KR101998431B1

KR101998431B1 - 리포솜 제제

Info

Publication number: KR101998431B1
Application number: KR1020137030967A
Authority: KR
Inventors: 개리 후지이; 윌리엄 에이. 에른스트; 질 아들러-무어; 린다 위키안
Original assignee: 몰레큘라 익스프레스 인코포레이티드
Priority date: 2011-04-26
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2019-07-09
Also published as: EA201391467A1; EA034702B1; JP2014518620A; WO2012149045A2; CN103747797B; EP2701734A4; CN103747797A; CA2834349A1; US20140287022A1; EP2701734A2; KR20140043348A; WO2012149045A3; EP2701734B1

Abstract

본 발명은 리포솜 백신 조성물, 이의 제조 방법 및 동물에서 면역 반응을 자극하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다. 이 조성물은 다이미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"); 다이미리스토일포스파티딜글라이세롤("DMPG"), 다이미리스토일트라이메틸암모늄 프로판("DMTAP"), 또는 DMPG 및 DMTAP 둘 다; 및 적어도 하나의 스테롤; 및 제1 폴리펩타이드 서열, 및 막 단백질로부터 막관통 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 서열에 대해서 이종성인 제2 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항원 폴리펩타이드로부터 형성된 리포솜을 포함하되, 상기 막관통 서열은 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 다수의 잔기를 가지며, 이의 적어도 9개의 연속 잔기는 소수화도 스코어가 약 0.7 이상인 알파 나선을 형성하는 것으로 예상된다.

Description

리포솜 제제{LIPOSOMAL FORMULATIONS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 발명은 2011년 4월 26일자에 출원된 미국 가특허출원 제61/479,302호(모든 표, 도면 및 특허청구범위를 비롯한 이의 전문이 본 명세서에 포함됨)로부터 우선권을 주장한다.

연방 정부 지원 연구에 대한 성명

미국 정부는 특허권자가 국립 알레르기 전염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases: NIH) 승인 U01AI074508호 및 1R43AI078654호의 조건에 의해 제공되는 것과 같은 합당한 조건으로 다른 이에게 라이센스를 허여하는 데 요하는 제한된 정황으로 본 발명에서의 유료 라이센스 및 권한을 갖는다.

본 발명의 배경기술의 하기 설명은 단지 독자가 본 발명을 이해하는 것을 돕기 위해 제공되고, 본 발명을 기술하거나 이에 대한 선행 기술을 구성하는 것으로 인정되지 않는다.

리포솜은 1개의 층("단층") 또는 1개 초과의 층("다층")의 인지질로부터 형성되는 소포이다. 인지질 빌딩 블록의 양친매성 특성으로 인해, 리포솜은 통상적으로 친수성 외부 면을 제시하고 친수성 코어를 둘러싸는 친수성 층을 포함한다. 친수성/소수성 성분의 도입, 이의 비독성 성질, 생체분해성, 생체적합성, 아쥬번트성(adjuvanticity), 세포 면역의 유도, 지속 방출의 특성 및 대식세포에 의한 즉각적 유입에서의 리포솜의 다양성은 이들을 항원 전달에 매력적인 후보물질로 만든다.

리포솜은 매우 다양한 박테리아, 원생동물, 바이러스 및 종양 세포 항원에 대한 체액성 및 세포 매개 면역 둘 다를 유도하는 것으로 입증되었다. 광범위한 리포솜 백신 사용이 오랫동안 예상되었지만, 이러한 백신이 상업적으로는 거의 개발되지 않았다. 리포솜의 면역보강 작용(immunoadjuvant action)은 다양한 구조 특징에 따라 달라진다. 이러한 특징은 항원의 천연 형태를 항상 모방하지 않을 수 있는 리포솜에 의해 제시되는 항원의 3차원 형태를 포함한다.

예를 들면, 막관통 도메인에 대략 35개의 아미노산 N 말단으로 이루어진 분절인 HIV gp41의 막 인접 부위(membrane proximal region: MPR)는 바이러스 계통군에 걸쳐 잘 보존되고 바이러스 세포 융합에 필수적이므로 바람직한 백신 표적으로 생각된다. 그러나, 유용한 면역 반응을 끌어내기 위한 노력이 현재까지 성공하지 못했고, 운반 단백질에 접합되거나 재조합 구성체에 그래프팅된 구조적으로 구속된 에피토프를 제시하고자 하는 시도가 중화 항체를 이끌어내지는 못했다. 에피토프 구조와 관련된 공통의 결여 이외에, MPR의 비교적 약한 면역원성은 항체 인식으로부터 MPR을 마스킹하는 gp41에서의 면역우성 부위를 향한 재조합 엔벨로프 면역원에 대한 면역 반응을 발생시킬 수 있다.

또한, 리포솜 형성 전에 항원을 리포솜과 연결시키는 방법은 대개 항원을 세제 및/또는 유기 용매에 노출시킨다. 반대로, 형성 이후 항원을 리포솜과 연결시키는 방법은 리포솜을 바람직하지 않은 화학 처리에 노출시킬 수 있다. 리포솜은 또한 세망내피계 및 대식세포에 의해 신속히 청소될 수 있어, 백신으로서의 리포솜의 효능을 감소시킨다.

또한, 이러한 특징은 또한 생체내 소포 운명을 조절하는 인자를 포함할 수 있다. 리포솜 형성 전에 항원을 리포솜과 연결시키는 방법은 대개 항원을 세제 및/또는 유기 용매에 노출시킨다. 반대로, 형성 이후 항원을 리포솜과 연결시키는 방법은 리포솜을 바람직하지 않은 화학 처리에 노출시킬 수 있다. 리포솜은 또한 세망내피계 및 대식세포에 의해 신속히 청소될 수 있어, 백신으로서의 리포솜의 효능을 감소시킨다.

면역 반응을 자극하는 데 유용한 방식으로 항원을 전달하는 리포솜 백신을 제공할 수 있는 방법 및 조성물에 대한 수요가 당해 분야에 존재한다.
[선행기술문헌]
US 7368537 (2008. 5. 6)
US 2010/0203099 (2010. 8. 12)
US 2010/0226973 (2010. 9. 9)
US 2006/0134103 (2006. 6. 22)
US 2007/0036826 (2007. 2. 15)

본 발명의 목적은 리포솜 조성물, 이의 제조 방법, 및 이의 사용 방법을 제공하는 것이다. 이러한 조성물을 동물에서 면역 반응을 자극하기 위해 백신 제제로서 사용할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 조성물로서,

a) 수성 비히클; 및

b) 리포솜을 포함하되,

상기 리포솜은,

(ⅰ) 다이미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"),

(ⅱ) 다이미리스토일포스파티딜글라이세롤("DMPG"), 다이미리스토일트라이메틸암모늄 프로판("DMTAP"), 또는 DMPG 및 DMTAP 둘 다,

(ⅲ) 적어도 하나의 스테롤; 및

(ⅳ) 항원 폴리펩타이드 서열, 및

천연 이종성 막 단백질의 막관통 서열을 포함하거나 이 천연 이종성 막 단백질로부터 유도된 제2 폴리펩타이드 서열을 포함하고,

상기 제2 폴리펩타이드 서열은 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 다수의 잔기를 갖되, 적어도 9개의 연속 잔기는 소수화도 스코어(hydrophobicity score)가 약 0.7 이상인 알파 나선을 형성하는 것으로 예상되며,

상기 항원 폴리펩타이드 서열은 상기 제2 폴리펩타이드 서열의 N 또는 C 말단에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링되어 수성 가용성 융합 폴리펩타이드를 제공하고, 상기 융합 폴리펩타이드의 항원 폴리펩타이드 서열은 상기 리포솜의 외면에서 디스플레이되는 것인 조성물에 관한 것이다.

문맥 내 용어 "약"은 소정의 측정의 ±10%를 의미한다.

본 발명의 목적을 위해, 9의 윈도우 크기, 엣지 100%의 상대 중량, 선형 중량 변동 및 하기의 아미노산 스케일 값의 매개변수를 이용하여 문헌[Esienberg et al., J. Mol. Biol. (1984) 179:125-142]의 방법론을 이용하여 폴리펩타이드 서열의 알파 나선도 및 소수화도를 계산한다:

기재된 바대로, 적합한 소수성 서열은 통상적으로 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 길이(약 15개 내지 30개의 잔기; 더 바람직하게는 약 18개 내지 25개의 잔기)를 갖고, 이의 적어도 9개의 연속 잔기는 소수화도(아이젠버그 스코어)가 약 +0.7인 알파 나선을 형성하는 것으로 예상된다.

상기의 특정 실시양태에서, 본 발명은 조성물로서,

a) 수성 비히클; 및

b) 리포솜을 포함하되, 상기 리포솜은,

(ⅰ) 다이미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"),

(ⅲ) 적어도 하나의 스테롤; 및

(ⅳ) 항원 폴리펩타이드를 포함하고, 해당 항원 폴리펩타이드는,

M2 세포외 도메인의 적어도 10개의 연속 잔기를 포함하고, 상기 M2 세포외 도메인에서 천연인 1개 이상의 시스테인 잔기를 제거하도록 변형된 제1 폴리펩타이드 서열, 및

상기 제2 폴리펩타이드 서열은 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 다수의 잔기를 갖되, 적어도 9개의 연속 잔기는 소수화도 스코어가 약 0.7 이상인 알파 나선을 형성하는 것으로 예상되며,

상기 항원 폴리펩타이드 서열은 상기 제2 폴리펩타이드 서열의 N 또는 C 말단에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링되어 수성 가용성 융합 폴리펩타이드를 제공하고, 상기 융합 폴리펩타이드의 항원 폴리펩타이드 서열은 리포솜의 외면에서 디스플레이되는 것인 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "M2 세포외 도메인"은 자연 또는 공통 M2 단백질 서열의 세포외 도메인으로부터 적어도 10개의 아미노산 잔기를 포함하고, M2 단백질 막관통 도메인의 전부 또는 일부가 결여되어, 생성된 M2 세포외 도메인 폴리펩타이드가 수성 매질 중에 가용성인 IAV M2 단백질로부터 유도된 폴리펩타이드를 의미한다.

자연 IAV M2 단백질 서열의 예는 하기를 포함한다:

스위스-프로트(Swiss-Prot) Q0A2E4(서열 번호 1)

스위스-프로트 P63231(서열 번호 2):

스위스-프로트 P06821(서열 번호 3):

스위스-프로트 P05780(서열 번호 4):

스위스-프로트 P35938(서열 번호 5):

스위스-프로트 P05778(서열 번호 6):

스위스-프로트 P03492(서열 번호 7):

스위스-프로트 O70632(서열 번호 8):

스위스-프로트 P63232(서열 번호 9):

이 목록은 서열분석된 수백개의 IAV 단리물 및 추론된 M2 단백질 서열로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이 서열에서, 2번 내지 22번 잔기는 세포외 도메인(개시제 메티오닌이 통상적으로 제거됨)을 나타내고; 23번 내지 43번 잔기는 막관통 도메인을 나타내고; 44번 내지 97번 잔기는 세포질 도메인을 나타낸다.

공통 IAV M2 세포외 도메인 서열을 다양한 IAV 단리물의 상관관계에 의해 결정한다. 상이한 종 유도 바이러스 단리물에 대한 3개의 공통 서열이 문헌[Betakova, Current Pharmaceutical Design, 2007, 13, 3231-3235]에 기재되어 있다:

인간(서열 번호 10): SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD

돼지(서열 번호 11): SLLTEVETPIRNGWECKCNDSSD

조류(서열 번호 12): SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD

특정 실시양태에서, 시스테인 잔기는 이 서열로부터 제거된다. 다른 잔기(예를 들면, 세린)에 대한 시스테인 잔기의 돌연변이, 또는 시스테인 잔기 전의 세포외 도메인의 절두(truncation)에 의해 이를 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항원 폴리펩타이드에서 용도 확인된 IAV M2 세포외 도메인 서열은 하나 이상의 하기 서열로부터 적어도 10개의 연속 잔기, 가장 바람직하게는 모든 15개의 잔기를 포함한다:

인간(서열 번호 13): SLLTEVETPIRNEWG;

돼지(서열 번호 14): SLLTEVETPIRNGWE; 또는

조류(서열 번호 15): SLLTEVETPTRNGWE

시스테인이 세린으로 돌연변이된 이러한 바람직한 IAV M2 세포외 도메인 서열의 일례에서, 본 명세서에 기재된 항원 폴리펩타이드에서 용도 확인된 IAV M2 세포외 도메인 서열은 하기를 포함한다:

(서열 번호 16): SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD

HSV2 항원 폴리펩타이드 서열의 예는 하기(서열 번호 60 내지 서열 번호 81)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:

본 발명의 목적을 위해, 폴리펩타이드 서열은 천연 단백질의 서열에 적어도 90%, 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 적어도 97% 동일한 경우 특정한 천연 단백질 서열로부터 "유도된다".

본 발명의 목적을 위해, 막관통 서열은 이 서열이 항원 폴리펩타이드 서열이 얻어지거나 유도되는 단백질과 다른 천연 단백질로부터 얻어지거나 유도되는 경우 "이종성"이다. 본 발명에서 용도 확인된 천연 단백질의 예시적인 막관통 도메인이 하기 기재되어 있다.

편리함을 위해, 상기 (ⅱ) 파트에서 선택된 지질(들)은 DMPG, DMTAP, 또는 2종의 혼합물을 의미하도록 의도되는 DMPG/DMTAP로서 하기 언급된다. 특정 실시양태에서, DMPC, DMPG/DMTAP 및 스테롤의 상대 백분율은 50% 내지 98%의 DMPC:1% 내지 25%의 DMPG/DMTAP:1% 내지 25%의 스테롤이고, 특정한 다른 실시양태에서, 70% 내지 98%의 DMPC:1% 내지 15%의 DMPG/DMTAP:1% 내지 15%의 스테롤이다. 이는 다른 성분이 리포솜에 존재하지 않는다는 것을 암시하려고 의도되기보다는, 이것은 서로에 대한 몰 비율의 DMPC, DMPG/DMTAP 및 스테롤의 상대 백분율을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 리포솜은 또한 당해 분야에 널리 공지된 하나 이상의 추가의 성분, 예컨대 펩타이도글라이칸, 리포펩타이드, 리포폴리사카라이드, 모노포스포릴 리피드 A, 리포테이코산, 레시퀴모드, 이미퀴모드, 플라젤린, 비메틸화 CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, α-갈락토실세라마이드, 무라밀 다이펩타이드, 모든 트랜스 레티노산, 이중 가닥 바이러스 RNA, 열 충격 단백질, 다이옥타데실다이메틸암모늄 브로마이드, 양이온성 계면활성제, 톨 유사 수용체 효능제, 다이미리스토일트라이메틸암모늄프로판 및 노드형(nod-like) 수용체 효능제를 포함할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 이 상대 백분율은 70% 내지 85%의 DMPC:5% 내지 15%의 DMPG/DMTAP:10% 내지 15%의 스테롤이고, 더 바람직하게는 약 75%의 DMPC, 약 10%의 DMPG/DMTAP 및 약 15%의 스테롤이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 이 문맥 내에서 소정의 측정의 ±10%를 의미한다. DMPG는 상기 (ⅱ) 파트에서 선택된 지질로서 특히 바람직하다.

본 명세서에 사용되는 용어 "스테롤"은 3번 탄소 위치에서 스테로이드 및 하이드록실(-OH) 또는 에스터(-OR) 치환의 4원 고리 구조 특징을 갖는 임의의 분자를 의미한다:

당업자라면 하나 이상의 다른 고리 탄소에서 스테롤이 추가로 치환될 수 있고, 고리에서 다양한 이중 결합을 또한 포함할 수 있는 것으로 이해한다. 특정 실시양태에서, 스테롤은 콜레스테롤, 콜레스테릴 클로로포르메이트, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 라노스테롤, 데스모스테롤 및 캄퍼스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 목록은 제한으로 의도되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바대로, 소수성 막관통 도메인의 존재에도 불구하고 수용액 중에 가용성인 융합 단백질로서 항원 폴리펩타이드를 제조하는 것이 유리하다. 수성 가용성 항원 구성체의 제공은 (1) 융합 단백질로서 유기체로부터의 발현을 위해 수성 시스템 또는 종래 수성 합성 화학적 방법을 이용하여 리포솜으로부터 별도로 이 구성체가 제조되게 하고; (2) 표준 수성 정제 절차가 가능하게 한다. WO00/016746(모든 표, 도면 및 특허청구범위를 비롯한 이의 전문이 본 명세서에 포함됨)을 참조한다.

본 발명의 목적을 위해, 2개의 폴리펩타이드는 2개의 폴리펩타이드 사이의 펩타이드 결합 사이에 화학 결합이 없는 경우 서로에 "직접적으로 커플링"되고, 2개의 폴리펩타이드는 연결 화학 구조가 2개의 폴리펩타이드를 연결하는 경우 "간접적으로 커플링"된다. 간접 커플링의 예는 하나 이상의 아미노산 잔기, 이황화 연결 또는 이작용성 화학 가교결합 시약일 수 있다. 이 목록은 제한으로 의도되지 않는다. 현재 2개의 폴리펩타이드 서열을 커플링하는 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 항원 폴리펩타이드는 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 M2 세포외 도메인 잔기 및 막관통 도메인 잔기 둘 다를 포함하는 단일 "융합" 단백질로서 합성되거나 발현될 수 있다. M2 세포외 도메인 잔기 및 막관통 도메인 잔기가 별개의 분자로서 합성되거나 발현되는 경우, 문헌[Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1991]에 도시된 것과 같은 화학 가교결합제를 사용할 수 있다. 이 시약은 펩타이드의 아미노산 측쇄에 커플링하는 작용기를 통상적으로 제공한다. 가교결합제를 사용하여 표적화될 수 있는 모이어티는 1차 및 ε-아민, 설프하이드릴, 카보닐, 하이드록실 및 카복실산을 포함한다. 또한, 많은 반응성 기가 광반응성 페닐 아지드와 같은 가교결합제를 사용하여 비선택적으로 커플링될 수 있다. 2개의 서열은 말단 대 말단으로 간접적으로 커플링되거나, 추가의 연결 원자 또는 아미노산 잔기가 관심대상(interest)인 2개의 폴리펩타이드 서열 사이에 포함될 수 있다.

지질 혼합물로부터 리포솜을 제조하는 적합한 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Basu & Basu, Liposome Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2002; Gregoriadis, Liposome Technology, 3 ^rd Edition, Informa HealthCare, 2006]을 참조한다. 바람직한 방법은 본 명세서에 기재된 압출, 균질화 및 음파 처리 방법을 포함한다. 지질 혼합물을 건조한 후, 수성 비히클 중에 수화시키고 음파 처리하여 리포솜을 형성하는 단계를 포함하는 본 발명의 리포솜을 제조하는 예시적인 방법이 하기 기재되어 있다. 바람직한 스테로이드 유도체, 면역원성 폴리펩타이드 또는 탄수화물을 이러한 유도체에게 공유 커플링시키는 방법 및 공유 결합이 상기 및 하기 자세히 기재되어 있다.

특정 실시양태에서, 리포솜이 점막으로 전달될 때 채워지고/지거나 정맥내 전달될 때 청소되는 효율에 크기가 영향을 미칠 수 있으므로, 리포솜이 특정한 평균 크기 범위 내에 제공된다. 광자 상관 분광학, 동적 광 산란 등과 같은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 리포솜 크기를 결정할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 리포솜은 실질적으로 직경이 50 내지 500㎚이고, 더 바람직하게는 실질적으로 50 내지 300㎚이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "실질적으로"는 문맥 내에서 적어도 75%, 더 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%의 리포솜이 지정된 범위 내에 있다는 것을 의미한다.

특정 실시양태에서, DMPC, DMPG/DMTAP 및 스테롤의 상대 백분율은 50% 내지 98%의 DMPC:1% 내지 25%의 DMPG/DMTAP:1% 내지 25%의 스테롤이고, 특정한 다른 실시양태에서, 70% 내지 98%의 DMPC:1% 내지 15%의 DMPG/DMTAP:1% 내지 15%의 스테롤이다. 상기 기재된 바대로, 이는 다른 성분이 지질 혼합물(그러므로 리포솜)에 존재하지 않는다는 것을 암시하려고 의도되기보다는, 이것은 서로에 대한 몰 비율의 DMPC, DMPG/DMTAP 및 스테롤의 상대 백분율을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 지질 혼합물은 또한 당해 분야에 널리 공지된 하나 이상의 추가의 성분, 예컨대 펩타이도글라이칸, 리포펩타이드, 리포폴리사카라이드, 모노포스포릴 리피드 A, 리포테이코산, 레시퀴모드, 이미퀴모드, 플라젤린, 비메틸화 CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, α-갈락토실세라마이드, 무라밀 다이펩타이드, 모든 트랜스 레티노산, 이중 가닥 바이러스 RNA, 열 충격 단백질, 다이옥타데실다이메틸암모늄 브로마이드, 양이온성 계면활성제, 톨 유사 수용체 효능제, 다이미리스토일트라이메틸암모늄프로판 및 노드형 수용체 효능제를 포함할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 이 상대 백분율은 70% 내지 85%의 DMPC: 5% 내지 15%의 DMPG/DMTAP: 10% 내지 15%의 스테롤이고, 더 바람직하게는 약 75%의 DMPC, 약 10%의 DMPG/DMTAP 및 약 15%의 스테롤이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 이 문맥 내에서 소정의 측정의 ±10%를 의미한다. DMPG는 상기 (ⅱ) 파트에서 선택된 지질로서 특히 바람직하다.

최종 조성물 내 항원 폴리펩타이드의 바람직한 농도는 약 0.05 내지 1㎎/㎖, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 0.6㎎/㎖ 범위이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 이 문맥 내에서 소정의 측정의 ±10%를 의미한다.

특정 실시양태에서, 상기 방법은 특정한 평균 크기 범위 내의 리포솜을 선택하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들면, 리포솜을 포함하는 수성 비히클을 예비 선택된 기공 크기를 갖는 막을 통해 압출하고 막에 걸쳐 흐르는 물질을 수집하여 리포솜 크기를 선택할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 리포솜은 실질적으로 직경이 50 내지 500㎚, 더 바람직하게는 실질적으로 직경이 50 내지 200㎚, 가장 바람직하게는 실질적으로 직경이 50 내지 150㎚이도록 선택된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "실질적으로"는 문맥 내에서 적어도 75%, 더 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%의 리포솜이 지정된 범위 내에 있다는 것을 의미한다.

특정 실시양태에서, 막관통 서열은 이의 원래의 문맥 내에서 신호 고정 서열을 갖는 이종성 막 단백질로부터 얻어지거나 유도된다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 이는 II형 또는 III형 막 단백질과 같은 단백질의 막 간격 도메인으로부터의 적어도 10개의 연속 잔기, 특정 실시양태에서 적어도 15개의 연속 잔기, 또 다른 실시양태에서 적어도 18개의 연속 잔기, 또 다른 실시양태에서 적어도 20개의 연속 잔기, 몇몇 실시양태에서 25개 이상의 연속 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 이러한 서열은 통상적으로 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 길이(약 15개 내지 30개의 잔기; 더 바람직하게는 약 18개 내지 25개의 잔기)를 갖고, 소수화도(아이젠버그 등의 스코어)가 잔기당 약 +1.5인 알파 나선을 형성하는 것으로 예상된다. 용어 "약"은 이 문맥 내에서 소정의 측정의 ±10%를 의미한다. II형 및 III형 막 단백질은 막 삽입 및 토폴로지를 조절하는 절단 가능한 N 말단 신호 펩타이드가 결여되고, 대신 폴리펩타이드의 전좌를 중재하고 막에서 단백질을 고정하는 절단 가능한 신호 서열인 소수성 "신호 고정 서열"을 통해 번역후 막에 삽입한다.

이러한 단백질의 일례는 사이토크롬 b5이다. 사이토크롬 b5 폴리펩타이드는 트립신 민감 분획에 의해 연결된 2개의 명확한 도메인으로 이루어진다. 아미노에 가까운 도메인은 전자 수송에 관여하는 촉매 도메인이고, 소수성 "카복실에 가까운" 도메인은 막에서 단백질을 고정하도록 기능한다. 당해 분야에 공지된 다른 적합한 단일 통과 막 단백질은 뮤신-4 베타 사슬, 트랜스페린 수용체, TNFRSF13B, 아미노펩티다제 N, 다이펩티딜 펩티다제 4, 종양 괴사 인자신탁신(Tumor necrosis factorsyntaxin) 3, BclXL 및 R9AP를 포함한다. 이 목록은 제한으로 의도되지 않는다.

특정한 대안적인 실시양태에서, 막관통 서열은 다수의 신호 고정 서열을 갖는 다회 통과 막 단백질인 이종성 막 단백질, 예컨대 박테리오로돕신, G 단백질 커플링 수용체, 예컨대 CCR1-10, CXCR1, 아세틸콜린 수용체, 아드레노메둘린 수용체 등, 사이토크롬 C 옥시다제, 니코틴성 아세틸콜린 수용체, mGluR 및 아쿠아포린으로부터 얻어지거나 유도된다. 이 목록은 제한으로 의도되지 않는다.

적합한 막관통 도메인의 예는 하나 이상의 하기 서열로부터 10개 이상의 연속 잔기를 포함한다. 다양한 다른 이러한 도메인이 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 서열은 DAS 서버(Cserzo, M., E. Wallin, I. Simon, G. von Heijne, and A. Elofsson. 1997. Protein Eng. 10:673-676)를 사용하여 계산할 때 막관통 도메인을 형성하는 것으로 예상된다.

Cyt b5a 서열을 예시적인 소수성 막관통 도메인으로서 취하면, 본 발명의 항원 융합 단백질은 하기 서열 중 하나의 모두 또는 임의의 연속 부분을 포함할 수 있지만, 단 이 서열은 적어도 밑줄 친 잔기를 포함한다:

cyt b5 단백질 서열의 하기 목록은 제한으로 의도되지 않는다. 다른 유사한 단백질이 당해 분야에 또한 널리 공지되어 있다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩타이드 서열은 스위스-프로트 수탁 번호에 의해 상기 기재된 cyt b5 단백질 서열 중 하나와 적어도 70%의 서열 일체성, 상기 기재된 전체 42개의 잔기 길이에 걸쳐 서열 번호 26으로 상기 기재된 인간 서열에 대해 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%의 서열 일체성을 포함한다. 디폴트 매개변수로 설정된 기본 로직 정렬 조사 도구(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST)(Altschul, S.F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)를 사용하여 서열 일체성을 결정한다. 동일한 단백질을 실질적으로 모두 코딩하는 다수의 핵산 서열을 생성하는 유전자 코드의 축퇴를 이용하여 핵산 서열을 변경할 수 있는 것으로 이해된다. 예의 방식으로, 본 발명의 항원 융합 단백질은 하기 서열의 모두 또는 임의의 연속 부분을 포함할 수 있고, 단 이 서열은 적어도 밑줄 친 잔기를 포함한다:

관련 양태에서, 본 발명은 동물에서 체액성 및/또는 세포 매개 면역 반응을 확립하도록 선택되고, 천연 이종성 막 단백질의 막관통 서열을 포함하거나 이 천연 이종성 막 단백질로부터 유도된 제2 폴리펩타이드 서열의 N 또는 C 말단에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 제1 폴리펩타이드 서열, 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 다수의 잔기를 갖고, 적어도 9개의 연속 잔기가 소수화도 스코어가 약 0.7 이상인 알파 나선을 형성하도록 예상된 제2 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 수성 가용성인, 정제된 항원 폴리펩타이드에 관한 것이다.

특정한 예시적인 실시양태에서, 본 발명은 M2 세포외 도메인의 적어도 10개의 연속 잔기를 포함하고, 상기 M2 세포외 도메인에서 천연인 1개 이상의 시스테인 잔기를 제거하도록 변형된 제1 폴리펩타이드 서열, 천연 이종성 막 단백질의 막관통 서열을 포함하거나 이 천연 이종성 막 단백질로부터 유도되고, 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 다수의 잔기를 갖고, 적어도 9개의 연속 잔기가 소수화도 스코어가 약 0.7 이상인 알파 나선을 형성하도록 예상된 제2 폴리펩타이드 서열을 임의로 포함하는, 수성 가용성인, 정제된 항원 폴리펩타이드로서, 상기 제1 폴리펩타이드 서열이 상기 제2 폴리펩타이드 서열의 N 또는 C 말단에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 정제된 항원 폴리펩타이드를 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 동물을 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 유효량의 본 발명의 조성물을 비경구 또는 경장 경로에 의해 상기 동물에게 전달하는 단계를 포함한다. 이러한 조성물을 제조하기 위한 바람직한 물질, 방법 및 조건이 상기 및 하기에 자세히 기재되어 있다.

바람직한 경장 투여 경로는 입(경구), 비강, 직장 및 질내 경로에 의한 전달을 포함한다. 바람직한 비경구 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 경로를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대개 "프라임(prime)/부스트(boost)" 면역화 프로토콜로 언급되는 본 발명의 조성물의 복수의 전달을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 프라임 및 부스트 전달은 본 발명의 리포솜 조성물을 비경구 또는 경장 경로에 의해 동물에게 전달하는 단계를 포함한다. 이러한 면역화 프로토콜에서, 프라임 전달은 하나 이상의 증강 전달보다 상이한 투여 경로를 통할 수 있다. 예를 들면, 프라임 전달은 면역원의 피하 전달에 의해 이루어질 수 있고, 부스트 전달은 근육내 전달에 의해 이루어질 수 있다.

또한, 관심 대상 항원의 프라임 및 하나 이상의 부스트 전달은 "균일(프라임 및 부스트 둘 다 본 발명의 리포솜 조성물의 전달을 포함한다는 것을 의미)" 또는 "비균일"(프라임 또는 부스트 전달 중 하나가 본 발명의 리포솜 조성물의 전달을 포함하고, 다른 전달이 상이한 백신 플랫폼에 의해 이루어질 수 있다는 것을 의미)일 수 있다. 이러한 대안적인 백신 플랫폼은 비리포솜 백신 제제 중의 항원의 전달, 항원을 코딩하는 DNA 백신의 전달, 재조합 바이러스 백신의 전달 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 리포솜 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 항원 폴리펩타이드를 발현시키거나 합성하는 단계(항원 폴리펩타이드는 비변성 조건 하에 단량체 형태임); 항원 폴리펩타이드를 정제시키는 단계; 항원 폴리펩타이드를 포함하는 수용액을 (ⅰ) DMPC, (ⅱ) DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP 둘 다, 및 (ⅲ) 적어도 하나의 스테롤을 포함하는 지질 혼합물에 첨가하는 단계; 항원 폴리펩타이드 및 지질 혼합물을 건조시키는 단계; 및 수성 비히클의 존재 하에 건조된 항원 폴리펩타이드 및 지질 혼합물을 음파 처리하여 리포솜을 형성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 목적은 천연 이종성 막 단백질의 막관통 서열을 갖거나 이 천연 이종성 막 단백질로부터 유도된 융합 단백질로서 관심 대상 폴리펩타이드를 발현시키도록 구성되고 배열된 핵산을 제공하는 것이다. 이 용어가 본 명세서에 정의된 바대로, 이러한 핵산은 바람직하게는 단리되거나 정제된다.

제1 양태에서, 본 발명의 핵산은 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열로서,

티오레독신을 코딩하는 제1 핵산 서열;

관심 대상 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 제2 핵산 서열; 및

천연 이종성 막 단백질의 막관통 서열을 코딩하거나 이 천연 이종성 막 단백질로부터 유도된 제3 핵산 서열을 포함하되,

상기 제2 폴리펩타이드 서열이 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 다수의 잔기를 갖되, 적어도 9개의 연속 잔기가 소수화도 스코어가 약 0.7 이상인 알파 나선을 형성하는 것으로 예상되며,

상기 핵산 서열이, 핵산이 발현될 때, 티오레독신이 막관통 서열의 N 말단에서 발현되도록 구성된 핵산 서열을 갖는다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 발현 시스템에서 이러한 핵산의 사용을 촉진하는 하나 이상의 추가의 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이러한 핵산 서열은 발현 조절 서열, 예컨대 프로모터 서열 및 발현 벡터를 제공하도록 이러한 핵산에 작동적으로 연결된 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있다. 또 다른 추가의 핵산 서열은 친화도 마커, 검출 마커 및/또는 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 이 목록은 제한으로 의도되지 않는다.

다양한 실시양태에서, 이러한 벡터에서의 핵산 서열의 순서는 융합 단백질에서 N 말단에서 C 말단으로의 발현 순서가 티오레독신 - 관심 대상 폴리펩타이드 서열 - 막관통 서열; 또는 티오레독신 - 친화도 마커 - 프로테아제 절단 부위 - 관심 대상 폴리펩타이드 서열 - 막관통 서열; 티오레독신 - 프로테아제 절단 부위 - 관심 대상 폴리펩타이드 서열 - 막관통 서열; 또는 티오레독신 - 막관통 서열 - 관심 대상 폴리펩타이드 서열; 또는 티오레독신 - 친화도 마커 - 프로테아제 절단 부위 - 막관통 서열 - 관심 대상 폴리펩타이드 서열; 또는 티오레독신 - 프로테아제 절단 부위 - 막관통 서열 - 관심 대상 폴리펩타이드 서열이도록 구성된다. 각각의 경우에, 이러한 핵산 서열은 바람직하게는 발현 벡터이고, 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다.

하기 기재된 것처럼, 재조합으로 발현시키고자 하는 서열 내 희귀 코돈을 아미노산 서열을 변경함이 없이 숙주 시스템의 코돈 바이어스를 더 가깝게 반영하는 것으로 대체함으로써("코돈 최적화"라 칭함) 발현 숙주에 대해서 이종성인 단백질 서열의 발현이 대개 개선될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 핵산의 적어도 일부를 코돈 최적화한다. 예의 방식으로, 이. 콜라이를 발현을 위한 종으로 선택할 때, 상기 기재된 하나 이상의 제1, 제2 및 제3 핵산 서열이 이. 콜라이에 존재하는 것으로 알려진 코돈 바이어스를 차지하도록 코돈 최적화된다.

다양한 실시양태에서, 관심 대상 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 제2 핵산 서열은 항원 서열, 폴리펩타이드 표적화 리간드(예를 들면, 본 명세서에서 "수용체"라 칭하는 표적에 결합하는 항체 또는 다른 아미노산 서열), 융합성 폴리펩타이드 서열 등(티오레독신 및 막관통 서열 둘 다에 이종성임)을 코딩할 수 있다.

관련 양태에서, 본 발명은 이러한 핵산 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 특정한 양태에서, 벡터에 의해 코딩된 선택 가능한 마커 및 숙주 세포에 의해 발현된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 사용하여 형질전환된 숙주 세포를 선택할 수 있다. 임의로, 융합 단백질을 숙주 세포로부터 분리하고 수성 매질 중에 정제할 수 있다. 이후, 관심 대상 폴리펩타이드 서열이 리포솜 표면에서 디스플레이되도록 이 융합 단백질을 상기 기재된 바대로 리포솜으로 도입할 수 있다.

본 발명은 이의 적용 시 하기 상세한 설명에 기재되거나 도면에 도시된 구성성분의 상세한 구성의 및 배치로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 실시양태를 다양한 방식으로 또한 기술하거나 실행하거나 수행할 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 어법 및 전문용어 및 요약서가 설명 목적을 위한 것이고 제한으로 고려되어서는 안 되는 것으로 이해되어야 한다.

그러므로, 당업자는 이 개시내용이 기초하는 개념이 본 발명의 몇몇 목적을 실행하기 위한 다른 구조, 방법 및 시스템을 설계하는 데 기초로서 쉽게 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 특허청구범위가 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 한 이러한 동등한 구성을 포함하는 것으로 생각되는 것이 중요하다.

도 1 내지 도 10은 문헌[Esienberg et al., J. Mol. Biol. (1984) 179:125-142]의 방법론을 이용하여 계산된 본 발명을 실행하기 위해 사용되는 다양한 폴리펩타이드 막관통 서열의 소수화도 도면을 도시한 것이다.

"투여"는, 이 용어가 인간, 포유동물, 포유동물 피험체, 동물, 수의 피험체, 위약 피험체, 조사 피험체, 실험 피험체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체에 적용되면서, 제한 없이 피험체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체 등에 대한 외인성 리간드, 시약, 위약, 소분자, 약제학적 물질, 치료학적 물질, 진단제 또는 조성물의 접촉을 의미한다. "투여"는 예를 들면 치료학적, 약동학적, 진단학적, 조사, 위약 및 실험 방법과 관련될 수 있다. 세포의 치료는 시약과 세포의 접촉 및 시약과 유체(여기서, 유체는 세포와 접촉함)의 접촉을 포함한다. "투여"는 또한 예를 들면 시약, 진단, 결합 조성물 또는 다른 세포에 의한 세포의 실험실내 및 생체외 치료를 포함한다.

"효능제"는, 이 용어가 리간드 및 수용체와 관련되면서, 수용체를 자극하는 분자, 분자 조합, 복합체 또는 시약 조합을 포함한다. 예를 들면, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)의 효능제는 GM-CSF, GM-CSF의 무테인 또는 유도체, GM-CSF의 펩타이드 모방체, GM-CSF의 생물학적 기능을 모방하는 소분자 또는 GM-CSF 수용체를 자극하는 항체를 포함할 수 있다.

"길항제"는, 이 용어가 리간드 및 수용체와 관련되면서, 수용체를 억제하고/하거나, 대응하고/하거나, 하향조절하고/하거나, 탈감각화하는 분자, 분자 조합 또는 복합체를 포함한다. "길항제"는 수용체의 구성적 활성을 억제하는 임의의 시약을 포함한다. 구성적 활성은 리간드/수용체 상호작용의 부재 하에 증명되는 것이다. "길항제"는 또한 수용체의 자극된(또는 조절된) 활성을 억제하거나 예방하는 임의의 시약을 포함한다. 예의 방식으로, GM-CSF 수용체의 길항제는, 임의의 제한을 의도함이 없이, 리간드(GM-CSF)에 결합하고 이것이 수용체에 결합하는 것을 막는 항체 또는 수용체에 결합하고 리간드가 수용체에 결합하는 것을 막는 항체를 포함하고, 이 항체는 불활성 형태의 수용체를 잠근다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 의미한다. 보존적 치환의 예는 하기 그룹 중 하나의 아미노산의 동일한 그룹의 다른 아미노산에 대한 교환이다(미국 특허 제5,767,063호(Lee 등에 등록 허여); Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132).

(1) 소수성: 노르류신, Ile, Val, Leu, Phe, Cys, Met;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) 사슬 기원에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe; 및

(7) 작은 아미노산: Gly, Ala, Ser.

"유효량"은, 제한 없이, 증상 또는 의학 병증 또는 장애의 징후를 경감, 역전, 완화, 예방 또는 진단할 수 있는 양을 포함한다. 달리 기재되지 않은 한, 명확히 또는 문맥상, "유효량"은 병증을 경감하기에 충분한 최소량으로 제한되지 않는다.

"유전자"는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드는 생물학적 활성, 항원 활성, 생물학적 불활성 또는 항원 불활성 등일 수 있다. 용어 유전자는 예를 들면 특이적 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)의 합; ORF + 핵산을 코딩하는 인트론의 합; ORF 및 작동적으로 연결된 프로모터(들)의 합; ORF 및 작동적으로 연결된 프로모터(들) 및 임의의 인트론의 합; ORF 및 작동적으로 연결된 프로모터(들), 인트론(들), 및 프로모터(들) 및 다른 조절 요소, 예컨대 인핸서(들)의 합을 포함한다. 특정 실시양태에서, "유전자"는 유전자의 발현을 조절하기 위한 시스 형태로 필요한 임의의 서열을 포함한다. 용어 유전자는 또한 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 항원 또는 항원 활성 단편을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산을 의미할 수 있다. 용어 유전자는 코딩된 펩타이드 또는 단백질이 임의의 생물학적 활성을 갖거나, 심지어 이 펩타이드 또는 단백질이 항원 활성이라는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 비발현성 서열을 코딩하는 핵산 서열은 유전적으로 슈도유전자로 생각된다. 용어 유전자는 또한 rRNA, tRNA 또는 리보자임과 같은 리보핵산을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

"리간드"는 수용체의 효능제 또는 길항제인 소분자, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 막 관련 또는 막 결합 분자를 의미한다. "리간드"는 또한 효능제 또는 길항제가 아닌 결합제를 포함하고, 효능제 또는 길항제 특성을 갖지 않는다. 관례상, 리간드가 제1 세포에 막 결합하는 경우, 수용체는 일반적으로 제2 세포에서 발생한다. 제2 세포는 제1 세포와 동일한 일체성(동일한 명칭)을 가질 수 있거나, 상이한 일체성(상이한 명칭)을 가질 수 있다. 리간드 또는 수용체는 전부 세포내 있을 수 있고, 즉 이것은 시토졸, 핵 또는 몇몇 다른 경우 세포내 구획 내 존재할 수 있다. 리간드 또는 수용체는 예를 들면 세포내 구획으로부터 혈장 막의 외면으로 이의 위치를 변경할 수 있다. 리간드 및 수용체의 복합체를 "리간드 수용체 복합체"라 칭한다. 리간드 및 수용체가 신호전달 경로에 관여하는 경우, 리간드는 신호전달 경로의 상류 위치에서 생기고, 수용체는 하류 위치에 생긴다. 리간드는 항체일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "항체"는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편으로부터 유도되거나, 이후에 모델링되거나, 실질적으로 이들에 의해 코딩된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들면, 문헌[Fundamental Immunology, 3rd Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994; J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97]을 참조한다. 용어 항체는 (ⅰ) VL, VH, CL 및 CHl 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ⅱ) 힌지 영역에서 이황화 연결에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ⅲ) VH 및 CHl 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (ⅳ) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (ⅴ) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (ⅵ) 단리된 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하는 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항원-결합 부분, 즉 "항원 결합 부위"(예를 들면, 단편, 하위서열, 상보성 결정 부위(CDR))를 포함한다. 단일 사슬 항체는 또한 용어 "항체" 내에 참조문헌으로 포함된다.

"핵산"은 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이들의 중합체를 의미한다. 핵산의 비제한적인 예는 예를 들면 cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드이다. 특정한 핵산 서열은 또한 함축적으로 "대립유전자 변이체" 및 "스플라이스 변이체(splice variant)"를 포함할 수 있다.

"작동적으로 연결된"은, mRNA를 코딩하는 프로모터 및 핵산의 문맥 내에서, 프로모터가 핵산의 전사를 개시하는 데 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

용어 "서열 일체성 백분율" 및 "서열 일체성(%)"은 2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열의 비교 또는 정렬에 의한 서열 유사성의 백분율을 의미한다. 서열을 정렬하여, 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 일치 수를 계산하고, 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 그 결과에 100을 곱해, 2개의 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교하여 일체성(%)을 결정할 수 있다. 일체성(%)을 계산하기 위한 알고리즘은 스미스 워터만(Smith-Waterman) 상동성 조사 알고리즘이다(예를 들면, 문헌[Kann and Goldstein (2002) Proteins 48:367-376; Arslan, et al. (2001) Bioinformatics 17:327-337] 참조).

"정제된" 및 "단리된"은, 폴리펩타이드를 언급할 때, 폴리펩타이드가 자연에서 이것이 관련되는 다른 생물학적 거대분자가 실질적으로 부재한다는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "정제된"은 확인된 폴리펩타이드가 존재하는 폴리펩타이드의 적어도 50%, 더 종종 적어도 60%, 통상적으로 적어도 70%, 더 통상적으로 적어도 75%, 가장 통상적으로 적어도 80%, 일반적으로 적어도 85%, 더 일반적으로 적어도 90%, 가장 일반적으로 적어도 95%, 및 관습적으로 적어도 98중량% 이상을 차지한다는 것을 의미한다. 물, 완충제, 염, 세제, 환원제, 프로테아제 억제제, 안정화제(첨가된 단백질, 예컨대 알부민을 포함), 및 부형제, 및 분자량이 1000 미만인 분자의 중량은 폴리펩타이드 순도 결정에서 일반적으로 이용되지 않는다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제6,090,611호(Covacci 등에 등록 허여)의 순도 기재 참조]을 참조한다.

"펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 서로 결합된 짧은 아미노산 서열을 의미한다. 펩타이드는 유리로 존재하거나, 다른 모이어티, 예컨대 거대분자, 지질, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드 및/또는 폴리펩타이드에 결합될 수 있다. 펩타이드가 폴리펩타이드 사슬에 도입된 경우, 용어 "펩타이드"는 구체적으로 짧은 아미노산 서열을 의미하기 위해 여전히 사용될 수 있다. "펩타이드"는 펩타이드 결합 또는 몇몇 다른 형태의 연결에 의해 다른 모이어티에 연결될 수 있다. 펩타이드는 길이가 적어도 2개인 아미노산이고, 일반적으로 길이가 약 25개 미만인 아미노산이고, 최대 길이는 관습 또는 문맥의 기능이다. 용어 "펩타이드" 및 "올리고펩타이드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

"단백질"은 일반적으로 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. 단백질은 또한 폴리펩타이드의 3차원 구조를 의미할 수 있다. "변성 단백질"은 몇몇 잔여 3차원 구조를 갖는 부분 변성 폴리펩타이드, 또는 대안적으로, 필수적으로 랜덤인, 즉 완전 변성인 3차원 구조를 갖는 부분 변성 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명은 예를 들면 글리코실화, 포스포릴화, 황산화, 이황화 결합 형성, 탈아마이드화, 이성질체화, 신호 또는 리더 서열 가공의 절단점, 공유 및 비공유 결합 보조인자, 산화된 변이체 등을 포함하는 폴리펩타이드 변이체의 시약 및 이의 사용 방법을 포함한다. 이황화 연결 단백질의 형성이 기재되어 있다(예를 들면, 문헌[Woycechowsky and Raines (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:533-539; Creighton, et al. (1995) Trends Biotechnol. 13:18-23] 참조).

"재조합"은, 예를 들면 핵산, 세포, 동물, 바이러스, 플라스미드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 벡터 등을 언급할 때 사용될 때, 외인성 비자연 핵산의 도입, 자연 핵산의 변경, 또는 전체적으로 또는 부분적으로 재조합 핵산, 세포, 바이러스, 플라스미드, 또는 벡터로부터의 유도체화에 의한 변형을 나타낸다. 재조합 단백질은 예를 들면 재조합 핵산, 바이러스, 플라스미드, 벡터 등으로부터 유도된 단백질을 의미한다. "재조합 박테리아"는 게놈이 재조합 방법, 예를 들면 돌연변이, 결실, 삽입 및/또는 재배열에 의한 조작된 박테리아를 포함한다. "재조합 박테리아"는 또한 재조합 게놈외(extra-genomic) 핵산을 포함하도록 변형된 박테리아, 예를 들면, 플라스미드 또는 제2 염색체, 또는 기존의 게놈외 핵산이 변경된 박테리아를 포함한다.

"선택 가능한 마커"는 선택 가능한 마커를 포함하는 세포에 선택하거나 이에 대항하여 선택하도록 하는 핵산을 포함한다. 선택 가능한 마커의 예는, 제한 없이, 예를 들면: (1) 달리 독성 화합물(예를 들면, 항생제)에 내성을 제공하는 생성물을 코딩하거나, 달리 해롭지 않은 화합물(예를 들면, 수크로스)에 감수성을 코딩하는 핵산; (2) 수용자 세포에서 달리 결여된 생성물(예를 들면, tRNA 유전자, 영양요구성 마커(auxotrophic marker))을 코딩하는 핵산; (3) 유전자 생성물의 활성을 억제하는 생성물을 코딩하는 핵산; (4) 쉽게 확인될 수 있는 생성물(예를 들면, 표현형 마커, 예컨대 베타-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP), 세포 표면 단백질, 에피토프 태그, 플래그(FLAG) 태그)을 코딩하는 핵산; (5) 하이브리드화 기술, 예를 들면, PCR 또는 분자 비콘(beacon)에 의해 확인될 수 있는 핵산을 포함한다.

"특이적으로" 또는 "선택적으로" 결합한다는, 리간드/수용체, 핵산/보체 핵산, 항체/항원 또는 다른 결합 쌍(예를 들면, 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인)을 언급할 때, 단백질 및 다른 생물의약품의 이종성 집단에서 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 지정된 조건 하에, 특이적 리간드는 특정한 수용체에 결합하고 상당한 양으로 샘플에 존재하는 다른 단백질에 결합하지 않는다. 특이적 결합은 또한 예를 들면 고려된 방법의 항체의 항원-결합 부위로부터 유도된 결합 화합물, 핵산 리간드, 항체, 또는 결합 조성물이 임의의 다른 결합 화합물과의 친화도보다 종종 적어도 25% 초과, 더 종종 적어도 50% 초과, 가장 종종 적어도 100%(2배) 초과, 보통 적어도 10배 초과, 더 보통 적어도 20배 초과, 가장 보통 적어도 100배 초과인 친화도로 이의 표적에 결합한다는 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "피험체"는 인간 또는 비인간 유기체를 의미한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 인간 및 수의 질환 둘 다에 적용 가능하다. 특정 실시양태에서, 피험체는 "환자", 즉 질환 또는 병증의 의학 관리를 받는 살아 있는 인간이다. 이는 병리학 징후가 조사되는 확인된 질병이 없는 사람을 포함한다. 기존의 플라스모디움(plasmodium) 감염을 갖는 피험체가 바람직하다.

"치료학적 유효량"은 환자 이익을 나타내기에, 즉 치료하고자 하는 병증의 증상의 감소, 예방 또는 경감을 발생시키기에 충분한 시약 또는 약제학적 조성물로 정의된다. 물질 또는 약제학적 조성물이 진단제를 포함할 때, "진단학적 유효량"은 신호, 이미지 또는 다른 진단 매개변수를 생성하기에 충분한 양으로 정의된다. 약제학적 제제의 유효량은 개인의 감수성 정도, 개인의 성별, 성별 및 체중 및 개인의 특이적 반응과 같은 인자에 따라 변한다(예를 들면, 미국 특허 제5,888,530호(Netti 등에 등록 허여) 참조).

(병증 또는 질환과 관련하여) "치료" 또는 "치료하는"은 바람직하게는 임상 결과를 포함하는 유리한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 질환과 관련하여 유리한 또는 원하는 결과는 질환 및/또는 생명 연장으로 고생하는 사람의 질환과 관련된 병증 개선, 질환 치유, 질환의 중증도 감소, 질환의 진행 지연, 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 경감, 삶의 질의 증가 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 마찬가지로, 본 발명의 목적을 위해, 병증과 관련하여 유리한 또는 원하는 결과는 병증 개선, 병증 치유, 병증의 중증도 감소, 병증의 진행 지연, 병증과 관련된 하나 이상의 증상의 경감, 병증 및/또는 생명 연장으로 고생하는 사람의 삶의 질 증가 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

"백신"은 예방 백신을 포함한다. 백신은 또한 치료 백신, 예를 들면 백신에 의해 제공된 항원 또는 에피토프와 관련된 병증 또는 장애를 포함하는 포유동물에게 투여되는 백신을 포함한다.

백신 제제의 목표는 관심 대상 항원을 보유하는 병원균, 종양 세포 등에 신속히 반응하는 기억 T 세포 및 B 세포의 충분한 집단을 생성시킬 수 있는 항원 및 아쥬번트의 조합을 제공하는 것이다. 본 발명은 이 목표를 충족할 수 있는 리포솜 백신 조성물을 제공하는 방법, 이의 제조 방법 및 동물에서 면역 반응을 자극하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.

인플루엔자 및 헤르페스 바이러스 백신과 관련하여 하기 자세히 기재되어 있지만, 당해 분야의 당업자는 이 예시적인 실시양태가 제한을 의미하지 않는다는 것을 이해할 것이다.

미국에서 계절성 독감("계절 독감" 또는 "인간 독감"이라고도 함)은 매년 대략 36,000명의 사망자 및 200,000명 초과의 입원환자를 생성시키는 것으로 보고되고 있다. 이는 인플루엔자 전염병이 통상적으로 겨울마다 생기므로 "계절성"이라 불린다. 북반구 및 남반구에서 다른 때에 발생하는 2가지 독감 계절이 존재한다. 전세계적으로, 계절성 인플루엔자는 매년 250,000 내지 500,000명의 사람을 죽이는 것으로 예상된다. 65살 이상의 성인에서 선진국에서의 대부분의 사망이 발생한다. 계절 독감은 미국에서 7번째 주요 사망 원인이고, 미국 단독의 이의 경제적 비용은 80십억불이 넘는 것으로 예상된다. 3가지 유형의 계절성 인플루엔자 A, B 및 C가 존재한다. 아마도 가장 치명적인 계절성 독감 발생은 1918년 독감 유행병(스페인 독간 유행병; A형 인플루엔자, H1N1 아류)으로, 1918년 내지 1919년에 걸친다. 이러한 발생으로 사망한 개인의 추정수는 20 내지 100백만명의 사람 범위이다.

인플루엔자 A 바이러스("IAV")는 바이러스의 많은 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae) 패밀리이다. 인플루엔자 A 바이러스는 단일 가닥, 분절, 네가티브 센스 RNA 게놈을 포함한다. 8개의 RNA 분절은 하기와 같다:

바이러스 혈구응집소를 코딩하는 "HA"(혈구응집소의 약 500개의 분자가 하나의 비리온을 만드는 데 필요하다);

바이러스 뉴라미니다제를 코딩하는 "NA"(약 100개의 분자의 뉴라미니다제가 하나의 비리온을 만드는 데 필요하다);

바이러스 핵단백질을 코딩하는 "NP";

동일한 RNA 분절로부터 상이한 리딩 프레임을 사용함으로써 2개의 기질 단백질 M1 및 M2(후자는 바이러스 엔벨로프에서 이온 채널임)를 코딩하는 "M"(약 3000개의 매트릭스 단백질 분자가 하나의 비리온을 만드는 데 필요하다);

동일한 RNA 분절로부터 상이한 리딩 프레임을 사용함으로써 비구조 단백질 NS1 및 NEP를 코딩하는 "NS";

바이러스 RNA 중합효소를 코딩하는 "PA";

동일한 RNA 분절로부터 상이한 리딩 프레임을 사용함으로써 PB1-F2 단백질과 함께 다른 RNA 중합효소를 코딩하는 "PB1"; 및

RNA 중합효소를 코딩하는 "PB2".

따라서, IAV 게놈은 11개의 단백질(HA, NA, NP, M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2)을 코딩한다. IAV는 통상적으로 H(헤마글루티닌) 수 및 N(뉴라미니다제) 수에 따라 생기는 명명법인 아류로 분류된다. 새로운 인플루엔자 바이러스는 돌연변이 또는 게놈 재편성에 의해 계속해서 진화한다. IAV 게놈은 상이한 바이러스 균주 사이의 전체 유전자의 교환을 허용하는 게놈의 분절화 특성과 함께, 고유한 높은 돌연변이 속도로 인해, 고도로 성형된다. 이는 IAV 백신의 매년 재구성을 요하는 연속 항원 변이를 나타내는 바이러스를 생성시킨다.

현재의 백신에 의해 생성된 보호 면역 반응은 대부분 바이러스 혈구응집소(HA) 및 뉴라미니다제(NA) 단백질에 기초하는 것으로 생각된다. 암탉 수정란에서 바이러스를 성장시킨 후, 바이러스를 사멸하거나 생 바이러스를 약독화시켜 미국 및 전세계에 걸쳐 사용되는 인플루엔자 백신을 제조한다. IAV 백신을 생성하기 위한 이 수정란 기반 기술은 1950년대에 생성되었다. 현재의 백신 생성 표적을 성취하기 위해, 수백만개의 11일령의 수정란은 매일 생성이 가능해야 한다. IAV에서의 연속 항원 변이로 인해, 현재의 계절 독감에 기초한 백신은 미래의 계절 독감의 경우의 업적에 따라 달라지지 않는다. 관련 독감 균주에 대한 여러 교차 예방이 있을 수 있지만, 임의의 미래의 유행성 독감 바이러스 균주에 특이적으로 생성된 백신으로부터 최고로 예방된다.

H5N1 백신 생성과 관련된 문제점은 전체 생성 용량 결여 및 급등 생성 용량 결여(이는 대기 기준으로 수억개의 11일령의 특수 수정란에 따라 달라지는 시스템을 개발하는 데 비현실적이다)를 포함한다.

현대의 분자 생물학 기술에 기초한 몇몇 IAV 백신은 초기 병기 임상 실험을 시작하였다. 바이러스 혈구응집소(HA) 및 뉴라미니다제(NA) 단백질과 관련된 이러한 여러 백신이 기재되어 있지만, NP 및 M2 단백질로부터의 항원과 같은 신규한 표적이 또한 조사되었다.

단순 포진 바이러스는 바이러스의 헤르페스비리다에(Herpesviridae) 패밀리의 구성원이다. 2형 단순 포진 바이러스(HSV2)에 의해 야기되는 성기 포진은 인간에서 가장 흔한 성 매개 질환 중 하나이다. 역학 연구는 매 6명 중 1명만큼 많은 미국 성인이 HSV2로 감염된다는 것을 나타낸다. 이 질환은 정상 성인과 면역억제된 성인 둘 다에 영향을 미치고, 인간 면역결핍증 바이러스(HIV)에 의한 감염의 감수성 증가와 관련된다. 심각한 임상 질환이 감염된 엄마로부터 HSV2의 전달 후 이의 신생아에서 발생할 수 있고, 이 엄마는 비감염 여성보다 자궁경부암이 발생할 가능성이 더 많다. HSV2 전달에 기여하는 주요 인자는 임상 증상 부재 하에 생식관으로부터 바이러스의 보관이다. 현재, 이 질환의 전파를 예방하는 효과적인 백신이 이용 가능하지 않다. 아단위 단백질계 항원을 포함하는 몇몇 HSV2 백신 후보물질은 HSV2에 의한 감염 또는 임상 질환에 대해 보호 면역을 제공하는 목표를 성취하지 못한다. 시험된 백신 후보물질의 성공적스럽지 못한 결과, HSV2로 감염된 사람이 감염 HIV에 더 감수성이라는 인식 및 바이러스 보관이 대개 HSV2의 "임상적으로 무증상" 운반체에서 발생한다는 사실의 견지에서, 새로운 면역화 전략을 비롯한 HSV2 질환 관리에 대한 새로운 접근법을 개발하기 위한 노력이 중요한 건강관리 목적에 남아 있다.

B 및 D 당단백질(각각 gB 및 gD)의 재조합 형태를 포함하는 2개의 상이한 HSV2 백신을 3상 임상 실험에서 시험하였다. 이 백신 포함 재조합 HSV2 gB 및 gD 중 하나는, 아쥬번트 MF59와 배합되어, 단백질의 수중유 에멀션을 생성한다. 백신은 백신접종된 수용자에서 고수준의 HSV2 특이적 중화 항체를 자극하지만, 제1 임상 삽화 또는 감염의 재활성화의 후속 빈도의 기간에 미치는 유의적인 효과가 관찰되지 않아, 이 백신이 특히 효과적이지는 않다는 것을 제시한다. 제2 HSV2 백신은 HSV2 gD 및 수산화알루미늄 및 3-데아실화 모노포스포릴 리피드 A를 포함하는 아쥬번트 시스템, AS04로 이루어진다. 예비 결과는 이 백신이 증상적 HSV2 성기 포진의 발생을 예방하기 위해 HSV1 음성 혈청 (남성이 아닌) 여성에서 효과적이라는 것을 제시하지만, 더 큰 연구로부터의 최근의 결과는 초기 발견을 확신시키지 못한다. GSK HSV2 gD계 백신의 예상치 못한 실패는 효과적인 HSV2 백신을 개발하기 위한 표적으로서 gD 항원의 역할에 대한 추가의 추측을 확실히 발생시킨다.

이 백신 제제의 임상 실패의 원인인 많은 가능한 인자가 있다. 가장 명확한 것 중 하나는 gD 항원은 단독으로 이종성 인간 집단에 완전 보호 면역을 제공하는 데 필요한 에피토프를 포함하지 않는다는 것이다. 인간 및 마우스에서의 연구는 CD8 및 CD4 T 세포가 HSV2 감염의 조절에 중요하다는 것을 나타낸다. gD 에피토프가 인간 CD4 T 세포에 의해 인식되면서, gD 특이적 CD8 T 세포가 관찰되지 않았다. 최근에, HSV1 양성 혈청 개인으로부터 얻은 47개의 새로운 CD8 T 세포 에피토프가 확인되었고, 이 CD8 T 세포 중 어느 것도 gD에 반응하지 않았다. 이 연구는 gD 단백질이 중화 항체를 생성하고 CD4 T 세포를 자극할 수 있지만, 잠복 감염 세포의 청소 또는 제어와 가장 관련되는 강한 CD8 T 세포 반응을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다. CD8 T 세포 없이, gD 백신은 단독으로 인간에서 HSV2 감염에 대한 보호 면역 반응을 자극할 수 없는 것으로 보인다. 제2 가능성은 사용된 아쥬번트 시스템이 보호 면역 반응을 자극하는 데 최적이 아닐 수 있다는 것이다. 임상으로 시험된 제제가 강한 세포 면역 반응 아쥬번트 를 도입하지 않는다. 마지막으로, 특정 요법에서 HSV2 풍토병의 균주의 약간의 차이에 의해 야기된 교차 보호의 잠재적 결여와 같은 다른 인자가 gD계 백신의 전체 효능에 또한 역할을 한다. 종합하면, HSV2 백신 후보물질의 실패에 대한 모든 가능한 이유를 해소하는 것을 목표로 하는 연구는 현재까지 진정한 효과적인 HSV2 백신을 확인하기 위한 상당한 노력을 요한다.

이전에, 리포솜 HSV2 gD_1-306 백신(L-gD_1-306-HD)을 질내(암컷) 또는 직장내(수컷 또는 암컷) 공격의 급성 쥐과 HSV2 감염 모델에서 시험하였다(Olson et al., Vaccine 28: 548-560, 2009(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)). 용량마다 60㎍의 gD_1-306-HD 및 15㎍의 모노포스포릴 리피드 A(MPL)를 포함하는 L-gD_1-306-HD의 2 용량은 HSV2 질내 공격에 대해 보호를 제공하는 것으로 보고되어 있다(86 내지 100%의 생존율, 대조군 리포솜에 대해 P≤0.0003; MPL이 없는 L-gD_1-306-HD에 대해 P=0.06). L-gD_1-306-HD/MPL로 면역화된 수컷 및 암컷 마우스(BALB/c 및 C57BL/6) 둘 다 HSV2 직장내 공격에 대해 상당히 보호되고, 생존율이 대조군과 비교하여 더 높다(71 내지 100%, P≤0.007). L-gD_1-306-HD/MPL은 또한 L-gD_264-285-HD/MPL인 리포솜 펩타이드 백신(수컷 BALB/c, P≤0.001; 암컷 BALB/c 및 수컷 C57BL/6, P=0.06)과 비교할 때 생존율 증가를 제공한다. L-gD_1-306-HD/MPL을 투여받은 마우스는 또한 암컷에서 최소 질환 징후, 이의 척수에서 바이러스 부담 감소 및 중화 항체 역가 상승을 갖는다. 백신은 또한 IL-4(P≤0.01)와 비교하여 상당히 증가된 수준의 IFN-γ를 갖는 수컷 및 암컷 마우스 둘 다의 gD_1-306-HD 특이적 지라세포를 자극하여, Th1 반응이 증대되었다는 것을 나타낸다.

상기 기재된 바대로, 본 발명의 리포솜 제제는 다이미리스토일포스파티딜콜린("DMPC")을 다이미리스토일포스파티딜글라이세롤("DMPG"), 다이미리스토일트라이메틸암모늄 프로판("DMTAP"), 또는 DMPG 및 DMTAP 둘 다 및 하나 이상의 스테롤과 함께 사용하여 제조된 리포솜을 포함한다. 리포솜 성분은 천연 또는 합성일 수 있다. 스테롤은 스테로이드 알코올로도 공지되어 있다. A 고리의 3번 위치에서 하이드록실 기를 갖는 스테로이드의 하위그룹이 존재한다.

또한, 이 리포솜 제제는 항원 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "항원 폴리펩타이드"는 수용자 동물에 외래인 적어도 하나의 항원 에피토프를 포함하고, 본 명세서에 기재된 리포솜 제제를, 전체로 또는 부분적으로, 사용하여 동물에게 전달시 항원 특이적 항체의 형성 및/또는 항원 특이적 T 세포 반응을 자극하는 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명을 실행시 사용할 수 있는 항원 폴리펩타이드는, 오직 예의 방식으로, 바이러스 병원균, 박테리아 독소, 박테리아 병원균, 진균 병원균, 암 세포로부터 유도될 수 있다. 바람직한 항원 펩타이드는 IAV M2 단백질 세포외 도메인으로부터 유도된 잔기 및/또는 HSV2 gD 단백질, DNA 패키징 외피 단백질, 외피 단백질 VP11/12, 핵 제거 라미나 단백질 및/또는 엔벨로프 당단백질 L 기원의 잔기를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바대로, 본 발명의 항원 폴리펩타이드는, 관심 대상 항원 서열 이외에, 적합한 소수성 도메인을 포함한다. 적합한 항원 서열의 예는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 서열, IAV M2 단백질 서열, 외피 숙주 셧오프 단백질, 외피 단백질 VP13/14, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 아단위 1, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 아단위 2, 외외피 단백질 VP11/12, 엔벨로프 당단백질 B, DNA 패키징 외외피 단백질, 핵 제거 라미나 단백질, 다기능 발현 제어인자, 전사 제어인자, 감염된 세포 단백질 8, 단일 가닥 DNA-결합 단백질, 캡시드 성숙 프로테아제, 엔벨로프 당단백질 I로 이루어진 군으로부터 선택된백질로부터 얻은 HSV2 단백질 서열을 포함한다. 도 1 내지 도 10은 아이젠버그 등(J. Mol. Biol. 179:125-142(1984))의 바람직하게는 본 발명에서 용도를 갖는 천연 단백질로부터의 다수의 예시적인 소수성 도메인의 소수화도 프로필을 도시한 것이다. 본 명세서에 예의 방식으로 제공된 이 소수성 도메인 서열 및 다른 서열은 사실상 오직 예시적이다. 이러한 또는 다른 소수성 서열을 보존적 아미노산 치환을 사용하여 변형하여 예를 들면 인간 사이토크롬 b5 막관통 도메인과 유사한 소수성 프로필을 갖는 추가의 합성 서열에 도달할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 9의 윈도우 크기, 엣지 100%의 상대 중량 및 선형 중량 변이의 매개변수를 이용하여 아이젠버그 등의 방법론을 이용하여 소수화도 프로필을 계산한다. 아미노산 스케일 값은 하기와 같다:

소수성 도메인 부분에 적합한 서열은 통상적으로 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 길이(약 15개 내지 30개의 잔기; 더 바람직하게는 약 18개 내지 25개의 잔기)를 갖고, 이의 적어도 9개의 연속 잔기는 소수화도(아이젠버그 스코어)가 약 +0.7인 알파 나선을 형성하는 것으로 예상된다. 용어 "약"은 이 문맥 내에서 소정의 측정의 ±10%를 의미한다. II형 및 III형 막 단백질은 막 삽입 및 토폴로지를 조절하는 절단 가능한 N 말단 신호 펩타이드가 결여되고, 대신 폴리펩타이드의 전좌를 중재하고 막에서 단백질을 고정하는 절단 가능한 신호 서열인 소수성 "신호 고정 서열"을 통해 번역후 막에 삽입한다.

융합 단백질:

상기 기재된 바대로, 이종성 막관통 서열에 면역성 폴리펩타이드 서열을 공유 결합시키는 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 항원 폴리펩타이드는 화학적으로 합성하거나 재조합 DNA 방법론을 이용하여 발현시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 항원 에피토프는 신호 고정 서열을 갖는 이종성 단일 통과 막 단백질로부터 막관통 서열을 갖는 융합 단백질의 일부로서 발현된다. 이러한 재조합 단백질은 바이러스 엔벨로프 단백질, 바이러스 코트 단백질, 박테리아 외부 막 단백질 및 진핵 막 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 항원 서열을 포함한다.

융합 단백질은 세포계 및 세포 유리 시스템에서 발현될 수 있다. 대규모 단백질 발현 및 정제의 경우, 박테리아 발현은 박테리아 균주 및 RBS(원핵 리보솜 결합 서열)에 따라 통상적으로 박테리아 또는 T7 프로모터의 조절 하에 흔히 사용된다. 스페이서 잔기에 의해 임의로 프랭킹된 또는 분리된 적합한 발현 조절 서열, 단백질 분해성 절단 부위 등에 작동적으로 연결된 관심 대상 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 적절한 벡터로 삽입한다(일반적으로, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨) 참조). 관심 대상 핵산은 (스페이서 또는 프레임워크 잔기와 함께 또는 이것 없이) 항원 폴리펩타이드로 궁극적으로 발현된다.

이. 콜라이는 본 발명의 항원 폴리펩타이드의 발현에 특히 유용한 원핵 숙주 중 하나이다. 사용에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 다른 엔테로박테리아세아(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라, 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스 종을 포함한다. 이 원핵 숙주에서, 숙주 세포와 상용성인 발현 조절 서열(예를 들면, 복제 기원)을 통상적으로 포함하는 발현 벡터를 또한 만들 수 있다. 또한, 임의의 다수의 많은 널리 공지된 프로모터가 람다 파지로부터의 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트리토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 프로모터 시스템에 존재한다. 프로모터는 통상적으로 임의로 작동유전자 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위해 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다.

효모와 같은 다른 미생물이 발현에 또한 사용된다. 사카로미세스(Saccharomyces)는 바람직한 숙주이고, 적합한 벡터는 원하는 경우 발현 조절 서열, 예컨대 프로모터, 예컨대 3-포스포글라이세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소 및 복제 기원, 종결 서열 등을 갖는다.

본 발명의 항원 폴리펩타이드를 발현하고 생성하기 위해 포유동물 조직 세포 배양물을 또한 사용할 수 있다(문헌[Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987] 참조). 바큘로바이러스 발현, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마에 대한 곤충 세포를 포함하여 비접촉 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었다. 이러한 세포를 위한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터, 및 인핸서(Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49-68 (1986)), 및 필요한 정보 처리 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 아데닐산중합반응 부위 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스 또는 거대세포 바이러스로부터 유도된 프로모터이다.

상이한 유기체는 종종 "코돈 바이어스"; 즉 유전자 코드에서 보이는 특정한 아미노산을 코딩하는 소정의 코돈이 유기체 사이에 상당히 변하는 정도를 나타낸다. 일반적으로, 유전자가 더 희귀한 코돈을 포함할수록, 이종성 단백질이 특이적 숙주 시스템 내에 합당한 수준으로 덜 발현될 것이다. 이러한 수준은 희귀한 코돈이 단백질의 N 말단 부분 또는 클러스터에서 보일 때 훨씬 낮다. 재조합으로 발현시키고자 하는 서열 내의 희귀한 코돈을 아미노산 서열을 변형함이 없이 숙주 시스템의 코돈 바이어스를 더 가깝게 반영하는 다른 코돈으로 대체하는 것("코돈 최적화"라 칭함)은 기능성 단백질 발현의 수준을 증가시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 임의의 비최적 코돈의 적어도 1%, 더 일반적으로 적어도 5%, 가장 일반적으로 적어도 10%, 종종 적어도 20%, 더 종종 적어도 30%, 가장 종종 적어도 40%, 일반적으로 적어도 50%, 더 일반적으로 적어도 60%, 가장 일반적으로 적어도 70%, 최적으로 적어도 80%, 더 최적으로 적어도 90%, 가장 최적으로 적어도 95%가 변경되어 최적 코돈을 제공하고, 관습적으로 임의의 비최적 코돈의 100%가 발현에 코돈 최적화된다. 유전자 최적화 도구, 예컨대 유전자 디자이너(Gene Designer) 2.0(DNA2.0), 옵티멈진(OptimumGene)(상표명)(GenScript), 옵티마이저(OPTIMIZER)(Puigbo et al., Nucl. Acids Res. 35 (Suppl 2): W126-31, 2007), 진옵티마이저(GeneOptimizer)(등록상표)(GeneArt), 진 컴포저(Gene Composer)(Lorimer et al., BMC Biotechnology 2009, 9:36 doi:10.1186/1472-6750-9-36) 및 미국 특허 제7,561,973호 및 제7,561,972호에 개시된 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 원하는 융합 단백질의 발현을 최적화하기 위해 사용될 수 있다.

관심 대상 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주 유형에 따라 달라진다. 예를 들면, 염화칼슘 형질감염이 원핵 세포에 흔히 이용되고, 인산칼슘 치료 또는 전기영동이 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다(일반적으로 상기 Sambrook 등의 문헌 참조).

특정 실시양태에서, 융합 단백질은 추가의 펩타이드 서열, 예컨대 친화도 마커, 검출 마커 및/또는 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 이러한 친화도/검출 마커의 예는 스트렙 태그(strep-tag), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), 티오레독신(Trx), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP), 폴리-His, FLAG, c-myc 및 혈구응집소(HA)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. GST, MBP, Trx, CBP 및 폴리-His는 각각 고정 글루타티온, 말토스, 페닐아르신 옥사이드, 칼모듈린 및 금속-킬레이트 수지에서 이의 동족(cognate) 융합 단백질의 정제가 가능하게 한다. 스트렙 태그, 플래그, c-myc 및 혈구응집소(HA)는 이 에피토프 태그를 특이적으로 인식하는 상업적으로 구입 가능한 단일클론 및 다중클론 항체를 사용하여 융합 단백질의 면역친화도 정제가 가능하게 한다. 다른 적합한 태그 서열은 당해 분야의 당업자에게 명확하다. 마찬가지로, 다양한 단백질 분해성 효소(예를 들면, 트립신, 서브틸리신, 서몰리신, 키모트립신, 파파인 등) 및 상응하는 프로테아제 절단 부위가 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의 단백질 분해성 효소는 Xa 인자, 엔테로키나제, 트롬빈, 담배 에치 바이러스 프로테아제(tobacco etch virus protease) 및 인간 리노바이러스 3C 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 도입된 프로테아제 절단 부위는 IEGR(서열 번호 55), DDDDK(서열 번호 56), LVPRGS(서열 번호 57), ENLYFQG(서열 번호 58) 및 LEVLFQGP(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이러한 융합 단백질은 폴리펩타이드 사이의 축합이라 불리는 화학 구조를 또한 포함할 수 있다. 2개의 폴리펩타이드 펩타이드 중 하나의 서열의 마지막 잔기가 다른 서열의 제1 잔기에 연결된 경우 "직접적으로" 축합된다. 2개의 폴리펩타이드가 펩타이드 중 하나의 서열의 마지막 잔기와 다른 서열의 제1 잔기 사이에 추가의 화학 구조(예컨대, 때때로 "링커" 잔기라 칭하는 추가의 아미노산)가 있는 경우 "간접적으로" 축합된다.

화학적 단백질 커플링

융합 단백질에 대한 대안으로서, 하나 이상의 항원 에피토프를 화학적으로 합성하거나, 신호 고정 서열을 갖는 이종성 단일 통과 막 단백질 및 화학 결합을 통해 커플링된 별개의 펩타이드로부터의 막관통 서열로부터 별도로 발현시킬 수 있다. 화학 가교결합제는 다양한 문헌 및 카달로그에 기재되어 있다. 예를 들면, 문헌[Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1991]을 참조한다. 이 시약은 펩타이드의 아미노산 측쇄에 커플링하는 작용기를 대개 이용한다. 가교결합제의 설계는 이용하고자 하는 기능성 모이어티의 선택을 포함한다. 기능성 모이어티의 선택은 가교결합하고자 하는 종에 이용 가능한 표적 부위에 따라 전적으로 달라진다. 몇몇 종(예를 들면, 단백질)은 표적화에 다수의 이용 가능한 부위(예를 들면, 라이신 ε-아미노 기, 시스테인 설프하이드릴 기, 글루탐산 카복실 기 등)를 제시할 수 있고, 관심 대상 생물학적 특성(예를 들면, 항체의 결합 친화도, 효소의 촉매 활성 등)을 잘 보존하기 위해 경험적으로 스테롤에 포함되기 위한 특정한 기능성 모이어티를 선택할 수 있다.

아민 기를 통한 커플링:

이미도에스터 및 N-하이드록시숙신이미딜("NHS") 에스터는 아민 특이적 기능성 모이어티로 통상적으로 사용된다. NHS 에스터는 1차 또는 2차 아민과의 반응시 안정한 생성물을 생성한다. 커플링은 생리학적 pH에서 효과적이고, NHS-에스터 가교결합제는 이의 이미데이트 대응물보다 용액 중에 더 안정하다. 균일 이작용성(homobifunctional) NHS-에스터 접합이 1단계 또는 2단계 반응에서 아민 함유 단백질을 가교결합하기 위해 흔히 사용된다. 1차 아민은 NHS-에스터의 주표적이다. 단백질의 N 말단에 존재하는 접근 가능한 α-아민 기가 NHS-에스터와 반응하여 아마이드를 형성한다. 그러나, 단백질 상의 α-아민이 항상 이용 가능한 것은 아니므로, 아미노산의 측쇄와의 반응이 중요해진다. 5개의 아미노산이 이의 측쇄에 질소를 갖지만, 라이신의 오직 ε-아미노 기가 NHS-에스터와 상당히 반응한다. NHS-에스터 가교결합제가 1차 아민과 반응할 때 공유 아마이드 결합이 형성되어, N-하이드록시숙신이미드를 방출한다.

설프하이드릴 기를 통한 커플링:

말레이미드, 알케닐 및 아릴 할라이드, α-할로아실 및 피리딜 다이설파이드가 설프하이드릴 특이적 기능성 모이어티로 통상적으로 사용된다. 말레이미드 기는 반응 혼합물의 pH가 pH 6.5 내지 7.5 사이에 유지될 때 설프하이드릴 기에 특이적이다. pH 7에서, 말레이미드와 설프하이드릴의 반응은 아민과의 반응보다 1000배 빠르다. 말레이미드는 티로신, 히스티딘 또는 메티오닌과 반응하지 않는다. 유리 설프하이드릴이 충분한 분량으로 존재하지 않을 때, 이용 가능한 이황화 결합의 환원에 의해 이것이 종종 생성될 수 있다.

카복실 기를 통한 커플링:

카보다이이미드는 카복실을 1차 아민 또는 하이드라지드에 커플링시켜, 아마이드 또는 하이드라존 결합을 형성한다. 카보다이이미드는 카보다이이미드와 커플링시키고자 하는 분자 사이에 가교 브릿지가 형성되지 않는다는 점에서 다른 접합 반응과 다르고; 오히려, 이용 가능한 카복실 기와 이용 가능한 아민 기 사이에 펩타이드 결합이 형성된다. 단백질의 카복시 말단 및 글루탐산 및 아스파르트산 측쇄를 표적화할 수 있다. 초과의 가교결합제가 존재하는 경우, 단백질이 카복실 및 아민 둘 다를 포함하므로, 중합반응이 발생할 수 있다. 가교 브릿지가 형성되지 않고, 아마이드 결합은 펩타이드 결합과 동일해서, 가교결합의 역전이 단백질 파괴 없이는 불가능하다.

비선택적 반응성 기:

광친화도 시약은 화학적으로 불활성이지만 자외선 또는 가시광선에 노출될 때 반응성이 되는 화합물이다. 아릴아지드는 250 내지 460㎚의 파장에서 광분해되어 반응성 아릴 나이트렌을 형성하는 광친화도 시약이다. 아릴 나이트렌은 비선택적으로 반응하여 공유 결합을 형성한다. 환원제가 아지도 기를 환원시킬 수 있으므로, 이를 주의해서 사용해야 한다.

아르기닌을 통한 커플링:

글라이옥살은 아르기닌 잔기의 구아니디닐 부분을 표적화하기 위한 유용한 화합물이다. 글라이옥살은 약알칼리 pH에서 아르기닌을 표적화한다. 라이신과의 약간의 교차 반응성(더 높은 pH에서 가장 큼)이 존재한다.

카보닐 기를 통한 커플링:

카보닐(알데하이드 및 케톤)은 pH 5 내지 7에서 아민 및 하이드라지드와 반응한다. 하이드라지드와의 반응은 아민보다 빨라, 이것이 부위 특이적 가교결합에 유용하게 한다. 카보닐은 단백질에 용이하게 존재하지 않지만; 나트륨 메타페리오데이트를 사용한 당 모이어티의 온화한 산화는 근처 하이드록실을 알데하이드 또는 케톤으로 전환시킨다. 환원 말단(들)을 갖는 탄수화물의 경우, 카보닐 기(들)은 하이드라진 모이어티에 반응성이어서 하이드라존 결합을 형성할 수 있다. S-HyNic는 HyNic(6-하이드라지노니코틴아마이드) 모이어티를 활성화된 에스터(즉, NHS)를 통해 유리 아미노 기를 거쳐 분자로 도입하기 위해 사용되는 비균일 이작용성(heterobifunctional) 링커이다. HyNic 하이드라진 링커의 첨가는 약간 산성인 완충제(100mM NaPO4, pH6)에서 접합물을 형성시킨다. 환원 말단을 갖는 탄수화물의 경우, CDAP 특이적 활성화를 이용할 수 있다. 온화한 조건(활성화의 경우 pH 9.5 및 접합의 경우 pH 7) 하에, 1-사이아노-4-다이메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트("CDAP")는 하이드록실 기를 사이아닐 에스터로 전환시켜, 아민 기의 존재 하에 카바메이트를 형성한다.

결합 화학에 임의로 포함된 중합체 물질은 바람직하게는 폴리(알케닐렌 옥사이드)이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "알케닐렌 옥사이드"는 -X-O-(여기서, X는 산소 O에 공유 결합된 알케닐렌 모이어티임)의 구조를 의미하고; 따라서 폴리(알케닐렌 옥사이드임)는 -(X-O-)_m)-의 구조를 의미한다. 폴리(알케닐렌 옥사이드) 중합체가 비분지 단독중합체(즉, 구조 -((CH₂)_n-O-)_m)-(여기서, n은 변하지 않음)의 구조의 중합체), 예컨대 에틸렌 글라이콜로부터 유도된 폴리(에틸렌 옥사이드)인 것이 바람직하다. 대안적인 중합체, 예컨대 다른 폴리알케닐렌 옥사이드 단독중합체(예를 들면, 메틸렌 옥사이드, 프로필렌 옥사이드, 아이소프로필렌 옥사이드 및 부틸렌 옥사이드 중합체) 및 폴리(알케닐렌 옥사이드)의 공중합체 또는 블록 공중합체를 또한 사용할 수 있다. PEG계 중합체가 사용되는 본 발명의 양태에서, 이것이 40 내지 1000 단량체 단위의 평균 길이(n)를 갖는 것이 바람직하다. 다른 단독중합체 및 공중합체에 대한 바람직한 평균 분자량에 도달하도록 당해 분야의 당업자가 다른 알케닐렌 옥사이드의 몰 당량을 용이하게 결정할 수 있다.

"수 평균" 방법을 이용하여 본 발명의 평균 분자량을 측정한다. 특정한 분자량(M_i)을 갖는 분자수가 N_i로 제공되는 상이한 분자량을 갖는 중합체 분자의 혼합물에서, 소정의 질량의 "수 평균" 확률은 하기와 같고,

수 균 분자량은 하기로 제공된다.

수 평균은 존재하는 분자의 전체 중량을 전체 분자수로 나눈 것을 나타내는 단순한 연산 평균이다. 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 방법 및 장치를 사용하여 증기압 삼투압법에 의해 중합체의 수 평균 분자량을 측정할 수 있다.

폴리(알케닐렌 옥사이드) 대신 사용될 수 있는 대안적인 중합체 물질은 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리사카라이드, 전분, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴 아마이드 또는 다른 유사한 중합체와 같은 물질을 포함한다. 당해 분야의 당업자는 상기내용이 단지 예시적이고 본 명세서에서 사용하기에 적합한 비항원 중합체 물질의 유형을 제한하도록 의도되지 않는다는 것을 인식할 것이다.

본 명세서에 사용되는 "투여"는, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 포함하는 동물과 관련하여, 피험체의 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체에 대한 외인성 시약의 전달을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 "유효량"은 의학 병증 또는 장애의 증상 또는 징후를 경감하거나, 반전시키거나, 완화시키거나, 예방할 수 있는 시약의 양을 의미한다. 달리 기재되지 않은 한, 명확히 또는 달리, "유효량"은 병증을 경감시키기에 충분한 최소량 또는 병증의 최적 또는 최대 경감을 발생시키는 양으로 제한되지는 않는다. "유효량"은, 백신 투여의 문맥 내에서, 포유동물에서 면역 반응을 야기하는 것이다. 이러한 유효량은, 그것 자체가 자연히, 이러한 면역 반응을 발생시키기에 충분하지 않을 수 있지만, 추가의 시약의 이전 또는 후속 전달(예를 들면, 프라임-부스트 백신접종)과 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "면역학적 반응" 또는 "면역 반응"은 B 세포에 의한 항체 생성; 및/또는 억제 T 세포 및/또는 관심 대상 벡터, 조성물 또는 백신에 존재하는 항원 또는 항원들에 특이적으로 관련된 T 세포의 활성화의 적어도 하나 이상의 효과를 포함한다.

표준 면역검정, 예컨대 RIA, ELISA 검정; 세포내 염색; 예를 들면, 림프증식(림프구 활성화) 검정, CTL 세포독성 세포 검정을 포함하는 T 세포 검정, 또는 감작 피험체에서 항원에 특이적인 T 림프구의 검정(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, 체액성 및 세포 면역 반응을 측정하는 것을 포함하는, 면역 반응을 측정하기 위한, 다양한 실험실내 및 생체내 검정이 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 검정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

리포솜 제제:

리포솜 제제는 선행 기술에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 에탄올 주사(Batzri et al., Biochem. Biophys. Acta. 298:1015, 1973); 이써 주입(Deamer et al., Biochem. Biophys. Acta. 443:629, 1976; Schieren et al., Biochem. Biophys. Acta. 542:137, 1978); 세제 제거(Razin, Biochem. Biophys. Acta. 265:24 1972); 용매 증발(Matsumato et al., J. Colloid Interface Sci. 62:149, 1977); 물 에멀션(REV) 중의 클로로포름으로부터의 유기 용매의 증발(Szoka Jr. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194, 1978); 핵공 폴리카보네이트 막을 통한 MLV 또는 EUV의 압출(Olson et al., Biochem. Biophys. Acta. 557:9, 1979); 인지질 혼합물의 냉동 및 해동(Pick, Arch. Biochem. Biophys., 212:186, 1981), 및 음파 처리 및 균질화를 포함하는 다수의 상이한 기술에 의해 리포솜이 제조되었다. 관례상, 리포솜은 크기로 분류되고, 언급되는 리포솜 유형을 지칭하기 위해 3글자 두문자가 사용된다. 다층 소포가 일반적으로 "MLV"로 지칭된다. 소형 단층 소포가 "SUV"로 지징되고, 대형 단층 소포가 "LUV"로 지칭된다. 이러한 지칭은 때때로 리포솜의 화학 조성에 따른다. 명명법의 설명 및 공지된 유형의 리포솜의 요약을 위해, 문헌[Storm et al., PSIT, 1: 19-3, 1998]을 참조한다.

본 발명의 리포솜 조성물은 리포솜 그 자체의 일부로서 또는 리포솜이 형탁된 비히클의 일부로서, 다양한 부형제, 아쥬번트, 담체, 보조 물질, 변형제(modulating agent) 등을 추가로 포함할 수 있다.

임의로 존재하는 담체는 그 자체가 상기 조성물을 투여받는 개인에게 해로운 항체의 생성을 유도하지 않는 분자이다. 적합한 담체는 통상적으로 크고, 천천히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글라이콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체(예컨대, 오일 액적 또는 리포솜) 및 불활성 바이러스 입자이다. 미립자 담체의 예는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체로부터 유도된 것, 및 PLG로 공지된 폴리(락타이드) 및 폴리(락타이드-코-글라이콜라이드)로부터 유도된 마이크로입자를 포함한다. 예를 들면, 문헌[Jeffery et al., Pharm. Res. 10:362, 1993; McGee et al., J. Microencapsul. 14: 197, 1997; O'Hagan et al., Vaccine 11:149, 1993]을 참조한다. 이러한 담체는 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다.

아쥬번트는 (1) 알루미늄염(alum), 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등; (2) 수중유 에멀션 제제(다른 특이적 면역자극제, 예컨대 무라밀 펩타이드(하기 참조) 또는 박테리아 세포벽 성분을 갖거나 갖지 않음), 예컨대 (a) 모델 11OY 미세유동화기(미국 메사추세츠주 뉴톤에 소재하는 마이크로플루이딕스(Microfluidics))와 같은 미세유동화기를 사용하여 마이크론 이하의 입자로 제제화되는 5%의 스쿠알렌, 0.5%의 트윈(Tween 80) 및 0.5%의 스판(Span) 85를 포함(필요하지는 않지만 다양한 양의 MTP-PE(하기 참조)를 임의로 함유)하는 MF59(국제 공보 WO 제90/14837호), (b) 더 큰 입자 크기의 에멀션을 생성하기 위해 마이크론 이하의 에멀션으로 미세유동화되거나 와류되는 10%의 스쿠알렌, 0.4%의 트윈 80, 5%의 플루로닉(pluronic) 블록 중합체 Ll 21 및 MDP를 포함하는 SAF, 및 (c) 리비(Ribi)(상표명) 아쥬번트 시스템(RAS)(미국 몬태나주 해밀톤에 소재하는 리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem)); (3) 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 트레할로스 다이마이콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS), 바람직하게는 MPL+CWS(Detoxu)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분; (4) 사포닌 아쥬번트, 예컨대 스티물론(Stimulon)(상표명)(미국 메사추세츠주 우스터에 소재하는 캠브리지 바이오사이언시스(Cambridge Bioscience)); (5) 완전 프로인트 아쥬번트(CFA) 및 불완전 프로인트 아쥬번트(IFA); (6) 사이토카인, 예컨대 인터류킨(IL-I, IL-2 등), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 베타 케모카인(MIP, 1- 알파, 1-베타 란테스(Rantes) 등); (7) 박테리아 ADP-리보실레이팅 독소, 예컨대 콜레라 독소(CT), 백일해 독소(PT), 또는 이. 콜라이 열 불안정성 독소(LT), 특히 LT-K63(여기서, 63번 위치에서 야생형 아미노산에 라이신이 치환됨), LT-R72(여기서, 72번 위치에서 야생형 아미노산에 아르기닌이 치환됨), CT-S109(여기서, 109번 위치에서 야생형 아미노산에 세린이 치환됨) 및 PT-K9/G129(여기서, 9번 위치에서 야생형 아미노산에 라이신이 치환되고, 129번 위치에서 글라이신이 치환됨)(예를 들면, 국제 공보 WO93/13202 및 WO92/19265 참조)의 해독 돌연변이체; 및 (8) 상기 조성물의 효과를 증대시키는 면역자극제로 작용하는 다른 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

바람직한 아쥬번트는 톨 유사 수용체(TLR), (NOD)형 수용체(NLR), 레티노산 유도성 유전자 기반(RIG) I형 수용체(RLR) 및/또는 C형 렉틴 수용체(CLR)를 통한 선천성 면역 활성화를 중재하는 병원균 관련 분자 패턴(PAMP)을 포함한다. PAMP의 예는 리포단백질, 리포폴리펩타이드, 펩타이도글라이칸, 지모산, 리포폴리사카라이드, 나이지리아 포린, 플라젤린, 프로필린, α-갈락토실세라마이드, 무라밀 다이펩타이드를 포함한다. 펩타이도글라이칸, 리포단백질 및 리포테이코산은 그람 양성의 세포벽 성분이다. 리포폴리사카라이드는 대부분의 박테리아에 의해 발현되고, MPL는 일례이다. 플라젤린은 병원균 및 공생 박테리아에 의해 분비되는 박테리아 편모의 구조 성분을 의미한다. α-갈락토실세라마이드(α-GalCer)는 천연 살해 T(NKT) 세포의 활성인자이다. 무라밀 다이펩타이드는 모든 박테리아에 흔한 생물활성 펩타이도글라이칸 모티프이다.

다른 바람직한 아쥬번트는 세포내 수용체 TLR3에 의해 센싱되는 바이러스 이중 가닥 RNA; TLR7, 8 및 9에 의해 센싱되는 박테리아 또는 바이러스 DNA 또는 ssRNA에 존재하는 CpG 모티프; 모든 트랜스 레티노산; 및 교차 제시에 매우 효과적인 담체 분자인 열 충격 단백질, 예컨대 HSP70 및 Gp96을 포함한다. 약제학적 아쥬번트는 레시퀴모드, TLR7/8 효능제 및 이미퀴모드, TLR7 효능제를 포함한다.

약제학적 조성물:

본 발명의 리포솜은 비경구 또는 경장 전달을 위한 약제학적 조성물로서 제제화되는 것이 바람직하다. 동물에 투여하기 위한 통상적인 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클, 예컨대 수용액, 비독성 부형제, 예컨대 염, 보존제, 완충제 등을 포함한다. 예를 들면 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Easton ed. , Mack Publishing Co., pp 1405-1412 and 1461- 1487 (1975); The National Formulary XIV, 14th Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, DC (1975)]을 참조한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 식물성 오일 및 주사용 유기 에스터, 예컨대 에틸올레이트이다. 수성 담체는 물, 알코올 용액/수용액, 식염수 용액, 비경구 비히클, 예컨대 염화나트륨, 덱스트로스 링거액 등이다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제를 포함한다. 보존제는 항생제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스를 포함한다. 당해 분야의 기술에 따라 약제학적 조성물의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도를 조정한다.

특정한 백신의 반복 투여(동종 부스팅)는 체액성 반응을 부스팅하는 데 효과적인 것으로 입증되었다. 벡터에 대한 사전 면역이 탄탄한 항원 제시 및 적절한 염증성 신호의 생성을 손상시키므로, 이러한 접근법은 세포 면역을 부스팅하는 데 효과적이지 않을 수 있다. 이러한 문제점을 피하는 하나의 접근법은 상이한 항원 전달 시스템의 백신의 순차 투여(이종 부스팅)이다.

이종 부스팅 요법에서, 적어도 하나의 프라임 또는 부스트 전달은 본 명세서에 기재된 리포솜 제제의 전달을 포함한다. 이 요법의 이종 암은 하기 전략 중 하나 이상을 이용한 항원 전달을 포함할 수 있다:

관심 대상 항원을 포함하는 약독화된 및/또는 불활성화된 박테리아 또는 바이러스(이 항원은 병원균 침입을 봉입하는 데 있어서 이들이 비효과적 또는 비효율적이게 만드는 몇몇 변성 조건으로 처리된 입자임);

정제된 항원(병원균의 세포 배양물 또는 병원균을 포함하는 조직 샘플, 또는 이의 재조합 버전으로부터 정제된 통상적인 천연 항원);

피험체의 숙주 세포에서 항원을 발현시키고/시키거나 분비하도록 재조합으로 조작된 생 바이러스 또는 박테리아 전달 벡터(이 전략은 비병원성이고 비독성이도록 바이러스 벡터를 유전적으로 조작하는 것에 기초함);

항원 제시 세포(APC) 벡터, 예컨대 수지상 세포(DC) 벡터(항원이 로딩된 세포를 포함하거나, 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물로 형질감염됨);

종양 세포, 예를 들면, 자가 및 동종이계 종양 세포; 및

네이키드 DNA 벡터 및 네이키드 RNA 벡터(유전자 총, 전기천공, 박테리아 숙주, 마이크로구, 마이크로입자, 리포솜, 양이온다중 나노입자 등에 의해 투여할 수 있음).

하기 경로 중 임의의 하나 또는 조합에 의해 프라임 백신 및 부스트 백신을 투여할 수 있다. 일 양태에서, 동일한 경로로 프라임 백신 및 부스트 백신을 투여한다. 다른 양태에서, 상이한 경로로 프라임 백신 및 부스트 백신을 투여한다. 용어 "상이한 경로"는 신체의 상이한 부위, 예를 들면 경구, 비경구, 경장, 비경구, 직장, 노드내(림프절), 정맥내, 동맥, 피하, 근육내, 종양내, 종양주위, 종양내, 주입, 점액, 비강, 뇌척수 공간 또는 뇌척수 유체 내 등등, 및 상이한 방식에 의한 예를 들면 경구, 정맥내 및 근육내에서의 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

유효량의 프라임 또는 부스트 백신은 1 용량으로 제공될 수 있지만, 1 용량으로 제한되지 않는다. 따라서, 투여는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 백신 투여일 수 있다. 1 초과의 백신 투여가 있는 경우, 투여는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간 등의 간격으로 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분 9분, 10분 이상의 시간 간격으로 떨어질 수 있다. 시간의 문맥 내에, 용어 "약"은 30분 내 임의의 시간 간격의 플러스 또는 마이너스를 의미한다. 투여는 또한 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일 및 이들의 조합의 시간 간격으로 떨어질 수 있다. 본 발명은 시간상 동일하게 떨어진 투약 간격으로 제한되지는 않지만, 비동일 간격의 투약, 예컨대 1일, 4일, 7일 및 25일에서의 투여로 이루어지는 프라이밍 스케줄을 포함하여, 비제한적인 예를 단지 제공한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 예시하도록 제공된다. 이 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.

실시예 1. 인플루엔자 A 바이러스 물질 및 방법

A. IAVM2e1-HD pET28a 벡터

IAVM2e1-HD pET28a 플라스미드 설계는 이미 기재되어 있다[Ernst et al., 2006].

B. IAVM2e1-HD pEV 벡터

IAVM2e1-HD 단백질을 생성하기 위해, Bgl II 제한 효소 부위 및 엔테로키나제(EK) 부위를 포함하는 IAVM2e1 유전자를 코딩하는 5'-올리고뉴클레오타이드 프라이머(Integrated DNA Technologies)를 합성하였다. LDR-IAVM2e1-HD 단백질을 생성하기 위해, Bgl II 제한 효소 부위, EK 부위 및 pET28a 벡터의 LDR 서열을 포함하는 IAVM2e1 유전자를 코딩하는 5'-올리고뉴클레오타이드 프라이머(Integrated DNA Technologies)를 합성하였다. 유사하게, Xho I 제한 효소 부위를 포함하는, 소수성 도메인에 대한 유전자를 코딩하는 3'-올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였다. IAVM2e1-HD 유전자를 생성하기 위해, 모레큘러 익스프레스(Molecular Express)에 의해 이미 구성된 IAVM2e1-HD pET28a 벡터 주형을 증폭시키는 중합효소 사슬 반응(PCR)에 프라이머를 사용하였다. 간단히 말하면, PCR 관에, 7.5㎕의 10X Pfx(Invitrogen) 완충제, 1㎕의 50mM MgCl2, 1.5㎕의 10mM dNTP, 1㎕의 20μM 5' 및 3' 프라이머, 10ng의 IAVM2e1-HD pET28a 플라스미드, 1㎕의 Pfx 중합효소를 첨가하고 적량 내지 50㎕의 증류수를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25시간 동안(1분 동안 94℃, 1분 동안 58℃, 1분 동안 72℃) 사이클링하고, 이후 7분 동안 72℃에서 최종 연장시켰다. PCR 정제 키트(Qiagen, 캘리포니아주의 쳇스위스시에 소재)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다. PCR 생성물 및 pEV1 벡터를 Bgl II 및 Xho I(Invitrogen)로 효소 용해시켰다. pEV1 벡터는 pET32b 및 pET28a의 복합 벡터이고, 여기서, 티오레독신-6His-pET32b의 복수 클로닝 부위는 pET28a로 삽입되었다. pEV1 벡터는 pET28a 벡터의 카나마이신 내성 하에 pET32b의 트롬빈 절단 부위 및 티오레독신-6His를 제공하였다. 용해된 DNA를 겔 정제하고(Qiagen, 캘리포니아주의 쳇스위스시에 소재), 이후 결찰하고 DH5-α 이. 콜라이로 형질전환하였다. 플라스미드를 형질전환된 이. 콜라이로부터 정제하고 서열분석하여 적절한 서열, 프레임 및 유전자 기원을 보장한다.

C. 절두형 및 시스테인 돌연변이 IAVM2e1-HD 구성체

돌연변이된 IAVM2e1-HD 단백질을 생성하기 위해, Bgl II 제한 효소 부위, 담배 에치 바이러스(TEV) 프로테아제 부위 및 IAVM2e1 서열의 제1 22개의 염기를 코딩하는 5' 프라이머(Integrated DNA Technologies)를 합성하였다. 유사하게, Hind III 제한 효소 부위를 포함하는, 다양한 돌연변이된 IAVM2e1 유전자 및 절두형 IAVM2e1(1-15)에 대한 서열을 코딩하는 3' 프라이머를 합성하였다(표 1). 이러한 구성체에 대한 벡터는 HD를 코딩하는 영역의 HinD III 부위 5'를 갖는 이전 구성체로부터 HD를 포함하였다.

세린 돌연변이체에 대한 각각의 시스테인의 경우, 모레큘러 익스프레스에 의해 이미 구성된 pEV1-IAVM2e1 주형으로부터 IAVM2e1 영역을 증폭하기 위해 5' 프라이머 및 3' 프라이머 중 하나를 사용하여 반응을 설정하였다. 간단히 말하면, PCR 관에, 7.5㎕의 10X Pfx 중합효소 완충제, 1㎕의 50mM MgCl2, 1.5㎕의 10mM dNTP, 20μM의 5' 및 3' 프라이머 각각 1㎕, 10ng의 IAVM2e1-HD pEV1, 0.75㎕의 Pfx(Invitrogen)를 첨가하고 적량 내지 50㎕의 증류수를 첨가하였다. 반응 혼합물을 94℃에서 5분 동안 가열하여 중합효소를 활성화하였다. 20초 동안 95.5℃, 이어서 40초 동안 70℃의 30회 사이클로 처리하였다. 사이클링 후, 이를 68℃에서 10분의 최종 연장 기간 동안 항온처리한 후, 4℃에서 유지시킨다. 퀴아퀵 스핀 키트(Qiaquick Spin Kit)(Qiagen)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다. 이후, 이를 1X React 2 완충제(Invitrogen) 중의 Bgl II 및 HinD III의 각각 5 단위를 사용하여 37℃에서 30분 동안 용해시켰다. 3.5% 누세이브(Nuseive) 아가로스 겔에서 각각의 생성물을 겔 정제하였다. 겔로부터 밴드를 절제하고, 퀴아퀵 겔 추출 키트를 사용하여 DNA 단편을 정제하였다. 다양한 양의 DNA와 함께 공지량의 저 질량 DNA 표준품 다음에 2% 아가로스 겔을 분석하여 DNA 농도를 결정하였다.

오직 1개 내지 15개의 아미노산을 포함하는 결실 돌연변이체의 경우, 삽입물은 더 낮은 프라이머가 13개의 염기에 의해 상부 프라이머에 겹칠 정도로 짧았다. 이런 경우, 2개의 프라이머에 의해 PCR 관에서 유사한 반응을 설정하지만, 주형 DNA를 첨가하지 않았다. 중합효소를 활성화하는 5분 변성 기간 후, 반응물을 2분 동안 48℃에서 항온처리한 후, 온도를 20% 상승 속도로 70℃로 증가시키고 5분 동안 여기서 유지시켰다. 48℃ 및 70℃ 단계를 한번 더 반복한 후, 70℃에서 10분 연장 단계를 수행하였다. 생성된 생성물을 겔 정제하고, 약간 더 긴, 돌연변이된 IAVM2e1 PCR 생성물과 동일한 절차에 의해 분석하였다.

55㎕의 1X React 2 중의 3㎍의 모레큘러 익스프레스 플라스미드(MEP)-180을 24 단위의 Bgl II 및 10 단위의 HinD III로 밤새 37℃에서 용해시켜 HD를 갖는 pEV1 벡터를 제조하였다. 1% 아가로스 겔에서 벡터를 겔 정제하였다. 퀴아젠 겔(Qiagen Gel) 정제 키트를 사용하여 절제된 밴드를 정제하였다. 공지량의 고 질량 DNA 표준품 다음에 1% 아가로스 겔에서 실행하여 DNA 농도를 결정하였다.

이후, 각각의 용해된 정제 PCR 생성물을 벡터에 비해 3배 몰비의 PCR 생성물 및 1배의 결찰 혼합물(Novagen Clonables Ligation/형질전화 키트)을 포함하는 10㎕의 반응물 중에 16℃에서 80분 동안 벡터에 결찰하였다. 이후, 1마이크로리터의 이 반응물을 노바블루(Novablue) 화학 컴피턴트(competent) 세포로 형질전환하고, 30㎎/ℓ의 카나마이신을 포함하는 LB-아가로스 플레이트에 평판배양하고, 밤새 항온처리하였다. IAVM2e1 서열이 너무 짧으므로, 콜로니 PCR 및 PCR 생성물의 제한 분석 둘 다를 사용하여 콜로니를 분석하였다. 모레큘러 익스프레스 올리고뉴클레오타이드(MEO) 프라이머 MEO-248 및 MEO-250을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. MEO-248 프라이머 부위는 HD의 5' 말단에서 Bgl II 부위의 상류 540bp에서 시작하고 MEO-250은 HinD III 부위의 하류 250bp에서 종료되었다. IAVM2e1의 23개의 아미노산 서열 + TEV 부위의 7개의 아미노산은 90bp를 요했다. 대략 900bp의 단편을 만드는 PCR을 2개의 별개의 추가의 반응 중에 Bgl II 및 HinD III로 용해시키고 3.5% 아가로스 겔에서 분석하였다. 겔이 절단 부위 둘 다 존재한다는 것을 나타내는 경우, 콜로니를 30㎎/ℓ의 카나마이신, 37℃에서 225rpm에서 16㎖의 LB 중에 밤새 성장시켰다. 프라이머 MEO-302 및 MEO-250(Davis Sequencing)을 사용하여 서열분석에 의한 검증을 위해 플라스미드 DNA(퀴아젠 플라스미드 미니프렙 키트(Qiagen Plasmid Miniprep Kit)를 정제하였다. 서열분석 결과를 BLAST를 이용하여 얼라인(Align) 2개 이상의 서열을 이용하여 의도되는 DNA 서열과 비교하였다.

서열 번호 53 및 서열 번호 54는 각각 인간 사이토크롬 b5 및 제노푸스 MGC80327 단백질로부터 얻은 (밑줄 친) 소수성 도메인을 포함하는 IAVM2e1-HD 구성체를 도시한다. 구성체의 제조 동안 사용되는 제한 부위로부터 생긴 아미노산의 (이중 밑줄 친) 짧은 링커 서열은 사이토크롬 b5 또는 제노푸스 MGC80327 잔기를 IAVM2e1 서열에 연결한다. (밑줄 치지 않은) IAVM2e1 서열은 따라서 브릿징 아미노산 잔기를 통해 소수성 도메인의 아미노 말단에 간접적으로 축합된다.

D. IAVM2e1-HD 구성체의 발현

IAVM2e1-HD 단백질을 발현시키기 위해, pEV1 플라스미드 또는 IAVM2e1-HD-pET28a 플라스미드를 포함하는 IAVM2e1-HD를 이. 콜라이 발현 균주 C-43(Lucigen)으로 형질전환시켰다. 출발 배양물을 G-25 환경 진탕기(New Brunswick Scientific) 내에서 37℃에서 밤새 30㎎/ℓ의 카나마이신이 보충된 동물 비함유 LB 브로스(AthenaES) 중에 성장시켰다. 30㎎/ℓ의 카나마이신 및 1% 글라이세롤이 보충된 0.5ℓ의 동물 비함유 LB 브로스를 포함하는 4-2ℓ 무균 진탕기 플라스크에, 출발 배양물을 0.09 내지 0.12의 광학 밀도(O.D.)(A600㎚)로 첨가하였다. 배양물을 오비탈 진탕(225rpm)으로 37℃에서 0.5 내지 0.7 O.D.(A600㎚)로 항온처리하고, 이때 배양물을 0.75mM 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)(BioWorld)로 유도하였다. 이 배양물을 37℃ 진탕으로 추가로 5시간 동안 항온처리하였다. 박테리아를 4℃에서 25분 동안 원심분리(4000xg)로 수집하고, 펠렛을 칭량하였다.

E. 6His-IAVM2e1-HD의 정제

6His-IAVM2e1-HD 단백질을 정제하기 위해, 박테리아를 8M의 우레아, 20mM 이미다졸, 50mM 트라이스(pH 8.0) 완충제 중에 용리시키고, 미세유동화기 M-110L(마이크로플루이딕스) 중에 15,000psi에서 3회 균질화시켜 박테리아 DNA를 전단시키고 박테리아를 파열하였다. 이후, 용리된 박테리아를 원심분리(30,000xg)하여 세포 부유물을 제거하였다. 세척된 니켈 충전 킬레이팅 아가로스 수지(Qiagen)를 IAVM2e1-HD 단백질을 포함하는 상청액과 항온처리하여 정제를 성취하였다. 수지를 20mM 이미다졸을 포함하는 5 칼럼 용적의 우레아 완충제로 세척한 후, 5 칼럼 용적의 0.3% 나트륨 데옥시콜레이트로 세척하고, 최종적으로 250mM 이미다졸, 50mM 인산나트륨(pH 7.9)으로 용리시켰다. 단백질 분획을 4% 내지 12% SDS-PAGE에서 전기영동하고 6His-IAVM2e1-HD 단백질을 포함하는 분획을 확인하기 위해 쿠마시 블루로 염색하였다. 6His-IAVM2e1-HD 단백질을 포함하는 250mM 이미다졸 용리물 분획을 풀에 넣고, 0.1㎖의 패킹된 폴리믹신 B-아가로스와 항온처리하여 잔류 내독소를 제거하였다. 폴리믹신 B-아가로스 처리 후, 단백질을 10mM 인산나트륨(pH 7.2)에 투석하여 잔류 이미다졸, 우레아 및 나트륨 데옥시콜레이트를 제거하였다. 각각 BCA 및 리물루스 아모에바이사이트 어세이(Limulus Amoebacyte Assay)(Charles River Lab.)에 의해 단백질 농도 및 내독소 농도를 결정하였다.

F. pEV1 플라스미드의 IAVM2e1-HD로부터의 정제

이. 콜라이 펠렛을 4용적(wt/vol)의 10mM 트라이스 완충제(pH 8.1); 20% 수크로스; 1mM 에틸렌다이아민테트라아세테이트(EDTA)로 현탁시켰다. 박테리아가 완전 현탁되면, 라이소자임 분말(Sigma)을 1㎎/㎖의 농도로 첨가하고, 실온에서 20분 동안 교반하였다. 스페로플라스트()를 30,000xg에서 4℃에서 30분 동안 원심분리에 의해 수집하였다. 펠렛을 1mM 페닐메탄설포닐플루라이드(PMSF), DNase(10단위/㎖)을 포함하는 얼음 냉각 증류수 중에 재현탁시키고, 10분 동안 교반하였다. 30,000xg에서 4℃에서 30분 동안 원심분리에 의해 막을 수집하였다. 펠렛화된 막을 300㎖의 10mM 트라이스 완충제(pH 8.1); 1mM PMSF 중에 재현탁시켰다. 교반하면서, 3-[(3-콜라미도프로필)다이메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS)(Sigma)(20% 스톡)를 적하하여 1%의 최종 농도를 만들었다. 혼합물을 미세유동화기 M-110L(마이크로플루이딕스) 내에서 15,000psi에서 3회 균질화한 후, 4℃에서 추가로 16시간 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 30,000xg에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 미립자를 제거하였다. 깨끗한 용리물에, 염화나트륨 및 이미다졸을 첨가하여 각각 500mM 및 20mM의 최종 농도를 만들었다. 이후, 용리물을 패킹된 Ni-NTA 수지(Qiagen)와 4℃에서 45분 동안 회전시키면서 항온처리하였다. 수지를 225xg에서 5분 동안 원심분리에 의해 수집하고, 콘테스(Kontes) 2.5㎝x25㎝ 칼럼에 옮기고, 10 칼럼 용적의 10mM 트라이스 완충제(pH 8.1), 20mM 이미다졸, 500mM NaCl 및 1% CHAPS로 세척하였다. 단백질을 250mM 이미다졸, 20mM 트라이스(pH 8.0)로 용리시키고, 분획을 수집하고, 쿠마시 블루 염색 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 표적 단백질을 포함하는 분획을 풀에 넣고, 15kDa 분자량 컷오프(MWCO)(Spectra-Por)로 2mM 트라이스, 10mM NaCl(pH 8.1)에 투석하였다.

G. SDS-PAGE

쿠마시 블루로 염색된 SDS PAGE 겔에서 적절한 MW를 나타내어 IAVM2e1-HD 단백질의 일체성을 결정하였다. 이 밴드의 염색 강도를 공지된 농도의 표준 단백질의 염색 강도와 비교하여 시험 샘플 내의 불순물의 농도를 추정하였다.

H. Trx-6-His-IAVM2e1-HD의 HPLC 분석

다이오넥스(Dionex) GP50 HPLC 시스템을 사용하여 단백질 샘플의 HPLC 분석을 수행하였다. 이 시스템은 GP50 기울기 펌프, GM-3 기울기 혼합기, AS50 오토샘플러 및 PDA-100 포토다이오드 어레이 검출기로 이루어진다. 1㎖/분, 25℃에서 아세토나이트릴 구배 용리를 이용하여 다이오넥스 어클레임(Dionex Acclaim) 120 C8 칼럼(4.6x250㎜; 5μM; 120 A)에서 RP-HPLC에 의해 성분을 분리하였다: 용매 A(10% 아세토나이트릴, 0.1% 트라이플루오로아세트산); 용매 B(90% 아세토나이트릴, 0.1% 트라이플루오로아세트산); (0분, 40% B); (1분, 40% B); (25분, 100% B). 220㎚에서 UV 흡광도에 의해 성분을 검출하였다. 통상적으로, 분석마다 20㎕의 샘플을 주입하였다. 티오레독신-IAVM2e(1-15)-HD 융합 단백질은 대략 11 내지 12분에서 용리하였다. 1.17x10-4㎎/mAU220㎚*분의 전환 계수를 이용하여 11 내지 12분의 피크 면적으로부터 융합 단백질의 함량을 예측하였다. IAVM2e(1-15)-HD는 대략 14분에 용리하고; 7.27x10-5㎎/mAU220㎚*분의 전환 계수를 이용하여 14분의 피크 면적으로부터 IAVM2e(1-15)-HD의 함량을 예측하였다.

I. Ni-NTA 정제된 단백질의 프로테아제 절단

엔테로키나제 절단 부위를 포함하는 재조합 단백질을 단백질(New England Biolabs) 1밀리그램당 10ng의 엔테로키나제 또는 단백질(Invitrogen) 1밀리그램당 10단위의 TEV로 절단하였다.

J. IAVM2e1-HD를 농축시키고 티오레독신을 제거하기 위한 한외 여과

30kDa의 MWCO PES 막(밀리기공)을 사용하여 아미콘(Amicon) UF 셀(밀리기공)를 통해 대략 20mg/㎖의 IAVM2e1-HD 농도로 한외 여과에 의해 절단된 단백질 용액을 농축시켰다. 이후, 농축된 샘플을 10mM 인산나트륨 완충제(pH 7.0)로 4회(각각 1/10 희석) 세척하여 통과액 중에 벌크한 티오레독신 성분을 제거하였다.

K. pEV1로부터 HPLC 정제 IAVM2e1-HD

다이오넥스 얼티메이트(Dionex Ultimate) 3000 HPLC 시스템을 사용하여 IAVM2e1-HD 및 LDR-IAVM2e1-HD의 HPLC 정제를 수행하였다. 이 시스템은 얼티메이트 3000 펌프 및 얼티메이트 3000 가변 파장 검출기로 이루어진다. 용매 A(물, 0.1% 트라이플루오로아세트산); 용매 B(아세토나이트릴, 0.1% 트라이플루오로아세트산); (0분, 5% B); (1분, 5% B); (60분, 100% B); (65분, 100% B); (70분 5% B); (75분, 5% B)의 아세토나이트릴 구배 용리를 이용하여 바이닥(Vydac) C8 칼럼(22x250㎜; 10μM; 300 A)에서 단백질을 RP-HPLC로 분리하였다. 220㎚에서 UV 흡광도로 성분을 검출하였다.

L. 정제된 IAVM2e1-HD를 농축하기 위한 한외 여과

IAVM2e1-HD를 포함하는 HPLC 분획을 단량체 IAVM2e1-HD에 대해 5kDa의 MWCO 재생 셀룰로스 막(밀리기공) 및 이합체 IAVM2e1-HD에 대해 10kDa의 MWCO 재생 셀룰로스 막(밀리기공)을 사용하여 아미콘 UF 셀(밀리기공)을 통해 한외 여과로 대략 20㎎/㎖의 워킹 농도로 농축시켰다. 농축된 단백질 샘플을 일련의 4회 세척(각각 1/10 희석)에 의해 10mM 인산나트륨 완충제(pH 7.0)로 완충제 교환하였다. 4℃에서 최종 샘플을 저장하였다.

M. 내독소 농도

리물루스 아모에바이사이트 라이세이트(Limulus Amoebacyte Lysate: LAL) 검정(Charles River Lab)에 의해 내독소 농도를 결정하였다. 내독소 비함유 무균수를 사용하여 IAVM2e1-HD 단백질 제제의 8개의 10배 희석액 및 대조군 내독소 표준품의 8개의 2배 희석액을 준비하였다. 대조군 및 IAVM2e1-HD 샘플을 무균 내독소 비함유 10x75㎜의 붕규산 유리 관에 분취하고 동일 용적(100㎕)의 LAL과 첨가하였다. 또한, 100㎕의 LAL을 음성 대조군으로서 100㎕의 내독소 비함유 주사용 무균수에 첨가하였다. LAL 표지 감수성에 응고를 나타내지 않는 제1 희석의 역수를 곱해 샘플 내의 내독소 농도(EU/㎖)를 계산하였다.

N. IAVM2e1-HD 순도 및 서열

이온 스프레이 질량 분광학(LC/MS/MS)(Midwest Bio Services)에 의해 단백질의 순도를 평가하였다. IAVM2e1-HD의 트립신 절단, 이어서 이온 포획 질량 분광학(Midwest Bio Services)에 의해 단백질의 서열을 검증하였다.

O. 웨스턴 블롯 분석

정제된 단백질이 표적 재조합 단백질(IAVM2e1-HD)인지 검증하기 위해, 4% 내지 20%의 SDS-PAGE(Invitrogen)에서 정제된 단백질(2㎍)의 샘플을 실행하였다. 단백질을 100mAmp에서 1.5시간 동안 트라이스-글라이신-메탄올 완충제 중의 0.2μM 나이트로셀룰로스 막(NCM)(BioRad)으로 옮겼다. NCM을 4℃에서 16시간 동안 3% 소 혈청 알부민(BSA)(EMD, PN 2960)으로 차단하였다. IAVM2e1-HD를 검출하기 위해, NCM을 0.2% 트윈-20(pH 7.4)(TTBS)을 포함하는 트라이스 완충 식염수 중에 1.5% BSA 중에 희석된 항-M2e 단일클론 항체(mAb)(피어스(Pierce) 카달로그 MA1082호)의 1:1000 희석액과 항온처리하였다. 블롯을 TTBS 중에 접합된(1:7500) 2차 항체, 염소 항마우스 IgG-HRP와 항온처리하였다. 블롯을 추가로 1 시간 동안 락킹(rocking)하면서 항온처리하였다. 블롯을 15분 동안 20㎖의 TTBS로 3회 세척하였다. 이후, 10㎖의 테트라메틸 벤지딘(TMB) 용액(피어스, 카달로그 34108호)을 첨가하여 블롯을 진행시키고 15 내지 30분 동안 진탕시키면서 항온처리하였다. NCM을 증류수로 온화하게 세정하여 반응을 중단시켰다.

P. 리포솜 제제

다이미리스토일포스파티딜 콜린(DMPC, Lipoid), 콜레스테롤(Chol, Nippon Oil and Fat), 다이미리스토일포스파티딜 글라이세롤(DMPG, Nippon Fine Chemicals), 모노포스포릴 리피드 A(MPL)를 클로로포름, 메탄올(1:1 비) 중에 용해시키고 IAVM2e1-HD 단백질을 65:1 지질 대 단백질 농도로 첨가하였다. 시험 샘플에 3의 상이한 용량이 제공되므로, 상이한 농도를 갖는 3의 상이한 제제를 제조하였다. 이러한 방식으로, 동일한 용적의 용량을 각각의 동물에게 주었다. 대조군(L 대조군)으로서 단백질 없이 지질 및 MPL의 동일한 샘플을 제조하였다(표 2). 지질 및 단백질을 질소 스트림 하에 건조시켰다. 건조된 지질 필름을 48시간 동안 진공 하에 위치시켜 잔류 유기 용매를 제거하였다. 건조된 지질 필름에, 적절한 양의 완충제(인산나트륨(10mM) 완충제, 9% 수크로스(pH 7.4))를 첨가하여 0.6, 0.3 또는 0.1㎎/㎖의 IAVM2e1-HD의 농도를 생성시켰다. 지질 단백질 혼합물을 60℃에서 약 10분 동안 가열하고, 15초 동안 와류시킨 후, 리포솜을 제조하기에 불투명해질 때까지 프로브를 3 내지 5분 동안 브랜선 소니파이어(Branson Sonifier)에서 10 내지 20% 전력으로 음파 처리하였다. 리포솜을 0.2μM 폴리이써설폰 주사기 필터를 통해 무균, 발열원 유리 관으로 무균 여과시키고 층류 후드에서 라벨링하였다. 리포솜 제제를 직접 모레큘러 익스프레스, 인크로부터 닥터 질 알더 모어(Dr. Jill Adler-Moore)(칼 폴리 포모나(Cal Poly Pomona))로 옮기고, 리포솜의 레시피에 대해 사인하였다. 리포솜을 얼음에 옮기고, 칼 폴리 포모나에서 4℃에서 저장하였다. 리포솜 크기 분포를 마이크로트랙(Microtrac)(마이크로트랙-UPA150, Honeywell)으로 결정하였다. 각각의 리포솜 제제의 단백질 농도를 HPLC 검정으로 확인하였다.

Q. 인플루엔자 바이러스 감염 모델

인플루엔자 공격 모델에서, BALB/c 마우스의 군(n = 17/군)을 L-IAVM2e1-HD 백신 또는 동량의 L 대조군(단백질을 제외한 모든 성분을 갖는 리포솜)으로 0주에 피하로 면역화하고 8주에 비강내로 면역화하였다. 비공격 마우스 중 5마리를 6일에 희생시키고, (하기 기재된) ELISA 검정을 위해 혈청을 수집하였다. 면역화된 마우스 중 남은 12마리를 감염된 폐 균질물로부터 단리된 10 LD50의 IAV(H1N1(A/PR/8/34)로 부스트후 1주(9주)에 비강내로(40㎕/공격 용량) 공격하였다. 동물을 케타민(80㎎/kg)과 자일라진(16㎎/kg)의 혼합물로 복강내로 우선 마취시켜 바이러스 공격을 수행하였다. 200㎕ 마이크로피펫 팁을 사용하여, 바이러스를 마우스의 콧구멍에 직접 투여하여, 바이러스를 자연히 흡입하게 하였다. 7마리의 동물을 이환률(체중 감소, 털 손질 부족 및 활동 감소) 및 사망률의 징후를 28일 동안 모니터링하였다. 5마리의 마우스를 공격후 5일에 희생시키고, 이의 폐를 (하기 기재된) 병소 검정으로 바이러스 부담에 대해 검정하였다.

R. ELISA에 의한 항체 역가 및 아이소유형 규명

군당 5마리의 마우스로부터, 마지막 면역화 6일 후 혈청을 수집하였다. 간단히 말하면, 마우스를 케타민(120㎎/kg)과 자일라진(20㎎/kg)의 혼합물로 복강내 주사로 매우 진정시키고 혈액을 심장 천자로 제거하였다. 혈액을 헤파린으로 세정한 마이크로원심분리 관으로 옮겼다. 혈액을 1500rpm에서 20분 동안 원심분리하여 혈액 세포로부터 혈청을 분리하였다. 수집된 혈청을 분취하고 사용까지 -80℃에서 저장하였다.

마우스로부터 심장 천자로 수집한 혈청을 OptEIA ELISA 검정(PharMingen, Inc.)으로 IAVM2e1에 대한 항체 아이소유형 역가를 위한 검정에 사용하였다. 간단히 말하면, 상기 절차는 5㎍/웰의 IAVM2e1 단백질(UCLA Peptide Core Facility)을 포함하는 100㎕/웰 코팅 완충제(65mM Na2CO3, 100mM NaHCO3(pH 9.5))와 4℃와 밤새 항온처리된 넓적 바닥 96웰 마이크로역가 이뮬론(Immulon) 플레이트를 사용하는 것을 포함한다. 플레이트를 275㎕의 세척 완충제(0.05% 트윈-20과 함께 PBS)로 3회 세정하고, 각각의 웰에 275㎕의 차단 완충제(PBS 중의 1% 소 태아 혈청)를 첨가하고 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리하여 차단하였다. 이후, 플레이트를 275㎕의 세척 완충제/웰로 7회 세척하고, 100㎕의 희석 마우스 혈청 샘플(차단 완충제 중에 희석됨)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 2시간 항온처리 종료 5분 전, 바이오틴 표지 검출 항체(항-마우스 면역글로불린 아이소유형 항체: 항-IgG1, 항-IgG2a, 항-IgG2b, IgG3, 항-IgA)를 차단 완충제 중에 제조하였다. 웰을 275㎕/웰의 세척 완충제로 7회 세척하고, 100㎕의 바이오틴 항-마우스 면역글로불린 아이소유형 항체를 첨가하였다. 플레이트를 실링하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 웰을 275㎕의 세척 완충제로 7회 세척하여, 완충제가 이의 제거 전 각각의 세척에 1분 동안 웰에 잔류하게 하였다. 차단 완충제로 1:1000로 희석된 스트렙타비딘-HRP를 각각의 웰(100㎕/웰)에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 275㎕의 세척 완충제로 7회 세척하였다. 기질 시약(퍼옥시다제 검출 시약)을 각각의 웰(100㎕/웰)에 첨가하고, 암소에서 실온에서 40분 동안 웰 내에서 항온처리하였다. 스톱 용액(1M H3PO4)을 각각의 웰(100㎕/웰)에 첨가하고, 플레이트를 450㎚에서 스펙트라맥스(Spectramax) 플레이트 리더로 판독하였다. 항체 역가를 마지막 혈청 희석의 역수로서 계산하여 배경 위의 OD 판독을 제공하였다(IAVM2e1로 코팅되지 않은 웰).

S. 바이러스 중화 검정

면역화된 마우스로부터 얻은 혈청을 PBS 중에 희석하고, 50㎕의 각각의 혈청 희석액을 96웰 환저 플레이트 내에서 4개의 웰 내에서 H1N1 바이러스의 50㎕의 1:100 내지 1:120 희석액에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2로 37℃에서 8시간 동안 습윤 챔버 내에서 항온처리하였다. 24웰 넓적 바닥 플레이트에, 200㎕의 1x106 MDCK 세포/㎖ 및 400㎕의 바이러스/혈청 희석 혼합물(96웰 플레이트의 4개의 웰로부터의 풀에 넣은 물질)을 각각의 웰에 첨가하였다. 24웰 플레이트를 5% CO2로 37℃에서 48시간 동안 항온처리하였다. 이후, 세포를 250㎖의 100% 메탄올로 고정하고, 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 이후, 메탄올을 경사 여과시키고, 세포를 20% 에탄올 용액 중의 250㎖의 0.1% 결정 바이올렛로 실온에서 10분 동안 염색하였다. 세포를 증류수로 세정하고, 실온에서 건조시켰다. H1N1 바이러스에 의한 50% MDCK 세포 용해를 예방할 수 있는 최적 희석으로 중화 역가를 결정하였다. 50% MDCK 세포 용해를 결정하기 위해, UVP Gel DOC 시스템을 사용하여 플레이트에서의 각각의 웰의 밀도를 계산하였다.

T. 실험실내 바이러스 병소(또는 "플라크") 검정

폐에서 바이러스 역가를 평가하기 위해, 각각의 군에서 5마리의 마우스로부터 얻은 폐를 공격후 5일에 수집하고, 균질화하고 균질화된 폐의 10배 연속 희석액을 CMEM(MEM, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신) 내에서 얼음에서 제조하였다. 폐 샘플의 200㎕의 분취량을 24웰 플레이트 내에서 200㎕의 MDCK 세포(7x105 내지 1x106 세포/㎖)와 혼합하고 37℃, 5% CO2에서 항온처리하여 MDCK 세포가 플레이트 바닥에 부착하게 하였다. 6시간 후, CMEM 중에 희석된 300㎕의 3% 메틸셀룰로스를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 항온처리기에서 40 내지 48시간 동안 항온처리하였다. 바이러스 병소 형성을 가시화하기 위해, 면역조직화학적 염색 절차를 수행하였다. 3% 메틸셀룰로스를 제거하고 플레이트를 PBS로 1회 세척하였다. 이후, PBS 중의 400㎕의 4% 포름알데하이드를 각각의 웰에 첨가하여 세포를 고정하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 항온처리하고, 고정물을 제거하고 세포를 PBS 중의 0.5% 트라이톤 X-100의 웰당 400㎕로 투과시켰다. 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후, PBS, 10% FBS로 실온에서 90분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 PBS로 1회 세척하고, 150㎕/웰의 단일클론 항-NP-인플루엔자 항체(PBS 중의 1:100 희석)를 첨가하였다. 실온에서 90분 동안 항온처리한 후, 플레이트를 PBS로 7회 세척하고, 150㎕의 호스 래디 퍼옥시다제 표지 항-IgG(PBS 중의 1:1000 희석, 10% FBS)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 90분 동안 항온처리하고, PBS 및 첨가된 300㎕의 발생 중인 기질(25.7㎖의 Na2HPO4(0.1M)와 혼합된 24.3㎖의 시트르산(0.05 M) 및 20㎎의 다이아미노벤지딘 및 20㎕의 H2O2)로 7회 세척하였다. 플레이트를 10 내지 30분 동안 항온처리하고, 플레이트를 증류수로 세척하여 반응을 중지시켰다. 도립 현미경을 사용하여 병소 형성 단위의 수(즉, 각각의 웰에서 갈색 색상의 세포의 국소 부위의 수)를 계수하였다. 각각의 웰 내의 병소의 수를 희석 인자로 곱하고 병소 또는 "플라크" 형성 단위/㎖를 결정하기 위해 이용하였다.

U. 통계학적 분석.

통계학적 분석은 랭크드 ANOVA, 카플란-메이어(Kaplan-Meier), 만-위트니(Mann-Whitney) 랭크 합계 시험 또는 윌콕손 시험을 이용하였다. 선택된 특정 시험(을)은 분석하고자 하는 데이터/샘플의 유형에 따라 달라진다.

실시예 2. 결과

이 연구에서, 본 발명자들은 또한 pET28a-IAVM2e1-HD에 새로운 4개의 IAVM2e1-HD 구성체를 구성하였다; (i) 상기 기재된 LDR 서열과 함께 pEV1 IAVM2e1-HD, (ⅱ) pEV1-IAVM2e1(C16S,C18S)-HD, (iii) pEV1-IAVM2e1(C16S)-HD, (iv) pEV1-IAVM2e1(C18S)-HD 및 (v) pEV1-IAVM2e1(1-15)-HD. 모든 새로운 플라스미드를 서열분석하고, 프레임 내 있는 것으로 검증되었고, 정확한 서열을 포함하였다. 각각의 IAVM2e1-HD 구성체에 대한 PCR 생성물은 각각의 PCR 생성물이 예상된 크기의 각각의 IAVM2e1-HD 삽입물에 상응한다는 것을 나타낸다. 플라스미드를 이. 콜라이 균주 C-43으로 형질전환하고 발현시켰다. 구성체가 발현 단백질이라는 것을 검증하기 위해 소규모 발현 연구를 수행하였다. 원래 pET28a-IAVM2e1-HD 구성체와 달리, pEV 함유 IAVM2e-HD 구성체는 각각의 비유도 대조군과 비교하여 높은 수준의 단백질을 나타냈다. 표적 M2e 단백질이 발현된다는 것을 검증하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. IAVM2e1 단백질을 항-M2e mAb로 발생시켰다. 반대로, 음성 대조군 B. 안트라시스 보호성 항원은 예상된 바대로 검출되지 않았다. 몇몇 IAVM2e1 샘플에서 다수의 밴드가 보이고, 이는 SDS 및 β-머캅토에탄올의 존재 하에서도, IAVM2e1-HD가 다합체를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다.

이후, 막 분획을 Ni-NTA 친화도 정제로 추가로 처리하였다. 티오레독신-IAVM2e-HD 융합 단백질 분획을 20mM 트라이스, 250mM 이미다졸(pH 8)로 용리시켰다. 이 분획을 SDS-PAGE에 의해 평가하고, 표적 단백질을 포함하는 분획을 풀에 넣고, 추가로 정제하였다. 다양한 재조합 티오레독신-IAVM2e1-HD 융합 단백질의 처리 및 다양한 IAVM2e1-HD 펩타이드의 정제를 유사하게 수행하였다. IAVM2e1(1-15)-HD 펩타이드의 정제는 대표적인 데이터 세트로서 본 명세서에 자세히 기재되어 있다. 용리 완충제(20mM 트라이스, 250mM 이미다졸(pH 8)) 중의 Ni-NTA 친화도 정제 융합 단백질의 샘플을 HPLC로 분석하여 단백질 함량을 평가하였다. 티오레독신-IAVM2e1(1-15)-HD 융합 단백질 샘플의 대표적인 HPLC 크로마토그램은 대략 9 및 12분에 용리하는 2종의 주성분을 보여주고; 용매 앞의 주피크(3분)는 주로 잔류 이미다졸 및 더 극성인 성분로 이루어졌다. 9분 성분은 겉보기 분자량이 대략 17kDa인 주오염물였다(데이터 비도시). 12분 성분은 표적 티오레독신-IAVM2e1(1-15)-HD 융합 단백질였다.

샘플을 농축하고 소분자, 예컨대 이미다졸 및/또는 다른 성분을 고갈시키기 위해, Ni-NTA 친화도 정제 융합 단백질 샘플을 한외 여과시키고 완충제를 10mM 인산나트륨 완충제(pH 8)와 교환하였다. 50kDa의 MWCO PES 막으로 아미콘 한외 여과 교반 세포, 50㎖ 용량을 사용하여 한외 여과를 수행하였다. 통상적으로, 4회 이상의 한외 여과 사이클을 상기 기재된 바대로 수행하여, 용리 완충제 및 이의 성분의 10,000배 이상의 희석액을 생성시켰다. 한외 여과 공정으로부터의 통과액(풀에 있음) 및 보유물 분획을 HPLC로 분석하였다. 이 방법에 의해, 9분에서의 대부분의 오염 성분을 제거할 수 있다. 보유물 분획은 대부분의 12분 융합 단백질 성분을 보유하였다. 한외 여과 공정은 이전에 관찰되었지만, 조사되지 않은 현상의 이점을 취하고, 저분자량 HD 단백질이 고 MWCO 막에 보유될 수 있다. 이런 경우, 약 24.0kDa의 단량체 융합 단백질이 50kDa의 MWCO PES 막에 보유될 수 있고, 약 17kDa 오염물을 포함하는 다른 성분이 통과하였다. 단백질의 -HD 성분이 50kDa보다 큰 안정한 멀티 아단위 복합체 또는 응집체로 조립되어, -HD 단백질이 보유물 분획으로 보유되게 한다는 것을 제시한다.

융합 단백질을 후속하여 TEV 프로테아제로 절단하여, 0.5mM EDTA, 10mM β-머캅토에탄올의 존재 하에 25℃에서 18시간 동안 1㎎의 융합 단백질당 5단위의 TEV 프로테아제를 사용하여 IAVM2e1(1-15)-HD 펩타이드로부터 티오레독신 성분을 탈착시켰다. TEV 프로테아제에 의한 융합 단백질의 절단에 의해 티오레독신 및 IAVM2e(1-15)-HD 성분을 생성시킨 후, 샘플을 50kDa의 MWCO PES 막을 통해 아미콘 교반 세포 한외 여과로 처리하여 티오레독신 성분을 부분적으로 고갈시켰다. 한외 여과된 샘플은, 11분 내지 12분에서의 잔류 융합 단백질 및 14분에서의 IAVM2e1(1-15)-HD가 거의 100% 보유되면서, 8분 내지 9분에서의 티오레독신 성분이 85% 초과로 고갈된다는 것을 나타낸다.

추정상 IAVM2e1(1-15)-HD을 포함하고 티오레독신 성분이 상당히 고갈된 한외 여과 공정으로부터 얻은 보유물을 10mM 인산나트륨(pH 8) 1㎖당 대략 10㎎의 IAVM2e1(1-15)-HD로 희석한 후, 정제용 RP-HPLC로 처리하여 남은 오염 성분으로부터 IAVM2e1(1-15)-HD를 정제하였다. 대략 20㎎의 IAVM2e1(1-15)-HD를 포함하는 2㎖의 샘플을 정제용 C18 칼럼(22x250㎜)에 주입하고, 0.1% TFA를 포함하는 아세토나이트릴 구배로 용리시켰다. 이 방법은 잔류 티오레독신 성분을 30분 내지 35분 동안 용리시키고, 비절단 융합 단백질을 35분 내지 40분 동안 용리시켰다. 40분 내지 42분으로부터의 분획을 통상적으로 IAVM2e1(1-15)-HD 펩타이드로서 수집하였다. 상기 방법은 매우 순수한 것으로 예상되는 추정상 IAVM2e1(1-15)-HD 성분으로부터 티오레독신 및 융합 단백질 성분을 효과적으로 분해하는 것으로 보인다.

다양한 재조합 IAVM2e1-HD 융합 단백질을 유사하게 처리하였다. TEV 프로테아제 절단 샘플을 정제용 HPLC로 처리하고, 펩타이드의 단량체 형태를 유사하게 회수하였다. 다양한 HPLC 정제 IAVM2e1-HD 펩타이드를 포함하는 분획을 HPLC로 분석하여 순도를 평가하였다. 분석용 HPLC 크로마토그램은 11분 내지 15분 사이에 용리하는 비교적 순수한 IAVM2e1-HD 펩타이드가 티오레독신 및 융합 단백질을 포함하는 검출 가능한 수준의 임의의 다른 오염 단백질 성분 없이 정제용 HPLC 분획으로부터 회수된다는 것을 나타낸다.

IAVM2e1(1-15)-HD 및 IAVM2e1(C16S,C18S)-HD 펩타이드를 시스테인 잔기 없이 설계하고, 그러므로 이황화 연결 이합체 또는 다합체를 형성하지 않을 것이다. 그러므로, 이 펩타이드를 5kDa의 MWCO 재생 셀룰로스 막을 통한 아미콘 교반 세포 한외 여과에 의해 단량체로 회수하고, 아세토나이트릴/TFA 용매로부터 10mM 인산나트륨(pH 8)로 완충제 교환 펩타이드를 보유하였다.

IAVM2e1(C16S)-HD 및 IAVM2e1(C18S)-HD 펩타이드를 1개의 시스테인을 포함하도록 설계하고, 그러므로 이합체를 형성할 수 있다. 이 펩타이드를 10mM 인산나트륨(pH 8)과 완충제 교환한 후, 이후 72시간 동안 공기의 존재 하에 주변 온도에서 산화시켰다. 산화 후, 이합체를 정제용 HPLC로 남은 단량체로부터 정제하였다. 이합체는 통상적으로 단량체보다 대략 2분 내지 3분 늦게 용리되어, 명확한 분획이 정제된 이합체로서 수집되게 하였다. 이합체 분획을 5kDa의 MWCO 재생 셀룰로스 막을 통한 교반 세포 한외 여과에 의해 완충제 교환하였다. 10mM 인산나트륨(pH 8)으로 완충제 교환할 때, 이합체가 용이하게 침전되었다. 최종 샘플을 교환하고 80% 에탄올로 회수하고, 이 에탄올은 이합체 펩타이드를 더 용이하게 가용화시켰다.

(pEV 벡터로부터의) LDR-6His-IAVM2e1-HD 펩타이드를 pET28a 재생 IAVM2e1-HD 펩타이드를 모방하도록 설계하였다. pET28a-IAVM2e1-HD 펩타이드를 통상적으로 정제한 후, 동결건조하고 pH 8에서 완충제 중에 재구성하였다. 2개의 시스테인의 존재로 인해, pET28a-IAVM2e1-HD 펩타이드가 용이하게 주요 분자 종으로서 이합체 및 다합체 형태를 띠는 것으로 관찰되었다. 따라서, 정제된 LDR-6His-IAVM2e1-HD 단량체를 이합체 및 다합체의 형성을 모방하도록 유사하게 처리하였다. HPLC 정제 LDR-6His-IAVM2e1-HD 단량체를 한외 여과시켜 완충제와 10mM 인산나트륨(pH 8)로 교환한 후, 동결건조하고 물로 재구성하여, 10mM 인산나트륨(pH 8)에서 완충 용량을 유지시켰다. 재구성된 LDR-6His-IAVM2e1-HD의 HPLC 분석은 다른 종에 대한 단량체의 상당한 산화를 제시한다.

인산나트륨 완충제 또는 80% 에탄올 중에 재구성된 정제 IAVM2e1-HD 펩타이드를 비환원 조건 하에(단량체로의 이황화 연결 다합체의 환원을 피하기 위해 β-머캅토에탄올 없이) SDS-PAGE에 의해 분석하여 펩타이드의 이동 패턴을 평가하였다. 각각의 펩타이드에 대한 계산된 분자량이 표 3, 칼럼 3에 도시되어 있다.

단량체인 것으로 예상된 IAVM2e1(1-15)-HD 펩타이드는 6.9kDa의 단량체 종의 계산된 크기와 일치하는 겉보기 분자량이 대략 5kDa인 단일 밴드로서 용리하였다. 단량체인 것으로 또한 예상된 IAVM2e1(C16S,C18S)-HD 펩타이드는 8.0kDa의 단량체 종의 계산된 크기와 일치하는 겉보기 분자량이 대략 6kDa인 단일 밴드로서 용리하였다. 이합체인 것으로 예상된 IAVM2e1(C16S)-HD 및 IAVM2e1(C18S)-HD 펩타이드는 16kDa의 이의 이합체 형태의 계산된 크기와 일치하는 14 내지 22kDa의 마커 사이에 단일 밴드로서 용리하였다. 이 샘플의 환원은 단량체 형태와 일치하는 6kDa의 마커 근처의 이동하는 단일 밴드를 보여준다. 다합체 형태를 포함하는 것으로 예상된 LDR-6His-IAVM2e1-HD 펩타이드는 비환원 조건 하에 명확한 5개의 밴드를 보여준다. 샘플의 환원은 10.3kDa의 단량체 형태와 일치하는 6kDa의 마커 위의 주밴드 및 14kDa의 마커 바로 위의 부밴드의 오직 2개의 명확한 밴드를 나타낸다. 14kDa의 마커 위의 부밴드는 무시할 만한 수준의 오염 티오레독신 성분일 수 있다. 대략 20, 30 및 40kDa에서의 밴드는 각각 이합체, 삼합체 및 사합체의 분자 크기와 일치하였다. 도 6의 4 레인에서의 이동 패턴에 기초하여, 이 제제 내의 LDR-6His-IAVM2e1-HD 펩타이드는 주로 단량체 및 이합체 형태로 있는 것으로 보인다. 종합적으로, SDS-PAGE 분석은 적절한 분자 종의 비교적 순수한 IAVM2e1-HD 펩타이드를 나타낸다.

IAVM2e1-HD 펩타이드의 질량을 정확하게 검증하기 위해, 샘플을 SEC-ESI-MS로 처리하였다. 결과가 표 3의 3 및 4 칼럼에 요약되어 있다. 종합적으로, 질량 분광분석법 데이터는 정제된 펩타이드의 측정된 질량이 다양한 IAVM2e1-HD 펩타이드의 계산된 질량과 동일하다는 것을 입증하고, 표적화된 IAVM2e1-HD 펩타이드가 회수된다는 것을 확인시켜 준다.

정제 공정이 내독소를 무시할 만한 수준으로 제거하는지 검증하기 위해, 다양한 IAVM2e1-HD 샘플을 LAL 검정에 의해 내독소 수준에 대해 검정하였다. 결과가 EU/15㎍의 단백질(차후 동물 연구에서 용량당 예상된 양의 단백질)로 표 3의 5 칼럼에 도시되어 있다. 종합적으로, 다양한 샘플 내의 내독소 수준은 무시할 만하고, IAVM2e1(1-15)-HD 샘플은 6.9 EU/15㎍에서 가장 높은 수준을 나타낸다.

새로운 구성체를 시험하기 위해 사용되는 다량의 마우스로 인해, 상이한 L-IAVM2e1-HD 제제의 2의 별도 연구를 수행하였다. 각각의 군에서, 원래 L-LDR-IAVM2e1-HD(pET28a), L-LDR-IAVM2e1-HD(pEV1, 이는 pET28a 버전과 동일한 단백질이지만, 고발현 플라스미드임)를 양성 대조군으로서 사용하고, L 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. 제1 군은 L-IAVM2e1(C16S, C18S)-HD 및 L-IAVM2e1(1-15)-HD를 포함하고, 이들 각각은 IAVM2e1-HD 단백질의 단량체 형태를 생성하는 것으로 예상된다.

크기 분포는 각각의 상이한 리포솜 제제에 대해 변했다. 종합적으로, 리포솜은 41.8㎚ 내지 84.5㎚ 범위의 1 피크 및 189.9㎚ 내지 298.2㎚ 범위의 제2 피크를 갖는 이봉 분포를 보여준다. 반대로, L-LDR-IAVM2e1-HD(pEV1) 제제는 188㎚의 일봉 분포를 보여준다(표 4). 리포솜 단백질 샘플에 대한 이봉 크기 분포는 UPA 측정 동안 수성 표면에서의 IAVM2e1-HD의 막내 이동으로 인할 수 있다. 반대로, 단백질을 포함하지 않는 L 대조군은 57.8㎚의 일봉 가우시안 크기 분포를 갖는다.

각각의 L-IAVM2e1(C16S, C18S)-HD 및 L-IAVM2e1(1-15)-HD 제제에 대해 단백질 농도를 결정하였다. 단백질 농도의 RP-HPLC 분석은 샘플이 원래 출발 물질의 80% 내지 100%를 포함한다는 것을 보여준다. 단백질 손실은 관의 측면에 부착한 단백질, 프로브 음파 처리 동안의 손실 및 무균 여과 동안의 손실 때문이다. pET28 및 pEV로부터의 IAVM2e1-HD 구성체의 다합체 형태 및 분해 결여로 인해, 단백질 농도가 결정되지 않았다.

제2 군은 단백질의 이합체 형태를 생성하는 것으로 예상된 2개의 단일 돌연변이체 뱃치(즉, C16S 및 C18S IAVM2e 펩타이드)를 포함하였다. 리포솜은 크기 분포가 변하는 통상적인 반투명 용액을 생성하였다. 제1 군에서 단량체 IAVM2e1-HD 구성체로 보이는 것처럼, 일봉 분포를 보여주는 몇몇 제제 및 이봉 분포를 보여주는 몇몇 제제가 존재한다(표 5). 이 분포에서의 변산도는 단백질 유형 또는 단백질 농도와 상관되는 것으로 보이지 않았다. 통상적으로, 제1 피크는 48㎚ 내지 17㎚ 범위이고, 제2 피크는 149㎚ 내지 254㎚ 범위이다. 최종 리포솜 제제의 단백질 농도를 RP-HPLC로 결정하였다. 데이터는 매우 적은 단백질이 이 샘플의 제제 동안 소실된다는 것을 나타낸다(표 5).

이전에, 본 발명자들은 L-IAVM2e1-HD 백신이 마우스에서 치사 인플루엔자 바이러스 공격에 대한 강한 보호 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다[Ernst et al., 2006]. L-IAVM2e1-HD 면역화된 마우스 혈청이 미접촉 마우스에서 치사 인플루엔자 공격에 보호되므로, 이 반응은 체액성 면역 반응과 관련된다. 새로운 구성체를 시험하기 위해 사용된 마우스의 전체 수로 인해, 2의 별도 연구를 수행하였다. 제1 연구에서, BALB/c 마우스를, 물질 및 방법 섹션에 기재된 바대로, 원래 L-LDR-IAVM2e1-HD(pET28a), L-LDR-IAVM2e1-HD(pEV; 이는 pET28a 버전과 동일한 단백질이지만, 고발현 플라스미드임), L-IAVM2e1(1-15)-HD 및 L-IAVM2e1(C16S, C18S)-HD로 면역화하였다. 이 실험에서, 절두형(IAVM2e1-15) 및 이중 돌연변이체 IAVM2e1(C16S, C18S) 단백질을 원래 IAVM2e1 단백질과 비교하였다. 15㎍의 (pET28a로부터의) 원래 제제 및 (pEV로부터의) 원래 제제로 면역화된 마우스는 72%의 생존율의 우수한 면역 보호 반응을 나타냈다. 마우스를 5㎍, 15㎍ 또는 30㎍의 L-IAVM2e1(1-15)-HD로 면역화할 때, 마우스 중 86%가 치사 인플루엔자 공격(L 대조군과 비교하여 p<0.05)에 생존하였다. L 대조군을 투여받고 후속하여 공격된 모든 마우스는 9일에 사망했다(도 7a). 추가로, 면역화된 마우스는 대조군 치료군과 비교하여 질환 및 체중 감소의 최소 징후를 나타냈다. 5㎍, 15㎍ 또는 30㎍의 L-IAVM2e1(C16S, C18S)-HD로 면역화된 마우스와 L-IAVM2e1(1-15)-HD로 면역화된 마우스와 비교시, 30㎍의 용량을 투여받는 마우스만이 대조군과 유의적인 차이를 나타냈다(p = 0.006, 86%의 생존율). 5㎍ 또는 15㎍의 L-IAVM2e1(C16S, C18S)-HD를 투여받는 마우스가 각각 57% 및 42%의 생존율을 나타냈다(도 8a). 마우스를 또한 생존율(%)과 상관되는 체중 감소 및 질환 징후에 대해 평가하였다.

제2 연구에서, 마우스를 리포솜 제제로서 단일 시스테인 IAVM2e1 돌연변이체(C16S 또는 C18S)로 면역화하였다. 이 돌연변이체는 IAVM2e1-HD의 이합체 형태를 생성하고, 상기 기재된 단량체 IAVM2e1-HD 형태와 생체내 비교하였다. 마우스의 군을 5㎍, 15㎍ 또는 30㎍의 L-IAVM2e1(C16S)-HD로 면역화하고 후속하여 A/PR/8/34의 10 LD50으로 공격하였다. 면역 보호 반응은 시험된 3 용량 사이에 변했다. 5㎍, 15㎍ 또는 30㎍의 용량으로 면역화된 마우스는 각각 86%, 71% 및 57%의 생존율을 나타냈다. 오직 5㎍(p = 0.004) 및 15㎍(p = 0.032)의 용량이 L 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 나타냈고, L 대조군으로 치료된 모든 마우스는 공격후 9일에 사망하였다. 마우스를 C16S 돌연변이체보다 훨씬 우수한 반응을 나타낸 5㎍, 15㎍ 또는 30㎍의 L-IAVM2e1(C18S)-HD로 치료하였다. 15㎍의 용량을 투여받은 모든 마우스는 치사 공격에 생존하였고, 5㎍ 및 30㎍의 용량을 투여받은 7마리의 마우스 중 1마리를 제외한 모든 마우스(86%)가 생존하였다. 각각의 이 용량은 L 대조군을 투여받는 마우스보다 현저히 우수하였다(p<0.005). 흥미롭게도, 단일 시스테인 돌연변이 구성체 둘 다 비돌연변이 L-LDRIAVM2e1-HD 백신보다 우수한 보호를 생성하였다. 면역화된 마우스의 추가의 평가는 대조군 치료군과 비교하여 질환 및 체중 감소의 최소 징후를 나타냈다.

실시예 3. 결론

IAVM2e1 분절이 2개의 시스테인(제16 및 제18 위치에서; 표 2 참조)을 포함하고, 펩타이드가 이황화 결합하여 다합체에 대해 이합체를 형성할 수 있으므로, IAVM2e1-HD 단백질의 정제가 어려웠다. 단백질이 다양한 형태로 발현되므로, 정제의 분해가 원하는 것보다 낮았다. 오직 1개의 시스테인을 갖거나 임의의 시스테인이 없는 IAVM2e1-HD를 발현시키고 정제함으로써, 본 발명은 더 균일한 단백질 분자를 생성시켰다. 본 발명자들의 데이터는 단일 시스테인 IAVM2e1-HD 돌연변이가 이합체를 형성하지 않고, 티오레독신의 하류에서 발현될 때, 원래 IAVM2e1-HD와 비교하여 필적하는 양의 단백질을 생성한다는 것을 보여준다. IAVM2e1-HD의 단량체 형태를 시험하기 위해, 2개의 추가의 구성체를 제조하였다. 시스테인 둘 다 돌연변이된 1개의 구성체 및 IAVM2e1의 오직 처음 15개의 잔기가 사용되는 제2 구성체를 제조하였다. 둘 다의 경우에, 단백질을 단량체로서 형성하고, 원래 형태 및 단일 시스테인 돌연변이 형태로 동일하게 발현시켰다. 이 데이터는 시스테인이 산화 환경(즉, 리포솜의 제제 중에 사용되는 완충제) 중에 위치할 때 단백질의 이합체화 및 다합체화의 단백질 구조에서 확정적 역할을 한다는 것으로 나타낸다. 단백질의 단량체 형태의 정제는 간단하게 고순도로 정제를 성취하였다. 추가로, 단백질이 티오레독신의 C 말단으로 축합될 때, IAVM2e1-HD 단백질의 발현에 차이가 없다는 것이 명확하다.

본 명세서에 기재된 전임상 결과는 IAVM2e1 항원 분절이 범용 인플루엔자 백신에 실행 가능한 후보물질이라는 증거를 제공한다. 사용되는 펩타이드의 상이한 형태 사이에 변산도가 존재하지만, 거의 모든 구성체가 대조군과 비교하여 적어도 하나의 용량 양에서 상당한 보호 면역 반응을 자극하였다. 예상치 못하게, 이 데이터로부터 이중 시스테인 돌연변이체 및 절두형 IAVM2e1(1-15) 단백질 둘 다 보호 면역 반응을 자극하므로, 시스테인이 보호 면역 반응에서 역할을 하지 않는다는 것이 명확하다.

실시예 4. 참조문헌

실시예 5. HSV2

HSV2 단백질 백신의 효과를 입증하기 위해, 적합한 HSV 항원 함유 리포솜 제제를, IAVM2e1에 치환하는 하나 이상의 하기 HSV2 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들로 이루어진 폴리펩타이드로, 실시예 1에서처럼 제조하였다:

인간 HLA A2:01 형질전화(Tg) 마우스(n = 20/군)를 인간에서 보호 면역 반응을 자극하는 HSV2 백신의 실행가능성을 입증하기 위해 동물 모델로서 사용하였다. 이 백신에서 나타난 5개의 HLA 단상형 중에서, 이 HLA 단상형이 모든 인간 인종 집단 중에서 가장 흔한 HLA 단상형을 나타내므로, HLA A2:01은 최고의 모델이다. 상기처럼, 본 명세서에 사용되는 바대로 적절한 소수성 도메인에 축합된 HSV2 서열(들)의 리포솜 제제를 MPL 또는 CpG 부형제로 제조하였다. 백신접종된 마우스(N=20/군)를 루미넥스 멀티 비드 ELISA 및 ELISPOT 분석(5마리의 마우스/군)을 통해 각각의 HSV2 펩타이드로 이들의 반응에 대해 평가하고, 마우스를 질내로 공격하여 상기 기재된 절차를 이용하여 보호의 정도를 모니터링하였다.

당해 분야의 당업자는 목적을 성취하고 언급된 목표 및 이점, 및 본 명세서에 내재하는 목표 및 이점을 얻기 위해 본 발명이 잘 선택된다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 본 명세서에 제공된 실시예는 바람직한 실시양태의 대표이고, 예시적이며, 본 발명의 범위에 대한 제한으로 의도되지 않는다.

본 발명이 당해 분야의 당업자가 이를 제조하고 사용하기에 충분히 자세히 기재되어 있고 예시되어 있지만, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 대안, 변형 및 개선이 명확해야 한다. 본 명세서에 제공된 실시예는 바람직한 실시양태의 대표이고, 예시적이며, 본 발명의 범위에 대한 제한으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서의 변형 및 다른 사용이 당업자에게 일어난다. 이 변형은 본 발명의 정신 내에 포함되고 특허청구범위에 의해 한정된다.

본 발명의 범위 및 정신을 벗어남이 없이 본 명세서에 개시된 본 발명에 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야의 당업자에게 용이하게 명확하다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보는, 각각의 개별 공보가 참조문헌으로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 정도와 동일한 정도로, 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.

본 명세서에 예시적으로 기재된 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 부재 또는 부재들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본 명세서에서의 각각의 경우에 임의의 용어 "포함하는", "로 필수적으로 이루어진" 및 "로 이루어진"은 다른 2의 용어로 대체될 수 있다. 이용되는 용어 및 표현은 제한이 아니라 명세서의 용어로 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용에서 도시되고 기재된 특징의 임의의 등가물 또는 이의 일부를 배제하고자 하는 의도가 없지만, 청구된 본 발명의 범위 내에 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본 명세서에 개시된 개념의 임의의 특징, 변형 및 변경이 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경이 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다는 것을 이해해야 한다.

다른 실시양태가 하기 특허청구범위 내에 기재되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> MOLECULAR EXPRESS, INC. <120> LIPOSOMAL FORMULATIONS <130> WO2012/149045 <140> PCT/US2012/035034 <141> 2012-04-25 <150> US 61/479,302 <151> 2011-04-26 <160> 83 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 97 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15 Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Ile Ala Ala Ser Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Cys Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe 35 40 45 Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser 50 55 60 Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln 65 70 75 80 Gln Ser Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu 85 90 95 Glu <210> 2 <211> 97 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 2 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe 35 40 45 Lys 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<220> <223> Description of Unknown: Stx 3 TM peptide <400> 24 Ile Met Ile Leu Ile Cys Cys Val Ile Leu Ala Ile Val Ile Ala Ser 1 5 10 15 Thr Ile <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 25 Ile Ile Pro Gly Ile Ser Ala Met Ile Val Ala Leu Met Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asn Lys Pro Pro Glu Thr Leu Ile Thr Thr Ile Asp Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Trp Trp Thr Asn Trp Val Ile Pro Ala Ile Ser Ala Val Ala Val Ala 20 25 30 Leu Met Tyr Arg Leu Tyr Met Ala Glu Asp 35 40 <210> 27 <211> 42 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 27 Ala Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ile Thr Thr Val Glu Ser Asn Ser Ser 1 5 10 15 Trp Trp Thr Asn Trp Val Ile Pro Ala Ile Ser Ala Leu Val Val Ala 20 25 30 Leu Met Tyr Arg Leu Tyr Met Ala Glu Asp 35 40 <210> 28 <211> 42 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Ala Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ile Thr Thr Val Glu Ser Asn Ser Ser 1 5 10 15 Trp Trp Thr Asn Trp Val Ile Pro Ala Ile Ser Ala Leu Ala Val Ala 20 25 30 Leu Met Tyr Arg Leu Tyr Met Ala Glu Asp 35 40 <210> 29 <211> 42 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 29 Ser Lys Pro Met Glu Thr Leu Ile Thr Thr Val Asp Ser Asn Ser Ser 1 5 10 15 Trp Trp Thr Asn Trp Val Ile Pro Ala Ile Ser Ala Leu Ile Val Ala 20 25 30 Leu Met Tyr Arg Leu Tyr Met Ala Asp Asp 35 40 <210> 30 <211> 41 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 30 Gln Lys Pro Ala Glu Thr Leu Ile Thr Thr Val Gln Ser Asn Ser Ser 1 5 10 15 Ser Trp Ser Asn Trp Val Ile Pro Ala Ile Ala Ala Ile Ile Val Ala 20 25 30 Leu Met Tyr Arg Ser Tyr Met Ser Glu 35 40 <210> 31 <211> 42 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 31 Ala Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ile Thr Thr Val Glu Ser Asn Ser Ser 1 5 10 15 Trp Trp Thr Asn Trp Val Ile Pro Ala Ile Ser Ala Leu Val Val Ser 20 25 30 Leu Met Tyr His Phe Tyr Thr Ser Glu Asn 35 40 <210> 32 <211> 42 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 32 Ala Lys Pro Val Glu Thr Leu Ile Thr Thr Val Asp Ser Asn Ser Ser 1 5 10 15 Trp Trp Thr Asn Trp Val Ile Pro Ala Ile Ser Ala Val Val Val Ala 20 25 30 Leu Met Tyr Arg Ile Tyr 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Arg Tyr Tyr Ile Ser Asn 35 40 <210> 41 <211> 42 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 41 Gln Lys Pro Ser Glu Thr Phe Ile Thr Thr Thr Asp Ser Asp Ser Ser 1 5 10 15 Trp Trp Ser Asn Trp Ile Ile Pro Gly Ile Ser Ala Met Ile Val Ala 20 25 30 Leu Met Tyr Arg Phe Tyr Met Val Ser Glu 35 40 <210> 42 <211> 42 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 42 Ser Lys Pro Pro Glu Thr Leu Ile Thr Thr Val Asp Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Trp Trp Thr Asn Trp Val Ile Pro Ala Ile Ser Ala Val Ala Val Ala 20 25 30 Leu Met Tyr Arg Leu Tyr Met Ala Glu Asp 35 40 <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 43 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 44 <211> 50 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 44 atcagatctc gaaaacctgt acttccagtc cctgctgacc gaagttgaga 50 <210> 45 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 45 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 46 <211> 43 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 46 cgcaagcttg tcgacgtcgg aggagtcgtt acaacgagaa ccc 43 <210> 47 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 47 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 48 <211> 38 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 48 cgcaagcttg tcgacgtcgg aggagtcgtt agaacgac 38 <210> 49 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 49 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 50 <211> 45 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 50 cgcaagcttg tcgacgtcgg aggagtcgtt actacgacta cccca 45 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 51 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 <210> 52 <211> 45 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 52 acaaagctta ccccattcgt tacggatcgg ggtctcaact tcggt 45 <210> 53 <211> 62 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 53 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn 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Herpes simplex virus <400> 76 Ser Ser Gly Val Val Phe Gly Thr Trp Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 77 Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Tyr 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 78 Tyr Met Ala Asn Gln Ile Leu Arg Tyr 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 79 Tyr Val Ala Gly Phe Leu Ala Leu Tyr 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 80 Cys Pro Arg Arg Pro Ala Val Ala Phe 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 81 Val Val Arg Gly Pro Thr Val Ser Leu 1 5 <210> 82 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 82 His His His His His His 1 5 <210> 83 <211> 42 <212> PRT <213> Xenopus sp. <400> 83 Gln Lys Pro Ser Glu Thr Phe Ile Thr Thr Thr Asp Ser Asp Ser Ser 1 5 10 15 Trp Trp Ser Asn Trp Ile Ile Pro Gly Ile Ser Ala Met Ile Val Ala 20 25 30 Leu Met Tyr Arg Phe Tyr Met Val Ser Glu 35 40

Claims

삭제
조성물로서,
수성 비히클; 및
리포솜을 포함하되, 상기 리포솜은,
다이미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"),
다이미리스토일포스파티딜글라이세롤("DMPG"), 다이미리스토일트라이메틸암모늄 프로판("DMTAP"), 또는 DMPG 및 DMTAP 둘 다,
적어도 하나의 스테롤; 및
항원 폴리펩타이드를 포함하며, 해당 항원 폴리펩타이드는,
인플루엔자 A M2 세포외 도메인의 적어도 10개의 연속 잔기를 포함하고, 상기 M2 세포외 도메인에서 천연 유래 1개 이상의 시스테인 잔기를 제거하도록 변형된 제1 폴리펩타이드 서열, 및
막 단백질로부터 막관통 서열을 포함하는 인플루엔자 A M2에 대해서 이종성인 제2 폴리펩타이드 서열을 포함하고,
상기 제2 폴리펩타이드 서열은 인플루엔자 A M2에 대해서 이종성인 천연 막 단백질의 막관통 서열을 포함하거나 이 천연 막 단백질로부터 유도되고, 지질 이중층을 횡단하기에 충분한 다수의 잔기를 갖되, 적어도 9개의 연속 잔기는 소수화도 스코어가 0.7 이상인 알파 나선을 형성할 수 있으며,
상기 제1 폴리펩타이드 서열은 상기 제2 폴리펩타이드 서열의 N 또는 C 말단에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링되어 수성 가용성 융합 폴리펩타이드를 제공하고, 상기 융합 폴리펩타이드의 제1 폴리펩타이드 서열은 상기 리포솜의 외면에서 디스플레이되는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 DMPC: DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP : 스테롤의 상대 백분율은 50 몰% 내지 98 몰%의 DMPC:1 몰% 내지 25 몰%의 DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP:1 몰% 내지 25 몰%의 스테롤인 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 DMPC: DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP : 스테롤의 상대 백분율은 70 몰% 내지 98 몰%의 DMPC:1 몰% 내지 15 몰%의 DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP:1 몰% 내지 15 몰%의 스테롤인 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 DMPC: DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP : 스테롤의 상대 백분율은 70 몰% 내지 85 몰%의 DMPC:5 몰% 내지 15 몰%의 DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP :10 몰% 내지 15 몰%의 스테롤인 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 DMPC: DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP : 스테롤의 상대 백분율은 75 몰%의 DMPC: 10 몰%의 DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP : 15 몰%의 스테롤인 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 리포솜은 DMPG를 포함하는 것인 조성물.
제7항에 있어서, 상기 리포솜은 DMTAP를 포함하지 않는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 펩타이도글라이칸, 리포펩타이드, 리포폴리사카라이드, 모노포스포릴 리피드 A, 리포테이코산, 레시퀴모드, 이미퀴모드, 플라젤린, 비메틸화 CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, α-갈락토실세라마이드, 무라밀 다이펩타이드, 모든 트랜스 레티노산, 이중 가닥 바이러스 RNA, 열 충격 단백질, 다이옥타데실다이메틸암모늄 브로마이드, 양이온성 계면활성제, 톨 유사(toll-like) 수용체 효능제, 다이미리스토일트라이메틸암모늄프로판 및 노드형(nod-like) 수용체 효능제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 성분을 추가로 포함하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤, 콜레스테릴 클로로포르메이트, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 라노스테롤, 데스모스테롤 및 캄퍼스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 스테롤을 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 9 중 하나의 2번 내지 22번 잔기로부터 적어도 10개의 연속 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 서열 번호 10 내지 서열 번호 12 중 하나로부터의 적어도 10개의 연속 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 1개 이상의 시스테인 잔기는, 1개 이상의 관심 대상(interest) 시스테인 잔기의 다른 잔기로의 돌연변이에 의해 또는 1개 이상의 관심 대상 시스테인 잔기 앞의 세포외 도메인 서열의 절두(truncation)에 의해, 인플루엔자 A M2 세포외 도메인 서열로부터 제거된 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 서열 번호 13 내지 서열 번호 15 중 하나로부터의 적어도 10개의 연속 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 서열 번호 16을 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드 서열은 사이토크롬 b5, 뮤신-4 베타 사슬, 트랜스페린 수용체, TNFRSF13B, 아미노펩티다제 N, 다이펩티딜 펩티다제 4, 종양 괴사 인자신탁신(Tumor necrosis factorsyntaxin) 3, BclXL 및 R9AP로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 의해 코딩된 막관통 서열을 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드 서열은 서열 번호 17 내지 서열 번호 25 중 하나로부터의 적어도 10개의 연속 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제17항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드 서열은 사이토크롬 b5 단백질에 의해 코딩된 막관통 서열을 포함하는 것인 조성물.
제16항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드 서열은 서열 번호 26 내지 서열 번호 42 중 하나에 의해 코딩된 막관통 서열을 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 서열 번호 60 내지 서열 번호 81로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것인 조성물.
삭제
제2항에 따른 리포솜 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 항원 폴리펩타이드를 재조합으로 발현시키거나 화학적 방법에 의해 합성하는 단계로서, 상기 항원 폴리펩타이드는 비변성 조건 하에 단량체 형태인 것인, 상기 합성하는 단계;
상기 항원 폴리펩타이드를 수용액으로 정제시키는 단계;
상기 항원 폴리펩타이드를 포함하는 수용액을, (ⅰ) DMPC, (ⅱ) DMPG, DMTAP, 또는 DMPG 및 DMTAP 둘 다, 및 (ⅲ) 적어도 하나의 스테롤을 포함하는 지질 혼합물에 첨가하는 단계;
상기 항원 폴리펩타이드 및 지질 혼합물을 건조시키는 단계; 및
수성 비히클의 존재 하에 상기 건조된 항원 폴리펩타이드 및 지질 혼합물을 음파 처리하여 상기 리포솜을 형성하는 단계를 포함하는, 리포솜 조성물의 제조방법.
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