CN103747797B

CN103747797B - 脂质体制剂

Info

Publication number: CN103747797B
Application number: CN201280026044.0A
Authority: CN
Inventors: G·藤井; W·A·恩斯特; 摩尔 J·阿德勒-; L·维茨安
Original assignee: Molecular Express Inc
Current assignee: Molecular Express Inc
Priority date: 2011-04-26
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2017-06-09
Anticipated expiration: 2032-04-25
Also published as: KR101998431B1; EP2701734B1; JP2014518620A; KR20140043348A; US20140287022A1; CN103747797A; EA034702B1; EA201391467A1; WO2012149045A2; EP2701734A4; WO2012149045A3; CA2834349A1; EP2701734A2

Abstract

本发明涉及脂质体疫苗组合物、其制备方法及使用其在动物中刺激免疫反应的方法。所述组合物包含由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱("DMPC")、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油("DMPG")或二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷("DMTAP")或DMPC和DMTAP两者、和至少一种甾醇，以及抗原多肽形成的脂质体，所述抗原多肽包含第一多肽序列和与所述第一多肽序列异源的第二多肽序列，所述第二多肽序列包含得自膜蛋白的跨膜序列，所述跨膜序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成具有约0.7或更高的疏水性评分的α螺旋。

Description

脂质体制剂

相关申请案

本发明要求2011年4月26日提交的美国临时专利申请号61/479,302的优先权，所述临时专利申请据此整体(包括所有表格、附图和权利要求书)并入本文。

发明背景

关于联邦政府资助研究的声明

按照美国国家过敏症和传染病研究所(NIH)资助号U01AI074508和1R43AI078654的条款规定，美国政府拥有本发明的已付清许可以及在有限情况下要求专利所有人就合理条款许可他人的权利。

提供以下对发明背景的讨论仅仅是为了有助于读者理解本发明，并不承认描述或构成本发明的现有技术。

脂质体是由一个(“单层”)或多个(“多层”)磷脂层形成的囊泡。由于磷脂基本单元的两亲特性，脂质体通常包含呈现出亲水外表面并封闭亲水芯的亲水层。脂质体在结合亲水/疏水组分中的多能性、它们的无毒性质、生物降解性、生物相容性、佐剂性、诱导细胞免疫、持续释放特性以及被巨噬细胞的迅速摄取使得它们成为具有吸引力的用于递送抗原的候选物。

已证实脂质体可同时诱导对大部分细菌、原虫、病毒和肿瘤细胞抗原的体液和细胞介导的免疫。虽然一直期待脂质体疫苗的广泛使用，但是此类疫苗很少得到商业开发。脂质体的免疫佐剂作用取决于许多结构特性。此类特性包括脂质体呈递的抗原的三维构象，这种构象可能并不总是模拟抗原的天然构象。

例如，HIV gp41的膜近侧区(MPR)(由跨膜域N端的大约35个氨基酸构成的片段)已被视为可取的疫苗靶点，因为它在病毒分支中高度保守并且对于病毒-细胞融合必不可少。然而，在引发有用的免疫反应中迄今为止的努力尚未取得成功，并且尝试呈递结构约束性表位(偶联到载体蛋白或接枝到重组构建体上)尚未得到中和抗体。除了缺乏关于表位结构的一致性外，MPR相对弱的免疫原性还可导致对重组包膜免疫原的免疫反应，所述重组包膜免疫原针对掩蔽MPR以避免抗体识别的gp41上的免疫优势区。

此外，在形成脂质体前将抗原与脂质体相关联的方法通常将抗原暴露于洗涤剂和/或有机溶剂。相比之下，在形成之后将抗原与脂质体相关联的方法会将脂质体暴露于不利的化学处理。脂质体还可被网状内皮系统和巨噬细胞快速清除，从而降低脂质体作为疫苗的效率。

此外，此类特性还可以包括在体内控制囊泡命运的因素。在形成脂质体前将抗原与脂质体相关联的方法通常将抗原暴露于洗涤剂和/或有机溶剂。相比之下，在形成之后将抗原与脂质体相关联的方法会将脂质体暴露于不利的化学处理。脂质体可被网状内皮系统和巨噬细胞快速清除，从而降低脂质体作为疫苗的效率。

本领域仍然需要可提供脂质体疫苗的方法和组合物，所述脂质体疫苗以可用于刺激免疫反应的方式递送抗原。

发明概述

本发明的目的是提供脂质体组合物、其制备方法及其使用方法。此类组合物可用作疫苗制剂以刺激动物中的免疫反应。

在一个方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含：

a)水性媒介物；以及

b)脂质体，所述脂质体包含：

(i)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、

(ii)二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷(“DMTAP”)或DMPG和DMTAP两者、

(iii)至少一种甾醇；以及

iv)抗原多肽序列，以及

包含天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜序列的第二多肽序列，所述第二多肽序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成具有约0.7或更高的疏水性评分的α螺旋，

其中所述抗原多肽序列直接或间接偶合到所述第二多肽序列的N端或C端以提供水溶性融合多肽，并且其中融合多肽的抗原多肽序列展示在脂质体的外表面上。

在此上下文中的术语“约”是指给定测量值的+/-10％。

出于本发明的目的，多肽序列的α螺旋性和疏水性使用Esienberg等，J.Mol.Biol.(1984)179:125-142的方法采用以下参数进行计算：9的窗口大小、边缘100％的相对权重、线性权重差异以及如下氨基酸量表值：

Ala：0.620 Arg：-2.530 Asn：-0.780 AsP：-0.90 Cys：0.290 Gln：-0.850 Glu：-0.740

Gly：0.480 His：-0.400 Ile：1.380 Leu：1.060 Lys：-1.500 Met：0.640 Phe：1.190

Pro：0.120 Ser：-0.180 Thr：-0.050 Trp：0.810 Tyr：0.260 Val：1.080.

如上所述，合适的疏水序列通常具有跨过脂质双层的足够长度(约15-30个残基；更优选地约18-25个残基)，经预测其至少9个连续残基形成具有约+0.7的疏水性(Esienberg评分)的α螺旋。

在前述某些实施方案中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含：

a)水性媒介物；以及

b)脂质体，所述脂质体包含：

(i)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、

(iii)至少一种甾醇；以及

iv)包含含有M2胞外域的至少10个连续残基的第一多肽序列的抗原多肽，所述序列经修饰以移除天然存在于所述M2胞外域中的一个或多个半胱氨酸残基，以及

如本文所用的术语“M2胞外域”是指衍生自IAV M2蛋白的多肽，其包含得自天然或共有M2蛋白序列胞外域的至少10个氨基酸残基，并且不含M2蛋白跨膜域的全部或一部分，所得的M2胞外域多肽因而可溶于水性介质。

天然IAV M2蛋白序列的实例包括：

该清单无意为限制性的，因为已对数百种IAV分离蛋白进行了测序，并推导了M2蛋白序列。在这些序列中，第2-22位残基表示胞外域(起始子甲硫氨酸通常被移除)；第23-43位残基表示跨膜域，而第44-97位残基表示胞浆域。

共有IAV M2胞外域序列已通过许多IAV分离蛋白的相关性测定。不同物种来源的病毒分离蛋白的三个共有序列由Betakova,Current Pharmaceutical Design,2007,13,3231-3235进行了描述：

人(SEQ ID NO：10)：SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD

猪(SEQ ID NO：11)：SLLTEVETPIRNGWECKCNDSSD

禽(SEQ ID NO：12)：SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD

在某些实施方案中，半胱氨酸残基从这些序列中移除。这可通过半胱氨酸残基突变成另一残基(例如丝氨酸)或通过在半胱氨酸残基之前将胞外域截短而完成。在优选的实施方案中，可用于本文所述的抗原多肽的IAV M2胞外域序列包含来自以下序列一者或多者的至少10个连续残基，最优选所有15个残基：

人(SEQ ID NO：13)：SLLTEVETPIRNEWG；

猪(SEQ ID NO：14)：SLLTEVETPIRNGWE；或

禽(SEQ ID NO：15)：SLLTEVETPTRNGWE

在其中半胱氨酸已突变成丝氨酸的这样的优选IAV M2胞外域序列的一个实例中，可用于本文所述的抗原多肽的IAV M2胞外域序列包括：

(SEQ ID NO：16)：SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD

HSV2抗原多肽序列包括但不限于以下这些(SEQ ID NO：60-81)：

出于本发明的目的，多肽序列如果与天然存在的蛋白至少90％相同、更优选95％相同、最优选至少97％相同，则该多肽序列“衍生”自特定的天然存在的蛋白序列。

出于本发明的目的，跨膜序列如果得自或衍生自与得出或衍生出抗原多肽序列的蛋白不同的天然存在的蛋白则为“异源的”。可用于本发明的天然存在蛋白的示例性跨膜域在下文描述。

为了方便起见，在上面的部分(ii)中选择的脂质将在下文称为DMPG/DMTAP，其旨在表示DMPG、DMTAP或两者的混合物。在某些实施方案中，DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为50％至98％的DMPC:1％至25％的DMPG/DMTAP:1％至25％的甾醇，并在某些其它实施方案中，为70％至98％的DMPC:1％至15％的DMPG/DMTAP:1％至15％的甾醇。这并非暗示没有其它组分存在于脂质体中；而是代表按彼此的摩尔数计的DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比。在某些实施方案中，脂质体还可以包含一种或多种本领域熟知的另外的组分，诸如肽聚糖、脂肽、脂多糖、单磷酰脂A、脂磷壁酸、瑞喹莫德、咪喹莫特、鞭毛蛋白、含未甲基化CpG基序的寡核苷酸、α-半乳糖神经酰胺、胞壁酰二肽、全反式维甲酸、双链病毒RNA、热休克蛋白、二(十八烷基)二甲基溴化铵、阳离子表面活性剂、toll样受体激动剂、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷和nod样受体激动剂。

在优选的实施方案中，这些相对百分比为70％至85％的DMPC:5％至15％的DMPG/DMTAP:10％至15％的甾醇，更优选地约75％的DMPC、约10％的DMPG/DMTAP和约15％的甾醇。如本文用在此语境中的术语“约”是指给定测量值的+/-10％。DMPG作为在上面的部分(ii)中选择的脂质是尤其优选的。

如本文所用的术语“甾醇”是指具有类固醇特有的4元环结构和3碳位的羟基(-OH)或酯(-OR)取代的任何分子：

技术人员将会理解，甾醇可在其它环碳的一个或多个处被进一步取代，并且还可以在环中包含多个双键。在某些实施方案中，甾醇选自胆固醇、胆固醇氯甲酸酯、豆甾醇、谷甾醇、麦角固醇、羊毛甾醇、链甾醇和菜油甾醇。该清单无意为限制性的。

如本文所述，有利的是，将抗原多肽制备为可溶于水溶液的融合蛋白，尽快存在疏水性跨膜域。提供水溶性抗原构建体(1)使得构建体能够单独地由脂质体使用从生物体作为融合蛋白而表达的水性体系产生或使用常规水性合成化学方法产生；以及(2)使得能够采用后续标准水性纯化程序。参见WO00/016746，其据此整体(包括所有表格、附图和权利要求书)并入本文。

出于本发明的目的，如果在两个多肽之间的肽键之间不存在居间化学键则两个多肽彼此“直接偶合”，而如果连接性化学结构连接两个多肽，则两个多肽“间接偶合”。间接偶合的例子可以是一个或多个氨基酸残基、二硫键或双官能化学交联试剂。该清单无意为限制性的。共价偶合两个多肽序列的方法是本领域熟知的。例如，可使用标准分子生物学技术作为同时包含M2胞外域残基和跨膜域残基的单个“融合”蛋白而合成或表达抗原多肽。在M2胞外域残基和跨膜域残基作为单独的分子合成或表达的情况下，可以采用化学交联剂，诸如Wong,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking,CRC Press,BocaRaton,Fla.,1991中所讨论的那些。这些试剂通常提供偶合到肽的氨基酸侧链的官能团。可使用交联剂靶向的部分包括伯胺和ε-胺类、巯基类、羰基类、羟基类和羧酸类。此外，许多反应性基团可使用诸如光反应性苯基叠氮化合物的交联剂非选择性偶合。两个序列可直接端对端偶合，或在目标两个多肽序列之间可包括另外的连接原子或氨基酸残基。

由脂质混合物制备脂质体的合适方法是本领域熟知的。参见例如Basu&Basu,Liposome Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology).Humana Press,2002；Gregoriadis,Liposome Technology.第3版.Informa Healthcare,2006。优选的方法包括其中所述的挤出、匀化和超声方法。包括干燥脂质体混合物然后在水性媒介物中水合并超声以形成脂质体的制备本发明脂质体的示例性方法在下文描述。优选的类固醇衍生物、将免疫原性多肽或碳水化合物共价偶合到此类衍生物的方法以及共价键合在上文和下文详细讨论。

在某些实施方案中，提供特定平均大小范围内的脂质体，因为大小可影响脂质体在经粘膜递送时的摄取效率和/或经静脉内递送时的清除效率。脂质体大小可通过本领域熟知的方法测定，包括光子相关光谱法、动态光散射等。在优选的实施方案中，脂质体的直径基本上在50与500nm之间，更优选地基本上在50与300nm之间。如本文在此语境中所用的术语“基本上”意指至少75％、更优选80％、最优选90％的脂质体在指定的范围内。

在某些实施方案中，DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为50％至98％的DMPC:1％至25％的DMPG/DMTAP:1％至25％的甾醇，并在某些其它实施方案中，为70％至98％的DMPC:1％至15％的DMPG/DMTAP:1％至15％的甾醇。如上所讨论，这并非暗示没有其它组分存在于脂质混合物中(并因此存在于脂质体中)；而是代表按彼此的摩尔数计的DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比。在某些实施方案中，脂质混合物还可以包含本领域熟知的一种或多种另外的组分，诸如：肽聚糖、脂肽、脂多糖、单磷酰脂A、脂磷壁酸、瑞喹莫德、咪喹莫特、鞭毛蛋白、含未甲基化CpG基序的寡核苷酸、α-半乳糖神经酰胺、胞壁酰二肽、全反式维甲酸、双链病毒RNA、热休克蛋白、二(十八烷基)二甲基溴化铵、阳离子表面活性剂、toll样受体激动剂、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷和nod样受体激动剂。

在最终组合物中抗原多肽的优选浓度在约0.05至1mg/mL的范围内，更优选地在约0.1至0.6mg/mL的范围内。如本文用在此语境中的术语“约”是指给定测量值的+/-10％。

在某些实施方案中，方法还包括选择特定平均大小范围内的脂质体。脂质体大小可例如通过将包含脂质体的水性媒介物挤出通过具有选定孔径的膜并收集流过膜的材料而加以选择。在优选的实施方案中，将脂质体的直径选择为基本上在50与500nm之间，更优选地基本上在50与200nm之间，最优选地基本上在50与150nm之间。如本文在此语境中所用的术语“基本上”意指至少75％、更优选80％、最优选90％的脂质体在指定的范围内。

在某些实施方案中，跨膜序列得自或衍生自在其天然背景中具有信号锚定序列的异源膜蛋白。如本文所用，这是指包含得自诸如II型或III型膜蛋白的蛋白的跨膜域的至少10个连续残基(在某些实施方案中，至少15个连续残基，在另外其它实施方案中，至少18个连续残基，在还有其它实施方案中，至少20个连续残基，以及在一些实施方案中，25个或更多个连续残基)的多肽序列。此类序列通常具有跨过脂质双层的足够长度(约15-30个残基；更优选地约18-25个残基)，并且经预测其形成每个残基具有约+1.5/的疏水性(Eisenberg等评分)的α螺旋。在此上下文中的术语“约”是指给定测量值的+/-10％。II型和III型膜蛋白不含控制膜插入和拓扑结构的N端信号肽，相反通过介导多肽转位并将蛋白锚定在膜中的作为不可裂解的信号序列的疏水性“信号锚定序列”而在翻译后插入膜。

这样的蛋白的一个实例为细胞色素b5。细胞色素b5多肽由两个不同的通过胰蛋白酶敏感性片段连接的结构域组成。氨基近侧结构域是涉及电子传输的催化结构域，而疏水性“羧基近侧”结构域起到将蛋白锚定在膜中的作用。本领域已知的其它合适的单次跨膜蛋白包括粘蛋白-4β链、转铁蛋白受体、TNFRSF13B、氨肽酶N、二肽基肽酶4、肿瘤坏死因子突触融合蛋白3、BclXL和R9AP。该清单无意为限制性的。

在某些替代实施方案中，跨膜序列得自或衍生自作为具有多个信号锚定序列的多次跨膜蛋白的异源膜蛋白，诸如细菌视紫红质、G蛋白偶联受体(诸如CCRs1-10)、CXCR1、乙酰胆碱受体、肾上腺髓质素受体等、细胞色素C氧化酶、烟碱型乙酰胆碱受体、mGluR和水通道蛋白。该清单无意为限制性的。

合适的跨膜域的实例包含得自以下序列中的一个或多个的10个或更多个连续残基。许多其它这样的结构域是本领域熟知的，并且可预测序列形成跨膜域，如使用DAS服务器所计算(Cserzo,M.,E.Wallin,I.Simon,G.von Heijne,and A.Elofsson.1997.ProteinEng.10:673-676)。

R9AP TM(SEQ ID NO：17)：LIVSLLLCGTALVAITL

mGluR1 TM(SEQ ID NO：18)：IIAIAFSCLGILVTLFVTLIFVLY

Cyt b5a TM(SEQ ID NO：19)：VIPAISAVAVALMY

Cyt b5a TM bov(SEQ ID NO：20)：LIPAISALFVALIY

Cyt b5a TM sus(SEQ ID NO：21)：VIPAISALVVSLMY

Cyt b5a TM xen(SEQ ID NO：22)：LIPAAAVVLLGFMY

BclXL TM(SEQ ID NO：23)：TGMTVAGVVLLGS

Stx 3 TM(SEQ ID NO：24)：IMILICCVILAIVIASTI

MGC80327 xen TM(SEQ ID NO：25)：IIPGISAMIVALMY

以Cyt b5a序列作为示例性疏水跨膜域，本发明的抗原融合蛋白可包含以下序列之一的全部或任何连续部分，前提条件是该序列至少包含带下划线的残基：

智人(Swiss-Prot P00167)(SEQ ID NO：26)

NKPPETLITTIDSSSSWWTNWVIPAISAVAVALMYRLYMAED

褐家鼠(Swiss-Prot P00173)(SEQ ID NO：27)

AKPSETLITTVESNSSWWTNWVIPAISALVVALMYRLYMAED

小家鼠(Swiss-prot P56395)(SEQ ID NO：28)

AKPSDTLITTVESNSSWWTNWVIPAISALAVALMYRLYMAED

家兔(Swiss-Prot P00169)(SEQ ID NO：29)

SKPMETLITTVDSNSSWWTNWVIPAISALIVALMYRLYMADD

红原鸡(Swiss-Prot P00174)(SEQ ID NO：30)

QKPAETLITTVQSNSSSWSNWVIPAIAAIIVALMYRSYMSE

猪(Swiss-Prot P00172)(SEQ ID NO：31)

AKPSETLITTVESNSSWWTNWVIPAISALVVSLMYHFYTSEN

家马(Swiss-Prot P00170)(SEQ ID NO：32)

AKPVETLITTVDSNSSWWTNWVIPAISAVVVALMYRIYTAED

金黄地鼠(Swiss-Prot P70116)(SEQ ID NO：33)

AKPSESLITTVESNSSWWTNWVIPAVSALAVALMYRLYMGRR

绵羊(Swiss-Prot C9E8M7)(SEQ ID NO：34)

TKPSESIITTIDSNSSWWTNWLIPAISALVVALMYHLYTSEN

非洲爪蟾(Swiss-Prot Q28EA4)(SEQ ID NO：35)

KNQGKNDVLLTTSSSSSSSWSSWLIPAAAVVLLGFMYRFYMVD

家蚕(Swiss-Prot Q2F5S4)(SEQ ID NO：36)

QYSWEDTAKTSETEASFVNSWKFPVLLGLALTLLYSYIFG

油橄榄(Swiss-Prot O24651)(SEQ ID NO：37)

KQPHYNQDKTSDFIIKLLQFLVPLFILGVAVGIHFYTKSSA

沼泽红假单胞菌(Swiss-Prot Q07P44)(SEQ ID No：38)WCGKEATEAYATKTKGRAHTREADELLPKYRIGRFAP

热带爪蟾(Swiss-Prot Q28EA4)(SEQ ID NO：39)

QKPTETFITTTDSDSSWWSNWIIPGISAFIVALMYRFYMASE

海鞘类被囊动物(Swiss-Prot Q9GV21)(SEQ ID NO：40)

QEEQPQFVTTHESMAETSSWSNWVIPAIVALAVALVYRYYISN

cyt b5蛋白序列的以上清单无意为限制性的。其它类似蛋白也是本领域熟知的。优选地，这样的多肽序列包含与通过Swiss-Prot登录号在上文列出的cyt b5蛋白序列之一至少70％的序列同一性，并且优选地与上文作为SEQ ID NO：26列出的人类序列在上列整个42个残基长度上至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％的序列同一性。序列同一性采用以默认参数设置的碱基局部对准检索工具(BLAST)(Altschul，S.F.等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)测定。应当理解，可使用遗传密码的简并性产生核酸序列的变化以产生均编码基本上相同蛋白的多个核酸序列。以举例的方式，本发明的抗原融合蛋白可包含以下序列的全部或任何连续部分，前提条件是该序列至少包含带下划线的残基：

非洲爪蟾MGC80327蛋白(Swiss-Prot Q6DE13)(SEQ ID NO：41)

QKPSETFITTTDSDSSWWSNWIIPGISAMIVALMYRFYMVSE

猕猴EMBL：CO646551(SEQ ID NO：42)

SKPPETLITTVDSSSSWWTNWVIPAISAVAVALMYRLYMAED

在相关的方面，本发明涉及纯化的抗原多肽，所述抗原多肽包含：选择为在动物中建立体液和/或细胞介导的免疫反应的第一多肽序列，第一多肽序列直接或间接偶合到第二多肽序列的N端或C端，第二多肽序列包含天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜序列，所述第二多肽序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成疏水性评分为约0.7或更大的α螺旋，其中所述纯化的抗原多肽序列为水溶性的。

某些示例性实施方案中，本发明提供纯化的抗原多肽，所述抗原多肽包含含有M2胞外域的至少10个连续残基的第一多肽序列，所述序列经修饰以移除天然存在于所述M2胞外域中的一个或多个半胱氨酸残基，所述抗原多肽任选地包含第二多肽序列，所述第二多肽序列包含天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜蛋白，所述第二多肽序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成疏水性评分为约0.7或更大的α螺旋，其中所述纯化的抗原多肽序列为水溶性的，其中所述第一多肽序列直接或间接偶合到所述第二多肽序列的N端或C端。

在其它方面，本发明涉及使动物免疫的方法。这些方法包括通过肠胃外或肠道途径向所述动物递送有效量的本发明的组合物。制备此类组合物的优选材料、方法和条件在上文和下文详细讨论。

优选的肠道给药途径包括通过口(口腔)、鼻腔、直肠和阴道途径递送。优选的肠胃外给药途径包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内途径。

在某些实施方案中，本发明的方法包括多次递送本发明的组合物，通常称为“初免/加强”免疫方案。在优选的实施方案中，初免和加强递送的一者或多者包括通过肠胃外或肠道途径向动物递送本发明的脂质体组合物。在此类免疫方案中，初免递送可通过与一次或多次加强递送不同的给药途径进行。例如，初免递送可通过皮下递送免疫原进行，而加强递送可通过肌内递送而进行。

此外，目标抗原的初免和一次或多次加强递送可以是“同源的”，这意味着初免和加强均包括递送本发明的脂质体组合物；或者可以是“异源的”，也就是说初免或加强递送之一包括递送本发明的脂质体组合物，而另一种递送可通过不同的疫苗平台进行。此类替代性疫苗平台包括但不限于递送非脂质体疫苗制剂中的抗原、递送编码抗原的DNA疫苗、递送重组病毒疫苗等。

在另一方面，本发明涉及制备本发明的脂质体组合物的方法。这些方法包括表达或合成抗原多肽，其中抗原多肽在非变性条件下为单体形式；纯化抗原多肽；将包含抗原多肽的水溶液加到包含(i)DMPC、(ii)DMPG、DMTAP或DMPG和DMTAP两者，以及(iiI)至少一种甾醇的脂质混合物中；干燥抗原多肽和脂质混合物；以及在存在水性媒介物的情况下对干燥的抗原多肽和脂质混合物进行超声处理以形成脂质体。

本发明的另一个目的是提供被构造和布置成表达目标多肽的核酸，目标多肽作为具有天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜序列的融合蛋白。此类核酸优选地进行分离或纯化，因为那些术语在本文进行了定义。

在第一方面，本发明的核酸具有编码融合蛋白的核酸序列，所述序列包含：

编码硫氧还蛋白的第一核酸序列；

编码目标多肽序列的第二核酸序列；以及

编码天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜序列的第三核酸序列，所述第三核酸序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成具有约0.7或更高的疏水性评分的α螺旋，

其中所述核酸序列被构造成使得在表达所述核酸时，硫氧还蛋白在跨膜序列的N端表达。

在某些实施方案中，本发明的核酸还包含有利于在表达系统中使用此类核酸的一个或多个另外的核酸序列。此类核酸序列可包括可操作地连接到此类核酸的表达控制序列(诸如启动子序列和核糖体结合位点)以提供表达载体。另有其它核酸序列包含亲和标记、检测标记和/或蛋白酶裂解位点。该清单无意为限制性的。

在多个实施方案中，在这样的载体中的核酸序列的顺序被构造成使得在融合蛋白中从N端到C端的表达顺序为：硫氧还蛋白-目标多肽序列-跨膜序列，或硫氧还蛋白-亲和标记-蛋白酶裂解位点-目标多肽序列-跨膜序列，硫氧还蛋白-蛋白酶裂解位点-目标多肽序列-跨膜序列，或硫氧还蛋白-跨膜序列-目标多肽序列，或硫氧还蛋白-亲和标记-蛋白酶裂解位点-跨膜序列-目标多肽序列，或硫氧还蛋白-蛋白酶裂解位点-跨膜序列-目标多肽序列。在每种情况下，这样的核酸序列优选地处于表达载体中并可操作地连接到合适的表达控制序列。

如下文所讨论，表达宿主的异源蛋白序列的表达通常可以通过以下方式改善：将待表达序列中的罕见密码子替换为更密切反映宿主系统的密码子偏倚的其它密码子，而不用修饰氨基酸序列(称为“密码子优化”)。在多个实施方案中，对本发明的核酸的至少一部分进行密码子优化。以举例的方式，当将大肠杆菌选择为表达物种时，对上述第一、第二和第三核酸序列的一者或多者进行密码子优化，以考虑已知存在于大肠杆菌中的密码子偏倚。

在多个实施方案中，编码目标多肽序列的第二核酸序列可编码抗原序列、多肽靶向配体(例如结合到在本文称为“受体”的抗体或其它氨基酸序列)、融合多肽序列等，它们对于硫氧还蛋白和跨膜序列均为异源的。

在相关的方面，本发明涉及用这样的核酸载体转化的宿主细胞。在某些方面，转化的宿主细胞可使用通过载体编码的选择性标记以及编码宿主细胞所表达的融合蛋白的核酸进行选择。任选地，融合蛋白可从宿主细胞中分离并在水性介质中纯化。该融合蛋白然后可结合到如上所讨论的脂质体中，使得目标多肽序列展示在脂质体的表面上。

应当理解，本发明在其申请中不限于在以下说明中所示的或在附图中显示的组成部分的构造和排列的细节。本发明除了所述的那些外还能够具有其它实施方案并能够以多种方式实践和进行。另外，应当理解，本文以及说明书摘要采用的词组和术语是为了进行说明而不应视为进行限制。

因此，本领域的技术人员将认识到，本公开所依赖的概念可容易地用作设计其它结构、方法和系统以执行本发明的若干目的的基础。因此，重要的是，权利要求书被视为包括此类等同构造，只要它们不背离本发明的精神和范围即可。

附图简述

图1-10示出了用于实施本发明的多种多肽跨膜序列的疏水性图，如使用Esienberg等，J.Mol.Biol.(1984)179:125-142的方法所计算。

发明详述

“施用”在应用于人类、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、兽医受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时是指但不限于使外源配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物接触受试者、细胞、组织、器官或生物流体等。“施用”可指例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。细胞的处理涵盖使试剂接触细胞，以及使试剂接触流体，其中流体与细胞接触。“施用”还涵盖例如通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一细胞对细胞的体外和间接体内处理。

“激动剂”在涉及配体和受体时包括刺激受体的分子、分子的组合、复合物、或试剂的组合。例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可涵盖GM-CSF、GM-CSF的突变蛋白或衍生物、GM-CSF的肽模拟物、模拟GM-CSF生物功能的小分子或刺激GM-CSF受体的抗体。

“拮抗剂”在涉及配体和受体时包括对受体起到抑制、对抗、下调和/或脱敏作用的分子、分子的组合或复合物。“拮抗剂”涵盖抑制受体的组成型活性的任何试剂。组成型活性是在不存在配体/受体相互作用的情况下显现的活性。“拮抗剂”还涵盖抑制或防止受体的刺激(或调控)活性的任何试剂。以举例的方式，GM-CSF受体的拮抗剂包括但不限于结合到配体(GM-CSF)并防止其结合到受体的抗体，或结合到受体并防止配体结合到该受体的抗体，或其中抗体将受体锁定在无活性构象。

“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定的核酸序列，保守修饰变体是指编码相同的氨基酸序列或具有一个或多个保守取代的氨基酸序列的核酸。保守取代的实例是以下组之一中的氨基酸交换为同一组中的另一氨基酸(授予Lee等的美国专利号5,767,063；Kyte and Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157:105-132)。

(1)疏水：正亮氨酸、Ile、Val、Leu、Phe、Cys、Met；

(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe；以及

(7)小氨基酸：Gly、Ala、Ser。

“有效量”涵盖但不限于可改善、逆转、缓解、防止或诊断医疗病症或障碍的症状或体征的量。除非另外明确地或通过上下文指明，否则“有效量”不限于足以改善病症的最低量。

“基因”是指编码寡肽或多肽的核酸序列。寡肽或多肽可以是具有生物活性的、具有抗原活性的、无生物活性的或无抗原活性的等等。术语“基因”涵盖例如编码特定寡肽或多肽的开放阅读框(ORF)的总和，ORF与编码内含子的核酸的总和，ORF与可操作地连接的启动子的总和，ORF与可操作地连接的启动子和任何内含子的总和，ORF与可操作地连接的启动子、内含子和启动子以及其它调控元件诸如增强子的总和。在某些实施方案中，“基因”涵盖调控基因表达所需的任何顺式序列。术语“基因”还可以指编码肽的核酸，所述肽涵盖抗原或肽、寡肽、多肽或蛋白的抗原活性片段。术语“基因”未必暗示编码的肽或蛋白具有任何生物活性，或甚至该肽或蛋白具有抗原活性。编码不能表达的序列的核酸序列通常被视为假基因。术语“基因”还涵盖编码核糖核酸诸如rRNA、tRNA或核糖酶的核酸序列。

“配体”是指作为受体激动剂或拮抗剂的小分子、肽、多肽或者膜相关或膜结合分子。“配体”还涵盖不是激动剂或拮抗剂并且不具有激动剂或拮抗剂性质的结合剂。按照惯例，如果配体在第一细胞上是膜结合的，则受体通常存在于第二细胞上。第二细胞可具有与第一细胞相同的种类(相同的名称)，或者它可具有与第一细胞不同的种类(不同的名称)。配体或受体可完全在细胞内，也就是说，其可以位于细胞溶质、细胞核或一些其它细胞内区室中。配体或受体可改变其位置，例如从细胞内区室改变到质膜的外表面。配体和受体的复合物称为“配体受体复合物”。如果配体和受体涉及信号传导通路，则配体存在于信号传导通路的上游位置，而受体存在于信号传导通路的下游位置。配体可以为抗体。如本文所用的术语“抗体”是指衍生自一种或多种免疫球蛋白基因的、在一种或多种免疫球蛋白基因后模制的或基本上由一种或多种免疫球蛋白基因编码的能够特异性结合抗原或表位的肽或多肽或其片段。参见例如Fundamental Immunology,第3版,Edition,W.E.Paul编,RavenPress,N.Y.(1993)；Wilson(1994；J.Immunol.Methods 175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25:85-97。术语“抗体”包括保持结合抗原的能力的抗原结合部分，即“抗原结合位点”(例如片段、子序列、互补决定区(CDR))，包括(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其为包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体以引用的方式也包括在术语“抗体”内。

“核酸”是指单链、双链形式或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。核酸的非限制性实例为例如cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸。特定的核酸序列还可以隐含地涵盖“等位变体”和“剪接变体”。

在启动子和编码mRNA的核酸的背景下的“可操作地连接”意指启动子可用于引发该核酸的转录。

术语“百分比序列同一性”和“％序列同一性”是指通过两个或更多个氨基酸或核酸序列的比较或比对发现的序列相似性的百分比。百分比同一性可通过以下方式对两个分子之间的序列信息进行直接比较而测定：比对序列，对两个比对序列之间的精确匹配数计数，除以较短序列的长度，以及将结果乘以100。计算序列同一性的算法为Smith-Waterman同源性搜索算法(参见例如Kann和Goldstein(2002)Proteins 48:367-376；Arslan等(2001)Bioinformatics 17:327-337)。

所谓“纯化的”和“分离的”在涉及多肽时意指多肽在基本上不存在在自然界中与之相关的其它生物大分子的情况下存在。如本文所用的术语“纯化的”意指：所鉴定的多肽往往占所存在多肽的至少50％，更往往占所存在多肽的至少60％，典型地占所存在多肽的至少70％，更典型地占所存在多肽的至少75％，最典型地占所存在多肽的至少80％，通常占所存在多肽的至少85％，更通常占所存在多肽的至少90％，最通常占所存在多肽的至少95％，以及照惯例占所存在多肽的至少98％或更多。水、缓冲剂、盐、洗涤剂、还原剂、蛋白酶抑制剂、稳定剂(包括添加的蛋白，诸如白蛋白)和赋形剂以及分子量小于1000的分子的重量通常用于确定多肽纯度。参见例如在授予Covacci等的美国专利No.6,090,611中的纯度讨论。

“肽”是指氨基酸的短序列，其中氨基酸通过肽键彼此连接。肽可以是游离的或结合到另一部分，诸如大分子、装置、寡糖或多糖和/或多肽。如果肽结合到多肽链中，则术语“肽”仍可用于具体指代氨基酸的短序列。“肽”可通过肽键或某一其它类型的键合连接到另一部分。肽的长度为至少两个氨基酸并通常小于约25个氨基酸，其中最大长度取决于惯例或背景。术语“肽”和“寡肽”可互换使用。

“蛋白”通常是指包含多肽链的氨基酸序列。蛋白还可以指多肽的三维结构。“变性蛋白”是指具有一定的残余三维结构的部分变性的多肽，或者是指基本上无规的三维结构，即完全变性的。本发明涵盖多肽变体的试剂和使用方法，例如涉及糖基化、磷酸化、硫酸盐化、二硫键形成、脱酰胺化、异构化、信号或先导序列加工中的裂解位点、共价或非共价结合的辅因子、氧化的变体等等。二硫键连接的蛋白的形成有所描述(参见例如Woycechowskyand Raines(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4:533-539；Creighton等(1995)TrendsBiotechnol.13:18-23)。

“重组”当涉及例如核酸、细胞、动物、病毒、质粒、肽、多肽、蛋白、载体等使用时是指通过引入外源非天然核酸、改变天然核酸或通过完全或部分地衍生自重组核酸、细胞、病毒、质粒或载体而进行修饰。重组蛋白是指例如衍生自重组核酸、病毒、质粒、载体等的蛋白。“重组细菌”涵盖其中基因组通过重组方法例如通过突变、缺失、插入和/或重排而进行工程改造的细菌。“重组细菌”还涵盖经修饰以包含重组基因组外核酸例如质粒或第二染色体的细菌，或其中现有的基因组外核酸被改编的细菌。

“选择性标记”涵盖允许选择含有该选择性标记的细胞的核酸。选择性标记的实例包括但不限于例如：(1)编码提供对其它毒性化合物(例如抗生素)抗性的产物或编码对其它有害化合物(例如蔗糖)易感性的核酸；(2)编码原本在受体细胞中缺乏的产物的核酸(例如tRNA基因、营养缺陷型标记)；(3)编码抑制基因产物活性的产物的核酸；(4)编码可容易地鉴定的产物的核酸(例如表型标记，诸如β-半乳糖苷酶、绿荧光蛋白(GFP)、细胞表面蛋白、表位标签、FLAG标签)；(5)可通过杂交技术例如PCR或分子信标鉴定的核酸。

“特异性”或“选择性”结合当涉及配体/受体、核酸/互补核酸、抗体/抗原或其它结合对(例如细胞因子与细胞因子受体)时是指确定蛋白在蛋白和其它生物分子的异源群中存在性的结合反应。因此，在指定的条件下，指定的配体结合到特定的受体而不以显著的量结合到存在于样品中的其它蛋白。特异性结合还可以意指例如所设想的方法的结合化合物、核酸配体、抗体或衍生自抗体的抗原结合位点的结合组合物以一定的亲和力结合到其靶标，所述亲和力通常比与任何其它结合化合物的亲和力高至少25％、更通常高至少50％、最通常高至少100％(2倍)、常见地达至少10倍、更常见地达至少20倍、最常见地达至少100倍。

如本文所用的术语“受试者”是指人类或非人生物体。因此，本文所述的方法和组合物适用于人类和兽医疾病两者。在某些实施方案中，受试者为“患者”，即正在接受疾病或病症的医疗护理的活人。这包括正在研究其病理学体征的无确定疾病的人。优选的是存在疟原虫感染的受试者。

“治疗有效量”定义为足以显示出患者有益效果即导致所治疗的病症的症状减轻、防止或改善的试剂或药物组合物的量。当药剂或药物组合物包括诊断剂时，“诊断有效量”定义为足以产生信号、图像或其它诊断参数的量。药物制剂的有效量将根据许多因素变化，诸如个体的易感性程度、个体的年龄、性病和体重、以及个体的特异反应(参见例如授予Netti等的美国专利号5,888,530)。

“治疗”(关于病症或疾病)是获得有益或所需结果包括并优选临床结果的方法。出于本发明的目的，关于疾病的有益或所需结果包括但不限于以下一者或多者：改善与疾病相关的病症、治愈疾病、减轻疾病的严重性、延迟疾病的进展、缓解与疾病相关的一种或多种症状、提高患病者的生活质量和/或延长生存时间。同样，出于本发明的目的，关于病症的有益或所需结果包括但不限于以下一者或多者：改善病症、治愈病症、减轻病症的严重性、延迟病症的进展、缓解与病症相关的一种或多种症状、提高患病者的生活质量和/或延长生存时间。

“疫苗”涵盖预防性疫苗。疫苗还涵盖治疗性疫苗，例如施用给患有病症或障碍的哺乳动物的疫苗，所述病症或障碍与该疫苗提供的抗原或表位相关。

疫苗制剂的目标是提供能够生成足够的记忆T细胞和B细胞群以快速地与具有目标抗原的病原体、肿瘤细胞反应的抗原和佐剂的组合。本发明涉及可满足该目标的提供脂质体疫苗组合物的方法、其制备方法及其在刺激动物免疫反应中的使用方法。

虽然下文相对于流感和疱疹病毒疫苗详细描述，但是本领域的技术人员将理解到这些示例性实施方案无意为限制性的。

据报道，在美国年度流感(也称为“季节性流感”或“人类流感”)每年导致大约36,000例死亡和超过200,000例住院。由于流感流行通常在每个冬天出现，因此它也被称为“季节性”流感。在北半球和南半球存在两个在不同时间出现的流感季节。在世界范围内，据估计，季节性流感每年导致250,000至500,000人死亡。在工业化世界的大部分死亡病例发生在65岁及以上的成年人。季节性流感是美国人群的第七大死因，据估计其仅在美国造成的经济损失就高于800亿美元。存在三种类型的季节性流感：甲型、乙型和丙型。最致命的季节性流感集中爆发可能是从1918年持续到1919年的1918年流感大流行(西班牙流感大流行；甲型流感，H1N1亚型)。在这次集中爆发中的死亡人数据估计在2000万至1亿人。

甲型流感病毒(“IAV”)是正黏液病毒家族的成员。甲型流感病毒包含单链、分段、负义RNA基因组。八个RNA片段为：

“HA”，其编码病毒血凝素(需要约500个血凝素分子来构成一个病毒粒子)；

“NA”，其编码病毒神经氨酸苷酶(需要约100个神经氨酸苷酶分子来构成一个病毒粒子)；

“NP”，其编码病毒核蛋白质；

“M”，其通过使用来自相同RNA片段的不同阅读框编码两种基质蛋白M1和M2(后者为病毒包膜中的离子通道)(需要约3000个基质蛋白分子来构成一个病毒粒子)；

“NS”，其通过使用来自相同RNA片段的不同阅读框编码非结构蛋白NS1和NEP；

“PA”，其编码病毒RNA聚合酶；

“PB1”，其通过使用来自相同RNA片段的不同阅读框编码与PB1-F2蛋白一起的另一种RNA聚合酶；以及

“PB2”，其编码RNA聚合酶。

因此，IAV基因组编码十一种蛋白(HA、NA、NP、Ml、M2、NS1、NEP、PA、PB1、PB1-F2、PB2)。IAV通常被分成亚类，其名称根据H(血细胞凝集素)数和N(神经氨酸苷酶)数命名。新的流感病毒通过突变或通过基因组重配而不断进化。IAV基因组为高度塑性的，原因是固有的高突变率，以及允许不同病毒株之间整个基因交换的基因组分段性质。这导致表现出连续抗原变异的病毒，这需要每年重配IAV疫苗。

据信，由当前的疫苗产生的保护性免疫反应在很大程度上基于病毒血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)蛋白。用于美国和全世界的流感疫苗通过在已受精的鸡蛋中使病毒生长然后杀死病毒或减活病毒而制备。这种生产IAV疫苗的基于鸡蛋的技术始创于20世纪50年代。为了实现目前的疫苗生产目标，在每个生产日期需要用到数百万只11天的受精鸡蛋。由于IAV的连续抗原变异，基于当前的季节性流感的疫苗无法用在将来的季节性流感。虽然可存在一定的针对相关流感病毒株的交叉保护，但是最佳的保护将来自于针对任何将来的大流行流感病毒株专门生产的疫苗。

H5N1疫苗生产中的问题包括总体生产能力不足以及突击生产能力不足(以备用方式开发依赖于数以亿计的11天专用鸡蛋的系统是不切实际的)。

一些基于现代分子生物学技术的IAV疫苗已经开始了早期临床试验。虽然已经描述了若干种涉及病毒血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)蛋白的此类疫苗，但是也探索了新的靶标，诸如得自NP和M2蛋白的抗原。

单纯性疱疹病毒是疱疹病毒家族的成员。由单纯性疱疹病毒2型(HSV2)导致的生殖器疱疹是人类中最常见的性传播疾病之一。流行病学研究表明，每6个美国成年人中就多达1人感染过HSV2。该疾病会影响正常的和免疫低下的成年人，并与对人免疫缺陷病毒(HIV)感染增加的易感性相关。严重的临床疾病可在从被感染母亲传播HSV2后的婴幼儿中发生，这些母亲发生宫颈癌的可能性比未感染妇女高。促使HSV2传播的主要因素是在不存在临床症状的情况下病毒从生殖道脱落。目前，尚无有效的预防该疾病传播的疫苗。若干种包含基于亚单位蛋白的抗原的HSV2候选疫苗未能实现提供对HSV2造成的感染或临床疾病的保护性免疫的目标。鉴于所测试的候选疫苗未能获得成功的结果、认识到感染HSV2的人更易感染HIV以及病毒脱落通常发生在HSV2的“临床无症状”载体中这一事实，开发管理HSV2疾病的新方法(包括新的免疫策略)的努力仍然是一项重要的医疗保健目的。

包含重组形式的糖蛋白B和D(分别为gB和gD)的两种不同的HSV2疫苗已进行了3期临床试验。这些疫苗之一包含与佐剂MF59相结合的重组HSV2 gB和gD以形成蛋白的水包油乳液。该疫苗在接种疫苗的受体中刺激了高水平的HSV2特异性中和抗体，但是未观察到对第一临床事件的持续时间或感染再活化的后续频率的明显影响，从而表明该疫苗不是特别有效。第二种HSV2疫苗由HSV2 gD和佐剂体系AS04(包含氢氧化铝和3-脱酰基单磷酰脂质A)组成。虽然初步结果表明该疫苗在HSV1血清反应阴性的女性(但不包括男性)中可有效防止有症状的HSV2生殖器疱疹的发展，但是从更深入的研究中获得的最近结果未确证最初的发现。基于GSK HSV2 gD的疫苗意料之外的失败将无庸置疑地导致进一步探究gD抗原作为开发有效HSV2疫苗的靶标的作用。

存在许多可能导致这些疫苗制剂临床失败的可能因素。最明显的一点在于单独的gD抗原不含为异源人群提供完整保护性免疫所必需的表位。人类和小鼠中的研究表明CD8和CD4 T细胞在HSV2感染的控制中具有重要意义。虽然gD表位由人类CD4 T细胞识别，但是未观察到gD特异性CD8 T细胞。最近，鉴定了HSV1血清反应阳性个体中的47个新的CD8 T细胞表位，这些CD8 T细胞均对gD无反应。这些研究表明，虽然gD蛋白可产生中和抗体并刺激CD4 T细胞，但是它不能诱导强烈的CD8 T细胞反应，而CD8 T细胞反应与潜在感染细胞的清除或控制最相关。在无CD8 T细胞的情况下，单独的gD疫苗似乎不能在人类中刺激对HSV2感染的保护性免疫反应。第二种可能性在于所用的佐剂体系可能对于刺激保护性免疫反应不是最佳的。进行临床试验的制剂未结合强细胞免疫反应佐剂。最后，其它因素，诸如可能缺乏由特定地区的地方性HSV2株的轻微差异导致的交叉保护，也可能在基于gD的疫苗的总体效果中发挥着作用。总之，致力于解决迄今为止HSV2候选疫苗失败的所有可能原因的研究将需要付出巨大的努力以鉴定真正有效的HSV2疫苗。

此前，在阴道内(雌性)或直肠内(雄性或雌性)攻毒的急性鼠类HSV2感染模型中测试了脂质体HSV2 gD_1-306疫苗(L-gD_1-306-HD)(Olson等，Vaccine 28:548-560,2009，以引用方式并入本文)。据报道，每个剂量包含60μg gD_1-306-HD和15μg单磷酰脂A(MPL)的两剂L-gD_1-306-HD提供了针对HSV2阴道内攻毒的保护(86-100％存活率，与对照脂质体相比较的P≤0.0003；与不含MPL的L-gD_1-306-HD相比较的P＝0.06)。用L-gD_1-306-HD/MPL免疫的雄性和雌性小鼠(BALB/c和C57BL/6)均得到了针对HSV2直肠内攻毒的明显保护，与对照相比存活率更高(71-100％,P≤0.007)。L-gD_1-306-HD/MPL还提供了与脂质体肽疫苗L-gD_264-285-HD/MPL相比升高的存活率(雄性BALB/c，P≤0.001；雌性BALB/c和雄性C57BL/6，P＝0.06)。给予L-gD_1-306-HD/MPL的小鼠还具有最轻的疾病体征、其脊髓中降低的病毒负荷以及雌性中升高的中和抗体滴度。该疫苗还刺激了雄性和雌性小鼠两者的gD_1-306-HD特异性脾细胞，与IL-4相比IFN-γ的水平明显升高(P≤0.01)，从而表明存在增强的Th1反应。

如上所讨论，本发明的脂质体制剂包含使用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)与二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷(“DMTAP”)或DMPG和DMTAP两者以及一种或多种甾醇一起制备的脂质体。脂质体的组分可以是天然存在的或合成的。甾醇也称为类固醇。它们是在A环的第3位具有羟基的类固醇的亚组。

此外，这些脂质体制剂还包含抗原多肽。如本文所用的术语“抗原多肽”是指以下多肽，其包含受体动物外来的至少一个抗原表位，并且完整地或部分地使用本文所述的脂质体制剂递送给动物时刺激抗原特异性抗体的形成和/或抗原特异性T细胞反应。可用于实践本发明的抗原多肽仅以举例的方式可衍生自病毒病原体、细菌毒素、细菌病原体、真菌病原体、癌细胞。优选的抗原肽包含衍生自IAV M2蛋白胞外域的残基和/或得自HSV2 gD蛋白、DNA包装被膜蛋白、被膜蛋白VP11/12、核离开纤层蛋白和/或包膜糖蛋白L的残基。

如本文所述，本发明的抗原多肽除了目标抗原序列外还包含合适的疏水性结构域。合适的抗原序列的实例包括含有一个或多个T细胞表位的多肽序列，IAV M2蛋白序列，得自选自以下的蛋白的HSV2蛋白序列：被膜宿主关闭蛋白、被膜蛋白VP13/14、核糖核苷酸还原酶亚单位1、核糖核苷酸还原酶亚单位2、被膜蛋白VP11/12、包膜糖蛋白B、DNA包装被膜蛋白、核离开纤层蛋白、多功能表达调节因子、转录调节因子、感染细胞蛋白8、单链DNA结合蛋白、衣壳成熟蛋白酶、包膜糖蛋白I。图1-10示出了可优选地用于本发明的得自天然存在的蛋白的多种示例性疏水结构域的Eisenberg等(J.Mol.Biol.179：125-142(1984))疏水性。这些疏水结构域序列以及本文以举例的方式提供的其它结构域序列在本质上仅为示例性的。这些或其它疏水序列可使用保守氨基酸取代进行修饰，以得出具有与例如人类细胞色素b5跨膜域相似的疏水性的另外的合成序列。出于本发明的目的，疏水性使用Esienberg等的方法采用以下参数进行计算：9的窗口大小、边缘100％的相对权重、线性权重差异。氨基酸量表值如下：

Ala：0.620 Arg：-2.530 Asn：-0.780 Asp：-0.900 Cys：0.290 Gln：-0.850 Glu：-0.740 Gly：0.480 His：-0.400 Ile：1.380 Leu：1.060 Lys：-1.500 Met：0.640 Phe：1.190Pro：0.120 Ser：-0.180 Thr：-0.050 Trp：0.810 Tyr：0.260 Val：1.080

疏水结构域部分的合适序列通常具有跨过脂质双层的足够长度(约15-30个残基；更优选地约18-25个残基)，经预测其至少9个连续残基形成具有约+0.7的疏水性(Esienberg评分)的α螺旋。在此上下文中的术语“约”是指给定测量值的+/-10％。II型和III型膜蛋白不含控制膜插入和拓扑结构的N端信号肽，相反通过介导多肽转位并将蛋白锚定在膜中的作为不可裂解的信号序列的疏水性“信号锚定序列”而在翻译后插入膜。

融合蛋白：

如上所讨论，将免疫原性多肽序列共价连接到异源跨膜序列的方法是本领域熟知的。本发明的抗原多肽可化学合成或使用重组DNA技术表达。在多个实施方案中，将一个或多个抗原表位作为与以下部分的融合蛋白的一部分而表达：得自具有信号锚定序列的异源单次跨膜蛋白的跨膜序列。此类重组蛋白可包含选自以下的抗原序列：病毒包膜蛋白、病毒外壳蛋白、细菌外膜蛋白和真核膜蛋白。

融合蛋白可在基于细胞和无细胞的系统中表达。对于大规模蛋白表达和纯化，通常使用细菌表达，通常在细菌或T7启动子的控制下，具体取决于细菌菌株和RBS(原核核糖体结合序列)。将编码可操作地连接到合适表达控制序列、蛋白水解裂解位点等(任选地位于间隔残基的侧翼或被间隔残基分开)的目标多肽序列的核酸通过标准重组DNA技术插入适宜的载体(一般参见以引用方式并入本文的Sambrook等，Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989)。目标核酸最终作为抗原多肽(含或不含间隔或框架残基)而表达。

大肠杆菌是一种尤其可用于表达本发明的抗原多肽的原核宿主。适用的其它微生物宿主包括诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其它肠杆菌诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)以及多种假单胞菌(Pseudomonas)种。在这些原核宿主中，还可以制备通常将包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)的表达载体。此外，任何数量的多种熟知的启动子将存在，诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或得自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常任选地与操纵子序列一起控制表达，并具有用于引发和完成转录和翻译的核糖体结合位点等。

其它微生物诸如酵母也用于表达。酵母属是优选的宿主，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列，诸如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖解酶)和复制起点、终止序列等。

哺乳动物组织细胞培养也可用于表达和产生本发明的抗原多肽(参见Winnacker,From Genes to Clones(VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987)。已经开发了能够分泌完整的免疫球蛋白的许多合适的宿主细胞系，包括用于杆状病毒表达的昆虫细胞、CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。这些细胞的表达载体可包含表达控制序列，诸如复制起点、启动子和增强子(Queen等，Immunol.Rev.89:49-68(1986))，以及必要的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒或巨细胞病毒的启动子。

不同的生物体通常展示出“密码子偏倚”；即，以遗传密码出现的编码特定氨基酸的给定密码子在不同生物体之间显著差异的程度。一般来讲，基因所含的密码子越罕见，异源蛋白将在该特定的宿主系统内以合理的水平表达的可能性越低。如果罕见密码子成簇出现或在蛋白的N端部分出现，则这些水平将变得甚至更低。将待重组表达的序列中的罕见密码子替换为更密切反映宿主系统密码子偏倚的其它密码子而不用修饰氨基酸序列(称为“密码子优化”)可增加功能性蛋白表达水平。在多种实施方案中，使任何非最佳密码子的至少百分之一发生改变以提供最佳密码子，更常见地使至少百分之五发生改变，最常见地使至少百分之十发生改变，通常使至少20％发生改变，更通常使至少30％发生改变，最通常使至少40％发生改变，常常使至少50％发生改变，更常常使至少60％发生改变，最常常使至少70％发生改变，较佳地使至少80％发生改变，更佳地使至少90％发生改变，最佳地使至少95％发生改变，以及照惯例对任何非最佳密码子的100％进行密码子优化以进行表达。诸如Gene Designer 2.0(DNA2.0)、OptimumGene^TM(GenScript)、OPTIMIZER(Puigbo等，Nucl.Acids Res.35(Suppl 2):W126-31,2007)、(GeneArt)、GeneComposer(Lorimer等，BMC Biotechnology 2009,9:36doi:10.1186/1472-6750-9-36)的基因优化工具和美国专利7,561,973、7,561,972中所公开的方法是本领域已知的并可用于优化所需功能蛋白的表达。

引入含有目标多核苷酸序列的载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。(一般参见Sambrook等，上文)。

在某些实施方案中，融合蛋白可包含另外的肽序列，诸如亲和标记、检测标记和/或蛋白酶裂解位点。此类亲和/检测标记的实例包括但不限于strep-tag、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(Trx)、钙调蛋白结合肽(CBP)、聚-His、FLAG、c-myc和血凝素(HA)。GST、MBP、Trx、CBP和多聚组氨酸使得能够分别在固定化谷胱甘肽、麦芽糖、氧化苯胂、钙调蛋白和金属螯合树脂上纯化它们的同源融合蛋白。Strep-标签、FLAG、c-myc和血凝素(HA)使得能够使用特异性识别这些表位标签的市售单克隆和多克隆抗体进行融合蛋白的免疫亲和纯化。其它合适的标签序列对于本领域的技术人员将是显而易见的。同样，多种蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶等)和相应的蛋白酶裂解位点也是本领域技术人员已知的。在优选的实施方案中，用于本发明方法的一种或多种蛋白水解酶选自因子Xa、肠激酶、凝血酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶和人鼻病毒3C蛋白酶。在另外其它优选的实施方案中，引入的蛋白酶裂解位点选自IEGR(SEQ ID NO:55)、DDDDK(SEQ ID NO:56)、LVPRGS(SEQ ID NO:57)、ENLYFQG(SEQ IDNO:58)和LEVLFQGP(SEQ ID NO:59)。

此类融合蛋白还可以包含在据称待融合的多肽之间的化学结构。两个多肽在以下情况中则为“直接”融合：肽之一的序列的最后一个残基接合到另一个序列的第一个残基。两个多肽在以下情况中则为“间接”融合：另外的化学结构(诸如另外的氨基酸，有时称为“接头”残基)位于肽之一的序列的最后一个残基与另一个序列的第一个残基之间。

化学蛋白偶合

作为融合蛋白的一种替代形式，一个或多个抗原表位可化学合成或独立于得自具有信号锚定序列的异源单次跨膜蛋白的跨膜序列而进行表达，然后使用化学键合偶合单独的肽。化学交联剂在许多书籍和目录中有所论述。参见例如Wong,Chemistry of ProteinConjugation and Cross-linking,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1991。这些试剂通常采用偶合到肽的氨基酸侧链的官能团。设计交联剂涉及选择待采用的官能部分。官能部分的选择完全依赖于待交联的物质上可用的靶点。一些物质(例如蛋白)可呈现出许多可用的靶点(例如赖氨酸ε-氨基、半胱氨酸巯基、谷氨酸羧基等)，并且可从经验上选择包含在甾醇中的特定官能部分以便最佳地保留目标生物特性(例如抗体的结合亲和力、酶的催化活性等)。

通过胺基团偶合：

亚氨酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺基(“NHS”)酯通常用作胺特异性官能部分。NHS酯在与伯胺或仲胺反应时产生稳定的产物。偶合在生理pH下是高效的，并且NHS酯在溶液中比其亚氨酸酯对应物更稳定。同双官能NHS酯偶联通常用于以一步或两步反应交联含胺的蛋白。伯胺是NHS酯的主要靶标。存在于蛋白N端上的可触及α-胺基团与NHS酯反应形成酰胺。然而，由于蛋白上的α-胺不总是可用，因此与氨基酸侧链的反应变得重要。虽然五种氨基酸在其侧链中具有氮，但是只有赖氨酸的ε-氨基明显与NHS酯反应。当NHS酯交联剂与伯胺反应时形成共价酰胺键，释放出N-羟基琥珀酰亚胺。

通过巯基偶合：

马来酰亚胺类、烷基和芳基卤化物、α-卤代酰基化物和吡啶二硫化物通常用作巯基特异性官能部分。当反应混合物的pH保持在pH 6.5与7.5之间时，马来酰亚胺基团是巯基特异性的。在pH 7时，马来酰亚胺类与巯基类的反应是与胺类反应的1000倍。马来酰亚胺类不与酪氨酸类、组氨酸类或甲硫氨酸类反应。当游离的巯基类不以足够的量存在时，它们通常可通过可用二硫键的还原生成。

通过羧基偶合：

碳二亚胺类将羧基类偶合到伯胺类或酰肼类，导致形成酰胺或腙键。碳二亚胺类与其它偶联反应的不同之处在于在碳二亚胺与进行偶合的分子之间不形成交联桥，而是在可用的羧基与可用的胺基团之间形成肽键。可靶向蛋白的羧基末端，以及谷氨酸和天冬氨酸侧链。在存在过量的交联剂的情况下，聚合反应可以发生，因为蛋白同时包含羧基和胺。不形成交联桥，并且酰胺键与肽键相同，因此在不破坏蛋白的情况下交联的逆转是不可能的。

非选择性反应性基团：

光亲和试剂是一种化学惰性的但在暴露于紫外线或可见光时变得具有反应性的化合物。芳基叠氮化物是在250-460nm之间的波长下光分解形成反应性芳基氮宾的试剂。芳基氮宾非选择性反应形成共价键。还原剂必须谨慎使用，因为它们可还原叠氮基。

通过精氨酸类偶合：

乙二醛类是靶向精氨酸残基的胍基部分的有用化合物。乙二醛类将在适度的碱性pH下靶向精氨酸类。存在一定的与赖氨酸类的交叉反应性(在较高的pH下最大)。

通过羰基偶合：

羰基类(醛类和酮类)与胺类和酰肼类在pH 5-7下反应。与酰肼类的反应比与胺类的反应更快，使得它可用于位点特异性交联。羰基类不易存在于蛋白质中；然而，使用偏过碘酸钠温和氧化糖部分会将邻近的羟基类转化成醛类或酮类。对于具有还原性末端的碳水化合物，羰基可与肼部分反应形成腙键。S-HyNic是用于将HyNic(6-肼基烟酰胺)部分借助活化酯(即NHS)通过游离氨基结合到分子中的杂双官能接头。添加HyNic肼接头允许在略微呈酸性的缓冲液(100mM NaPO4,pH6)中形成偶联物。对于不含还原性末端的碳水化合物，可以使用CDAP特异性活化。在温和的条件下(对于活化为pH 9.5，对于偶联为pH 7)，1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(“CDAP”)将羟基转化成氰基酯，然后将在存在胺基团的情况下形成氨基甲酸酯。

任选地包含在键合化学中的聚合物物质为聚(亚烷基氧化物)。如本文所用，术语“亚烷基氧化物”是指结构-X-O-，其中X是共价连接到氧O的亚烷基部分；因此聚(亚烷基氧化物)是指结构-(X-O-)_m)-。优选的是，聚(亚烷基氧化物)聚合物为非支化均聚物(即结构-((CH₂)_n-O-)_m)-的聚合物，其中n无变化)，诸如衍生自乙二醇的聚环氧乙烷。也可以使用替代性聚合物，诸如其它聚亚烷基氧化物均聚物(例如亚甲基氧化物、亚丙基氧化物、亚异丙基氧化物和亚丁基氧化物聚合物)，以及聚(亚烷基氧化物)的共聚物或嵌段共聚物。在其中使用基于PEG的聚合物的本发明的那些方面，优选的是，它们具有40与1000个单体单元之间的平均长度n。其它亚烷基氧化物的分子当量可容易地由本领域的普通技术人员确定，以得到其它均聚物和共聚物的优选平均分子量。

本发明的平均分子量使用“数均”方法测量。在具有不同分子量的聚合物分子的混合物中，其中具有特定分子量M_i的分子的数量由N_i给定，所存在的给定质量的“数均”概率为

而数均分子量由下式给出

数均分子量是简单算术平均值，表示所存在的分子的总重量除以分子的总数。聚合物的数均分子量可通过使用本领域技术人员已知的方法和设备通过蒸气压渗透法测量。

可用于代替聚(亚烷基氧化物)的替代性聚合物物质包括诸如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮类、多糖类、淀粉类、聚乙烯醇类、聚丙烯酰胺类或其它类似聚合物的材料。本领域的普通技术人员将认识到，前面的内容仅仅是示例性的，无意限制适用于本文的非抗原聚合物物质的类型。

如本文关于动物(优选地包括哺乳动物，最优选地包括人)使用的“施用”是指向受试者的细胞、组织、器官或生物流体递送外源试剂。

如本文所用的“有效量”是指可改善、逆转、减轻或防止医疗病症或障碍的症状或体征的试剂的量。除非另外地明确或以其它方式指出，否则“有效量”不限于足以改善病症的最低量，或导致病症的最佳或最大改善的量。在疫苗施用背景下的“有效量”是导致哺乳动物免疫反应的量。这样的有效量在其自身上可不足以导致这样的免疫反应，但是可与之前或后续递送的另外试剂一起使用(例如初免-加强疫苗接种)。如本文所用的“免疫学反应”或“免疫反应”涵盖以下效应中的至少一种或多种：通过B细胞产生抗体；和/或抑制性T细胞和/或特异性针对存在于目标载体、组合物或疫苗中的一种或多种抗原的T细胞的活化。

用于测量免疫反应(包括测量体液和细胞免疫反应)的多种体外和体内测定法是本领域已知的，这些测定法包括但不限于标准免疫测定法，诸如RIA、ELISA测定法；细胞内染色；T细胞测定法，包括例如淋巴细胞增殖(淋巴细胞活化)测定法、CTL细胞毒性细胞测定法，或通过测定致敏受试者中的抗原的特异性T淋巴细胞。此类测定法是本领域熟知的。

脂质体制备：

脂质体的制备是现有技术熟知的。一般来讲，脂质体已通过多种不同的技术制备，包括乙醇注入(Batzri等，Biochem.Biophys.Acta.298:1015,1973)；醚输注(Deamer等，Biochem.Biophys.Acta.443:629,1976；Schieren等，Biochem.Biophys.Acta.542:137,1978)；洗涤剂移除(Razin,Biochem.Biophys.Acta.265:24 1972)；溶剂蒸发(Matsumato等，J.Colloid Interface Sci.62:149,1977)；从氯仿的水乳液中蒸发有机溶剂(REV)(Szoka Jr.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:4194,1978)；通过核孔聚碳酸酯膜挤出MLV或EUV(Olson等，Biochem.Biophys.Acta.557:9,1979)；磷脂混合物的冻融(Pick,Arch.Biochem.Biophys.,212:186,1981)以及超声和匀化。按照惯例，脂质体按大小归类，并将3个字母的首字母缩略词用于命名所讨论的脂质体的类型。多层囊泡通常被命名为“MLV”。小单层囊泡被命名为“SUV”，大单层囊泡被命名为“LUV”。这些命名有时在后面跟着脂质体的化学组成。有关已知的脂质体类型的命名和概述的讨论，参见Storm等，PSIT,1:19-3,1998。

本发明的脂质体组合物还可以包含(作为脂质体自身的一部分，或作为脂质体的悬浮媒介物的一部分)各种赋形剂、佐剂、载体、辅助物质、调节剂等。

任选地存在的载体是自身不引起产生对接受组合物的个体有害的抗体的分子。合适的载体通常是较大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白类、多糖类、聚乳酸类、聚乙醇酸类、聚氨基酸类、氨基酸共聚物类、脂质聚集体类(诸如油滴或脂质体)和失活病毒粒子。颗粒载体的实例包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(称为PLG)的微粒。参见例如Jeffery等，Pharm.Res.10:362,1993；McGee等，J.Microencapsul.14:197,1997；O'Hagan等，Vaccine 11:149,1993。此类载体是本领域普通技术人员熟知的。

佐剂包括但不限于：(1)铝盐(明矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳液制剂(含或不含其它特异性免疫刺激剂，诸如胞壁酰肽(参见下文)或细菌细胞壁组分)，诸如(a)MF59(国际专利公开号WO 90/14837)，含有5％的角鲨浠、0.5％的吐温80和0.5％的Span85(尽管不需要，但可任选地含有各种量的MTP-PE(参见下文))，使用微流化机诸如型号为11OY的微流化机(Microfluidics,Newton,Mass.)将其配制成亚微粒颗粒，(b)SAF，含有10％的角鲨浠、0.4％的吐温80、5％的pluronic-嵌段聚合物L1 21和MDP，微流化成亚微粒乳液或涡旋产生较大粒度的乳液，以及(c)Ribi^TM佐剂体系(RAS)(RibiImmunochem,Hamilton,MT)；(3)一种或多种选自以下的细菌细胞壁组分：单磷酰基酯A(MPL)、海藻糖二聚霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选地MPL+CWS(Detoxu)；(4)皂角苷佐剂，诸如Stimulon^TM(Cambridge Bioscience,Worcester,Mass.)；(5)弗氏完全佐剂(CFA)以及弗氏不完全佐剂(IFA)；(6)细胞因子，诸如白介素(IL-I、IL-2等)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、β趋化因子(MIP、1-α、1-βRantes等)；(7)细菌ADP-核糖基化毒素的解毒突变体，诸如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)，尤其是LT-K63(其中赖氨酸代替野生型的63位氨基酸)、LT-R72(其中精氨酸代替野生型的72位氨基酸)、CT-S109(其中丝氨酸代替野生型的109位氨基酸)和PT-K9/G129(其中赖氨酸代替野生型的9位氨基酸和甘氨酸代替野生型的129位氨基酸)(参见如国际专利公开号WO93/13202和WO92/19265)；以及(8)其它作为免疫刺激剂以增强组合物效能的物质。

优选的佐剂包括但不限于病原相关分子模式(PAMP)，其通过Toll样受体(TLR)、(NOD)样受体(NLR)、视黄酸诱导基因(RIG)-I样受体(RLR)和/或C型凝集素受体(CLR)介导先天免疫激活。PAMP的实例包括但不限于脂蛋白、脂多肽、肽聚糖、酵母聚糖、脂多糖、奈瑟菌孔蛋白、鞭毛蛋白、profillin、α-半乳糖神经酰胺、胞壁酰二肽。肽聚糖、脂蛋白和脂磷壁酸是革兰氏阳性菌的细胞壁组分。脂多糖由大多数细菌表达，MPL是一个实例。鞭毛蛋白是指由病原性和共生菌分泌的细菌鞭毛的结构组分。α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)是自然杀伤细胞T(NKT)细胞的激活因子。胞壁酰二肽是所欲哦细菌共有的生物活性肽聚糖基序。

其它优选的佐剂包括由细胞内受体TLR3感知的病毒双链RNA；由TLR7、8和9感知的存在于细菌或病毒DNA或ssRNA上的CpG基序；全反式维甲酸；以及作为交叉呈递的高度有效的载体分子的热休克蛋白，诸如HSP70和Gp96。药物佐剂包括瑞喹莫德(TLR7/8激动剂)和咪喹莫特(TLR7激动剂)。

药物组合物：

本发明的脂质体优选地配制成供肠胃外或肠道递送的药物组合物。典型的供施用给动物的药物组合物包含药学上可接受的媒介物，诸如水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.第15版.Easton编,MackPublishing Co.,pp 1405-1412和1461-1487(1975)；The National Formulary XIV.第14 版.American Pharmaceutical Association,Washington,DC(1975)。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油和注射用有机酯，诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外载体，诸如氯化钠、林格氏右旋糖等。静脉内载体包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。药物组合物的各种组分的pH和精确浓度根据本领域的普通技能进行调整。

反复施用特定的疫苗(同源加强)已证实可有效加强体液反应。这样的方法在加强细胞免疫方面可能无效，原因是在免疫前载体往往损害稳固的抗原呈递并生成适当的炎性信号。一种解决这一问题的方法是按顺序施用使用不同抗原递送系统的疫苗(异源加强)。

在异源加强方案中，至少一次初免或加强递送包括递送本文所述的脂质体制剂。方案的异源分支可包括使用以下策略中的一种或多种递送抗原：

包含目标抗原的减活和/或灭活细菌或病毒，其为已用一定的变性条件处理以使得它们在引起病原侵袭方面无效或效率低下的粒子；

纯化的抗原，其通常为从病原体或包含病原体的组织样品的细胞培养中纯化的天然产生的抗原，或其重组形式；

经重组工程改造以在受试者的宿主细胞中表达和/或分泌抗原的或病毒或细菌递送载体。这些策略依赖于将病毒载体基因工程改成成非病原性的和无毒的；

抗原呈递细胞(APC)载体，诸如树突状细胞(DC)载体，其包含含有抗原的或用包含编码所述抗原的核酸的组合物转染的细胞；

肿瘤细胞，例如自体和异体肿瘤细胞；以及

可通过基因枪、电穿孔、细菌菌蜕、微球、微粒、脂质体、多阳离子纳米粒子等施用的裸DNA载体和裸RNA载体。

初免疫苗和加强疫苗可通过以下途径的任一种或组合进行施用。在一个方面，初免疫苗和加强疫苗通过相同的途径施用。在另一个方面，初免疫苗和加强疫苗通过不同的途径施用。术语“不同的途径”涵盖但不限于身体上的不同位点，例如为口腔、非口腔、肠道、肠胃外、节间(淋巴结)、静脉内、动脉、皮下、肌内、肿瘤内、肿瘤周围、肿瘤内、输注、粘膜、鼻腔、脑脊髓空间或脑脊液中等的位点，以及通过不同的模式，例如口腔、静脉内和肌内。

初免或加强疫苗的有效量可以一个剂量给予，但不限于一个剂量。因此，施用可以为疫苗的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或更多次施用。如果存在不止一次疫苗施用，则施用的时间间隔可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟或更多分钟，约间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时等。在小时的背景下，术语“约”意指任何时间间隔±30分钟。施用的时间间隔还可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天，以及它们的组合。本发明不限于间隔相等时间的给药间隔，而是涵盖间隔不等的给药，诸如初免计划由第1天、4天、7天和25天的施用组成，这只是给出非限制性实例。

实施例

以下实施例用于阐述本发明。这些实施例绝对无意限制本发明的范围。

实施例1.甲型流感病毒材料和方法

A.IAVM2e1-HDpET28a载体

IAVM2e1-HD pET28a质粒设计之前已有描述[Ernst等，2006]。

B.IAVM2e1-HD pEV载体

表1.所评估的不同IAVM2e1序列的肽和寡核苷酸序列

为了生成IAVM2e1-HD蛋白，合成了编码含有Bgl II限制性酶位点和肠激酶(EK)位点的IAVM2el基因的5’寡核苷酸引物(Integrated DNA Technologies)。为了生成LDR-IAVM2e1-HD蛋白，合成了编码含有Bgl II限制性酶位点、EK位点和pET28a载体的LDR序列的IAVM2e1基因的5’寡核苷酸引物(Integrated DNA Technologies)。相似地，合成了编码含有Xho I限制性酶位点的疏水结构域基因的3’寡核苷酸引物。为了生成IAVM2e1-HD基因，将引物用于聚合酶链反应(PCR)以扩增之前由Molecular Express构建的IAVM2e1-HD pET28a载体模板。简而言之，向PCR管中，加入7.5μL 10X Pfx(Invitrogen)缓冲液、1μL 50mMMgCl2、1.5μL 10mM dNTP、1μL 20μM 5’和3’引物、10ng IAVM2e1-HD pET28a质粒、1μL Pfx聚合酶，适量补充至50μL。将反应混合物循环25次(94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟)，然后在72℃下进行7分钟的最终延长。将PCR产物用PCR纯化试剂盒(Qiagen,Chatsworth,CA)纯化。将PCR产物和pEVl载体用Bgl II和Xho I(Invitrogen)进行酶消化。pEVl载体是pET32b和pET28a的复合载体，其中，pET32b的硫氧还蛋白-6His-多克隆位点被插入pET28a。pEVl载体提供pET32b的硫氧还蛋白-6His和凝血酶裂解位点，并处于pET28a载体的卡那霉素抗性下。将消化后的DNA进行凝胶纯化(Qiagen,Chatsworth,CA)，然后连接并转化到DH5-α大肠杆菌中。将质粒从转化的大肠杆菌中纯化并进行测序，以确保基因的序列、框架和取向正确。

C.截短的半胱氨酸突变IAVM2e1-HD构建体

为了生成突变的IAVM2e1-HD蛋白，合成了编码Bgl II限制性酶位点、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶位点和IAVM2e1序列的前22个碱基的5’引物(Integrated DNATechnologies)。相似地，合成了编码包含Hind III限制性酶位点的各种突变IAVM2e1基因和截短IAVM2e1(1-15)的序列的3’引物(表1)。这些构建体的载体包含得自之前构建体的HD，所述构建体为编码HD的区域的5’HinD III位点。

对于每个半胱氨酸到丝氨酸突变体，使用5’引物和一种3’引物建立反应以从之前由Molecular Express构建的pEVl-IAVM2e1模板扩增IAVM2el区。简而言之，向PCR管中，加入7.5μL 10X Pfx聚合酶缓冲液、1μL 50mM MgCl2、1.5μL 10mM dNTP、20μM 5’和3’引物各1μL、10ng IAVM2e1-HD pEVl、0.75ul Pfx(Invitrogen)，用蒸馏水适量补充至50μL。将反应混合物加热到94℃维持5分钟以激活聚合酶。然后接受30个下述循环：95.5℃20秒，然后70℃40秒。循环后，将混合物在68℃下孵育10分钟的最终延长期，然后保持在4℃。将PCR产物使用Qiaquick Spin试剂盒(Qiagen)进行纯化。然后使用1X React 2缓冲液(Invitrogen)中的Bgl II和HinD III各5个单位在37℃消化30分钟。将各产物在3.5％Nuseive琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化。将条带从凝胶上切下，使用Qiaquick凝胶提取试剂盒对DNA片段进行纯化。DNA浓度通过在2％琼脂糖凝胶上靠着具有不同量DNA的已知量的低质量DNA标准品进行分析而测定。

对于只含第1-15个氨基酸的缺失突变体，插入序列足够短，使得下游引物与上游引物重叠13个碱基。在此情况下，在PCR管中通过两种引物但不添加模板DNA建立了相似的反应。在5分钟的变性阶段以激活聚合酶后，将反应物在48℃孵育2分钟，然后以20％的升温速度将温度升至70℃，在该温度下保持5分钟。将48℃和70℃步骤再重复一次，然后为70℃下10分钟的延长步骤。将所得的产物进行了凝胶纯化，并通过与略长的、突变IAVM2e1PCR产物相同的程序进行了分析。

通过以下方式制备了含有HD的pEVl载体：在37℃下在55μL 1X React 2中将3μgMolecular Express Plasmid(MEP)-180用24个单位的Bgl II和10个单位的HinD III消化过夜。然后将载体在1％琼脂糖凝胶上进行了凝胶纯化。将切下的条带用Qiagen凝胶纯化试剂盒进行了纯化。DNA浓度通过在1％琼脂糖凝胶上靠着已知量的高质量DNA标准品运行而测定。

然后在16℃下持续80分钟将各消化后的纯化PCR产物在含有以下物质的10μL反应物中连接到载体：3倍摩尔比的PCR产物与载体，以及1x连接混合物(Novagen ClonablesLigation/转化试剂盒)。然后将一微升该反应物转化到Novablue化学感受态细胞中，铺到含有30mg/L卡那霉素的LB琼脂板上，然后孵育过夜。由于IAVM2e1序列如此短，因此同时使用PCR产物的集落PCR和限制性分析对集落进行了分析。PCR反应使用Molecular Express寡核苷酸(MEO)引物MEO-248和MEO-250进行。MEO-248引物位点适于Bgl II位点上游540bp，MEO-250在HD的5’末端终止于HinD III位点下游250bp。IAVM2e1的23个氨基酸的序列加上TEV位点的7个氨基酸需要90bp。将产生约900bp片段的PCR产物用Bgl II和HinD III在两个单独的附加反应中消化，并在3.5％琼脂糖凝胶上分析。如果凝胶表明存在两个切割位点，则让集落在含有30mg/L卡那霉素的16ml LB中在225rpm、37℃下生长过夜。对质粒DNA(Qiagen质粒小量提取试剂盒)进行了纯化，以使用引物MEO-302和MEO-250通过测序(DavisSequencing)进行确认。将测序结果使用“Align 2"与预期的DNA序列进行了比较，或使用BLAST与更多的序列进行了比较。

SEQ ID NO:53和54示出了分别包含得自人细胞色素b5和爪蟾MGC80327蛋白的疏水结构域(带下划线)的IAVM2e1-HD构建体。由制备构建体期间采用的限制性位点产生的氨基酸的短接头序列(双下划线)将细胞色素b5或爪蟾MGC80327残基连接到IAVM2e1序列。IAVM2e1序列(无下划线)因此通过桥接氨基酸残基直接融合到疏水结构域的氨基端。

D.IAVM2e1-HD构建体的表达

为了表达IAVM2e1-HD蛋白，将包含pEVl质粒或IAVM2e1-HD-pET28a质粒的IAVM2e1-HD转化到大肠杆菌表达菌株C-43(Lucigen)中。使起子培养物在补充了30mg/L卡那霉素的无动物LB肉汤(AthenaES)中在G-25环境摇床(New Brunswick Scientific)中在37℃下生长过夜。向装有0.5L补充了30mg/L卡那霉素和1％甘油的无动物LB肉汤的4-2L无菌摇瓶中，加入起子培养物达到0.09-0.12(A600nm)的光密度(O.D.)。将培养物在轨道摇床(225rpm)中在37℃下孵育到0.5-0.7O.D.(A600nm)，此时将培养物用0.75mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)(BioWorld)诱导。将培养物在37℃和振荡下再孵育5小时。通过在4℃下离心(4000xg)25分钟收集细菌，对沉淀称重。

E.6His-IAVM2e1-HD的纯化

为了纯化6His-IAVM2e1-HD蛋白，将细菌在8M尿素、20mM咪唑、50mM Tris pH 8.0缓冲液中裂解，然后在微硫化机M-110L(Microfluidics)中在15,000psi下匀化三次以剪切细菌DNA并破裂细菌。然后对裂解后的细菌离心(30,000xg)以除去细胞碎片。通过将洗涤后的镍-带电螯合琼脂糖树脂(Qiagen)与含有IAVM2e1-HD蛋白的上清液一起孵育而实现纯化。将树脂用5倍柱体积的含20mM咪唑的尿素缓冲液洗涤，然后用5倍柱体积的0.3％脱氧胆酸钠洗涤，最后用250mM咪唑、50mM磷酸钠pH 7.9洗脱。将蛋白馏分在4％-12％SDS-PAGE上进行电泳，用考马斯蓝染色以鉴定含有6His-IAVM2e1-HD蛋白的馏分。将含有6His-IAVM2e1-HD蛋白的250mM咪唑洗脱馏分合并，用0.1ml装填的多粘菌素B-琼脂糖孵育以除去残余的内毒素。在多粘菌素B-琼脂糖处理后，将蛋白针对10mM磷酸钠pH 7.2渗析以除去残余的咪唑、尿素和脱氧胆酸钠。蛋白浓度和内毒素浓度分别通过BCA和Limulus AmoebacyteAssay(Charles River Lab.)测定。

F.从pEVl质粒中纯化IAVM2e1-HD

将大肠杆菌沉淀用4倍体积(重量/体积)的10mM Tris缓冲液(pH 8.1)、20％蔗糖、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)悬浮。完全悬浮细菌后，将溶菌酶粉末(Sigma)加入到达1mg/ml的浓度，然后在室温下搅拌20分钟。通过在30,000xg和4℃下离心30分钟收集原生质球。将沉淀重悬在含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、DNase(10单位/ml)的冰冷蒸馏水中，搅拌10分钟。通过在30,000xg和4℃下离心30分钟收集膜。将沉淀的膜重悬在300ml 10mM Tris缓冲液(pH 8.1)、1mM PMSF中。在搅拌下，将3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)(Sigma)(20％储液)逐滴加入达到1％的最终浓度。将混合物在微硫化机M-110L(Microfluidics)中在15,000psi下匀化三次，然后在4℃下再搅拌16小时。然后将混合物在30,000xg和4℃下离心30分钟以除去颗粒。向澄清的裂解物中，加入氯化钠和咪唑分别达到500mM和20mM的最终浓度。然后将裂解物在4℃和旋转下用装填的Ni-NTA树脂(Qiagen)孵育45分钟。通过在225xg下离心5分钟收集树脂，然后转移到Kontes 2.5cm×25cm柱，并用10倍柱体积的10mM Tris缓冲液pH 8.1、20mM咪唑、500mM NaCl和1％CHAPS洗涤。将蛋白用250mM咪唑、20mM Tris pH 8.0洗脱，收集馏分，通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE进行分析。将含有靶蛋白的馏分合并，以15kDa截留分子量(MWCO)(Spectra-Por)针对2mM Tris、10mM NaCl(pH 8.1)渗析。

G.SDS-PAGE

IAVM2e1-HD蛋白的种类通过在用考马斯蓝染色的SDS PAGE凝胶上展示相应的分子量而确定。测试样品中杂质的浓度通过将这些条带的染色强度与已知浓度的参考蛋白的染色强度相比较而估计。

H.Trx-6-His-IAVM2e1-HD的HPLC分析

使用Dionex GP50 HPLC系统进行了蛋白样品的HPLC分析。该系统由GP50梯度泵、GM-3梯度混合器、AS50自动进样器和PDA-100光电二极管阵列检测器组成。组分通过RP-HPLC在Dionex Acclaim 120 C8柱(4.6×250mm；5μm；120A)上采用乙腈梯度洗脱在1ml/min、25℃下分离：溶剂A(10％乙腈，0.1％三氟乙酸)；溶剂B(90％乙腈，0.1％三氟乙酸)；(0分钟，40％B)；(1分钟，40％B)；(25分钟，100％B)。组分通过220nm的紫外吸光度进行检测。通常，每次分析进样20μL。硫氧还蛋白-IAVM2e(1-15)-HD融合蛋白大约在11-12分钟时洗出。将1.17×10-4mg/mAU220nm*min的转换因子用于通过11-12分钟峰面积估计融合蛋白含量。IAVM2e(1-15)-HD大约在14分钟时洗出；将7.27×10-5mg/mAU220nm*min的转换因子用于通过14分钟峰面积估计IAVM2e(l-15)-HD含量。

I.Ni-NTA纯化的蛋白的蛋白酶裂解

将包含肠激酶裂解位点的重组蛋白用每毫克蛋白10ng的肠激酶(New EnglandBiolabs)或每毫克蛋白10个单位的TEV(Invitrogen)裂解。

J.超滤以浓缩IAVM2e1-HD并除去硫氧还蛋白

将裂解的蛋白溶液通过使用30kDa MWCO PES膜(Millipore)的Amicon超滤单元(Millipore)超滤而浓缩到约20mg/ml的IAVM2e1-HD浓度。然后将浓缩的样品用10mM磷酸钠缓冲液pH 7.0洗涤4次(每次1/10稀释)，以除去流过液中的大部分硫氧还蛋白组分。

K.从pEV 1中通过HPLC纯化IAVM2e1-HD

使用Dionex Ultimate 3000 HPLC系统进行了IAVM2e1-HD和LDR-IAVM2e1-HD的HPLC纯化。该系统由Ultimate 3000泵和Ultimate 3000可变波长检测器组成。蛋白通过RP-HPLC在Vydac C8柱(22×250mm；10μm；300A)上采用乙腈梯度洗脱分离：溶剂A(水，0.1％三氟乙酸)；溶剂B(乙腈，0.1％三氟乙酸)；(0分钟，5％B)；(1分钟，5％B)；(60分钟，100％B)；(65分钟，100％B)；(70分钟，5％B)；(75分钟，5％B)。组分通过220nm的紫外吸光度进行检测。

L.超滤以浓缩纯化的IAVM2e1-HD

将包含IAVM2e1-HD的HPLC馏分通过使用针对单体IAVM2e1-HD的5kDa MWCO再生纤维素膜(Millipore)和针对二聚体IAVM2e1-HD的10kDa MWCO再生纤维素膜(Millipore)的Amicon超滤单元(Millipore)超滤浓缩到约20mg/ml的工作浓度。将浓缩的蛋白样品通过一系列4次洗涤(每次1/10稀释)进行缓冲液交换到10mM磷酸钠缓冲液pH 7.0中。将最终样品储存在4℃下。

M.内毒素浓度

内毒素浓度通过Limulus Amoebacyte Lysate(LAL)测定法(Charles River Lab)测定。使用无内毒素的无菌水配制了IAVM2e1-HD蛋白制备物的8个10倍稀释样和对照内毒素标准品的八个2倍稀释样。将对照和IAVM2e1-HD样品等分到无菌无内毒素的10×75mm硼硅酸盐玻璃管中，再添加等体积(100μL)的LAL。此外，将100μL LAL加到100μL无内毒素的无菌注射用水中，作为阴性对照。样品中的内毒素浓度(EU/mL)通过将LAL标记的灵敏度乘以未显示出凝块的第一稀释度的倒数而计算。

N.IAVM2e1-HD纯度和序列

蛋白的纯度通过离子喷雾质谱法(LC/MS/MS)(Midwest Bio Services)评估。蛋白的序列通过IAVM2e1-HD的胰蛋白酶裂解然后通过离子阱质谱法(Midwest Bio Services)确认。

O.蛋白印迹分析

为了确认纯化的蛋白是目标重组蛋白(IAVM2e1-HD)，将纯化蛋白的样品(2μg)在4％-20％SDS-PAGE(Invitrogen)上运行。在100mAmps下将蛋白转移到Tris-甘氨酸-甲醇缓冲液中的0.2μM硝酸纤维素膜(NCM)(BioRad)保持1.5小时。将NCM用3％牛血清白蛋白(BSA)(EMD,PN 2960)在4℃下封闭16小时。为了检测IAVM2e1-HD，将NCM通过在以下溶液中按1:1000稀释的抗M2e单克隆抗体(mAb)(Pierce目录号MA1082)孵育：含0.2％Tween-20的Tris缓冲盐水pH 7.4中的1.5％BSA(TTBS)。将印迹用TTBS中偶联的二抗山羊抗小鼠IgG-HRP(1:7500)孵育。将印迹在振荡下再孵育1小时。将印迹用20ml TTBS洗涤三个15分钟。然后通过添加10ml四甲基联苯胺(TMB)溶液(Pierce，目录号34108)并在不振荡的情况下孵育15-30分钟对印迹显色。通过用蒸馏水温和冲洗NCM终止反应。

P.脂质体制备

将二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC,Lipoid)、胆固醇(Choi,Nippon Oil and Fat)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG,Nippon Fine Chemicals)、单磷酰脂A(MPL)溶于氯仿、甲醇(比率1:1)，然后将IAVM2e1-HD蛋白加入达到65:1的脂质与蛋白浓度比。由于向测试样品给予三种不通的剂量，制备了具有不同浓度的三种不同的制备物。以此方式，可将相同体积的剂量给予每一动物。制备了无蛋白的脂质和MPL的相同样品作为对照(L-对照)(表2)。将脂质和蛋白在氮气流下干燥。将干燥的脂质膜置于真空下48小时以除去残余的有机溶剂。向干燥的脂质膜中加入适量的缓冲液(磷酸钠(10mM)缓冲液，9％蔗糖pH 7.4)，产生0.6、0.3或0.1mg/ml的IAVM2e1-HD浓度。将脂质蛋白混合物在60℃加热约10分钟，涡旋15秒，然后在Branson Sonifier上以10-20％的功率用探针超声处理3-5分钟，直到制备出半透明的脂质体。将脂质体通过0.2μM聚醚砜注射式过滤器除菌过滤到无菌、无热原的管中，在层流罩中进行标记。将脂质体制备物从Molecular Express,Inc.转移到Jill Adler-Moore博士本人(Cal Poly Pomona)并签收。然后将脂质体转到冰上，在4℃下储存在Cal Poly Pomona。脂质体粒径分布由Microtrac(Microtrac-UPA150,Honeywell)测定。各脂质体制备物的蛋白浓度通过HPLC测定法确认。

表2.L-IAVM2e1-HD制剂

Q.流感病毒感染模型

在流感攻毒模型中，将BALB/c小鼠组(n＝17只/组)用L-IAVM2e1-HD疫苗或等同剂量的L-对照(含有除蛋白外的所有组分的脂质体)在第0周时进行皮下免疫并在第8周时进行鼻内免疫。将未攻毒小鼠中的五只在第6天处死，采集血清进行ELISA测定(下文所述)。将免疫小鼠的其余十二只在加强后一周(第9周)用10 LD50的从感染肺匀浆分离的IAV(H1N1(A/PR/8/34)进行鼻内攻毒(每个攻毒剂量40μL)。通过首先对动物用氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(16mg/kg)混合物进行腹膜内麻醉而进行病毒攻毒。使用200μL微量移液器吸头，将病毒直接施用到小鼠的鼻孔上，让它们自然吸入病毒。在28天的时间内对七只动物监测发病体征(体重减轻、缺乏理毛以及活动减少)和死亡率。在攻毒后5天将五只小鼠处死，通过斑块分析法(下文所述)测定了它们肺部的病毒负荷。

R.通过ELISA进行抗体滴度和同种型表征

从五只小鼠/组中，在最后一次免疫后6天采集了血清。简而言之，将小鼠通过腹膜内注射氯胺酮(120mg/kg)和赛拉嗪(20mg/kg)混合物而深镇静，然后通过心脏穿刺采集血液。将血液转移到已用肝素冲洗的微量离心管。将血液在1500rpm下离心20分钟以从血细胞中分离血清。将采集的血清等分，然后储存在-80℃下直至使用。

将通过心脏穿刺从小鼠采集的血清用于通过OptEIA ELISA测定法(PharMingen,Inc.)测定抗体同种型对IAVM2e1的滴度。简而言之，程序涉及使用在4℃下用100μL/孔的包被缓冲液(65mM Na2CO3,100mM NaHCO3,pH 9.5)孵育过夜的平底96孔微量滴定Immulon板，包被缓冲液含有5μg/孔的IAVM2e1蛋白(UCLA Peptide Synthesis Core Facility)。将平板用275μL洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤3次，然后通过向各孔添加275μL封闭缓冲液(PBS中1％的胎牛血清)并将平板在室温下孵育2h而进行封闭。然后将平板用275μL洗涤缓冲液/孔洗涤7次，将100μL稀释后的小鼠血清样品(在封闭缓冲液中稀释)加到各孔中，在室温下孵育2h。在2h孵育结束前五分钟，在封闭缓冲液中制备了生物素标记的检测抗体(抗小鼠免疫球蛋白同种型抗体：抗IgG1、抗IgG2a、抗IgG2b、IgG3、抗IgA)。将孔用275μL/孔的洗涤缓冲液洗涤7次，然后将100μL生物素抗小鼠免疫球蛋白同种型抗体加入。将平板密封，在室温下孵育1小时。将孔用275μL洗涤缓冲液洗涤7次，让缓冲液在每次洗涤时保留在孔中一分钟然后除去。将用封闭缓冲液稀释到1:1000的链霉亲和素-HRP加到各孔(100μL/孔)中，在室温下孵育1小时，然后用275μL洗涤缓冲液洗涤7次。将底物试剂(过氧化物酶检测试剂)加到各孔(100μL/孔)中，在孔中在室温和暗处孵育40分钟。将终止溶液(1MH3PO4)加到各孔中(100μL/空)，将平板通过Spectramax酶标仪在450nm处读取。抗体滴度的计算方式为最后得出高于背景(未用IAVM2e1包被的孔)的OD的血清稀释度的倒数。

S.病毒中和测定

将得自免疫小鼠的血清在PBS中稀释，将50μL各血清稀释样加到96孔圆底板的四个平行孔中的50μL按1:100-1:120稀释的H1N1病毒中。将板在37℃的含5％CO2的潮湿箱中孵育8小时。向24孔平底板中，将200μL 1×106个MDCK细胞/ml和400μL病毒/血清稀释样混合物(得自96孔板的四个孔的合并材料)加到各孔中。将24孔板在37℃与5％CO2的条件下孵育48h。然后将细胞用250ml 100％甲醇固定，并在室温下孵育20分钟。然后滗出甲醇，将细胞在室温下用250ml在20％乙醇溶液中的0.1％结晶紫染色10分钟。将细胞用蒸馏水冲洗，然后在室温下干燥。中和滴度确定为能够防止50％MDCK被H1N1病毒产生细胞溶解的最低稀释度。为了确定50％MDCK细胞溶解，使用UVP Gel DOC系统计算了板中各孔的密度。

T.体外病毒斑块(“噬斑”)分析

为了评估肺中的病毒滴度，在攻毒后第五天采集了每组中五只小鼠的肺，匀化，然后在CMEM(MEM，10％FBS和1％青霉素-链霉素)中在冰上制备了匀化的肺的十倍序列稀释样。将200μL肺样品的等分试样与200μL MDCK细胞(7×105-1×106个细胞/ml)在24孔板中混合，在37℃、5％CO2下孵育以让MDCK细胞粘附到板底。6h后，将300μL在CMEM中稀释的3％甲基纤维素加到各孔中。将板在37℃、5％CO2培养箱中孵育40-48h。为了观察病毒斑块的形成，进行了免疫组织化学染色程序。移除3％甲基纤维素，将板用PBS洗涤1次。然后，将400μL4％甲醛的PBS溶液加到各孔中以固定细胞。将板在室温下孵育30分钟，移除固定液，将细胞用每孔400μL的0.5％Triton X-100的PBS溶液透化。将板用PBS洗涤两次，然后用PBS、10％FBS在室温下孵育90分钟。孵育后，将板用PBS洗涤1次，将每孔150μL的单克隆抗-NP-流感抗体(在PBS中按1:100稀释)加入。在室温下孵育90分钟后，将板用PBS洗涤7次，将150μL辣根过氧化物酶标记的抗IgG(在PBS、10％FBS中按1:1000稀释)加到各孔中。将板孵育90分钟，用PBS洗涤7次，将300μL显色底物(与24.3ml柠檬酸(0.05M)和20mg二氨基联苯胺和20μLH2O2混合的25.7ml Na2HPO4(0.1M))加入。将板孵育10至30分钟，然后用蒸馏水洗涤板而终止反应。使用倒置显微镜对斑块形成单元的数量计数(即，每个孔中棕色细胞的局部区域的数量)。将每个孔中的斑块数量乘以稀释因子，并用于确定每毫升的斑块或“噬斑”形成单位数。

U.统计分析。

统计分析利用了rANOVA、Kaplan-Meier、Mann-Whitney秩和检验或Wilcoxon检验。所选的特定检验将取决于所分析的数据/样品类型。

实施例2.结果

在本研究中，除了pET28a-IAVM2e1-HD外，我们还构建了四个新的IAVM2e1-HD构建体：(i)具有上述LDR序列的pEVl IAVM2e1-HD，(ii)pEVl-IAVM2e1(C16S,C18S)-HD，(iii)pEVl-IAVM2e1(C16S)-HD，(iv)pEV 1-IAVM2e1(C18S)-HD和(v)pEVl-IAVM2e1(1-15)-HD。对所有新的质粒进行了测序，并确认处于框内且包含正确的序列。各IAVM2e1-HD构建体的PCR产物表明各PCR产物与相应IAVM2e1-HD插入序列的预期大小对应。将质粒转化进大肠杆菌菌株C-43并进行表达。进行了小规模表达研究以确认构建体表达了蛋白。不同于原始pET28a-IAVM2e1-HD构建体，包含pEV的IAVM2e-HD构建体显示出与相应的未诱导对照相比高水平的蛋白表达。为了确认表达了目标M2e蛋白，进行了蛋白印迹分析。将IAVM2e1蛋白通过抗M2e单抗显色。相比之下，如预期，未检测到阴性对照炭疽芽孢杆菌保护性抗原。在若干IAVM2e1样品中观察到了多个条带，从而表明即使在存在SDS和β-巯基乙醇的情况下，IAVM2e1-HD也可形成多聚体。

将膜馏分进一步处理，然后接受Ni-NTA亲和纯化。将硫氧还蛋白-IAVM2e-HD融合蛋白馏分用20mM Tris、250mM咪唑(pH 8)洗脱。将馏分通过SDS-PAGE进行了评估，合并含有靶蛋白的馏分，进一步纯化。相似地进行了各种重组硫氧还蛋白-IAVM2e1-HD融合蛋白的处理和各种IAVM2e1-HD肽的纯化。作为代表性数据集，在此详细描述了IAVM2e1(1-15)-HD肽的纯化。通过HPLC分析了洗脱缓冲液(20mM Tris，250mM咪唑，pH 8)中Ni-NTA亲和纯化的融合蛋白的样品。硫氧还蛋白-IAVM2e1(1-15)-HD融合蛋白样品的代表性HPLC色谱图显示出在大约9和12分钟时洗出的两个主要组分；在溶剂前沿处的大峰(3min)主要由残余的咪唑和极性更高的组分构成。9min组分是主要的污染物，表观分子量为约17kDa(数据未示出)。12min组分是目标硫氧还蛋白-IAVM2e1(1-15)-HD融合蛋白。

为了浓缩样品并耗尽污染性小分子诸如咪唑和/或其它组分，将Ni-NTA亲和纯化的融合蛋白样品进行超滤，然后缓冲液交换到10mM磷酸钠缓冲液(pH 8)中。超滤通过使用具有50kDa MWCO PES膜的Amicon超滤搅拌单元(50ml容量)完成。通常，如上所述进行了4个或更多个超滤循环，从而导致稀释缓冲液及其组分10,000或更高倍数的稀释。通过HPLC对得自超滤过程的流过液(合并液)和渗余液馏分进行了分析。通过这种方法，可以处于9min处的大部分污染性组分。渗余液馏分保留了大部分12min融合蛋白组分。超滤过程利用了之前观察到的但未进行研究的现象，其中低分子量HD蛋白可被高MWCO膜截留。在此情况下，约24.0kDa的单体融合蛋白可被50kDa MWCO PES膜截留，而其它组分(包括约17kDa的污染物)则流过。有人提出，蛋白的-HD组分组装成稳定的多亚单位复合物或以高于50kDa聚集，从而使得将-HD蛋白截留在渗余液馏分中。

随后在存在0.5mM EDTA、10mMβ-巯基乙醇的情况下在25℃经18小时以每1mg的融合蛋白使用5个单位的TEV蛋白酶处理，将融合蛋白通过TEV蛋白酶裂解，以将硫氧还蛋白组分从IAVM2e1(1-15)-HD肽分离。在通过TEV蛋白酶将融合蛋白裂解以产生硫氧还蛋白和IAVM2e(1-15)-HD组分后，使样品通过50kDa MWCO PES膜接受Amicon搅拌单元超滤，以部分消耗硫氧还蛋白组分。超滤后的样品显示出在8-9min处的硫氧还蛋白已消耗掉85％以上，而几乎100％保留了11-12min处的残余融合蛋白和14min处的IAVM2e1(1-15)-HD。

将包含推定IAVM2e1(1-15)-HD并明显耗尽了硫氧还蛋白组分的得自超滤过程的渗余液稀释到每毫升10mM磷酸钠(pH 8)约10mg IAVM2e1(1-15)-HD，然后接受制备型RP-HPLC以从剩余的污染性组分中纯化IAVM2e1(1-15)-HD。将2mL含有大约20mg IAVM2e1(1-15)-HD的样品进样到制备型C18柱(22×250mm)，用含有0.1％TFA的乙腈梯度进行洗脱。该方法在30-35min之间洗脱出残余的硫氧还蛋白，并在35-40min之间洗脱出未裂解的融合蛋白。得自40-42min的馏分通常作为IAVM2e1(1-15)-HD肽而收集。该方法似乎有效地从推定的IAVM2e1(1-15)-HD组分中解离了硫氧还蛋白和融合蛋白，预计为高纯的。

相似地对各种重组IAVM2e1-HD融合蛋白进行了处理。使TEV蛋白酶裂解的样品接受了制备型HPLC，相似地回收了单体形式的肽。将包含各种通过HPLC纯化的IAVM2e1-HD肽的馏分通过HPLC进行了分析以评估纯度。分析型HPLC色谱表明从制备型HPLC馏分中回收了在11至15min之间洗出的相对纯的IAVM2el-HD肽，而无可检测水平的任何其它污染性蛋白组分，包括硫氧还蛋白和融合蛋白。

设计了无半胱氨酸的IAVM2e1(1-15)-HD和IAVM2e1(C16S,C18S)-HD肽，并因此能够形成二硫键连接的二聚体或多聚体。这样，作为单体通过以下方式回收了这些肽：通过采用5kDa MWCO再生纤维素膜的Amicon搅拌单元超滤，以从乙腈/TFA溶剂中保留肽并缓冲液交换到10mM磷酸钠(pH 8)中。

设计了含有一个半胱氨酸的IAVM2e1(C16S)-HD和IAVM2e1(C18S)-HD肽，并因此能够形成二聚体。将这些肽缓冲液交换到10mM磷酸钠(pH 8)中，然后在环境温度和存在空气下经72小时氧化。氧化后，通过制备型HPLC从剩余的单体中纯化了二聚体。二聚体通常在单体后约2-3min洗出，从而使得能够作为纯化的二聚体收集不同的馏分。将二聚体馏分通过采用5kDa MWCO再生纤维素膜的搅拌单元超滤进行了缓冲液交换。当缓冲液交换到10mM磷酸钠(pH 8)中时，二聚体易于形成沉淀。对最终样品进行了交换，并回收到80％乙醇中，其更容易地溶解二聚体肽。

设计了LDR-6His-IAVM2e1-HD肽(通过pEV载体)以模拟pET28a再生的IAVM2e1-HD肽。通常将pET28a-IAVM2e1-HD肽纯化，然后冻干，然后在缓冲液(pH 8)中复溶。由于存在2个半胱氨酸，据观察，pET28a-IAVM2e1-HD肽容易地呈二聚体和多聚体形式作为主要的分子物种。因此，相似地对纯化的LDR-6His-IAVM2e1-HD单体进行了处理以模拟二聚体和多聚体的形成。对HPLC纯化的LDR-6His-IAVM2e1-HD单体进行了超滤以缓冲液交换到10mM磷酸钠(pH 8)中，然后冻干并用水复溶，从而保持10mM磷酸钠(pH 8)下的缓冲能力。复溶的LDR-6His-IAVM2e1-HD的HPLC分析表明单体明显氧化成了其它物质。

通过SDS-PAGE在非还原条件下(不含β-巯基乙醇以避免二硫键连接的多聚体还原成单体)分析了在磷酸钠缓冲液或80％乙醇中复溶的纯化IAVM2e1-HD肽，以评估多肽的迁移模式。各肽的分子量计算值如表3的第3列所示。

表3.纯化的IAVM2e1-HD蛋白的性质。NaPi(磷酸钠)。通过ESI-MS进行质谱分析。基于平均同位素的质量计算值。通过LAL测

定法确定的内毒素水平。

预期为单体的IAVM2e1(1-15)-HD肽作为单个条带洗脱，表观分子量为约5kDa，与6.9kDa的单体物质的计算大小一致。也预期为单体的IAVM2e1(C16S,C18S)-HD肽作为单个条带洗脱，表观分子量为约6kDa，与8.0kDa的单体物质的计算大小一致。预期为二聚体的IAVM2e1(C16S)-HD和IAVM2e1(C18S)-HD肽作为14与22kDa标记之间的单个条带洗脱，与其16kDa的二聚体形式的计算大小一致。这些样品的还原显示出在6kDa标记附近迁移的单个条带，与单体形式一致。预期包含多种形式的LDR-6His-IAVM2e1-HD肽在非还原条件下显示出五个不同的条带。样品的还原只显示出2个不同的条带，主要条带在6kDa标记之上，与10.3kDa单体形式一致，而次要条带正好在14kDa标记之上。14kDa标记之上的次要条带可能是可忽略水平的污染性硫氧还蛋白组分。约20、30和40kDa的条带分别与二聚体、三聚体和四聚体的分子大小一致。基于图6第4道的迁移模式，此制备物中的LDR-6His-IAVM2e1-HD肽似乎主要为单体和二聚体形式。总体而言，SDS-PAGE分析表明了相应分子物种的相对纯的IAVM2e1-HD肽。

为了准确确认IAVM2e1-HD肽的质量，使样品接受了SEC-ESI-MS。结果汇总在表3的第3和4列中。总体而言，质谱数据确认了纯化肽的质量测量值与各种IAVM2e1-HD肽的质量计算值相同，从而确认了回收了目标IAVM2e1-HD肽。

为了确认纯化过程能够将内毒素移除到可以忽略的水平，通过LAL测定法分析了各种IAVM2e1-HD样品的内毒素水平。结果在表3的第5列中示出，单位为EU/15μg蛋白(在随后的动物研究中的每剂的预期蛋白量)。总体而言，各样品中的内毒素水平可以忽略，而IAVM2e1(1-15)-HD样品显示出最高的水平，为6.9EU/15μg。

由于用于测试新构建体的小鼠的量较大，进行了不同L-IAVM2e1-HD制剂的两项单独的研究。在各组中，将原始L-LDR-IAVM2e1-HD(pET28a)、L-LDR-IAVM2e1-HD(pEVl，这种蛋白与pET28a形式相同，但在高表达质粒中)用作阳性对照，将L-对照用作阴性对照。第一组包含了L-IAVM2e1(C16S,C18S)-HD和L-IAVM2e1(1-15)-HD，经预测其每一者产生IAVM2e1-HD蛋白的单体形式。

各种不同的脂质体制剂的尺寸分布不同。总体而言，脂质体显示出双峰分布，一个峰在41.8nm至84.5nm的范围内，第二个峰在189.9nm至298.2nm的范围内。相比之下，L-LDR-IAVM2e1-HD(pEVl)制备物显示出188nm的单峰分布(表4)。脂质体蛋白样品的双峰尺寸分布可能是由于在UPA测量期间IAVM2e1-HD在水性表面处的膜内移动。相比之下，不含蛋白的L-对照具有57.8nm的单峰高斯尺寸分布。

表4.L-IAVM2e1-HD制剂的第一项小鼠研究

NA-不适用

ND-未进行

测定了各L-IAVM2e1(C16S,C18S)-HD和L-IAVM2e1(1-15)-HD制剂的蛋白浓度。蛋白浓度的RP-HPLC分析表明样品含有80％至100％的原始原料。蛋白的损失可归因于蛋白粘附到管的侧面、由于探针超声处理造成的损失以及无菌过滤期间造成的损失。由于pET28和pEV的IAVM2e1-HD构建体的多聚体形式以及分离度不足，未确定蛋白浓度。

第二组含有两个单一突变体批次(即C16S和C18S IAVM2e肽)，经预测它们产生蛋白的二聚体形式。脂质体产生了具有不同尺寸分布的典型半透明溶液。如第一组中的IAVM2e1-HD构建体所见，有一些制备物显示出单峰分布，一些显示出双峰分布(表5)。此分布的变化性似乎不与蛋白类型或蛋白浓度相关。通常，第一个峰在48nm至173nm之间，第二个峰在149nm至254nm之间。通过RP-HPLC测定了最终脂质体制剂的蛋白浓度。数据表明，在这些样品的制备期间损失的蛋白非常少(表5)。

表5.L-IAVM2e1-HD制剂的第二项小鼠研究

NA-不适用

ND-未进行

之前，我们证实了L-IAVM2e1-HD疫苗能够在小鼠中诱导针对致命性流感病毒攻毒[Ernst等，2006]的强保护性免疫反应。这种反应与体液免疫反应相关，原因是L-IAVM2e1-HD免疫的小鼠能够保护初始小鼠抵抗致命性流感攻毒。由于用于测试新构建体的小鼠的总数，进行了两项单独的研究。在第一项研究中，如“材料和方法”章节中所述通过原始L-LDR-IAVM2e1-HD(pET28a)、L-LDR-IAVM2e1-HD(pEV；这种蛋白与pET28a形式相同，但在高表达质粒中)、L-IAVM2e1(1-15)-HD和L-IAVM2e1(C16S,C18S)-HD对BALB/c小鼠免疫。在该实验中，将截短的(IAVM2e1-15)和双突变IAVM2e1(C16S,C18S)蛋白与原始IAVM2e1蛋白进行了比较。用15μg原始制剂(得自pET28a)和原始制剂(得自pEV)免疫的小鼠显示出72％存活率的良好免疫保护性反应。当将小鼠用5μg、15μg或30μg L-IAVM2e1(1-15)-HD免疫时，86％的小鼠在致命性流感攻毒中存活(与L-对照相比较的p<0.05)。接受L-对照并随后进行攻毒的所欲小鼠均在第9天死亡(图7A)。另外，免疫后的小鼠显示出与对照处理组相比最轻的疾病体征和体重损失。与用L-IAVM2e1(1-15)-HD免疫的小鼠相比，在用5μg、15μg或30μg L-IAVM2e1(C16S,C18S)-HD免疫的小鼠之中，只有接受30μg剂量的小鼠显示出与对照的明显差异(p＝0.006，86％的存活率)。而接受5μg或15μg L-IAVM2e1(C16S,C18S)-HD的小鼠分别只显示出57％和42％的存活率(图8A)。还对小鼠评价了与存活百分比相关的体重损失和疾病体征。

在第二项研究中，将小鼠使用作为脂质体制剂的单一半胱氨酸IAVM2e1突变体(C16S或C18S)免疫。这些突变体产生了IAVM2e1-HD的二聚体形式，并如上所述在体内与单体IAVM2e1-HD形式进行了比较。将小鼠组用5μg、15μg或30μg L-IAVM2e1(C16S)-HD免疫，随后用10 LD50的A/PR/8/34攻毒。免疫保护性反应在所测试的三个剂量之间存在差异。用5μg、15μg或30μg剂量免疫的小鼠分别显示出86％、71％和57％的存活率。只有5μg(p＝0.004)和15μg(p＝0.032)剂量与L-对照相比显示出明显的差异，其中所有用L-对照处理的小鼠均在攻毒后9天死亡。用5μg、15μg或30μg L-IAVM2e1(C18S)-HD处理的小鼠显示出了比C16S突变体好得多的反应。所有接受15μg剂量的小鼠均在致死性攻毒中存活，接受5μg和30μg剂量的七只小鼠(86％)中只有一只存活。这些剂量的每一者都明显由于接受L-对照的小鼠(p<0.005)。令人感兴趣的是，两种单一半胱氨酸突变构建体均产生了比未突变的L-LDRIAVM2e1-HD疫苗好的保护。另外，对免疫后的小鼠的评价显示出与对照处理组相比最轻的疾病体征和体重损失。

实施例3.结论

由于IAVM2e1片段包含两个半胱氨酸(在第16和18位；参见表2)并且肽可通过二硫键形成二聚体至多聚体，因此IAVM2e1-HD蛋白的纯化比较困难。由于蛋白以多种形式表达，因此纯化的分离度低于期望。通过表达和纯化只有一个半胱氨酸或不含任何半胱氨酸的IAVM2e1-HD，本发明产生了更均匀的蛋白分子。我们的数据表明，单个半胱氨酸IAVM2e1-HD突变未形成二聚体，当在硫氧还蛋白下游表达时，产生了与原始IAVM2e1-HD相当的蛋白量。为了测试IAVM2e1-HD的单体形式，制备了两个两外的构建体。所制备的一个构建体中两个半胱氨酸均发生突变，第二个构建体中只使用了IAVM2e1的前15个残基。在两种情况下，蛋白均作为单体而形成，并与原始和单个半胱氨酸突变形式一样好地表达。这些数据表明，当置于氧化环境中时(即用于制备脂质体的缓冲液)，半胱氨酸在蛋白的二聚化和多聚化蛋白结构中发挥着决定性作用。直接进行了蛋白的单体形式的纯化，纯化达到了高纯度。另外，显然的是，当蛋白融合到硫氧还蛋白的C端时，IAVM2e1-HD蛋白的表达无差异。

本文所述的临床前结果证实了IAVM2e1抗原片段是通用流感疫苗的可行候选物。虽然在所用的肽的不同形式之间存在变化，但几乎所有的构建体通过至少一个剂量与对照相比都刺激了明显的保护性免疫反应。出人意料的是，从这些数据中显而易见的是，半胱氨酸在保护性免疫反应中不起作用，因为双半胱氨酸突变体和截短的IAVM2e1(1-15)蛋白都刺激了保护性免疫反应。

实施例4.参考文献

Ernst WA,Kim HJ,Tumpey TM等Protection against H1,H5,H6 and H9influenza A infection with liposomal matrix 2 epitope vaccines.Vaccine 2006；24(24):5158-68.

Fan J,Liang X,Horton MS等Preclinical study of influenza virus A M2peptide conjugate vaccines in mice,ferrets,and rhesus monkeys.Vaccine 2004；22(23-24):2993-3003.

Liu W,Li H,Chen YH.N-terminus of M2 protein could induce antibodieswith inhibitory activity against influenza virus replication.FEMS Immunol.MedMicrobiol.2003；35(2):141-6.

Neirynck S,Deroo T,Saelens X,Vanlandschoot P,Jou WM,Fiers W.Auniversal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2protein.Nat.Med 1999；5(10):1157-63.

实施例5.HSV2

为了证实HSV2蛋白疫苗的有效性，如实施例1中所述制备了含有合适的HSV抗原的脂质体制剂，其中多肽包含替代IAVM2e1的以下HSV2序列中的一者或多者并优选地由它们组成：

HTDHPNNTY、RSSLGSLLY、YMESVFQMY、FLVDAIVRVA、FLIAYQPLL、FLWEDQTLL、ILIEGIFFA、RILGVLVHL、SVYPYDEFV、EYQRLYATF、KYFYCNSLF、LYPDAPPLRL、ALATVTLKY、ALLAKMLFY、LLAYVSVLY、SIVHHHAQY、SSGVVFGTWY、VYMSPFYGY、YMANQILRY、YVAGFLALY、CPRRPAVAF和VVRGPTVSL(SEQ ID NO:60-81)

将人HLA A2:01转基因(Tg)小鼠(n＝20只/组)用作动物模型以证实HSV2疫苗刺激人类中的保护性免疫反应的可行性。在此疫苗中的五种代表性HLA单倍型之中，HLA A2:01是最佳的模型，因为该HLA单倍型代表所有人类族群之中最常见的HLA单倍型。如上所述，通过MPL或CpG佐剂制备了如本文所述的融合到合适的疏水结构域的HSV2序列的脂质体制剂。通过Luminex multi-bead ELISA和ELISPOT分析(5只小鼠/组)对接种疫苗的小鼠(N＝20只/组)评价了它们对各种HSV2多肽的反应，并使用上述程序对小鼠进行了阴道内攻毒以监测保护程度。

本领域的技术人员将容易地认识到，本发明能够很好地完成本发明的目的并获得提到的以及其中固有的那些结果和优势。本文提供的实例代表优选的实施方案，是示例性的，而不意欲限制本发明的范围。

虽然为了使本领域的技术人员完成和利用本发明已经足够详细地描述和示例性地示出了本发明，但是在不脱离本发明精神和范围的前提下各种替代形式、修改形式和改进形式应是显而易见的。本文提供的实例代表优选的实施方案，是示例性的，而不意欲限制本发明的范围。其中的修改形式和其它用途将是本领域的技术人员能够想到的。这些修改形式包括在本发明的精神内并由权利要求书的范围限定。

对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明精神和范围的前提下可对本文公开的发明进行各种替换和修改。

本说明书中提及的所有专利和出版物表明本发明所属领域的普通技术人员的水平。所有专利和出版物均以引用方式并入本文，达到如同各个出版物具体且单独地表明以引用方式并入的相同程度。

可将本文示例性描述的本发明适宜地在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、任何一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，在本文各种情况下，术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”的任何一个均可使用另外两个术语中的任一个代替。已采用的术语和表述用作描述性而非限制性的术语，而使用此类术语和表述的目的并非将所示和所述的特征的任何等同形式或其部分排除在外，而是应当认识到各种修改形式可能在本发明要求保护的范围之内。因此，应当理解的是，尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征进行了具体公开，但是本领域的技术人员可以获得本文公开的概念的修改形式和变型形式，并且此类修改形式和变型形式被视为在由所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

其它实施方案在以下权利要求书内示出。

Claims

1.一种组合物，其包含：

水性媒介物；和

脂质体，所述脂质体包含：

(i)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、

(ii)二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)，或

二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷(“DMTAP”)或DMPG和DMTAP两者、

(iii)至少一种甾醇；以及

(iv)抗原多肽，所述抗原多肽包含：

含有甲型流感M2胞外域的至少前15个残基的第一多肽序列，所述序列经修饰以通过半胱氨酸残基突变成另一残基或通过在半胱氨酸残基之前将胞外域截短而移除天然存在于所述M2胞外域中的一个或多个半胱氨酸残基，以及

通过细胞色素b5蛋白编码的跨膜序列的第二多肽序列，

其中所述第一多肽序列直接或间接偶合到所述第二多肽序列的N端或C端以提供水溶性融合多肽，并且

其中所述融合多肽的所述第一多肽序列展示在脂质体的外表面上。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为50％至98％的DMPC:1％至25％的DMPG/DMTAP:1％至25％的甾醇。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为70％至98％的DMPC:1％至15％的DMPG/DMTAP:1％至15％的甾醇。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为70％至85％的DMPC:5％至15％的DMPG/DMTAP:10％至15％的甾醇。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为约75％的DMPC、约10％的DMPG/DMTAP和约15％的甾醇。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述脂质体包含DMPG。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述脂质体不含DMTAP。

8.根据权利要求1-5和7之一所述的组合物，还包含选自以下的一种或多种另外的组分：肽聚糖、脂肽、脂多糖、单磷酰脂A、脂磷壁酸、瑞喹莫德、咪喹莫特、鞭毛蛋白、含未甲基化CpG基序的寡核苷酸、α-半乳糖神经酰胺、胞壁酰二肽、全反式维甲酸、双链病毒RNA、热休克蛋白、二(十八烷基)二甲基溴化铵、阳离子表面活性剂、toll样受体激动剂、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷和nod样受体激动剂。

9.根据权利要求1-5和7之一所述的组合物，其中所述组合物包含选自以下的甾醇：胆固醇、胆固醇氯甲酸酯、豆甾醇、谷甾醇、麦角固醇、羊毛甾醇、链甾醇和菜油甾醇。

10.根据权利要求1-5和7之一所述的组合物，其中所述第一多肽序列是得自SEQ IDNO:13-15之一的所有15个连续残基。

11.根据权利要求1-5和7之一所述的组合物，其中所述第一多肽序列是SEQ ID NO:16。

12.根据权利要求1-5和7之一所述的组合物，其中所述第二多肽序列是得自SEQ IDNO:17-25之一的至少10个连续残基。

13.根据权利要求1-5和7之一所述的组合物，其中所述第二多肽序列是通过SEQ IDNO:26-42之一编码的跨膜序列。

14.根据权利要求1-8之一所述的组合物在制造用于使动物免疫的药物中的用途。

15.一种制备根据权利要求1的脂质体组合物的方法，其包括：

重组表达或通过化学方法合成所述抗原多肽，其中所述抗原多肽在非变性条件下为单体形式；

将所述抗原多肽纯化到水溶液中；

向包含所述抗原多肽的所述水溶液添加包含(i)DMPC、(ii)DMPG、DMTAP或DMPG和DMTAP两者以及(iii)至少一种甾醇的脂质混合物；

干燥所述抗原多肽和脂质混合物；以及

对所述干燥的抗原多肽和脂质混合物在存在水性媒介物的情况下进行超声处理以形成脂质体。

16.一种编码融合蛋白的分离的核酸序列，所述序列包含：

编码硫氧还蛋白的第一核酸序列；

编码IAVM2e1的第二核酸序列；以及

其中所述核酸序列被构造成使得在表达所述核酸时，硫氧还蛋白在所述跨膜序列的N端表达，

其中所述第三核酸序列是通过细胞色素b5蛋白编码的跨膜序列。

17.根据权利要求16所述的分离的核酸序列，还包含可操作地连接到编码所述融合蛋白的所述核酸序列的表达控制序列。

18.根据权利要求16或17所述的分离的核酸序列，还包含编码亲和标记的一个或多个另外的核酸序列。

19.根据权利要求16-17之一所述的分离的核酸序列，还包含编码蛋白酶裂解位点的一个或多个另外的核酸序列。

20.根据权利要求16-17之一所述的分离的核酸序列，其中对所述分离的核酸序列的至少一部分进行密码子优化以在宿主细胞中表达。

21.根据权利要求20所述的分离的核酸序列，其中对所述分离的核酸序列的至少一部分进行密码子优化以在大肠杆菌中表达。

22.根据权利要求16-17和21之一的分离的核酸序列，其中所述第二核酸序列编码抗原序列、多肽靶向配体或融合多肽序列。

23.根据权利要求16-17和21之一所述的组合物，其中所述第三核酸序列是得自SEQ IDNO:17-25之一的至少10个连续残基。

24.根据权利要求16-17和21之一所述的组合物，其中所述第三核酸序列是通过SEQ IDNO:26-42之一编码的跨膜序列。

25.一种宿主细胞，其通过根据权利要求16-24之一所述的分离的核酸转化。

26.根据权利要求25所述的宿主细胞用于获得目标多肽序列的用途，其包括：

分离的核酸序列编码的融合蛋白由所述宿主细胞所表达。

27.根据权利要求26所述的用途，还包括将所述表达的融合蛋白的全部或一部分纯化到水溶液中。

28.根据权利要求27所述的用途，还包括向包含所述纯化蛋白的所述水溶液添加包含(i)DMPC、(ii)DMPG、DMTAP或DMPG和DMTAP两者以及(iii)至少一种甾醇的脂质混合物；

干燥所述纯化的蛋白和脂质混合物；以及

对所述干燥的纯化蛋白和脂质混合物在存在水性媒介物的情况下进行超声处理以形成脂质体。