DE69727314T2

DE69727314T2 - Ein ISCOM oder eine ISCOM-Matrix, umfassend hydrophobe Rezeptormoleküle für antigene Stoffe

Info

Publication number: DE69727314T2
Application number: DE1997627314
Authority: DE
Inventors: Bror Morein; Bengtsson Karin Loevgren; Jill Ekstroem
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2017-02-21
Also published as: CA2247103C; BR9707638A; US6027732A; DE69727314D1; NZ331418A; WO1997030726A1; AU2238397A; CA2247103A1; AU718443B2; ATE258066T1; SE9600648D0; DK0944397T3; EP0944397A1; EP0944397B1; ES2214608T3

Description

Die Erfindung betrifft lipidhaltige Partikel, ausgewählt aus Iscoms und Iscom-Matrizen, welche einen oder mehrere hydrophobe Rezeptorkomponenten enthalten, die an Antigene aus Mikroorganismen, so wie Bakterien, Viren, oder Teile davon, d. h. an die rezeptorbindenden Teile, so wie Toxine oder Oberflächenproteine, binden.
Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zum Herstellen solcher lipidhaltiger Partikel und die humanmedizinische, veterinärmedizinische oder andere pharmakologisch vorbeugende und heilende Verwendung, so wie die immuntherapeutische Verwendung, dieser Partikel. Die Erfindung beinhaltet insbesondere Iscoms und Iscom-Matrizen, deren Oberflächen mit bakteriellen Toxinfragmenten, so wie der Choleratoxin B-Untereinheit (CTB), präpariert sind.
Hintergrund der Erfindung
Lipidhaltige Strukturen in der Form von Mizellen, Liposomen und anderen Vesikeln, Iscoms (immunstimulierender Komplex/immunstimulierende Partikel), Iscom-Matrizen usw. wurden als wirksame Träger für pharmakologisch und/oder immunologisch aktive Substanzen oder Molekülkomplexe vorgestellt. Siehe beispielsweise WO-A1-90/03184 (Morem et al., Clin. Immunother. Review, 1995; Kersten et al., Iscom-Liposome Review, 1995). In vielen Fällen wurde gezeigt, daß die Immunisierung von Labortieren mit solchen lipidhaltigen Strukturen, in die verschiedene Antigene mit einbezogen sind, eine erhöhte Immunantwort auf die entsprechenden Antigene hervorruft, verglichen mit der Immunantwort, die nach der Immunisierung unter Verwendung des entsprechenden Antigens in einer freien Form erhalten wird.
Iscom und Iscom-Matrizen sind als wirksame Träger für Antigene und Adjuvansmoleküle dokumentiert, um die Immunogenizität von kleinen und großen Molekülen (Antigenen) zu verstärken, d. h. sie stark immunogen zu machen, sowohl wenn sie parenteral als auch wenn sie lokal auf mukösen Oberflächen verabreicht werden (topisch). Das Iscom hat einzigartige Eigenschaften dahingehend, daß es wirksam nach mukosaler intranasaler Verabreichung ist. Es ist gut dokumentiert (Morem et al., Clin. Immunother. 3, 1995, 461–475), daß sowohl Iscoms mit integrierten Antigenen (normalerweise Protein) als auch Iscoms als Träger, beispielsweise kleine Antigene, so wie Oligopeptide, oder wie beispielhaft ausgeführt durch Biotin, effektiv eine Immunantwort auf diese großen oder kleinen Moleküle hervorrufen.
Iscom-Matrizen (und Iscom) haben eine gut dokumentierte, beinhaltete Adjuvansaktivität, die Antikörper-vermittelte sowie zellvermittelte Immunantworten auf die gleichsam verabreichten Antigene potenziert. Iscom ruft zellvermittelte Immunantwort sowohl unter Klasse I- als auch Klasse II-Restriktion hervor.
Cholera ist die ernsthafteste aller Diarrhöekrankheiten und wird verursacht durch die Vibrio-Cholerabakterien in Gruppe I. Diese Bakterien kolonisieren sich im Dünndarm von Menschen und scheiden ein Ektotoxinprotein aus, das als Choleratoxin bekannt ist. Dieses Toxin bindet an und wird absorbiert durch Zellen in den Schleimhäuten und verursacht ein intensives Ausscheiden von Elektrolyten und Wasser aus den Zellen, was zu den schweren Fällen von Diarrhöe, Entwässerung und metabolischer Azidose führt, die die Cholera kennzeichnen.
Ähnliche Krankheiten können verursacht werden durch sogenannte "enterotoxische" (ET) Colibakterien, aber die Symptome sind normalerweise milder. Solche Bakterien verursachen häufig Diarrhöe bei jungen Individuen unter Menschen und praktisch allen Arten von Tieren, einschließlich Schweinen und Rindvieh. Diese Diarrhöe-Arten, welche zu großen ökonomischen Verlusten in der Viehwirtschaftindustrie führen können, werden teilweise durch das hitzelabile Toxin (LT) verursacht, das dem Choleratoxin (CT) ähnlich ist. Diese Toxine sind so ähnlich, daß sie an die gleichen Rezeptoren binden.
Die Strukturen von CT und LT sind gut definiert bezüglich Struktur und Funktion. Sie sind oligomere Proteine, die aus einem Teil bestehen, der an den Choleratoxinrezeptor, nämlich den B-Teil, bindet, welcher wiederum aus fünf Untereinheiten besteht, welche jeweils ein ungefähres Molekulargewicht von 11.600 haben und einen Pentamerring bilden. Die A-Untereinheit ist ein proteolytisch gespaltenes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 28.000, bestehend aus zwei Disulfid-verbundenen Fragmenten. Das größere A1-Fragment enthält Toxin-Enzym-Aktivität, während das kleinere A2-Fragment das A1-Fragment mit dem B5-Ring verbindet. CT bindet mit hoher Affinität an eine Klasse von Rezeptoren, die auf der Oberfläche der sogenannten Bürstensaummembranen im Dünndarm existieren, ebenso wie an die Plasmamembran der meisten menschlichen Zellen. Das GM1-Gangliosid stellt den Rezeptor für CT dar (Holmgren et al., Infect. Immun. 38, 424–433). LT bindet ebenso an GM1.
CT bzw. LT sind beides wichtige Bestandteile in den Impfstoffen der Untereinheit, die dafür vorgesehen sind, einen Schutz gegen Cholera und enterotoxische Colibakterien hervorzurufen. Im Falle von Darminfektionen ist es von besonderem Interesse, einen lokalen Schutz hervorzurufen, der unter anderem durch Sekretions-IgA in die Darmmembran ausgeübt wird. CT und LT werden beide als Targeting-Moleküle für gut geeignet gehalten bei Adjuvansformulierungen für Impfstoffe, die für die Verabreichung im Darmtrakt und in den Atemwegen vorgesehen sind (Morein, Lovgren and Cox, 1966), wobei sie unter anderem die Fähigkeit haben, eine Sekretions-IgA-Antwort hervorzurufen, die ein wichtiger Bestandteil bei dem Schutz ist. Die B-Untereinheiten von CT und LT haben eine Menge Interesse als Trägermoleküle und sogar als universelle Vektorsysteme für orale Impfstoffe auf sich gezogen (Mucosal Handbook Immunology, Hrsg. Ogra, P. L. Lamm Me, Mc Ghee Jr., Mestechy, J., Strober, W., Bienenstock, J, 1994). Das Interesse ist sogar noch weiter angestiegen, da gezeigt wurde, daß das Konjugat zwischen CTB und anderen Antigenen nicht nur eine Immunantwort in den lokalen Darmschleimhautmembranen hervorruft, sondern auch zu einem begrenzten Ausmaß in anderen entfernten Schleimhäuten, so wie der Speicheldrüse, der Lunge, dem Genitaltrakt, und im Blut (Handbook mucosal, 1994). Das Problem mit CTB und LTB ist es, daß sie eine niedrige (innere) Kapazität haben, ihre eigene starke, schützende Immunantwort gegen das Choleratoxin oder gegen LT oder gegen das Antigen, für das sie als Träger modifiziert sind, zu potenzieren. Sie haben so eine niedrige Adjuvansaktivität in Bezug auf die immunmodulierende und immunpotenzierende Wirkung (Morein, Lovgren und Cox, 1966).
CTB und LTB werden experimentell als Träger eines Antigens verwendet, mit dem Zweck, durch lokale Verabreichung (oral) eine lokale Immunantwort in den Schleimhäuten des Verdauungstrakts ebenso wie in anderen Schleimhäuten durch darmverbundenen lymphatischen Verkehr (GALT) oder direkte Anwendung auf anderen Schleimhäuten, so wie den Atemwegen, hervorzurufen. CTB und LTB haben Targeting-Kapazität, was bedeutet, daß von ihnen erwartet wird, sowohl sich selbst als auch die Antigene, die sie tragen können, zu dem lymphatische System im Darmtrakt zu lenken und anzuordnen, was bedeutet, zu den M-Zellen in Payer's Patches, zu Lamina propria (LP) und zu dem lymphatischen System im Darm und anderen Schleimhäuten durch GALT oder durch direkte Anwendung auf diesen Schleimhäuten, beispielsweise in den Atemwegen.
Die folgenden ungelösten Schwierigkeiten existieren bezüglich der Verwendung von CTB und LTB für lokale Immunisierung.

1. CTB und LTB haben durch ihre eigene relativ geringe Immunogenizität und eine geringe immunverstärkende Kapazität den Bedarf, daß sie mit einem Adjuvansbestandteil potenziert werden, um optimale Wirksamkeit zu erhalten. In anderen Worten, dieses beinhaltet sowohl ihre eigene Immunogenizität als auch ihre immunverstärkende Wirkung auf die Antigene, die sie mit sich getragen haben können. Ihr Wert als Adjuvans ist auf "Targeting" beschränkt, während weitere Adjuvansaktivitäten in der Form von immunmodulierenden und immunverstärkenden Kapazitäten erforderlich sind, um eine optimale Immunogenizität zu erhalten.
2. Es gibt Limitierungen für das Konjugieren von Antigenen auf CTB und LTB mit insbesondere hoher physikalischer oder ökonomischer Ausbeute, da nur eine limitierte Anzahl von Aminogruppen und/oder Carboxygruppen aktiviert werden kann, ohne dabei ernsthaft ihren Wert als Antigen oder als Träger in Schleimhäuten zu reduzieren und ohne daß sie sich selbst und die begleitenden Antigene auf die lymphatischen Organe und Zellen richten, um Immunantworten hervorzurufen. Sogar wenn eine ausreichende Anzahl von Kopplungsgruppen auf einem Trägermolekül erhältlich ist, ist es gut bekannt, daß es schwierig ist, aufgrund der ungenügenden Ausbeute die gewünschte ökonomische Ausbeute aus solchen Konstruktionen zu erhalten. Beispielsweise werden häufig nicht mehr als 15–20% der erhältlichen Antigene durch die Umsetzung an das Trägermolekül gebunden.
3. CTB und LTB haben einen limitierten Raum zum chemischen Binden von größeren Molekülen, da sie funktionelle Epitope blockieren können, die erforderlich sind, um die Komplexe auf die lymphatischen Organen und Zellen zu richten.

Alving et al. beschreibt Liposome als Trägersystem für Malaria-Sporozoidantigen und Choleratoxin (CT).
Nabila et al. beschreibt Liposome, die Lipid A als Adjuvans und Choleratoxin als ein Proteinantigen enthalten.
Valdolas et al. beschreibt Liposome, die OVA und den B-Bestandteil des Choleratoxins CTB enthalten. Im Gegensatz dazu betrifft die vorliegende Erfindung Iscom-Partikel, die lipidhaltige Rezeptoren umfassen, beispielsweise den GM1-Rezeptor für Choleratoxin.
Scheepers et al. offenbaren die perorale Immunisierung mit einer Zusammensetzung, die Iscoms, bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) und Influenza NP enthält. LPS wird verwendet, um das hoch wasserlösliche NP durch das Anhaften des bakteriellen Lipopolysaccharids LPS amphipatisch zu machen. Diese Iscoms enthalten keinen lipidhaltigen Rezeptor.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun demonstriert, daß durch die Verwendung von lipidhaltigen Partikeln, ausgewählt aus Iscoms und Iscom-Matrizen, die einen oder die mehrere hydrophobe Rezeptormoleküle für Antigensubstanzen oder Targeting-Moleküle enthalten, ein Beitrag in Richtung eines neuen allgemeinen Systems zum Binden von Molekülen geleistet wird. Diese Rezeptoren können lipidhaltige Rezeptoren sein oder Rezeptoren, die hydrophobe Proteine sind. Durch dieses neue allgemeine System wird ein größerer Anteil von Antigenen oder anderen Substanzen an das Partikel mit einer Ausbeute gebunden, die beginnt, sich 100% zu nähern, was ökonomisch vorteilhaft ist, aber vor allem ermöglicht es dieses neue System, ohne Wettbewerb aus früheren Systemen (die den Rezeptor nicht verwenden) ( EP 0 109 924 B1 , EP 0 180 546 B1 , EP 0 242 380 B1 ) an Antigen und Targeting-Moleküle oder Molekülkomplexe zu binden. Konsequenterweise ist die Immunantwort effizienter induziert durch die Antigene, die an den Rezeptor gebunden sind. Vor allem wird es möglich, Antigen an den Rezeptor gemeinsam mit den anderen Antigenen zu binden, die beinhaltet sind, ohne den Rezeptor zu verwenden. Mit dieser Erfindung ist es leichter, sowohl Targeting-Moleküle, welche beispielsweise in Schleimhäute eintreten können, als auch Passagier-Antigene, welche durch Schleimhäute nicht absorbiert werden können, zu binden (siehe die Schwedische Patentanmeldung 9600647-3). Ein besonderer Vorteil ist es, daß lipidhaltige Rezeptoren als ein integriertes Lipid in den Komplexen verwendet werden können, das heißt, sie können Lipide ersetzen, die verwendet werden, um den Komplex aufzubauen (Pat. Lipid-Iscom).
Unter den rezeptorbindenden Bestandteilen, die durch die Erfindung umfaßt sind, sind beispielsweise bakterielle Toxine und deren aktive Bindeteile in Form von Untereinheiten oder Fragmenten oder verschiedenen Modifikationen oder Derivaten davon, bakterielle Fimbrien oder andere Adhäsionsmoleküle und deren aktive Bindeteile und/oder Derivatstrukturen. In vielen Fällen sind diese Targeting-Strukturen auch relevante Impfstoffantigene, und die Präsentation solcher Antigene auf der Oberfläche von lipidhaltigen Partikeln usw. zur Verwendung bei der Impfung sind ebenso Teil der Erfindung.
Iscom enthält wenigstens ein Glykosid, wenigstens ein Lipid und wenigstens eine Art Antigensubstanz, insbesondere Proteine und Peptide. Diese Komplexe verstärken die Immunogenizität der enthaltenen Antigene und können auch eine oder mehrere immunmodulatorische (Adjuvans-aktive) Substanzen enthalten und sind beschrieben in EP 0 109 924 B1 , EP 0 242 380 B1 und EP 0 180 546 B1 .
Die Matrix enthält wenigstens ein Glykosid, eine Adjuvans-aktive Substanz, und wenigstens ein Lipid. Die Matrix hat eine immunverstärkende Wirkung auf gleichsam verabreichte antigene Substanzen, siehe EP 0 436 620 B1 .
Es wurde gezeigt, daß die Lipide in diesen Komplexen teilweise durch lipidhaltige Rezeptoren für Antigensubstanzen aus Mikroorganismen ersetzt werden können. Auf diese Art und Weise wird die Menge Antigen, die an das Partikel bindet, bemerkenswert erhöht.
In den Fällen, wo die Komplexe Iscoms sind, werden diese Iscoms hergestellt, wie in dem Europäischen Patent EP 0 109 942 B1 beschrieben. Hier werden Viren, Mykoplasma, Bakterien, Parasiten, Tierzellen, enthaltend Antigene oder antigene Determinanten, insbesondere Proteine oder Peptide oder isolierte Beispiele, die hydrophobe oder amphipatische Bereiche haben, mit einem oder mit mehreren Lösungsmitteln vermischt, wodurch Komplexe zwischen Antigenen oder antigenen Determinanten und Lösungsmitteln gebildet werden, wonach die Antigene oder Determinanten aus dem Lösungsmittel abgetrennt werden in der Gegenwart einer Glykosidlösung oder aus dem Lösungsmittel abgetrennt und direkt in eine Glykosidlösung, enthaltend Cholesterin, Phospholipid und ein oder mehrere Glykoside (Quillaja-Bestandteile) mit hydrophoben und hydrophilen Domänen in einer Konzentration von wenigstens der kritischen Mizellbindenden Konzentration, überführt werden, wobei ein Proteinkomplex gebildet wird, welcher dann isoliert und auf gereinigt wird.
Die verwendeten Lipide sind insbesondere diejenigen, die in dem Patent des Anmelders EP 0 109 942 B1 , insbesondere auf S. 3, und in EP 0 436 620 B1 , S. 7, Zeilen 7–24 beschrieben sind. Insbesondere Sterole, so wie Cholesterin, und Phospholipide, so wie Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin, werden verwendet.
Die Lipide können ebenso lipophile Rezeptormoleküle enthalten, die an zellbindende Bestandteile, insbesondere an Antigene, binden. Solche Rezeptoren sind Glykolipide, beispielsweise das Choleratoxin-Rezeptorgangliosid GM1 und fukosyliertes Blutgruppenantigen. Die zellbindenden Bestandteile können dann als Transportmoleküle fungieren. Sie werden an den lipidhaltigen Rezeptor durch ein einfaches Mischen mit dem Komplex, der den Rezeptor enthält, gebunden. Dann kann das Iscom- oder das Matrix-Molekül mit dem Antigen vermischt werden, das an den Rezeptor bindet.
Es ist möglich, von der Matrix fortzuschreiten, die hergestellt werden kann durch Lösen von wenigstens einem Sterol in einem Lösungsmittel, Hinzufügen des Glykosids oder der Saponine und der anderen Lipide, nachdem das Lösungsmittel entfernt werden kann, wenn es mit dem Endprodukt nicht vereinbar ist. Die Matrix wird normalerweise in eine wäßrige Lösung transferiert, in welcher ihre separaten Teile nicht löslich sind. Das Lösungsmittel kann z. B. durch Gelfiltration, Ultrafiltration, Dialyse oder Elektrophorese entfernt werden. Die Matrix kann dann aus einem Überschuß an Sterol und Saponin, z. B. durch Ultrazentrifugation, durch eine Dichtegradienten oder durch Gelfiltration auf gereinigt werden. Das Lösungsmittel kann jegliches von denen sein, die in EP 0 436 629 B1 , S. 5, Zeilen 24–45 erwähnt sind. Die anderen Bestandteile und das Verfahren sind ebenso in dieser Druckschrift beschrieben.
Die Glykoside, die bei dem Verfahren verwendet werden, können diejenigen sein, die in EP 0 109 942 B1 , S. 4, letzter Absatz beschrieben sind. Es werden insbesondere Saponine verwendet, so wie Triterpensaponine, insbesondere Quillaja-Saponine aus Quillaja saponaria Molina oder Zellkulturen aus diesem Baum oder Unterbestandteile davon, insbesondere diejenigen, die in dem Europäischen Patent des Anmelders EP 0 436 620 B1 , S. 4, Zeilen 19–46 beschrieben sind. Diese können QHA, QHB, QHC oder andere Zusammensetzungen aus Quillaja-Saponinen sein. Die Glykoside sind Adjuvanzien und strukturbildende Elemente in ein Iscom und Matrix. Es ist ebenso möglich, andere Adjuvanzien oder immunmodulatorische Bestandteile als Glykoside in den Iscoms oder den Matrizen mit einzubeziehen, wie es in EP 0 436 620 B1 erwähnt ist.
Es ist ebenso möglich, das Transportmolekül und/oder das Passagier-Antigen als separate Einheit mit einem Iscom-Partikel zu vermischen, in welchem das Passagier-Antigen oder das Transport (Targeting)-Molekül integriert ist, oder mit dem Iscom- und/oder dem Matrix-Komplex, an welchen das Passagier-Antigen oder das Transportmolekül gekoppelt ist, d. h. viele Kombinationen sind möglich. Per Definition enthält ein Iscom-Partikel Antigen, und Iscom-Matrix enthält kein Antigen. Sogar andere Adjuvanzien oder immunmodulatorische Bestandteile können mit den Iscom- und/oder den Matrix-Komplexen als separate Einheiten vermischt werden, d. h. sie müssen nicht notwendigerweise mit in die Komplexe einbezogen oder an diese gekoppelt werden. Beispiele solcher Adjuvanzien sind in Cox et al., CRS, 1992 zur Verfügung gestellt. Normalerweise werden MDP, MTP und Avridin verwendet. Es ist jedoch vorteilhaft, diese Adjuvanzien in das Iscom und die Matrix mit einzubeziehen, wenn eine niedrige Dosierung von Adjuvanzien erforderlich ist. Es ist ebenso möglich, sowohl das Transportmolekül als auch das Passagier-Antigen mit dem Iscom-Komplex oder der Matrix zu vermischen. In diesen Fällen enthält der Iscom-Komplex ein weiteres Antigenmolekül.
Wenn das (die) Transportmolekül(e) oder das (die) Passagier-Antigen(e) keine hydrophoben oder amphipatischen Gruppen aufweist bzw. aufweisen, kann es bzw. können sie chemisch an das Iscom-Partikel gekoppelt werden. Beispiele solcher Kopplungsprozeduren und Kopplungsgruppen werden gefunden in EP 0 242 380 B1 , S. 9 und in EP 0 436 620 B1 , S. 6, Zeile 33 bis S. 7, Zeile 6, wo das Kopplungsverfahren beschrieben wird. Sie können Lipide sein, wie in Beispiel 7 hierunter.
Die relativen Mengen an Cholesterin, Lipiden und Antigen, die verwendet werden können, können in den oben erwähnten Patenten EP 0 109 942 B1 , EP 0 180 564 B1 und EP 0 436 620 B1 gefunden werden.
Wenn der Rezeptor ein hydrophobes Protein, so wie ein Glykoprotein, oder ein fukosyliertes Blutgruppenantigen ist, kann er in das Lipidmolekül durch hydrophobe Interaktion mit einbezogen werden. Er kann ebenso in ein Iscom als ein Proteinanteil mit einbezogen werden.
Außer dem Antigen, das an den Rezeptor anhaftet, können auch andere Antigene dazu gebracht werden, durch die Substitution von entsprechenden Gruppen an dem Rezeptor anzuhaften. Solche entsprechenden Gruppen, die an solchen anderen Antigenen angehaftet werden können, können Teile des Antigens sein, das an dem Rezeptor anhaftet. Diese Teile können mit gut bekannten Verfahren gebunden werden, beispielsweise denen, die in EP 0 436 620 B1 erwähnt sind. Durch gentechnologische Manipulation ist es ebenfalls möglich, Fusionsproteine oder Peptide zwischen einem Antigen und Teilen davon und dem rezeptorbindenden Antigen zu konstruieren. Andere Antigene als jene, die von Cholera und enterotoxischen Kolibakterien abstammen, können dadurch an den GM1-Rezeptor durch Substitution mit Teilen des CTB oder LTB gebunden werden. Beispiele davon sind in Biochemica et Biophysica Acta 1223 (1994) 285–295 "Regeneration of active receptor recognition domains on the B subunit of cholera toxin by formation of hybrids from chemically inactivated derivatives", Marc J. S. De Wolf, Wilfried S. H. Dierick angegeben. Auf diese Art und Weise können Antigene, die normalerweise nicht durch eine Schleimhaut hindurchdringen, durch die Schleimhaut geführt werden.
CTB ist dadurch ein nützlicher Träger für chemisch und genetisch hergestellte Antigene. Sanchez & Holmgren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 481–485, 1989) und Sanchez, Johansson et al. (Res. Microbiol. 141, 971–979, 1990). Mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken wurden fremde Antigene an die Amino- oder Carboxylenden der CTB-Untereinheit des Antigens gebunden, und ein Gen wurde exprimiert, das über Expressionssysteme entwickelt wurde, um das Hybridprotein herzustellen.
In den Beispielen, die beschrieben wurden, um die Erfindung zu illustrieren, wurden Iscom-Matrix, so wie lipidhaltige Partikel, und die Choleratoxin B-Untereinheit (CTB) als rezeptorspezifisch bindende Strukturen und als ein relevantes Impfstoffantigen verwendet.
Das Choleratoxin besteht aus einer A-Untereinheit, die die Toxinaktivität hervorruft, und der B-Untereinheit, die das Toxin an die Plasmamembran auf der Zelle durch ein Glykolipid (GM1) anhaftet. Um die Toxizität zu reduzieren, wird normalerweise nur die B-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) als Impfstoffantigen verwendet, um eine Immunantwort hervorzurufen. Die B-Untereinheit ist nicht toxisch und ruft eine relativ schwache Immunantwort hervor, verglichen mit CT nach lokaler (mukosaler) intranasaler oder systemischer parenteraler Immunisierung, beispielsweise subkutaner oder intramuskulärer Immunisierung, d. h. die B-Untereinheit hat eine niedrige Adjuvansaktivität, wenn sich die Aktivität auf immunmodulierende oder immunverstärkende Aktivität bezieht. CTB ist auch erhältlich als ein rekombinantes DNA-Produkt (rCTB) ( EP 368 819 ).
Es ist schwierig, Antigen kovalent an CTB oder LTB mit hohen physikalischen und ökonomischen Ausbeuten zu koppeln, da nur eine limitierte Anzahl von Aminogruppen und/oder Carboxygruppen aktiviert werden kann, ohne dabei ernsthaft die antigene Aktivität von CTB und LTB zu reduzieren oder deren Kapazität als Trägermoleküle in den Schleimhäuten zu schaden, und sich selbst und begleitende Antigene auf lymphatische Gewebe und Organe und Zellen zu richten, um Immunantwort hervorzurufen. Sogar wenn eine ausreichende Anzahl von Gruppen für die chemische Konjugation von Antigen(en) auf einem Trägermolekül erhältlich ist, ist es gut bekannt, daß es schwierig ist, gute und ökonomische Ausbeuten aus solchen Konstruktionen zu erhalten (Lovgren et al., J. Immunol. Methods 173, 237–243).
Die Verwendung von Transportproteinen in ein Iscoms hat verschiedene Vorteile. Dies ist insbesondere offensichtlich für die Konstruktion von oralen, nasalen oder rektalen Impfstoffen gegen Infektionen. Solche Impfstoffe können eine Trägerkonstruktion mit Antigen und Adjuvansbestandteil(en), angereichert beispielsweise mit CTB oder LTB, enthalten, um die Konstruktion in lymphatischen Organen und Zellen im Darmtrakt zu lokalisieren und um die Immunantwort auf lymphatische Gewebe in anderen Schleimhäuten über GALT, MALT, HALT zu richten (Darm-, mukosal bzw. nasalfaryngeal assoziiertes lymphatisches Gewebe), beispielsweise nach Verabreichung in den Atemwegen oder durch direkte lokale mukosale Anwendung.
Das Iscom ist größer als Transportmoleküle wie CTB oder LT, und daher ist Platz, um ausgewählte Passagier- Antigene und ausgewählte Adjuvansbestandteile zu konjugieren oder sie auf irgendeine andere Art und Weise, zum Beispiel durch hydrophobes oder elektrostatisches Binden, mit einzubeziehen.
Bei der Produktion der Matrix ist das Gewichtsverhältnis von Sterol, zweitem Lipid und Glykosid 0,2–10 : 0,2–10 : 1–100, vorzugsweise 1 : 1 : 5. Wenn ein lipidhaltiger Rezeptor verwendet wird, kann er das (die) andere(n) Lipid(e) vollständig ersetzen, so daß das Verhältnis von Sterol, lipidhaltigem Rezeptor und Glykosid wie oben sein wird. Es ist ebenfalls möglich, sowohl den lipidhaltigen Rezeptor und ein zweites Lipid, vorzugsweise Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin und den Rezeptor, so zu verwenden, daß das Verhältnis wird: Sterol : zweites Lipid : Rezeptor : Glykosid = 0,2–10 : 0,2–10 : 0,1–1 : 5–10, vorzugsweise 1 : 1 : 0,25 : 5. Das Verhältnis der Rezeptormoleküle hängt von der Menge der Target- oder Antigenmoleküle ab, die man hinzuzufügen wünscht.
Die Bestandteile können im Prinzip in jedem möglichen Verhältnis mit einbezogen werden. Es wurde gezeigt, daß das fertiggestellte Produkt das bevorzugte Gewichtsverhältnis zwischen den beinhalteten Bestandteilen erhält und daß der Überschuß nicht mit eintritt. Wenn eine große Menge des zweiten Lipids, so wie Phospholipid, verwendet wird, wird der Komplex fettig und fragil und fällt leicht auseinander. Zu wenig des zweiten Lipids macht es schwierig, daß der Komplex gebildet wird, und Jahresring-geformte Untereinheiten werden gebildet. Dies kann durch Elektronenmikroskopie bestimmt werden.
Ob ein Iscom oder eine Matrix gebildet wurde, kann bestätigt werden durch Studieren des Produkts durch Elektronenmikroskopie. Eine typische Matrix oder ein typisches Iscom hat eine charakteristisch offene sphärische Struktur, enthaltend kreisförmige Untereinheiten oder Teile der sphärischen Struktur, wie in 3 in EP 0 109 942 B1 gesehen werden kann. Die Iscoms haben eine niedrigere Sedimentationskonstante als die entsprechenden Mizellen und oft eine höhere Sedimentationskonstante als die entsprechenden monomeren Formen des Proteins oder Peptids. Matrix und Iscom haben eine Sedimentationskonstante von ungefähr 20 S.
Der Vorteil des Verwendens von lipidhaltigen Rezeptoren zum Binden von zielsuchenden oder Impfstoffantigenen ist, daß es möglich ist, eine Matrix aus Glykosid, Sterol, möglicherweise einem zweiten Lipid und einem lipidhaltigen Rezeptor herzustellen und dann die fertige Matrix mit dem Transport (Targeting)-Molekül einfach zu vermischen. Das Verfahren ist billiger und einfacher, als wenn man ein fertig hergestelltes Iscom, enthaltend die obigen Inhaltsstoffe plus ein Transportantigen, herstellen müßte oder wenn man das Antigen mit der fertig hergestellten Matrix unter Verwendung von chemischen Konjugationsverfahren verbinden müßte.
Wenn das Antigen in das Iscom integriert oder chemisch an die Matrix gekoppelt ist, werden Aminogruppen oder Carboxylgruppen, die antigene Determinanten darstellen können, modifiziert. Die antigenen Determinanten werden denaturiert, wenn das Antigen zur Integration in das Iscom aktiviert wird oder wenn es chemisch an die Matrix oder das Iscom gekoppelt wird (wenn zwei Antigene verwendet werden, enthält das Iscom bereits wenigstens ein Antigen). Dies bedeutet, daß die aktive Antigenmenge bemerkenswert reduziert wird. Darüber hinaus ist die Rückgewinnung niedrig, verglichen damit, wenn dem Antigen erlaubt wird, an einen lipidhaltigen Rezeptor zu binden. Dies kann beispielsweise bedeuten, daß bei dem Herstellungsverfahren ungefähr fünfmal mehr Antigen erforderlich ist, verglichen damit, wenn ein lipidhaltiger Rezeptor verwendet wird. Wenn ein lipidhaltiger Rezeptor verwendet wird, wird das Verfahren bemerkenswert billiger. Parallel zur reduzierten Miteinbeziehung steigt die Menge des Glykosid- und Adjuvansgehalts pro Einheit des Antigens an, was teilweise die niedrigeren Mengen des Antigens bezüglich der erreichten Immunantwort ausgleicht, aber gleichzeitig kann die Toxizität aufgrund des erhöhten Prozentsatzes des Adjuvans ansteigen. Andererseits wird die Immunantwort im Prinzip stärker, wenn ein Rezeptorbinden des Antigens verwendet wird, während die ursprünglichen konformationalen antigenen Determinanten beibehalten werden.
Ein weiterer Vorteil zeigt sich, wenn es wünschenswert ist, ein Transport (Targeting)-Molekül und ein Passagier-Antigen an das Iscom oder an die Matrix anzubringen. Wenn das Iscom oder die Matrix mit lipidhaltigen Rezeptoren hergestellt wurde, gibt es mehr Platz zum Integrieren des Passagier-Antigens in das Iscom oder dafür, es chemisch an die Matrix zu koppeln. Bei Verwendung von einem lipidhaltigem Rezeptor wird das Binden des Passagier-Antigens nicht beeinflußt. Es wird einfacher, optimale Bedingungen zu erzielen. Die Kontrolle der Menge des Passagier-Antigens oder der Transport (Targeting)-Moleküle, die in das Iscom integriert oder chemisch mit dem Iscom oder der Matrix verbunden wird, wird verbessert. Wenn das Iscom sowohl mit einem Transport (Targeting)-Molekül als auch einem Antigen unter, Verwendung derselben Verfahren hergestellt wird, können sie für die Bindebereiche in Wettbewerb stehen, und es nicht möglich, die Einbeziehung der zwei Antigene vollständig zu kontrollieren.
Insbesondere bezüglich des Cholerantigens CTB, welches eine fünffach bindende Untereinheit aufweist, ist es möglich, bis zu 13mal das Gewicht des GM1-Rezeptors zu binden. Es sind immer noch Bindeorte im CTB unbesetzt, welche an Zellrezeptoren in der Mukosa binden und als Transport (Targeting)-Moleküle dienen können.
Das Gewichtsverhältnis von Sterol, zweitem Lipid, Protein und Glykosid beträgt 0,2–10 : 0,2–10 : 0,2–10 : 1–100, vorzugsweise 1 : 1 : 1 : 5–10, um mit subkutaner Verabreichung verwendet zu werden. Mit oraler oder intranasaler Verabreichung kann die Glykosidmenge größer sein als das obige Verhältnis, nämlich 1–200, vorzugsweise 5–20.
Diese Mengen sind sowohl anwendbar, wenn zunächst die Matrix hergestellt wird, als auch dann, wenn die Antigene chemisch gekoppelt werden und wenn die Iscom-Partikel hergestellt werden.
Das Verfahren zum Herstellen von CTB (oder LTB)-Iscoms beinhaltet das Mischen von Quil A oder Quil A-Bestandteilen mit einer Lipidmischung, enthaltend Cholesterin, Phosphatidylcholin und Gal 1–3, Gal NAcb 1–4 (Neu Aca2–3), Gal (GM1), welches ein spezifischer Rezeptor für das Choleratoxin (CT) und das hitzelabile Toxin von enterotoxischem E. coli (LT) sowie deren Unterheiten CTB und LTB ist. Phosphatidylcholin (PC) kann vollständig oder teilweise durch Phosphatidylethanolamin (PE) ersetzt werden, wobei die Aminogruppe am PE eine Kopplungsgruppe für Antigen oder andere gewünschte Bestandteile darstellt. Im Gegensatz zu Cholesterin sind PC und PE nicht wesentlich für die Iscom-Zusammensetzung, sondern können mit anderen "weichen" Lipiden ersetzt werden.
Ein Iscom oder eine Iscom-Matrix kann in Zusammensetzungen hergestellt werden, enthaltend ein Lösungsmittel, so wie Wasser oder physiologische Salinlösung. Als Lösungsmittel kann die Zusammensetzung ebenso das Detergens beinhalten, mit dem der Komplex hergestellt wird, wenn es für die Human- oder Veterinärmedizin akzeptabel ist. Die Zusammensetzungen können ebenso andere Additive und Füllstoffe enthalten, die in der Human- oer Veterinärmedizin akzeptabel sind.
Solch eine Zusammensetzung kann beispielsweise einen Iscom-Komplex und einen Füllstoff, so wie eine physiologische Salinlösung, enthalten. Sie kann ebenso aus Matrizen, gemischt mit Antigen, zusammengesetzt sein. Der Impfstoff kann in verabreichbaren Formen erhältlich gemacht werden, die eine Einheit mit einer Matrix in einer Zusammensetzung, enthaltend einen Füllstoff, und eine Einheit mit dem Antigen in einer Zusammensetzung, enthaltend einen Füllstoff, enthalten. Beide dieser Zusammensetzungen sind dann dafür vorgesehen, bei der gleichen Gelegenheit verabreicht zu werden.
Die Menge an ein Iscom, Matrix und Antigen wird so ausgewählt, daß sie pharmazeutisch effektiv sein wird, und kann durch den Fachmann entschieden werden. Für Menschen sollten wenigstens 1 μg, vorzugsweise 1–200 μg der Antigene verwendet werden, wobei die ökonomische Meinung das obere Limit setzt. Für Tiere sollte die Dosis wenigstens 0,1 μg der Antigene betragen, abhängig von dem Antigen und der Größe des Individuums.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt, daß freies rCTB (rekombinantes CTB), analysiert in einem 10–50%igen Sucrosegradienten, nach der Ultrazentrifuation am oberen Ende des Gradienten angeordnet ist, d. h. Fraktion 12–14. Vgl. 2 und 3.
2 zeigt Iscoms mit rCTB in einem Diagramm, wo Fraktionen in einem 10–50%igen Sucrosegradienten nach der Zentrifugation gegen 1) die Absorbanz bei 595 nm zur Bestimmung der rCTB-Konzentration unter Verwendung des Bradford-Verfahrens und 2) CPM zur Analyse von ³H-Cholesterin, einem Iscom-Matrix-Bestandteil, aufgetragen sind. Iscom-Matrix mit rCTB und GM1 in einem Gewichtsverhältnis von 13 : 1 wird hergestellt gemäß Beispiel 1 und wird dann ultrazentrifugiert. Iscoms mit rCTB werden in den Fraktionen 6–9 gefunden. Annähernd alle rCTB werden in ein Iscoms gefunden.
3 zeigt ein Diagramm derselben Art wie 2. Beim Herstellen der Iscoms bei diesem Versuch war die rCTB-Konzentration 100mal größer als die GM1-Konzentration w/w. Nicht mit einbezogene rCTB werden am oberen Bradford-Ende gefunden, d. h. weiter oben in dem Gradienten in den Fraktionen 10–12.
4A und 4B sind Balkendiagramme, die den ELISA-Titer im Serum von Mäusen nach der Immunisierung mit freiem rCTB und rCTB, das in eine Iscom-Matrix mit einbezogen ist, zeigen.
Die ausgefüllten Balken betreffen die subkutane Immunisierung, während die schraffierten Balken die intranasale Immunisierung betreffen. 4A zeigt Serumantikörpertiter 5 Wochen nach der ersten Immunisierung, während 4B den Titer 6 Wochen nach der zweiten Immunisierung zeigt. Das Intervall zwischen den Immunisierungen betrug 6 Wochen.
5A und 5B sind Balkendiagramme derselben Art wie 4A und 4B. Mäuse wurden subkutan mit 2 μg rCTB (ausgefüllte Balken) oder intranasal mit 4 μg rCTB (schraffierte Balken) immunisiert. 5A zeigt Serumantikörpertiter 5 Wochen nach der ersten Immunisierung, während 5B den Titer 6 Wochen nach der zweiten Immunisierung zeigt. Das Intervall zwischen den Immunisierungen betrug 6 Wochen.
6 zeigt die Antikörpertiter nach unterschiedlichen Immunisierungen. rCTB gemischt mit Matrix und rCTB gebunden an ein Iscom rufen nach subkutaner Immunisierung Serumantikörper der Unterklasse IgG_2a und IgG₁ hervor, nicht wie rCTB, welches fast nur IgG₁ hervorruft. 6A zeigt das Ergebnis 14 Tage nach der ersten Boost-Immunisierung am Tag 42, während 6B die Werte 4 Tage nach der zweiten Boost-Immunisierung am Tag 110 zeigt.
7 zeigt das Ergebnis nach subkutaner Immunisierung von Mäusen mit rCTB gebunden an die Matrix, rCTB gemischt mit Matrix und nur rCTB. Die Serumantikörperantwort 14 Tage nach der ersten Immunisierung und 14 Tage nach der zweiten Immunisierung ist gezeigt. Das Intervall zwischen den Immunisierungen betrug 42 Tage.
8 zeigt die Memory-Zellantwort nach dem zweiten Boost am Tag 180 für dieselbe Immunisierung wie in 6. Vier Tage nach der Boost-Dosis wurden Serumproben für die Antikörperbestimmung genommen.
Die Erfindung wird nun genauer beschrieben werden unter Bezugnahme auf die folgenden Verfahrensbeispiele.
BEISPIEL 1
Miteinbeziehung von GM1 und rCTB in ein Iscoms
Das Choleratoxin (CT) ist ein wirksames Adjuvans, insbesondere bei der lokalen mukosalen Immunisierung. Sogar die B-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) wird als ein Adjuvans aufgrund dessen zielsuchender Qualitäten bei der lokalen Immunisierung eingeschätzt, aber diese Aktivität ist daher auf eine führende Funktion für das Antigen zu den lymphatischen Zellen der Därme beschränkt. Wenn CTB an die Iscom-Matrix gebunden ist oder in ein Iscom mit einbezogen ist, wird eine Formulierung, die die Immunantwort verstärkt, erhalten und ist wirksam bei lokaler und bei parenteraler Immunisierung. Diese Wirkung ist interessant in Verbindung mit Impfstoffen gegen Cholera und beim Auswählen einer Adjuvans für die anderen Antigene für lokale mukosale oder parenterale Immunisierung. Das rekombinante Choleratoxin, Untereinheit B (rCTB) ( EP 0 368 819 ) wird mit unterschiedlichen Präparationen vermischt, mit:
MEGA-10 (Bachem P1000 Decanoyl-n-methylglucamid), 20 Gew.-% in H₂O;
Phosphatidylcholin (PC) (Sigma P 5763), 10 mg/ml, gelöst in 20 Gew.-% MEGA-10 in H₂O;
Cholesterin (C) (Sigma C 8667), 1q0 mg/ml, gelöst in 20 Gew.-% MEGA-10 in H₂O);
GM1 (Sigma G7641), 10 mg/ml, gelöst in 20 Gew.-% MGA-10 in H₂O;
Phosphatidylethanolamin (PE) (Sigma P2768), 10 mg/ml, gelöst in 20 Gew.-% MEGA-10 in H₂O;
Quil A (Spikosid, Iscotec, Luleå), 100 mg/ml in H₂O;
rCTB, 5 mg/ml in einer Pufferlösung mit 0,05 M TRIS (pH 7,5), 0,2 M NaCl, 0,0001 M Na₂ EDTA, 0,003 NaN₃.
Phosphatidylcholin wurde mit Cholesterin plus Spurenmengen von radioaktivem Cholesterin (³H-Cholesterin Amersham) im Verhältnis 1 : 1 (100 mg von jedem Lipid in 10 ml 20%igem MEGA-10) und mit unterschiedlichen Mengen von GM1 von 1 μg bis 7,5 μg (1 μg, 1,7 μg, 2,5 μg, 4 μg, 5 μg, 7,5 μg) in 1,0 ml PBS (phosphatgepufferte physiologische NaCl-Lösung), pH 7,2 gemischt.
In 1 ml der sechs unterschiedlichen Varianten der Phosphatidylcholin/Cholesterin-GM1-Lösung wurde Quil A hinzugefügt bis zu einer Endkonzentration von 0,2%. Die Mischungen wurden in einem Sonorex TK 52 2 × 15 min sonifiziert und bei Raumtemperatur (RT) 1 h lang stehen gelassen. Dann wurden die Mischungen gegen PBS dialysiert, zunächst für 24 h bei Raumtemperatur und dann für 24 h in einem Kühlraum (+4°C). Daß eine Matrix gebildet wurde, konnte durch Elektronenmikroskopie gesehen werden. In jede der sechs unterschiedlichen Matrix-Varianten, welche sich bezüglich des GM1-Gehalts unterschieden, wurden 100 μg rCTB hinzugefügt. Die Mischungen wurden 2 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Matrix-Partikel mit damit verbundenem rCTB, d. h. Iscom, wurden durch Zentrifugation in einem 10–15%igen Sucrosegradienten in PBS 18 h lang in einem TST 41.14-Rotor (Kontron) bei 39.000 rpm bei 10°C aufgereinigt. Der Gradient wurde in 16 bis 18 Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden mit Bezugnahme auf rCTB unter Verwendung des Proteinbestimmungsverfahrens gemäß Bradford (Bradford, Analyt. Biochem., 72, 1976, 248–254) analysiert und kolorimetrisch bei 595 nm bestimmt und in Bezugnahme auf Lipide durch Nachweis von ³H-Cholesterin und Elektronenmikroskopie, um die Gegenwart von möglichen Matrix- oder Iscom-Strukturen zu studieren. 1 zeigt freie Fraktionen 12–14, 2 und 3 zeigen die Mengen an Lipid (
) und rCTB (☐) in den Fraktionen, wenn das Verhältnis von rCTB : GM1 13 : 1 (2) ist, wobei das Iscom mit rCTB in den Fraktionen 6–9 existiert, oder 100 : 1 (3), wobei nicht mit einbezogenes rCTB weiter oben in dem Gradienten, d. h. den Fraktionen 10–12, liegt.
Ergebnis
Die größte relative Menge (Gewicht) an rCTB, das vollständig in die GM1-Matrix mit einbezogen wurde, d. h. das Iscom, war 13mal größer als die Menge an GM1 (2). In verschiedenen anderen Experimenten haben wir dasselbe Verhältnis gesehen. Wenn eine größere Menge an rCTB hinzugefügt wird, wird der Überschuß an rCTB weiter oben im Gradienten nicht-verbunden mit ³H-Cholesterin gefunden, was zeigt, daß dieses rCTB nicht mit einbezogen wird. Wenn eine kleinere Menge an rCTB hinzugefügt wird, bilden sich Aggregate durch Quervernetzen, da rCTB fünf mögliche Bindeorte für GM1 hat. Matrix mit damit verbundenem rCTB, d. h. Iscom, wird in den Fraktionen 6–9 2) gefunden. Ähnliche Ergebnisse werden erzielt mit Phosphatidylethanolamin in der Matrix oder dem Iscom anstelle von Phosphatidylcholin (Ergebnisse nicht dargestellt).
Schlußfolgerung
rCTB kann effektiv an eine Matrix gebunden werden, die das Glykolipid GM1 enthält. Eine Hinzufügung einer entsprechenden Menge GM1 während der Matrix-Herstellung impliziert ein effizientes Herstellungsverfahren.
BEISPIEL 2
Bei diesem Beispiel ist gezeigt, daß rCTB, das in ein Iscom mit einbezogen ist, eine höhere Antikörperantwort hervorruft als freies rCTB.
Eine GM1-Matrix wurde auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Phosphatidylcholin/Cholesterin und GM1 (PC/C/GM1 und Quil A) in dem Verhältnis von 1,1 : 0,25 : 5 wurde mit MEGA-10 (Endkonzentration: 2%) gemischt. Die Mischung wurde auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 1 dialysiert. rCTB wurde in einer Menge (Gewicht) hinzugefügt, die 13mal größer war als die Menge an GM1. Auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 1 wurde der gebildete Komplex mit EM und durch Sucrosegradientenzentrifugation analysiert. Die Gradientenfraktionen wurden wie in Beispiel 1 bezüglich Cholesterin und Protein (rCTB) analysiert. Iscoms mit mit einbezogenem rCTB wurden danach für die Verwendung bei Immunisierungsexperimenten sichergestellt.

Sechs Gruppen von jeweils acht Mäusen wurden subkutan mit 2 g rCTB oder mit 4 g rCTB intranasal an zwei Gelegenheiten innerhalb eines sechswöchigen Intervalls (siehe 4A und 4B) immunisiert. rCTB war entweder in freier Form, d. h. vermischt mit Matrix ohne GM1, oder gebunden an die Matrix über GM1 vorhanden. Zwei Varianten der GM1-Matrix gemäß dem obigen wurden verwendet in einem Gewichtsverhältnis von 13 : 1 oder 25 : 1 (rCTB : GM1, abhängig vom Gewicht), d. h. gesättigt oder übermäßig gesättigt bezüglich des Verhältnisses rCTB/GM1.

Gruppe A:	Freies rCTB, 2 μg rCTB subkutan, 0 μg Quil A
Gruppe B:	Freies rCTB, 4 μg rCTB intranasal, 0 μg Quil A
Gruppe C:	Iscom, 2 μg rCTB (13 × GM1) subkutan, 3 μg Quil A
Gruppe D:	Iscom, 4 μg rCTB (13 × GM1) intranasal, 6,1 μg Quil A
Gruppe E:	Iscom, 2 μg rCTB (25 × GM1) intranasal, 1, 6 μg Quil A
Gruppe F:	Iscom, 4 μg rCTB (25 × GM1) intranasal, 3,2 μg Quil A

Die Antikörpertiter im Serum wurden unter Verwendung von ELISA zu unterschiedlichen Zeiten gemäß 4A und 4B gemessen.
Bei dem ELISA-Test wurden die ELISA-Platten (Nunc, Roskilde, Dänemark) mit 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,5, enthaltend 2 μg rCTB/ml inkubiert. Die Serumproben aus den Mäusen wurden in Serien verdünnt. Die ELISA-Platten wurden mit den verdünnten Serumlösungen behandelt. Gebundene Maus-Antikörper wurden mit Peroxidasekonkugiertem Kaninchen-anti-Maus-Konjugat (Dakopatts) nachgewiesen und als ein Substrat wurde TMB, H₂O₂ (EC Diagostics, Uppsala) verwendet.
Ergebnis
Die Ergebnisse sind in 4A und 4B ausgeführt, welche Serumantikörpertiter zeigen, die durch ELISA 5 Wochen nach der ersten subkutanen und intranasalen Immunisierung mit rCTB (A) und 6 Wochen nach der zweiten Immunisierung (B) gemessen wurden. Das Intervall zwischen den Immunisierungen betrug 6 Wochen. rCTB, mit einbezogen in ein Iscom im Verhältnis von 13 : 1 (rCTB : GM1 (Gewicht)), rief nach zwei subkutanen Immunisierungen mit 2 μg rCTB einen Titer von 87.000 hervor. Iscoms mit einem rCTB : GM1-Verhältnis von 25 : 1 rief Titer von 50.000 hervor. Entsprechende Serumantikörpertiter bei zwei subkutanen Immunisierungen mit freiem rCTB waren 8600.
Nach zwei intranasalen Immunisierungen mit rCTB im Iscom (13 : 1) (rCTB : GM1) wurden Serumtiter von 21.000 erhalten, während 25 : 1 (rCTB : GM1) Serumantikörpertiter von 33.000 hervorriefen. Freies rCTB rief nach zwei intranasalen Immunisierungen ELISA-Titer in Serum von 19.000 hervor.
Schlußfolgerung
rCTB im Iscom ist nach subkutaner Immunisierung immunogener als freies rCTB, aber es gab keinen signifikanten Unterschied nach intranasaler Immunisierung.
BEISPIEL 3
Bei diesem Experiment wurde eine Matrix als Adjuvans mit nicht mit einbezogenem Antigen bei subkutaner und intranasaler Immunisierung verwendet.
Matrix ohne GM1 wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit dem einzigen Unterschied, daß GM1 ausgeschlossen wurde. Die Gewichtsverhältnisse von Phosphatidylcholin/Cholesterin/Quillaja betrugen 1 : 1 : 5. Lipide wurden in 20% MEGA gelöst. Dialyse wurde wie in Beispiel 1 ausgeführt. Die Matrix wurde wie in Beispiel 1 analysiert und charakterisiert unter Verwendung von Elektronenmikroskopie und analytischer Sucrosegradientenzentrifugation. Matrix mit GM1 wurde wie in Beispiel 1 hergestellt und rCTB wurde im Verhältnis von 13 : 1 (rCTB : GM1) mit einbezogen. Wenn GM1 von der Matrix ausgeschlossen wurde, trat kein Binden des rCTB an die Matrix auf.

Acht Mäuse pro Gruppe wurden subkutan mit 2 μg rCTB in ein Iscoms oder gemischt mit Matrix als Adjuvans oder intranasal mit 4 μg rCTB in ein Iscoms oder gemischt mit Matrix als Adjuvans immunisiert. Zwei Immunisierungen wurden innerhalb eines sechswöchigen Intervalls ausgeführt.

Gruppe C:	Iscom, 2 μg rCTB, subkutan, 3 μg Quil A
Gruppe D:	Iscom, 4 μg rCTB, intranasal, 6,1 μg Quil A
Gruppe G:	Matrix, gemischt mit 2 μg rCTB subkutan, 3,0 μg Quil A
Gruppe H:	Matrix, gemischt mit 4 μg rCTB intranasal, 6,1 μg Quil A

Die Antikörpertiter im Serum wurden gemessen unter Verwendung von ELISA, und die Titer sind als die Verdünnung angegeben, die die Absorbtion von 1,0 ergibt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 5 zusammengefaßt, welche die Serumantikörperantwort nach der Immunisierung mit 2 μg rCTB verabreicht subkutan oder 4 μg rCTB verabreicht intranasal, gemessen im ELISA 5 Wochen nach der ersten Immunisierung (A) und 6 Wochen nach der zweiten Immunisierung (B), zeigt. Das Intervall zwischen den Immunisierungen betrug 6 Wochen. Nach zwei subkutanen Immunisierungen mit rCTB gemischt mit Matrix als Adjuvans wurde ein durchschnittlicher Titer von 91.000 induziert, verglichen mit 87.000 für rCTB in ein Iscom-Form. Nach zwei intranasaten Immunisierungen wurde 54.000 induziert für rCTB gemischt mit Matrix, verglichen mit 21.000 für rCTB im Iscom.
Schlußfolgerung
Nach subkutaner Immunisierung, waren die Serumantikörpertiter, die durch rCTB in ein Iscom-Form induziert wurden, fast so hoch wie die, welche durch rCTB gemischt mit Matrix als Adjuvans induziert wurden. Nach intranasaler Immunisierung wurden doppelt so hohe Titer nach der Immunisierung mit rCTB gemischt mit Matrix induziert als mit rCTB in ein Iscom-Form. Es ist interessant zu bemerken, daß Matrix in freier Form einen so starken Adjuvanseffekt auf die Antikörperantwort hat, wie die Iscom-Form des rCTB. In die Matrix-Formel wurde zweimal so viel Quillaja mit einbezogen.
Vor allem ist es überraschend, daß Matrix in freier Form einen Adjuvanseffekt nach lokaler mukosaler Verabreichung mit rCTB aufweist, welches selbst einen Adjuvanseffekt in der Targeting-Form hat, wenn durch Schleimhäute immunisiert wird.
BEISPIEL 4
Eine der Aufgaben für ein Adjuvans ist es, eine starke Immunantwort hervorzurufen, die gemessen werden kann als eine Antikörperantwort oder als eine zellvermittelte Immunantwort. Eine andere seiner Aufgaben ist es, die gewünschte Art von Immunantwort hervorzurufen, die z. B. in IgG-Unterklassen ausgelesen werden kann, welche die Antwort der T-Helferzellen reflektieren, die durch Zytokinproduktion identifiziert ist. Bei diesem Experiment ist gezeigt, daß rCTB in freier Form ohne Adjuvans eine Serumantikörperantwort hervorrufen, die auf die Unterklasse IgG fokussiert ist. Durch Mischen von rCTB mit Matrix oder durch Miteinbeziehen von rCTB in ein Iscom werden auch Serumantikörper gegen rCTB in der Unterklasse IgG_2a hervorgerufen, welche mit der TH1-Antwort in Verbindung steht.
Acht Mäuse pro Gruppe (drei Gruppen) wurden zweimal subkutan in einem sechswöchigen Intervall mit 2 μg rCTB ohne Adjuvans oder mit 2 μg rCTB gemischt mit Matrix oder mit 2 μg rCTB-Iscom immunisiert.
Die Serumantikörperantworten wurden unter Verwendung von ELISA gemäß einem Zeitplan gemessen, der in 6 ersichtlich ist. Die Verteilung der Serumantikörper in Klassen und Unterklassen wurde unter Verwendung von ELISA durch Verwendung von Klassen- und Unterklassen- spezifischen Antiseren (Dakopatts, Dänemark) analysiert.
Ergebnisse
Freies rCTB ohne Adjuvans hat hauptsächlich eine IgG₁-Antwort gegen rCTB hervorgerufen, während keine Antikörper in der Unterklasse IgG_2a gefunden werden konnten. Sowohl rCTB-Iscom als auch rCTB gemischt mit Matrix riefen sowohl IgG₁- als auch IgG_2a-Antikörper gegen rCTB (6A) 14 Tage nach der ersten Boost-Immunisierung, am Tag 42, hervor. Sogar nach einem zweiten Boost am Tag 110 rief freies rCTB ohne Adjuvans keine IgG₂-Antwort hervor, während Iscom und rCTB gemischt mit Matrix 4 Tage nach der zweiten Boost-Immunisierung eine klare IgG₂-Antwort ergaben (6B).
Schlußfolgerung
Es gibt Qualitätsunterschiede bezüglich der Serumantikörperantwort im rCTB in freier Form ohne Adjuvans, verglichen mit rCTB zur Verfügung gestellt mit Matrix als Adjuvans oder gebunden an ein Iscom. Sowohl Matrix als auch Iscom mit rCTB rufen Antikörper gegen rCTB der Unterklasse IgG_2a sowie Ige₁ hervor, nicht so wie freies rCTB, das nur in der Lage ist, Ige₁-Antikörper hervorzurufen.
BEISPIEL 5
Die Wirkung von Impfstoffen gegen Infektionen hängt nicht nur von dem direkten Effekt ab, den die hervorgerufene Immunantwort hat, sondern auch von den induzierten Memory-Zellen, die in Verbindung mit Infektionen rekrutiert werden. Die Funktion der Memory-Zellen ist insbesondere eine lange Zeit nach der Impfung wichtig, wenn die hergerufene Immunität niedrig geworden ist. Eine starke Antwort der Memory-Zellen, die schnell zum Zeitpunkt der Infektion rekrutiert werden kann, ist daher wünschenswert.
Acht Mäuse pro Gruppe (3 Gruppen) wurden zweimal subkutan in einem achtwöchigen Intervall mit 2 μg rCTB ohne Adjuvans, mit rCTB einbezogen in ein Iscom oder mit rCTB gemischt mit Matrix immunisiert. Die Antikörperantwort wurde unter Verwendung von ELISA gemessen, wobei jede Gruppe in zwei Untergruppen von jeweils vier Mäusen unterteilt wurde. Eine zweite Boost-Immunisierung wurde am Tag 180 ausgeführt und Bluttests für das Serum wurden 4 Tage später entnommen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse können aus 7 ersehen werden. Nach der ersten Immunisierung (Tag 14) wurden die stärksten Immunantworten durch rCRTB gemischt mit Matrix (17.000) und rCTB-Iscom (9000) hervorgerufen. rCTB ohne Adjuvans induzierte Titer von etwa 1000. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung (das Intervall zwischen den Immunisierungen betrug 42 Tage) hatten die Mäuse in allen Gruppen ihre Serumantikörpertiter bemerkenswert erhöht. Die höchsten Titer wurden in der Matrix-Gruppe gefunden (ungefähr 57.000) und in der Iscom-Gruppe (35.000), während die Titer für die Gruppe, die mit rCTB ohne Adjuvans geimpft wurde, ungefähr 6000 betrugen.
Nach der dritten Immunisierung (d. h. dem zweiten Boost) am Tag 180, d. h. 140 Tage nach der zweiten Immunisierung, hatten die Mäuse, die mit freiem rCTB immunisiert wurden, Antikörpertiter von ungefähr 8000, d. h. ungefähr dieselben Titer wie nach der zweiten Immunisierung. Mäuse, die mit Iscom oder mit rCTB gemischt mit Matrix immunisiert wurden, antworteten nach der dritten Immunisierung am Tag 180 mit einem erhöhtem Serumantikörpertiter für Matrix (ungefähr 90.000) und für Iscom (ungefähr 70.000) (8). Serum wurde 4 Tage nach der dritten Immunisierung für Antikörpertests entnommen.
Schlußfolgerung
Der starke Antikörperanstieg im Serum bei Mäusen, die eine lange Zeit nach der früheren Immunisierung (140 Tage) mit rCTB-Iscom oder mit rCTB gemischt mit Matrix erneut immunisiert wurden, zeigt, daß eine starke Memory-Antwort durch die vorhergehende Immunisierung hervorgerufen wurde. rCTB ohne Adjuvans jedoch zeigte keinerlei Immunantwort, die nach einer langen Zeit verstärkt werden kann.
BEISPIEL 6
rCTB wurde vorinkubiert bei 20°C für 1 h mit GM1-enthaltender Matrix in Verhältnissen, die vorher so getestet wurden, daß Präparation (A) die Matrix mit rCTB sättigen sollte, und so, daß Präparation (B) eine Übersättigung ergeben würde, so daß ungefähr die Hälfte der Menge an rCTB nicht an die Matrix binden konnte. Nach der Inkubation wurde die Matrix von nicht-gebundenem rCTB durch Zentrifugation gereinigt.
Die Präparationen A und B wurden dann für perorale, intranasale oder intraperitoneale Immunisierung von 8–10 Wochen alten C57/B1-Mäusen verwendet. Gruppen von 3 Mäusen in jeder Gruppe wurden 3 Dosen mit einem zweiwöchigen Intervall zwischen den Dosen verabreicht. Jede Dosis enthielt 17 μg rCTB und 26 μg Quillaja für perorale Immunisierung, die Hälfte der Dosis für intranasale und ein Sechstel der Doses für intraperitoneale Immunisierung.
Drei weiteren Gruppen von Mäusen wurden perorale, intranasale bzw. intraperitoneale Immunisierungen verabreicht mit entsprechenden Mengen der Matrix (nicht enthaltend GM1) vermischt mit rCTB.
Eine Woche nach der dritten Dosis wurden die Tiere getötet, ausgeblutet und mit PBS-Heparin künstlich durchblutet, wonach Lungengewebe aus beiden Lungen entnommen und zerdrückt wurde, und Teile des Darmkanals wurden aus dem oberen, mittleren und unteren Bereich des Dünndarms entnommen und zerdrückt. Das Gewebe wurde bei –30°C gefroren und dann aufgetaut und in PBS-1% Saponin (1 ml pro 1 mg Gewebe) suspendiert und in der Kälte (+4 bis 10°C) über Nacht extrahiert. Der Gewebeextrakt und die Seren wurden dann für spezifische Antikörper gegen CTB unter Verwendung von GM1-ELISA getitert.
Die Ergebnisse können in Tabelle 1 gesehen werden. Es ist offensichtlich, daß alle der Präparationen A–C eine hohe Serumantikörperantwort nach intraperitonealer und intranasaler Immunisierung ergeben und daß intranasale Immunisierung mit (A) und (B) gute lokale IgA-Antikörpertiter im Gewebeextrakt aus Zellen der Atemwege stimulieren.
TABELLE 1 ANTIKÖRPERTITER BEI MÄUSEN IM SERUM UND IM GEWEBEEXTRAKT NACH INTRAPERITONEALER (IP), INTRANASALER (IN) ODER ORALER IMMUNISIERUNG MIT B-UNTEREINHEIT (rCTB) AUS DEM CHOLERATOXIN in einem Iscom
3 Immunisierungen: 3 Mäuse pro Gruppe, mittlere Titer sind gezeigt.
Die Mäuse wurden dreimal immunisiert mit:
A = PC/C + GM1 + rCTB 13 × (gesättigt)
B = PC/C – GM1 + rCTB 25 × (übersättigt)
C = PC/C – GM1 + rCTB (PC/C und rCTB getrennt)
D = rCTB
E = rCTB + Choleratoxin
Verdünnung ausgedrückt als 1/x ist < 5
PO = perorale Verabreichung 20 μl (17 μg CTB & QA 26 μg)
IP = intraperitoneal 3 μl
IN = intranasal 10 μl
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel zeigt, daß eine Iscom-enthaltende Matrix mit GM1 an welches rCTB gebunden ist und welches gemeinsam mit einem Ovalbumin (OVA), welches mit einem Lipidschwanz zur Verfügung gestellt wurde mit einbezogen wurde, eine Antikörperantwort gegen rCTB und gegen OVA nach einer intranasalen (IN) Immunisierung hervorruft.
Lipidieren von OVA
Reagenz

1 mg OVA
1 mg Phosphatidylethanolamin (PE) mit kleinen Mengen von ¹⁴C-markiertem PE
1,4 mg N-Hydroxysulfonsuccinimid
38,4 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)charbodiimid-HCl
H₂O bis auf ein Volumen von 2 ml

Die Mischung wurde 2 h auf einem Schüttelbrett bei Raumtemperatur inkubiert.
Dieses OVA wurde in ein Iscoms mit und ohne GM1 mit einbezogen, analog zu dem Verfahren, das vorher in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die Iscoms wurden charakterisiert durch Elektronenmikroskopie (EM) und durch analytische Sucrosegradientenzentrifugation auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 1.
Bei der Iscom-Präparation wurden die folgenden Inhaltsstoffe verwendet:

Lipidiertes OVA, 2 ml 300 μg

Cholesterin 1000 μg

Spikosid (Quil A) 5000 μg

H₂O bis auf ein Volumen von 2,15 ml
Zur Herstellung siehe Beispiel 1.
Wenn die Iscoms auch GM1 enthalten sollten, wurden die folgenden Inhaltsstoffe verwendet:

Lipidiertes OVA 300 μg

Cholesterin 1000 μg

GM1 50 μg

Spikosid (Quil A) 5000 μg

Gesamtvolumen 2,2 ml (H₂O)
Bei der Herstellung von OVA-rCTB-Iscoms wurden OVA-GM1-Iscoms mit 13mal größeren Mengen (Gewicht) an rCTB als GM1 vermischt. Die Mengen wurden auf dieselbe Art und Weise berechnet wie in EP 180 562 , Beispiel 21.

Fünf Gruppen zu je acht Mäusen wurden intranasal zweimal innerhalb eines sechswöchigen Intervalls gemäß dem folgenden Plan immunisiert:

Gruppe A	OVA (frei), 10 μg intranasal
Gruppe B	OVA-Iscom, 10 μg Antigen intranasal
Gruppe C	OVA-Iscom + rCTB (frei), 10 μg jedes Antigens intranasal
Gruppe D	OVA-rCTB-Iscom, 10 μg jedes Antigens intranasal
Gruppe E	OVA-rCTB-Iscom, 2 μg jedes Antigens subkutan
Gruppe F	OVA frei + rCTB frei, 10 μg jedes Antigens intranasal

3 Wochen nach der ersten Immunisierung und 2 Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden Serumproben entnommen. Lungen wurden 2 Wochen nach der ersten und zweiten Immunisierung zur Extraktion von IgA-Antikörpern präpariert. Die Antikörpertiter im Serum und im Lungenextrakt wurden auf dieselbe Art und Weise wie in Beispielen 1 und 2 bestimmt.
Ergebnisse nach einer Immunisierung
Die Mäuse in Gruppe D sprachen mit signifikanten Spiegeln der Antikörpertiter gegen rCTB im Serum an. Signifikante Antikörpertiter gegen rCTB wurden im Lungenextrakt nachgewiesen. Niedrige Antikörpertiter gegen OVA wurden sowohl im Serum als auch im Lungenextrakt erhalten.
Nach subkutaner Immunisierung (Gruppe E) wurden ungefähr dieselben Antikörperspiegel gegen rCTB wie gegen OVA erhalten. Keine Antikörperantwort wurde gegen rCTB oder OVA im Lungenextrakt gemessen.
Bei den Mäusen in Gruppe C, die intranasal mit OVA-Iscoms plus freiem rCTB immunisiert worden waren, wurden Antikörpertiter gegen rCTB mit ELISA-Serumantikörpertitern gemessen, die auf demselben Niveau waren wie diejenigen der Mäuse in Gruppe D. Keine Antikörpertiter gegen OVA konnten im Serum gemessen werden. Im Lungenextrakt wurden signifikante Titer gegen rCTB gemessen; aber keine oder sehr wenig Antikörperantwort konnte gegen OVA gemessen werden.
Bei den Mäusen in Gruppe F wurden moderate Antikörpertiter im Serum und im Lungenextrakt gegen rCTB nach der primären Immunisierung (i. n.), aber nicht gegen OVA erhalten.
Bei den Mäusen in den verbleibenden Gruppen (A, B) konnten keine Antikörpertiter gegen OVA im Serum oder im Lungenextrakt gemessen werden.
Ergebnisse nach der zweiten Immunisierung
Hohe Antikörpertiter gegen OVA im Serum wurden gemessen bei den Mäusen in Gruppen D und E, d. h. bei den Mäusen, die intranasal bzw. subkutan mit OVA-rCTB-Iscoms immunisiert wurden.
Im Lungenextrakt aus den Mäusen in Gruppe D wurden Antikörpertiter gegen sowohl rCTB als auch gegen OVA gemessen.
Keine oder sehr niedrige Titer wurden in den Lungenextrakten von Mäusen gemessen, die subkutan mit OVA-rCTB-Iscoms (Gruppe E) immunisiert wurden.
Bei den Mäusen in Gruppe C wurden hohe Antikörperantworten gegen rCTB im Serum gemessen, aber sehr niedrige Serumtiter wurden gegen OVA erhalten. Im Lungenextrakt wurden Antikörpertiter gegen rCTB, aber nicht gegen OVA gemessen.
Bei den Mäusen in Gruppe B (OVA-Iscom) wurden niedrige Titer gegen OVA sowohl im Serum als auch im Lungenextrakt gemessen. Freies OVA (Gruppe A) rief keine nachweisbaren Antikörpertiter hervor, weder im Serum noch im Lungenextrakt.
Nach der zweiten Immunisierung wurde ein mehrfacher Serumantikörperanstieg der Titer gegen rCTB, aber nicht gegen OVA erhalten. Nach der zweiten Immunisierung wurden IgA-Antikörpertiter gegen rCTB in der Lunge gemessen, die signifikant waren, aber keine Antikörperantwort wurde gegen OVA gemessen.
Schlußfolgerung
Die Ergebnisse zeigen, daß Iscoms, enthaltend rCTB als Transport (Targeting)-Moleküle und OVA als Passagier-Antigene, effektiv die Antikörperantwort gegen sowohl rCTB als auch OVA im Lungenextrakt und im Serum induzieren. Nur OVA, OVA-Iscoms (Iscoms mit nur einem Passagier-Antigen) oder freies OVA plus rCTB-Iscoms riefen keine oder sehr niedrige Antikörperantworten gegen OVA im Serum und im Lungenextrakt hervor.

Claims

Lipidhaltiges Partikel, ausgewählt aus Iscoms und Iscom-Matrix, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehrere lipidhaltige Rezeptoren für Antigensubstanzen von Mikroorganismen, bakterielle Toxine, Fimbrien, Adhäsionsmoleküle und bindungsaktive Teile davon umfaßt oder Rezeptoren, die hydrophob sind, wobei die Rezeptoren in das Partikel integriert sind.
Lipidhaltiges Partikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens eine antigene oder Target-suchende Substanz umfaßt, die an den Rezeptor gebunden ist.
Lipidhaltiges Partikel nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch einen Gehalt von wenigstens zwei Antigenen oder wenigstens einem Antigen und wenigstens einem Target-suchenden Molekül und dadurch, daß wenigstens ein Antigen an ein rezeptorbindendes Molekül gebunden ist.
Lipidhaltige Partikel nach irgendeinem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormolekül ein lipidhaltiges Molekül ist.
Lipidhaltige Partikel nach irgendeinem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormolekül der lipidhaltige Rezeptor GM1 für das Choleratoxin ist und das Antigen das Choleratoxin oder Teile davon ist.
Lipidhaltige Partikel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen die B-Untereinheit von Choleratoxin oder immunologisch eng verwandten Proteinen, hitzelabiles Enterotoxin von E. coli oder Untereinheiten davon ist, die an den Rezeptor binden.
Lipidhaltige Partikel nach einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormolekül ein hydrophobes Protein ist.
Lipidhaltige Partikel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormolekül ein Glykoprotein oder ein fukosyliertes Blutgruppenantigen ist.
Lipidhaltige Partikel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormolekül das Glykoprotein ist, das hitzelabiles Enterotoxin von E. coli oder Untereinheiten davon bindet, und daß das Antigen das Enterotoxin von E. coli oder Teile davon ist.
Impfstoffzubereitung zur Prophylaxe und/oder Immuntherapie, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Partikeln nach irgendeinem der Ansprüche 1–9.