KR20150041203A - 약학적 조성물 - Google Patents

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KR20150041203A
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안드레아 파이퍼
안드레아스 무스
프레드 반 루벤
마리아 필그렌
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에이씨 이뮨 에스.에이.
카톨리에케 유니버시테이트 루벤
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Abstract

본 발명은 신경섬유 농축체에 의해 유발되거나 그와 관련이 있는 질병의 치료 및 진단을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 알츠하이머 질환을 비롯한 타우병증의 치료 및 진단을 위한 약학적 조성물로서, 항원 펩티드, 특히 타우 단백질의 주요한 병리학적 포스포-에피토프를 모방하는 항원 포스포-펩티드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION}
본 발명은 신경섬유 농축체(neurofibrillary tangle)에 의해 유발되거나 그와 관련이 있는 질병의 치료 및 진단을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 알츠하이머 질환(AD)을 비롯한 타우병증(tauopathy)의 치료 및 진단을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
신경섬유 농축체는 AD의 주요한 신경 병리학적 특징이다. 이는 과인산화 단백질인 타우 및 이의 이형태체(conformer)의 응집에 의해 발생한다. AD는 많은 신경변성 타우병증, 특히 특정 유형의 전측두엽 치매(FTD)와 함께 이러한 병리를 공유한다.
타우 단백질은 미세소관(MT)에 특이적으로 결합하여 그 미세소관의 조립 및 안정성을 촉진하는 것으로, 매우 가용성이고 "자연적으로 접혀지지 않은" 단백질이다. MT들은 신경세포의 세포골격 보전을 위해 주요한 중요성이 있으므로, 신경회로의 적당한 형성 및 기능을 위해 중요하고, 따라서 학습 및 기억을 위해 중요하다. MT에의 타우의 결합은, 주로 시험관내 및 비신경 세포에서 확인되는 바와 같이 동적 인산화 및 탈인산화에 의해 조절된다. 많은 수(>80)의 가능한 인산화 부위 및 그 각각의 정확한 기여 때문에, 그의 원인이 되는 키나아제의 정체가 생체 내에서 충분히 규명되지 않은 상태로 남았다.
AD 뇌에서, 타우 병리는 아밀로이드 연쇄 가설의 본질을 구성하는 아밀로이드 병리 이후에 발생하므로 아마도 그 아밀로이드 병리에 반응하여 발생한다. 이는 AD 및 다운 증후군 환자에 대한 연구에 근거하고 그에 의해 설명되고, 아밀로이드 및 타우 병리 모두를 갖는 형질전환 마우스에 대한 연구에 의해 확증된다 (Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyl1aert et al, 2006; 2008; Terwel et al, 2008).
인간 AD 환자에서 두 병리의 정확한 시기 및 타우 병리에 아밀로이드 병리를 연결하는 기작은 정확히 알려져 있지 않지만, 주요 "타우-키아아제"인 GSK3 및 cdk5에 대하여 작용하거나 그에 의해 작용하는 신경신호전달 경로의 활성화를 동반하는 것으로 제안되고 있다(Muyllaert et al, 2006, 2008 참조).
타우병증이 명백한 부작용은 아니지만 AD의 주요한 병리학적 요인이라는 가설은 확실한 유전적, 병리학적 및 실험적 관찰에 근거하는데, 이러한 관찰은 하기의 사항들을 서로 충분히 확증하고 있다:
- 아밀로이드 단백질 전구체(APP) 또는 프리세닐린(presenilin)에서의 돌연변이로 인한 조기에 발병된 가족성 AD의 경우, 그 필수적인 발병 원인은 아밀로이드 축적이지만, 그 병리는 후기 발병된 산발성 AD의 경우와 마찬가지로 2차적인 타우병리를 반드시 포함한다.
- 인식기능장애 및 치매의 심각성은, 아밀로이드에 대한 PIB-PET 이미지화를 포함하고, 높은 뇌 아밀로이드 적재량을 갖는 인식이 정상인 개체에서 많은 허위양성을 확인하고 있는 몇몇의 임상 단계 1 및 2의 연구에 의해 예시되는 바와 같이, 아밀로이드 병리가 아니라 타우병증과 관련이 있다.
- 가족성 FTD의 경우, 타우병증은 돌연변이 타우에 의해 유발되고, 아밀로이드 병리 없이 신경변성을 직접 유발한다.
- 실험적 마우스 모델에서, 아밀로이드 병리에 의해 유발된 인식 장애는 타우 단백질이 없는 경우 거의 완전히 완화된다(Roberson et al, 2007).
이러한 합쳐진 주장들은 AD 및 관련 신경변성 타우병증에서 인식 장애에 주요한 역할을 한다는 가설을 지지한다.
AD의 두드러진 최근의 치료법은 특정 mAb들을 이용하여, 신경 독성 또는 시냅스 독성인 것으로 추정되는 아밀로이드 펩티드 및 이의 응집체를 제거하는 수동 면역요법이다.
여기서 제안된 것으로, 타우 병리를 표적하는 면역요법은 신경변성을 유발하는 것으로 알려져 있거나 가정되는 병리학적 단백질인 타우 이형태체를 저해하는 것으로 예상된다. 유발된 AD의 아밀로이드 병리 및 과인산화된 단백질의 신경내 응집체들은 경도 인식 장애(MCI)로부터 AD의 심각한 치매로 이어지는 병리학적 상태의 인식 및 변성 캐스케이드에 상승 작용하는 것으로 제안되고 있다. 따라서, 타우 표적 약물과 아밀로이드 표적 (또는 임의의 다른 것을 표적) 약물의 조합은 바람직하고 실질적으로 더욱 효과적인 AD 치료법을 구성하게 된다.
타우 단백질을 표적하는 다른 치료적 접근방법들은 드물고 주로 하기의 것들을 포함한다:
- 타우의 인산화를 병리학적 수준으로 증가시키는 것으로 생각되는 키나아제의 억제제
- 과인산화된 타우 단백질의 세포질 응집을 차단하는 화합물.
이러한 접근방법들은 특이성 및 효능의 측면에서 여러 가지 결점이 있고, APP 및 아밀로이드의 대사를 변화시키기 위한 시도와 같이 이루어지므로, 이들은 모두 타우에 대한 면역요법을 비롯한 추가의 치료 방법들에 대한 지속적인 조사의 중요성을 강조한다.
생체내에서 병리학적 타우 이형태체를 규명(표적하는 것은 물론이고)하기 위한 노력은 실제적으로 이루어지지 않았었다. Ap42 단계 II 임상 시험에서, 농축체(tangle) 병리는 충분히 고려되거나 심도 있게 분석되지 않은 것으로 보인다 (Nicoll et al., 2003; Masliah et al., 2005). 다른 한편으로, AD 유사 병리를 겸비하는 전임상 마우스 모델에서 아밀로이드를 표적하는 실험적 면역요법도 타우 응집체가 잔존했지만 타우 병리에 대한 효과를 입증했다(Oddo et al., 2004).
면역요법에 의해 세포내 타우 단백질에 접근하는 실현성에 의심이 있어왔다. 이러한 의심은 Asuni 및 이의 동료에 의한 타우병증 마우스 모델에서의 최근의 실험적 연구에 의해 부정되어 왔다 (Asuni et al., 2007). 이들은 타우 단백질 유래의 포스포-펩티드(phospho-peptide)를 이용한 백신접종에 의해 농축체 병리의 감소 및 기능 개선을 확인했다. 이들 데이터는 파킨슨병 (PO) 모델에서 알파-시뉴클린을 표적하는 면역요법의 이전의 보고 (Masliah et al., 2005) 및 근위축성 측삭 경화증(ALS) 모델에서 슈퍼옥사이드 디뮤스타제의 이전의 보고(Urushitiani et al., 2007)를 확증한다. 이러한 두 질병은 아직 충분히 이해되지 않은 기작에 의해 신경변성으로 이어지는 세포내 단백질의 예이다. 다른 한편으로, 세균에서 배양되고 그로부터 분리된 전장 재조합 타우 단백질은 백신으로서 적당하지 않은 것으로 보이지만, 사용된 보강제, 즉 완전 프로인트 및 백일해 독소는 그 연구의 부정적인 결과에 기여할 수 있었다 (Rosenmann et al., 2006).
예를 들어, 아밀로이드 만큼이나 AD에 대하여 대표적인 것으로 과인산화된 타우 단백질의 신경내 응집체에 의해 유발된 AD의 아밀로이드 병리와 같은 신경변성 장애를 유발하는 것으로 알려져 있거나 추정되는 병리학적 단백질 이형태체를 중화하도록 작용하는 수동 및/또는 능동 면역요법에 대한 미충족 필요성이 있다.
이러한 미충족 필요성은 타우 단백질의 주요한 병리학적 포스포-에피토프(phospho-epitope)를 모방하는 포스포-펩티드에 기반하는 mAb 및 리포좀계 백신(Nicolau et al., 2002; Muhs et al., 2007)을 이용하여 수동 및 능동 면역 방법을 제공함으로써 본 발명의 범위 내에서 충족될 수 있었다. 이러한 합쳐진 작용들은 AD를 비롯한 타우병증에서 시냅스 독성 및 신경 독성의 원인이 되는 것으로 생각되는 선형 및 입체 구조의 간단하고 및 복잡한 포스포-에피토프에 대한 신규의 특이적인 mAb를 생성한다.
본 발명은 아주 효과적이고 타우병증, 타우병증과 관련이 있는 증상, 신경섬유 병변의 형성과 관련이 있는 질병 및 장애의 그룹, 또는 이러한 신경변성 장애의 그룹에서 두드러진 뇌병리를 예방 또는 완화할 수 있는 면역 반응으로서, 생물체, 특히 동물, 특히 포유동물 또는 인간에서 아주 특이적이고, 특히 형태 특이적인(conformation specific) 면역 반응을 유도하기 위한 신규한 방법, 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 타우병증, 타우병증과 관련이 있는 증상, 신경섬유 병변의 형성과 관련이 있는 질병 및 장애의 그룹, 또는 이러한 신경변성 장애의 그룹에서 두드러진 뇌병리를 예방 또는 완화하기 위한 것으로, 본 발명에 따른 것이고 본원에서 기재한 바와 같은 항원 펩티드 또는 이의 기능적 단편 및 상기 항원 펩티드 또는 이의 기능적 단편의 투여시 생물체에서 아주 특이적이고, 특히 형태 특이적인 면역 반응의 결과로서 생성되는 항체, 특히 그의 기능적 부분을 비롯한 모노클로날 항체, 및 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
이러한 신경변성 장애의 그룹은 두 개의 아류로 나누어질 수 있다. 첫 번째 부류의 질병 또는 장애는 타우 및 아밀로이드 병리의 공존을 보이며 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야곱병, 투사형 치매, 다운 증후군, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커(Gerstmann-Straussler-Scheinker)병, 봉입체 근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증 및 외상성 뇌손상을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
두 번째 부류의 질병 또는 장애는 명백한 아밀로이드 병리를 보이지 않으며 이에는 근위축성 측삭 경화증/파킨슨병 치매 복합증, 호은성 그레인 치매(argyrophilic grain dementia), 피질기저핵 변성, 석회화를 갖는 확산 신경섬유 농축체, 염색체 17에 연결된 파킨슨병을 갖는 전측두엽 치매, 할러보든-슈파쯔 증후군(Hallervorden-Spatz Syndrome), 다발성 신경계 위축증, C형 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 피크병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 상핵 범뇌염(progressive supranuclear panencephalitis)이 있으나 이에 제한되지 않는다.
특히, 본 발명은 신경섬유의 병변과 관련된 질병 또는 장애로 고생하는 포유동물, 특히 인간의 인지 기억 능력을 유지 또는 개선, 특히 회복, 더욱 특히 완전히 회복하기 위한 신규한 방법, 및 본 발명에 따른 것이고 본원에서 기재된 바와 같은 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하고, 숙주 동물에게 상기 항원 펩티드 및 이의 단편의 투여시에 얻어질 수 있는 항체, 특히 그의 기능적 부분을 포함한 모노클로날 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 목적은 타우 및 아밀로이드 병리들의 공존을 보이고 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야곱병, 투사형 치매, 다운 증후군, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커(Gerstmann-Straussler-Scheinker)병, 봉입체 근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증 및 외상성 뇌손상을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병 또는 장애, 및 명백한 아밀로이드 병리를 보이지 않고 괌(Guam)의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유 농축체를 갖는 비괌의 운동 뉴런 질환(Non-Guamanian motor neuron disease), 호은성 그레인 치매(argyrophilic grain dementia), 피질기저핵 변성, 석회화를 갖는 확산 신경섬유 농축체, 염색체 17에 연결된 파킨슨병을 갖는 전측두엽 치매, 할러보든-슈파쯔 증후군(Hallervorden-Spatz Syndrome), 다발성 신경계 위축증, C형 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 피크병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 상핵 범뇌염(progressive supranuclear panencephalitis), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 신경섬유 농축체 단독치매(Tangle only dementia), 뇌염후변성 파킨슨병, 근육퇴행 위축을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병 또는 장애를 포함하는 신경변성 질환 또는 장애의 이종 그룹을 포함하는 타우병증에서 두드러진 뇌 병리인 신경섬유 병변의 형성에 의해 유발되거나 그와 관련이 있는 질병 또는 장애의 치료를 위한 것으로, 타우 단백질로부터 얻어질 수 있는 항원 펩티드, 특히 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공함에 있다. 특히, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 타우 단백질의 주요한 병리학적 포스포-에피토프를 모방하는 항원 포스포-펩티드 또는 이의 단편으로서, 담체에의 부착 또는 재구성을 통해 추가로 변형되는 항원 펩티드 또는 이의 단편, 상기 항원 펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물, 및 이러한 펩티드 및 이의 단편 및 약학적 조성물을 각각 제조하는 방법을 제공함에 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드 또는 이의 기능적 단편 및 상기 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 5개 내지 30개 아미노산 잔기, 특히 10 개 내지 25개 아미노산 잔기, 특히 12 개 내지 22개 아미노산 잔기, 특히 14개 내지 20개 아미노산 잔기, 특히 16개 내지 18개 아미노산 잔기로 구성되고, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9에 표시된 서열들의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는데, 상기 서열들은 병리 증상 또는 장애, 특히 신경섬유 병소의 형성과 관련된 증상 또는 장애와 관련이 있는 특징적 인산화 패턴의 특징을 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9에서 나타낸 서열들의 군에서 선택되는 항원 펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 기능적 단편에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 및 상기 항원 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 2에서 표시한 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 2의 항원 펩티드와 실질적으로 동일한 면역 활성을 갖는데, 서열번호 2의 아미노산 잔기 18 (P-Tyr18)에 해당하는 아미노산 잔기는 인산화된다 (T1).
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 2에서 표시한 아미노산 서열을 나타내는데, 상기 아미노산의 18(P-Tyr18)이 인산화된다 (T1).
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 3 및 서열번호 4에서 각각 나타낸 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내고 서열번호 3의 항원 펩티드와 실질적으로 동일한 면역 활성을 갖는데, 서열번호 3 및 4 각각의 아미노산 잔기202 (P-Ser202), 205 (P-Thr205), 212 (P-Thr212) 및 214 (P-Ser214)에 해당하는 적어도 하나, 특히 적어도 2개, 특히 적어도 3개, 특히 전부가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 3 및 4에서 각각 나타낸 아미노산 서열을 나타내는데, 아미노산 잔기 202 (P-Ser202), 205 (P-Thr205), 212 (P-Thr212) 및 214 (PSer214)의 적어도 하나, 특히 적어도 2개, 특히 적어도 3개, 특히 전부가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 4에서 표시한 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내고 서열번호 4의 항원 펩티드와 실질적으로 동일한 면역 활성을 갖는데, 상기 서열번호 4의 서열의 아미노산 잔기 202 (P-Ser202) 및 205 (P-Thr205)에 해당하는 아미노산 잔기들 중 적어도 하나, 특히 적어도 2개가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 4에서 표시한 아미노산 서열을 나타내는데, 서열번호 4의 서열의 202 (P-Ser202) 및 205 (P-Thr205)중 적어도 하나, 특히 적어도 2개가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 3에서 표시한 아미노산 서열과 적어도 8%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 나타내고 서열번호 3의 항원 펩티드와 실질적으로 동일한 면역 활성을 갖는데, 서열번호 3의 아미노산 잔기 212 (P-Thr212) 및 214 (P-Ser214)에 해당하는 아미노산 잔기들 중 적어도 하나, 특히 적어도 2개가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 아미노산 잔기 212 (P-Thr212) 및 214 (P-Ser214)중 적어도 하나, 특히 적어도 2개가 인산화되어 있는 서열번호 3에서 표시한 아미노산 서열을 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 5에서 표시한 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 5의 항원 펩티드와 실질적으로 동일한 면역 활성을 갖는데, 상기 서열번호 5의 아미노산 잔기 396 (P-Ser396) 및 404 (P-Ser404)에 해당하는 아미노산 잔기들 중 적어도 하나, 특히 전부가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 아미노산 잔기 396 (P-Ser396) 및 404 (P-Ser404)중 하나 이상, 특히 전부가 인산화되어 있는 서열번호 5의 아미노산 서열을 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 6에서 표시한 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 6의 항원 서열과 실질적으로 동일한 면역 활성을 갖는데, 서열번호 6의 아미노산 잔기 404 (P-Ser404) 및 409 (P-Ser409)에 해당하는 아미노산 잔기들 중 하나 이상, 특히 전부가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 아미노산 잔기 404 (P-Ser404) 및 409 (P-Ser409)중 하나 이상, 특히 전부가 인산화되어 있는 서열번호 6에서 나타낸 아미노산 서열을 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 7에서 표시한 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내고, 서열번호 7의 항원 펩티드와 실질적으로 동일한 면역 활성을 갖는데, 서열번호 7의 아미노산 잔기 202 (PSer202), 205 (P-Thr205), 212 (P-Thr212) 및 214 (P-Ser214)에 해당하는 아미노산 잔기들 중 적어도 하나, 특히 적어도 2개, 특히 적어도 3개, 특히 전부가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 아미노산 잔기 202 (P-Ser202), 205 (P-Thr205), 212 (P-Thr212) 및 214 (P-Ser214)중 적어도 하나, 특히 적어도 2개, 특히 적어도 3개, 특히 전부가 인산화되어 있는 서열번호 7에서 표시된 아미노산 서열을 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 8에서 표시한 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내고, 서열번호 8의 항원 펩티드와 실질적으로 동일한 항원 활성을 갖는데, 상기 서열번호 8의 아미노산 잔기 409 (P-Ser409)가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 8에서 표시된 아미노산 서열을 나타내는데, 서열번호 8의 아미노산 잔기 409 (P-Ser409)에 해당하는 아미노산 잔기가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 9에서 표시된 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 9의 항원 펩티드와 실질적으로 동일한 면역 활성을 갖는데, 서열번호 9의 아미노산 잔기 404 (P-Ser404)에 해당하는 아미노산 잔기가 인산화되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편, 및 상기 항원 펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 단편은 서열번호 9에 표시된 아미노산 서열을 나타내는데, 서열번호 9의 아미노산 서열 404 (P-Ser404)에 해당하는 아미노산 잔기가 인산화되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따라 변형된 항원 펩티드 또는 이의 기능적 단편 및 상기 변형된 항원 펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는데, 상기 펩티드는 서열번호 2 내지 9에서 표시한 항원 펩티드와 본질적으로 동일하고, 서열번호 2 내지 9의 항원 펩티드, 특히 상기 단편의 보존적으로 변형된 변이체와 실질적으로 동일한 면역 활성을 갖는데, 상기 변형 결과, 하나 이상의 아미노산, 특히 1개 내지 10개의 아미노산, 더욱 특히 1개 내지 6개의 아미노산, 더 더욱 특히 1개 내지 4개의 아미노산, 특히 1개 내지 3개의 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환되어 있다. 기능적으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환 테이블은 당업계에 잘 알려져 있고 아래에 기재되어 있다. 상기 보존적 치환은 상기 펩티드의 전체 순전하 및 상기 펩티드에 걸친 전하 분포가 본질적으로 동일하게 유지되도록 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 변이 펩티드 단편, 특히 본 발명에 따라 변형된 변이 항원 펩티드, 및 상기 변이 펩티드 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 상기 펩티드는 본 발명의 상기 확인된 단편과 본질적으로 동일하고 상기 단편과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는데, 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되어 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 2-mer, 3-mer, 4~mer, 5-mer, 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10mer, 11-rner, 12-mer, 13-mer, 14-mer, 15-mer, 16-mer, 20-mer, 30mer 및 50-mer로 이루어진 군에서 선택되는 폴리머의 형태로 제공되는데, 상기 폴리머를 구성하는 모노머 단위체들은 항상 동일하거나 또는 상이한 모노머 단위체 들이고, 본 발명에 따르고 본원에서 기재한 바와 같은 펩티드, 특히 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9에서 나타낸 펩티드, 또는 이의 기능적 단편 및 변이 펩티드들로 이루어진 군에서 선택된다.
일 구체예에서, 본 발명에 따르고 본원에 기재한 바와 같은 항원 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 담체, 특히 초분자 항원 구조물을 제공하는 보조제로서의 기능성도 갖는 담체에의 부착 또는 담체내로의 재구성을 통해 변형된다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 항원 펩티드 또는 이의 단편은 그 전체 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 WO 공개 WO 2005/081872호에 기재된 바와 같은 "초분자 항원 구조물"을 생성하도록 리포좀에의 부착 또는 리포좀내로의 재구성을 통해 변형된다. 항원 펩티드 또는 이의 단편은 담체 표면상의 항원 펩티드가 독특한 제시를 나타내어 항원의 노출을 향상시키고 최종적으로 고도의 형태적 민감성을 나타내는 항체를 생성하도록 추가로 변형된다. 특히, 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 리포좀 담체/면역 애주번트의 지질 이중충에의 삽입을 촉진하는 친유성 또는 소수성 부분과의 회합을 통해 변형되고, 특히 리포좀 이중층에서 펩티드에 대한 앵커(anchor) 로서 작용하고 리포좀 표면에 아주 근접하여 위치하고 안정화되도록 하는 치수를 갖는 친유성 또는 소수성 부분에 의해 변형된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 상기 친유성 또는 소수성 부분은 지방산, 트리글리세리드 또는 인지질이고, 특히 지방산, 트리글리세리드 또는 12 내지 24 탄소수의 탄소 사슬을 함유하는 인지질, 특히 팔미트산이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 항원 또는 이의 기능적 단편은 상기 항원 펩티드 또는 이의 기능적 단편의 N- 또는 C-말단에 공유결합된 팔미트 산의 적어도 두 분자에 의해 변형되고 리포좀 담체에의 재구성에 의해 변형된다.
본 발명의 일 구체예에서, 결합체(conjugate)내의 펩티드 또는 단편은 팔미트 산의 4분자에 각각 결합되므로, 테트라팔미토일화된다.
본 발명의 일 구체예에서, 팔미트 산의 두 분자는 펩티드 또는 단편의 N-말단에 결합되고 팔미트산의 두 분자는 펩티드 또는 단편의 C-말단에 결합된다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 예를 들어 팔미트 산과 같은 친유성 또는 소수성 부분과의 결합을 통해 변형되고 리포좀에서 재구성되는 본 발명에 따르고 본원에 개시된 바와 같은 항원 펩티드를 제공하는데, 상기 리포좀 제제는 예를 들어 지질 A, 명반, 인산칼슘, 인터루킨 및/또는 다당류 및 단백질의 마이크로캡슐, 특히 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A와 같은 해독된 지질 A, 또는 초분자 항원 구조물을 초래하는 명반을 추가로 함유할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 담체 분자 당, 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 항원 펩티드, 특히 2개 이상의 항원 펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 초분자 구조물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 담체 분자는 리포좀이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 두 개 이상의 항원 펩티드는 동일 또는 상이한 펩티드들이고, 특히 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로부터 선택된 펩티드 또는 이의 단편 또는 이의 기능적 단편 및 변이 펩티드이다.
일 구체예에서, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 두 개 이상의 항원 펩티드들 또는 이의 기능적 단편들의 조합을 담체 분자당 포함하는 본 발명에 따르고 본원에 개시된 바와 같은 초분자 구조물에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 인산화된 병리학적 타우 단백질 이형태체(conformer) 또는 이러한 이형태체의 병리학적 특성을 유발하는 이형태체의 일부, 특히 타우 단백질의 병리학적 포스포-에피토프를 인식 및 결합하는 항체, 특히 임의의 기능적으로 균등한 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 인산화된 병리학적 타우 단백질 이형태체(conformer) 또는 이러한 이형태체의 병리학적 특성을 유발하는 이형태체의 일부, 특히 타우 단백질의 병리학적 포스포-에피토프를 높은 특이성으로 인식 및 결합하는 항체, 특히 임의의 기능적으로 균등한 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따른 항체, 특히 임의의 기능적으로 균등한 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 모노클로날 항체는 병리학적 단백질 타우 이형태체 또는 이러한 이형태체의 병리학적 특성을 유발하는 상기 이형태체의 일부에, 인산화되지 않고 비병리학적인 타우 이형체에 대한 결합 친화성과 비교하여 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 특히 적어도 60%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95% 및 100% 이하 더 높은 친화성으로 결합한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 인간 알츠하이머 질환의 뇌에서 신경섬유 농축체(NFT) 및 신경그물 실(neuropil thread)에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 기능적 부분을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 타우 단백질상의 에피토프, 또는 에피토프들의 조합, 특히 인산화된 병리학적 단백질 타우 이형태체에 특이적인 에피토프, 특히 타우 단백질의 병리학적 포스포-에피토프, 예를 들어 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9에서 나타낸 서열들의 군에서 선택된 펩티드 서열로 표시되거나 그에 포함되는 에피토프 및 이의 변이 단편에 직접적이고 특이적으로 결합하는 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 이의 기능적 부분을 제공함에 있다.
특히, 본 발명은 항원 펩티드, 특히 본 발명에 따르고 위에서 기재한 바와 같은 펩티드 조성물, 특히 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9에서 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항원 펩티드 또는 이의 기능적 단편 또는 변이 단편을 포함하는 조성물로 적당한 동물을 면역시켜서 얻을 수 있는 항체로서, 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 모노클로날 항체를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 3일자로 기탁번호 DSM ACC3043으로 기탁된 하이브리도마 세포주 ACI-41-Ab1에 의해 생성되는 항체의 특징적 특성을 갖는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 2010년 3월 3일자로 기탁번호 DSM ACC3043으로 기탁된 하이브리도마 세포주 ACI-41-Ab1에 의해 생성되는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3044로 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6 에 의해 생성되는 항체의 특징적 특성을 갖는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM AGC3044로 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6에 의해 생성되는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3045로 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8에 의해 생성되는 항체의 특징적 특성을 갖는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM AGC3045로 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8에 의해 생성되는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3046으로 기탁된 하이브리도마 세포주 4C1에 의해 생성되는 항체의 특징적 특성을 갖는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM AGC3046으로 기탁된 하이브리도마 세포주 4C1에 의해 생성되는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3047로 기탁된 하이브리도마 세포주 5D10A3에 의해 생성되는 항체의 특징적 특성을 갖는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM AGC3047로 기탁된 하이브리도마 세포주 5D10A3에 의해 생성되는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3048로 기탁된 하이브리도마 세포주 6C10에 의해 생성되는 항체의 특징적 특성을 갖는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM AGC3048로 기탁된 하이브리도마 세포주 6C10에 의해 생성되는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3049로 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1에 의해 생성되는 항체의 특징적 특성을 갖는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM AGC3049로 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1에 의해 생성되는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3050으로 기탁된 하이브리도마 세포주 7C2에 의해 생성되는 항체의 특징적 특성을 갖는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM AGC3050으로 기탁된 하이브리도마 세포주 7C2에 의해 생성되는 항체, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
상기 항체는 전술한 바와 같은 특이적 결합 특성을 여전히 나타내는 키메라 항체 또는 인간화 항체의 형태로 제공될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재한 바와 같은 본 발명의 항체를 생성하는 세포주에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 3일자로 기탁번호 DSM ACC3043으로 기탁된 하이브리도마 세포주 ACI-41-Ab1에 관한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3044로 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6 에 관한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3045로 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8에 관한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3046으로기탁된 하이브리도마 세포주 4C1에 관한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3047로 기탁된 하이브리도마 세포주 5D10A3에 관한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3048로 기탁된 하이브리도마 세포주 6C10에 관한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3049로 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1에 관한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3050으로 기탁된 하이브리도마 세포주 7C2에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 특이적 타우 결합 특성을 갖는 항체를 여전히 생성하는 것으로, 상기 나열한 특이적 하이브리도마 세포주의 서브클론 및 변이 클론을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 기억 손상으로 고생하는 동물, 특히 포유 동물 또는 인간의 인식 기억 능력의 유지 또는 개선, 특히 완전한 회복을 위한 약학적 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 항원 펩티드 단편, 특히 담체, 특히 리포좀 담체에의 부착 및/또는 재구성을 통해 변형된 항원 펩티드 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, 본 발명에 따른 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 일부, 특히 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 일부를 포함하는 항체를 치료적 유효량으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 타우 및 아밀로이드 병리들의 공존을 보이고 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야곱병, 투사형 치매, 다운 증후군, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커(Gerstmann-Straussler-Scheinker)병, 봉입체 근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증 및 외상성 뇌손상을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병 또는 장애, 및 명백한 아밀로이드 병리를 보이지 않고 괌(Guam)의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유 농축체를 갖는 비괌의 운동 뉴런 질환(Non-Guamanian motor neuron disease), 호은성 그레인 치매(argyrophilic grain dementia), 피질기저핵 변성, 석회화를 갖는 확산 신경섬유 농축체, 염색체 17에 연결된 파킨슨병을 갖는 전측두엽 치매, 할러보든-슈파쯔 증후군(Hallervorden-Spatz Syndrome), 다발성 신경계 위축증, C형 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 피크병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 상핵 범뇌염(progressive supranuclear panencephalitis), 아급성 경화성 범뇌염, 신경섬유 농축체 단독치매(Tangle only dementia), 뇌염후변성 파킨슨병, 근육퇴행 위축을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병 또는 장애를 포함하는 신경변성 질환 또는 장애의 이종 그룹을 포함하는 타우병증에서 두드러진 뇌 병리인 신경섬유 병변의 형성에 의해 유발되거나 그와 관련이 있는 질병 또는 장애의 치료를 위한 것으로, 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물 및/또는 방법을 제공함에 있는데, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, 본 발명에 따르고 본원에 기재한 바와 같은 약학적 조성물을 인간, 특히 포유동물 또는 인간에게 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 기억 손상으로 고생하는 동물, 특히 포유동물 또는 인간의 인식 기억 능력을 유지 또는 증가, 특히 완전히 회복시키기 위한 것으로, 본 발명에 따르고 본원에 기재한 바와 같은 약학적 조성물 및/또는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, 본 발명에 따르고 본원에 기재한 바와 같은 약학적 조성물을 인간, 특히 포유동물 또는 인간에게 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 신경섬유 병변의 형성에 의해 유발되거나 그와 관련이 있는 질병 및 증상으로 고생하는 동물, 특히 포유동물 또는 인간에서 면역 반응을 유도하기 위한 약학적 조성물 및 이러한 조성물을 제조하는 방법 외에도, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 본 발명에 따른 약학적 조성물을 상기 동물 또는 인간에게 치료적 유효량으로 투여함으로써 상기 면역 반응을 유도하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 타우병증을 초래하는 신경섬유 병변으로 고생하는 동물, 특히 포유동물 또는 인간에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 기억 손상과 같은 상기 질병 또는 상태와 관련이 있는 증상의 유지 또는 개선, 특히 그 원래 상태의 완전한 회복이 달성될 수 있는 정도까지 상기 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
동물, 특히 포유동물, 특히 인간에게 투여시 본 발명에 따르고 본원에 개시된 바와 같은 항원 펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 IgG1 및 IgG2b와 같은 비염증성 Th2 아형(subtype)의 항체 및/또는 IgG3와 같은 T-세포 비의존성 IgG 아류의 항체를 주로 생성하고/하거나, 뇌의 염증 마커, 특히 IL-1β, IL-6, IFN-γ및 TNF α로 이루어진 군에서 선택되는 염증 마커를 유의하게 증가시키지 않는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따르고 본원에 기재한 바와 같은 항원 펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 환자, 특히 동물 또는 인간 환자, 특히 T-세포 비의존성 반응을 필요로 하는 환자, 예를 들어 면역 관용성 환자 또는 T-세포 활성화 환자에서 질병, 상태 또는 장애의 치료시 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있는데, 상기 항원 펩티드는 담체, 특히 리포좀 담체에의 부착 또는 재구성을 통해 변형되어 상기 항원이 담체, 특히 리포좀의 표면에 제시되도록 되어있다.
일 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 조성물은 면역 자극제로서 효과적이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 펩티드 항원은 리포좀의 표면상에 아주 반복적인 배열로 제시된다. 추가의 특정 구체예에서, 상기 항원은 T-세포 에피토프이다.
본 발명의 일 구체예에서, 본원에서 기재한 바와 같은 본 발명의 항원 조성물은 면역 관용성 환자 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 면역저하 환자, 특히 자가면역 질환으로 고생하는 환자, 특히 T-세포 결핍, 특히 CD4 T 세포의 결핍 및/또는 CD4 T 세포상에서 CD14 및/또는 CD40L의 발현의 감소에 의해 유발되는 CD4 T 세포의 결핍으로 고생하는 환자를 치료하기 위해 사용된다.
본 발명에 따른 항체는 시료 또는 원위치에서(in situ) 타우 단백질의 에피토프에의 항체 또는 이의 활성 단편의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는 방법으로서 환자에서 타우 단백질 관련 질병 또는 상태를 진단하는 방법에 사용될 수 있는데, 상기 방법은
(a) 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를, 타우 단백질의 에피토프와 결합하는 상기 항체와 접촉시키는 단계와,
(b) 상기 항체를 타우 단백질에 결합시켜서 면역학적 복합체를 형성하는 단계와,
(c) 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계와,
(d) 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 상기 시료 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 단백질의 존재 여부와 관련시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 시료 또는 원위치에서(in situ) 타우 단백질의 에피토프에의 항체 또는 이의 활성 단편의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 타우 단백질 관련 질병 또는 상태에 대한 소인(predisposition)을 진단하는 방법으로서,
(a) 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를, 타우 단백질의 에피토프와 결합하는 본 발명에 따르고 위에서 기재한 바와 같은 항체와 접촉시키는 단계와,
(b) 상기 항체를 타우 항원에 결합시켜서 면역학적 복합체를 형성하는 단계와,
(c) 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계와,
(d) 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 상기 시료 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 항원의 존재 여부와 관련시키는 단계와,
(e) 상기 면역학적 복합체의 양을 정상 대조 값과 비교하는 단계를 포함하고,
상기 정상 대조 값과 비교하여 상기 복합체의 양의 증가는 상기 환자가 타우 단백질 관련 질병 또는 상태로 고생하거나 그를 발생할 위험이 있다는 것을 나타내는 것인 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 본 발명에 따른 항체 또는 약학적 조성물로 치료한 후 환자에서 최소 잔류 질병을 모니터링하기 위한 방법으로서,
(a) 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를, 타우 단백질의 에피토프와 결합하는 본 발명에 따르고 위에서 기재한 바와 같은 항체와 접촉시키는 단계와,
(b) 상기 항체를 타우 항원에 결합시켜서 면역학적 복합체를 형성하는 단계와,
(c) 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계와,
(d) 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 상기 시료 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 항원의 존재 여부와 관련시키는 단계와,
(e) 상기 면역학적 복합체의 양을 정상 대조 값과 비교하는 단계를 포함하고,
상기 정상 대조 값과 비교하여 상기 복합체의 양의 증가는 상기 환자가 여전히 최소 잔류 질병으로 고생하고 있다는 것을 나타내는 것인 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 본 발명에 따른 항체 또는 약학적 조성물로 치료되고 있는 환자의 반응성을 예측하는 방법으로서,
(a) 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를, 타우 단백질의 에피토프와 결합하는 본 발명에 따르고 위에서 기재한 바와 같은 항체와 접촉시키는 단계와,
(b) 상기 항체를 타우 항원에 결합시켜서 면역학적 복합체를 형성하는 단계와,
(c) 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계와,
(d) 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 상기 시료 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 항원의 존재 여부와 관련시키는 단계와,
(e) 상기 치료의 개시 전후에 상기 면역학적 복합체의 양을 비교하는 단계를 포함하고,
상기 복합체의 양의 감소는 상기 환자가 상기 치료에 반응하는 높은 가능성을 갖는다는 것을 나타내는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 타우 관련 질병 또는 상태의 검출 및 진단을 위한 테스트 키트에서 사용될 수 있다.
특히, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는, 타우 단백질 관련 질병 및 상태의 검출 및 진단을 위한 테스트 키트, 특히 본 발명에 따른 하나 이상의 항체를 보유하는 용기, 및 상기 항체를 타우 단백질에 결합하여 면역학적 복합체를 형성하고 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하여 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 타우 단백질의 존재 여부와 관련시키는 목적으로 상기 항체를 사용하는 것에 대한 사용설명서를 포함하는 테스트 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 목적 및 다른 목적, 특징 및 이점들은 개시된 구체예 및 특허청구범위를 읽어본 후 명백하게 된다.
도 1a는 ACI-33으로 면역시킨 WT 마우스에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 항체를 도시한다. 0일, 13일 및 28일째에 ACI-33의 3회 주사를 받고 1일, 27일 및 47일째에 출혈되는 C57BL/6 야생형 마우스의 혈청에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻어진 O.D. + 표준 편차로 표시된다.
도 1a는 ACI-33으로 면역시킨 TKO 마우스에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 13일 및 28일째에 ACI-33의 3회 주사를 받고 1일, 27일 및 47일째에 출혈되는 C57BL/6 야생형 마우스의 혈청에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻어진 O.D. + 표준 편차로 표시된다.
도 2a는 ACI-35로 면역시킨 WT 마우스에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 16일, 30일, 99일 및 113일째에 ACI-35의 5회 주사를 받고 1일, 28일, 42일, 98일 및 126일째에 출혈되는 C57BL/6 야생형 마우스의 혈청에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻어진 O.D. + 표준 편차로 표시된다.
도 2b는 ACI-35로 면역시킨 TKO 마우스에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 16일, 30일, 99일 및 113일째에 ACI-35의 5회 주사를 받고 1일, 28일, 42일, 98일 및 128일째에 출혈되는 TKO 마우스의 혈청에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻어진 O.D. + 표준 편차로 표시된다.
도 3a는 ACI-36으로 면역시킨 WT 마우스에서 항-Tau401-418 [pS404/pS409] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 13일 및 28일째에 ACI-36의 3회 주사를 받고 1일, 27일 및 47일째에 출혈되는 C57BL/6 야생형 마우스의 혈청에서 항-Tau401-418 [pS404/pS409] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻어진 O.D. + 표준 편차로 표시된다.
도 3b는 ACI-36으로 면역시킨 TKO 마우스에서 항-Tau401-418 [pS404/pS409] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 13일 및 28일째에 ACI-36의 3회 주사를 받고 1일, 27일 및 47일째에 출혈되는 TKO 마우스의 혈청에서 항-Tau401-418 [pS404/pS409] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻어진 O.D. + 표준 편차로 표시된다.
도 4a 및 4b는 ACI-41로 면역시킨 WT 마우스에서 항-Tau206-221 [pT212/pS214] 및 항-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 20일 및 35일째에 ACI-41의 3회 주사를 받고 1일, 34일 및 48일째에 출혈되는 C57BL/6 야생형 마우스의 혈청에서 항-Tau206-221 [pT212/pS214] 및 항-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻어진 O.D. + 표준 편차로 표시된다. 동일한 혈청이 두 pTau 펩티드에 대하여 시험되었다.
도 4c 및 4d는 ACI-41로 면역시킨 TKO 마우스에서 항-Tau206-221 [pT212/pS214] 및 항-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 20일 및 35일째에 ACI-41의 3회 주사를 받고 1일, 34일 및 48일째에 출혈되는 TKO 마우스의 혈청에서 항-Tau206-221 [pT212/pS214] 및 항-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻어진 O.D. + 표준 편차로 표시된다. 동일한 혈청이 두 pTau 펩티드에 대하여 시험되었다.
도 5a는 ACI-33으로 면역시킨 WT 마우스에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-33 면역 후 47일째에 C57BL/6 야생형 마우스의 혈청에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG1, 2a, 2b, 3및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) 및 1/3200 (IgM)의 희석비에서 O.D.로 표시된다.
도 5b는 ACI-33으로 면역시킨 TKO 마우스에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-33 면역 후 47일째에 TKO 마우스의 혈청에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG1, 2a, 2b, 3및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) 및 1/3200 (IgM)의 희석비에서 O.D.로 표시된다.
도 6a는 ACI-35로 면역시킨 WT 마우스에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-35 면역 후 42일째에 C57BL/6 마우스의 혈청에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b, 3및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/1600 (IgG2a), 1/1600 (IgG2b), 1/800 (IgG3) 및 1/1600 (IgM)의 희석비에서 O.D로 표시된다.
도 6b는 ACI-35로 면역시킨 TKO 마우스에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-35 면역 후 42일째에 TKO 마우스의 혈청에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b, 3및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/1600 (IgG2a), 1/1600 (IgG2b), 1/800 (IgG3) 및 1/1600 (IgM)의 희석비에서 O.D.로 표시된다.
도 7a는 ACI-36으로 면역시킨 WT 마우스에서 항-Tau401-418 [pS404/S409] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-36 면역 후 47일째에 C57BL/6 마우스의 혈청에서 항-Tau401-418 [pS404/S409] IgG1, 2a, 2b, 3및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/400 (IgG2a), 1/400 (IgG2b), 1/100 (IgG3) 및 1/400 (IgM)의 희석비에서 O.D.로 표시된다.
도 7b는 ACI-36으로 면역시킨 TKO 마우스에서 항-Tau401-418 [pS404/S409] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-36 면역 후 47일째에 TKO 마우스의 혈청에서 항-Tau401-418 [pS404/S409] IgG1, 2a, 2b, 3및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/400 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) 및 1/400 (IgM)의 희석비에서 O.D.로 표시된다.
도 8a는 ACI-41로 면역시킨 WT 마우스에서 항-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-36 면역 후 48일째에 C57BL/6 마우스의 혈청에서 항- Tau196-211 [pS202/pT205] IgG1, 2a, 2b, 3및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b), 1/1600 (IgG3) 및 1/3200 (IgM)의 희석비에서 O.D로 표시된다.
도 8b는 ACI-41로 면역시킨 TKO 마우스에서 항-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-36 면역 후 48일째에 TKO 마우스의 혈청에서 항- Tau196-211 [pS202/pT205] IgG1, 2a, 2b, 3및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b), 1/1600 (IgG3) 및 1/3200 (IgM)의 희석비에서 O.D.로 표시된다.
도 9a 및 9b는 T25 플라스크로부터의 ACI-36 하이브리도마 상등액들의 TAUPIR 및 Tau ELISA 스크린 결과를 도시한다. 도 9a는 희석하지 않은 상등액을 이용한 늙은 biGT 마우스의 TAUPIR 염색 결과를 도시한다. 도 9b는 희석되지 않은 클론 상등액 시료들의 항-pTau 펩티드 T4.5, 항-Tau 펩티드 T4.6, 항-pTau 단백질 및 항-Tau 단백질 역가의 분석 결과를 도시한다. 결과는 O.D.로 표시된다.
도 10a, 10b 및 10c는 T25 플라스크로부터의 ACI-36 하이브리도마 상등액들의 TAUPIR 및 Tau ELISA 스크린 결과를 도시한다. 도 10a는 희석하지 않은 상등액을 이용한 늙은 biGT 마우스의 TAUPIR 염색 결과를 도시한다. 도 10b는 희석되지 않은 클론 상등액 시료들의 항-pTau 펩티드 T8.5, 항-Tau 펩티드 T8.6, 항-pTau 단백질 및 항-Tau 단백질 역가의 분석 결과를 도시한다. 결과는 O.D.로 표시된다. 도 10c는 희석되지 않은 클론 상등액 시료들의 항-pTau 펩티드 T9.5, 항-Tau 펩티드 T9.6, 항-pTau 단백질 및 항-Tau 단백질 역가의 분석 결과를 도시한다. 결과는 O.D.로 표시된다.
도 11은 T8: Tau206-221 [pT212IpS214], T9: Tau196-211 [pS202/pT205] 및 hP-Tau로 코팅한 플레이트 상의 하이브리도마 상등액의 분석 결과를 도시한다. 하이브리도마 클론의 상등액 유래의 항-Tau206-221 [pT212/pS214], 항-Tau 196-211 [pS202/pT205] 및 항-hP-Tau 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 O.D.로 표시된다. 동일한 상등액이 pTau 펩티드 및 hP-Tau 모두에 대하여 희석되지 않은 상태로 시험되었다.
도 12는 인간 AD 뇌에서 항체 클론 ACI-41-Ab1 (T89-F4) 염료들인 NFT들의 분석 결과를 도시한다. AD (a, b 및 c), PSP (진행성 상핵 마비) (d, 6 및 f) 및 건강한 대조군 (g, h 및 i) 개체들로부터 얻은 뇌 절편들이 AT100 (d 및 g), 또는 1/1(b, e 및 h) 또는 1/30 (c, f 및 i) 희석비의 ACl-41-Ab1 (T89-F4) (b, e 및 h)를 이용하여 염색했다.
도 13은 인간 AD 뇌에서 항체 5D10 염료들인 NFT들의 분석 결과를 도시한다. AD 개체들로부터 얻은 피질 뇌 절편을 5D10 (a) 또는 AT100 (b)를 이용하여 염색했다.
도 14는 ACI-35로 면역시킨 마우스에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 14일 및 14일째에 ACI-35의 3회 주사를 받고 -7일, 7일, 21일, 35일 및 56일째에 출혈되는 C57BL/6 마우스의 혈장에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 10마리 마우스의 그룹에서 얻은 O.D.+ 표준 편차로 표시된다.
도 15는 ACI-35로 면역시킨 마우스에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 아형 항체들의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-35 면역 후 35일째에 C57BL/6 마우스의 혈장에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b 및 3의 분석 결과를 도시한다. 결과는 10마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/1600 (IgG1), 1/3200 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b) 및 1/800 (IgG3)의 불포화 희석비에서 O.D.로 표시된다.
도 16a는 ACI-35로 면역시킨 마우스에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 항체들의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-35 면역 후 35일째에 C57BL/6 마우스의 혈장에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 항체들의 분석 결과를 도시한다. 결과는 10마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/6400의 희석비에서 O.D.로 표시된다.
도 16b는 ACI-35로 면역시킨 마우스에서 항-Tau393-408 IgG 항체들의 분석 결과를 도시한다. 첫 번째 ACI-35 면역 후 35일째에 C57BL/6 마우스의 혈장에서 항-Tau393-408 IgG 항체들의 분석 결과를 도시한다. 결과는 10마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100의 희석비에서 O.D.로 표시된다.
도 17은 Con A 또는 pTau/Tau 로 다시 자극시킨 비장 유래의 세포의 증식을 도시한다. 56일째에 Tau-특이적 T 세포 증식을 MTT로 분석한 결과를 도시한다. 각 그룹의 10 마리의 마우스로부터 비장세포를 풀링(pooling)하고 ConA, Tau393-408 [pS396/S404] 또는 Tau393-408 펩티드를 이용하여 다시 자극시켰다.
도 18은 Tau393-408 [pS396/S404] 및 Tau393-408 펩티드로서 다시 자극시킨 비장세포의 시토카인 생성에 대한 EUSPOT 분석 결과를 도시한다. P-Tau/Tau-특이적 T 세포의 EUSPOT 분석 결과를 도시한다. 각 그룹의 10 마리의 마우스로부터 비장세포를 풀링(pooling)하고 Tau393-408 [pS396/S404] 및 Tau393-408 펩티드를 이용하여 다시 자극시켰다.
도 19는 ACI-33으로 면역시킨 마우스에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 13일, 28일, 91일 및 133일째에 ACI-33의 5회 주사를 받고 -1일, 27일, 41일, 76일, 104일 및 135일째에 출혈되는 TPLH 마우스의 혈청에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 마우스 그룹에서 얻은 O.D.+표준 편차로서 표시된다. -1일째에, 마우스의 수는 10마리였다. 27일, 41일 및 76일째에 마우스의 수는 9마리였다. 1마리 마우스가 싸우다 죽었다. 104일째에 마우스의 수는 6마리였다. 3마리의 마우스가 병리로 인해 죽었다. 135일째에 마우스의 수는 2 마리였다. 4마리의 마우스가 병리로 인해 죽었다.
도 20은 ACI-35로 면역시킨 마우스에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] 19G 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 13일, 27일, 91일 및 133일째에 ACI-35의 5회 주사를 받고 -1일, 26일, 40일, 75일, 103일, 145일 및 155일째에 출혈되는 TPLH 마우스의 혈청에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] 19G 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 마우스 그룹에서 얻은 O.D.+표준 편차로서 표시된다. -1일 및 26 일째에, 마우스의 수는 10마리였다. 40 일째에 9 마리, 75일째에 6마리, 103일 및 104일째에 4마리, 155일째에 3마리였다. 모든 마우스가 병리로 인해 죽었다.
도 21은 ACI-39로 면역시킨 마우스에서 항-Tau206-221 [pT212, pS214] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 13일, 28일, 91일 및 133일째에 ACI-39의 5회 주사를 받고 -1일, 27일, 41일, 76일, 104일 및 133 일째에 출혈되는 TPLH 마우스의 혈청에서 항-Tau206-221 [pT212, pS214] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 마우스 그룹에서 얻은 O.D.+표준 편차로서 표시된다. -1일, 27일 및 41일째에, 마우스의 수는 10마리였다. 76 일째에 7 마리, 104일째에 6마리, 135일째에 2마리였다. 모든 마우스가 병리로 인해 죽었다.
도 22는 ACI-40으로 면역시킨 마우스에서 항-Tau196-211 [pS202, pT205] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 13일, 28일, 91일 및 133일째에 ACI-40의 5회 주사를 받고 -1일, 27일, 41일, 76일, 104일 및 135 일째에 출혈되는 TPLH 마우스의 혈청에서 항-Tau196-211 [pS202, pT205] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 마우스 그룹에서 얻은 O.D.+표준 편차로서 표시된다. -1일, 27일 및 41일째에, 마우스의 수는 10마리, 76 일째에 8 마리, 104일째에 6마리, 135일째에 5마리였다. 모든 마우스가 병리로 인해 죽었다.
도 23은 ACI-33으로 면역시킨 마우스에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 3회의 ACI-33 면역 후 41일째에 TPLH 마우스의 혈청에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG1, 2a, 2b, 3 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 9마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/200 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) 및 1/100 (IgM)의 희석비에서 불포화 O.D.로서 표시된다.
도 24는 ACI-35로 면역시킨 마우스에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 3회의 ACI-35 면역 후 40일째에 TPLH 마우스의 혈청에서 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b, 3 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 9마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) 및 1/100 (IgM)의 희석비에서 불포화 O.D.로서 표시된다.
도 25는 ACI-39로 면역시킨 마우스에서 항-Tau206-221 [pT212, pS214] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 3회의 ACI-39 면역 후 41일째에 TPLH 마우스의 혈청에서 항-Tau206-221 [pT212, pS214] IgG1, 2a, 2b, 3 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 10마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/200 (IgG2a), 1/200 (IgG2b), 1/100 (IgG3) 및 1/100 (IgM)의 희석비에서 불포화 O.D.로서 표시된다.
도 26은 ACI-40으로 면역시킨 마우스에서 항-Tau196-211 [pS202, pT205] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 3회의 ACI-40 면역 후 41일째에 TPLH 마우스의 혈청에서 항-Tau196-211 [pS202, pT205] IgG1, 2a, 2b, 3 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 10마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/400 (IgG2a), 1/200 (IgG2b), 1/800 (IgG3) 및 1/100 (IgM)의 희석비에서 불포화 O.D.로서 표시된다.
도 27은 ACI-33으로 면역시킨 마우스에서 여러 가지 Tau 펩티드 및 단백질에 대한 IgG 항체 역가를 도시한다. ACI-33의 3회 주사 후 TPLH 마우스의 -1일 및 41일째 혈청에서 IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 9마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차를 나타내는 O.D.로 표시된다.
도 28은 ACI-35로 면역시킨 마우스에서 여러 가지 Tau 펩티드 및 단백질에 대한 IgG 항체 역가를 도시한다. ACI-35의 3회 주사 후 TPLH 마우스의 -1일 및 40일째 혈청에서 IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 9마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차를 나타내는 O.D.로 표시된다.
도 29는 ACI-39로 면역시킨 마우스에서 여러 가지 Tau 펩티드 및 단백질에 대한 IgG 항체 역가를 도시한다. ACI-39의 3회 주사 후 TPLH 마우스의 -1일 및 41일째 혈청에서 IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 10마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차를 나타내는 O.D.로 표시된다.
도 30은 ACI-40으로 면역시킨 마우스에서 여러 가지 Tau 펩티드 및 단백질에 대한 IgG 항체 역가를 도시한다. ACI-40의 3회 주사 후 TPLH 마우스의 -1일 및 41일째 혈청에서 IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 10마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차를 나타내는 O.D.로 표시된다.
도 31은 PBS 주사된 마우스와 비교하여 ACJ-33으로 면역시킨 마우스의 로타로드(Rotarod) 시험 결과를 도시한다. 로타로드 시험은 TPLH의 연령(월)으로 나타낸 5개의 상이한 경우에 대하여 수행되었다.
도 32는 anti- Tau5-20 [pY18] 항체 역가와 로타로드 시험 사이의 상관관계를 도시한다. 상관관계는 7.8 개월 연령의 ACI-33 주사된 마우스에 대하여 측정되었다. 마우스 혈청의 항체 역가는 ELISA (O.D.)에 의해 측정되었고 로타로드 시험 결과는 장치(시간)상에서 지연된 시간-동물을 측정했다.
도 33은 PBS 주사된 마우스와 비교하여 ACI-35로 면역시킨 마우스의 로타로드 시험 결과를 도시한다. PBS 대조군과 비교한 ACI-35로 면역시킨 9.5마리 TPLH 마우스의 로타로드 결과를 도시한다. ACI-35의 경우 5마리였고, PBS의 경우 4마리였는데, 다른 마우스들은 그 모델이 나타낸 병리로 인해 죽었다.
도 34는 ACI-33으로 처리한 누드 및 야생형 마우스에서 FAGS에 의한 CD3+CD4+ 정량 결과를 도시한다. 누드 또는 야생형 마우스 또는 ACI-33을 공급받는 마우스에서 CD3 및 CD4에 대하여 양성으로 염색된 게이트된 세포들의 %를 도시한다. 좌측 패널: 누드 및 야생형 그룹의 2마리 마우스에서 FAC 분석 결과의 개략도. 우측 패널: 각각의 칼럼은 6마리의 그룹에 대한 평균 및 SD를 나타낸다. 마우스 #5 및 #6: 누드 마우스; 마우스 #7 및 #8: 야생형 마우스.
도 35는 ACI-33로 면역시킨 누드 및 야생형 마우스에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 0일, 14일 및 26일째에 ACI-33의 3회 주사를 받고 2일, 7일, 21일, 35일 및 56일째에 출혈되는 누드 및 야생형 마우스의 혈청에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 O.D. + 표준 편차로 표시된다.
도 36은 ACI-33으로 면역시킨 누드 및 야생형 마우스에서 항-Tau5-20 [pY1B] IgG 아형 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 3회의 ACI-33 면역 후 35일째에 누드 및 야생형 마우스의 혈청에서 항-Tau5-20 [pY1B] IgG1, 2a, 2b, 3 및 IgM 항체의 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) 및 1/100 (IgM)의 희석비에서의 O.D.로 표시된다.
도 37은 ACI-33으로 면역시킨 누드 및 야생형 마우스에서 여러 가지 Tau 단백질에 대한 IgG 항체 역가를 도시한다. ACI-33의 3회 주사 후 누드 및 야생형 마우스의 35일째 혈청의 IgG 항체 역가 분석 결과를 도시한다. 결과는 6마리 마우스의 그룹에서 얻은 평균 + 표준 편차를 나타내는 O.D.로 표시된다.
서열번호 1: Tau 379-408 [pS396, pS404]의 아미노산 서열
서열번호 2: 서열 1 (T1): Tau 5-20 [pY18]의 아미노산 서열
서열번호 3: 서열 8 (T8): Tau 206-221 [pT212, pS214]의 아미노산 서열
서열번호 4: 서열 9 (T9): Tau 196-211 [pS202, pT205]의 아미노산 서열
서열번호 5: 서열 3 (T3): Tau 393-408 [(pS396, pS404]의 아미노산 서열
서열번호 6: 서열 4 (T4): Tau 401-418 [pS404, pS409]의 아미노산 서열
서열번호 7: 서열 2 (T2): Tau 200-216 [pS202+pT205 & pT212+pS214]의 아미노산 서열
서열번호 8: 서열 10 (T10): Tau 407-418 [pS409]의 아미노산 서열
서열번호 9: 서열 11 (T11): Tau 399-408 [pS404]의 아미노산 서열
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드 ", "펩티드 ", 및 "단백질"은 상호교환적인 것으로서, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산들로 구성된 생체분자를 의미하도록 정의된다.
용어 "펩티드"는 하나의 아미노산의 알파 탄소의 카르복시기와 또 다른 아미노산의 알파 탄소의 카르복시기 사이의 축합 반응에 의해 형성된 펩티드 결합을 통해 그 알파 탄소들이 결합되어 있는 아미노산(대표적으로는 L-아미노산)의 사슬이다. 그 사슬의 한 말단(즉, 아미노 말단)의 말단 아미노산은 유리 아미노기를 갖는 반면에, 그 사슬의 다른 말단(즉, 카르복시 말단)의 말단 아미노산은 유리 카르복시기를 갖는다. 이와 같은 용어 "아미노 말단" (N-말단으로 약기함)은 그 펩티드의 아미노 말단의 아미노산상의 유리 알파-아미노기를 의미하거나, 그 펩티드의 임의의 다른 위치의 아미노산의 알파-아미노기(펩티드 결합에 관여하는 경우에는 이미노기)를 의미한다. 마찬가지로, 용어 "카르복시 말단" (C-말단으로 약기함)은 그 펩티드의 카르복시 말단의 아미노산상의 유리 카르복시기를 의미하거나, 그 펩티드의 임의의 다른 위치의 아미노산의 카르복시기를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "이의 단편" 또는 "단편"은 본원에서 정의한 펩티드(예를 들어, 서열번호 2 내지 9에서 각각 나타낸 펩티드)와 동일한 (생물학적) 활성을 갖는 기능적 펩티드를 의미한다. 즉, 상기 펩티드는 생명체, 특히 동물, 특히 포유동물 또는 인간에서 매우 특이적인 면역 반응, 특히 형태 특이적인 면역 반응을 여전히 유도할 수 있어서, 아주 효과적이고, 타우병증, 특히 타우병증과 관련이 있는 증상을 예방 또는 완화시킬 수 있는 것이다. 특히, 상기 단편은 본원에서 사용되고 정의되는 바와 같은 타우 펩티드의 특정 병리학적 포스포-에피토프(들)를 여전히 함유한다.
대표적으로, 펩티드를 구성하는 아미노산들은 그 펩티드의 아미노 말단에서 시작하여 그 펩티드의 카르복시 말단을 향한 방향으로 증가하는 순서로 넘버링된다. 따라서, 하나의 아미노산이 또 다른 것의 뒤에 있다고 말하면, 그 아미노산은 이전의 아미노산과 비교하여 그 펩티드의 카르복시 말단에 더욱 가까이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "잔기"는 아미드 결합을 통해 펩티드에 혼입되는 아미노산을 의미한다. 이와 같은 아미노산은 천연 아미노산이거나, 달리 한정하지 않는 경우, 천연 아미노산과 유사하게 작용하는 천연 아미노산의 알려진 유사체(즉, 아미노산 모방물)를 포함할 수 있다. 또한, 아미드 결합 모방물(mimetic)은 당업자에게 잘 알려져 있는 펩티드 골격 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 문구 "본질적으로 구성되는"은 이 문구가 언급되는 펩티드의 본질적을 특성을 실질적으로 변화시키는 임의의 요소를 제외하는 의미로 사용되는 것이다. 따라서, "...로 본질적으로 구성되는 펩티드의 설명은 그 펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키게 되는 임의의 아미노산 치환, 부가 또는 결실은 제외한다.
또한, 당업자는 위에서 언급한 바와 같이, 암호화된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율(대표적으로는 5% 미만, 더욱 대표적으로는 1% 미만)의 아미노산들을 변경, 추가 또는 결실시키는 개개의 치한, 결실 또는 부가는 보존적으로 변형된 변경인데, 그 변경의 결과 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된다는 것을 인식하게 된다. 기능적으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환 테이블은 당업자에게 잘 알려져 있다. 하기의 6개의 그룹들은 각각, 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산들을 함유한다:
1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K);
5) 이소루신 (I),루신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).
문구 "분리된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 천연 상태에서 확인되는 바와 같이 일반적으로 동반되는 유리 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 따라서, 본원에서 기재되는 펩티드는 이의 본래의 환경과 일반적으로 관련이 있는 물질을 함유하지 않는다. 대표적으로, 본원에서 기재되는 분리된 면역원성 펩티드는 은이 염색된 겔 상에서 띠 세기(band intensity)로 측정하였을 때 적어도 약 80% 순수, 보통은 적어도 약 90% 순수, 바람직하게는 적어도 약 95% 순수하다.
단백질 순도 또는 균질성은 단백질의 아크릴아미드 겔 전기영동 및 이후의 염색을 통한 시각화와 같은 당업자에게 알려진 다수의 방법을 통해 확인될 수 있다. 특정 목적을 위하여, 고해상도가 요구될 수 있고 HPLC 또는 이와 유사한 정제 수단이 이용될 수 있다.
면역원성 펩티드는 길이가 비교적 짧기 때문에(즉, 약 50개 아미노산 미만), 흔히 표준 화학적 펩티드 합성 기법을 이용하여 합성된다.
서열의 C 말단이 불용성 지지체에 부착된 다음 그 서열의 나머지 아미노산들이 순차적으로 첨가되는 고체상 합성이 본원에서 기재된 면역원성 펩티드의 화학적 합성을 위한 바람직한 방법이다. 고체상 합성 기법은 당업자에게 알려져 있다.
그렇지 않으면, 본원에 기재된 면역원성 펩티드는 재조합 핵산 방법을 이용하여 합성된다. 일반적으로, 이러한 방법은 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 만들고, 그 핵산 서열을 특정 프로모터의 조절하의 발현 카세트에 위치시키고, 그 펩티드를 숙주에서 발현시키고, 발현된 펩티드 또는 폴리펩티드를 분리하고, 필요한 경우, 그 펩티드를 변성시키는 것을 포함한다. 이러한 과정을 당업자에게 가르치기에 충분한 기법들이 문헌에서 확인된다.
발현되는 경우, 재조합 펩티드는 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비롯한 표준 과정에 따라 정재될 수 있다. 약 50% 내지 95% 균질도의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 80 % 내지 95 % 이상의 균질도가 치료제로서의 용도로 가장 바람직하다.
당업자는 화학적 합성, 생물학적 발현 또는 정제 후, 그 면역원성 펩티드는 그 구성 펩티드의 천연 형태와 실질적으로 상이한 형태를 가질 수 있다는 것을 인식하게 된다. 이러한 경우, 그 항증식성 펩티드를 변성 또는 환원시킨 다음, 그 펩티드를 바람직한 형태로 다시 접는 것이 흔히 필요하다. 단백질을 환원 또는 변성시키고 재접힘을 유도하는 방법들이 당업자에게 알려져 있다.
그 정제된 단백질의 항원성은 예를 들어, 면역 혈청과의 반응 또는 그 단백질 자체에 대하여 생성된 항혈청과의 반응을 확인함으로써 확인될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "a", "an" 및 "the"는 하나 이상을 의미하고 그 문맥이 부절절하지 않은 경우 복수를 포함하도록 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "검출하는" 또는 "검출된"은 면역학적 또는 조직학적 방법과 같은 생물학적 분자의 검출을 위한 알려진 방법을 사용하는 것을 의미하고, 그 연구중인 생체분자의 존재 또는 농도를 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 것을 의미한다.
"분리된"이란 자연적으로 발생하는 상분들 중 적어도 일부가 없는 생물학적 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체", "항체들" 또는 "이의 기능적 부분"은 당업계에서 인식된 용어로서, 알려진 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편, 특히 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 면역 특이적으로 결합하는 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 면역글로불린은 면역글로불린 분자의 임의의 유형(IgG, IgM, IgO, IgE, IgA 및 IgY) 또는 부류 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 아류에 속할 수 있다.
"항체"는 모노클로날 항체, 폴리클로날, 키메라, 단쇄, 이중특이성, 유인원화, 인간 및 인간화 항체 외에도 이의 활성 단편을 포함하는 것으로 본 발명의 범위에서 의도된다. 알려진 항원에 결합하는 분자의 활성 단편의 예로는 Fab 면역글로불린 발현 라이브러리 및 전술한 항체 및 단편들 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 비롯하여 Fab 및 F(ab')2이 있다. 이러한 활성 단편들은 다수의 기법을 이용하여 본 발명의 항체로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 정제된 모노클로날 항체는 펩신과 같은 효소로 절단되고, HPLC 겔 여과를 받을 수 있다. 다음에, Fab 단편을 함유하는 적절한 수집되고 막 여과 등을 통해 농축될 수 있다. 항체의 활성 단편의 분리를 위한 일반적인 기법의 추가의 설명에 대하여는 예를 들어 다음문헌[Khaw, B. A et al, J. NucL Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al., Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986]을 참조한다.
"인간화 항체"는 비인간 제공자의 면역글로불린 유래의 CDR들을 갖는 일종의 조작된 항체를 의미하는 것으로서, 그 분자의 나머지 면역글로불린 유래 부분들은 하나 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래된다.
또한, 인간화 항체는 그의 골격 영역들 중 하나 이상의 영역이 인간 또는 영장류의 아미노산을 갖고 있는 가변 영역을 갖는 항체를 추가로 의미할 수 있다. 게다가, 골격 지지체 잔기들은 결합 친화성을 보존하도록 변형될 수 있다. "인간화 항체"를 얻기 위한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991) 참조).
또한, 인간화 항체는, 예를 들어 토끼와 같은 거대 동물에서 친화성-성숙된 인간적인 폴리클로날 항체의 제조를 가능하게 하는 신규한 유전자 조작 접근방법을 이용하여 얻어질 수도 있다(http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).
또한, 용어 "모노클로날 항체"는 당업계에서 잘 인식되어 있는 용어로서, 단일 클론 유래의 라이브러리에서 대량으로 제조되고 하나의 항원만을 인식하는 항체를 의미한다. 대표적으로, 모노클로날 항체는 일반적으로 짧게 생존하는 항체 생성 b 세포를 암세포(때때로 "불멸 세포"라고함)와 같은 급속 성장 세포에 융합시킴으로써 제조된다. 얻어지는 잡종 세포 또는 하이브리도마는 급속히 증식하여, 다량의 항체를 생성하는 클론을 만든다.
용어 "항원"은 생명체, 특히 동물, 더욱 특히 인간을 비롯한 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 실체 또는 이의 단편을 의미한다. 이러한 용어는 항원성 또는 항원 결정기의 원인이 되는 면역원 또는 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "가용성"(soluble)은 수용액에 부분적으로 또는 완전히 용해되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성"은 면역원성 작용제에 대한 항체, T 세포 및 기타 반응성 면역 세포의 생성을 유도 또는 강화하고 인간 및 동물에서의 면역 반응에 기여하는 물질을 의미한다.
면역 반응은 개체가 본 발명의 투여된 면역원성 조성물에 대한 충분한 항체, T 세포 및 기타 반응성 면역 세포를 생성하여 치료하고자 하는 장애를 완화시키는 경우에 발생한다.
용어 "하이브리도마"는 당업계에서 인식된 용어로서, 항체 생성 세포와 불멸 세포, 예를 들어 다발성 골수종 세포의 융합을 통해 생성되는 세포를 의미하는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 이러한 잡종 세포는 항체의 연속적인 공급물을 생성할 수 있다. 융합 방법의 더욱 상세한 설명에 대하여는 상기의 "모노클로날 항체"의 정의 및 하기의 실시 예들을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "담체"는 항원 펩티드 또는 초분자 구조물이 혼입될 수 있거나 결합됨으로써, 인간 또는 동물의 면역계에 항원 펩티드 또는 그 펩티드의 일부를 제시 또는 노출시킬 수 있는 구조를 의미한다. 인간 또는 동물 치료에 적당히 사용될 수 있는 임의의 입자, 예를 들어, 소포체, 입자 또는 미립자가 본 발명에서 항체로 사용될 수 있다.
용어 "담체"는 항원 펩티드를 포함하는 초분자 항원 구조물 조성물이 전달 기구를 통해 원하는 부위로 운반될 수 있는 전달 방법을 추가로 포함한다. 이러한 전달 시스템의 일례는 콜로이드성 금과 같은 콜로이드성 금속을 이용한다.
본 발명의 초분자 항원 구조물 조성물에서 사용될 수 있는 담체 단백질로는 말토오스 결합 단백질(MBP), 우혈청 알부민(BSA), 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 오발부민, 플라젤린(flagellln), 티로글로불린, 임의의 종의 혈청 알부민, 임의의 종의 감마 글루불린, 동계 세포(syngeneic cell), la 항원을 갖는 동계 세포, D- 및/또는 L-아미노산이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 "초분자 항원 구조물 조성물"에 있어서, 리포좀은 전술한 바와 같이 초분자 구조물을 포함하는 담체로 사용될 수 있는 동시에, 본 발명에 따른 치료 백신으로 치료하고자 하는 표적 동물 또는 인간에서 면역 반응을 증가 또는 자극하기 위한 애주번트로 작용할 수 있는 이중 기능을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 초분자 항원 구조물 조성물은 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 우혈청 알부민(BSA) 및 기타 애주번트, 예를 들어 지질 A, 명반, 인산칼슘, 인터루킨 1, 및/또는 다당류 및 단백질의 마이크로캡슐, 특히 해독된 지질 A, 예를 들어 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A, 또는 명반을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가의 애주번트, 추가의 보존제, 희석제, 유화제, 안정화제, 및 알려져 있고 종래 기술의 백신에서 사용된 기타 성분들을 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 또한, 당업계에 알려진 임의의 애주번트 계가 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있다. 이러한 애주번트로는 프로인트 불완전 애주번트, 프로인트 완전 애주번트, 다분산된 β-(1,4) 결합 아세틸화 만난 ("Acemannan", TITERMAX®(CytRx사로부터 입수가능한 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 애주번트), Chiron사로부터 입수가능한 변형 지질 애주번트, Cambridge Biotech로부터 입수가능한 사포닌 유도체 애주번트, 사멸 백일해균(Bordetella pertussis ), 그램 음성 세균의 리포다당체(LPS), 황산 덱스트란과 같은 거대한 중합체성 음이온, 명반, 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄과 같은 무기 겔이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 용어 "유효량"은 인간 또는 동물에게 투여 시 면역 반응을 유도하는 항원 면역원성 조성물의 양을 의미한다. 상기 유효량은 통상적인 과정에 따라 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "면역 관용 환자"(immune tolerant patient)는 항원, 특히 비자가 항원, 특히 새로운 항원, 예를 들어, 새로이 발생하는 질병에 존재하는 새로운 항원에 대하여 제한된 반응 능력을 나타내는 동물 또는 인간 환자를 의미한다. 이러한 제한은 CD4+ T 세포의 역연령에 부분적으로 기인할 수 있다. 또한, "면역 관용 환자"는 회상 반응(recall response) 동안 기억 T 세포의 증식 및 시토카인 분비의 결함으로 인해 항원 노출에 대한 장기간 CD4+ T 세포 반응의 손상을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 빛-세포 활성화된 환자"는 T-세포 활성화를 나타내고 T-세포 반응의 추가의 자극이 의학적 위험을 일으키게 되는 동물 또는 인간 환자를 의미한다.
본원에서 사용되는 "면역저하 환자"(immunocompromised patient)는 연령, HIV와 같은 질병 또는 암에 의해 손상되거나, 류머티스성 관절염, 건선, 전신성 홍반성 낭창, 베게너 육아종증을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증성 질환에 대한 치료와 같은 치료에 의해 손상되어진 면역계를 갖는 동물 또는 인간 환자를 의미한다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명에 따른 항원 조성물에 대한 항체 유도 반응은 광범위하게 T-세포 비의존적인 것으로 확인되었다. 이러한 측면에서 누드 마우스 모델이 사용되었고, 누드 마우스를 백신접종하고 그 면역화된 누드 마우스에서 본 발명에 따른 항원 조성물에 의해 유도된 A β특이적 항체 반응을 평가하기 위해 항체 반응이 측정되었다. 그 누드 마우스는 Foxrrlnu 돌연변이를 가지므로, 적당한 흉선의 결핍으로 인해 감소된 T-세포 기능을 가졌다.
본원에서 사용되는 "약학적 유효량"은 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 상태의 증상 또는 이와 관련된 임의의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 약학적 조성물 내의 유효 성분의 투여량을 의미한다.
특정 구체예에서, 본 발명은, 특히 리포좀과 같은 담체 분자에의 항원 제시를 이용하여, 바람직한 항원 형태의 노출 및 안정화를 강화하여, 궁극적으로 아주 특이적인 면역 반응, 특히 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하고, 독특한 특성을 갖는 항체를 생성한다.
특히, 항원 펩티드는 아주 반복적인 배열, 특히 담체 분자당 적어도 10개의 항원 단위체, 특히 담체 분자당 적어도 50개의 항원 단위체, 특히 담체 분자당 적어도 100개의 항원 단위체, 특히 담체 분자당 적어도 200개의 항원 단위체, 특히 담체 분자당 적어도 300개의 항원 단위체, 특히 담체 분자당 적어도 400개의 항원 단위체, 특히 담체 분자당 적어도 500개의 항원 단위체를 포함하는 반복적인 배열로 담체 분자의 표면에 제시된다.
본 발명에 따르고 본원에 개시된 바와 같은 변형된 포스포-펩티드 항원, 특히 타우 단백질의 주요한 병리학적 포스포-에피토프를 모방하는(mimicking) 포스포-펩티드 항원은 다음문헌[Nicolau et al., (2002) Proc Natl. Acad. Sci USA 99, 2332-2337]에 보고된 변형 방법에 따라 합성될 수 있다. 이러한 접근 방법은 표준 Fmoc/tBu 화학적 방법을 이용하여 아미드 수지상에 고체상 펩티드 합성에 의해 상기 구조물을 단계적으로 조립하는 것을 포함한다. 다음에, 그 말단 리신의 직교 보호기들을 제거했고, 그 유리 아미노기를 팔미트산으로 아실화했다. 상기 측쇄 보호기를 제거하는 동시에 그 수지로부터 펩티드를 방출하는 것은 산성 조건하에서 달성됨으로써, 원하는 테트라팔미토일화 포스포-펩티드가 미정제 생성물로서 제공되었다.
이와 같이, 최종 생성물이 고순도로 얻어질 수 있고 이의 정체 및 순도는 전기분무 질량 분광분석 및/또는 HPLC 분석과 같은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 타우 단백질의 주요한 병리학적 포스포-에피토프를 모방하는 펩티드 항원으로서 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 포스포-펩티드 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하는데, 상기 펩티드 항원은 상기 항원의 원하는 형태를 유지 및 안정화할 수 있도록 변형되어 있다. 이러한 원하는 형태로 인해, 동물 또는 인간에로의 도입 시 강하고 아주 특이적인 면역 반응이 유도된다.
상기 항원 단백질의 원하는 형태의 형성 및 안정화를 달성하는 한 가지 방법은 담체, 특히 애주번트로서도 작용할 수 있는 담체에 부분적으로 또는 완전히 부착되었거나 혼입 또는 재구성된 항원 펩티드를 제시하는 것이다.
본 발명의 범위 내에서 생각될 수 있는 담체는, 예를 들어, 소포체, 미립자체 또는 분자, 세균막 단백질, 장내 세균의 Omp 단백질, 나노입자, 미셀, 금입자, 마이크로비드 및/또는 비로좀이거나, 항원 펩티드에 대한 담체/애주번트로서 적당히 작용할 수 있는 임의의 다른 수단, 특히 리포좀이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 항원 펩티드는, 예를 들어 반 데르 발스, 소수성 또는 정전기적 상호작용, 또는 상기 상호작용 중 둘 이상의 조합과 같은 약한 상호작용을 통해 담체에 부착되거나 또는 담체내로 혼입 또는 재구성되어, 상기 항원 펩티드를 3차원적 이동으로 제한하여 형태적 변화가 방지 또는 심하게 제한되도록 함으로써 유지 및 안정화되는 특정 형태가 상기 펩티드에 제시된다.
소포체, 입자 또는 미립자체가 리포좀과 같은 담체/애주번트로 사용되는 경우, 항원 펩티드의 조성은 그의 전체 순전하가 그 펩티드가 부착되는 담체/애주번트 표면의 전하와 동일하도록 선택될 수 있다. 동일하게 대전된 담체/애주번트와 항원 펩티드의 사이, 특히 동일하게 대전된 담체 표면과 항원 펩티드를 구성하는 아미노산 잔기의 사이, 더욱 특히 동일하게 대전된 담체 표면과 항원 펩티드에 포함된 동일하게 대전된 아미노산의 사이의 정전기적 반발력은 그 항원 펩티드가, 높은 생물학적 활성을 확보하는 한정되고, 아주 특이적이고 안정화된 형태를 취할 수 있도록 한다. 따라서, 그 항원 펩티드는 표적 생명체의 면역계가 생물학적 활성 형태의 항원 구조물에 포함된 항원 결정기와 자유롭게 접촉하도록 할 수 있도록 생물학적으로 높은 활성이 있는 형태로 노출 및 제시되어, 동물 또는 인간에게 투여 시, 강하고 형태 특이적인 면역 반응을 유도하여, 상기 표적 생명체에서 예를 들어 높은 항체 역가를 유도한다.
그 면역원성 반응은 본 발명에 따른 약학적 조성물로 치료하고자 하는 표적 또는 인간 내에서 면역 반응을 증가 또는 자극할 수 있는 애주번트로서 작용할 수 있는 리포좀을 담체로 이용함으로써 더욱 증가될 수 있다. 임의적으로, 상기 리포좀은 추가의 애주번트, 예를 들어, 지질 A, 명반, 인산칼슘, 인터루킨 1, 및/또는 다당체의 마이크로캡슐, 특히 해독된 지질 A, 예를 들어 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A, 또는 명반을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 항원 펩티드, 특히 그 전체 순전하가 음성인 항원 펩티드는, 리포좀, 특히 리포좀 헤드기(head group)의 전체 순전하가 음성이도록 그 구성성분들이 선택되는 리포좀에서 재구성된 상태로 사용된다. 특히, 상기 리포좀은 디미리스토일 포스파티딜 콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPEA), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤 (DMPG) 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 성분들로 구성되고, 모노포스포릴 지질 A, 또는 본 발명의 범위 내에서 적당히 사용될 수 있는 임의의 다른 애주번트, 예를 들어 명반, 인산칼슘, 인터루킨 1, 및/또는 다당체 및 단백질의 마이크로캡슐을 임의적인 성분으로서 추가로 함유한다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따르고 전술한 바와 같은 변형된 항원 펩티드는, 담체/애주번트에 삽입하여 그 담체/애주번트에 펩티드를 고정하고 담체/애주번트 분자의 표면상에 또는 그에 근접하게 그 펩티드를 제시하여 그 정전기력이 전술한 바와 같이 효과적이도록 할 수 있는 앵커-타입 분자에 공유 결합된 상태로 제공된다.
리포좀이 담체/애주번트로서 사용되는 경우, 일반적으로 그 항원 펩티드 구조물은 형성됨에 따라 리포좀 막에 삽입되는 소수성 꼬리를 갖는다. 게다가, 항원 펩티드는 소수성 꼬리를 함유하도록 변형되어 리포좀에 삽입될 수 있도록 할 수 있다.
특히, 본 발명의 항원 조성물은 항원 효과를 강화하도록 변형된 펩티드를 포함하는데, 이러한 펩티드는 페길화(pegylation)(폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜을 이용)를 통해 변형되거나, 전술한 바와 같은 팔미트산, 폴리아미노산(예를 들어, 폴리글리신, 폴리히스티딘), 다당체(예를 들어, 폴리갈락투론산, 폴리락트산, 폴리글리콜라이드, 키틴, 키토산), 합성 중합체(폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에스테르), 또는 공중합체(예를 들어, 폴리(메타크릴산) 및 N-(2-히드록시)프로필 메타크릴아미드) 등을 이용한 다른 방법을 통해 변형될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 리포좀에 삽입될 수 있도록 소수성 꼬리를 함유하도록 변형되는 본 발명에 따르고 전술한 바와 같은 항원 펩티드가 제공된다. 특히, 단백질의 주요한 포스포-에피토프를 모방하는 것으로 본 발명에 따르고 본원에서 기재한 바와 같은 포스포-펩티드 항원은 담체/애주번트의 지질 이중층에의 삽입을 용이하게 하는 친유성 또는 소수성 부분에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 친유성 또는 소수성 부분은 지방산, 트리글리세리드 및 인지질, 지방산, 탄소 골격이 적어도 10개의 탄소수를 갖는 지방산, 트리글리세리드 및 인지질, 특히 적어도 약 14개의 탄소수 및 약 24개까지의 탄소수의 탄소 골격을 갖는 친유성 부분인데, 이러한 범위에 속하는 각각의 탄소 원자수도 본 발명의 일부이다. 특히, 본 발명은 소수성 꼬리, 특히 적어도 14개 탄소수, 특히 16개 탄소수의 탄소 골격을 갖는 소수성 부분을 포함하는 소수성 꼬리를 함유하도록 변형되는 것으로, 본 발명에 따르고 전술한 바와 같은 항원 펩티드에 관한 것이다. 소수성 부분의 예로는 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산 및 콜레스테롤 또는 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DSPE)이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 소수성 부분은 팔미트산이다.
일 구체예에서, 본 발명에 따르고 본원에 기재한 바와 같은 항원 펩티드는 상기 친유성 또는 소수성 부분에 공유 결합된다. 본 발명에 있어서, 상기 항원 펩티드의 공유 결합은, 그의 말단(들), 특히 그의 N- 및 C-말단(들)에서, 본 발명에 따른 항원 펩티드의 서열에 해당하는 아미노산 서열을 연장시키고 지방산 잔기가 결합되는 아미노산 잔기에 의해 매개될 수 있다.
특히, 각각의 결합체(conjugate)는 12 내지 14 탄소수의 탄소 사슬, 특히 16 탄소수의 탄소 사슬을 함유하는 지방산의 적어도 4개 분자를 포함하는데, 상기 지방산 분자는 상기 항원 펩티드의 N- 및 C-말단에 공유 결합되어 있다. 상기 아미노산 서열에 포함되는 다른 분포도 상상될 수 있다. 또한, 이러한 펩티드는 상기 지방산 분자에 공유 결합된다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따르고 본원에 기재한 바와 같은 정제되거나 부분적으로 정제되거나 변형된 항원 펩티드의 존재하에서 리포좀을 재구성함으로써 제조한 리포좀을 포함할 수 있다. 게다가, 펩티드 단편은 리포좀내에 재구성될 수 있다. 또한, 본 발명은 그의 항원성을 증가시키도록 변형된 항원 펩티드 단편을 포함한다. 예를 들어, 항원 단편 및 애주번트는 그 펩티드에 부착되거나 그와 혼합될 수 있다. 항원 부분 및 애주번트의 예로는 친유성 뮤라밀 디펩티드 유도체, 비이온성 블록 중합체, 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄, 및 이들의 혼합물이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 리포좀으로는 당업자에게 알려진 것들이 있다. 리포좀을 제조하는데 유용한 표준 지질들 중 임의의 것을 이용할 수 있다. 표준 이층 또는 다층 리포좀을 사용하여 본 발명의 조성물을 제조할 수 있다. 당업자에게 알려진 리포좀을 제조하는 임의의 방법을 사용할 수 있지만, 가장 바람직한 리포좀은 본원에 참조로 포함되는 다음문헌[Alving et al., Infect . Immun . 60:2438-2444, 1992]의 방법에 따라 제조된다. 리포좀은 애주번트 또는 면역조절제 또는 둘 모두를 임의적인 성분으로서 함유할 수 있다. 바람직한 면역조절제는 지질 A, 특히 해독된 지질 A, 예를 들어 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A이다.
리포좀은 예를 들어 다음문헌[Wagner et al (2002) Journal of Liposome Research Vol 12(3), pp 259-270]에 기재된 바와 같은 교차흐름 주입 기법(crossflow injection technique)에 의해 제조될 수 있다. 수성 완충계내로 지질 용액의 주입 동안에, 지질은 "침전"을 형성한 다음 소포체에서 자체 배열되려는 경향이 있다. 얻어지는 소포체 크기는 지질 농도, 교반 속도, 주입 속도, 및 선택된 지질의 종류와 같은 인자에 의존한다. 그 제조 장치는 교차 흐름 주입 모듈, 극성 상(예를 들어, PBS 완충 용액)을 위한 용기, 에탄올/지질 용액 용기 및 압력 장치, 특히 질소 압력 장치로 구성될 수 있다. 수용액 또는 극상 용액이 교차 흐름 주입 모듈을 통해 펌핑되는 때, 다양한 압력이 인가되면서 에탄올/지질 용액이 주입된다.
일 구체예에서, 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 변형된 항체는 인지질 및 콜레스테롤(포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤)로 구성되는 리포좀내로의 재구성을 통해 변형될 수 있는데, 콜레스테롤은 다양한 몰비로 사용된다. 다른 인지질을 이용할 수도 있다. 지질 A는 인지질 1 mole 당 40 ㎍의 농도로 사용된다. 상기 리포좀은 전술한 바와 같이 초분자 구조물을 포함하는 담체로 사용될 수 있는 동시에, 본 발명에 따른 치료 백신으로 치료하고자 하는 표적 동물 또는 인간에서 면역 반응을 증가 또는 자극하기 위한 애주번트로 작용할 수 있는 이중 기능을 가질 수 있다. 임의적으로, 상기 리포좀은 추가의 애주번트 또는 면역조절제 또는 둘 모두, 예를 들어 지질 A, 명반, 인산칼슘, 인터루킨 1, 및/또는 다당체 및 단백질의 마이크로캡슐, 특히 지질 A, 더욱 특히 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A와 같은 해독된 지질 A, 또는 명반을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 지질 A를 갖는 리포좀이 본 발명의 약학적 조성물을 제조하기 위한 애주번트로 사용된다. 디미리스토일포스파티딜-콜린, -글리세롤 및 -콜레스테롤은 특히 9:1 :7의 몰비로 혼합된다. 다음에, 모노포스포릴 지질 A와 같은 강한 면역조절제가 적당한 농도, 특히 인지질 1 mmol 당 20 mg 내지 50 mg의 농도, 더욱 특히 인지질 1 mmol 당 30 mg 내지 40 mg의 농도로 첨가된다. 다음에, 상기 변형된 항원 펩티드가 1:30 내지 1:200, 특히 1:50 내지 1:120, 더욱 특히 1:100의 펩티드 대 인지질의 몰비로 인지질에 첨가된다. 용매는 예를 들어 증발을 통해 제거되고, 얻어지는 막은 PBS와 같은 멸균 완충 용액을 이용하여 수화된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 항원 펩티드는 이의 N- 및 C-말단에 공유 결합된 팔미트산의 적어도 2 분자에 의해 변형되거나 리포좀 담체내로의 재구성을 통해 변형된 상태로 제공된다.
팔미토일화(palmitoylation)는 C16 :0 지방산 부분의 비교적 감소된 길이로 인해 리포좀 이중층에서 펩티드에 대한 앵커를 제공하면서 그 펩티드가 리포좀 표면에 노출되거나 또는 그에 아주 근접하게 노출된 상태로 제시되도록 한다.
본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 항원, 특히 타우 단백질의 주요한 병리학적 포스포-에피토프를 모방하는 포스포-펩티드를 약학적 유효량으로 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 액체 용액 또는 주사가능한 현탁액의 형태, 또는 그렇지 않으면, 후술하는 바와 같이 본 발명을 이용하기 위한 키트에서 주입 전에 가용성화하기에 적당한 고체 형태로 제조될 수 있다.
적당한 약학적 담체, 희석제 및/또는 부형제는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 인산염 완충 식염액, 물, 수중유 에멀션과 같은 에멀션, 여러 가지 형태의 습윤제, 멸균 용액 등이 포함된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형화는 당업계에 잘 알려진 표준 방법에 따라 달성될 수 있다.
본 발명에 따르고 본원에서 기재한 바와 같은 펩티드 항원, 특히 타우 단백질의 주요한 병리학적 포스포-에피토프를 모방하는 포스포-펩티드를 약학적 유효량으로 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 타우병증, 특히 타우병증과 관련이 있는 증상으로 고생하는 인간 또는 동물에게 투여되어 상기 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도하여 상기 질병과 관련이 있는 증상을 완화하거나 상기 질병에 걸리지 않은 건강한 개체에서 확인되는 상태를 회복할 수 있다.
본 발명의 조성물은 적당한 약학적 유효량으로 고체, 액체 또는 에어로졸의 형태로 임의의 적절한 표준 투여 경로를 통해 인간 또는 동물에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물은 국소, 경구, 직장, 비내 또는 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하 또는 근육내) 경로로 투여될 수 있다. 게다가, 상기 조성물은 생분해성 중합체와 같은 지속 방출 매트릭스에 혼입될 수 있는데, 상기 중합체는 전달이 요구되는 곳의 근처, 예를 들어 종양 부위에 이식된다. 그 투여 방법은 단일 투여량의 투여, 예정 시간 간격으로 반복 투여량의 투여, 및 예정 시간 동안의 지속 투여를 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 항원 구조물, 특히 약학적으로 허용가능한 형태의 상기 항원 구조물을 포함하는 백신 조성물은 1 주 내지 20 주의 시간 간격, 특히 1 주 내지 10주의 시간 간격, 특히 1주 내지 6 주의 시간 간격, 더욱 특히 1주 내지 4주의 시간 간격, 더 더욱 특히 2 주 내지 3주의 시간 간격으로, 반복 투여, 특히 1 내지 15회, 더욱 특히 2 내지 10회, 더욱 특히 3 내지 5회, 더 더욱 특히 3회 반복 투여된다. 면역계는 추가접종(boosting) 후 적당한 시기, 특히 추가 접종 후 3 내지 10일, 더욱 특히 추가 접종 후 4 내지 8일, 더욱 특히 추가접종 후 7일째에 혈청/혈장 시료를 채취하고, 당업자에게 알려진 방법, 특히 ELISA 분석법과 같은 일반적으로 사용되는 면역분석법들 중 하나의 방법을 이용하여 항원 구조물의 면역원성을 측정함으로써 모니터링될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 항원 펩티드 조성물은 비경구, 특히 복막내, 정맥내, 피하 및 근육내 주사를 통해 투여된다.
비경구 투여용 제제로는 멸균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 에멀션이 있다. 비수성 용매로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르가 있으나 이에 제한되지 않는다. 수성 용매는 물, 알코올/수용액, 에멀션, 또는 식염수 및 완충 매질을 비롯한 현탁액으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 비경구용 담체(parenteral vehicle)로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산화 링거, 또는 고정 오일이 있다. 정맥내 투여용 담체로는 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물(예를 들어 링거 덱스트로스에 기반한 것들) 등이 있다. 또한, 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 보존제가 존재할 수도 있다.
상기 조성물의 투여량은 치료되는 상태, 사용된 조성물의 종류, 및 환자의 체중, 크기 및 상태, 신체 표면적, 투여될 화합물 및 조성물의 종류, 동시 투여되는 다른 약물, 및 투여 경로와 같은 다른 임상적 인자들에 의존하게 된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 질병, 특히 신경변성 질환의 치료를 위해 다른 생물학적 활성 물질과 함께 투여될 수 있다. 상기 다른 생물학적 활성 물질은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 혼합물의 형태로 이미 포함하는 동일 조성물의 일부일 수 있는데, 본 발명의 약학적 조성물 및 다른 생물학적 활성 물질은 동일한 약학적으로 허용가능한 용매 및/또는 담체에서 서로 혼합되거나 그와 혼합되고, 별개로 제공되거나 또는 부분들로 이루어진 키트의 형태로 일제히 제공될 수 있는 별개의 조성물의 일부로서 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 다른 생물학적 활성 물질과 동시에, 간헐적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 제1의 추가의 생물학적 활성 물질과 동시에 투여될 수 있거나 상기 약학적 조성물의 투여 후 또는 전에 연속하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 물질이 본 발명에 따른 적어도 하나의 약학적 조성물과 함께 투여되는 적용 방법이 선택되는 경우, 그 화합물들 또는 물질들은 동시에 부분적으로 투여될 수 있거나 또는 여러 가지 조합으로 부분적으로 연속하여 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야곱병, 투사형 치매, 다운 증후군, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커(Gerstmann-Straussler-Scheinker)병, 봉입체 근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증 및 외상성 뇌손상을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병 또는 장애, 및 괌(Guam)의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유 농축체를 갖는 비괌의 운동 뉴런 질환(Non-Guamanian motor neuron disease), 호은성 그레인 치매(argyrophilic grain dementia), 피질기저핵 변성, 석회화를 갖는 확산 신경섬유 농축체, 염색체 17에 연결된 파킨슨병을 갖는 전측두엽 치매, 할러보든-슈파쯔 증후군(Hallervorden-Spatz Syndrome), 다발성 신경계 위축증, C형 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 피크병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 상핵 범뇌염(progressive supranuclear panencephalitis), 아급성 경화성 범뇌염, 신경섬유 농축체 단독치매(Tangle only dementia), 뇌염후변성 파킨슨병, 근육퇴행 위축이 있으나 이에 제한되지 않는 질병 또는 장애를 포함하는 신경변성 질환 또는 장애의 그룹에서 두드러진 뇌 병리인 신경섬유 병변의 형성과 관련이 있는 질병 및 장애의 그룹인 타우병증의 영향을 예방 및/또는 치료 및/또는 완화시키기 위한 본 발명에 따른 조성물과 임의적인 한 종 이상의 추가의 생물학적 활성 물질들의 혼합물을 제공하는 외에도, 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 상기 약학적 조성물을 포함하는 조성물들을 포함하는 혼합물을 사용하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명에 따른 혼합물은 본 발명에 따른 약학적 조성물 외에도, 예를 들어, 알쯔하이머병에 관여하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 β단백질과 같은 아밀로이드 유사 단백질과 관련이 있는 질병 또는 장애의 그룹인 아밀로이드증 및/또는 타우병증의 약물에서 사용되는 알려진 약물과 같은 생물학적 활성 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 다른 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 아밀로이드 β 단백질에 의해 유발되는 아밀로이드증을 비롯한 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 단백질과 관련이 있거나 그에 의해 유발되는 질병 및 장애의 치료에 사용될 수 있거나 다른 신경학적 장애의 약물에 사용될 수 있는 치료제일 수도 있다.
상기 다른 생물학적 물질 또는 화합물은 본 발명에 따른 치료 백신과 동일 또는 유사한 기작에 의해 또는 무관한 작용 기작에 의해 또는 다수의 관련 및/또는 무관한 작용기작에 의해 그의 생물학적 효과를 나타낼 수 있다.
일반적으로, 상기 다른 생물학적 활성 화합물은 신경전달 강화제, 정신과용 약물, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 칼슘 채널 차단제, 생원성 아민, 벤조디아제핀 신경안정제, 아세틸콜린 합성, 저장 또는 방출 강화제, 아세틸콜린 시냅스후 수용체 작동약, 모노아민 옥시다제-A 또는 -B 억제제, N-메틸-D-아스파르테이트 글루타메이트 길항약, 비스테로이드성 항염증약, 항산화제, 및 세로토닌 수용체 길항약을 포함할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 혼합물은 산화 스트레스에 대한 화합물, 항-세포사멸 화합물, 금속 킬레이트제, DNA 복구 억제제, 예를 들어, 피렌제핀 및 대사산물, 3-아미노-1-프로판설폰산(3APS), 1,3-프로판디설포네이트 (1,3-PDS), 시크리타제 억제제, β- 및 γ-시크리타제 억제제, 타우 단백질, 신경전달물질, β-시이트 브레이커(sheet breaker), 항염증성 분자, 또는 콜린에스테라제 억제제 (ChEI), 예를 들어 타크린(tacrine), 리바스티그민(rivastigmine), 도네페질(donepezil) 및/또는 갈란타민, 및 기타 약물 및 영양 보조제로 이루어진 군에서 선택된 적어도 한 종의 다른 생물학적 활성 화합물을, 본 발명에 따른 치료 백신 및 임의적인 성분으로서 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함할 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명에 따른 혼합물은 니아신(niacin) 또는 메만틴(memantine)을 본 발명에 따른 치료 백신 및, 임의적인 성분으로서, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 환각, 망상, 사고 장애(두드러진 모순된 사고, 사고이탈에 의해 나타남), 및 기괴하거나 지리멸렬한 행동을 포함하는 양성 및 음성 정신 증상 외에도, 무쾌감증, 평평한 정서, 무관심 및 사회적 위축의 치료를 위한 비정형 항정신성 약물, 예를 들어, 클로자핀, 지프라시돈, 리스페리돈, 아리피프라졸 또는 올란자핀을, 본 발명에 따른 치료 백신 및, 임의적인 성분으로서, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함하는 혼합물을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명에 따르고 전술한 바와 같은 조성물 및 혼합물은 본 발명에 따른 약학적 조성물 및 상기 생물학적 활성 물질을 각각 치료적 및 예방적으로 유효한 양으로 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물과 함께 적당히 사용될 수 있는 다른 화합물들이 예를 들어 WO 20041058258 (특히 pages 16 및 17 참조)에 기재되어 있는데, 이러한 WO 20041058258는 치료약물 표적 (pages 36-39), 알칸설폰산 및 알카노설폰산(pages 39~51), 콜린에스테라제 억제제(pages 51-56), NMDA 수용체 길항약 (pages 56-58), 에스트로겐(pages 58-59), 비스테로이드성 항염증약 (pages 60-61), 항산화제 (pages 61-62), 퍼옥시솜 증식인자 활성화 수용체 (PPAR) 작동약(pages 63-67), 콜레스테롤 저하제 (pages 68-75), 아밀로이드 억제제(pages 75-77), 아밀로이드 형성 억제제 (pages 77-78), 금속 킬레이트제(pages 78-79), 항정신병약물 및 항우울제 (pages 80-82), 영양 보충제(pages 83-89), 및 뇌에서 생물학적 활성 물질의 생체내이용률을 증가시키는 화합물(see pages 89-93) 및 프로드러그(pages 93 and 94 )를 포함하며, 상기 특허 문헌은 특히 상기에 나타낸 페이지들에서 언급된 화합물들에 대하여 본원에 참조로 포함된다.
실시 예
실시 예 1: 백신
인산화 타우 단백질 유래의 8개의 서열을 백신 개발을 위한 항원으로 디자인했다. 예전에 사용된 면역원성 펩티드를 대조군로 사용했다 (Asuni et al., 2007).
설명 백신 서열
T5: 조절서열: Tau 393-408 [(pS396, pS404] ACI-37
Figure pat00001

(서열번호 1)
T1: 서열 1: 1 (T1): Tau 5-20 [pY18] ACI-33
Figure pat00002

(서열번호 2)
T8: 서열 8: (T8): Tau 206-221 [pT212, pS214] ACI-39
Figure pat00003

(서열번호 3)
T9: 서열 9: Tau 196-211 [pS202, pT205] ACI-40
Figure pat00004

(서열번호 4)
T3: 서열 3: Tau 393-408 [(pS396, pS404] ACI-35
Figure pat00005

(서열번호 5)
T4: 서열 4: Tau 401-418 [pS404, pS409] ACI-36
Figure pat00006

(서열번호 6)
T2: 서열 2: Tau 200-216 [pS202+pT205 & pT212+pS214] ACI-34
Figure pat00007

(서열번호 7)
T10: 서열 10: Tau 407-418 [pS409] ACI-42
Figure pat00008

(서열번호 8)
T11: 서열 11: Tau 399-408 [pS404] ACI-43
Figure pat00009

(서열번호 9)
실시 예 2: 타우 -유래 테트라팔미토일화 포스포 -펩티드의 제조
측면에서 2쌍의 리신을 갖는 항원 펩티드 서열을 표준 Fmoc/tBu 화학적 방법을 이용하여 아미노 수지상에 고체상 펩티드 합성을 통해 단계적으로 합성했다. 다음에, 말단 리신의 직교 보호기들을 선택적으로 제거하고 그 유리 아미노기들을 팔미트산으로 아실화했다. 그 측쇄 보호기들을 제거하면서 그 수지로부터 펩티드를 방출하는 것은 산성 조건하에서 수행하여, 원하는 테트라팔미토일화 포스포-펩티드를 미정제 생성물로서 얻었다. 상기 생성물의 정체 및 순도를 MALDI-TOF 질량 분광분석 및 HPLC 분석을 통해 확인했다.
Tau-유래 테트라팔미토일화 포스포-펩티드들의 서열:
Figure pat00010
2.1: 펩티드 단백질 T1 의 합성
직교하게 보호된 아미노산 Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 당량)를 DMF에서 2 당량의 DIC/HOBt의 존재하에 아미드 수지 (Rink 아미드 MBHA 수지, 1 당량, 0.26 mmol)에 수동으로 로딩했다. 다음에, 상기 수지를 DMF로 세척(3 x 1 분)했다. DMF에 용해된 25% 피페리딘을 이용하여 N-말단의 Fmoc 기를 제거(1 x 1 분 및 2 x 15 분)한 후, Fmoc-lys(Mtt)-OH (3 당량)의 두 번째 잔기를 DMF에 용해된 5 당량의 PyBOP/HOBtlDIEA를 이용하여 자동으로 결합시켰다 (2 x 15 분). 이전에 기재된 결합 프로토콜을 이용하여, Fmoc 표준 측쇄 보호기를 갖는 그 다음의 16개 아미노산들을 자동으로 혼입했다. 그 인신화 아미노산들은 포스페이트 기에 모노벤질 에스테르 형태로 도입했다. 각각의 결합 단계 이후에, DMF를 이용한 세척 단계 (3 x30 초), DMF에 용해된 25% 피페리딘을 이용한 Fmoc 제거 단계 (3 x 3 분) 및 DMF를 이용한 두 번째 세척 단계(6 x 30 초)가 수행되었다. 그 Tyr(PO(OBzl)2)의 결합 후, DMF에 용해된 0.5% DBU를 Fmoc-제거 단계에서 사용했다. 그 펩티드 서열의 합성은 DMF에 용해된 2 당량의 PyBOP/HOBt/DIEA를 이용하여 마지막 2번의 Fmoc-lys(Mtt)-OH의 첨가를 통해 종결했다.
다음에, 말단 리신 잔기들의 Mtt 기들을 10분의 몇 회의 사이클 동안 10 mL의 TIPS/TFA/DCM (1:1:98)의 탈기 혼합물로 상기 수지 (1 당량, 600 mg, 0.092 mmol)를 처리하여 질소 하에 선택적으로 절단했다. 그 수지를 DCM (x3) 및 DMF (x3)로 세척했다. 다음에, 팔미트산(20 당량, 473 mg, 1.85 mmol)을 DCM/DMF (1:1) (6 mL)에서 TBTU (20 당량, 593 mg, 1.85 mmol) 및 DIEA (40 당량, 643 ㎕, 3.70 mmol)를 이용하여 상기 보호기 제거된 아미노기에 결합시켰다. 그 수지를 DCM (x5) 및 DMF (x5)으로 세척했다. 다음에, N-말단의 Fmoc 기를 DMF에 용해된 탈기된 20% 피페리딘을 이용하여 제거하고 (3 x 10 분), 그 수지를 DMF (x3) 및 DCM (x5)로 세척했다. 최종적으로, 수지 절단과 동시에 측쇄 보호기 제거를, 4.5 시간 동안 TFA/TIPS/H2O/EDT (95:1:2.5:2.5) (4 mL)의 탈기 혼합물을 이용하여 질소하에서 수행했다. 차가운 디에틸 에테르로부터 분쇄하여 56% 순도(HPLC 분석으로부터)를 갖는 백색 고체(189 mg, 60% 수율)로서 미정제 생성물 T1을 얻었다. MALDI-TOF 질량 분광분석 결과, 상기 주요 생성물의 정체가 확인되었다 (m/z 예상치: 3427.12 [MH+], 실측치: 3426.87).
2.2: 펩티드 항원 T3의 합성
직교하게 보호된 아미노산인 Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 당량)을, DMF에서 PyBOP/HOSt/DIEA의 존재하에 아미드 수지(Rink 아미드 MBHA 수지, 1 당량, 0.4 mmol)에 수동으로 로딩했다. 다음에, 그 수지를 DMF로 세척(3 x 1 분)했다. DMF에 용해된 25% 피페리딘을 이용하여 N-말단의 Fmoc 기를 제거(1 x 1 분 및 2 x 15 분)한 후, Fmoc-lys(Mtt)-OH (3 당량)의 두 번째 잔기를 동일 로딩 조건을 이용하여 결합시켰다. Fmoc 표준 측쇄 보호기들을 갖는 그 다음의 16개 아미노산들을 이전에 기재된 결합 프로토콜을 이용하여 수동으로 혼입했다. 그 인신화 아미노산들은 포스페이트 기에 모노벤질 에스테르 형태로 도입했다. 그 결합 시간은 Proline후 TNBT 테스트 및 클로라닐 테스트를 통해 측정했다. 필요한 경우, 두 번째 결합은 DIC/HOBt 또는 HATU/DIEA의 존재하에서 2 당량의 Fmoc-아미노산을 이용하여 수행했다. 각각의 결합 단계 이후에, DMF를 이용한 세척 단계 (3 x 1분), DMF에 용해된 25% 피페리딘을 이용한 Fmoc 제거 단계 (1 x 1 분 및 2 x 15 분) 및 DMF를 이용한 두 번째 세척 단계(7 x 1분)가 수행되었다. 첫 번째 Ser(PO(OBzl)OH)의 결합 후, DMF에 용해된 0.5% DBU를 Fmoc-제거 단계에 사용했다. 상기 펩티드 서열의 합성은 DMF에 용해된 마지막 2번의 Fmoc-lys(Mtt)-OH의 첨가를 통해 종결했다.
다음에, 말단 리신 잔기들의 Mtt 기들을 10분의 몇 회의 사이클 동안 10 mL의 TIPS/TFA/DCM (1:1:98)로 상기 수지 (1 당량, 195 mg, 0.01 mmol)를 처리하여 선택적으로 절단했다. 그 수지를 DCM (x3) 및 DMF (x3)로 세척했다. 다음에, 팔미트산(20 당량, 51 mg, 0.2 mmol)을 DCM/DMF (1:1) (2 mL)에서 TBTU (20 당량, 64 mg, 0.2 mmol) 및 DIEA (40 당량, 70 ㎕, 0.4 mmol)를 이용하여 상기 보호기 제거된 아미노기에 결합시켰다. 그 수지를 DCM (x5) 및 DMF (x5)으로 세척했다. 다음에, N-말단의 Fmoc 기를 DMF에 용해된 20% 피페리딘을 이용하여 제거하고 (3 x 10 분), 그 수지를 DMF (x3) 및 DCM (x5)로 세척했다. 최종적으로, 수지 절단과 동시에 측쇄 보호기 제거를, 2 시간 동안 TFA/TIPS/H2O (95:2.5:2.5) (2 mL)의 혼합물을 이용하여 수행했다. 차가운 디에틸 에테르로부터 분쇄하여 67% 순도(HPLC 분석으로부터)를 갖는 백색 고체(34 mg, 100% 수율)로서 미정제 생성물 T3을 얻었다. MALDI-TOF 질량 분광분석 결과, 상기 주요 생성물의 정체가 확인되었다(m/z 예상치: 3365.15 [MH+], 실측치: 3369.66).
2.3: 펩티드 항원 T4 의 합성
직교하게 보호된 아미노산인 Fmoc-Lys(Mtt)-OH (5배 과량)를 DMF에서 활성화제로서 DCCI and HOBt를 이용하여 Tentagel R RAM 아미드 수지(0.19mm/g, 750 mg, 0.1425 mmol)에 자동으로 부착했다. N-말단의 Fmoc 기를 제거한 후, Fmoc-lys(Mtt)-OH (5배 과량)의 두 번째 잔기를 DCCI 및 HOBt의 존재하에서 결합시켰다. 표준 측쇄 보호기들을 갖는 그 다음의 16개 아미노산들을 유사한 결합/보호기제거 프로토콜을 이용하여 자동으로 혼입했다. 모든 잔기의 경우 60분의 이중 결합을 수행한 후 아세트산 무수물을 이용한 캐핑(capping) 단계를 수행했다. 상기 펩티드 서열의 합성은 마지막 2번의 Fmoc-lys(Mtt)-OH의 첨가를 통해 종결했다.
다음에, 말단 리신 잔기들의 Mtt 기들을 10분의 몇 회의 사이클 동안 10 mL의 TIPS/TFA/DCM (1:1:98)로 상기 수지 (1 당량, 750 mg, 0.075 mmol)를 처리하여 선택적으로 절단했다. 그 수지를 DCM (x3) 및 DMF (x3)로 세척했다. 다음에, 팔미트산(20 당량, 51 mg, 0.2 mmol)을 DCM/DMF (1:1) (7 mL)에서 TBTU (20 당량, 482 mg, 1.5 mmol) 및 DIEA (40 당량, 536 ㎕, 3.0 mmol)를 이용하여 상기 보호기 제거된 아미노기에 결합시켰다. 그 수지를 DCM (x5) 및 DMF (x5)으로 세척했다. 다음에, N-말단의 Fmoc 기를 DMF에 용해된 20% 피페리딘을 이용하여 제거하고 (3 x 10 분), 그 수지를 DMF (x3) 및 DCM (x5)로 세척했다. 최종적으로, 수지 절단과 동시에 측쇄 보호기 제거를, 3.5 시간 동안 TFA/TIPS/H2O (95:2.5:2.5) (6 mL)의 혼합물을 이용하여 수행했다. 차가운 디에틸 에테르로부터 분쇄하여 50% 순도(HPLC 분석으로부터)를 갖는 백색 고체(96 mg, 37% 수율)로서 미정제 생성물 T4을 얻었다. MALDI-TOF 질량 분광분석 결과, 상기 주요 생성물의 정체가 확인되었다(m/z 예상치: 3455.10 [MH+], 실측치: 3456.13).
2.4: 펩티드 항원 T8 의 합성
직교하게 보호된 아미노산 잔기인 Fmoc-lys(Mtt)-OH (5 당량, 781 mg, 1.25 mmol)를, 8 시간의 2회의 결합 동안 DMF (5 ml)에서 DIPCDI (5 당량, 196 ml, 1.25 mmol) 및 HOBt (5 당량, 169 mg, 1,25 mmol)을 이용하여 Rink 아미드 PEGA 수지 (1 당량, 0.33 mmol/g, 758 g)에 수동으로 부착했다. 다음에 상기 수지를 DMF (x 5)로 세척했다. DMF에 용해된 20% 피페리딘(7 ml x 3 x 5 분)을 이용하여 N-말단의 Fmoc 기를 제거한 후, Fmoc-lys(Mtt)-OH (10 당량, 1.56 g, 2.5 mmol)의 두 번째 잔기를 TBTU (10 당량, 803 mg, 2.5 mrnol), HOBt (10 당량, 338 mg, 2.5 mmol) 및 DIEA (20 당량, 871 ml, 5.0 mmol)의 존재하에 결합시켰다. 유사한 결합/보호기제거/세척 사이클을 통해, 표준 측쇄 보호기를 갖는 그 다음의 16개 아미노산을 수동으로 혼입했다. 예외적으로, 상기 인산화 아미노 산들은 DMF에 용해된 TBTU (10 당량), HOBt (5 당량) 및 DIEA (15 당량)를 이용하여 포스페이트기(10당량)에서 모노벤질 에스테르의 형태로 도입되었다. 합성 동안 1 시간의 결합 시간이 사용되었다. 상기 펩티드 서열의 합성은 마지막 2회의 Fmoc-Lys(Mtt)-OH의 참가를 통해 종료했다.
다음에, 말단 리신 잔기들의 Mtt 기들을 10분의 몇 회의 사이클 동안 10 mL의 TIPS/TFA/DCM (1:1:98)로 상기 펩티딜 수지 (1 당량, 385 mg, 0.019 mmol)를 처리하여 선택적으로 절단했다. 그 수지를 DCM (x3) 및 DMF (x3)로 세척했다. 다음에, 팔미트산(20 당량, 968 mg, 3.8 mmol)을 DCM/DMF (1:1) (4 mL)에서 TBTU (20 당량, 1.21 g, 3.8 mmol) 및 DIEA (40 당량, 1.31 ml, 7.6 mmol)를 이용하여 상기 보호기 제거된 아미노기에 결합시켰다. 그 수지를 DCM (x5) 및 DMF (x5)으로 세척했다. 다음에, N-말단의 Fmoc 기를 DMF에 용해된 20% 피페리딘을 이용하여 제거하고 (3 x 10 분), 그 수지를 DMF (x3) 및 DCM (x5)로 세척했다. 최종적으로, 수지 절단과 동시에 측쇄 보호기 제거를, 3.5 시간 동안 TFA/TIPS/H2O (95:2.5:2.5) (4 mL)의 혼합물을 이용하여 수행했다. 차가운 디에틸 에테르로부터 분쇄하여 55% 순도(HPLC 분석으로부터)를 갖는 백색 고체(50.2 mg, 10% 수율)로서 미정제 생성물 T8을 얻었다. MALDI-TOF 질량 분광분석 결과, 상기 주요 생성물의 정체가 확인되었다(m/z 예상치: 3331.17 [MH+], 실측치: 3335.19).
2.5: 펩티드 항원 T9 의 합성
직교하게 보호된 아미노산인 Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 당량)를 DMF에서 PyBOP/HOBt/DIEA의 존재하에서 아미드 수지(Rink 아미드 MBHA 수지, 1 당량, 0.4 mmol)에 수동으로 로딩했다. DMF에 용해된 25% 피페리딘을 이용하여 N-말단의 Fmoc 기를 제거 (1 x 1 분 및 2 x 15 min)한 후, 동일한 로딩 조건을 이용하여 Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 당량)의 두 번째 잔기를 결합시켰다. 이전에 기재된 결합 프로토콜을 이용하여, Fmoc 표준 측쇄 보호기를 갖는 그 다음의 16개 아미노산을 혼입했다. 상기 인산화 아미노산들은 포스페이트기에서 모노벤질 에스테르로서 도입되었다. 결합 시간은 프롤린 후 TNBT 테스트 또는 클로라닐 테스트를 통해 측정했다. 필요한 경우, DIC/HOBt 또는 HATU/DIEA의 존재하에서 2 당량의 Fmoc-아미노산을 이용하여 두 번째 결합을 수행했다. 각각의 결합 단계 후, DMF를 이용한 세척 단계 (3 x 1 분), DMF에 용해된 25% 피페리딘을 이용한 Fmoc 제거 단계(1 x 1 분 및 2 x 15 분) 및 DMF를 이용한 두 번째 세척단계 (7 x 1 분)가 수행되었다. Thr(PO(OBzl)OH)의 결합 후, DMF에 용해된 0,5% DBU를 Fmoc 제거 단계에 사용했다. 상기 펩티드 서열의 합성은 마지막 2회의 Fmoc-Lys(Mtt)-OH의 참가를 통해 종료했다.
다음에, 말단 리신 잔기들의 Mtt 기들을 10분의 몇 회의 사이클 동안 10 mL의 TIPS/TFA/DCM (1:1:98)로 상기 수지 (1 당량, 650 mg, 0.156 mmol)를 처리하여 선택적으로 절단했다. 그 수지를 DCM (x3) 및 DMF (x3)로 세척했다. 다음에, 팔미트산(20 당량, 1.01 g, 3.15 mmol)을 DCM/DMF (1:1) (6 mL)에서 TBTU (20 당량, 814mg, 3.15 mmol) 및 DIEA (40 당량, 1.1 ml, 6.30 mmol)를 이용하여 상기 보호기 제거된 아미노기에 결합시켰다. 그 수지를 DCM (x5) 및 DMF (x5)으로 충분히 세척했다. 다음에, N-말단의 Fmoc 기를 DMF에 용해된 20% 피페리딘을 이용하여 제거하고 (3 x 10 분), 그 수지를 DMF (x3) 및 DCM (x5)로 세척했다. 최종적으로, 수지 절단과 동시에 측쇄 보호기 제거를, 3 시간 동안 TFA/TIPS/H2O (95:2.5:2.5) (9 mL)의 혼합물을 이용하여 수행했다. 차가운 디에틸 에테르로부터 분쇄하여 69% 순도(HPLC 분석으로부터)를 갖는 백색 고체(191 mg, 59% 수율)로서 미정제 생성물 T9을 얻었다. MALDI-TOF 질량 분광분석 결과, 상기 주요 생성물의 정체가 확인되었다(m/z 예상치: 3172.98 [MH+], 실측치: 3172.90).
2.6: 펩티드 항원 T10 의 합성
테트라팔리토일화 펩티드 T10을 T9의 경우와 유사한 프로토콜에 따라 제조했다(펩티드 합성 스케일: 0.25 mmol). 또한, 문제의 서열 Asn-Val-Ser-Ser 이전의 빌딩 블록으로서 유사 프롤린[psi(Gly-Ser)]을 사용했다. 56% 수율(HPLG 분석으로부터)을 갖는 백색 고체(809 mg, 정량적 수율)로서 미정제 생성물 T10을 얻었다. MALDI-TOF 질량분광분석 결과 그 주요 생성물의 정체가 확인되었다 (m/z 예상치: 2761.9 [MH+], 실측치: 2759.2).
2.7: 펩티드 항원 T11 의 합성
테트라팔리토일화 펩티드 T11을 T9의 경우와 유사한 프로토콜에 따라 합성했다(펩티드 합성 스케일: 0.25 mmol). 80% 수율(HPLG 분석으로부터)을 갖는 백색 고체(495 mg, 76% 수율)로서 미정제 생성물 T11을 얻었다. MALDI-TOF 질량분광분석 결과 그 주요 생성물의 정체가 확인되었다 (m/z 예상치: 2613.8 [MH+], 실측치: 2612.2).
실시 예 3: 백신 제조 (방법 A)
타우 유래의 테트라팔미토일화 인신화 펩티드를 칭량하고(양에 대하여는 하기 표 2참조), 250 ml 유리 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 다음에, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤 (DMPG), 콜레스테롤 및 애주번트인 모노포스포릴 지질 A (MPLA) (모두 USA, AL주의 Avanti Polar Lipids Inc.사로부터 입수)를 칭량하고 각각 9:1:7:0.2의 몰비로 첨가했다. 다음에, 클로로포름을 첨가하여 미립자를 갖는 투명한 용액을 얻었다. 15분간 부드럽게 교반한 후, 40 ℃에서 감압하에 증발시킨 다음 고진동하에 3 시간 동안 증발시켜 유기 용매를 제거했다. 층상 후드에서(lamellar hood)에서 멸균 PBS를 첨가하여, 얻어지는 박막을 다시 수화시킨 다음, 실온에서 18 시간 동안 부드럽게 교반하였다. 얻어지는 펩티드/인지질의 몰비는 1:100이었다. 다음에, 그 리포좀 현탁액을 15 ml 멸균 팔콘 튜브에 분배(튜브당 5 ml 생성물)한 다음, 2~8 ℃ 에서 보관했다. 최종 펩티드 농도는 40μM 이었다.
실시 예 4: 타우 리포좀 백신의 특성 규명
4.1. 방법
4.1.1 HPLC 에 의한 펩티드, DMPC 및 콜레스테롤 정량
리포좀 타우 백신들(모두 실시 예 3에서 기재된 방법 A에 따라 제조한 ACI-33, ACI-35, ACI-36, ACI-39, ACI40 및 ACI-41)의 정량을 위하여, 유리 HPLC 바이알내의 백신 시료(20 ㎕)에 물(20 ㎕)을 첨가한 다음, 이소프로판올(140 ㎕) 및 TFA(20 ㎕)를 첨가하여 시료를 제조했다. 5배 희석된 시료를 간단히 볼텍싱한 다음 주입(20 ㎕) 했다. 75 ℃로 온도조절한 G3-역상 Zorbax 300SB-B3 칼럼 (250 x 4.6mm, 5 ㎛, 30 Å, Agilent사)를 이용하여 분석을 수행하면서 207 및 214 nm 검출했다. 용리 용매를 다음과 같았다: 용매 B, 95% 이소프로판올, 5% 물, 0.1% TFA; 용매 A, 10% 아세토니트릴, 90% 물, 0.1% TFA. 40% B에서 60% A까지의 구배를 1 ml/min의 유속으로 20분간 적용했다. 타우 펩티드(T1, T3, T4, T8 및 T9) 및 DMPC/콜레스테롤의 표준을 검정의 목적을 위해 별개로 분리했다. 타우 펩티드의 경우, TFA/iPrOH/H2O (1:7:2) 에서 1 mg/ml의 스톡 용액을 제조하고 400 ㎍/ml 내지 12.5 ㎍/ml까지 (1:1)로 연속 희석했다. 지질의 경우, 70% 이소프로판올 및 30% 물에서 8.0 mg/ml의 DMPC 및 3.5 mg/ml의 콜레스테롤의 스톡 용액을 제조하고 동일 혼합물을 이용하여 (1:5), (1:10) 및 (1:50)으로 희석했다.
4.1.2 HPLC 에 의한 MPLA 정량
UV 활성 발색단인 3,5-디니트로벤질옥시아민(DNBA)을 이용하여 애주번트를 유도체화한 후 UV 검출하면서 타우 리포좀내의 MPLA를 정량했다. 간략히 말해서, 20 ㎕의 리포좀 타우 구조물을 피리딘내의 DNSA의 용액 (10 mg/ml, 전체 체적 100 ㎕)에 첨가하고, 60 ℃에서 3 시간 가열한 다음, 상기 피리딘을 증발 제거했다. 얻어지는 펠릿을 HPLC 분석을 위해 클로로포름/메탄올 (2:1, v/v)에서 다시 가용성화했다. MPLA (Avanti Polar Lipids사)를 4개의 상이한 농도에서 검정의 목적을 위해 사용하고, 상기 리포좀 타우 구조물의 경우와 마찬가지로 유도체화 및 분석했다. HPLC 분석은 254 nm의 검출 파장에서 50 ℃로 온도조절된 Agilent XDB-C18 역상 칼럼 (250x4,6 mm, 120 Å, 5 ㎛)를 이용하여 수행했다. 용리 용매는 다음과 같았다: 용매 A, 95% 아세토니트릴, 5% 물, 4.8 mM 인산; 용매 B, 95% 이소프로판올, 5% 물, 4,8 mM 인산. 10% B에서 70% B까지의 구배를 1 ml/min의 유속으로 30분간 적용했다.
4.1.3 리포좀 표면 전위
타우 리포좀 구조물 시료를 PBS로 100배 희석했다. 25℃ 에서 Zetasizer Nano (Malvern, USA)를 이용하여 분석을 수행했다. 측정 기간 및 전압 선택은 자동 방식으로 수행되었는데, 대표적인 인가 전압은 50 mV였다. Smoluchowski 식을 이용하여 데이터를 변환하고 DTS 5.0 (Malvern) 소프트웨어를 이용하여 제타 전위를 계산했다. 타우 리포좀 구조물은 9:1:7:0.2의 몰비의 DMPC/DMPG/콜레스테롤/MPLA의 혼합물로 구성되므로, 예상되는 순 전하는 음성일 것이다.
4.1.4 원편광 이색성에 의한 형태 분석
타우 리포좀 단백질을 PBS로 (1:1)로 희석하여 18 μM의 최종 펩티드 농도를 얻었다. 동일한 조성을 갖지만 타우 펩티드가 결실된 리포좀을 바탕 제거를 위한 바탕용액으로 사용하였다. 23 ℃에서 0.1 cm 경로 길이의 석영 큐벳을 갖는 Jasco-815 분광편광계(Hellma, Germany)상에서 CD 스펙트럼을 획득했다. 측정은 1.0 nm 밴드 폭 및 0.5 nm 해상도로서 195-250 nm 파장 범위에서 이루어졌다. 1초의 반응 시간과 함께 50 nm/min의 스캔 속도를 이용했다. 바탕 스펙트럼(8회 스캔으로부터)을 평균하고 각 시료의 스펙트럼의 8회 스캔의 평균으로부터 감했다. 얻어진 스펙트럼
Figure pat00011
을 다음 식을 이용하여 평균 잔기 몰 타원율로 변환한 후 평탄화했다:
Figure pat00012
상기 식에서, MRW은 평균 잔기 분자량 (MW/잔기의 수)이고, I는 광경로 길이(cm)이고, c는 농도 (g/cm3)이다.
4.1.5 ThT 형광 분석
ThT 형광 측정치를 마이크로플레이트 리더 Infinite M200(Tecan Group Ltμd, Switzerland)상에서 획득했다. 일반적인 과정으로서, 타우 리포좀 구조물을 PBS로 여러 가지 농도까지 희석했다(표 2). 동일한 조성을 갖지만 타우 단백질이 결실된 리포좀을 유사하게 희석하여 음성 대조군(배치 ACI-35-081 015-8)로 사용했다. 98 ㎕의 각각의 백신 또는 바탕 용액에, ThT (2 ㎕, 물에서 1.2 mM)를 첨가하여 24μM의 최종 농도를 만들었다. 간단한 볼텍싱 후, 각 시료로부터의 분취량(70 ㎕)을 검고 불투명한 384-웰 Perkin Elmer 마이크로타이터 플레이트 상에 첨가하고, 형광 방출을 440 nm에서의 여기시 30분 후에 485 nm에서 측정했다. 여기 대역폭은 9 nm였고, 방출 대역폭은 20 nm였다. γ-시클로덱스트린을 내부 대조군로 사용했다. PBS내의 640 mM 스톡 용액으로부터 PBS내의 연속적인 2배 희석액들을 만들어서 320, 160 및 80 mM γ-시클로덱스트린 대조 용액들을 얻었다.
ThT 분석을 위해 제조한 시료
펩티드 백신 배(batch) 희석비 펩티드 농도(㎕/ml)
T1 ACI-33 ACI-33-081031-A 2배 23
ACI-33-081031-A 3배 15
ACI-33-081031-A 4배 7.7
ACI-33-081031-A 12배 3.8
T3 ACI-35 ACI-353-081015-A 2배 39
ACI-35-081015-A 3배 26
ACI-35-081015-A 4배 20
ACI-35-081015-A 12배 5
T4 ACI-36 ACI-36-081010-A 2배 16.5
ACI-36-081010-A 3배 11
ACI-36-081010-A 4배 8.3
ACI-36-081010-A 12배 2.1
T8 ACI-39 ACI-39-090202-A 2배 24
ACI-39-090202-A 3배 16
ACI-39-090202-A 4배 12
ACI-39-090202-A 12배 4
T9 ACI-40 ACI-40-090202-A 2배 30
ACI-40-090202-A 3배 20
ACI-40-090202-A 4배 15
ACI-40-090202-A 12배 5
T8+T9 ACI-41 ACI-41-090204-A 2배 11.5
ACI-41-090204-A 3배 7.7
ACI-41-090204-A 4배 5.8
ACI-41-090204-A 12배 1.9
음성 대조군 음성 대조군 ACI-39-081015-B 2배 적용불가
ACI-39-081015-B 3배 적용불가
ACI-39-081015-B 4배 적용불가
ACI-39-081015-B 12배 적용불가
4.2. 결과
4.2.1 HPLC 에 의한 펩티드, DMPC 및 콜레스테롤 정량
백신 시료의 주입으로부터 얻은 207 nm의 검출 파장에서의 HPLC 크로마토그램은 타우 펩티드, DMPC 및 콜레스테롤의 존재를 나타냈다 (표 4 참조). 표준을 이용하여 측정한 검정 곡선으로부터, 백신내의 각 성분의 양을 계산했다. 타우 리포좀 현탁액에서 검출된 타우 펩티드, DMPC 및 콜레스테롤 함량은 목표 값에 근접했다.
4.2.2 HPLC 에 의한 MPLA 정량
DNBA-유도체화 타우 백신 시료의 주입으로부터 얻은 254 nm의 검출 파장에서의 HPLC 크로마토그램은은 표지된 MPLA 존재를 나타냈다 (표 4 참조). 표준을 이용하여 얻은 검정 곡선을 이용하여, 타우 리포좀 단백질내의 MPLA의 양을 계산했다. 타우 리포좀 현탁액내의 검출된 MPLA 함량은 목표 값에 근접했다.
4.2.3 리포좀 표면 전위
타우 리포좀 백신의 측정된 제타 전위가 표 4에서 보여진다.
4.2.4 CD 에 의한 리포좀 백신 내의 타우 단백질의 형태 분석
상기의 설명에 따라 제조한 리포좀 백신의 형태를 원편광 이색성으로 측정했다. 그 결과는 표 3에서 보여진다.
4.2.5. 리포좀 백신 내의 타우 펩티드의 ThT 분석
ThT 형광 분석으로 측정한 리포좀 백신(전술한 방법 A에 의해 제조함)의 타우 펩티드의 응집된 상태가 표 4에서 보여진다.
백신 특성의 요약
백신 성분 체류 시간 목표 값 결과 (㎍ /ml) 리포좀 표면 장력(mV) 형태
원편광 이색성		 ThT 분석(펩티드 응집) 형광 신호
AC-33 펩티드 T1 19.3분 130 46 -18.7 베타-시이트 및 베타-턴 혼합 형태 응집
콜레스테롤 11.2분 1027 923
DMPC 10.0분 2314 2463
DMPG 적용불가 261 적용불가
MPLA 39.8분 135 62
AC-35 펩티드 T1 19.5분 130 78 -19.2 무작위 코일 형태 응집 없음
콜레스테롤 11.6분 1046 1438
DMPC 10.3분 2357 적용불가
DMPG 적용불가 266 적용불가
MPLA 29.7분 135 124
AC-36 펩티드 T1 20.3분 130 33 -17.8 약간의 베타 응집
콜레스테롤 11.2분 1018 1387 -시이트를 갖는 무작위 코일 형태 응집
DMPC 10.0분 2296 적용불가
DMPG 적용불가 259 적용불가
MPLA 29.7분 135 83
AC-39 펩티드 T1 19.3분 130 48 -16.8 베타-시이트 형태 응집없음
콜레스테롤 11.8분 1056 1906
DMPC 10.5분 2381 4316
DMPG 적용불가 269 적용불가
MPLA 30.9분 135 144
AC-40 펩티드 T1 21.0분 130 60 -14.7 무작위 코일 형태 응집 없음
콜레스테롤 11.8분 1109 1655
DMPC 10.5분 2500 2894
DMPG 적용불가 269 적용불가
MPLA 30.9분 135 122
AC-41 펩티드 T1 18.3분+
19.9분		 65+65 23+34 -17.3 무작위 코일과 베타-시이트의 혼합물 응집없음
콜레스테롤 11.2분 1109 34
DMPC 9.9분 2500 1574
DMPG 적용불가 282 3829
MPLA 30.9분 135 80
실시 예 5: 야생형 및 Tau -/- KO 마우스에서 타우 팔미토일화 항원의 면역원성
5.1. 방법
5.1.1 Tau 녹아웃 마우스 ( TKO )
외인성 개시 코돈과 인-프레임(in-frame)으로 유전자의 액손 1에서 강화 녹색 형광 단백질(EGFP) cDNA를 삽입한 표적 벡터를 이용하여 tau 유전자의 불활성화(knocking out)를 달성했다. 이로써, 타우의 처음 33개 아미노산 이후에 EGFP를 갖는 융합 단백질을 제조했다(Tucker KL. et al., Nature Neuroscience , 2001). 상기 유전자의 결실은 전체 뇌 파쇄물의 웨스턴 블럿 분석을 통해 확인했다. 몇 개의 항-타우 항체를 이용한 타우 단백질 수준은 동형접합 돌연변이에는 모든 타우 아형이 없었으며, 이형접합 돌연변이는 50% 감소했다는 것을 나타냈다. 그 돌연변이는 G57BLl6 배경에서는 유지되았다.
5.12 백신의 제조
실시 예 3에서 기재된 방법 A에 따라 백신을 제조했다.
5.1.3 면역화
G57BL/6 또는 Tau-/- KO 마우스(TKO)에게 백신(AGI-33, ACI-35, AGI-36 및 ACI-41)을 복막내로 3회(계획 1) 주사했다(표 4).
ACI-33, ACI-35, ACI-36 및 ACl-41 면역의 경우, 3회의 면역은 계획 1에 따라 각 투여 사이에 2주의 간격을 두고 수행되었다(0일, 13일, 28일). 1차 면역 1일전 (-1일) 및 2차 면역후(27일째) 및 3차 면역후(47일째)에, 혈액 시료를 채취하고 혈청을 제조했다. 혈청은 혈액 시료가 응고되도록 밤새 방치한 후 원심분리 후 상등액을 취함으로써 제조했다. Tau 포스포펩티드-특이적 IgG 및 IgM 항체 역가 및 IgG 아형 패턴을 ELISA에 의해 측정했다. 대조군로서, pTau 펩티드-비특이적 IgG 항체 역가를 ELISA에 의해 측정했다.
마우스 면역화
군 마우스 연령(월) 동물의 수 및 성별 처리/체적a 백신 배치 투여 경로b 펩티드의 투여량 ㎍/투여c MPLA의 투여량
㎍/투여c
ACI-33(T1 펩티드) WT 6 3 마리 암컷
3마리 수컷		 ACI-33
0.2 ml		 ACI-33-081031-A i.p. 9 12
KO 4.5 3 마리 암컷
3마리 수컷		 ACI-33
0.2 ml		 ACI-33-081031-A i.p 9 12
ACI-35(T3 펩티드) WT 6 3 마리 암컷
3마리 수컷		 ACI-35
0.2 ml		 ACI-35-081035-A i.p 16 23
KO 6-8 3 마리 암컷
3마리 수컷		 ACI-35
0.2 ml		 ACI-35-081035-A i.p 16 23
ACI-36(T4 펩티드) WT 6 3 마리 암컷
3마리 수컷		 ACI-36
0.2 ml		 ACI-36-081110-A i.p 7 13
KO 4 3 마리 암컷
3마리 수컷		 ACI-36
0.2 ml		 ACI-36-081110-A i.p 7 13
ACI-41(T8+T9 펩티드) WT 7 3 마리 암컷
3마리 수컷		 ACI-41
0.2 ml		 ACI-41-081204-A i.p 5 7
KO 4 3 마리 암컷
3마리 수컷		 ACI-41
0.2 ml		 ACI-41-081204-A i.p 5 7
a:이론적 체적
b:복막내
c:분석후 측정량
계획 1: ACI-33, ACI-3S, ACI-36 및 ACI-41에 대한 면역 및 출혈 스케줄
Figure pat00013
5.1.4 타우 펩티드-특이적 항체의 정량
pTau 타우 펩티드에 대한 특이적인 IgG 항체를 3개의 출혈 시료에서 ELISA에 의해 측정했다. 타우 펩티드 특이적 IgG를 1일 및 47일째의 혈청에서 측정했다. 펩티드인 pTau 특이적 IgM 및 IgG 아형 항체를 47일째의 혈청 출혈 시료에서 ELISA로 측정했다. 플레이트를 4 ℃에서 10 ㎍ /ml의 해당하는 타우 펩티드로 밤새 코팅했다. 각각의 웰을 PBS-0.05% Tween 20로 세척하고 PBS-0.05% Tween 20내의 1% BSA로 블로킹 한 후, 혈청의 연속 희석액을 상기 플레이트에 첨가하고 37 ℃에서 2 시간 배양했다. 세척 후, 플레이트를 알칼리성 포스페이타제(AP)-결합 항마우스 IgG 전체 항체(Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) 또는 아형 특이 항체(양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-결합 항-마우스 IgM, AP-결합 항-마우스 IgG1, 비오틴-결합 항-마우스 IgG2a 및 IgG3(Pharmingen BD, San Diego, CA, USA) 및 HRP-결합 항-마우스 IgG2b (Zymed Laboratories, San Francisco, GA))와 함께 37 ℃ 에서 2 시간 동안 배양했다. 세척 후, 플레이트를 AP에 대한 포스페이타제 기질인 pNPP(파라-니트로-페닐-포스페이트, 또는 HRP에 대한 기질인 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)와 함께 배양하고, ELISA 리더 플레이트를 이용하여 405 nm에서 판독했다. 비오틴-결합 항체에 대한 추가의 단계를 수행하였는데, 이 경우 플레이트를 스트렙타비딘 HRP (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에서 45 분간 배양한 다음 ABTS를 이용하여 검출했다. 결과는 첫 번째 희석 시 및 IgG에 대한 불포화 희석 시 및 IgG 아형 및 IgM에 대한 불포화 희석시의 O.D.(광학 밀도)로 표시된다.
5.1.5 형질전환 동물 유래의 뇌 절편상의 Tau 농축체에의 항- 타우 항체의 결합 (TAUPIR)
뇌 절편상의 농축체에의, 면역접종 동물에 존재하는 항체의 결합을TAUPIR 면역조직화학 분석을 통해 수행했다.
사용된 뇌 절편은 말기 단계에서 Tau P301L(TPLH: P301 L 돌연변이를 갖는 인간 타우의 최장(441개 아미노산) 형질전환 동물 및 15개월 이상 연령의 이중 형질전환 biGT 마우스 (TPLH 마우스와 교잡한 GSK-3 형질전환 마우스)로부터 얻었다.
뇌 절편을 PBS에서 5 분간 세척한 다음, 실온에서 PBS:MeOH (1:1) 내의 1.5 % H2O2에서 배양하여 내인성 퍼옥시다제를 블로킹했다. 그 절편을 PBST (PBS/0.1% TritonX100)에서 3회 세척한 후, PBST+10 % FCB (우태혈청) 블로킹 용액에서 실온으로 30분간 배양했다. 항-타우 항체를 함유하는 혈청을 이용한 배양을 4 ℃ 에서 밤새 수행했다. 혈청을 112,500 내지 1,10,000의 여러 가지 상이한 희석비로 PBST/10 % FCS에서 희석했다. 절편을 PBST에서 3회 세척한 다음, 실온에서 1 시간 동안 PBST/10% FCS에서 HRP-결합 염소 항-마우스 (Dako, Glostrup, Denmark) 2차 항체와 함께 배양했다. 검출 전에, 절편을 PBST로 3회 세척하고 50 mM Tris/HCl pH7.6에서 배양했다. 그 절편을 디아미노벤지딘 (DAB: 10ml의 50 mM Tris HCI + 3 ㎕ H2O2 30 %에서 1개 정제(tablet)) (MP Biomedicals, Solon, OH, USA)에서 3 분간 배양하여 검출을 수행했다. 그 절편을 PBST에서 3회 세척하여 반응을 멈추었다. 다음에, 그 절편을 실란화된 유리판에 옮기고 50 ℃ 열판상에서 2 시간 동안 공기 건조했다. Mayers 헤마톡실린 (Fluka Chernie, Buchs, Switzerland)와 함께 1 분간 배양하여 대조염색을 수행한 다음, 흐르는 수돗물로 4분간 세척했다. 절편을 50 %, 70 %, 90 % 에탄올 중탕에 통과시키고 100% 에탄올 중탕에 2회 통과시킨 다음, 자일롤에 각 1 분씩 2회 통과시켜서 탈수시켰다. 최종적으로, 절편에 유리 커버 슬립하의 DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, England)를 위치시켰다.
5.1.6 웨스턴 블럿 ( WB )
형질전환 동물에서 추출한 뇌에서 pTau에의, 백신접종 동물의 혈청에 존재하는 항체의 결합을 WB에 의해 수행했다.
야생형 FVB, TPLH, biGT 및 Tau 녹아웃 (TKO) 마우스의 뇌 균질화를 하기의 완충액에서 수행했다: 25 mM Tris/HCI pH7.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 30 mM NaF, 0,2 mM Na3VO4, 1 nM 오카다산, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), 5 mM Na4P2O7, 1개 정제의 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 (CPIC), 전체 12 ml. 전체 뇌 균질물을 얻기 위하여, 뇌를 700 rpm에서 모터 구동 포터(유리관/테프론 막자)를 이용하여 1 vol/wt 대뇌반구 (ml/g)로 얼음 상에서 균질화했다.
전체 뇌 균질물을 시료 완충액(125 mM Tris/HCl pH6.8, 4% (w/v) 도데실 황산 나트륨 (SDS), 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루) +5% 베타-머캅토-에탄올에 절반으로 희석한 다음, 95 ℃까지 급속히 가열했다. 시료를 5 분간 유지하고, 시료 완충액에서 1/4로 희석하고, 95 ℃까지 다시 가열한 다음, 냉각하고 14000rpm으로 5분간 원심분리시켜서, 가용성화되지 않은 데브리스(debris)를 제거했다. 상등액을 수집하고 SDS-PAGE 겔상에 로딩했다.
셀룰로오스 막(Hybond-ECL)에의 이동을 이동 완충액 (25 mM Tris pH 8.6, 190 mM 글리신, 20% 메탄올)에서 수행했다. 막을 블로킹 완충액(TSS 에서 0.1 % Tween (TSS (50 mM Tris HCl, pH7.6, 150 mM NaCl) + 5% 스킴 밀크)에 옮긴 다음, 블로킹 완충액에 희석된 마우스 혈청과 함께 4 ℃에서 밤새 배양했다. 블로킹 용액에 1/10,000으로 희석된 2차 항체인 HRP-결합 염소 항-마우스 (Dako, Glostrup, Denmark)와의 배양을 실온에서 1 시간 동안 수행했다. ECI 웨스턴 블러팅 검출 시약(GE Healthcare)을 이용하여 검출을 수행했다.
5.2. 결과
5.2.1 면역접종 마우스의 혈청 유래의 항체의 특이성
백신접종 마우스 유래의 혈청을, TAUPIR에서의 타우 농축체인 pTau 및 Tau 펩티드 및 웨스턴 블럿에서의 pTau에 대한 그 혈청의 특이성을 ELISA 분석에서 시험했다.
ACI-33 백신은 복막내 주사 후 항-Tau5-20 [pY18] IgG 반응을 유도했다. 2차 면역 후(27일), 그 IgG 반응은 안정하게 유지되었으며 3차 면역(47일)에 의해 증가하지 않았다(도 1a: WT 마우스, 일원분산분석 P<0.05 -1일 대(vs) 27일, P<0.001, -1일 대 47일, 및 도 1b: TKO 마우스, 일원분산분석 P<0.001 -1일 대 27일).
ACI-35 백신은 복막 내 주사 후 강한 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG 반응을 유도했다. 2차 면역 후 (28일). 그 IgG 반응은 안정하게 유지되었으며(42일, 98일 및 126일), 3차 면역(42일)에 의해 증가하지 않았고, 추가접종 전, 동안 및 후에 출혈은 감소하지 않았다 (도 2a: WT 마우스: 일원분산분석 P<0.0001 -1일 대 28일/42일/98일/126일, 도 2b: TKO 마우스, 일원분산분석 P<0.0001 -1일 대 28일/42일/98일/126일).
ACI-36 백신은 복막 내 주사 후 Tau401-418 [pS404/S409] IgG 반응을 유도했다. 2차 면역 후 (27일), IgG 반응은 안정하게 유지되었고, 3차 면역 (47일)에 의해 증가하지 않았다 (도 3a: WT 마우스: 일원 분산분석 P<0.001 -1일 대 27일, P<0.0001 -1일 대 47일, 및 도 3b: TKO 마우스: 일원분산분석P<0.0001 -1일 대 27일/47일).
ACI-41 백신은 복막 내 주사 후 Tau206-221 [pT212/pS214] 및 Tau196-211 [pS202/pT205] 펩티드 모두에 대하여 강한 IgG 반응을 유도했다. 2차 면역 후 (34일), 그 IgG 반응은 안정하게 유지되었고 (48일), 3차 면역(48일)에 의해 증가하지 않았다(도 4a:WT 마우스, 항-Tau206-221 [pT212/pS2i4]-lgG, 일원분산분석 P<0.0001 -1일 대 34일/48일) (도 4b: WT 마우스, 항-Tau196-211 [pS202/pT205]-IgG, 일원분산분석 P<0.0001 -1일 대 34일/48일). (도 4c: TKO 마우스, 항-Tau206-221 [pT212/pS214]-IgG, 일원 분산분석 P<0.0001 -1일 대 34일/48일) (도 4d: TKO 마우스, 항-Tau196-211 [pS202/pT205]]-IgG, 일원분산분석 P<0.0001 -1일 대 34일/48일).
백신접종 마우스 유래의 혈청을 TAUPIR 면역조직화학 분석 및 웨스턴 블럿에서 항-tau 항체의 특이성에 대하여 추가로 시험했다. 모든 리포좀 구조물 및 각각의 마우스 모델에 대하여 얻은 데이터는 다음 표 5에서 요약되어 있다.
백신접종 마우스 유래의 항체의 특이성의 요약
백신 마우스 ELISA (양성/전체 마우스) TAUPIR (양성/전체 마우스) 웨스턴 블럿(양성/전체 마우스)
ACI-33 WT 4/6 2/6 1/6
KO 5/6 2/6 2/6
ACI-35 WT 5/6; 1 5/6; 1 5/6; 1
KO 6/6 3/6 6/6
ACI-36 WT 5/6 4/6 1/6
KO 5/6; 1 3/6; 1 1/6; 1
ACI-41 WT 6/6 4/6 4/6
KO 6/6 1/6 3/6
5.2.2 아생형 C57BL /6 및 Tau -/- KO ( TKO ) 면역화 마우스로부터 아형 반응의 분석
ACI -33
ACI-33 백신은 WT 마우스에서 3회 면역 후 IgG2a, 2b 및 3 아형뿐 아니라 IgM에 대하여 항체 역가를 유도했다(도 5a; WT 마우스). IgG1이 거의 없었고 IgG1 및 IgG2b 및 3 사이에는 유의적인 차이가 없다 (도 5a; WT 마우스; 일원분산분석 P<0.05 IgG1 대 IgG3, P<0.001 IgG1 대 IgG2b).
ACI-33 TKO 마우스에서 3회 면역 후 IgG2a, 2b 및 3 아형뿐 아니라 IgM에 대하여 항체 역가를 유도했다(도 5b; TKO 마우스). IgG1은 거의 없었고, 이러한 아형과 다른 IgG 아형 사이에는 유의적인 차이가 있었다 (도 5b, 일원분산분석 P<0.05 IgG1 대 IgG2a/IgG3, P<0.001 IgG1 대 IgG2b).
ACI -35
ACI-35 백신은 WT 마우스에서 3회 복막내 면역 후 모든 IgG 아형뿐 아니라 IgM에 대하여 높은 항체 역가를 유도했다 (도 6a; WT 마우스). 유의적인 차이는 IgG3와 비교하여 더욱 높은 IgM 반응이다(도 6a; WT 마우스, 일원분산분석 P<0.05 IgM 대 IgG3).
ACI-35 백신은 TKO 마우스에서 3회 복막내 면역 후 모든 IgG 아형뿐 아니라 IgM에 대하여 높은 항체 역가를 유도했다(도 6b; TKO 마우스).
ACI -36
ACI-36 백신은 WT 마우스에서 3회 복막내 면역 후 모든 IgG 아형뿐 아니라 IgM에 대하여 높은 항체 역가를 유도했다 (도 7a; WT 마우스).
ACI-36 백신은 TKO 마우스에서 3회 복막내 면역 후 모든 IgG 아형뿐 아니라 IgM에 대하여 높은 항체 역가를 유도했다(도 7b; TKO 마우스). IgG1과 비교하여 IgG2b의 통계적으로 유의하게 높은 수준이 있었다(도 7b; TKO 마우스, 이원분산분석 P<0.05 IgG2b 대 IgG1).
ACI -41
ACI-41 백신은 WT 마우스에서 3회 복막내 면역 후 모든 IgG 아형뿐 아니라 IgM에 대하여 높은 항-Tau196-2i1 [pS202/pT205] 항체 역가를 유도했다 (도 8a; WT 마우스).
ACI-41 백신은 TKO 마우스에서 3회 복막내 면역 후 모든 IgG 아형뿐 아니라 IgM에 대하여 높은항-Tau196-211 [pS202/pT205] 항체 역가를 유도했다 (도 8b: TKO 마우스).
5.3. 결론
Tau 백신은 모든 마우스에서 IgG 역가를 유도했다. ACI-33 면역 마우스에서 IgG2b 및 IgG3과 비교하여 낮은 IgG1 항체 반응이 있었다. 모든 다른 tau 백신 마우스의 경우, 모든 IgG2a, 2b 및 3 아형뿐 아니라 IgM에 대한 유도된 항체 역가들은 대등했다.
타우 단백질 면역화 마우스로부터 생성된 항체들은 타우 펩티드에는 거의 결합하지 않으면서 pTau에 특이적으로 결합한다. 또한, 상기 생성된 항체들은 Tau 형질전환 마우스 뇌 내의 농축체를 인식하고 및 WB 에 위한 Tau 형질전환 마우스 추출물 유래의 pTau를 인식할 수 있었다.
실시 예 6: 하이브리도마 및 항체의 생성 및 스크리닝
본 연구의 목적은 항-Tau mAb (모노클로날 항체)를 생성 및 스크리닝하는 것이었다. 타우 백신으로 면역시킨 마우스의 비장을 골수종 세포주와 융합하여 하이브리도마를 생성했다. 그 하이브리도마를 인산화 및 비인산화 전길이 타우 단백질에 대한 반응성 외에도, 백신 제조에서 사용된 인산화 및 비인산화 타우 항원 펩티드에 대한 반응성에 대하여 평가했다. 또한, 타우 형질전환 마우스의 뇌 절편에 대한 면역화학분석을 이용하여 타우 농축체에 대한 하이브리도마 상등액의 반응성에 대하여 하이브리도마 스크리닝을 수행했다.
6.1.방법
6.1.1 융합
ACI-33 (TauS-20 [pY18]) 및 ACI-35로 백신접종한 야생형 C578L16 마우스를 하이브리도마 생성에 사용했다. 그 마우스는 0일째 및 4일째에 ACI-33 백신으로 추가접종하고 7일째에 융합을 수행했다. 상기 면역시킨 마우스 유래의 173x106 (ACI-33) 비장세포를 SP2-O-Ag14 골수종 세포와 5(비장세포)/1(골수종 세포)의 비율로 융합했다.
ACI-36 (Tau401-418 [pS404/S409])으로 백신접종한 야생형 C57BL/6 마우스를 하이브리도마 생성에 이용했다. 그 마우스는 0일째 및 4일째에 ACI-36 백신으로 추가접종하고 7일째에 융합을 수행했다. 상기 면역시킨 마우스 유래의 7. 84x106 비장세포를 SP2-O-Ag14 골수종 세포와 5(비장세포)/1(골수종 세포)의 비율로 융합했다.
ACI-41 (Tau206-221 [pT212/pS214]와 Tau196-211 [pS202/pT205]의 혼합물)으로 백신접종한 야생형 C57BLl6 마우스를 하이브리도마 생성에 이용했다. 상기 마우스를 0일째 및 4일째에 ACI-41 백신으로 추가접종하고 8일째에 융합을 수행했다. 상기 면역시킨 마우스 유래의 162x106 비장세포를 SP2-O-Ag14와 골수종 세포와 5(비장세포)/1(골수종 세포)의 비율로 융합했다.
상기 3번의 융합 결과 8x96 웰 플레이트가 얻어졌고, 그 클론들은 플레이트(1-8) 및 열(A-G) 및 최종적으로 칼럼(1-12)에 따라 명명했다.
6.1.2 클론을 선별하기 위한 스크리닝 방법
우선, 상기 8x96 웰 플레이트를 IgG 발현에 대하여 2회 스크리닝했다. 다음에, 양성 발현 클론을 24 웰 플레이트에 옮기고 성장하는 세포의 세포 상등액(클론)을 Tau ELISA 스크린 및 면역조직화학 TAUPIR 스크린에서 시험했다. ELISA 및/또는 TAUPIR에서의 상등액을 T25 플라스크에 옮기고 클론들을 IgG 발현, Tau ELISA 스크린 및 TAUPIR에 대하여 다시 스크리닝했다.
6.1.3 IgG 스크린
Elisa 플레이트를, 4 ℃에서 16 시간 동안 코팅 완충액에서 50 ㎕/웰의 항-마우스 IgG 항체 (CER Groupe, Marloie, Belgium)로 코팅했다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후, 100㎕/웰의 블로킹 용액을 실온에서 1 시간 동안 적용했다. 50 ㎕의 희석하지 않은 하이브리도마 상등액을 실온에서 1 시간 동안 배양했다. 혼합 단계 후, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-결합 항-마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 (Ab Serotec, Raleigh, NC, USA)의 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 상기 플레이트 상에 도포했다. 최종 세척 후, HRP에 대한 포스페이타제 기질인 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 이용하여 검출을 수행하고, 플레이트를 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 405 nm에서 판독했다. 결과는 O.D.(광학 밀도)로 표시한다.
6.1.4 하이브리도마 Tau ELISA 스크린
pTau 펩티드 (ACI-33, T1.5: Tau5-20 [pY18]; ACI-36, T45: Tau401-418 [pS404/S409]; ACI-41, T8.5: Tau206-221 [pT212/pS214] 및 T9.5: Tau196-211 [pS202/pT205] PolyPeptide Laboratories, Hillerod, Denmark), 상응하는 corresponding 타우 펩티드 (ACI-33, T1.6: Tau5-20; ACI-36, T4.6: Tau401-4; ACI-41, T8.6: Tau206-221 및 T9.6: Tau196-211, PolyPeptide Laboratories, Hillerod, Denmark), 인산화 전길이 (441개 아미노산) Tau 단백질 (pTau protein, Vandebroek et al., 2005) 및 전길이 (441 아미노산) 타우 단백질(Tau protein, SignalChem, Richmond, Canada)에 대하여 하이브리도마 ELISA 스크린을 수행했다. 끝으로, 우혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군로 사용했다.
플레이트를 4 ℃에서 10 ㎕/ml의 해당하는 Tau 펩티드 및 1 ㎕/ml의 해당하는 타우 단백질로 밤새 코팅했다. 각각의 웰을 PBS0.05% Tween 20으로 세척하고 PBS-0.05% Tween 20에 용해된 1% BSA로 블로킹한 후, 희석하지 않은 하이브리도마 상등액 또는 배지 음성 그룹을 그 플레이트에 첨가하고 37 ℃에서 2 시간 배양했다. 세척 후 플레이트를 37 ℃에서 2 시간 동안 알칼리성 포스페이타제(AP)-결합 항-마우스 IgG 전체 항체(Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA)와 함께 배양했다. 세척 후, 플레이트를 AP에 대한 포스페이타제 항체인 pNPP (파라-니트로-페닐-포스페이트) 와 함께 배양하고 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 405 nm에서 판독했다. 결과는 O.D.(광학 밀도)로 표시한다.
6.1.5 하이브리도마 IHC 스크린: 형질전환 마우스 유래의 뇌 절편의 농축체에 대한 항-타우 항체의 결합(TAUPIR)
TAUPI 실험을 실시 예 5.1.5의 프로토콜에 따라 수행했다.
6.1.6 T25 플라스크 IgG 스크린
Elisa 플레이트를 탄산염-중탄산염 코팅 완충액 pH 9.6 (Sigma, Buchs, Switzerland)에서 5 ㎍/ml의 항-마우스 IgG F(ab')2 단편 특이적 항체(Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA)로서 4 ℃ 에서 밤새 코팅했다. 플레이트를 세척한 후, 희석하지 않은 하이브리도마 상등액, 양성 대조군 IgG1 항체 (1 ㎍/ml에서 6E10: Covance, Emeryville, CA, USA) 또는 음성 대조군(배지 단독)를 실온에서 1 시간 동안 배양했다. 세척 단계 후, 2차 AP-결합 염소 항-마우스 IgG (아류 1+2a+2b+3) Fc 단편 특이적 항체(Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA)를 37℃에서 2 시간 동안 상기 플레이트에서 배양했다. 최종 세척 후, AP에 대한 포스페이타제 기질인 pNPP (파라-니트로-페닐포스페이트)를 이용하여 검출을 수행하고, 플레이트를 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 405 nm에서 판독했다. 결과는 O.D.(광학 밀도)로 표시한다.
6.2. 결과
ACI -33 하이브리도마
상기 융합으로부터 얻어지는 8x96웰 플레이트 유래의 세포 상등액을 IgG의 생성에 대하여 스크리닝했다. 시험된 768개 웰(8x96 웰)은 IgG 발현에 대하여 양성이었고 24 웰 플레이트에 옮겼다. 상기 24 웰 플레이트에서, 79개 클론들이 성장했고, 그 세포 유래의 상등액을 분석했다. 양성 클론들은 T25 플라스크에 추가로 옮기고 상등액을 IgG 발현, ELISA 및 TAUPIR에 대하여 스크리닝했다(표 6).
24 웰 플레이트 스크린 T25 플라스크 스크린
ELISA에서 양성 TAUPIR에서 양성 IgG 스크린에서 양성 ELISA에서 양성 TAUPIR에서 양성
1A7 1A7
1A11
1C11 1C11
2C9 2C9
3C3 3C3 3C3
3C5 3C5
3E8 3E8
3G10 3G10 3G10 3G10
6C10 6C10 6C10 6C10 6C10
6F3 6F3
6F8 6F8
클론 6C10이 상기 세 개의 스크린에서 유일하게 양성이었고 서브클로닝을 위해 선택되었다.
AGI -36 하이브리도마
융합으로부터 얻어지는 8x96 웰 플레이트 유래의 세포 상등액을 IgG의 생성에 대하여 스크리닝했다. 시험된 768개 웰 (8x96 웰)중에서 333개 웰이 IgG 발현에 양성이었고 24-웰 플레이트에 옮겼다. 상기 24 웰 플레이트에서, 75개 클론이 성장했고 그 세포 유래의 상등액을 분석했다. 양성 클론들을 T25 플라스크에 옮기고 상등액을 IgG 생성, ELISA 및 TAUPIR에 대하여 스크리닝했다(표 7).
24 웰 플레이트 스크린 T25 플라스크 스크린
ELISA에서 양성 TAUPIR에서 양성 IgG 스크린에서 양성 ELISA에서 양성 TAUPIR에서 양성
2B6 2B6 2B6 2B6 2B6
2F92F9 2F9 2F9 2F9 2F9
2G1 2G1 2G1 2G1
3A8 3A8 3A8 3A8 3A8
3B9 3B9 3B9 3B9
3F11 3F11 3F11 3F11
4A3 4A3
4C1 4C1 4C1 4C1
4C12 4C12 4C12 4C12
4E12 4E12 4E12 4E12
5E10 5E10 5E10
5F5 5F5 5F5
7D6 7D6 7D6 7D6 7D6
6H1 6H1 6H1 6H1
다음 단계를 위한 클론을 선택하기 위하여, IgG/ELISA/TAUPIR 스크린에 대하여 양성인 모든 상등액들의 등급매김(ranking)을 ELISA 및 TAUPIR 결과를 기준으로 수행했다. ELISA 및 TAUPIR 결과를 등급매기는 것은 상기 방법 부분에서 설명한 바와 같이 수행했다. TAUPIR 염색은 처음 5개의 클론의 경우 동일했고, ELISA 결과에 대응했다. 4C12는 4C1과 동일한 플레이트에서 확인되어 두 클론이 동일하다는 가능성(동일한 에피토프를 인식함)을 증가시켰기 때문에 버렸다. 선택된 최상의 4개의클론은 3A8, 286, 4C1 및 6H1이었다. 다른 6개의 클론 (4C12, 281, 2F9, 706, 389, 4E12)는 백업(backup)으로 유지했다.
ELISA 스크린 및 TAUPIR 스크린에셔 양성을 나타낸 10개의 클론들의 등급매김을 수행하여 최상의 것을 선택했다(표 8). 회색으로 강조한 부분은 최상의 5개의 클론이다.
ELISA 및 TAUPIR에서 양성 클론에 대한 등급매김
ELISA에 대한 등급매김 TAUPIR에 대한 등급매김
3A8 6H1
2B6 4C1
4C1 3A8
6H11 4C12
4C12 2B6
2G1 2F9
2F9 3B9
7D6 2G1
3B9 7D6
4E12 4E12
ACI -41 하이브리도마
상기 융합으로부터 얻은 8x96 웰 플레이트 유래의 세포 상등액을 IgG의 생성에 대하여 스크리닝했다. 768개 웰(8x96 웰) 중에서 215개 웰이 IgG 발현에 대하여 양성이었고 24 웰 플레이트에 옮겼다. 상기 24 웰 플레이트에서, 81개 클론이 성장했고, 그 세포 유래의 상등액을 분석했다. 양성 클론을 T25 플라스크에 추가로 옮기고, 상등액을 IgG 생성, ELISA 및 TAUPIR에 대하여 스크리닝했다(표 9).
24 웰 플레이트 스크린 T25 플라스크 스크린
ELISA에서 양성 TAUPIR에서 양성 IgG 스크린에서 양성 ELISA에서 양성 TAUPIR에서 양성
3D11 3D11 3D11
4H6 4H6 4H6
5D10 5D10 5D10 5D10 5D10
5E6 5E6
5F10 5F10
6B7 6B7 6B7
7C2 7C2 7C2 7C2 7C2
8G8 8G8
8H8 8H8 8H8
클론 5D10 및 7G2만이 상기 3개의 스크린에서 양성이었고 서브클로닝을 위해 선택했다. 클론 5D10은 펩티드 T8.5에만 결합하는 반면에, 클론 7C2는 AGI-41 백신의 두 펩티드 (T8.5 및 T9.5)에 결합한다(도 10).
5D10 유래의 서브클론 5D10A4는 pTau 펩티드에 특이적이었다.
8.3. 결론
상기 생성된 항체는 비인간화 펩티드에는 거의 결합하지 않으면서 pTau 펩티드에 대한 높은 특이성을 나타냈다.
상기 3 개의 융합체 (ACI-33, ACI-36 및 ACI-41)로부터, 전체 7개의 클론을 OSMZ에 기탁했고(표 10) 추가의 서브클로닝을 위해 선택했다.
기탁된 하이브리도마의 목록
항원 백신 하이브리도마 명칭 기탁 번호 기탁일자
T8: Tau 206-221 [pT212/pS214] + T9: Tau 196-211 [pS202/pT205] ACI-41 ACI-41-Ab1 DSM ACC3043 2010년 3월 3일
T4: Tau 401-418 [pS404, pS409] ACI-36 2B6 DSM ACC3044 2010년 3월 10일
T4: Tau 401-418 [pS404, pS409] ACI-36 3A8 DSM ACC3045 2010년 3월 10일
T4: Tau 401-418 [pS404, pS409] ACI-36 4C1 DSM ACC3046 2010년 3월 10일
T8: Tau 206-221 [pT212/pS214] + T9: Tau 196-211 [pS202/pT205] ACI-41 5D10A3 DSM ACC3047 2010년 3월 10일
T1: Tau 5-20 [pY18] ACI-33 6C10 DSM ACC3048 2010년 3월 10일
T4: Tau 401-418 [pS404, pS409] ACI-36 6H1 DSM ACC3049 2010년 3월 10일
T8: Tau 206-221 [pT212/pS214] + T9: Tau 196-211 [pS202/pT205] ACI-41 7C2 DSM ACC3050 2010년 3월 10일
실시 예 7: ACI -41로 백신접종한 마우스 유래의 두 개의 항체( ACI -41- Ab1 및 5D10) 에 의한 인간 AD 뇌 절편 특이적 염색
본 연구의 목적은 ACI-41 백신으로 면역시킨 마우스의 두 개의 상이한 융합체로부터 생성된 항체 ACI-41-Ab1 (9H3 서브클론 T89-F4) 및 5D10을 이용하여 인간 알쯔하이머 질환(AD) 뇌의 신경섬유 농축체(NFT)를 염색하기 위한 것이다. 이를 위하여, 인간 AD 뇌 절편을 이용한 인산화-타우 단백질 면역반응 염색 분석(TAUPIR)을 이용했다.
7.1. 방법
7.1.1 5 D10 항체 생성
5D10을 실시 예 9에서 기재한 바와 같이 생성했다.
7.1.2 ACI -41- Ab1 생성
7.1.2.1 융합
ACI-41 (ACI-41 백신은 두 개의 인산화-타우 펩티드인 Tau206-221 [pT212/pS214] 및 Tau196211 [pS202/pT205]의 혼합물을 함유함)으로 면역시킨 야생형 C57BLl6 마우스를 하이브리도마 생성에 사용했다. 그 마우스를 융합 전 5일째에 ACI-41 펩티드로 추가 접종했다. 상기 면역시킨 마우스 유래의 58x106개의 비장세포를 SP2/0-O-Ag 14 골수종 세포와 5(비장세포)/1(골수종 세포)의 비로 융합했다. 그 융합결과 10x96 웰 플레이트가 얻어졌고 이 플레이트들을 스크리닝하여 관심 클론을 확인했다.
7.1.2.2 하이브리도마 ELISA 스크린
T8: Tau206-221 [pT212/pS214], T9: Tau196-211 [pS202/pT205] 또는 과인산화된 (hP)-Tau (웨스턴 블럿 부분에서 설명됨) 이 코팅된 플레이트 상에서 하이브리도마 ELISA 스크린을 수행했다.
플레이트를 실온에서 밤새 2 ㎍/ml의 hP-Tau로 코팅했다. 각각의 웰을 PBS로 세척하고 2% FCS(PBS내)로 블로킹 한 후, 하이브리도마 상등액을 그 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양했다. 세척 단계 후, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 PBS 1% FCS에서 퍼옥시다제 결합 AffiniPure 염소 항-마우스 전체 Ig (IgG + IgM의 검출, Dako Glostrup, Denmark)와 함께 배양했다. 플레이트를 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 이용하여 발색 반응시켰다. 그 반응을 2N H2SO4를 이용하여 멈추었고 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 판독했다. 결과는 각각의 하이브리도마 클론에 대하여 광학 밀도(O.D.)로 표시했다.
펩티드의 경우, 플레이트를 10 ㎍/ml의 Tau206-221 [pT212/pS214] 또는 Tau196-211 [pS202/pT205]로 4 ℃에서 밤새 코팅했다. PBS로 세척하고 PBS에서 2% NHS로 블로킹 한 후, 하이브리도마 상등액을 그 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양했다. 세척 단계 후, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 PBS 1% NHS에서 비오티닐화 항-마우스 IgG (Vector labs로부터 구입)와 함께 배양했다. 추가의 단계를 비오틴 결합 항체에 대하여 수행하고, 플레이트를 검출 전에 스트렙타비딘-HRP (ABC 키트, Vector labs)에서 30 분간 배양하였다. 세척 단계 후, 플레이트를 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 이용하여 발색 반응시켰다. 그 반응을 2N H2SO4를 이용하여 멈추었고 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 판독했다. 결과는 각각의 하이브리도마 클론에 대하여 광학 밀도(O.D.)로 표시했다.
7.1.2.3 하이브리도마 IHe 스크린: 형질전환 마우스의 뇌 절편의 농축체에 대한 항-Tau 항체의 결합(TAUPIR)
하이브리도마 세포에 의해 생성된 농축체(tangle)에 대한 항체의 결합을 Tau 형질전환 마우스의 뇌 절편에서 면역조직화학분석법(IHC)으로 수행했다.
뇌 절편은 늙은 (>20 개월) 이중 형질전환 biGT 마우스 (P301L 돌연변이 발현 마우스의 경우의 인간 Tau 최장 아형 (441개 아미노산)과 교잡한 GSK-3 형질전환 마우스) 및 음성 대조군로서 Tau 녹아웃 (TKO) 마우스로부터 얻었다.
TAUPIR 염색을 실시 예 5.1.5의 프로토콜에 따라 수행했다.
7.1.2.4 하이브리도마의 웨스턴 블럿 스크린 ( WB )
형질전환 동물의 뇌추출물 및/또는 hP-Tau 추출물의 pTau에의, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체의 결합을 WB로 수행했다.
야생형 FVB, TPLH, biGT 및 Tau 녹아웃 (TKO) 마우스의 뇌 균질화를 다음 완충액에서 수행했다: 25 mM Tris/HCl pH7.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA,30 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 1 nM 오카다산, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 5 mM Na4P2O7, 1개 정제의 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (CPIC), 전체 12 ml 당. 전체 뇌 균질물을 얻기 위하여, 뇌를 700 rpm에서 모터 구동 포터(유리관/테프론 막자)를 이용하여 1 vol/wt 대뇌반구 (ml / g)로 얼음 상에서 균질화했다.
hP-Tau 추출을 위하여, TPLH 및 TKO 마우스의 뇌를 다음 완충액을 이용하여 균질화했다: 100 mM MES pH 6.8, 1mM l3-머캅토-에탄올, 5 mM EDTA, 2.5 mM PMSF, 5 ㎍/ml 토실-L-리신 클로로메틸 케톤(TLCK), 100 mM NaF, 1 nM 오카다산, 0.2 mM Na3VO4 및 1개 정제의 완전 프로테아제 억제제 칵테일(CPIC), 전체 12 ml. 그 뇌를 700 rpm에서 모터 구동 포터(유리관/테프론 막자)를 이용하여 1 vol/wt 대뇌반구 (ml / g)로 얼음 상에서 균질화했다. 그 균질물을 4 ℃에서 20000xg로 30분간 원심분리하고, 그 상등액을 옮기고 녹는 얼음에서 냉각한 후 95 ℃까지 급속히 가열하여 그 온도에서 10분간 유지했다. 원심분리 단계를 수행한 후 상등액 분취를 수행하고 -20 ℃에서 "hP-Tau"로 보관했다.
전체 뇌 균질물을 시료 완충액(125 mM Tris/HCl pH6.8, 4% (w/v) 도데실 황산 나트륨 (SDS), 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루) +5% 베타-머캅토-에탄올에 절반으로 희석한 다음, 95 ℃까지 급속히 가열했다. 시료를 5 분간 유지하고, 시료 완충액에서 1/4로 희석하고, 95 ℃까지 다시 가열한 다음, 냉각하고 14000rpm으로 5분간 원심분리시켜서, 가용성화되지 않은 데브리스(debris)를 제거했다. 상등액을 수집하고 SDS-PAGE 겔상에 로딩했다. 셀룰로오스 막(Hybond-ECL)에의 이동을 이동 완충액 (25 mM Tris pH 8.6, 190 mM 글리신, 20% 메탄올)에서 수행했다. 막을 블로킹 완충액(TSS 에서 0.1 % Tween (TSS (50 mM Tris HCl, pH7.6, 150 mM NaCl) + 5% 스킴 밀크)에 옮긴 다음, 희석되지 않은 하이브리도마 상등액과 함께 4 ℃에서 밤새 배양했다. 블로킹 용액에 1/10,000으로 희석된 2차 항체인 HRP-결합 염소 항-마우스 (Dako, Glostrup, Denmark)와의 배양을 실온에서 1 시간 동안 수행했다. ECI 웨스턴 블러팅 검출 시약(GE Healthcare)을 이용하여 검출을 수행했다.
7.1.3 인간 AD 뇌의 타우 농축체에 대한 항-인산화- 타우 항체의 결합
항-인산화 Tau 항체 클론인 GI-41-Ab1 (9H3 T89-F4 서브클론) (마우스IgM 아형) 및 5D10 (마우스 IgG 아형)를 ACI-41로 백신접종한 마우스의 두 개의 각각의 융합체로부터 생성했다. 상기 ACI-41 백신은 두개의 인산화-Tau 펩티드인 Tau206-221 [pT212tpS214] 및 Tau196-211 [pS202/pT205]의 혼합물을 함유한다. 인간 AD 뇌의 뇌절편상의 농축체에 대한 항체 클론 T89-F4의 결합을 TAUPIR 면역조직화학법을 통해 수행했다. AD, 진행성 상핵 마비(PSP) 를 갖는 개체 및 건강한 대조군의 피질 뇌 절편을 사용했다. 뇌 절편을 5분간 PBS에서 세척한 다음, 실온에서 PBS:MeOH (1:1) 내의 1.5 % H2O2에서 배양하여 내인성 퍼옥시다제를 블로킹했다. 그 절편을 PBST (PBS/0.1% TritonX100)에서 3회 세척한 후, PBST+10 % FCB (우태혈청) 블로킹 용액에서 실온으로 30분간 배양했다. 일차 항체(클론 9H3 T89-F4, 5D10 및 양성 대조군로서 AT100)를 이용한 배양을 4 ℃에서 밤새 수행했다. 절편을 PBST에서 3회 세척한 다음, 실온에서 1 시간 동안 PBST/10% FCS에서 HRP-결합 염소 항-마우스 (Dako, Glostrup, Denmark) 2차 항체와 함께 배양했다. 검출 전에, 절편을 PBST로 3회 세척하고 50 mM Tris/HCl pH7.6에서 5분간 배양했다. 그 절편을 디아미노벤지딘 (DAB: 10ml의 50 mM Tris HCI + 3 ㎕ H2O2 30 %에서 1개 정제(tablet)) (MP Biomedicals, Solon, OH, USA)에서 3 분간 배양하여 검출 반응을 수행했다. 그 절편을 PBST에서 3회 세척하여 반응을 멈추었다. 다음에, 그 절편을 실란화된 유리판에 옮기고 50 ℃ 열판상에서 2 시간 동안 공기 건조했다. Mayers 헤마톡실린 (Fluka Chernie, Buchs, Switzerland)와 함께 1 분간 배양하여 대조염색을 수행한 다음, 흐르는 수돗물로 4분간 세척했다. 절편을 자일롤에 5분간 2회, 100% EtOH에 1 분간 2회 통과 시킨 다음, 90%, 70%, 50% EtOH 및 증류수에 1 분간 세척하여 탈파라핀화했다. 항원 회수를 위하여, 절편을 0.01 M 구연산 용액 (pH 6.0)에서 10분간 끓인 후 20분간 냉각시켰다. 최종적으로, 절편에 유리 커버 슬립하의 DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, England)를 위치시켰다. 염색된 절편을 형광 조명 기구(epifluorescence illumination optics) 및 3CCD 카메라(Leica,Wetzlar, Germany)를 이용하여 현미경 검사했다. 이미지를 포착하고 전용 소프트웨어 (IM500, Leica)를 이용하여 분석했다.
7.2. 결과
7.2.1 하이브리도마의 스크리닝
ELISA 스크린을 상기 방법에서 기재된 바와 같이 수행하고 172개의 하이브리도마 클론을 선택하고 12-웰 플레이트에 옮겼다. 다음에, ELISA를 수행하여 pTau 펩티드인 Tau206-221 [pT212/pS214], Tau196-211 [pS202/pT205] 및/또는 hP-Tau 추출물에 대한 상기 생성된 항체의 특이성을 평가했다. 그 결과, pTau 펩티드에 대한 25개의 양성 클론이 얻어졌고 21개의 클론은 hP-Tau에 대하여 특이성을 나타냈다 (도 11).
ELISA 분석과 병행하여 면역조직화학 연구를 수행했다. 상기 12-웰 플레이트에 옮겨진 클론들에서 상이한 염색 패턴들이 확인되었다. 선택된 클론 유래의 희석되지 않은 상등액과 함께 배양한 일부 biGT 절편에서 비특이적인 신경교종, 핵 및 세포질 염색이 관찰되었다.
클론인 9H3 (ACI-41-Ab1) 유래의 상등액은 높은 특이성으로 세포질 농축체 구조를 염색했다.
여러 가지 마우스 유래의 뇌 및 hP-Tau 추출물에 대한 WB 스크린을, 선택된 하이브리도마 유래의 희석되지 않은 상등액을 이용하여 수행했다.
7.2.2 인간의 알츠하이머 질환 뇌 절편의 신경섬유 농축체의 염색
항체 클론인 ACI-41-Ab1 (9H3 서브클론 T89-F4) 및 5D10이 인간 AD 뇌의 NFT에 결합하는 능력을 TAUPIR 면역조직화학 분석법으로 조사했다. 항-인산화 Tau 항체 클론은 인간 AD 뇌의 인산화-Tau 함유 NFT에 결합했다 (도 12).
인간 AD 피질 뇌 절편의 NFT에 결합하기 위한 항체 5D10의 능력을 TAUPIR 면역조직화학 분석법으로 조사했다. 항-인산화 Tau 항체는 인간 AD 뇌 피질 절편의 인산화-Tau 함유 NFT에 결합했다 (도 12).
7.3. 결론
ACI-41에 의해 발생된 하이브리도마 클론의 ELISA에 의한 스크리닝 결과, 포스포-펩티드 및/또는 전길이 hP-Tau에 결합하는 36개의 클론이 선별되었다. 이러한 36개 클론의 TAUPIR에 의한 스크리닝 결과, 하나의 클론 (9H3), ACI-41-Ab1에 의한 세포질 농축체 구조의 염색이 확인되었다.
두 개의 항체인 AGI-41-Ab1 (9H3-F4) 및 5D10은 인간 AD 뇌 절편의 NFT 및 신경그물 실에의 특이적인 결합을 나타냈다.
실시 예 8: 2개의 상이한 방법들에 의해 생성된 ACI -35가 야생형 마우스 (C57BL/6)에 복막내 및 피하 면역 후 pTau-특이적 IgG 반응을 유도하는 능력
본 연구의 목적은 2개의 상이한 방법, 즉 Process A ACI 또는 방법 L3 ACI에 의해 생성된 ACI-35 (Tau393-408 [pS396/pS404])가 야생형 C57BL/6 마우스에서 피하 (s.c.) 또는 복막내 주사 후(i.p.) 항체 역가를 유도하는 능력을 평가하기 위한 것이다. 마우스를 2주 간격으로 3회 면역시키고 첫 번째 주사 전 1 주전에 출혈시키고 면역 후마다 1주 후에 출혈시켰다. 전체 항-pTau (Tau393-408 [pS396/pS404]) IgG 반응을 ELISA로 측정했다. 또한, 상기 항체 반응의 아형 패턴을 3회 면역 후에 분석하여 IgG의 여러 가지 아형 및 IgM의 분포를 평가했다. 상응하는 비-Tau (Tau393-408) 펩티드에 대한 항체 역가를 분석했다. AGI-35에 의해 유도된 T 세포 반응을 EUSPOT 기법을 이용하여 분석했다.
8.1. 방법
8.1.1 방법 A ACI 에 의한 백신 ACI -35의 제조
ACI-35 백신을 실시 예 3의 프로토콜에 따라 제조했다. 다음에, 리포좀 현탁액 (배치 ACI-35-081103-B)을 분취한 다음 2~8 ℃에서 보관했다. 최종 펩티드/인지질의 몰비는 1:100이었다.
8.1.2 방법 L3 AGI 에 의한 백신 AGI -35의 제조
Tau 유래의 테트라팔미토일화 Tau393-408 [pS396/pS404] (8396 및 8404에서 포스포노기를 갖는 인간 Tau 393-408) (4.0 mg)을 25 ml 유리 바이알내로 칭량하고 헥사플루오로이소프로판올(HFIP)(5 ml)을 첨가했다. 다음에, 그 투명한 용액을, 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤 (DMPG), 콜레스테롤, 및 클로로포름내의 애주번트 모노포스포릴 지질 A(MPLA)(모두 Avanti Polar Lipids Inc. AL, USA) (각각 9:1:7:0.2의 몰비) 의 교반 용액(35 ml)에 첨가했다. 다음에, 얻어지는 용액을 0.2 ㎛ 소수성 PTFE 필터 막을 통해 250 ml 유리 둥근 바닥 플라스크내로 여과했다. 다음에, 유기 용매를 40℃에서 감압 하에 증발시킨 후 고진공하에 3 시간 동안 증발시켜 제거했다. 얻어지는 박막에 PBS (40ml)를 첨가하고 실온에서 18 시간 동안 부드럽게 교반하여 박막을 다시 탈수 시켰다. 다음에, 그 리포좀 현탁액(배치 ACI-35-081103-A)를 분취하여 2~8 ℃에서 보관했다. 최종 펩티드/인지질의 몰비는 1:100이었다.
8.1.3 면역화
13 주령 C57BL/6 마우스 (그룹당 10 마리)에서 상기 백신을 표 11에 따라 2주 간격(0일, 14일, 28일)으로 3회 피하 또는 복막내 주사했다. 첫 번째 면역전 1주째 및 주사 후 7일째(즉, 7일, 21일, 35일) 및 희생시에(56일째), 혈액 시료를 채취하고 혈장을 제조했다. Tau393-408 [pS39S/pS404]-특이적 IgG 및 IgM 항체 역가 및 IgG 아형 패턴을 ELISA로 측정했다. 대조군으로, pTau393-408-비특이적 IgG 항체 역가를 ELISA로 측정했다.
마우스 면역화
그룹 동물의 수 및 성별 처리/체적a 백신 체적 방법 투여
경로b 		타우 펩티드의 투여량
㎍/투여		 MPLA의 양
㎍/투여
1 10마리 암컷 ACI-35
0.2 ml		 ACI-35-001103-A L3 ACI 복막내 10 16
2 10마리 암컷 ACI-35
0.2 ml		 ACI-35-001103-A L3 ACI 피하 10 16
3 10마리 암컷 ACI-35
0.2 ml		 ACI-35-001103-B A ACI 복막내 13 19
4 10마리 암컷 ACI-35
0.2 ml		 ACI-35-001103-B A ACI 피하 13 19
a: 이론적 체적
b: 피하
c: 분석 후 측정된 양
8.1.4 타우 펩티드 특이적 항체의 정량
Tau393-408 [pS396/pS404]에 특이적인 IgG 항체를 5개의 혈장 츨혈 시료에서 ELISA로 측정했다. 특이적인 Tau393-408 IgG 항체, Tau393-408 [pS396/pS404]-특이적 IgM 및 IgG 아형 항체는 35일째 혈장 시료에서 ELISA로 측정했다.
플레이트를 4 ℃에서 밤새 10 ㎍/ml의 상응하는 Tau 펩티드로 코팅했다. 각각의 웰을 PBS-0.05% Tween 20으로 세척하고 PBS-O.05% Tween 20에서 1% BSA로 블로킹한 다음, 혈장의 멸균 희석액을 상기 플레이트에 첨가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양했다. 세척 후, 플레이트를 알칼리성 포스페이타제(AP)-결합 항마우스 IgG 항체(Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) 또는 아형 특이 항체(양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-결합 항-마우스 IgM, AP-결합 항-마우스 IgG1, 비오틴-결합 항-마우스 IgG2a 및 IgG3(Pharmingen BD, San Diego, CA, USA) 및 HRP-결합 항-마우스 IgG2b (Zymed Laboratories, San Francisco, GA))와 함께 37 ℃ 에서 2 시간 동안 배양했다. 세척 후, 플레이트를 AP에 대한 포스페이타제 기질인 pNPP(파라-니트로-페닐-포스페이트, 또는 HRP에 대한 기질인 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)와 함께 배양하고, ELISA 플레이트를 이용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정했다. 비오틴-결합 항체에 대한 추가의 단계를 수행하였는데, 이 경우 플레이트를 스트렙타비딘-HRP (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에서 45 분간 배양한 다음 ABTS를 이용하여 검출했다. 결과는 첫 번째 희석 시 및 IgG에 대한 불포화 희석 시 및 IgG 아형 및 IgM에 대한 불포화 희석시의 O.D.(광학 밀도)로 표시된다.
8.1.5 ELISPOT 에 의한 타우 펩티드 특이적 시토카인 생성 T 세포의 정량
Tau393-408 [pS396/pS404] 및 Tau393-408-특이적 T 세포들의 시토카인 생성을 ELISPOT에 의해 평가했다. 멀티스크린 96-웰 니트로셀룰로오스 플레이트 (Millipore, Molsheim, France)를 제조사의 지시(Pharmingen 80, San Diego, CA, USA) 에 따라 항-마우스 IFN- γ 및 IL-4 모노클로날 항체로 밤새 코팅했다. 면역시킨 마우스의 비장세포로부터 단일 세포 현탁액을 제조하고 5% CO2하에서 72 시간 동안 37 ℃에서 Tau393-408[pS396/pS404] 및 Tau393-408 (10 및 1 ㎍/ml) 및 Concavalin A (5 ㎍/ml, Amersham)과 함께 연속 희석액 상태로 배양했다. 다음에, 상기 플레이트들을 세척하고, 비오티닐화 항-마우스 IFN-γ및 IL-4 모노클로날 항체와 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 배양했다. 세척 후, 상기 플레이트를 스트렙타비딘-HRP와 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하고, 세척 후, 기질(AEC, 3-아미노-9-에틸카바졸)을 첨가하여 스팟을 발색시켰다. 웰당 스팟의 수를 실체 현미경 하에서 육안으로 계수하고 그 결과를 106개 세포당 스팟의 수로 표시했다. 미처리 마우스(naive mice)의 비장을 음성 대조군로 사용했다.
8.1.6 비방사성 세포 증식 분석
면역시킨 마우스의 비장세포로부터 단일 세포 현탁액을 제조하고 5% CO2하에서 72 시간 동안 37 ℃에서 Tau393-408[pS396/pS404] 및 Tau393-408 (10 및 1 ㎍/ml) 및 Concavalin A (5 ㎍/ml, Amersham)과 함께 연속 희석액 상태로 배양했다. 증식을 측정하기 위하여, 비방사성 세포 증식 분석(MTT) 키트를 제조사(Promega, Dubendorf, Switzerland)의 지시에 따라 사용했다. 간략히 말해서, 15㎕의 염료 용액을 각각의 웰에 첨가하고 그 플레이트를 37 ℃에서 4 시간 동안 배양했다. 다음에, 100 ㎕의 가용성화 스톱(stop) 용액을 각각의 웰에 첨가하고 그 플레이트를 4 ℃에서 최소 1 추가로 반응시켰다. 570 nm 및 690 nm 에서 O.D.를 측정했다.
8.2. 결과
8.2.1 여러 가지 백신에 의해 유도된 항체 반응의 평가
ACI-35 백신은 사용된 방법과 무관하게 복막 내 또는 피하 주사 후 강한 항-pTau393-408 [p396/pS404] IgG 반응을 유도했다. 일반적으로 첫 번째 백신 면역 후 7일째에 강한 항체 역가가 이미 존재하였다. 동일한 방법의 경우, 방법 L3 ACI로 백신 접종한 동물의 경우 21일 및 35일 동안 복막내 주사와 비교하여 피하 주사의 경우에 반응이 더 높았고(도 14, 2원 분산분석, P<0.001 21일/35일), 방법 A AGI로 주사된 동물의 경우 21일, 35일 및 56일 동안 피하 주사의 경우에 반응이 더 높았다(도 14, 2원 분산분석, P<0.001 21일/35일, P<0.01 56일). 복막내 주사된 동물의 경우, 그 반응은 7일 및 21일째의 초기 출혈 시 A ACI 방법과 비교하여 L3 ACI 방법의 경우에 더 높은 반면에(도 14, 2원 분산분석 P<0.001 7일/21일), 피하 주사된 동물의 경우에는 차이가 없었다. 요약하면, 두 방법들은 피하 주사 시 동등한 것으로 판단되었다.
불포화 O.D. 희석비에서의 결과를 분석한 결과, 다른 ACI-35 백신 방법의 복막내 및 피하 주사 사이의 차이가 확인되었다. 요약하면, 그 결과는 피하 주사가 복막내 주사보다 더욱 높은 Ab 역가를 제공했고 피하 주사의 경우 상기 두 방법들 사이에 유의적인 차이가 없다는 결과가 동일하게 유지되었다.
백신에 의해 유도된 항체의 아형을 확인하기 위하여, 35일째로부터의 혈장을 아형 특이적 IgG ELISA에 의해 분석했다. ACI-35는 모든 군에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 아형의 항-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG를 유도했다. IgG2b가 1/3200의 희석비에서도 높은 O.D.를 갖는 우세한 아형이었다. IgG1 아류의 경우, 두 방법에서 복막 내 주사와 비교하여 피하 주사의 경우에 반응이 더 높았다 (도 15, 일원분산분석, P<0.05). IgG3 아류의 경우 동일한 차이가 관찰되었다. IgG2a 및 2b 아류의 경우에는, 시험된 2 방법들 간에 차이가 없었을 뿐 아니라 백신의 복막 내 주사 및 피하 주사 사이에도 차이가 없었다.
상기 2가지 시험된 방법 사이에는 항-pTau393408[pS396/pS404] IgM 항체 반응에 차이가 없는 반면에, 피하 주사와 비교하여 복막 내 주사의 경우에 IgM 역가가 유의하게 높았다 (도 16a, 일원 분산분석 P<0.001).
또한, 비(non)-인산화 Tau393-408에 대한 항체 역가를 모든 군에 대하여 분석했다. 항-Tau393-408 특이적 IgG 항체가 모든 그룹에서 검출되었지만, 이의 역가는 항-pTau393-408 [pS396/pS404]보다 낮았다. 상기 두 방법 또는 주사 방식의 사이에는 항-Tau393-408 IgG 역가에 차이가 없었다(도 16b, 일원분산분석, P>0,05).
서로 다른 타우(Tau) 펩티드들에 대한 처음 세 개의 IgG 역가의 평균이 표 12에서 나타나 있다.
처음 세 개의 Tau393-408 [pS396/S404] IgG 역가(1/100 희석비에서의 O.D.)의 평균
백신 pTau 펩티드 백신을 생성하기 위한 방법 주사 방식 7일 21일 35일 평균
Tau393-408 [pS396/S404] L3 ACI 복막내 1.899 2.284 1.825 2.003
피하 1.485 2.956 2.444 2.295
A ACI 복막내 0.902 1.467 1.708 1.359
피하 1.276 2.964 2.426 2.222
8.22 ACI -35에 의해 유도된 T 세포 반응의 평가
시험관내에서 ConA, pTau393-408 [pS396/pS404] 또는 Tau393-40B 펩티드를 이용하여 비장세포를 다시 자극한 결과, 시험한 군들 사이에는 증식의 차이가 없었으나 (도 17), GonA의 경우에는 양성이었다.
10 ㎍/ml의 Tau393-40B [pS396/S404]를 이용한 재자극(re-stimulation )은 미처리 마우스와 비교하여 백신접종 마우스 유래의 비장세포의 경우에 더욱 높은 시토카인 분비를 유도했다(도 18). 피하 주사한 방법 L3 ACI는 IFN-γ, IL-4의 사이에 명백한 차이가 없이 두 경우 모두 더욱 높은 수준의 시토카인을 유도한다. 방법 A ACI의 정맥 내 주사 또는 피하 주사는 주로 IL-4인 시토카인 분비를 유도하고 그 수준은 복막 내 주사의 경우에 더 높다. ㎍/ml의 Tau393-40B [pS396/S404]을 이용한 재자극은 10 ㎍/ml의 Tau393-40B [pS396/S404]를 이용한 재자극과 비교가능한 결과를 유도했다.
비-pTau939-408 펩티드를 이용한 재자극은 pTau 펩티드 대조물과 비교가능한 결과를 유도했다(도 18). 역시, 방법 A ACI를 시용하면, 주로 IL-4인 시토카인이 유도된다.
8.3. 결론
ACI-35 백신은 상기 방법 또는 주사 방식과 무관하게 1차 면역 후 이미 강한 IgG 역가를 유도했다. 비교의 측면에서, 사용된 방법과 무관하게 백신의 피하 주사는 더욱 높은 IgG 항체 역가를 나타냈다. ACI-35 방법의 복막 내 주사 결과, IgG1 및 IgG3 역가가 다른 군과 비교하여 낮았다. ACI-35의 복막 내 주사 결과, IgM 역가가 피하 주사의 경우와 비교하여 유의하게 높았다. 끝으로, 모든 군들은 비-pTau393-408 펩티드에 대한 IgG 역가를 갖는다.
pTau 또는 Tau 펩티드를 이용한 재자극은 ELISPOT 연구에서 방법 A ACI로 백신접종한 마우스의 경우에 주로 IL-4인 시토카인 생성을 유도했다.
실시 예 9: Tau P301L 형질전환 마우스( TPLH )에서 타우 백신의 면역원성
본 연구의 목적은 Tau P301L 형질전환 마우스에서 타우 리포좀 백신(ACI33, ACI-35, AGI-39 및 ACI-40)의 피하(s.c.) 주사를 이용하여 항- Tau 백신접종의 면역원성을 분석하는데 있다.
9.1. 방법
9.1.1 타우 P301L 형질전환 마우스 ( TPLH )
FVB/N 배경을 갖는 동형접합 Tau P301L 형질전환 마우스를 이용하여, ACI-33 또는 ACI-35 피하 백신접종의 효능을 시험했다. 이러한 마우스는 마우스 thy1 프로모터의 조절하에서 P301L 돌연변이를 갖는 최장(longest) 인간 타우 아형을 발현한다. 6 내지 7월의 나이 및 늙은 TPLH 마우스에서 설정된 임상 증상은 진행성 신경 손상 및 신경섬유 농축체(NFT)의 형성과 함께 소멸성 타우병증을 발생한다. 말기 단계에서, 그 마우스는 체중이 감소하고, 그 대부분은 9개월 내지 11개월의 나이 및 예외 없이 12개월의 나이 이전에 급사(거의 호흡 문제(질식)로 인해)한다.
9.1.2 백신 ACI -33 및 ACI -35의 제조
실시 예 3의 방법 A에 따라 백신을 제조했다. 다음에, 리포좀 현탁액(배치 ACI-33-081031-A 및 배치 ACI-35-081015-A + GI-35-090402-A)를 분취한 후 2~8 ℃에서 보관했다. 최종 펩티드/인지질의 몰비는 1:100 이었다.
9.1.3 면역화
ACI -33, ACI -39 및 ACI -40
21 주 내지 31 주의 연령의 TPLH 마우스 (군당 8~10 마리 마우스: 암컷 및 수컷의 혼성)에게, 상기 백신을 5회 피하 주사했다(표 14). 처음 세 번의 면역은 계획 1에 따라 투여사이에 2주 간격(0일, 13일, 28일)으로 수행했다. 다음에, 그 동물들을 1 달에 1회 2 달 동안 추가 접종했다(91일 및 133일). 1차 면역전 1일, 2차 면역후(27일) 및 3차 면역후에(41일), 혈액 시료를 채취했다. 또한, 혈액 채취는 추가 접종 이전, 동안 및 이후(76일, 104일, 135일)에 수행했다. 그 혈액 시료를 밤새 정치하여 응고시킨 다음 원심분리 후 상등액을 취함으로써 혈청을 제조했다. 인산화-타우 펩티드 특이적 IgG 및 IgM 항체 역가 및 IgG 아형 패턴을 ELISA에 의해 측정했다. 또한, 비-pTau, 전길이(441개 아미노산) Tau 단백질 및 인산화 전길이 (441개 아미노산) 타우 단백질에 대한 특이적 IgG 항체 역가를 ELISA에 의해 측정했다.
ACI -35
21 주 내지 31 주의 연령의 TPLH 마우스 (군당 10 마리 마우스: 암컷 및 수컷의 혼성)에게, 상기 백신을 5회 피하 주사했다(표 13). 처음 세 번의 면역은 계획 1에 따라 투여사이에 2주 간격(0일, 13일, 28일)으로 수행했다. 다음에, 그 동물들을 1 달에 1회씩 2 달 동안 추가 접종했다(91일 및 133일). 1차 면역전 1일(-1일), 2차 면역후(26일) 및 3차 면역후에(40일), 혈액 시료를 채취했다. 또한, 혈액 채취는 추가 접종 이전, 동안 및 이후(75일, 103일, 145일, 155일)에 수행했다. 그 혈액 시료를 밤새 정치하여 응고시킨 다음 원심분리 후 상등액을 취함으로써 혈청을 제조했다. Tau393-408 [pS396/pS404]-특이적 IgG 및 IgM 항체 역가 및 IgG 아형 패턴을 ELISA에 의해 측정했다. 또한, 비-pTau393408, 전길이(441개 아미노산) Tau 단백질 및 인산화 전길이 (441개 아미노산) 타우 단백질에 대한 특이적 IgG 항체 역가를 ELISA에 의해 측정했다.
마우스 면역화
군 동물의 수 및 성별 처리/체적a 백신 배치 투여 경로b 타우 펩티드의 투여량
㎍/투여		 MPLA의 양c
㎍/투여
1 5마리암컷
5마리수컷
5마리암컷
5마리수컷		 ACI-33
0.2 ml
PBS
0.2ml		 ACI-33-081031-A

N.A.		 s.c

s.c
 9

N.A.
 12

N.A.
2 5마리암컷
5마리수컷
5마리암컷
5마리수컷		 ACI-33
0.2 ml
PBS
0.2ml		 ACI-33-081031-A
ACI-33-090402-A
N.A.		 s.c

s.c
 16
8
N.A.
 23
27
N.A.
3 5마리암컷
5마리수컷
5마리암컷
5마리수컷		 ACI-33
0.2 ml
PBS
0.2ml		 ACI-39-090202-A

N.A.		 s.c

s.c
 9.6

N.A.
 28.8

N.A.
4 5마리암컷
5마리수컷
5마리암컷
5마리수컷		 ACI-33
0.2 ml
PBS
0.2ml		 ACI-40-090202-A

N.A.		 s.c

s.c
 12

N.A.
 24.4

N.A.
N.A.=적용 불가
a: 이론적 체적
b: s.c.:피하
c:분석후 측정한 양
9.1.4 타우 펩티드 득이적 항체의 정량
For ACl-33, ACI-39 및 ACI-40으로 처리한 마우스의 경우, Tau5-20 [pY18], Tau206-221 [pT212, pS214] 및 Tau196-211 [pS202, pT205] 각각에 대한 특이적인 IgG 항체를 6개의 출혈 항체에서 ELISA에 의해 측정했다. Tau5-20-, 전길이 (441개 아미노산) 타우 단백질- 및 인산화 전길이(441개 아미노산) 타우 단백질-특이적 IgG를 -1일 및 41일째 혈청에서 측정했다. 인산화 타우 펩티드-특이적 IgM 및 IgG 아형 항체를 41일째의 혈청의 출혈 시료에서 ELISA에 의해 측정했다.
ACI-35로 처리한 마우스의 경우, Tau393-408 [pS396/pS404]에 대한 특이적인 IgG 항체를 7개의 특이적인 출혈 항체에서 ELISA에 의해 측정했다. Tau393-408-, 전길이(441개 아미노산) 타우 단백질 및 인산화 전길이 (441개 아미노산) T타우 단백질 특이적 IgG는 -1일째 및 40일째 혈청에서 측정했다. Tau393-408 [pS396/pS404] 특이적 IgM 및 IgG 이형 항체는 40일째 혈청의 출혈 시료에서 측정했다.
플레이트를 4 ℃에서 10 ㎍ /ml의 해당하는 타우 펩티드 및 1 ㎍ /ml의 해당하는 타우 펩티드로 밤새 코팅했다. 각각의 웰을 PBS-0.05% Tween 20로 세척하고 PBS-0.05% Tween 20에서 1% BSA로 블로킹 한 후, 혈청의 연속 희석액을 상기 플레이트에 첨가하고 37 ℃에서 2 시간 배양했다. 세척 후, 플레이트를 알칼리성 포스페이타제(AP)-결합 항마우스 IgG 전체 항체(Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) 또는 아형 특이적 항체(양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-결합 항-마우스 IgM, AP-결합 항-마우스 IgG1, 비오틴-결합 항-마우스 IgG3(구입처: Pharmingen BD사, San Diego, CA, USA) 및 HRP-결합 항-마우스 IgG2b (Zymed Laboratories사, San Francisco, GA))와 함께 37 ℃ 에서 2 시간 동안 배양했다. 세척 후, 플레이트를 AP에 대한 포스페이타제 기질인 pNPP(파라-니트로-페닐-포스페이트, 또는 HRP에 대한 기질인 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)와 함께 배양하고, ELISA 리더 플레이트를 이용하여 405 nm에서 판독했다. 비오틴-결합 항체에 대한 추가의 단계를 수행하였는데, 이 경우 플레이트를 스트렙타비딘 HRP (R&D Systems, Minneapolis사, MN, USA)에서 45 분간 배양한 다음 ABTS를 이용하여 검출했다. 결과는 IgG, IgG 아형 및 IgM에 대한 불포화 O.D.(광학 밀도)에서의 O.D. 로 표시된다.
9.1.5 형질전환 동물의 뇌 절편상의 타우 농축체에 대한 항- 타우 항체의 결합 (TAUPIR)
뇌 절편 상의 농축체에 대한, ACI-33, ACt-35, ACI-39 및 ACI-40으로 백신접종한 동물의 혈청에 존재하는 항체의 결합을 TAUPIR 면역조직화학법으로 수행했다. TAUPIR 염색을 실시 예 5.1.5의 프로토콜에 따라 수행했다.
9.1.6 웨스턴 블럿 ( WB )
실온에서 30 내지 60분 동안 Qdot 6.25 스트렙타비딘 결합 용액 (Invitrogen, CA, USA)을 이용한 검출 전에 세척을 수행하였다는 것을 제외하고 실시 예 5.1.6의 프로토콜에 따라 웨스턴 블럿을 수행했다.
9.2. 결과
9.2.1 IgG 항체 반응
모든 백신 구조물은 특이적 IgG 항체 역가를 생성했다. ACI-33 백신은 피하 주사 후 특이적 IgG 반응을 유도했다. 2회의 면역 후(27일), IgG 반응은 안정하게 유지되었으며, 3차 면역(41일)의 경우 증가하지 않았다 (도 19, 일원분산분석 P< 0.001 -1일 대 27일, P>0.05 27일 대 41일). 76일째에 항체 역가의 감소가 관찰되었고(도 19, 일원분산분석 P<0.001 41일 대 76일), 동물의 추가 접종은 104일째에 역가를 약간 증가시켰다.
ACI-35 백신은 피하 주사 후 항-Tau393-408 [pS396/pS404]-lgG 반응을 유도했다. 2회의 면역 후(26일), IgG 반응은 3차 면역(40일)의 경우에 증가하지 않았다(도 20, 일원 분산분석, P< 0.001 -1일 대 26일 및 40일). 동물의 추가접종은 103일째에 역가를 더욱 증가시켰다(도 20, 일원분산분석 P< 0.05 -1일 대 104일 및 P<0.001 -1일 대 145일).
ACI-39 백신은 피하 주사 후 항-Tau206-221 [pT212, pS214] IgG 반응을 유도했다. 2회 면역 후(27일), IgG 반응은 안정하게 유지되었고, 3차 면역(41일)에 의해 증가하지 않았다(도 21, 일원분산분석 P<0.001 1일 대 27일/41일). 76일째에 역가의 저하가 있었고, 동물의 추가접종은 그 역가를 3차 면역 후와 동일한 수준으로 복귀시켰다 (도 21, 일원분산분석 P< 0.05 -1일 대 76일 및 P> 0.05 41일 대 104일).
불포화 O.D. 희석비에서의 결과를 분석한 결과, 포화 1/100 희석비와 동일한 결론이 얻어졌다(일원 분산분석 P<0.05 -1일 대 27일/41일/104일 및 P>0.05 -1일 대 76일).
ACI-40 백신은 피하 주사 후 항-Tau196-211 [pS202, pT205] IgG 반응을 유도했다. 2차 면역 후(27일), IgG 반응은 안정하게 유지되었으며, 3차 면역(41일)에 의해 증가하지 않았다 (도 22, 일원 분산분석 P< 0.001 -1일 대 27일, P>0.05 27일 대 41일). 76일째에 항체 역가의 감소가 관찰되었다(도 22, 일원분산분석 P<0.001 41일 대 76일). 동물의 추가 접종은 104일째에 그 역가를 약간 더 증간시켰다.
불포화 O.D. 희석비에서의 결과를 분석한 결과, 포화 1/100 희석비와 동일한 결론이 얻어졌다 일원분산분석 P< 0.001 -1일 대 27일, P>0.05 27일 대 41일, 및 P<0.01 41일 대 76일).
9.2.2. 아형 분석
ACI-33 백신접종은 3회의 피하 면역 후, 주로 IgG2a 및 2b 아류인 항체 역가를 유도했다 (도 23). IgG1, IgG3 및 IgM 수준은 낮았고, IgG2a/2b와 IgG1/IgM의 수준 사이에는 유의적인 차이가 있었다 (도 23, 일원분산 분석 P<0.05 IgG1 대 IgG2a/2b, P<0.001 IgM 대 IgG2a/2b).
ACI-35 백신접종은 3회의 면역 후 주로 19G2a 및 2b 아류인 항체 역가를 유도했다(도 24). IgG1 수준은 더욱 낮았는데 IgG1과 IgG2a 사이에는 유의적인 차이가 있었다(도 24, 일원분산분석 P<0.05 IgG1 대 IgG2a). IgG3 및 IgM 수준은 낮았는데, IgG2a/2b와 IgG3/IgM 수준들의 사이에는 유의적인 차이가 있었다 (도 24, 일원 분산분석 P<0.05 IgG3/IgM 대 IgG2b, P<0.0001 IgG3/IgM 대 IgG2a).
ACI-39 백신접종은 3회의 피하 면역 후 주로 IgG2a 및 2b 아류인 항체 역가를 유도했다 (도 25). IgG1, IgG3 및 IgM 수준은 IgG2a/2b 역가보다 유의하게 낮았다(도 25, 일원분산분석 P<0.05 IgG2b 대 IgG1/IgG3, P<0.01 IgG2a EO IgG1/IgG3, P<0.001 IgG2a/2b 대 IgM).
ACI-40 백신접종은 3회의 면역 후 주로 IgG2b 아류인 항체 역가를 유도했다(도 26, 일원분산분석 P<0.05 IgG2b 대 IgG2a 및 P<0.001 IgG2b 대 IgG1/IgG3/IgM). 또한, IgG2a 역가는 IgM보다 높았다 (도 26, 일원분산분석 P<0.01 IgG2a 대 IgM).
9.2.3 항체 특이성
또한, 타우 백신의 3회 피하 주사 후에 유도된 IgG 역가를 여러 가지 Tau 펩티드 (pTau 펩티드 및 Tau 펩티드) 및 단백질(항-인산화 전길이 (441aa) 타우 단백질 = 항-pTau 단백질 및 전길이(441aa) 티우 단백질 = 항-타우 단백질)에 대하여 분석했다.
ACI-33으로 백신접종한 마우스의 경우, -1일째의 출혈을 대조군로 사용하고, 각각의 상이한 코팅의 경우, Tau5-20 [pY18] 및 Tau 단백질 코팅들의 경우 3회 면역 후에 채취한 혈청과 전출혈의 사이에는 차이가 있었다 (도 27, 일원분산분석, Tau5-20 [pY18]의 경우 P<0.001 d-1 대 41일, 타우 단백질의 경우 P<0.05 -1일 대 41일).
AGI-35로 백신접종한 마우스의 경우, -1일째의 출혈을 대조군로 사용했고, 항-Tau393-408 [pS396/pS404] 역가 만의 경우 -1일과 40일의 사이에는 유의적인 차이가 있었다(도 28, 일원분산분석, 항-Tau393-408 [pS396/pS404] 역가의 경우 P<0.0001 -1일 대 40일). 또한, Tau393-408 [pS396/pS404] 에 대하여 얻은 40일째의 항체 수준은 모든 다른 코팅에 대하여 얻은 수준과 유의적으로 상이했다(도 28, 일원분산분석 P<0.0001 40일째의 항-Tau393-408 [pS396/pS404] 대 40일째의 항-Tau393-408/pTau 단백질/타우 단백질).
ACI-39로 백신접종한 마우스의 경우, -1일째의 출혈을 대조군로 사용했고, Tau206-221 [pT212, pS214] 코팅의 경우, 상기 전출혈과 3일후에 얻은 혈청 사이에는 차이가 있었다(도 29; 일원분산분석, Tau206-221 [pT2i2, pS214]의 경우 P<0.001 -1일 대 41일).
ACI-40으로 백신접종한 마우스의 경우, -1일째 출혈을 대조군로 사용했고, Tau196-211 [pS202, pT205] 및 Tau 196-211 코팅의 경우, 상기 전출혈과 의 3회 면역 후 채취한 혈청의 사이에는 차이가 있었다(도 30, 일원분산분석, Tau196-211 [pS202, pT205]의 경우 P<0.001 -1일 대 41일, Tau196211의 경우 P<0.05 -1일 대 41일).
또한, 마우스 혈청을 TAUPIR 실험에서 사용하여, 그 혈청에 존재하는 항-Tau 항체가 타우 형질전환 동물의 뇌 절편의 농축체를 인식할 수 있는 지의 여부를 확인했다.
또한, 여러 가지 마우스 유래의 뇌 추출물에 대한 WB를 마우스 혈청 또는 대조 항체인 타우((pTau 및 Tau)의 타우-5 검출 형태를 이용하여 수행했다.
데이터는 하기 표 14에서 요약되어 있다.
백신접종 마우스에 대한 TAUPIR 및 WB의 요약
백신 TAUPIR (양성/전체 마우스) 웨스턴 블럿 (양성/전체 마우스)
ACI-33 6/10 3/9
ACI-35 4/10 0/4
ACI-39 7/10 1/5
ACI-40 10/10 3/7
9.3. 결론
항-타우 항체 역가를 여러 가지 타우 및 pTau 펩티드 외에도 전길이 pTau 또는 타우 단백질에 대한 그의 결합에 대하여 분석했다. 타우 리포좀 면역화는 비포스포-펩티드에는 약하게 결합하면서 pTau 펩티드 및 인산화 타우 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성했다.
IgG 아형의 측면에서, IgG2b 및 IgG3와 비교하여 IgG1 항체 반응은 낮았다. 투여 방식(피하)에 따라 낮은 IgM 반응이 관찰되었다.
타우 백신으로 면역시킨 마우스에 의해 생성된 항체의 특이성을 TAUPIR에서 시험하였고, 거의 모든 마우스 혈청은 돌연변이 타우 동물의 뇌 절편에 존재하는 타우 농축체에 높은 결합을 나타냈다.
실시 예 10: ACI -33 또는 ACI -35 백신접종 후 타우 P301L 형질전환 마우스 모델에서의 효능
본 연구의 목적은 Tau P301L 형질전환 마우스에서 AGI-33 (Tau5-20 [pY18]) 또는 ACI-35 (Tau393-408 [pS396/pS404]) 백신의 피하 주사를 이용하여 항-타우 백신접종의 효능을 분석하는데 있다. 마우스를 5회 면역시키고 그 행동의 변화를 그 동물의 수명 동안에 수행된 로타로드(rotarod) 시험을 통해 분석했다.
10.1 방법
10.1.1 백신 제조
ACI-33 및 ACI-35 백신을 실시 예3의 프로토콜에 따라 제조했다.
10.1.2. 면역화
동물들을 실시 예 9에서 기재된 프로토콜에 따라 ACI-33 또는 ACI-35로 면역시켰다 (ACI-33의 경우 계획 2 및 ACI-35의 경우 계획 3)
계획 2: ACI-33에 대한 면역화, 출혈 및 로타로드 시험의 스케줄
Figure pat00014
계획 3: ACI-33에 대한 면역화, 출혈 및 로타로드 시험의 스케줄
Figure pat00015
10.1.3 행동 ( 로타로드 )
동물의 운동 상태를 관찰하기 위하여, 자동 로타로드 시험을 수행했다. 불투명 디바이더에 의해 분리된 회전봉(3 cm 직경)에서 5마리의 마우스를 동시에 시험했다. 시험 동안, 상기 봉을 5분내에 4 rpm에서 40 rpm으로 가속시켰다. 각 마우스마다, 회전봉에서 머무른 시간을 최대 5분으로 하여 기록했다.
10.2 결과
ACI-33 또는 PBS 처리 후 TPLH의 운동 상태를 평가하기 위하여, 마우스를 5회의 상이한 경우들에 대하여 로타로드 시험했다(도 31). ACI-33과 PBS 주사된 동물 사이의 유의적인 차이가 7.3 개월 연령에서 관찰되었다 (도 31, 이원분산분석 P<0.001 7.3개월 연령). 마우스의 운동적 행동에 대한 ACI-33의 효과는 7.8개월 연령의 마우스 혈청의 항-Tau5-20 [pY18] 항체 역가와 관련이 있었다 (도 32, 스피어만 P< 0.001).
ACI-35 또는 PBS 처리 후 TPLH의 운동 상태를 평가하기 위하여, 마우스를 로타로드 시험했다(도 33). 처리군과 대조군 사이에 유의적인 차이가 없었지만, 마우스가 9.5개월 연령인 경우에 수행된 로타로드 시험에서는 ACI-35 효능에 대한 경향이 관찰될 수 있었다(도 33, Mann-Whitney test P= 0.1905, 9.5개월 연령).
10.3 결론
TPLH 마우스의 ACI-33 백신접종은 PBS 주사된 동물과 비교하여 로타로드 시험동안 마우스 운동 결함에 유익한 결과를 나타냈다. 이러한 긍정적인 효과는 마우스 혈청의 항-타우 항체와 관련이 있었다.
TPLH 마우스의 ACI-35 백신접종은 PBS 주사된 마우스와 비교하여 9.5 개월 연령에서 로타로드 시험 동안 마우스 운동 결핍에 효과를 나타냈다.
실시 예 11: 암컷 누드 마우스에서 항- 타우 항체
본 연구의 목적은 암컷 누드 마우스에서 ACI-33 (Tau5-20 [pY18J]에 의해 유도된 항-타우 항체 반응을 평가함에 있다. 상기 누드 마우스는 Foxn1nu 돌연변이를 가지며, 적당히 작용하는 흉선의 결핍으로 인해 감소된 T 세포 기능을 갖는다. 따라서, 본 연구의 목적은 ACI-33에 의해 유도된 항체 반응이 T-세포 비의존적인지의 여부를 분석함에 있다.
11 내지 13 주 연령의 누드 마우스 및 상응하는 야생형 새끼들에 피하 주사했다. 마우스를 2주 간격으로 3회 면역시키고 각 면역후 1주째마다 출혈시켰다. 전체 항-pTau (Tau5-20 [pY18J) 펩티드 IgG 반응을 ELISA에 의해 측정했다. 상기 항체 반응의 아형 패턴을 3차 면역 후 분석하여 IgG의 여러 가지 아류 및 IgM의 분포를 평가했다. 또한, 상응하는 비-pTau (Tau5-20), 전길이 (441aa) 타우 단백질 및 인산화 전길이 (441aa) 타우 단백질을 분석했다.
상기 누드 마우스에서 상기 T 헬퍼 세포의 부재를 확인하기 위하여, CD3+/CD4+ 세포의 비율(%)을 형광 표지 세포 분리기(FAGS)로 평가했다.
11.1 방법
11.1.1 백신 ACI -33의 제조
ACI-33 백신을 실시 예 3에 따라 제조했다. 다음에, 그 리포좀 현탁액 (배치 ACI-33-090818-A)을 분취한 후 2~8 ℃에서 보관했다. 최종 펩티드/인지질의 몰비는 1:100이었다. 백신을 JSW Life Sciences GmbH (Austria)사로 선적했다.
11.1.2 면역화
JSW Life Sciences GmbH에서, C57BL/6 배경을 갖는 누드 마우스 (B6.Cg-Foxn1 nu/J) 및 해당하는 새끼들(군당 6마리 암컷 마우스)에, 표 15에 따라 투여(0일, 14일, 28일) 사이에 2 주 간격으로 ACI-33를 3회 피하 주사했다. 1차 주사 7일전 및 2, 4, 7, 21, 35 및 56일 후에 안면 정맥/동맥으로부터 혈장 시료를 채취했다. Tau5-20 [pY18]-특이적 IgG 및 IgM 항체 역가 및 IgG 아형 패턴을 ELISA에 의해 측정했다. 또한, 비-pTau5-20, 전길이(441aa) 타우 단백질 및 인산화 전길이 (441aa) 타우 단백질에 대한 특이적인 IgG 항체를 ELISA에 의해 측정했다. 또한, FAGS 분석을 위하여 혈액 시료를 -7일째에 채취하여 GD3+/GD4+ 세포의 비율(%)를 측정했다.
11.1.3 타우 펩티드 특이적 항체의 정량
Tau5-20 [pY18]에 대한 특이적인 IgG 항체를 5개의 혈청 출혈 시료(2일, 7일, 21일, 35일 및 56일)에서 ELISA에 의해 측정했다. 또한, Tau5-20-, 전길이 (441aa), Tau 단백질- 및 인산화 전길이 (441aa) Tau 단백질-특이적 IgG를 35일째 혈청에서 측정했다. Tau5-20 (pY18]-특이적 IgM 및 IgG 아형 항체를 35일째 혈청 출혈 시료에서 ELISA에 의해 측정했다. 플레이트를 4 ℃에서 10 ㎍ /ml의 해당하는 타우 펩티드 및 1 ㎍ /ml의 해당하는 타우 단백질로 밤새 코팅했다. 각각의 웰을 PBS-0.05% Tween 20로 세척하고 PBS-0.05% Tween 20에서 1% BSA로 블로킹 한 후, 혈청의 연속 희석액을 상기 플레이트에 첨가하고 37 ℃에서 2 시간 배양했다. 세척 후, 플레이트를 알칼리성 포스페이타제(AP)-결합 항마우스 IgG 전체 항체(Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) 또는 아형 특이적 항체(양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-결합 항-마우스 IgM, AP-결합 항-마우스 IgG1, 비오틴-결합 항-마우스 IgG3(구입처: Pharmingen BD사, San Diego, CA, USA) 및 HRP-결합 항-마우스 IgG2b (Zymed Laboratories사, San Francisco, GA))와 함께 37 ℃ 에서 2 시간 동안 배양했다. 세척 후, 플레이트를 AP에 대한 포스페이타제 기질인 pNPP(파라-니트로-페닐-포스페이트, 또는 HRP에 대한 기질인 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)와 함께 배양하고, ELISA 리더 플레이트를 이용하여 405 nm에서 판독했다. 비오틴-결합 항체에 대한 추가의 단계를 수행하였는데, 이 경우 플레이트를 스트렙타비딘-HRP (R&D Systems사, Minneapolis, MN, USA)에서 45 분간 배양한 다음 ABTS를 이용하여 검출했다. 결과는 IgG, IgG 아형 및 IgM에 대한 불포화 O.D. (광학 밀도)에서의 O.D. 로 표시된다.
11.1.4 GD3 +/ GD4 + 세포 정량
마우스의 혈액 시료를 염화암모늄으로 투명해질 때까지 용해한 다음, 400x g으로 7분간 원심분리하고, 펠릿을 EDTA 함유 PBS에 재현탁했다. 다음에, 세포를 CD16/C032 블로킹 시약으로 블로킹하고 4 ℃에서 30분간 CD4 (PE 결합체) 및 CD3 (PE-Cy5) 항체로 염색했다. 시료를 PBS 세척하고, 고정용액(BD FAGS Flow에 1:40으로 희석된 DB Gellfix)에 재현탁하고 BO FAGS Galibur 세포분석기에 획득했다. CD3+ 및 CD4+에 대하여 양성으로 염색된 게이트된 세포(T-헬퍼 세포)의 비율(%)을 평가했다.
마우스 면역화
군 동물의 수 및 성별 처리/체적a 백신 배치 방법 투여 경로b T1의 투여량
㎍/투여		 MPLA의 양
㎍/투여
1 6마리 암컷 누드마우스 ACI-33
0.2ml		 ACI-33-090818-A ACI-A s.c. 12.6 15.8
2 6마리 야생형 마우스 ACI-33
0.2ml		 ACI-33-090818-A ACI-A s.c. 12.6 15.8
a: 이론 체적
b: s.c.: 피하
c:분석 후에 측정된 양
11.2 결과
11.2.1 일반적 관찰
어느 동물들도 조기에 죽지 않았고 처리에 따른 부작용은 보고되지 않았다. 모든 86.Cg-Foxn 1nu/J 동물의 경우, 대표적인 누드 표현형이 존재하였지만, 야생형(wt) 새끼들은 정상적인 털을 가졌다.
11.2.2 CD3 +/ CD4 + 세포 정량
CD3+/CD4+ 염색 및 이후의 FACS 분석 결과, WT 동물과 비교하여 누드 마우스에서 T-헬퍼 세포(CD3+/CD4+ 세포)의 유의적인 감소가 확인되었다(도 34).
11.2.3 면역 반응 분석
ACI-33 백신접종에 의해 생성된 항-Tau5-20 [pY18] IgG 역가를 분석하여 wt 및 누드 마우스에서 백신의 면역원성을 연구했다. 누드 마우스의 항-Tau5-20 [pY18] IgG 역가를 분석하여, ACI-33에 의해 유도된 반응이 T 세포 기능에 의존하지 않는 지의 여부를 연구했다. 그 백신은 누드 마우스에서 항-Tau5-20 [pY18] IgG 반응을 유도했고, 시험한 모든 시점에서 wt 및 누드 마우스에서 ACI-33에 의해 유도된 항체 반응 사이에는 유의적인 차이가 없었다(도 35; 이원분산분석, 누드와 wt 사이의 모든 출혈의 경우 P<0.05).
ACI-33 백신은 두 마우스 유형에서, 피하 주사 후 2차 면역후에(27일) 피크에 도달한 항-Tau5-20 [Py18] IgG 반응을 유도했다(도 35).
ACI-33 백신접종은 누드 와 wt 마우스 사이에 상이한 IgG 아류 및 IgM에 대하여 동일한 프로필의 항체 역가를 유도했는데, 상기 백신의 3회 면역 후 두 마우스 유형 사이에 유의적인 차이가 없었기 때문이다(도 36, 일원분산분석 P>0.05 IgG1 누드 대 IgG1 wt, IgG2a/2b 누드 대 IgG2a/2b wt, IgG3 누드 대 IgG3 wt, IgM 누드 대 IgM wt). 두 마우스 유형의 경우, IgG2b 및 IgM와 비교하여 IgG1의 수준이 유의적으로 낮았다(도 36, 일원분산분석, 누드 마우스: P<0.01 IgG1 대 IgG2b 또는 IgM; Wt 마우스: P<0.05 IgG1 대 IgG2b 또는 IgM). 또한, 누드 마우스는 IgG3와 비교하여 더욱 낮은 IgG1의 수준을 나타냈고 (도 36, 일원분산분석, 누드 마우스: P<0.05 IgG1 대 IgG3), IgG2a의 수준은 IgG2b, IgG3 및 19M보다 낮았다(도 36, 일원분산분석, 누드 마우스: P<0.05 IgG2a 대 IgG2b, IgG3 또는 IgM).
또한, ACI-33의 3차 피하 주사 후에 유도된 IgG 역가를 여러 가지 타우 펩티드(항-Tau5-20 [pY18] 및 항-Tau5-20) 및 단백질 (항-인산화 전길이 (441aa) 타우 단백질 = 항-pTau 단백질 및 항-전길이 (441aa) 타우 단백질 = 항-타우단백질)에 대하여 분석했다 (도 37). wt와 누드 마우스의 사이에 여러 가지 펩티드 및 단백질에 대한 역가에는 차이가 없었다. 누드 마우스 그룹의 경우, 항-Tau5-20 [pY18] 역가가 항-Tau5-20 역가보다 높은 유의적인 차이가 있었다 (도 37, 일원분산분석, P<0.05 항-Tau5-20 [pY18] 역가 대 항-Tau5-20 역가).
11.3 결론
누드 마우스에서 CD3+ 및 CD4+ 세포의 작은 비율에도 불구하고, ACI-33 백신은 강한 항-Tau5-20 [pY18] IgG 반응을 유도했다. 그 항체 반응의 지속성 및 IgG 아형 분포는 wt 및 누드 마우스 사이에 유사하여, 이러한 파라미터는 ACI-33 백신접종 시 T 세포에 의존하지 않는다는 것을 알 수 있다. 면역 적격 마우스와 비교하여, ACI-33 면역화는 T 세포 결핍 마우스에서 유사한 IgG 프로필을 가지면서 동일한 항체 역가 및 동적특성을 유도했다. 또한, 여러 가지 타우 펩티드에 대한 항체 역가는 면역 적격 마우스와 T 세포 결핍 마우스의 사이에 유사했다. 이러한 데이터는 ACI-33가 누드 및 WT 마우스 모두에서 T 세포 비의존적 항체 반응을 유도했다는 것을 나타낸다.
참조문헌 목록
Figure pat00016

기탁증
아래의 하이브리도마 세포주들이 부다페스트 조약하에 D-28124 Braunschweig, 7B, Inhoffenstr, Braunschweig에 소재한 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSM)에 AC IMMUNE S.A.의 이름으로 기탁되었다.
Figure pat00017
DSMZ DSMACC3043 20100303 DSMZ DSMACC3044 20100310 DSMZ DSMACC3045 20100310 DSMZ DSMACC3046 20100310 DSMZ DSMACC3047 20100310 DSMZ DSMACC3048 20100310 DSMZ DSMACC3049 20100310 DSMZ DSMACC3050 20100310
SEQUENCE LISTING <110> AC Immune SA K.U. Leuven Research & Development <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION <130> P2654 PCT BS <150> 09157303.0 <151> 2009-04-03 <160> 9 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> VARIANT <222> (26)..(26) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 1 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 20 25 30 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> /replace="phosphorylated tyrosine" <400> 2 Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="phosphorylated threonine" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 3 Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace="phosphorylated threonine" <400> 4 Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 5 Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 6 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 1 5 10 15 Ile Asp <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace="phosphorylated threonine" <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> /replace="phosphorylated threonine" <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 7 Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu 1 5 10 15 Pro <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 8 His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 9 Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 1 5 10

Claims (30)

  1. 기능적으로 균등한 항체를 포함하는 항체 또는 이의 기능적 부분으로서, 병리학적 단백질 타우 이형태체(conformer) 또는 상기 이형태체의 병리학적 특성을 유발하는 상기 이형태체의 일부에, 비병리학적인 타우 이형태체에 대한 결합 친화성과 비교하여 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 특히 적어도 60%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95% 및 100% 이하 더 높은 친화성으로 결합하는, 항체 또는 이의 기능적 부분.
  2. 청구항 1에 있어서, 인간 알츠하이머 질병의 뇌에서 신경섬유 농축체(NFT) 및 신경그물 실(neuropil thread)에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 기능적 부분.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 타우 단백질상의 에피토프, 또는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 나타낸 서열들의 군에서 선택된 펩티드 서열로 표시되거나 그에 포함되는 병리학적 단백질 타우 이형태체에 특이적인 에피토프들 및 이의 변이 단편들의 조합에 결합하는, 항체 또는 이의 기능적 부분.
  4. 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 적당한 동물을, 이의 기능적 단편을 포함하는, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 항원 펩티드로 면역시켜서 얻을 수 있는, 항체 또는 이의 기능적 부분.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단쇄, 이중특이성, 유인원화, 인간 또는 인간화 항체인, 항체 또는 이의 기능적 부분.
  6. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 폴리클로날 항체인, 항체 또는 이의 기능적 부분.
  7. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인, 항체 또는 이의 기능적 부분.
  8. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항들 중 어느 한 항에 기재된 항체로부터 유래한 CDR들을 갖는 인간 또는 인간화 항체인, 항체 또는 이의 기능적 부분.
  9. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체인, 항체 또는 이의 기능적 부분.
  10. 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 다음의 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 항체의 특징적 결합 특성을 갖는 것인, 항체 또는 이의 기능적 부분:
    a. DSM ACC3043으로 2010년 3월 3일자로 기탁된 ACI-41-Ab1;
    b. DSM ACC3044로 2010년 3월 10일자로 기탁된 2B6;
    c. DSM ACC3045로 2010년 3월 10일자로 기탁된 3A8;
    d. DSM ACC3046으로 2010년 3월 10일자로 기탁된 4C1;
    e. DSM ACC3047로 2010년 3월 10일자로 기탁된 5D10A3;
    f. DSM ACC3048로 2010년 3월 10일자로 기탁된 6C10;
    g. DSM ACC3049로 2010년 3월 10일자로 기탁된 6H1; 또는
    h. DSM ACC3050로 2010년 3월 10일자로 기탁된 7C2.
  11. 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는, 항체 또는 이의 기능적 부분:
    a. DSM ACC3043으로 2010년 3월 3일자로 기탁된 ACI-41-Ab1;
    b. DSM ACC3044로 2010년 3월 10일자로 기탁된 2B6;
    c. DSM ACC3045로 2010년 3월 10일자로 기탁된 3A8;
    d. DSM ACC3046으로 2010년 3월 10일자로 기탁된 4C1;
    e. DSM ACC3047로 2010년 3월 10일자로 기탁된 5D10A3;
    f. DSM ACC3048로 2010년 3월 10일자로 기탁된 6C10;
    g. DSM ACC3049로 2010년 3월 10일자로 기탁된 6H1; 또는
    h. DSM ACC3050로 2010년 3월 10일자로 기탁된 7C2.
  12. 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 약학적 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 타우 및 아밀로이드 병리들의 공존을 보이고 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야곱병, 투사형 치매, 다운 증후군, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커병, 봉입체 근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증 및 외상성 뇌손상을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병 또는 장애; 및 명백한 아밀로이드 병리를 보이지 않고 괌의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨병 치매 복합증, 신경섬유 농축체를 갖는 비괌의 운동 뉴런 질병, 호은성 그레인 치매, 피질기저핵 변성, 석회화를 갖는 확산 신경섬유 농축체, 염색체 17에 연결된 파킨슨병을 갖는 전측두엽 치매, 할러보든-슈파쯔 증후군, 다발성 신경계 위축증, C형 니만-피크병, 피크병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 상핵 범뇌염, 아급성 경화성 범뇌염, 신경섬유 농축체 단독치매, 뇌염후변성 파킨슨병, 근육퇴행 위축을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가의 질병 또는 장애를 포함하는 신경변성 질병 또는 장애의 이종 그룹을 포함하는 타우병증에서 두드러진 뇌 병리인, 신경섬유 병변의 형성에 의해 유발되거나 그와 관련이 있는 질병 및 장애의 치료를 위한, 약학적 조성물.
  14. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 기능적 부분 또는 이의 약학적 조성물을, 타우병증과 같은 신경변성 질병 또는 장애로 고생하는 동물, 특히 포유동물, 그러나 특히 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 타우병증과 같은 신경변성 질병 또는 장애의 치료를 위한 방법.
  15. 시료 또는 원위치에서(in situ) 타우 단백질의 에피토프에의 항체 또는 이의 활성 단편의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 타우 단백질 관련 질병, 장애 또는 상태를 진단하는 방법으로서,
    (a) 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를, 타우 단백질의 에피토프와 결합하는, 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 기능적 부분과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 항체 또는 이의 기능적 부분을 타우 단백질에 결합시켜서 면역학적 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 상기 시료 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 단백질의 존재 여부와 관련시키는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 시료 또는 원위치에서(in situ) 타우 단백질의 에피토프에의 항체 또는 이의 활성 단편의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 타우 단백질 관련 질병, 장애 또는 상태에 대한 소인(predisposition)을 진단하는 방법으로서,
    (a) 타우 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를, 타우 단백질의 에피토프와 결합하는, 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 기능적 부분과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 항체 또는 이의 기능적 부분을 타우 항원에 결합시켜서 면역학적 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 상기 시료 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 항원의 존재 여부와 관련시키는 단계;
    (e) 상기 면역학적 복합체의 양을 정상 대조 값과 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 정상 대조 값과 비교하여 상기 복합체의 양의 증가는 상기 환자가 타우 단백질 관련 질병 또는 상태로 고생하거나 이를 발생시킬 위험이 있다는 것을 나타내는 것인, 방법.
  17. 상기 항들 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 약학적 조성물로 치료한 후 환자에서 최소 잔류 질병을 모니터링하기 위한 방법으로서,
    (a) 타우 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를, 타우 단백질의 에피토프와 결합하는, 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 기능적 부분과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 항체 또는 이의 기능적 부분을 타우 항원에 결합시켜서 면역학적 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 상기 시료 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 항원의 존재 여부와 관련시키는 단계;
    (e) 상기 면역학적 복합체의 양을 정상 대조 값과 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 정상 대조 값과 비교하여 상기 복합체의 양의 증가는 상기 환자가 여전히 최소 잔류 질병으로 고생하고 있다는 것을 나타내는 것인, 방법.
  18. 상기 항들 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 약학적 조성물로 치료되고 있는 환자의 반응성을 예측하는 방법으로서,
    (a) 타우 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시료 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를, 타우 단백질의 에피토프와 결합하는, 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 기능적 부분과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 항체 또는 이의 기능적 부분을 타우 항원에 결합시켜서 면역학적 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 상기 시료 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 항원의 존재 여부와 관련시키는 단계;
    (e) 상기 치료의 개시 전후에 상기 면역학적 복합체의 양을 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 복합체의 양의 감소는 상기 환자가 상기 치료에 반응하는 높은 가능성을 갖는다는 것을 나타내는 것인, 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 타우 관련 질병, 장애 또는 상태의 검출 및 진단을 위한 테스트 키트.
  20. 청구항 19에 있어서, 본 발명에 따른 하나 이상의 항체 또는 이의 기능적 부분을 보유하는 용기, 및 상기 항체를 타우 항원에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성하는 목적으로 사용하고 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하여 상기 면역학적 복합체의 존재 여부를 타우 항원의 존재 여부와 관련시키는 것에 대한 사용설명서를 포함하는 테스트 키트.
  21. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 항체를 생성하는 세포주.
  22. 청구항 21에 있어서, 2010년 3월 3일자로 기탁번호 DSM ACC3043으로 기탁된 하이브리도마 세포주 ACI-41-Ab1인, 세포주.
  23. 청구항 21에 있어서, 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3044로 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6인, 세포주.
  24. 청구항 21에 있어서, 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3045로 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8인, 세포주.
  25. 청구항 21에 있어서, 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3046으로 기탁된 하이브리도마 세포주 4C1인, 세포주.
  26. 청구항 21에 있어서, 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3047로 기탁된 하이브리도마 세포주 5D10A3인, 세포주.
  27. 청구항 21에 있어서, 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3048로 기탁된 하이브리도마 세포주 6C10인, 세포주.
  28. 청구항 21에 있어서, 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3049로 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1인, 세포주.
  29. 청구항 21에 있어서, 2010년 3월 10일자로 기탁번호 DSM ACC3050으로 기탁된 하이브리도마 세포주 7C2인, 세포주.
  30. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 타우 단백질이 인간 타우 단백질인 것인, 항체 또는 이의 기능적 부분.
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