ES2595371T3 - Composición farmacéutica - Google Patents

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ES2595371T3 ES10713172.4T ES10713172T ES2595371T3 ES 2595371 T3 ES2595371 T3 ES 2595371T3 ES 10713172 T ES10713172 T ES 10713172T ES 2595371 T3 ES2595371 T3 ES 2595371T3
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Andrea Pfeifer
Andreas Muhs
Fred Van Leuven
Maria Pihlgren Bosch
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Katholieke Universiteit Leuven
AC Immune SA
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Katholieke Universiteit Leuven
AC Immune SA
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Abstract

Un péptido antigénico modificado (a) mediante la unión a un resto lipofílico o hidrofóbico que facilita la inserción en la bicapa lipídica de un liposoma y (b) mediante la reconstitución en un liposoma de tal modo que el péptido se presenta sobre la superficie del liposoma, en donde dicho péptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.

Description

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La descripción se refiere a un péptido antigénico, particularmente a un péptido antigénico modificado según la presente invención, o a un fragmento funcional del mismo, y a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido antigénico o un fragmento funcional del mismo, péptido o fragmento que exhibe una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 4, en donde al menos uno, particularmente al menos 2 de los residuos de aminoácido 202 (P-Ser202) y 205 (P-Thr205) están fosforilados.
La descripción se refiere a un péptido antigénico, particularmente un péptido antigénico modificado según la presente invención, o un fragmento funcional del mismo, y a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido antigénico o dicho fragmento funcional del mismo, péptido o fragmento que exhibe una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 8%, particularmente al menos un 85%, particularmente al menos un 90%, particularmente al menos un 95%, particularmente al menos un 98%, particularmente al menos un 99%, de identidad de secuencia con respecto a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3 y que tiene sustancialmente la misma actividad inmunogénica que dicho péptido antigénico de la SEQ ID NO: 3, en donde al menos uno, particularmente al menos 2 de los residuos de aminoácido correspondientes a los residuos de aminoácido 212 (P-Thr212) y 214 (P-Ser214) de la SEQ ID NO: 3 están fosforilados.
La descripción se refiere a un péptido antigénico, particularmente a un péptido antigénico modificado según la presente invención, o a un fragmento funcional del mismo, y a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido antigénico o un fragmento funcional del mismo, péptido o fragmento que exhibe una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 3, en donde al menos uno, particularmente al menos 2 de los residuos de aminoácido 212 (P-Thr212) y 214 (P-Ser214) están fosforilados.
La descripción se refiere a un péptido antigénico, particularmente un péptido antigénico modificado según la presente invención, o un fragmento funcional del mismo, y a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido antigénico o dicho fragmento funcional del mismo, péptido o fragmento que exhibe una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 8%, particularmente al menos un 85%, particularmente al menos un 90%, particularmente al menos un 95%, particularmente al menos un 98%, particularmente al menos un 99%, de identidad de secuencia con respecto a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5 y que tiene sustancialmente la misma actividad inmunogénica que dicho péptido antigénico de la SEQ ID NO: 5, en donde al menos uno, pero especialmente todos los residuos de aminoácido correspondientes a los residuos de aminoácido 396 (P-Ser396) y 404 (P-Ser404) de la SEQ ID NO: 5 están fosforilados.
La descripción se refiere a un péptido antigénico, particularmente a un péptido antigénico modificado según la presente invención, o a un fragmento funcional del mismo, y a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido antigénico o un fragmento funcional del mismo, péptido o fragmento que exhibe una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 5, en donde al menos uno, particularmente al menos 2 de los residuos de aminoácido 396 (P-Ser396) y 404 (P-Ser404) están fosforilados.
La descripción se refiere a un péptido antigénico, particularmente un péptido antigénico modificado según la presente invención, o un fragmento funcional del mismo, y a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido antigénico o dicho fragmento funcional del mismo, péptido o fragmento que exhibe una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 8%, particularmente al menos un 85%, particularmente al menos un 90%, particularmente al menos un 95%, particularmente al menos un 98%, particularmente al menos un 99%, de identidad de secuencia con respecto a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 6 y que tiene sustancialmente la misma actividad inmunogénica que dicho péptido antigénico de la SEQ ID NO: 6, en donde al menos uno, pero especialmente todos los residuos de aminoácido correspondientes a los residuos de aminoácido 404 (P-Ser404) y 409 (P-Ser409) de la SEQ ID NO: 6 están fosforilados.
La descripción se refiere a un péptido antigénico, particularmente a un péptido antigénico modificado según la presente invención, o a un fragmento funcional del mismo, y a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido antigénico o un fragmento funcional del mismo, péptido o fragmento que exhibe una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 6, en donde al menos uno, particularmente al menos 2 de los residuos de aminoácido 404 (P-Ser404) y 409 (P-Ser409) están fosforilados.
La descripción se refiere a un péptido antigénico, particularmente un péptido antigénico modificado según la presente invención, o un fragmento funcional del mismo, y a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido antigénico o dicho fragmento funcional del mismo, péptido o fragmento que exhibe una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 80%, particularmente al menos un 85%, particularmente al menos un 90%, particularmente al menos un 95%, particularmente al menos un 98%, particularmente al menos un 99%, de identidad de secuencia con respecto a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 7, y que tiene sustancialmente la misma actividad inmunogénica que dicho péptido antigénico de la SEQ ID NO: 7, en donde al menos uno, particularmente al menos 2, particularmente al menos 3, pero especialmente todos los residuos de aminoácido correspondientes a los residuos de aminoácido 202 (P-Ser202), 205 (P-Thr205), 212 (P-Thr212) y 214 (P-Ser214) de la SEQ ID NO: 7 están fosforilados.
La descripción se refiere a un péptido antigénico, particularmente a un péptido antigénico modificado según la presente invención, o a un fragmento funcional del mismo, y a una composición farmacéutica que comprende dicho
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También es un objetivo de la invención proporcionar una composición farmacéutica según la invención y tal como se describe en la presente memoria, y/o un método, para el tratamiento de enfermedades y trastornos que están producidos por la formación de lesiones neurofibrilares, o que están asociados a la misma, la patología cerebral predominante en la tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos, que incluyen enfermedades o trastornos que presentan una coexistencia de patologías tau y amiloide que incluyen, aunque sin limitación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miositis de cuerpo de inclusión, y angiopatía amiloide cerebral de proteína de prion, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no presenten una patología amiloide distintiva, que incluyen, aunque sin limitación, el complejo de Guam de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia, la enfermedad de neuronas motoras no Guamaniana con marañas neurofibrilares, la demencia de grano argirofílico, la degeneración corticobasal, las marañas neurofibrilares difusas con calcificación, la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17, la enfermedad de Hallevorden-Spatz, atrofia de sistema múltiple, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerotizante subaguda, demencia solo de maraña, parkinsonismo post-encefalítico, distrofia miotónica, método que comprende la administración a un animal, particularmente a un mamífero o un humano, de una composición farmacéutica según la invención y tal como se describe en la presente memoria en una cantidad terapéuticamente efectiva junto con un vehículo y/o diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La descripción proporciona una composición farmacéutica según la invención y tal como se describe en la presente memoria, y/o un método, para retener o aumentar la capacidad de memoria cognitiva pero, particularmente, para restaurar completamente la capacidad de memoria cognitiva de un animal, particularmente de un mamífero o un humano, que padezca de pérdida de memoria, método que comprende la administración a un animal, particularmente a un mamífero o a un humano, de una composición farmacéutica según la invención y tal como se describe en la presente memoria en una cantidad terapéuticamente efectiva junto con un vehículo y/o diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otro objetivo de la invención es proporcionar una composición farmacéutica y un método para producir dicha composición, así como un método para inducir una respuesta inmune en un animal, particularmente un mamífero o un humano que padece una enfermedad y afección que está producida por la formación de lesiones neurofibrilares,
o que está asociada a la misma, mediante la administración a dicho animal o humano de una composición farmacéutica según la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva junto con un vehículo y/o diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un animal, particularmente un mamífero o un humano que padece de lesiones neurofibrilares que dan como resultado una tauopatía, de tal modo que se puede obtener una retención o una mejoría de los síntomas asociados a dicha enfermedad o afección, tal como, por ejemplo, pérdida de memoria, particularmente una restauración completa de la condición original.
La composición farmacéutica que comprende un péptido antigénico según la invención y tal como se describe en la presente memoria, tras administración a un animal, particularmente un mamífero, pero especialmente un humano, da como resultado fundamentalmente la generación de anticuerpos de los subtipos Th2 no inflamatorio, tal como, por ejemplo, el isotipo IgG1 e IgG2b y/o anticuerpos de la subclase de IgG independiente de células T, tal como, por ejemplo, IgG3 y/o no conduce a un aumento significativo de los marcadores inflamatorios del cerebro, particularmente de los marcadores de inflamación seleccionados del grupo que consiste en IL-1 β, IL-6, IFN-γ y TNF α.
En un aspecto adicional, la composición farmacéutcia que comprende un péptido antigénico según la invención y tal como se describe en la presente memoria puede usarse para inducir una respuesta inmune independiente de células T en el tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno en un paciente, particularmente un paciente animal o humano, particularmente un paciente que necesite dicha respuesta independiente de células T, tal como, por ejemplo, un paciente inmuno tolerante o un paciente con células T activadas, en donde dicho péptido antigénico está modificado mediante la unión y/o la reconstitución en un vehículo, particularmente un vehículo liposómico, de tal modo que el antígeno es presentado sobre la superficie del vehículo, particularmente del liposoma.
La composición antigénica descrita en la presente memoria es efectiva como estimulante inmune.
En un aspecto específico, dicho péptido antigénico es presentado en una disposición altamente repetitiva sobre la superficie del liposoma. En un aspecto específico adicional, dicho antígeno no contiene un epítopo de célula T. La composición antigénica de la invención tal como se describe en la presente memoria se usa para tratar a un paciente inmuno tolerante o a un paciente con células T activadas, particularmente un paciente inmuno comprometido, particularmente un paciente que padece una enfermedad autoinmune, particularmente un paciente que padece una deficiencia de células T, particularmente una deficiencia de células T que está provocada por un agotamiento en dichos pacientes de células T CD4 y/o por una expresión reducida de CD14 y/o CD40L en las células T CD4.
Los anticuerpos según la descripción pueden usarse en un método de diagnóstico de una enfermedad o afección asociada a proteína tau en un paciente, que comprende la detección de la unión inmunoespecífica de un anticuerpo
o de un fragmento activo del mismo a un epítopo de la proteína tau en una muestra o in situ, que incluye las etapas de
(a)
poner la muestra o una parte o área específicas del cuerpo que se sospeche que contienen la proteína tau en contacto con dicho anticuerpo, anticuerpo que se une a un epítopo de la proteína tau;
(b)
permitir que el anticuerpo se una a la proteína tau para formar un complejo inmunológico;
(c)
detectar la formación del complejo inmunológico; y
(d)
correlacionar la presencia o la ausencia del complejo inmunológico con la presencia o la ausencia de proteína tau en la muestra o en la parte o área corporal específica.
Se proporciona un método para diagnosticar una predisposición a una enfermedad o afección asociada a proteína tau en un paciente, que comprende detectar la unión inmuno específica de un anticuerpo monoclonal o de un fragmento activo del mismo a un epítopo de la proteína tau en una muestra o in situ, que incluye las etapas de
(a)
poner la muestra o una parte o área específicas del cuerpo que se sospeche que contienen el antígeno tau en contacto con un anticuerpo según la invención y tal como se describe en la presente memoria, anticuerpo que se une a un epítopo de la proteína tau;
(b)
permitir que el anticuerpo se una al antígeno tau para formar un complejo inmunológico;
(c)
detectar la formación del complejo inmunológico; y
(d)
correlacionar la presencia o la ausencia del complejo inmunológico con la presencia o la ausencia de antígeno tau en la muestra o en la parte o área corporal específica,
(e)
comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico con un valor de control normal.
en donde un aumento de la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente está padeciendo, o está en riesgo de desarrollar, una enfermedad o afección asociada a proteína tau.
La descripción se refiere a un método para monitorizar una enfermedad residual mínima en un paciente tras el tratamiento con un anticuerpo o una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho método comprende
(a)
poner la muestra o una parte o área específicas del cuerpo que se sospeche que contienen el antígeno tau en contacto con un anticuerpo según la invención y tal como se describe previamente en la presente memoria, anticuerpo que se une a un epítopo de la proteína tau;
(b)
permitir que el anticuerpo se una al antígeno tau para formar un complejo inmunológico;
(c)
detectar la formación del complejo inmunológico; y
(d)
correlacionar la presencia o la ausencia del complejo inmunológico con la presencia o la ausencia de antígeno tau en la muestra o en la parte o área corporal específica,
(e)
comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico con un valor de control normal.
en donde un aumento de la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente sigue padeciendo una enfermedad residual mínima.
La descripción proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de un paciente que esté siendo tratado con un anticuerpo o una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende
(a)
poner la muestra o una parte o área específicas del cuerpo que se sospeche que contienen el antígeno tau en contacto con un anticuerpo según la invención y tal como se describe previamente en la presente memoria, anticuerpo que se une a un epítopo de la proteína tau;
(b)
permitir que el anticuerpo se una al antígeno tau para formar un complejo inmunológico;
(c)
detectar la formación del complejo inmunológico; y
(d)
correlacionar la presencia o la ausencia del complejo inmunológico con la presencia o la ausencia de antígeno tau en la muestra o en la parte o área corporal específica,
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(e) comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico antes y después del inicio del tratamiento.
en donde una reducción de la cantidad de dicho agregado indica que dicho paciente tiene un potencial elevado de responder al tratamiento.
El anticuerpo según la descripción puede usarse en un kit de ensayo para detección y diagnóstico de enfermedades y afecciones asociadas a tau.
En particular, se proporciona un kit de ensayo para la detección y el diagnóstico de enfermedades y afecciones asociadas a proteína tau que comprende anticuerpos según la descripción, en particular un kit de ensayo que comprende un recipiente que contiene uno o más anticuerpos según la presente descripción e instrucciones para usar los anticuerpos con el fin de unirse a antígeno tau para formar un complejo inmunológico y detectar la formación del complejo inmunológico de tal modo que la presencia o la ausencia del complejo inmunológico se correlaciona con la presencia o la ausencia de antígeno tau.
Éstos y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes tras una revisión de la siguiente descripción detallada de la realización descrita, y de las reivindicaciones anexas.
Descripción breve de las figuras y las secuencias
Figura 1a: anticuerpos de IgG anti-Tau5-20 [pY18] en ratones salvajes inmunizados con ACI-33. Análisis de anticuerpos de IgG anti-Tau5-20 [pY18] en los sueros de ratones C57BL/6 salvajes que han recibido 3 inyecciones de ACI-33 en los días 0, 13 y 28, y que han sido sangrados en los días 1, 27 y 47. Los resultados se expresan como
D.O. media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 1b: anticuerpos de IgG anti-Tau5-20 [pY18] en ratones TKO inmunizados con ACI-33. Análisis de anticuerpos de IgG anti-Tau5-20 [pY18] en los sueros de ratones C57BL/6 salvajes que han recibido 3 inyecciones de ACI-33 en los días 0, 13 y 28, y que han sido sangrados en los días 1, 27 y 47. Los resultados se expresan como D.O. media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 2a: anticuerpos de IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] en ratones salvajes inmunizados con ACI-35. Análisis de anticuerpos de IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] en los sueros de ratones C57BL/6 salvajes que han recibido 5 inyecciones de ACI-35 en los días 0, 16, 30, 99 y 113, y que han sido sangrados en los días -1, 28, 42, 98 y 126. Los resultados se expresan como D.O. media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 2b: anticuerpos de IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] en ratones TKO inmunizados con ACI-35. Análisis de anticuerpos de IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] en los sueros de ratones TKO que han recibido 5 inyecciones de ACI-35 en los días 0, 16, 30, 99 y 113, y que han sido sangrados en los días -1, 28, 42, 98 y 126. Los resultados se expresan como D.O. media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 3a: anticuerpos de IgG anti-Tau401-418 [pS404/pS409] en ratones salvajes inmunizados con ACI-36. Análisis de anticuerpos de IgG anti-Tau401-418 [pS404/pS409] en los sueros de ratones C57BL/6 salvajes que han recibido 3 inyecciones de ACI-36 en los días 0, 13 y 28, y que han sido sangrados en los días -1, 27 y 47. Los resultados se expresan como D.O. media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 3b: anticuerpos de IgG anti-Tau401-418 [pS404/pS409] en ratones TKO inmunizados con ACI-36. Análisis de anticuerpos de IgG anti-Tau401-418 [pS404/pS409] en los sueros de ratones TKO que han recibido 3 inyecciones de ACI-36 en los días 0, 13 y 28, y que han sido sangrados en los días -1, 27 y 47. Los resultados se expresan como
D.O. media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 4a/4b: anticuerpos de IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214] y anti-Tau196-211 [pS202/pT205] en ratones salvajes inmunizados con ACI-41. Análisis de anticuerpos de IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214] y anti-Tau196-211 [pS202/pT205] en los sueros de ratones C57BL/6 salvajes que han recibido 3 inyecciones de ACI-41 en los días 0, 20 y 35, y que han sido sangrados en los días -1, 34 y 48 Los resultados se expresan como D.O. media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones. Se evaluaron los mismos sueros en ambos péptidos pTau.
Figura 4c/4d: anticuerpos de IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214] y anti-Tau196-211 [pS202/pT205] en ratones TKO inmunizados con ACI-41. Análisis de anticuerpos de IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214] y anti-Tau196-211 [pS202/pT205] en los sueros de ratones TKO que han recibido 3 inyecciones de ACI-41 en los días 0, 20 y 35, y que han sido sangrados en los días -1, 34 y 48 Los resultados se expresan como D.O. media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones. Se evaluaron los mismos sueros en ambos péptidos pTau.
Figura 5a: isotipos de IgG anti-Tau5-20 [pY18] y anticuerpos de IgM en ratones salvajes inmunizados con ACI-33. Análisis de anti-Tau5-20 [pY18] IgG1, 2a, 2b, 3 y anticuerpos de IgM en los sueros de ratones C57BL/6 47 días después de la primera inmunización con ACI-33. Los resultados se expresan como D.O. a una dilución de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) y 1/3200 (IgM), presentando la media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
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Figura 5b: isotipos de IgG anti-Tau5-20 [pY18] y anticuerpos de IgM en ratones TKO inmunizados con ACI-33. Análisis de anti-Tau5-20 [pY18] IgG1, 2a, 2b, 3 y anticuerpos de IgM en los sueros de ratones TKO 47 días después de la primera inmunización con ACI-33. Los resultados se expresan como D.O. a una dilución de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) y 1/3200 (IgM), presentando la media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 6a: isotipos de IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] y anticuerpos de IgM en ratones salvajes inmunizados con ACI-35. Análisis de anti-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b, 3 y anticuerpos de IgM en los sueros de ratones C57BL/6 42 días después de la primera inmunización con ACI-35. Los resultados se expresan como D.O. a una dilución de 1/100 (IgG1), 1/1600 (IgG2a), 1/1600 (IgG2b), 1/800 (IgG3) y 1/1600 (IgM), presentando la media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 6b: isotipos de IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] y anticuerpos de IgM en ratones TKO inmunizados con ACI-35. Análisis de anti-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b, 3 y anticuerpos de IgM en los sueros de ratones TKO 42 días después de la primera inmunización con ACI-35. Los resultados se expresan como D.O. a una dilución de 1/100 (IgG1), 1/1600 (IgG2a), 1/1600 (IgG2b), 1/800 (IgG3) y 1/1600 (IgM), presentando la media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 7a: isotipos de IgG anti-Tau401-418 [pS404/S409] y anticuerpos de IgM en ratones salvajes inmunizados con ACI-36. Análisis de anti-Tau401-418 [pS404/S409] IgG1, 2a, 2b, 3 y anticuerpos de IgM en los sueros de ratones C57BL/6 47 días después de la primera inmunización con ACI-36. Los resultados se expresan como D.O. a una dilución de 1/100 (IgG1), 1/400 (IgG2a), 1/400 (IgG2b), 1/100 (IgG3) y 1/400 (IgM), presentando la media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 7b: isotipos de IgG anti-Tau401-418 [pS404/S409] y anticuerpos de IgM en ratones TKO inmunizados con ACI-36. Análisis de anti-Tau401-418 [pS404/S409] IgG1, 2a, 2b, 3 y anticuerpos de IgM en los sueros de ratones TKO 47 días después de la primera inmunización con ACI-36. Los resultados se expresan como D.O. a una dilución de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) y 1/400 (IgM), presentando la media + desviación estándar obtenida del grupo de 5 ratones.
Figura 8a: isotipos de IgG anti-Tau196-211 [pS202/pT205] y anticuerpos de IgM en ratones salvajes inmunizados con ACI-41. Análisis de anti-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG1, 2a, 2b, 3 y anticuerpos de IgM en los sueros de ratones C57BL/6 48 días después de la primera inmunización con ACI-41. Los resultados se expresan como D.O. a una dilución de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b), 1/1600 (IgG3) y 1/3200 (IgM), presentando la media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 8b: isotipos de IgG anti-Tau196-211 [pS202/pT205] y anticuerpos de IgM en ratones TKO inmunizados con ACI-41. Análisis de anti-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG1, 2a, 2b, 3 y anticuerpos de IgM en los sueros de ratones TKO 48 días después de la primera inmunización con ACI-41. Los resultados se expresan como D.O. a una dilución de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b), 1/1600 (IgG3) y 1/3200 (IgM), presentando la media + desviación estándar obtenida del grupo de 6 ratones.
Figura 9a/9b: sobrenadantes de hibridoma ACI-36 de matraces T25. Pantalla ELISA de TAUPIR y tau. 9a. Tinción TAUPIR de ratón biGT viejo usando sobrenadante no diluido. 9b. Análisis de los títulos de péptido anti-pTau T4.5, péptido anti-Tau T4.6, proteína anti-pTau y proteína anti-Tau de muestras de sobrenadante de clon no diluido. Los resultados se expresan como D.O.
Figura 10a/10b/10c: sobrenadantes de hibridoma ACI-41 de matraces T25. Pantalla ELISA de TAUPIR y tau. 10a. Tinción TAUPIR de ratón biGT viejo usando sobrenadante no diluido. 10b. Análisis de los títulos de péptido antipTau T8.5, péptido anti-Tau T8.6, proteína anti-pTau y proteína anti-Tau de muestras de sobrenadante de clon no diluido. Los resultados se expresan como D.O. 10c. Análisis de los títulos de péptido anti-pTau T9.5, péptido anti-Tau T9.6, proteína anti-pTau y proteína anti-Tau de muestras de sobrenadante de clon no diluido. Los resultados se expresan como D.O.
Figura 11: sobrenadante de hibridoma sobre placa recubierta con T8: Tau206-221 [pT212/pS214], T9: Tau196-211 [pS202/pT205] y hP-Tau. Análisis de anticuerpos anti-Tau206-221 [pT212/pS214], anti-Tau196-211 [pS202/pT205] y anti-hP-Tau de sobrenadante de clones de hibridoma. Los resultados se expresan como D.O. El mismo sobrenadante fue evaluado sin diluir en péptidos pTau y hP-Tau.
Figura 12: Manchas NFTs de anticuerpos de clon ACI-41-Ab1 (T89-F4) en cerebros humanos con AD. Secciones de cerebro de sujetos con AD (a, b y c), PSP (parálisis supranuclear progresiva) (d, e y f), y control sano (g, h e i) fueron teñidas usando AT100 (a, d y g) o ACI-41-Ab1 (T89-F4) en diluciones 1/1 (b, e y h) ó 1/30 (c, f e i).
Figura 13: Manchas NFTs de anticuerpo 5D10 en cerebros humanos con AD. Se tiñeron secciones de cerebro cortical de sujetos con AD usando anticuerpos 5D10 (a) ó AT100 (b).
Figura 14: Anticuerpos de IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] en ratones inmunizados con ACI-35. Análisis de anticuerpos de IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] en el plasma de ratones C57BL/6 que recibieron 3 inyecciones
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Arginina (R), Lisina (K);
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Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
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Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
Las frases “aislado” o “biológicamente puro” se refieren a material que está sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Por lo tanto, los péptidos descritos en la presente memoria no contienen materiales asociados normalmente a su entorno in situ. Típicamente, los péptidos inmunogénicos aislados descritos en la presente memoria son puros en al menos aproximadamente un 80%, normalmente en al menos aproximadamente un 90%, y preferiblemente en al menos aproximadamente un 95%, según se determina a través de la intensidad de banda en un gel teñido con plata.
La pureza o la homogeneidad de proteína pueden indicarse a través una serie de métodos bien conocidos en la técnica, tal como la electroforesis de gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido de visualización tras tinción. Para determinados fines será necesaria una alta resolución y se utiliza HPLC o un medio similar para la purificación.
Cuando los péptidos inmunogénicos tienen una longitud relativamente corta (esto es, inferior a aproximadamente 50 aminoácidos), a menudo se sintetizan usando técnicas químicas estándar de síntesis de péptidos.
La síntesis en fase sólida en la que el aminoácido C-terminal de la secuencia es unido a un soporte insoluble seguido de la adición secuencia del resto de aminoácidos de la secuencia es un método preferido para la síntesis química de los péptidos inmunogénicos descritos en la presente memoria. Las técnicas de síntesis en fase sólida son conocidas por los especialistas en la técnica.
Alternativamente, los péptidos inmunogénicos descritos en la presente memoria se sintetizan usando una metodología de ácidos nucleicos recombinante. Generalmente, esto implica crear una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, colocar el ácido nucleico en una casete de expresión bajo el control de un promotor particular, expresar el péptido en un hospedante, aislar el péptido o polipéptido expresado y, si se requiere, renaturalizar el péptido. En la bibliografía se dispone de técnicas suficientes para guiar al especialista en el uso de estos procedimientos.
Una vez expresados, los péptidos recombinantes pueden purificarse según procedimientos estándar, que incluyen la precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis de gel y similares. Se prefieren composiciones sustancialmente puras, con una homogeneidad de aproximadamente 50 % a 95%, y lo más preferido es una homogeneidad de 80 % a 95 % o más para uso como agentes terapéuticos.
El especialista en la técnica reconocerá que después de la síntesis química, y la expresión o purificación biológica, los péptidos inmunogénicos pueden poseer una conformación sustancialmente diferente a las conformaciones nativas de los péptidos constituyentes. En este caso, a menudo es necesario desnaturalizar y reducir el péptido antiproliferativo y después hacer que el péptido se repliegue en la conformación preferida. Los métodos para reducir y desnaturalizar proteínas y para inducir el replegamiento son bien conocidos por los especialistas en la técnica.
La antigenicidad de la proteína purificada puede confirmarse, por ejemplo, demostrando la reacción con suero inmune, o con antisueros producidos contra la propia proteína.
Los términos “un”, “una” y “el/la” tal como se usan en la presente memoria están definidos para indicar “uno o más” e incluyen el plural a menos que el contexto sea inapropiado.
Los términos “detectar” o “detectado” tal como se usan en la presente memoria significan el uso de técnicas conocidas para la detección de moléculas biológicas, tal como métodos inmunoquímicos o histológicos, y se refieren a la determinación cualitativa o cuantitativa de la presencia o la concentración de la biomolécula investigada.
Por “aislado” se entiende una molécula biológica libre de al menos parte de los componentes con los se encuentra en su estado natural.
Los términos “anticuerpo”, “anticuerpos” o “partes funcionales de los mismos”, tal como se usan en la presente memoria, son términos reconocidos en la técnica y se entiende que se refieren a moléculas o fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos, particularmente a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir moléculas que contienen un sitio de unión que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. La inmunoglobulina según la invención puede ser de cualquier tipo (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) o clase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
Dentro del alcance de la presente invención, “anticuerpos” pretende incluir anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena sencilla, biespecíficos, simianizados, humanos y humanizados, así como los fragmentos activos de los mismos. Los ejemplos de fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos
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En la “construcción antigénica supramolecular” según la presente invención, el liposoma puede tener una función dual en el sentido en que puede usarse como vehículo que comprende la construcción supramolecular tal como se ha descrito previamente en la presente memoria y, al mismo tiempo, actúa como adyuvante para aumentar o estimular la respuesta inmune en el animal o humano objeto de tratamiento con la vacuna terapéutica según la invención. También debe entenderse que las composiciones de construcción antigénica supramoleculares de la presente invención pueden comprender además adyuvantes adicionales que incluyen, aunque sin limitación, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) y otros adyuvantes tales como, por ejemplo, lípido A, alumbre, fosfato de calcio, interleuquina 1, y/o microcápsulas de polisacáridos y proteínas, pero particularmente un lípido A destoxificado, tal como monofosforil o difosforil lípido A, o alumbre, otros conservantes, diluyentes, emulsionantes, estabilizantes y otros componentes conocidos y que se usan en vacunas en la técnica anterior. Además, se puede usar cualquier sistema de adyuvante conocido en la técnica para la composición de la presente invención. Dichos adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund, mannano acetilado ligado mediante enlaces β-(1,4) polidispersado (“Acemannan”), TITERMAX® (adyuvantes de copolímero de polioxietileno-polioxipropileno de CytRx Corporation), adyuvantes lipídicos modificados de Chiron Corporation, adyuvantes derivados de saponina de Cambridge Biotech, Bordetella pertussis muerta, el lipopolisacárido (LPS) de bacterias gram-negativas, aniones poliméricos de gran tamaño como el sulfato de dextrano, y geles inorgánicos tales como alumbre, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.
Además, el término “cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de composición antigénica/inmunogénica que, cuando se administra a un humano o un animal, provoca una respuesta inmune. El especialista en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad efectiva siguiendo procedimientos rutinarios.
Un “paciente inmunotolerante” tal como se usa en la presente memoria se refiere a un paciente animal o humano que muestra una capacidad limitada de respuesta a antígenos, particularmente a antígenos no propios, pero especialmente a antígenos nuevos tales como, por ejemplo, nuevos antígenos presentes en enfermedades emergentes recientes. Esta limitación puede deberse, al menos en parte, a la edad cronológica de las células T CD4+. Además, un “paciente inmunotolerante” puede exhibir una respuesta inmune de células T CD4+ a lo largo plazo afectada frente a la exposición a antígeno, debido a defectos en la proliferación y la secreción de citoquina de las células T de memoria durante respuestas de recuerdo.
Un “paciente con células T activadas” tal como se usa en la presente memoria se refiere a un paciente animal o humano que exhibe una activación de células T y en el que una estimulación adicional de la respuesta de células T provocaría un riesgo médico.
Un “paciente inmunocomprometido” tal como se usa en la presente memoria se refiere a un paciente animal o humano que tiene un sistema inmune que ha sido afectado por la edad, una enfermedad tal como VIH o cáncer, o por un tratamiento tal como, por ejemplo, el tratamiento contra enfermedades inflamatorias que incluyen, aunque sin limitación, artritis reumatoide, soriasis, lupus eritematoso sistémico, granulomatosis de Wegener, etc.
Dentro del alcance de la presente invención, se ha demostrado que la respuesta inducida por anticuerpo a la composición antigénica según la invención es ampliamente dependiente de células T. Se usó un modelo de ratón nude a este respecto, se vacunaron ratones nude y se midieron las respuestas de anticuerpos para evaluar la respuesta de anticuerpo Aβ-específica inducida por la composición antigénica según la invención en los ratones nude inmunizados. Los ratones nude portan la mutación Foxn1nu y, en consecuencia, presentan una función de células T reducida debido a la falta de un timo apropiado.
Una “cantidad terapéuticamente efectiva” tal como se usa en la presente memoria se refiere a una dosis del ingrediente activo en una composición farmacéutica adecuada para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección que va a ser tratado, o cualesquier complicaciones asociadas al mismo.
La presente descripción utiliza una presentación de antígeno, particularmente sobre la superficie de una molécula vehículo tal como un liposoma, que da como resultado una exposición y estabilización mejoradas de una conformación de antígeno preferida, lo que finalmente conduce a una respuesta inmune altamente específica, particularmente una respuesta inmune independiente de células T, y da como resultado la generación de anticuerpos con propiedades únicas.
En particular, el péptido antigénico se presenta sobre la superficie de la molécula vehículo en una disposición altamente repetitiva, particularmente una disposición repetitiva que comprende al menos 10 unidades antigénicas repetitivas/molécula vehículo, particularmente al menos 50 unidades antigénicas repetitivas/molécula vehículo, particularmente al menos 100 unidades antigénicas repetitivas/molécula vehículo, particularmente al menos 200 unidades antigénicas repetitivas/molécula vehículo, particularmente al menos 300 unidades antigénicas repetitivas/molécula vehículo, particularmente al menos 400 unidades antigénicas repetitivas/molécula vehículo, particularmente al menos 500 unidades antigénicas repetitivas/molécula vehículo.
El antígeno de fosfo-péptido modificado según la invención y tal como se describe en la presente memoria, particularmente un antígeno de fosfo-péptido que imita a un fosfo-epítopo patológico principal de la proteína tau,
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En otro aspecto específico de la descripción, se proporciona un péptido antigénico modificado según la invención y tal como se describe en la presente memoria, ligado covalentemente a una molécula de tipo ancla que es capaz de insertarse en el vehículo/adyuvante, fijando de este modo el péptido al vehículo/adyuvante y presentándolo sobre, o en estrecha proximidad a, la superficie de una molécula de vehículo/adyuvante de tal modo que las fuerzas electrostáticas se puedan hacer efectivas, tal como se ha descrito previamente en la presente memoria.
Cuando se usan liposomas como vehículo/adyuvante, la construcción de péptido antigénico generalmente tiene una cola hidrofóbica que se inserta en la membrana del liposoma según se forma. Adicionalmente, los péptidos antigénicos se pueden modificar para contener una cola hidrofóbica de tal modo que puedan insertarse en el liposoma.
La composición antigénica descrita comprende particularmente péptidos modificados para potenciar el efecto antigénico, donde dichos péptidos pueden ser modificados mediante pegilación (usando polietilen glicol o polietilen glicol modificado), o pueden ser modificados mediante otros métodos tales como con ácido palmítico como se ha descrito previamente en la presente memoria, poli-aminoácidos (p.ej., poli-glicina, poli-histidina), polisacáridos (p.ej., ácido poligalacturónico, ácido poliláctico, poliglicolide, quitina, quitosán), polímeros sintéticos (poliamidas, poliuretanos, poliésteres) o copolímeros (p.ej., poli(ácido metacrílico) y N-(2-hidroxi)propil metacrilamida) y similares.
En un aspecto específico de la descripción, se proporcionan péptidos antigénicos según la descripción y tal como se han descrito previamente en la presente memoria, que son modificados para contener una cola hidrofóbica de tal modo que dichos péptidos pueden insertarse en el liposoma. En particular, el fosfo-péptido antigénico según la invención y tal como se describe en la presente memoria imita a un fosfo-epítopo patológico principal de la proteína tau, puede modificarse con un resto lipofílico o hidrofóbico que facilita la inserción en la bicapa lipídica del vehículo/adyuvante. Los restos lipofílicos o hidrofóbicos de la presente invención pueden ser ácidos grasos, triglicéridos y fosfolípidos, particularmente ácidos grasos, triglicéridos y fosfolípidos, en donde la cadena principal hidrocarbonada del ácido graso tiene al menos 10 átomos de carbono, particularmente restos lipofílicos que tienen ácidos grasos con una cadena principal hidrocarbonada de al menos aproximadamente 14 átomos de carbono y hasta aproximadamente 24 átomos de carbono, siendo parte de la presente invención cada número individual de átomos de carbono dentro de dicho rango. En particular, la invención se refiere a un péptido antigénico según la invención y tal como se ha descrito previamente en la presente memoria, que es modificado para contener una cola hidrofóbica, particularmente una cola hidrofóbica que comprende restos hidrofóbicos que tienen una cadena principal hidrocarbonada de al menos 14 átomos de carbono, pero especialmente 16 átomos de carbono. Los ejemplos de restos hidrofóbicos incluyen, aunque sin limitación, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico y colesterol o 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DSPE). En una realización específica de la invención, el resto hidrofóbico es ácido palmítico.
El péptido antigénico según la descripción y tal como se describe en la presente memoria, se une covalentemente al resto lipofílico o hidrofóbico. En el contexto de la presente invención, la unión covalente del péptido antigénico puede estar mediada por residuos de aminoácido, que extiende las secuencias de aminoácido correspondientes a las secuencias del péptido antigénico según la invención, en particular en su(s) extremo(s), particularmente en su(s) extremo(s) N-y C-terminales, y a los cuales se acoplan los residuos de ácido graso.
En particular, cada conjugado comprende al menos cuatro moléculas de ácido graso que contienen una cadena hidrocarbonada de entre C12 y C24, particularmente una cadena hidrocarbonada de C16, en donde las moléculas de ácido graso están unidas covalentemente en los extremos N-y C-terminales de los péptidos antigénicos. También se contemplan otras distribuciones, incluyendo dentro de la secuencia de aminoácido. Estos péptidos también se acoplan covalentemente a las moléculas de ácido graso.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden comprender, por tanto, liposomas preparados mediante reconstitución de liposomas en presencia de péptidos antigénicos purificados o parcialmente purificados o modificados según la invención, y tal como se describe en la presente memoria. Adicionalmente, se pueden reconstituir fragmentos de péptido en liposomas. La presente invención también incluye fragmentos de péptidos antigénicos modificados para aumentar su antigenicidad. Por ejemplo, se pueden unir o mezclar restos antigénicos y adyuvantes con el péptido. Los ejemplos de restos antigénicos y adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, derivados de dipéptido de muramilo lipofílicos, polímeros de bloque no iónicos, hidróxido de aluminio o adyuvante de fosfato de aluminio, y mezclas de los mismos.
Los liposomas que pueden usarse en las composiciones de la presente invención incluyen las conocidas por el especialista en la técnica. Se puede usar cualquiera de los lípidos estándar útiles en la preparación de liposomas. Se pueden usar liposomas bicapa y multicapa estándares para preparar las composiciones de la presente invención. Aunque se puede usar cualquier método de preparación de liposomas conocido por el especialista en la técnica, los liposomas más preferidos se preparan según el método de Alving et al., Infect. Immun. 60: 2438-2444, 1992. El liposoma puede contener opcionalmente un adyuvante o un inmunomodulador, o ambos. Un inmunomodulador preferido es lípido A, particularmente un lípido A destoxificado tal como, por ejemplo, monofosforil o difosforil lípido
A.
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residuo de Fmoc-Lys(Mtt)-OH (10 eq., 1,56 g, 2,5 mmol) en presencia de TBTU (10 eq., 803 mg, 2,5 mmol), HBOt (1 eq., 338 mg, 2,5 mmol) y DIEA (20 eq., 871 mL, 5,0 mmol). Los siguientes 16 aminoácidos que portan grupos protectores de cadena lateral estándar fueron incorporados manualmente aplicando ciclos de acoplamiento/desprotección/lavado similares. Excepcionalmente, los fosfoaminoácidos fueron introducidos como monobencil ésteres en el grupo fosfato (10 eq.) con TBTU (10 eq.), HBOt (5 eq.) y DIEA (15 eq.) en DMF. Se usó un tiempo de acoplamiento de 1 h durante la síntesis. El ensamblaje de la secuencia de péptidos finalizó con la adición de los dos últimos Fmoc-Lys(Mtt)-OH.
A continuación, los grupos Mtt de los residuos de lisina terminales fueron separados selectivamente mediante el tratamiento de la resina de peptidilo (1 eq., 385 mg, 0,019 mmol) con 10 mL de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante varios ciclos de 10 minutos. La resina se lavó con DCM (x3) y DMF (x3). A continuación se acopló ácido palmítico (20 eq., 968 mg, 3,8 mmol) a dichos grupos amino desprotegidos usando TBTU (20 eq., 1,21 g, 3,8 mmol) y DIEA (40 eq., 1,31 mL, 7,6 mmol) en DCM/DMF (1:1) (4 mL). La resina se lavó con DCM (x5) y DMF (x5). A continuación se eliminó el grupo Fmoc N-terminal con piperidina al 20% en DMF (3 x 10 min) y la resina se lavó con DMF (x3) y DCM (x5). Finalmente se llevó a cabo simultáneamente la separación de la resina y las desprotecciones de las cadenas laterales usando una mezcla de TFA/TIPS/H2O (95:2,5:2,5) (4 mL) durante 3,5 h. Una trituración en dietil éter frío dio lugar al producto sin purificar T8 en forma de sólido blanco (50,2 mg, 10% de rendimiento) con una pureza del 55% (según el análisis de HPLC). La espectrometría de masas MALDI-TOF confirmó la identidad del producto principal (m/z esperado: 3331,17 [MH+], observado: 3335,19).
2.5. Síntesis de péptido antigénico T9
El aminoácido protegido ortogonalmente Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 eq.) fue cargado manualmente en una resina de amida (resina de amida Rink MBHA, 1 eq., 0,4 mmol) en presencia de PyBOP/HOBt/DIEA en DMF. A continuación la resina se lavó con DMF (3 x 1 min). Tras eliminar el grupo Fmoc N-terminal con piperidina al 25% en DMF (1 x 1 min y 2 x 15 min), se acopló el segundo residuo de Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 eq.), usando las mismas condiciones de carga. Los siguientes 16 aminoácidos que portan grupos protectores de cadena lateral estándar fueron incorporados aplicando el protocolo de acoplamiento descrito previamente. Los fosfoaminoácidos fueron introducidos como monobencil ésteres en el grupo fosfato. El tiempo de acoplamiento fue determinado mediante el ensayo TNBT o el ensayo de cloranilo después de una Prolina. Si era necesario, se llevó a cabo un segundo acoplamiento con 2 eq. de Fmoc-aminoácido en presencia de DIC/HOBt o HATU/DIEA. Cada etapa de acoplamiento vino seguida de una etapa de lavado con DMF (3 x 1 min), la etapa de eliminación de Fmoc con piperidina al 25% en DMF (1 x 1 min y 2 x 15 min) y una segunda etapa de lavado con DMF (7 x 1 min). Tras el acoplamiento del Thr(PO(OBzl)OH), se usó DBU al 0,5% en DMF para la etapa de desprotección de Fmoc. El ensamblaje de la secuencia de péptidos finalizó con la adición de los dos últimos Fmoc-Lys(Mtt)-OH.
A continuación, los grupos Mtt de los residuos de lisina terminales fueron separados selectivamente mediante el tratamiento de la resina (1 eq., 650 mg, 0,156 mmol) con 10 mL de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante varios ciclos de 10 minutos. Tras lavar con DCM (x3) y DMF (x3), se acopló ácido palmítico (20 eq., 1,01 g, 3,15 mmol) a dichos grupos amino desprotegidos usando TBTU (20 eq., 814 mg, 3,15 mmol) y DIEA (40 eq., 1,1 mL, 6,30 mmol) en DCM/DMF (1:1) (6 mL). La resina se lavó intensamente con DCM (x5) y DMF (x5). A continuación se eliminó el grupo Fmoc N-terminal con piperidina al 20% en DMF (3 x 10 min) y la resina se lavó nuevamente con DMF (x3) y DCM (x5). Finalmente se llevó a cabo simultáneamente la separación de la resina y las desprotecciones de las cadenas laterales usando una mezcla de TFA/TIPS/H2O (95:2,5:2,5) (4 mL) durante 3 h. Una trituración en dietil éter frío dio lugar al producto sin purificar T9 en forma de sólido blanco (291 mg, 59% de rendimiento) con una pureza del 69% (según el análisis de HPLC). La espectrometría de masas MALDI-TOF confirmó la identidad del producto principal (m/z esperado: 3172,98 [MH+], observado: 3172,90).
2.6. Síntesis del péptido antigénico T10
El péptido tetrapalmitoilado T10 fue preparado siguiendo un protocolo similar al del T9 (escala de síntesis de péptido: 0,25 mmol). Adicionalmente, se usó una pseudo prolina [psi(Gly-Ser)] como bloque de construcción antes de la secuencia problemática Asn-Val-Ser-Ser. El producto T10 sin purificar fue obtenido en forma de sólido blanco (809 mg, rendimiento cuantitativo) con una pureza del 56% (según análisis de HPLC). La espectrometría de masas MALDI-TOF confirmó la identidad del producto principal (m/z esperado: 2761,9 [MH+], observado: 2759,2).
2.7. Síntesis del péptido antigénico T11
El péptido tetrapalmitoilado T11 fue preparado siguiendo un protocolo similar al del T9 (escala de síntesis de péptido: 0,25 mmol). El producto T11 sin purificar fue obtenido en forma de sólido blanco (495 mg, rendimiento del 76%) con una pureza del 80% (según análisis de HPLC). La espectrometría de masas MALDI-TOF confirmó la identidad del producto principal (m/z esperado: 2613,8 [MH+], observado: 2612,2).
EJEMPLO 3: Preparación de vacuna (Proceso A)
El fosfopéptido tetrapalmitoilado derivado de Tau fue pesado (ver la cantidad en la tabla 2 a continuación), y se colocó en un matraz de vidrio de fondo redondo de 250 mL. A continuación se pesó dimiristoil fosfatidilcolina
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(DMPC), dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG), colesterol y el adyuvante monofosforil Lípido A (MPLA) (todos de Avanti Polar Lipids Inc. AL, EE.UU.) y se añadieron en una proporción molar de 9:1:7:0,2 respectivamente. A continuación se añadió cloroformo dando lugar a una disolución transparente con partículas finas. Tras una agitación suave durante 15 minutos, se eliminó el disolvente orgánico por evaporación a presión reducida a 40ºC y a continuación en condiciones de alto vacío durante 3 h. La película fina resultante fue rehidratada mediante la adición de PBS estéril en una cabina laminar y se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 18 h. La relación molar final de péptido / fosfolípido fue de 1:100. La suspensión liposómica fue dividida entonces en alícuotas en tubos falcon de 15 mL estériles (5 mL de producto/tubo) antes de su almacenamiento a 2-8ºC. La concentración final de péptidos fue de 40 µM.
EJEMPLO 4: Caracterización de vacunas liposómicas de Tau
4.1. Métodos
4.1.1. Cuantificación de péptido, DMPC y colesterol mediante HPLC
Para el análisis de las vacunas tau liposómicas (ACI-33, ACI-35, ACI-36, ACI-39, ACI-40 y ACI-41, todas preparadas según el proceso A descrito en el EJEMPLO 3), se prepararon las muestras añadiendo agua (20 µL) en un vial de HPLC de vidrio, seguido de isopropanol (140 µL) y TFA (20 µL). El análisis se llevó a cabo usando una columna C3 de fase inversa Zorbax 300SB-B3 (250 x 4,6 mm, 5 µm, 300Å, Agilent) termostatizada a 75 ºC, con detección a 207 y 214 nm. Los disolventes de elución fueron los siguientes: disolvente B, 95% de isopropanol, 5% de agua, 0,1% de TFA; disolvente A, 10% de acetonitrilo, 90% de agua, 0,1% de TFA. Se aplicó un gradiente desde 40% de B hasta 60% de B durante 20 minutos con un caudal de 1 mL/min. Se usaron patrones separados de péptidos tau (T1, T3, T4, T8 y T9) y DMPC/colesterol a diferentes concentraciones con fines de calibración. Para los péptidos tau, se preparó una disolución madre de 1 mg/mL en TFA/iPrOH/H2O (1:7:2) y se diluyó en serie (1:1) desde 400 µg/mL hasta 12,5 µg/mL. Para los lípidos, se preparó una disolución madre de 8,0 mg/mL de DMPC y de 3,5 mg/mL de colesterol en un 70% de isopropanol y un 30% de agua, y se diluyó (1:5), (1:10) y (1:50) con la misma mezcla.
4.1.2. Cuantificación de MPLA mediante HPLC
Se cuantificó el MPLA de la vacuna liposómica tau mediante HPLC con detección UV tras derivatización del adyuvante con el cromóforo activo en UV 3,5-dinitrobenciloxiamina (DNBA). Resumidamente, se añadieron 20 µL de construcciones tau liposómicas a una disolución de DNBA en piridina (10 mg/mL, volumen total de 100 µL), se calentó a 60ºC durante 3h y a continuación se eliminó la piridina mediante evaporación. La partícula resultante se resolubilizó en cloroformo/metanol (2:1, v/v) para el análisis de HPLC. Se usó MPLA (Avanti Polar Lipids) con fines de calibración a cuatro concentraciones diferentes y se derivatizó y analizó como las construcciones tau liposómicas.El análisis de HPLC se llevó a cabo usando una columna C18 de fase inversa Agilent XDB (250 x 4,6 mm, 120 Å, 5 µm), termostatizada a 50 ºC, con detección a 254 nm. Los disolventes de elución fueron los siguientes: disolvente A, 95% de acetonitrilo, 5% de agua, ácido fosfórico 4,8 mM; disolvente B, 95% de isopropanol, 5% de agua, ácido fosfórico 4,8 mM. Se aplicó un gradiente desde 10% de B hasta 70% de B durante 30 minutos con un caudal de 1 mL/min.
4.1.3. Potencial superficial de liposoma
Se diluyeron muestras de construcción liposómica tau en una relación de 1 a 100 con PBS. Se llevó a cabo un análisis con un Zetasizer Nano (Malvern, EE.UU.) a 25 ºC. La selección de la duración y del voltaje de medida se llevó a cabo en modo automático, con un voltaje aplicado típico de 50 mV. Los datos fueron transformados usando la ecuación de Smoluchowski automáticamente con el software DTS 5.0 (Malvern) para calcular el potencial zeta. Como las construcciones liposómicas tau están constituidas por una mezcla de DMPC/DMPG/Colesterol/MPLA en una relación molar de 9:1:7:0,2; la carga neta esperada será negativa.
4.1.4. Análisis conformacional mediante dicroísmo circular
Las construcciones liposómicas tau fuero diluidas (1:1) con PBS para dar lugar a una concentración final de péptido de 18 µM. Se usaron liposomas con una composición idéntica pero que carecían del péptido tau como disolución blanco para la resta de la línea base. Se adquirieron espectros de DC (dicroísmo circular) en un espectropolarímetro Jasco-815 con una cubeta de cuarzo de longitud de paso 0,1 cm (Hellma, Alemania) a 23 ºC. Se tomaron medidas en el rango de longitud de onda de 195-250 nm con un ancho de banda de 1,0 nm y una resolución de 0,5 nm. Se empleó una velocidad de escaneado de 50 nm/min con un tiempo de respuesta de 1 s. Los espectros del blanco (de 8 escaneados) fueron promediados y sustraídos de la media de 8 escaneados para cada espectro de muestra. El espectro obtenido ([θ]obs, grados) fue suavizado tras ser convertido a elipticidad molar de residuo media ([θ], grados cm2 dmol-1) con la ecuación [θ] = [θ]obs x (MRW/10lc), donde MRW es el peso molecular de residuo medio (MW/número de residuos), l es la longitud de paso óptico (cm) y c es la concentración (g/cm3).
4.1.5. Ensayo de fluorescencia ThT
Las medidas de fluorescencia ThT fueron adquiridas en un lector de microplacas Infinite M200 (Tecan Group Ltd, Suiza). Como procedimiento general, se diluyeron las construcciones liposómicas Tau a diferentes concentraciones
con PBS (Tabla 2). Los liposomas con la misma composición pero que carecían del péptido tau fueron diluidos de forma similar para ser usados como control negativo (lote ACI-35-081015-B). A 98 µL de cada vacuna o de disolución de blanco, se añadió ThT (2 µL, 1,2 mM en agua) para obtener una concentración final de 24 µM. Tras someter brevemente a vórtice, se añadió una alícuota de cada muestra (70 µL) a una placa de microtitulación Perkin Elmer de 384 pocillos negra opaca, y se midió la emisión de fluorescencia a 485 nm después de 30 minutos de excitación a 440 nm. El ancho de banda de excitación fue de 9 nm y el ancho de banda de emisión fue de 20 nm. Se usó γ-ciclodextrina como control interno. Se realizaron diluciones 1 a 2 en PBS a partir de una disolución madre de 640 mM en PBS para obtener disoluciones de control de γ-ciclodextrina de 320, 160 y 80 mM.
Tabla 2: Muestras preparadas para el ensayo ThT
Péptido
Vacuna Lote Dilución Concentración de péptido(µg/mL)
T1
ACI-33 ACI-33-081031-A 1 a 2 23
ACI-33-081031-A
1 a 3 15
ACI-33-081031-A
1 a 4 7,7
ACI-33-081031-A
1 a 12 3,8
T3
ACI-35 ACI-35-081015-A 1 a 2 39
ACI-35-081015-A
1 a 3 26
ACI-35-081015-A
1 a 4 20
ACI-35-081015-A
1 a 12 5
T4
ACI-36 ACI-36-081110-A 1 a 2 16,5
ACI-36-081110-A
1 a 3 11
ACI-36-081110-A
1 a 4 8,3
ACI-36-081110-A
1 a 12 2,1
T8
ACI-39 ACI-39-090202-A 1 a 2 24
ACI-39-090202-A
1 a 3 16
ACI-39-090202-A
1 a 4 12
ACI-39-090202-A
1 a 12 4
T9
ACI-40 ACI-40-090202-A 1 a 2 30
ACI-40-090202-A
1 a 3 20
ACI-40-090202-A
1 a 4 15
ACI-40-090202-A
1 a 12 5
T8+T9
ACI-41 ACI-41-081204-A 1 a 2 11,5
ACI-41-081204-A
1 a 3 7,7
ACI-41-081204-A
1 a 4 5,8
ACI-41-081204-A
1 a 12 1,9
Control negativo
Control negativo
ACI-35-081015-B 1 a 2 n/a
ACI-35-081015-B
1 a 3 n/a
ACI-35-081015-B
1 a 4 n/a
ACI-35-081015-B
1 a 12 n/a
10
4.2. Resultados
4.2.1. Cuantificación de péptido, DMPC y colesterol mediante HPLC
El cromatograma de HPLC a la longitud de onda de detección de 207 nm obtenido de la inyección de las muestras de vacuna mostró la presencia de péptido tau, DMPC y colesterol (ver tabla 4). A partir de las curvas de calibrado 15 determinadas con los patrones, se calculó la cantidad de cada componente de la vacuna. El contenido de péptido tau, DMPC y colesterol detectado en las suspensiones liposómicas tau estaba próximo al valor objetivo.
4.2.2. Cuantificación de MPLA mediante HPLC
El cromatograma de HPLC a la longitud de onda de detección de 254 nm obtenido de la inyección de las muestras de vacuna tau derivatizada con DNBA mostró la presencia de MPLA (ver tabla 4). A partir de la curva de calibrado obtenida con el patrón, se calculó la cantidad de MPLA en las vacunas liposómicas. El contenido de MPLA detectado en las suspensiones liposómicas tau estaba próximo al valor objetivo.
5 4.2.3. Potencial superficial de liposoma El potencial zeta medido para las vacunas liposómicas tau se muestra en la tabla 4.
4.2.4. Análisis conformacional de péptido tau en las vacunas liposómicas mediante DC
Mediante dicroísmo circular se determinó la conformación de las vacunas liposómicas tau preparadas según la descripción. Los resultados se muestran en la tabla 3.
10 4.2.5. Ensayo ThT de péptido tau en las vacunas liposómicas
Los estados agregados de péptidos tau de las vacunas liposómicas (preparadas mediante el proceso A descrito anteriormente) determinados mediante un ensayo fluorimétrico ThT se muestran en la tabla 4.
Tabla 3. Resumen de características de las vacunas
Vacuna
Componente Tiempo de retención Valor objetivo (µg/mL) Resultado (µg/mL) Potencial superficial de liposoma (mV) Dicroísmo circular de conformación Ensayo ThT (agregación de péptido) Señal de fluorescencia
ACI-33
Péptido T1 19,3 min 130 46 -18,7 Conformación mixta de lámina beta y giro beta Agregación
Colesterol
11,2 min 1027 923
DMPC
10,0 min 2314 2463
DMPG
nd 261 nd
MPLA
39,8 min 135 62
AC-35
Péptido T3 19,5 min 130 78 -19,2 Conformación de bobina aleatoria Sin agregación
Colesterol
11,6 min 1046 1438
DMPC
10,3 min 2357 nd
DMPG
nd 266 nd
MPLA
29,7 min 135 124
ACI-36
Péptido T4 20,3 min 130 33 -17,8 Conformación de bobina aleatoria con alguna contribución de lámina beta Agregación
Colesterol
11,2 min 1018 1387
DMPC
10,0 min 2296 nd
DMPG
nd 259 nd
MPLA
29,7 min 135 83
ACI-39
Péptido T8 19,3 min 130 48 -16,8 Conformación de lámina beta Sin agregación
Colesterol
11,8 min 1056 1906
DMPC
10,5 min 2381 4316
DMPG
nd 269 nd
MPLA
30,9 min 135 144
ACI-40
Péptido T9 21,0 min 130 60 -14,7 Conformación de bobina aleatoria Sin agregación
Colesterol
11,8 min 1109 1655
DMPC
10,5 min 2500 2894
DMPG
nd 269 nd
MPLA
30,9 min 135 122
ACI-41
Péptido T8+T9 18,3 min + 19,9 min 65 + 65 23 + 34 -17,3 Mezcla de conformación de bobina aleatoria y lámina beta Sin agregación
Colesterol
11,2 min 1109 34
DMPC
9,9 min 2500 1574
DMPG
nd 282 3829
MPLA
30,9 min 135 80
EJEMPLO 5: Inmunogenicidad de antígenos palmitoilados en ratones salvajes y KO Tau-/
5.1. Métodos
5.1.1. Ratones bloqueados para tau (TKO)
El bloqueo del gen tau se logró usando un vector dirigido que insertó el ADNc de EGFP (proteína Fluorescente
5 Verde Potenciada) en exón 1 del gen en-marco con el codón de inicio endógeno. Esto produjo una proteína de fusión con los primeros 31 aa de tau seguidos de EGFP (descrito por Tucker KL. et al., Nature Neuroscience, 2001). La eliminación del gen fue confirmada mediante ensayo de transferencia western blot de lisatos de cerebro enteros. Los niveles de proteína tau con varios anticuerpos anti-tau mostraron que todas las isoformas de tau estaban ausentes en el mutante homocigoto, con una reducción del 50% en el mutante heterocigoto. La mutación se
10 mantuvo en un fondo de C57BL/6.
5.1.2. Preparación de la vacuna
Las vacunas se prepararon mediante el proceso A descrito en el EJEMPLO 3.
5.1.3. Inmunizaciones
Los ratones C57BL/6 o KO Tau-/-(TKO) recibieron inyecciones i.p. de la vacuna (ACI-33, ACI-35, ACI-36 y ACI-41) 15 en tres ocasiones (Esquema 1) (Tabla 4).
Para la inmunización de ACI-33, ACI-35, ACI-36 y ACI-41, se realizaron tres inmunizaciones con un intervalo de 2 semanas entre cada administración (día 0, día 13 y día 28) según el Esquema 1. Se tomaron muestras de sangre y se prepararon muestras de suero 1 día antes (día -1) de las primeras inmunizaciones, a continuación después de la segunda (día 27) y tercera (día 47) inmunizaciones. El suero fue preparado dejando que las muestras de sangre
20 coagularan durante una noche y después tomando el sobrenadante tras centrifugación. Los títulos de anticuerpos de IgM e IgG específicos de fosfopéptido Tau y las estructuras de isotipo de IgG fueron determinadas mediante ELISA. Como control, también se determinó mediante ELISA los títulos de anticuerpos de IgG específicos de péptidos nopTau.
25 Tabla 4: Inmunización de ratones
Grupo
Ratones Edad (meses) Nº de animales y género Tratamiento / Volumena Lote de vacuna Ruta de administraciónb Nivel de dosis Cantidad de péptido µg/dosisc Cantidad de MPLA µg/dosisc
ACI-33 (péptido T1)
Salvajes 6 3 ♀ 3 ♂ ACI-33 0,2 mL ACI-33081031-A i.p. 9 12
KO
4-5 3 ♀ 3 ♂ ACI-33 0,2 mL ACI-33081031-A i.p. 9 12
ACI-35 (péptido T3)
Salvajes 6 3 ♀ 3 ♂ ACI-35 0,2 mL ACI-35081015-A i.p. 16 23
KO
6-8 3 ♀ 3 ♂ ACI-35 0,2 mL ACI-35081015-A i.p. 16 23
ACI-36 (péptido T4)
Salvajes 6 3 ♀ 3 ♂ ACI-36 0,2 mL ACI-35081110-A i.p. 7 13
KO
4 3 ♀ 3 ♂ ACI-36 0,2 mL ACI-35081110-A i.p. 7 13
ACI-41 (péptido T8+T9)
Salvajes 7 3 ♀ 3 ♂ ACI-41 0,2 mL ACI-35081204-A i.p. 5 7
KO
4 3 ♀ 3 ♂ ACI-41 0,2 mL ACI-35081204-A i.p. 5 7
a volumen teórico. b i.p.: intra-peritoneal. c cantidad medida determinada tras análisis.
30 Esquema 1: Calendario de inmunizaciones y toma de muestras de sangre para ACI-33, ACI-35, ACI-36 y ACI
41.
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5.1.4. Cuantificación de anticuerpos específicos de péptido Tau.
Los anticuerpos de IgG específicos para péptidos pTau fueron determinados mediante ELISA en las 3 muestras de suero sanguíneo. Las IgG específicas de péptidos Tau fueron determinadas en los sueros de los días -1 y 47. Los anticuerpos de isotipo de IgG e IgM específicos de péptidos pTau fueron determinados mediante ELISA en la muestra de suero sanguíneo del día 47. Se recubrieron placas con 10 µg/mL del correspondiente péptido Tau durante una noche a 4ºC. Tras lavar cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0,05% y bloquear con BSA al 1% en PBS-Tween 20 al 0,05%, se añadieron diluciones en serie de suero a las placas y se incubó a 37ºC durante 2 horas. Tras lavar, las placas fueron incubadas con un anticuerpo total de IgG anti-ratón conjugado a fosfatasa alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EE.UU.) o con anticuerpos específicos de isotipo (IgM anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (HRP), IgG1 anti-ratón conjugada con AP, IgG2a anti-ratón conjugada con biotina e IgG3, adquiridas en Pharmingen BD, San Diego, CA, EE.UU., e IgG2b anti-ratón conjugada con HRP de Zymed Laboratories, San Francisco, CA) durante 2 horas a 37ºC. Tras lavar, las placas fueron incubadas con pNPP (paranitro-fenil-fosfato), el sustrato de fosfatasa para AP, o con ABTS (ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenztiazolina-6sulfónico)), el sustrato de HRP, y fueron leídas a 405 nm usando un lector de placas ELISA. Se realizó una etapa suplementaria para los anticuerpos conjugados a biotina, en la que las placas fueron incubadas durante 45 minutos en estreptavidina-HRP (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) antes de la detección con ABTS. Los resultados se expresan como D.O. (Densidad Óptica) en la primera dilución y en una dilución no saturada para IgG y en una
D.O. no saturada para los isotipos de IgG e IgM.
5.1.5. Unión de anticuerpos anti-Tau a marañas Tau en láminas de cerebro de animales transgénicos (TAUPIR)
La unión de los anticuerpos presentes en el suero de animales vacunados a marañas en láminas de cerebro se llevó a cabo mediante inmunohistoquímica TAUPIR.
Las láminas de cerebro usadas procedían de un animal transgénico Tau P301L (TPLH: isoforma más larga (441 aa) de Tau humana con la mutación P301L) en etapa terminal, y de ratones biGT transgénicos dobles viejos (>15 meses) (ratones transgénicos GSK-3 cruzados con ratones TPLH).
Las secciones de cerebro se lavaron durante 5 minutos en PBS y a continuación se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en H2O2 al 1,5% en PBS:MeOH (1:1) para bloquear la peroxidasa endógena. Tras lavar las secciones 3 veces en PBST (PBS/Triton X-100 al 0,1%) se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en una disolución bloqueante de PBST + FCS (suero fetal de ternero) al 10%. La incubación con el suero que contiene los anticuerpos anti-Tau se realizó durante la noche a 4ºC. El suero se diluyó en PBST/FCS al 10% usando varias diluciones diferentes desde 1/2.500 hasta 1/10.000. Las secciones se lavaron 3 veces en PBST antes de la incubación con un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con HRP (adquirido en Dako, Glostrup, Dinamarca) en PBST/FCS al 10% durante 1 hora a temperatura ambiente. Antes de la detección, las secciones fueron lavadas 3 veces con PBST y se incubaron en Tris/HCl 50 mM, pH 7,6, durante 5 minutos. La detección se llevó a cabo incubando las secciones durante 3 minutos en diaminobenzidina (DAB: 1 comprimido en 10 mL de Tris-HCl 50 mM + 3 µL de H2O2 al 30 %) (MP Biomedicals, Solon, OH, EE.UU.). La reacción se detuvo lavando las secciones 3 veces en PBST. Las secciones fueron transferidas entonces a placas de vidrio silanizado y se secaron al aire en placas templadas a 50ºC durante 2 horas. Se realizó una contra-tinción con una incubación con hematoxilina de Mayers (Fluka Chemie, Buchs, Suiza) durante 1 minuto, seguida de una etapa de lavado durante 4 minutos en agua de grifo corriente. Las secciones fueron deshidratadas mediante pasaje en baño etanol al 50 %, al 70 %, al 90 % y dos veces en etanol al 100 %, y después en xilol dos veces durante 1 minuto. Finalmente, las secciones fueron montadas con DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, Inglaterra) en tiras cubreobjetos de vidrio.
5.1.6. Análisis de transferencia Western Blot (WB)
Mediante WB se llevó a cabo la unión de los anticuerpos presentes en el suero de animales vacunados a pTau en extracto de cerebro procedente de animales transgénicos.
La homogenización de cerebro de ratón salvaje FVB, TPLH, biGT y con Tau bloqueado (TKO) se llevó a cabo en la siguiente disolución tampón: Tris/HCl 25 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 30 mM, Na3VO4 0,2 mM, ácido okadaico 1 nM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), Na4P2O7 5 mM, 1 comprimido de cóctel de inhibidor de proteasa completo (CPIC) para un total de 12 mL. Para obtener un homogenato cerebral completo se homogenizó el cerebro sobre hielo en una semiesfera de 1 vol. / peso (mL/g) con un homogeneizador tipo Potter motorizado (tubo de vidrio / mortero de teflón) usado a 700 rpm.
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5.2.2. Análisis de la respuesta de isotipo de ratones inmunizados salvajes C57BL/6 y Tau-/-KO (TKO)
ACI-33
La vacuna ACI-33 indujo títulos de anticuerpos en ratones salvajes para todos los isotipos, IgG2a, 2b y 3, así como para IgM, tras 3 inmunizaciones i.p. (Figura 5a, ratones salvajes). Casi no hubo IgG1 y hay una diferencia significativa entre IgG1 e IgG2b y 3 (Figura 5a; ratones salvajes; Anova de 1-sentido P<0,05 IgG1 frente a IgG3, P<0,001 IgG1 frente a IgG2b). La vacuna ACI-33 indujo títulos de anticuerpos en ratones TKO para todos los isotipos, IgG2a, 2b y 3, así como para IgM, tras 3 inmunizaciones i.p. (Figura 5b, ratones TKO). Casi no hubo IgG1, con una diferencia significativa entre dicha subclase y los otros isotipos de IgG (Figura 5b, Anova de 1-sentido P<0,05 IgG1 frente a IgG2a/IgG3, P<0,001 IgG1 frente a IgG2b).
ACI-35
La vacuna ACI-35 indujo en ratones salvajes títulos de anticuerpos elevados para todos los isotipos de IgG, así como para IgM, después de 3 inmunizaciones i.p. (Figura 6a, ratones salvajes). La única diferencia significativa es una mayor respuesta de IgM en comparación con IgG3 (Figura 6a, ratones salvajes, Anova de 1-sentido P<0,05 IgM frente a IgG3).
La vacuna IC-35 indujo en ratones TKO títulos de anticuerpos elevados para todos los isotipos de IgG, así como para IgM, después de 3 inmunizaciones (Figura 6b, ratones TKO).
ACI-36
La vacuna IC-36 indujo en ratones salvajes títulos de anticuerpos para todos los isotipos de IgG, así como para IgM, después de 3 inmunizaciones (Figura 7a, ratones salvajes).
La vacuna IC-36 indujo en ratones TKO títulos de anticuerpos para todos los isotipos de IgG, así como para IgM, después de 3 inmunizaciones (Figura 7b, ratones TKO). Se obtuvo un nivel mayor de IgG2b, estadísticamente significativo, en comparación con IgG1 (Figura 7b; ratones TKO, Anova de 1-sentido P<0,05 IgG2b frente a IgG1).
ACI-41
La vacuna IC-41 indujo en ratones salvajes títulos elevados de anticuerpo anti-Tau196-211 [pS202/pT205] para todos los isotipos de IgG, así como para IgM, después de 3 inmunizaciones (Figura 8a, ratones salvajes).
La vacuna IC-41 indujo en ratones TKO títulos elevados de anticuerpo anti-Tau196-211 [pS202/pT205] para todos los isotipos de IgG, así como para IgM, después de 3 inmunizaciones (Figura 8b, ratones TKO).
5.3. Conclusión
La vacuna Tau indujo títulos de IgG en todos los ratones. Se obtuvo una baja respuesta de anticuerpo de IgG1 en comparación con IgG2b e IgG3 en ratones inmunizados con ACI-33. En todos los ratones vacunados con tau, los títulos de anticuerpos inducidos para todos los isotipos IgG2a, 2b y 3, así como para IgM, fueron comparables.
Los anticuerpos generados a partir de ratones inmunizados con vacuna tau se unen específicamente a pTau con una unión marginal a péptidos Tau. Los anticuerpos generados también fueron capaces de reconocer marañas en cerebro de ratón transgénico Tau y pTau procedente de extracto de cerebro de ratón transgénico mediante WB.
EJEMPLO 6: Generación y escrutinio de hibridomas y anticuerpos
El objetivo de este estudio fue generar y escrutar mAbs anti-Tau (anticuerpos monoclonales). Los hibridomas fueron generados mediante fusión de bazo de ratón inmunizado con vacuna tau con una línea celular de mieloma. Los hibridomas fueron evaluados para determinar su reactividad frente a proteína Tau de longitud completa tanto fosforilada como sin fosforilar, así como frente a los péptidos antigénicos Tau fosforilados y sin fosforilar usados en la preparación de las vacunas. También se realizó un escrutinio de hibridomas usando inmunohistoquímica en láminas de cerebro de ratón transgénico Tau.
6.1. Métodos
6.1.1 Fusión
Se usó un ratón C57BL/6 salvaje vacunado con ACI-33 (Tau5-20 [pY18]) y ACI-35 para la producción de hibridomas. El ratón fue inyectado con la vacuna ACI-33 en el día 0 y nuevamente en el día 4, y la fusión se llevó a cabo en el día 7. Se fusionaron 173x106 (ACI-33) esplenocitos procedentes del ratón inmunizado con células de mieloma SP2O-Ag14 en una proporción de 5 esplenocitos / 1 célula de mieloma.
Se usó un ratón C57BL/6 salvaje vacunado con ACI-36 (Tau401-418 [pS404/S409]) para la producción de hibridomas. El ratón fue inyectado con la vacuna ACI-36 en el día 0 y nuevamente en el día 4, y la fusión se llevó a
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cabo en el día 7. Se fusionaron 84x106 esplenocitos procedentes del ratón inmunizado con células de mieloma SP2O-Ag14 en una proporción de 5 esplenocitos / 1 célula de mieloma.
Se usó un ratón C57BL/6 salvaje vacunado con ACI-41 (mezcla de Tau206-211 [pT212/pS214] y Tau196-211 [pS202/pT205]) para la producción de hibridomas. El ratón fue inyectado con la vacuna ACI-41 en el día 0 y nuevamente en el día 4, y la fusión se llevó a cabo en el día 8. Se fusionaron 162x106 esplenocitos procedentes del ratón inmunizado con células de mieloma SP2-O-Ag14 en una proporción de 5 esplenocitos / 1 célula de mieloma.
Las tres fusiones dieron como resultado 8 x placas de 96 pocillos y los clones fueron nombrados según la placa (1-8) y la fila (A-G) y finalmente la columna (1-12).
6.1.2. Método de escrutinio para seleccionar clones
Las 8 x placas de 96 pocillos fueron escrutadas en primer lugar dos veces para la expresión de IgG. Los clones de expresión positiva fueron transferidos a continuación a placas de 24 pocillos y los sobrenadantes celulares (=clones) de las células en crecimiento fueron evaluados en un escrutinio ELISA de Tau y en un escrutinio de inmunohistoquímica TAUPIR. Los sobrenadantes positivos en ELISA y/o TAUPIR fueron transferidos a matraces T25 y los clones volvieron a ser escrutados en función de la expresión de IgG, el escrutinio ELISA de Tau y el TAUPIR.
6.1.3. Escrutinio de IgG
Se recubrieron placas ELISA con 50 µL/pocillo de anticuerpo de IgG anti-ratón (CER Groupe, Marloie, Bélgica) en tampón de recubrimiento durante 16 h a 4ºC. Tras lavar las placas con PBS/Tween se aplicaron 100 µL/pocillo de una disolución bloqueante durante 1h a temperatura ambiente. Se incubaron 50 µL de sobrenadante de hibridoma sin diluir durante 1h a temperatura ambiente. Tras una etapa de lavado, se aplicó una mezcla de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 anti-ratón conjugadas a peroxidasa de rábano (HRP) (Ab Serotec, Raleigh, NC, EE.UU.) sobre las placas durante 1h a temperatura ambiente. Tras un lavado final, se llevó a cabo la detección con TMB (3-3’,5,5’tetrametilbenzidina), el sustrato de fosfatasa para HRP, y las placas fueron leídas a 405 nm usando un lector de placas ELISA. Los resultados se expresan como D.O. (Densidad Óptica).
6.1.4. Escrutinio ELISA de hibridomas Tau
El escrutinio ELISA de hibridomas se llevó a cabo con los péptidos pTau (ACI-33, T1.5: Tau5-20 [pY18]; ACI-36, T4.5: Tau401-418 [pS404/S409]; ACI-41, T8.5: Tau206-211 [pT212/pS214] y T9.5: Tau196-211 [pS202/pT205]; PolyPeptide Laboratories, Hillerød, Dinamarca), el correspondiente péptido Tau (ACI-33, T1.6: Tau5-20; ACI-36, T4.6: Tau401-4; ACI-41, T8.6: Tau206-221 y T9.6: Tau196-211, PolyPeptide Laboratories, Hillerød, Dinamarca), proteína Tau de longitud completa (441 aa) fosforilada (proteína pTau, Vandebroek et al., 2005) y proteína Tau de longitud completa (441 aa) (proteína Tau, SignalChem, Richmond, Canadá). Finalmente, como control negativo se usó Albúmina de Suero Bovino (BSA).
Se recubrieron placas con 10 µg/mL del correspondiente péptido Tau y 1 µg/mL de la correspondiente proteína Tau durante una noche a 4ºC. Tras lavar cada pocillo con PBS-Tween 20 al 0,05% y bloquear con BSA al 1% en PBS-Tween 20 al 0,05%, se añadió sobrenadante de hibridoma sin diluir o medio del control negativo a las placas y se incubó a 37ºC durante 2 horas. Después de un lavado, las placas fueron incubadas con un anticuerpo total de IgG anti-ratón conjugado a fosfatasa alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EE.UU.) durante 2 horas a 37ºC. Tras un lavado, las placas fueron incubadas con pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), el sustrato de fosfatasa para AP, y fueron leídas a 405 nm usando un lector de placas ELISA. Los resultados se expresan como D.O. (Densidad Óptica).
6.1.5. Escrutinio IHC de hibridomas: Unión de anticuerpos anti-Tau a marañas en secciones de cerebro de ratones transgénicos (TAUPIR)
Los experimentos TAUPIR se llevaron a cabo según el protocolo del EJEMPLO 5.1.5.
6.1.6. Escrutinio de IgG de matraces T25
Se recubrieron placas ELISA con 5 µg/mL de anticuerpo específico de fragmento F(ab’)2 de IgG anti-ratón (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EE.UU.) en tampón de recubrimiento de carbonato-bicarbonato, pH 9,6 (Sigma, Buchs, Suiza) durante una noche a 4ºC. Tras lavar las placas, se incubó durante 1 h a temperatura ambiente el sobrenadante de hibridoma, anticuerpo IgG1 de control positivo (6E10 a 1 µg/mL: Covance, Emeryville, CA, EE.UU.)
o control negativo (solo medio de cultivo). Tras una etapa de lavado, se incubó el anticuerpo secundario específico de fragmento Fcγ de IgG (subclases 1+2a+2b+3) anti-ratón de cabra conjugado con AP (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EE.UU.) sobre las placas durante 2 h a 37ºC. Tras un lavado final, se llevó a cabo la detección con pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), el sustrato de fosfatasa para AP, y las placas fueron leídas a 405 nm con un lector de placas ELISA. Los resultados se expresan como D.O. (Densidad Óptica).
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Escrutinio de placas de 24 pocillos
Escrutinio de matraces T25
Positivo en ELISA
Positivo en TAUPIR Positivo en escrutinio de IgG Positivo en ELISA Positivo en TAUPIR
7C2
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8H8
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Los clones 5D10 y 7C2 fueron los únicos positivos en los 3 escrutinios y fueron seleccionados para subclonación. El clon 5D10 se une solo al péptido T8.5, mientras que el clon 7C2 se une a los dos péptidos de la vacuna ACI-41 (T8.5 y T9.5) (Figura 10). El subclon 5D10A4 que procede del 5D10 fue específico para el péptido pTau.
5 8.3. Conclusión
Los anticuerpos generados han demostrado una elevada especificidad hacia péptidos pTau, con una unión solo marginal a péptidos no fosforilados.
De las 3 fusiones (ACI-33, ACI-36 y ACI-41), se depositaron un total de 7 clones en DSMZ (tabla 10) y se seleccionaron para continuar con la subclonación.
10 Tabla 10: Lista de hibridomas depositados
Antígeno
Vacuna Nombre de hibridoma Número de depósito Fecha de depósito
T8: Tau206-221 [pT212/pS214] + T9: Tau196-211 [pS202/pT205]
ACI-41 ACI-41-Ab1 DSM ACC3043 3 marzo 2010
T4: Tau 401-418 [pS404, pS409]
ACI-36 2B6 DSM ACC3044 10 marzo 2010
T4: Tau 401-418 [pS404, pS409]
ACI-36 3A8 DSM ACC3045 10 marzo 2010
T4: Tau 401-418 [pS404, pS409]
ACI-36 4C1 DSM ACC3046 10 marzo 2010
T8: Tau206-221 [pT212/pS214] + T9: Tau196-211 [pS202/pT205]
ACI-41 5D10A3 DSM ACC3047 10 marzo 2010
T1: Tau 5-20 [pY18]
ACI-33 6C10 DSM ACC3048 10 marzo 2010
T4: Tau 401-418 [pS404, pS409]
ACI-36 6H1 DSM ACC3049 10 marzo 2010
T8: Tau206-221 [pT212/pS214] + T9: Tau196-211 [pS202/pT205]
ACI-41 7C2 DSM ACC3050 10 marzo 2010
EJEMPLO 7: Tinción específica de lámina de cerebro con AD humano con dos anticuerpos (ACI-41-Ab1 y 5D10), derivados de ratones vacunados con ACI-41
El objetivo de este estudio fue teñir marañas neurofibrilares (NFTs, del inglés “neurofibrillary tangles”) en cerebro
15 humano con enfermedad de Alzheimer (AD) usando los anticuerpos ACI-41-Ab1 (9H3 subclon T89-F4) y 5D10, generados a partir de diferentes fusiones de ratones inmunizados con la vacuna ACI-41. Para realizar la evaluación, se empleó un ensayo de tinción de inmunorreactividad de proteína fosfo-Tau (TAUPIR) usando secciones de
cerebro con AD.
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Grupo
Nº de animales y género Tratamiento /Volumena Lote de vacuna Ruta de administraciónb Nivel de dosis, cantidad de péptido Tau µg/dosisc Cantidad de MPLA µg/dosisc
1
5 ♀ 5 ♂ 5 ♀ 3 ♂ ACI-33 0,2 mL PBS 0,2 mL ACI-33-081031-A N.A. s.c. s.c. 9 N.A. 12 N.A.
2
5 ♀ 5 ♂ 5 ♀ 5 ♂ ACI-35 0,2 mL PBS 0,2 mL ACI-35-081015-A ACI-35-090402-A N.A. s.c. s.c. 16 8 N.A. 23 27 N.A.
3
5 ♀ 5 ♂ 5 ♀ 3 ♂ ACI-39 0,2 mL PBS 0,2 mL ACI-39-090202-A N.A. s.c. s.c. 9,6 N.A. 28,8 N.A.
4
5 ♀ 5 ♂ 5 ♀ 3 ♂ ACI-40 0,2 mL PBS 0,2 mL ACI-40-090202-A N.A. s.c. s.c. 12 N.A. 24,4 N.A.
N.A. = No aplicable a volumen teórico. b s.c.: subcutánea. c cantidad medida determinada tras análisis.
9.1.4. Cuantificación de anticuerpos específicos de péptido Tau
Para los ratones tratados con ACI-33, ACI-39 y ACI-40, se determinaron mediante ELISA los anticuerpos de IgG específicos de, respectivamente, Tau5-20 [pY18], Tau206-221 [pT212, pS214] y Tau196-211 [pS202, pT205] en las 6 muestras de sueros sanguíneos. En los sueros de las muestras del día -1 y el día 41 se determinó la IgG específica de Tau5-20, proteína Tau de longitud completa (441 aa) y la proteína Tau de longitud completa fosforilada (441 aa). Los anticuerpos de IgM y de isotipos de IgG específicos de péptido fosfo-tau fueron determinados mediante ELISA en la muestra de suero sanguíneo del día 41.
Para los ratones tratados con ACI-35, los anticuerpos de IgG específicos para Tau393-408 [pS396/pS404] fueron determinados mediante ELISA en las 7 muestras de suero sanguíneo. En los sueros de las muestras del día -1 y el día 40 se determinó la IgG específica de Tau393-408, proteína Tau de longitud completa (441 aa) y la proteína Tau de longitud completa fosforilada (441 aa). Los anticuerpos de IgM y de isotipos de IgG específicos de Tau393-408 [pS396/pS404] fueron determinados mediante ELISA en la muestra de suero sanguíneo del día 40.
Se recubrieron placas con 10 µg/mL del correspondiente péptido Tau y 1 µg/mL de la correspondiente proteína Tau durante una noche a 4ºC. Tras lavar todos los pocillos con PBS-Tween 20 al 0,05% y bloquear con BSA al 1% en PBS-Tween 20 al 0,05%, se añadieron a las placas diluciones en serie de los sueros y se incubó a 37ºC durante 2 horas. Tras lavar, las placas fueron incubadas con un anticuerpo total de IgG anti-ratón conjugado a fosfatasa alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EE.UU.) o anticuerpos específicos de isotipo (IgM anti-ratón conjugado a peroxidasa de rábano (HRP), IgG1 anti-ratón conjugado a AP, IgG3 anti-ratón conjugado a biotina, adquiridos en Pharmingen BD San Diego, CA, EE.UU.; IgG2a anti-ratón conjugado a biotina adquirido en Invitrogen CA, EE.UU., e IgG2b anti-ratón conjugado a HRP de Zymed Laboratories, San Francisco, CA) durante 2 horas a 37ºC. Tras lavar, las placas fueron incubadas con pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), el sustrato de fosfatasa para AP, o con ABTS (2,2’-azino-bis(ácido 3-etilbenztiazolina-6-sulfónico)), el sustrato para HRP, y se leyeron a 405 nm usando un lector de placas ELISA. Para los anticuerpos conjugados a biotina se realizó una etapa suplementaria en la que las placas fueron incubadas durante 45 minutos en estreptavidina-HRP (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) antes de la detección con ABTS. Los resultados se expresan como D.O. (Densidad Óptica) a una D.O. no saturada para IgG, isotipos de IgG e IgM.
9.1.5. Unión de anticuerpos anti-Tau a marañas Tau en láminas de cerebro procedentes de animales transgénicos (TAUPIR)
La unión de anticuerpos presentes en el suero de animales vacunados con ACI-33, ACI-35, ACI-39 y ACI-40 a marañas en las láminas de cerebro se llevó a cabo mediante inmunohistoquímica TAUPIR.
La tinción TAUPIR se realizó según el protocolo del EJEMPLO 5.1.5.
9.1.6. Análisis de transferencia Western Blot (WB)
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Claims (1)

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