CN110302373A - 利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法 - Google Patents

利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110302373A
CN110302373A CN201910585110.1A CN201910585110A CN110302373A CN 110302373 A CN110302373 A CN 110302373A CN 201910585110 A CN201910585110 A CN 201910585110A CN 110302373 A CN110302373 A CN 110302373A
Authority
CN
China
Prior art keywords
envelope protein
virus envelope
transmembrane region
preparation
liposome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910585110.1A
Other languages
English (en)
Inventor
刘宝全
李林
李贵兴
李春斌
王剑锋
权春善
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Minzu University
Original Assignee
Dalian Nationalities University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Nationalities University filed Critical Dalian Nationalities University
Priority to CN201910585110.1A priority Critical patent/CN110302373A/zh
Publication of CN110302373A publication Critical patent/CN110302373A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法，属于病毒疫苗领域。本发明利用基因工程方法单独表达含有跨膜区的病毒包膜蛋白，再将其与制备的脂质体混合，通过逐步去除表面活性剂的方法使含有跨膜区的病毒包膜蛋白定向镶嵌在脂质体上。本发明的制备方法是以完整的病毒包膜蛋白制备疫苗，利用完整包膜蛋白蛋白的跨膜区使包膜蛋白定向排列在脂质体表面，利用脂质体模拟天然病毒包膜结构，提高疫苗免疫活性。

Description

利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及病毒疫苗领域，特别涉及一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法。
背景技术
疫苗是预防和控制传染病最经济、最有效的手段，从最早的接种用牛痘，到现在多种多样的疫苗，为保护人类健康起到重要作用。
当前使用的疫苗主要有三种类型：减毒活疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗。减毒活疫苗是利用低毒性为代价诱导机体形成抗体，免疫效果不理想并有安全隐患。灭活疫苗只是在使用阶段使病毒灭活，要生产过程中仍是使用有感染性的病毒，生产环节存在风险。基因工程疫苗通过异源表达病毒的包膜蛋白诱导人体形成抗体，过程中不使用活性病毒，过程安全；但基因工程疫苗多是病毒包膜蛋白的胞外域部分，没有完整的病毒包膜蛋白，缺少了跨膜区与胞内域，不能保持天然病毒包膜蛋白的排布形式，免疫效果不如完整的病毒包膜蛋白。
发明内容
本发明为解决现有技术中存在不足，利用脂质体镶嵌病毒的包膜蛋白，使疫苗具有与天然病毒包膜的相似的包膜结构，提高疫苗的免疫活性。
本发明的发明构思是：根据天然病毒包膜蛋白是通过跨膜区镶嵌在一个来源于寄主细胞的膜性上的结构特点，利用脂质体模拟寄主细胞膜，通过病毒包膜蛋白跨膜区使病毒包膜蛋白定向排列在脂质体表面上，形成与天然病毒包膜一致的包膜蛋白结构，提高疫苗的免疫活性。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1利用基因工程方法单独表达含有跨膜区的病毒包膜蛋白；病毒的包膜蛋白都有一段跨膜区并通过跨膜区部分镶嵌在包膜上，跨膜区保证病毒的抗原决定簇正确排列在包膜上，对于病毒的侵染、对于抗原活性都非常重要。利用病毒的包膜蛋白制备疫苗，克隆目的基因时必须包括病毒包膜蛋白的跨膜区部分。
S2以卵磷脂与胆固醇制备脂质体，或与人工合成类脂共同制备脂质体；
S3将含有跨膜区的病毒包膜蛋白与脂质体混合，通过逐步去除表面活性剂的方法使含有跨膜区的病毒包膜蛋白定向镶嵌在脂质体上。具体的方法是：利用含有表面活性剂的溶剂(如：LDAO(月桂基二甲基氧化胺)、Brij-35(L23聚氧乙烯月桂醚)、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、CHAPS、DDM(4.4'-二氨基二苯基甲烷)、SC等)进行含有跨膜区的病毒包膜蛋白的分离与纯化，利用表面活性剂保证病毒包膜蛋白在溶液中的溶解性；把制备好的脂质体同样用表面活性剂溶解，可以保证与病毒包膜蛋白溶液混合过程中不会造成病毒包膜蛋白的沉淀或析出；表面活性剂能够保证病毒包膜蛋白与脂质体(类脂)充分混合，向混合溶液中加入可以吸附表面活性剂的疏水性树脂(也称beads，美国伯乐公司产品，型号：Bio-Beads SM-2)，疏水性树脂吸附表面活性剂同时使类脂与病毒包膜蛋白组装形成脂质体，通过离心去除疏水性树脂及其吸附的表面活性剂，最终获得镶嵌有病毒包膜蛋白的脂质体。也可以不加入疏水性树脂直接使用透析的方法缓慢去除表面活性剂，能够达到相同的效果。
优选地，所述的病毒包膜蛋白为基因工程合成的完整病毒包膜蛋白或使用灭活病毒的包膜蛋白。
优选地，脂质体使用天然磷脂组装，包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺。进一步地，天然磷脂为二油酰磷脂酰胆碱。
优选地，脂质体可以使用胆固醇与人工合成类脂，或胶束、或其他可镶嵌病毒完整包膜蛋白的微粒。
有益效果：本发明的制备方法是以完整的病毒包膜蛋白制备疫苗，利用完整包膜蛋白蛋白的跨膜区使包膜蛋白定向排列在脂质体表面，利用脂质体模拟天然病毒包膜结构，提高疫苗免疫活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明所应用的化学试剂以及仪器如未经特别说明，均可从商业渠道购买。
实施例1
将乙肝病毒表面抗原基因利用化学合成法制备全长基因，与大肠杆菌表达载体pET28a重组后转化大肠杆菌DE3菌株并表达，利用表面活性剂LDAO促进溶解并完成纯化过程。
利用天然磷脂与胆固醇(5:1)制备脂质体，用表面活性剂LDAO溶解后，与乙肝病毒完整包膜蛋白全蛋白的表面活性剂LDAO溶液混合，混合均匀后逐级去除表面活性剂LDAO，制备镶嵌有乙肝病毒完整包膜蛋白全蛋白的脂质体，即：乙肝疫苗。
实施例2
将带状疱疹病毒表面抗原基因(糖蛋白E)利用化学合成法获取全长基因，与大肠杆菌表达载体pET30a重组后转化大肠杆菌DE3菌株并表达，利用表面活性剂Brij-35促进溶解并完成纯化过程。
利用天然磷脂与胆固醇(8:1)制备脂质体，用表面活性剂Brij-35溶解后，与带状疱疹病毒完整包膜蛋白全蛋白的表面活性剂Brij-35溶液混合，混合均匀后逐级去除表面活性剂Brij-35，制备镶嵌有带状疱疹病毒完整包膜蛋白全蛋白(糖蛋白E)的脂质体，即：带状疱疹疫苗。
实施例3
将乙肝病毒表面抗原基因利用化学合成法制备全长基因，与大肠杆菌表达载体pET28a重组后转化大肠杆菌DE3菌株并表达，利用表面活性剂LDAO促进溶解并完成纯化过程。
利用天然磷脂与人工类脂(5:1)制备脂质体，用表面活性剂LDAO溶解后，与乙肝病毒完整包膜蛋白全蛋白的表面活性剂LDAO溶液混合，混合均匀后逐级去除表面活性剂LDAO，制备镶嵌有乙肝病毒完整包膜蛋白全蛋白的脂质体。将疫苗脂质体进行过滤除菌，制得具有完整包膜蛋白的带状疱疹疫苗。
实施例1和实施例3中乙肝病毒抗原的蛋白质序列如下：
实施例2中带状疱疹病毒糖蛋白E的蛋白质序列如下：
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。

Claims (9)

1.一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
S1.利用基因工程方法单独表达含有跨膜区的病毒包膜蛋白；
S2.制备脂质体；
S3.将含有跨膜区的病毒包膜蛋白与脂质体混合，通过逐步去除表面活性剂的方法使含有跨膜区的病毒包膜蛋白定向镶嵌在脂质体上。
2.根据权利要求1所述的一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1中的病毒包膜蛋白为完整病毒包膜蛋白、灭活病毒的包膜蛋白中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2脂质体由天然磷脂组装，包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺。
4.根据权利要求3所述的一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，天然磷脂为二油酰磷脂酰胆碱。
5.根据权利要求1所述的一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2脂质体为胆固醇与人工合成类脂、胶束中的一种组装而成。
6.根据权利要求1所述的一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S3中去除表面活性剂的方法步骤如下：
S3.1用含有表面活性剂的溶剂溶解病毒包膜蛋白；
S3.2将制备好的脂质体溶解在含有表面活性剂的溶剂中；
S3.3将上述两溶液混合后加入疏水性树脂；
S3.4使用离心的方法处理步骤S3.3中的溶液得到最终产品。
7.根据权利要求1所述的一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S3中去除表面活性剂的方法步骤如下：
S3.1用含有表面活性剂的溶剂溶解病毒包膜蛋白；
S3.2将制备好的脂质体溶解在含有表面活性剂的溶剂中；
S3.3将上述两溶液混合均匀；
S3.4使用透析的方法处理步骤S3.3中的溶液得到最终产品。
8.根据权利要求6或7所述的一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S3中的表面活性剂为月桂基二甲基氧化胺、L23聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇辛基苯基醚和4.4'-二氨基二苯基甲烷中的一种。
9.使用权利要求1的方法制备的蛋白疫苗。
CN201910585110.1A 2019-07-01 2019-07-01 利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法 Pending CN110302373A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910585110.1A CN110302373A (zh) 2019-07-01 2019-07-01 利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910585110.1A CN110302373A (zh) 2019-07-01 2019-07-01 利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110302373A true CN110302373A (zh) 2019-10-08

Family

ID=68078585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910585110.1A Pending CN110302373A (zh) 2019-07-01 2019-07-01 利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110302373A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010034432A1 (en) * 1999-12-30 2001-10-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Proteoliposomes containing an integral membrane protein having one or more transmembrane domains
US20040109887A1 (en) * 2000-12-27 2004-06-10 Wyatt Richard T. Immunogenic proteoliposomes, and uses thereof
US20090263470A1 (en) * 2004-05-28 2009-10-22 Beth-Ann Coller Vaccine Compositions Comprising Virosomes and a Saponin Adjuvant
CN102107003A (zh) * 2011-01-05 2011-06-29 重庆大学 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒体疫苗及其制备方法
CN103747797A (zh) * 2011-04-26 2014-04-23 分子表达公司 脂质体制剂
US20180369144A1 (en) * 2013-10-22 2018-12-27 Translate Bio, Inc. Lipid formulations for delivery of messenger rna
CN110327462A (zh) * 2019-07-01 2019-10-15 大连民族大学 一种脂质体疫苗及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010034432A1 (en) * 1999-12-30 2001-10-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Proteoliposomes containing an integral membrane protein having one or more transmembrane domains
US20040109887A1 (en) * 2000-12-27 2004-06-10 Wyatt Richard T. Immunogenic proteoliposomes, and uses thereof
US20090263470A1 (en) * 2004-05-28 2009-10-22 Beth-Ann Coller Vaccine Compositions Comprising Virosomes and a Saponin Adjuvant
CN102107003A (zh) * 2011-01-05 2011-06-29 重庆大学 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒体疫苗及其制备方法
CN103747797A (zh) * 2011-04-26 2014-04-23 分子表达公司 脂质体制剂
US20180369144A1 (en) * 2013-10-22 2018-12-27 Translate Bio, Inc. Lipid formulations for delivery of messenger rna
CN110327462A (zh) * 2019-07-01 2019-10-15 大连民族大学 一种脂质体疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LINA WANG，等: "Functional Reconstitution of Staphylococcus aureus Truncated AgrC Histidine Kinase in a Model Membrane System", 《PLPS ONE》 *
徐磊，等: "基于人工囊泡研究跨膜蛋白的结构和功能综述", 《质量探索》 *
王丽娜，等: "利用表面活性剂介导的方法制备AgrC蛋白脂质体", 《化学学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2086831C (en) Immunostimulating and immunopotentiating reconstituted influenza virosomes and vaccines containing them
Nara et al. Neutralization of HIV‐1: a paradox of humoral proportions
Boyer et al. In vivo protective anti‐HIV immune responses in non‐human primates through DNA immunization
RU2162710C2 (ru) Вакцина против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома
HU229368B1 (en) Novel vaccine composition
CN104244974A (zh) 亨德拉和尼帕病毒g糖蛋白免疫原性组合物
CN101048498B (zh) 包含来自流感病毒和乙型肝炎病毒的抗原的病毒体颗粒
Kurrle et al. Influenza virus‐specific T cell‐mediated cytotoxicity: integration of the virus antigen into the target cell membrane is essential for target cell formation
Scheule Novel preparation of functional Sindbis virosomes
US20020001595A1 (en) Process for the preparation of antiviral agents
Karpenko et al. Results of phase I clinical trials of a combined vaccine against HIV-1 based on synthetic polyepitope immunogens
NZ197306A (en) Isolation of glycoprotein antigens from a virus preparation of a vaccine
CN110302373A (zh) 利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法
CA1214103A (en) Lectin-containing anti-viral vaccines for domestic animals and method of preparation
CN105132386B (zh) 一种外分泌体及其制备方法和其作为肿瘤疫苗的应用
Luan et al. Ionizable lipid nanoparticles enhanced the synergistic adjuvant effect of CpG ODNs and QS21 in a varicella zoster virus glycoprotein E subunit vaccine
CN110327462A (zh) 一种脂质体疫苗及其制备方法
Reiss et al. Influenza type A virus M protein expression on infected cells is responsible for cross-reactive recognition by cytotoxic thymus-derived lymphocytes
Gabalov et al. The adjuvant effect of selenium nanoparticles, Triton X-114 detergent micelles, and lecithin liposomes for Escherichia coli antigens
US9603921B2 (en) Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus
Konno et al. Proteolytic enhancement of human rotavirus infectivity
Kossovsky et al. Preservation of surface‐dependent properties of viral antigens following immobilization on particulate ceramic delivery vehicles
Tretiakova et al. Proof-of-Concept Study of Liposomes with a Set of SARS-CoV-2 Viral Peptidic T-Cell Epitopes as a Vaccine
RU2578160C1 (ru) Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса эбола (варианты)
WO2013043033A2 (es) Método de extracción, comprobacíon de extracto dializado de leucocitos de origen bazo de tiburón, para la obtención de factor de transferecia potencializado, específicamente diseñado para su uso como adyuvante potencializador de vacunas virales

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination