modo que en EP 180.562, ejemplo 2.1.

Se inmunizaron cinco grupos de ocho ratones cada uno por vía intranasal dos veces con un intervalo de seis semanas según el siguiente esquema:

4

A las 3 semanas de la primera inmunización y a las 2 semanas de la segunda inmunización, se recogieron muestras de suero. Se prepararon los pulmones 2 semanas después de la primera y segunda inmunización para extracción de anticuerpos IgA. Se determinaron los títulos de anticuerpo en el suero y en el extracto de pulmón del mismo modo que en los ejemplos 1 y 2.

Resultados después de una inmunización

Los ratones del grupo D respondieron con niveles significativos de títulos de anticuerpos frente a rCTB en suero. Se detectaron títulos de anticuerpos significativos frente a rCTB en el extracto de pulmón. Se obtuvieron títulos de anticuerpos más bajos frente a OVA tanto en suero como en el extracto de pulmón.

Después de la inmunización subcutánea (grupo E), se obtuvieron aproximadamente los mismos niveles de anticuerpos en suero frente a CTB que frente a OVA. No se midió respuesta de anticuerpos frente a rCTB u OVA en el extracto de pulmón.

En los ratones del grupo C, que habían sido inmunizados intranasalmente con iscomes de OVA más rCTB libre, se midieron los títulos de anticuerpos frente a rCTB con ELISA, títulos de anticuerpos en suero que eran del mismo nivel que los de los ratones del grupo D. No se pudo medir ningún título de anticuerpos frente a OVA en el suero. En el extracto pulmonar, se midieron títulos significativos frente a rCTB, pero no se pudo medir ninguna respuesta de anticuerpos, o se midió muy poca, frente a OVA.

En los ratones del grupo F, se obtuvieron títulos de anticuerpos moderados en el suero y en el extracto pulmonar frente a rCTB después de la inmunización primaria (i.n.), pero no frente a OVA.

En los ratones de los grupos restantes (A, B), no se pudo medir ningún título de anticuerpos frente a OVA en el suero ni en el extracto pulmonar.

Resultados después de la segunda inmunización

Se midieron elevados títulos de anticuerpos frente a OVA en suero en los ratones de los grupos D y E, es decir, en los ratones que habían sido respectivamente inmunizados intranasal o subcutáneamente con iscomes de OVA-rCTB.

En el extracto pulmonar de los ratones del grupo D, se midieron los títulos de anticuerpo frente a rCTB y a OVA.

No se midieron títulos, o se midieron títulos muy bajos, en el extracto de pulmón de ratones que habían sido inmunizados subcutáneamente con iscomes de OVA-rCTB (grupo E).

En los ratones del grupo C, se midieron altas respuestas de anticuerpos frente a rCTB en el suero, pero se obtuvieron títulos muy bajos en suero frente a OVA. En el extracto pulmonar, se midieron los títulos de anticuerpos frente a rCTB, pero no frente a OVA.

En los ratones del grupo B (iscom de OVA), se midieron bajos títulos frente a OVA tanto en suero como en el extracto pulmonar. La OVA libre (grupo A) no provocó títulos de anticuerpos detectables, tanto en suero como en el extracto pulmonar.

Después de la segunda inmunización, se obtuvo un aumento de anticuerpos en suero de varias veces los títulos frente a rCTB, pero no frente a OVA. Después de la segunda inmunización, se midieron títulos de anticuerpos IgA frente a rCTB en el pulmón que eran significativos, pero no se midió respuesta de anticuerpos frente a OVA.

Conclusión

Los resultados muestran que los iscomes que contienen rCTB como moléculas de transporte (de abordaje) y OVA como antígeno viajero inducen de manera efectiva respuesta de anticuerpos frente a rCTB y a OVA en extracto de pulmón y en suero. Sólo la OVA, los iscomes de OVA (iscomes con sólo antígeno viajero) o la OVA libre más iscomes de rCTB provocaban una respuesta de anticuerpos nula o muy baja frente a OVA en suero y en extracto de pulmón.

Claims (10)

1. Partícula que contiene lípidos, seleccionada entre iscomes y matriz de iscomes, caracterizada por consistir en uno o más receptores que contienen lípidos para substancias antigénicas procedentes de microorganismos, toxinas bacterianas, fimbrias, moléculas de adhesión y partes activas de unión de las mismas, o receptores que son hidrofóbicos, cuyos receptores han sido integrados en la partícula.

2. Partícula que contiene lípidos según la reivindicación 1, caracterizada por contener al menos una substancia antigénica y/o buscadora de un blanco unida al receptor.

3. Partícula que contiene lípidos según la reivindicación 2, caracterizada por un contenido de al menos dos antígenos o de al menos un antígeno y al menos una molécula buscadora de un blanco y por el hecho de que ese al menos un antígeno está unido a una molécula de unión a receptores.

4. Partícula que contiene lípidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada por ser la molécula receptora un receptor que contiene lípidos.

5. Partículas que contienen lípidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizadas por ser la molécula receptora el receptor que contiene lípidos GM1 de la toxina del cólera y ser el antígeno la toxina del cólera o partes de la misma.

6. Partículas que contienen lípidos según la reivindicación 5, caracterizadas por ser el antígeno la subunidad B de la toxina del cólera o proteínas estrechamente relacionadas desde el punto de vista inmunológico o la enterotoxina termolábil de E. coli o subunidades de la misma que se unen al receptor.

7. Partículas que contienen lípidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizadas por ser la molécula receptora una proteína hidrofóbica.

8. Partículas que contienen lípidos según la reivindicación 7, caracterizadas por ser la molécula receptora una glicoproteína o un antígeno de grupos sanguíneos fucosilado.

9. Partículas que contienen lípidos según la reivindicación 8, caracterizadas por ser la molécula receptora la glicoproteína que se une a la enterotoxina termolábil de E. coli o subunidades de ésta y por ser el antígeno la enterotoxina de E. coli o partes de ésta.

10. Preparación de vacuna para profilaxis y/o inmunoterapia, caracterizada por contener partículas según una de las reivindicaciones 1-9.