BRPI1015088B1 - Peptídeo antigênico modificado, composição farmacêutica e uso dos mesmos - Google Patents

Peptídeo antigênico modificado, composição farmacêutica e uso dos mesmos Download PDF

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BRPI1015088B1
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disease
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BRPI1015088-9A
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Andrea Pfeifer
Andreas Muhs
Fred Van Leuven
Maria Pihlgren
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Ac Immune S.A.
Katholieke Universiteit Leuven
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Abstract

peptídeo ou fragmento antigênico obtenível a partir da proteína tau,uso do referido peptídeo, anticorpo,composição farmacêutica, uso da referida composição, métodos para diagnosticar uma doença, distúrbio ou condição ou uma predisposição a doença, distúrbio ou condição associado a proteína tau, para monitorar doença a residual mínima em um paciente, para prever a responsividade de um paciente ao tratamento, e de uso dos referidos peptídeo ou fragmento, ou anticorpo ou composição farmacêutica, kit de teste, epítopo, e, linhagem celular a presente invenção diz respeito a métodos e composições farmacêuticas para uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com emaranhados neurofibrilares. em particular,a invenção diz respeito a composição farmacêutica que compreende um peptídeo antigênico, particularmente um fosfo-peptídeo antigênico que imita um fosfo-epítopo patológico de proteína tau, para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de tauopatias incluindo mal de alzheimer.

Description

[001] A presente invenção diz respeito a métodos e composições para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com emaranhados neurofibrilares. Em particular, a invenção diz respeito a métodos e composições para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de tauopatias incluindo Mal de Alzheimer (AD).
[002] Os emaranhados neurofibrilares são uma marca neuropatológica principal no AD. Estes originam-se pela agregação de proteína tau hiper-fosforilada e seus conformadores. A AD divide sua patologia com muitas tauopatias neurodegenerativas, em particular, com tipos especificados de demência frontotemporal (FTD).
[003] A proteína tau é uma proteína “naturalmente não dobrada” livremente solúvel que liga-se avidamente aos microtúbulos (MT) para promover sua montagem e estabilidade. Os MTs são de importância principal para a integridade citoesqueletal de neurônios e, desse modo, para a formação e funcionamento apropriados dos neurônios e desse modo para a formação e funcionamento apropriados dos circuitos neuronais, consequentemente para o aprendizado e memória. A ligação de tau ao MT é controlada pela fosforilação e desfosforilação dinâmicas, como demonstrado principalmente in vitro e em células não neuronais. Devido ao número grande de locais de fosforilação possíveis (>80), a contribuição exata de cada um e a identidade das cinases sensíveis permanece grandemente não definida in vivo.
[004] No cérebro com AD, a patologia de tau desenvolve- se mais tarde do que e, portanto, provavelmente em resposta à patologia amilóide, que constitui a essência da hipótese de cascata amilóide. Isto é fundamentado e indicado por estudos em pacientes com AD e síndrome de Down e é confirmado pelos estudos em camundongos transgênicos com patologia amilóide e tau combinadas (Lewis et al, 2001; Oddo et al, 2004; Ribe et al, 2005; Muyllaert et al, 2006; 2008; Terwel et al, 2008).
[005] O ritmo exato de ambas as patologias em pacientes com AD humanos bem como mecanismos que ligam amilóide à patologia permanecem grandemente desconhecidos, mas são propostos envolver a ativação de caminhos sinalizadores neuronais que atuam em ou por GSK3 e cdk5 com as “tau-cinases” principais (revisto por Muyllaert et al, 2006, 2008).
[006] A hipótese que a tauopatia não é um efeito colateral inocente mas um executor patológico principal em AD é fundamentado no exame genético, patológico e observações experimentais que confirmam um ao outro totalmente:• em casos de AD familiar de início precoce que ocorrem devido às mutações no precursor de proteína amilóide (APP) ou presenilina, a causa patogênica obrigatória é o acúmulo de amilóide, mas invariavelmente, a patologia compreende a tauopatia colateral, idêntica àquela nos casos de AD esporádicos de início tardio.• gravidade da disfunção cognitiva e Demência correlaciona-se com a tauopatia, não com a patologia amilóide, exemplificado mais recentemente por diversos estudos clínicos de fase-1&2 que incluem a formação de imagem PIB-PET para o amilóide e identificação de muitos indivíduos cognitivamente normais falso positivos com carga amilóide cerebral alta.• em FTD familiar, a tauopatia é provocada pelo tau mutante e causa a degeneração diretamente, sem patologia amilóide.• em modelos de camundongo experimentais, os defeitos cognitivos causados por patologia amilóide são quase completamente aliviados pela ausência de proteína tau (Roberson et al, 2007).
[007] Os argumentos combinados suportam a hipótese que a proteína tau é um desempenhador principal da morte cognitiva em AD e tauopatias neurodegenerativas relacionadas.
[008] Um tratamento emergente proeminente de AD é pela imunoterapia passiva com mAbs específicos, para reabilitar os peptídeos amilóides e seus agregados que são presumidos serem neuro-tóxicos ou sinapto-tóxico.
[009] A imunoterapia que alveja a patologia de tau, como proposto aqui, é antecipado para contra-reagir os conformadores de tau de proteína patológica que são conhecidos ou postulados para causar a neurodegeneração. A patologia de amilóide em AD causado e os agregados intraneuronais de proteína hiper-fosforilada são propostos para atuar sinergisticamente na cascata cognitiva e degenerativa de eventos patológicos que levam da deterioração cognitiva branda (MCI) à demência grave de AD. A combinação de tau-direcioando com medicação direcionada a amilóide (ou qualquer outro) portanto constituirá o tratamento preferido e mais substancialmente eficaz de AD.
[010] Outros métodos terapêuticos que alvejam a proteína tau alvo são raros e compreendem principalmente:• inibidores das cinases que são pensados aumentar a fosforilação de tau a níveis patológicos• compostos que bloqueiam a agregação citoplásmica de proteína tau hiper-fosforilada.Todos os métodos sofrem várias desvantagens de especificidade e eficácia, um problema que estes dividem com as tentativas de modificar o metabolismo de APP e amilóide, todos enfatizando a importância de uma pesquisa contínua quanto a opções de tratamento adicionais, incluindo imunoterapia contra tau.
[011] Praticamente nenhum esforço foi devotado para definir - alvo deixado sozinho - os conformadores de tau patológico in vivo. No ensaio clínico de fase 11 de Aβ42, a patologia do emaranhado não parece ser bem considerada nem analisada muito profundamente (Nicoll et al., 2003; Masiiah et al., 2005). Por outro lado, uma imunoterapia experimental que alveja amilóide em um modelo de camundongo pré-clínico com patologia semelhante a AD combinada também demonstrou um efeito na patologia de tau embora os agregados de tau persistam (Oddo et al., 2004).
[012] Algumas dúvidas surgiram quanto à praticabilidade do método de aproximar a proteína tau intra-celular por imunoterapia. Estes foram contados pelos estados experimentais mais recentes em um modelo de camundongo de tauopatia por Asuni and colleagues (Asuni et al., 2007). Estes apresentaram redução na patologia de emaranhado e melhoras funcionais por vacinação com um fosfopeptídeo derivado da proteína tau. Estes dados corroboram com os relatos prévios de imunoterapia que alveja a-sinucleína em um modelo de doença de Parkinson (PD) (Masliah et al.., 2005) e de um superóxido dismutase em um modelo de esclerose lateral amiotrófica (ALS) (Urushitiani et al., 2007). Estas duas doenças são exemplos de proteínas intracelulares que levam à neurodegeneração por mecanismos ainda não totalmente entendidos. Por outro lado, a proteína tau recombinante de comprimento total produzida em e isolada de bactérias parece não adequada como vacina, embora os adjuvantes usados, isto é, Freunds completo e toxina de coqueluxe, possam ter contribuído com a resposta negativa daquele estudo (Rosenmann et al., 2006).
[013] Existe uma necessidade não satisfeita quanto a imunoterapias passivas e/ou ativas que trabalham para contrarreagir os conformadores de proteína patológica que são conhecidos - ou presumidos - causar distúrbios neurodegenerativos, tais como patologia amilóide em AD causado, por exemplo, por agregados intra-neuronais de proteína tau hiper- fosforilada que são tão típicos para a AD quanto o amilóide.
[014] Esta necessidade não satisfeita pode ser satisfeita dentro do escopo da presente invenção fornecendo-se métodos de imunização passivos e ativos usando-se vacinas com base em lipossoma (Nicolau et al., 2002; Muhs et al, 2007) e mAbs com base em fosfopeptídeos que imitam fosfo-epítopos patológicos de proteína tau. Estas ações combinadas geraram novos mAbs contra fosfo-epítopos lineares e conformacionais, simples e complexos na proteína tau que são pensados serem responsáveis para a sinapto- e neuro-toxicidade em tauopatias, incluindo AD.
[015] A presente invenção fornece novos métodos e peptídeos antigênicos de acordo com a invenção e como descrito neste e seus fragmentos funcionais incluindo as composições que compreendem os ditos peptídeos antigênicos ou seus fragmentos para evocar uma conformação específica, particularmente altamente específica, resposta imune em um organismo, mas particularmente dentro de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que é altamente eficaz e capaz de evitar ou aliviar as tauopatias ou os sintomas associados com as tauopatias, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante neste grupo de distúrbios neurodegenerativos.
[016] A presente invenção também diz respeito aos anticorpos, particularmente, anticorpos monoclonais incluindo suas partes funcionais e composições farmacêuticas que compreendem os ditos anticorpos, que são resultantes da conformação altamente específica, particularmente a conformação específica, resposta imune de um organismo na administração do peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste ou um fragmento funcional deste e a composição que compreende o dito peptídeo antigênico ou fragmento destes para prevenir ou aliviar tauopatias ou os sintomas associados com tauopatias, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante neste grupo de distúrbios neurodegenerativos.
[017] Este grupo de distúrbios neurodegenerativos pode ser subdividido em duas sub-categorias. Em uma primeira categoria de doenças ou distúrbios estão compreendidas aquelas que apresentam coexistência de tau e patologias amilóides que incluem mas não limitam-se a, Mal de Alzheimer, Doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilística, Síndrome de Down, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite de corpo de inclusão, angiopatia amilóide cerebral de proteína priônica e dano cerebral traumático.
[018] Em uma segunda categoria de doenças ou distúrbios estão compreendidos os sem patologia amilóide distinta que incluem mas não limitam-se a, complexo esclerose lateral amiotrófica/demência de parkinsonismo, demência do grão angirofílico, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de sistema múltiplo, doença de Niemann-Pick, tipo C, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, panencefalite supranuclear progressiva.
[019] Em particular, a presente invenção fornece novos métodos e composições farmacêuticas que compreendem os peptídeos antigênicos de acordo com a invenção e como descrito neste ou seus fragmentos funcionais e anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, incluindo partes funcionais destes obteníveis na administração dos peptídeos antigênicos de acordo com a invenção e como descrito neste ou seus fragmentos funcionais a um animal hospedeiro, para reter ou melhorar, mas, particularmente, para restauração, mais particularmente, para restaurar completamente a capacidade de memória cognitiva em um mamífero, particularmente um ser humano, que sofre de uma doença ou distúrbio associados com a formação de lesões neurofibrilares.
[020] É um objetivo da invenção fornecer um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado ou um fragmento funcional deste e composições farmacêuticas que compreendem o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo é obtenível a partir da proteína tau. Em particular, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um fosfo-peptídeo antigênico, ou um fragmento funcional deste, que imita um fosfo-epítopo patológico de proteína tau, cujo peptídeo ou fragmento ainda é modificado através da ligação a ou reconstituição em um carregador, a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste e um método de produzir um tal ou um fragmento funcional deste e composição farmacêutica, respectivamente, para o tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante na tauopatia que compreende um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos incluindo doenças ou distúrbios que mostram a coexistência de tau e patologias amilóides que incluem mas não limitam-se a, Mal de Alzheimer, Doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilistica, Síndrome de Down, Doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite de corpo de inclusão e angiopatia amilóide cerebral de proteína priônica, dano cerebral traumático e doenças ou distúrbios adicionais que não apresentam uma patologia amilóide distinta que inclui mas não limita-se a, complexo de esclerose lateral amiotrófica/demência de parkinsonismo de Guam, Doença de neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência do grão angirofílico, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de sistema múltiplo, doença de Niemann-Pick, tipo C, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo Pós-encefálico, Distrofia Miotônica.
[021] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste e a composições farmacêuticas que compreendem o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento compreende entre 5 resíduos de aminoácido e 30 resíduos de aminoácido, particularmente entre10 resíduos de aminoácido e 25 resíduos de aminoácido, particularmente entre12 resíduos de aminoácido e 22 resíduos de aminoácido, particularmente entre14 resíduos de aminoácido e 20 resíduos de aminoácido, particularmente entre16 resíduos de aminoácido e 18 resíduos de aminoácido, respectivamente, de uma sequência de aminoácido selecionada do grupo de sequências descrito na SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8 e SEQ ID N°: 9 em que as ditas sequências caracterizam um padrão de fosforilação característico que é associado a condição ou distúrbios patológicos, particularmente uma condição ou distúrbio associados com a formação de lesões neurofibrilares,
[022] Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucléico ou fragmentos destes que codificam o peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste selecionada do grupo de sequências descrito na SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8 e SEQ ID N°: 9.
[023] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 80 %, particularmente pelo menos 85 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 %, particularmente pelo menos 98 %, particularmente pelo menos 99 % de identidade de sequência à sequência descrito na SEQ ID N°: 2 e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como o dito peptídeo antigênico da SEQ ID N°: 2, em que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido 18 (P-TyrW da SEQ ID N°: 2 é fosforilada (T1).
[024] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido as descrito na SEQ ID N°: 2, em que resíduo de aminoácido 18 (P-Tyr18) é fosforilada (T1).
[025] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 80 %, particularmente pelo menos 85 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 %, particularmente pelo menos 98 %, particularmente pelo menos 99 % de identidade de sequência à sequência descrito na SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4, respectivamente e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como o dito peptídeo antigênico da SEQ ID N°: 3, em que pelo menos um, particularmente pelo menos 2, particularmente pelo menos 3, mas especialmente todos os dos resíduos de aminoácido correspondentes ao resíduos de aminoácido 202 (P-Ser202), 205 (P-Thr205), 212 (P-Thr212), e 214 (P-Ser214) da SEQ ID N°: 3 e 4, respectivamente, são fosforilados.
[026] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido as descrito na SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4, respectivamente, em que pelo menos um, particularmente pelo menos 2, particularmente pelo menos 3, mas especialmente todos os dos resíduos de aminoácido 202 (P-Ser202), 205 (P-Thr205), 212 (P-Thr212), e 214 (PSer214) são fosforilados.
[027] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 80 %, particularmente pelo menos 85 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 %, particularmente pelo menos 98 %, particularmente pelo menos 99 % de identidade de sequência à sequência descrito na SEQ ID N°: 4 e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como o dito peptídeo antigênico da SEQ ID N°: 4, em que pelo menos um, particularmente pelo menos 2 dos resíduos de aminoácido correspondentes ao resíduos de aminoácido 202 (P-Ser202) e 205 (P-Thr205) da SEQ ID N°: 4 são fosforilados.
[028] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido as descrito na SEQ ID N°: 4, em que pelo menos um, particularmente pelo menos 2 dos resíduos de aminoácido 202 (P-Ser202) e 205 (P-Thr205) são fosforilados.
[029] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 8 %, particularmente pelo menos 85 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 %, particularmente pelo menos 98 %, particularmente pelo menos 99 % de identidade de sequência à sequência descrito na SEQ ID N°: 3 e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como o dito peptídeo antigênico da SEQ ID N°: 3, em que pelo menos um, particularmente pelo menos 2 dos resíduos de aminoácido correspondentes ao resíduos de aminoácido 212 (P-Thr212) e 214 (P-Ser214) da SEQ ID N°: 3 são fosforilados.
[030] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido as descrito na SEQ ID N°: 3, em que pelo menos um, particularmente pelo menos 2 dos resíduos de aminoácido 212 (P-Thr212) e 214 (Pi-Ser214) são fosforilados.
[031] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 80 %, particularmente pelo menos 85 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 %, particularmente pelo menos 98 %, particularmente pelo menos 99 % de identidade de sequência à sequência descrito na SEQ ID N°: 5 e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como o dito peptídeo antigênico da SEQ ID N°: 5, em que pelo menos um, mas especialmente todos os dos resíduos de aminoácido correspondentes ao resíduos de aminoácido 396 (P-Ser396) e 404 (P-Ser404) da SEQ ID N°: 5 são fosforilados.
[032] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido as descrito na SEQ ID N°: 5, em que pelo menos um, mas especialmente todos os dos resíduos de aminoácido 396 (P-Ser396) e 404 (P-Ser404) são fosforilados.
[033] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 80 %, particularmente pelo menos 85 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 %, particularmente pelo menos 98 %, particularmente pelo menos 99 % de identidade de sequência à sequência descrito na SEQ ID N°: 6 e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como o dito peptídeo antigênico da SEQ ID N°: 6, em que pelo menos um, mas especialmente todos os dos resíduos de aminoácido correspondentes ao resíduos de aminoácido 404 (P-Ser404) e 409 (P-Ser409) da SEQ ID N°: 6 são fosforilados.
[034] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido as descrito na SEQ ID N°: 6, em que pelo menos um, mas especialmente todos os dos resíduos de aminoácido 404 (P-Ser404) e 409 (P-Ser409) são fosforilados.
[035] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 80 %, particularmente pelo menos 85 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 %, particularmente pelo menos 98 %, particularmente pelo menos 99 % de identidade de sequência à sequência descrito na SEQ ID N°: 7 e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como o dito peptídeo antigênico da SEQ ID N°: 7, em que pelo menos um, particularmente pelo menos 2, particularmente pelo menos 3, mas especialmente todos os dos resíduos de aminoácido correspondentes ao resíduos de aminoácido 202 (P- Ser202), 205 (P-Thr205), 212 (P-Thr212), e 214 (P-Ser214) da SEQ ID N°: 7 são fosforilados.
[036] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido as descrito na SEQ ID N°: 7, em que pelo menos um, particularmente pelo menos 2, particularmente pelo menos 3, mas especialmente todos os dos resíduos de aminoácido 202 (p-Ser202), 205 (P- Thr205), 212 (P-Thr212) e 214 (P-Ser214) são fosforilados.
[037] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 80 %, particularmente pelo menos 85 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 % particularmente pelo menos 98 %, particularmente pelo menos 99 % de identidade de sequência à sequência descrito na SEQ ID N°: 8 e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como o dito peptídeo antigênico da SEQ ID N°: 8, em que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido 409 (P-Ser409) da SEQ ID N°: 8 é fosforilada.
[038] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido as descrito na SEQ ID N°: 8, em que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido 409 (P-Ser409) da SEQ ID N°: 8 é fosforilado.
[039] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 80 %, particularmente pelo menos 85 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 %, particularmente pelo menos 98 %, particularmente pelo menos 99 % de identidade de sequência à sequência descrito na SEQ ID N°: 9 e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como o dito peptídeo antigênico da SEQ ID N°: 9, em que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido 404 (P-Ser404) da SEQ ID N°: 9 é fosforilada.
[040] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico, particularmente um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção, ou um fragmento funcional deste e a composição farmacêutica que compreende o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste, cujo peptídeo ou fragmento apresenta uma sequência de aminoácido as descrito na SEQ ID N°: 9, em que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido 404 (P-Ser404) da SEQ ID N°: 9 é fosforilada.
[041] Também é compreendido pela presente invenção um peptídeo antigênico modificado de acordo com a presente invenção ou um fragmento funcional deste e a composições farmacêuticas que compreendem o dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional modificado deste, cujo peptídeo é essencialmente idêntico aos peptídeos antigênicos mencionados acima como mostrado na SEQ ID N°: 2 a 9 e tem substancialmente a mesma atividade imunogênica como os ditos peptídeos antigênicos das SEQ ID N°: 2 a 9, mas, particularmente um fragmento de peptídeo variante que é uma variante conservativamente modificada dos ditos fragmentos, em que as alterações resultam na substituição de um ou mais aminoácidos, particularmente entre um e 10 aminoácidos, mais particularmente entre 1 e 6 aminoácidos, ainda mais particularmente entre um e 4 aminoácidos, mas especialmente entre um e 3 aminoácidos, com um aminoácido quimicamente similar, as tabelas de substituição conservativas fornecendo aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidos na técnica e divulgados a seguir. A substituição conservativa deve, preferivelmente, ser feita tal que a carga de rede total do peptídeo e também a distribuição de carga na molécula do peptídeo permaneça essencialmente a mesma.
[042] Também é compreendido pela presente invenção um fragmento de peptídeo variante, particularmente um peptídeo antigênico variante modificado de acordo com a presente invenção e a composição farmacêutica compreendendo o dito fragmento de peptídeo variante, cujo peptídeo é essencialmente idêntico aos fragmentos identificados acima da invenção e tem, substancialmente, a mesma atividade biológica dos ditos fragmentos, em que um ou mais resíduos de aminoácido são detectados.
[043] Em uma forma de realização adicional, o peptídeo de acordo com a invenção ou um fragmento funcional deste é fornecido na forma de um polímero selecionado do grupo que consiste de um 2-mer, a 3- mer, a 4-mer, a 5-mer, a 6-mer a 7-mer, a 8-mer, a 9-mer, a 10-mer, a 11-mer, a 12-mer, a 13-mer, a 14-mer, a 15-mer, a 16-mer, a 20-mer, a 30-mer e a 50- mer, em que as unidades monoméricas constituindo do dito polímero são sempre idênticas ou são unidades monoméricas diferentes e selecionados do grupo que consiste de peptídeo de acordo com a invenção e como descrito neste, particularmente, um peptídeo como mostrado na SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEO, ID N°: 8 e SEQ ID N°: 9 ou um fragmento funcional deste e peptídeos variantes.
[044] Em uma forma de realização, o peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste ou um fragmento funcional deste, é modificado através da ligação a ou reconstituição em um carregador, particularmente um carregador que também tem funcionalidade como um adjuvante que resulta em uma construção antigênica supramolecular. Em uma forma de realização, o peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste ou um fragmento funcional deste, é modificado através da ligação a ou reconstituição em um lipossoma, tal como produzir uma “construção antigênica supramolar” como descrito na publicação WO2005/081872, cuja descrição está incluída neste por referência em sua totalidade. O peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste ainda é modificado, tal que este apresenta uma apresentação única do peptídeo antigênico na superfície carregadora, que leva a uma exposição intensificação do antígeno e ultimamente à geração de anticorpo que apresenta um alto grau de sensibilidade conformacional. Em particular, o peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste, é modificado através da associação com uma porção lipofílica ou hidrofóbica, que facilita a inserção na bicamada de lipídeo do carregador de lipossoma/adjuvante imune, particularmente, por uma porção lipofílica ou hidrofóbica que funciona como uma âncora para o peptídeo na bicamada de dimensão que leva ao peptídeo sendo posicionado e estabilizado na proximidade próxima à superfície de lipossoma.
[045] Em uma forma de realização adicional da invenção, a porção lipofílica ou hidrofóbica é um ácido graxo, um triglicerídeo ou um fosfolipídeo, particularmente, um ácido graxo, um triglicerídeo ou um fosfolipídeo contendo uma cadeia de carbono entre C12 e C24, mas, especialmente um ácido palmítico.
[046] Em uma forma de realização da invenção um peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste é fornecido ou um fragmento funcional deste, modificado por pelo menos, duas molécula de ácido palmítico covalentemente ligado às extremidades de terminal N e C do dito peptídeo antigênico ou um fragmento funcional deste e pela reconstituição em um carregador lipossômico.
[047] Em uma forma de realização da invenção, os peptídeos ou fragmentos nos conjugados são, cada um, ligados a quatro moléculas de ácido palmítico; estes são, portanto, tetrapalmitoilado.
[048] Em uma forma de realização da invenção, duas molécula de ácido palmítico são ligados ao terminal N e duas molécula de ácido palmítico são ligados à extremidade de terminal C do peptídeo ou fragmento.
[049] Ainda, em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste, ou um fragmento funcional deste, modificado através da associação com porção lipofílica ou hidrofóbica tal como, por exemplo, ácido palmítico e reconstituído em uma lipossoma, em que a preparação lipossomal pode, além de conter um adjuvante, tal como, por exemplo, lipídeo A, alume, fosfato de cálcio, interleucina e/ou microcápsulas de polissacarídeos e proteínas, mas particularmente, um lipídeo desintoxicado A, tal como monofosforil ou difosforil lipídeo A ou alume que resulta em uma construção antigênica supramolar.
[050] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a uma construção supramolecular da invenção e como descrito neste, que compreende por molécula carregadora um ou mais peptídeos antigênicos, particularmente, dois ou mais peptídeos antigênicos, de acordo com a invenção e como descrito neste ou um fragmento funcional deste.
[051] Em uma forma de realização da invenção, a dita molécula carregadora é um lipossoma.
[052] Em uma forma de realização da invenção, os dois ou mais peptídeos antigênicos são os mesmos peptídeos ou diferentes, particularmente peptídeos selecionados do grupo que consiste da SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, e SEQ ID N°: 9 ou fragmentos funcionais destes e peptídeos variantes.
[053] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a uma construção supramolecular da invenção e como descrito neste, que compreende, por molécula de carregador, uma combinação de dois ou mais peptídeos antigênicos da SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4 ou fragmentos funcionais destes.
[054] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo reconheces e liga um conformador de tau de proteína patológica fosforilada ou aquelas partes do conformador que causa as propriedades patológicas do dito conformador, particularmente um fosfo- epítopo patológico de proteína tau.
[055] Em particular, a presente invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo reconheces e liga um conformador tau de proteína patológica fosforilada ou aquelas partes do conformador que causam as propriedades patológicas do dito conformador, particularmente, um fosfo-epítopo patológico de proteína tau, com uma especificidade alta.
[056] Em uma forma de realização, o anticorpo, particularmente o anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes de acordo com a invenção liga o conformador tau de proteína patológica ou aquelas partes do conformador que causa as propriedades patológicas do dito conformador com uma afinidade que é pelo menos 40 %, particularmente pelo menos 50 %, particularmente pelo menos 60 %, particularmente pelo menos 70 %, particularmente pelo menos 80 %, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95 % e até 100 % maior do que a afinidade de ligação para o conformador de tau não patológico não fosforilado.
[057] Em uma forma de realização, um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes de acordo com a invenção é fornecida, que liga-se especificamente aos emaranhados neurofibrilares (NFTs) e filamento de neuropil em cérebros de Mal de Alzheimer humano.
[058] É um outro objetivo da presente invenção fornecer anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais ou partes funcionais destes, que liga direta ou especificamente liga-se a um epítopo na proteína tau ou a uma combinação de epítopos, particularmente a um epítopo específico a um, conformador tau de proteína patológica fosforilado, particularmente um fosfo-epítopo patológico de proteína tau tal como, por exemplo, um epítopo como representado por ou compreendido de uma sequência de peptídeo selecionada do grupo de sequências como dado na SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID NO; 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, e SEQ ID N°: 9 e seus fragmentos variantes.
[059] Em particular, a presente invenção fornece um anticorpo que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes obteníveis pela imunização de um animal adequado com um peptídeo antigênico, particularmente uma composição de peptídeo de acordo com a invenção e como descrito anteriormente, particularmente um composição que compreende um peptídeo antigênico que compreende uma sequência de aminoácido como dado na SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ. ID NO: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, e SEQ ID N°: 9, incluindo um fragmento funcional ou um fragmento variante deste.
[060] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo têm as propriedades características de um anticorpo produzido por linha celular de hibridoma ACI-41-Abl depositado em 3 de março de 2010 como DSM ACC3043.
[061] Mais particularmente, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linha celular de hibridoma ACI-41-Ab1 depositado em 3 de março de 2010 como DSM ACC3043.
[062] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo têm as propriedades características de um anticorpo produzido por linha celular de hibridoma 2B6 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3044.
[063] Mais particularmente, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linha celular de hibridoma 2B6 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3044.
[064] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo têm as propriedades características de um anticorpo produzido por linha celular de hibridoma 3A8 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACG3045.
[065] Mais particularmente, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linha celular de hibridoma 3A8 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3045.
[066] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo têm as propriedades características de um anticorpo produzido por linha celular de hibridoma 4C1 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3046,
[067] Mais particularmente, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linha celular de hibridoma 4C1 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3046.
[068] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo têm as propriedades características de um anticorpo produzido por linha celular de hibridoma 5D10A3 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3047.
[069] Mais particularmente, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linha celular de hibridoma 5D10A3 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3047.
[070] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo têm as propriedades características de um anticorpo produzido por linha celular de hibridoma 6C10 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3048.
[071] Mais particularmente, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linha celular de hibridoma 6C10 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3048.
[072] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo têm as propriedades características de um anticorpo produzido por linha celular de hibridoma 6H1 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3049.
[073] Mais particularmente, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linha celular de hibridoma 6H1 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3049.
[074] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo têm as propriedades características de um anticorpo produzido por linha celular de hibridoma 7C2 depositado em 10 de março de 2010 como DSM AGC3050.
[075] Mais particularmente, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzidos por linha celular de hibridoma 7C2 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACG3050.
[076] O anticorpo pode ser fornecido na forma de um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado que ainda apresenta as características de ligação específicas como divulgado acima.
[077] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a uma linha celular que produz um anticorpo da invenção como descrito neste.
[078] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a linha celular de hibridoma ACI-41-Ab1 depositado em 3 de março de 2010 como DSM ACC3043.
[079] Em uma outra forma de realização específica, a invenção relates linha celular de hibridoma 2B6 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3044.
[080] Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a linha celular de hibridoma 3A8 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3045.
[081] Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a linha celular de hibridoma 4C1 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3046.
[082] Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a linha celular de hibridoma 5D10A3 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3047.
[083] Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a linha celular de hibridoma 6C10 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3048,
[084] Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a linha celular de hibridoma 6H1 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3049.
[085] Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito à linha celular de hibridoma 7C2 depositado em 10 de março de 2010 como DSM ACC3050.
[086] Também estão incluídos neste subclones e clones variantes da linhas celulares de hibridoma listados acima, que produzirão um anticorpo com as propriedades de ligação tau específicas da presente invenção.
[087] Em uma forma de realização a invenção fornece a composição farmacêutica e um método de produzir a composição farmacêutica que compreende um fragmento de peptídeo antigênico, particularmente um fragmento de peptídeo antigênico modificado através da ligação a e/ou reconstituição em um carregador, particularmente, um carregador lipossômico, de acordo com a invenção e como descrito neste ou um fragmento funcional deste, junto com um carregador e/ou diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis, para a retenção ou melhora, particularmente para a restauração completa da capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofre de deterioração de memória.
[088] Em uma forma de realização, a composição farmacêutica é fornecida compreendendo um anticorpo que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes particularmente um anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes de acordo com a presente invenção em uma quantidade terapeuticamente eficaz junto com um carregador e/ou diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
[089] Também é um objetivo da invenção para fornecer a composição farmacêutica de acordo com a invenção e como descrito neste e/ou um método, para o tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante na tauopatia que compreende um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos incluindo doenças ou distúrbios que apresenta co-existência de tau e patologias amilóides que incluem mas não limita-se a, Mal de Alzheimer, Doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilistica, Síndrome de Down, Doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite de corpo de inclusão e angiopatia amilóide cerebral de proteína priônica, dano cerebral traumático e doenças ou distúrbios adicionais que não apresentam uma patologia amilóide distinta que inclui mas não limita-se a, complexo de esclerose lateral amiotrófica/Demência do parkinsonismo de Guam, Doença de neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência do grão angirofílico, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de sistema múltiplo, doença de Niemann-Pick, tipo C, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo Pós-encefálico, Distrofia Miotônica, o dito método compreendendo a administração a um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, a composição farmacêutica de acordo com a invenção e como descrito neste em uma quantidade terapeuticamente eficaz junto com um carregador e/ou diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
[090] Em uma forma de realização a invenção fornece uma composição farmacêutica de acordo com a invenção e como descrito neste e/ou um método para reter ou aumentar a capacidade de memória mas, particularmente, para restaurar totalmente a capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofre de deterioração de memória, o dito método compreendendo a administração a um animal, particularmente um mamífero ou ser humano, uma composição farmacêutica de acordo com a invenção e como descrito neste em uma quantidade terapeuticamente eficaz junto com carregador e/ou diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
[091] É um outro objetivo da invenção fornecer uma composição farmacêutica e método de produzir uma tal composição bem como um método para a indução de uma resposta imune em um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano que sofre de uma doença e condição que são causadas por ou associadas com a formação de lesões neurofibrilares, pela administração ao dito animal ou humano de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção em uma quantidade terapeuticamente eficaz junto com um carregador e/ou diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
[092] Em uma forma de realização da invenção, um método é fornecido para induzir uma resposta imune em um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano que sofre de lesões neurofibrilares resultando em uma tauopatia, até uma extensão que uma retenção ou melhora dos sintomas associados com esta doença ou condição, tal como, por exemplo, deterioração de memória pode ser obtida, particularmente uma restauração completa da condição original.
[093] A composição farmacêutica compreendendo um peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste na administração a um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um ser humano que resulta principalmente na geração de anticorpos de subtipos Th2 não inflamatórios, tais como, por exemplo, isotipo IgG1 e IgG2b e/ou anticorpos da subclasse de IgG independente de célula T, tal como, por exemplo, IgG3 e/ou não leva a um aumento significante nos marcadores de inflamação no cérebro, particularmente de marcadores de inflamação selecionados do grupo que consiste de IL-1β, IFN-y e TNF-α.
[094] Em um outro aspecto da invenção, a composição farmacêutica que compreende um peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste pode ser usado para induzir a resposta imune independente de célula T no tratamento de uma doença, condição ou distúrbio em um paciente, particularmente um animal ou paciente humano, particularmente um paciente em necessidade de uma tal Resposta independente de célula T, tal como, por exemplo, um paciente tolerante imune ou um paciente ativado por célula T em que o dito peptídeo antigênico é modificado através da ligação a e/ou reconstituição em um carregador, particularmente um carregador lipossômico tal que o antígeno seja apresentado na superfície do carregador, particularmente o lipossoma.
[095] Em uma forma de realização, a composição antigênica da invenção como descrito aqui é eficaz como um estimulador imune.
[096] Em uma forma de realização da invenção, o dito antígeno de peptídeo é apresentado em uma série altamente repetitiva da superfície da lipossoma. Em uma forma de realização específica adicional, o dito antígeno não contém um epítopo de célula T.
[097] Em uma forma de realização da invenção, a composição antigênica da invenção como descrito aqui é usada para o tratamento de um paciente tolerante imune ou um paciente ativado com célula T, particularmente a paciente imunocomprometido, particularmente um paciente que sofre de uma doença auto-imune, particularmente, um paciente que sofre de uma deficiência de célula T, particularmente uma deficiência de célula T, que é causada por uma depleção dentro dos ditos pacientes de células CD4 T e/ou uma expressão reduzida de CD14 e/ou o CD40L em células CD4 T.
[098] Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser usados em um método de diagnosticar uma doença ou condição associadas com a proteína tau em um paciente que compreende detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína tau em uma amostra ou in situ que inclui as etapas de(a) colocar a amostra ou uma parte corporal ou área corporal específica suspeitas de conter a proteína tau em contato com o dito anticorpo, cujo anticorpo liga um epítopo da proteína tau;(b) deixar o anticorpo ligar à proteína tau para formar um complexo imunológico;(c) detectar a formação do complexo imunológico e(d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de proteína tau na amostra ou parte ou área corporais específicas.
[099] Em uma forma de realização, um método é fornecido para diagnosticar uma predisposição à doença ou condição associadas com a proteína tau em um paciente que compreende detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo destes a um epítopo da proteína tau em uma amostra ou in situ que inclui as etapas de(a) colocar a amostra ou uma parte corporal ou área corporal específica suspeitas de conter a antígeno tau em contato com um anticorpo de acordo com a invenção e como descrito anteriormente, cujo anticorpo liga um epítopo da proteína tau;(b) deixar o anticorpo ligar ao antígeno tau para formar um complexo imunológico;(c) detectar a formação do complexo imunológico e(d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno tau na amostra ou parte ou área corporais específicas,(e) comparar a quantidade do dito complexo imunológico a um valor de controle normal,em que em que um aumento na quantidade do dito agregado em comparação com um valor de controle normal indica que o dito paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver uma proteína doença ou condição associada com tau.
[0100] Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um método para monitorar a doença residual mínima em um paciente seguindo o tratamento com um anticorpo ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito método compreende:(a) colocar a amostra ou uma parte corporal ou área corporal específica suspeitas de conter a antígeno tau em contato com um anticorpo de acordo com a invenção e como descrito anteriormente, cujo anticorpo liga um epítopo da proteína tau;(b) deixar o anticorpo ligar ao antígeno tau para formar um complexo imunológico;(c) detectar a formação do complexo imunológico e(d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno tau na amostra ou parte ou área específicas corporais,(e) comparar a quantidade do dito complexo imunológico a um valor de controle normal,em que em que um aumento na quantidade do dito agregado em comparação com um valor de controle normal indica que o dito paciente ainda sofre de uma doença residual mínima.
[0101] Ainda, em uma outra forma de realização, a invenção fornece um método para predizer a receptividade de um paciente sendo tratado com um anticorpo ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes que compreende(a) colocar a amostra ou uma parte corporal ou área corporal específica suspeitas de conter a antígeno tau em contato com um anticorpo de acordo com a invenção e como descrito anteriormente, cujo anticorpo liga um epítopo da proteína tau;(b) deixar o anticorpo ligar ao antígeno tau para formar um complexo imunológico;(c) detectar a formação do complexo imunológico e(d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno tau na amostra ou parte ou área corporais específicas,(e) comparar a quantidade do dito complexo imunológico antes ou após o início do tratamento,em que uma diminuição na quantidade do dito agregado indica que o dito paciente tem um potencial alto de ser sensível ao tratamento.
[0102] Em uma outra forma de realização da invenção, o anticorpo de acordo com a invenção pode ser usado em um kit de teste para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas com tau.
[0103] Em particular, um kit de teste é fornecido para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas com proteína tau que compreende anticorpos de acordo com a invenção, em particular um kit de teste que compreende um recipiente que mantém um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção e instruções para o uso dos anticorpos para o propósito de ligação ao antígeno tau para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico tal que a presença ou ausência do complexo imunológico correlaciona-se com a presença ou ausência de antígeno tau.
[0104] Estes e outros objetivos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes após uma revisão da seguinte descrição detalhada da forma de realização divulgada e das reivindicações anexas.
Breve descrição das figuras e sequências
[0105] Figura 1a Anticorpos de IgG anti-Tau5-20 [pYI8] em camundongos WT imunizados com ACI-33. Análise de anticorpos de IgG anti-Tau5-20 [pYI8] nos soros de camundongos do tipo selvagem C57BL/6 recebendo 3 injeções de ACI-33 em d0, d13 e d28 e sendo sangrado em d27 e d47. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0106] Figura 1b: Anticorpos de IgG anti-Tau5-20 [pYI8] em camundongos TKO imunizados com ACI-33. Análise de anti-Tau5-20 [pYl8] Anticorpos IgG nos soros de camundongos do tipo selvagem C57BL/6 recebendo 3 injeções de ACI-33 em d0, d13 e d28 e sendo sangrado em d-1, d27 e d47. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0107] Figura 2a: Anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] em camundongos WT imunizados com ACI-35. Análise de anti-Tau393-408 [pS396/pS404] Anticorpos IgG nos soros de camundongos do tipo selvagem C57BL/6 recebendo 5 injeções de ACI-35 em d0, d16, d30, d99 e d113 e sendo sangrados em d28, d42, d98 e d126. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0108] Figura 2b: Anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] em camundongos TKO imunizados com ACI-35. Análise de anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] nos soros de camundongos TKO recebendo 5 injeções de ACI-35 em d0, d16, d30, d99 e d113 e sendo sangrados em d-l, d28, d42, d98 e d26. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0109] Figura 3a: Anticorpos IgG Anti-Tau401-418 [pS404/S409] em camundongos WT imunizados com ACI-36. Análise de anticorpos IgG anti-Thu401-418 [pS4041S409] nos soros de camundongos do tipo selvagem C57BL/6 recebendo 3 injeções de ACI-36 em d0, d13 e d28 e sendo sangrado em d1, d27 e d47. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0110] Figure 3b: Anticorpos IgG anti-Tau401-418 [pS404/S409] em camundongos TKO imunizados com ACI-36. Análise de anticorpos IgG anti-Tau401-418 [pS404/S409] nos soros de camundongos TKO recebendo 3 injeções de ACI-36 em d0, d13 e d28 e sendo sangrado em d-l, d27 e d47. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos para d1/d27 e no grupo de 5 camundongos para d47.
[0111] Figura 4a/4b: Anticorpos IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214] e anti-Tau196-211 [pS202/pT205] em camundongos WT imunizados com ACI-41. Análise de anti-Tau206-221 [pT212/pS214] e anticorpos IgG anti-Tau196-211 [pS202/pT205] nos soros de camundongos do tipo selvagem C57BL/6 recebendo 3 injeções de ACI-41 em d0, d20, d35 e sendo sangrado em d-1, d34, d48. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos. Os mesmos soros foram testados em ambos os peptídeos pTau.
[0112] Figure 4c/4d: Anticorpos IgG Anti-Tau206- 221 [pT212/pS214] e anti-TauI96-211 [pS202/pT205] em camundongos TKO imunizados com ACI-41. Análise de anticorpos IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214] e anti-Tau 196-211 [pS202/pT205] nos soros de camundongos TKO recebendo 3 injeções de ACI-41 em d0, d20, d35 e sendo sangrado em &I, d34, d48. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos, os mesmos soros foram testados em ambos peptídeos pTau.
[0113] Figura 5a: Isotipo de IgG anti-Tau5-20 [pY18] e anticorpos IgM em camundongos WT imunizados com ACI-33. Análise de IgG1 anti-Tau5-20 [pY18] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de C57BL/6 camundongos 47 dias após a primeira imunização de ACI-33. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/3200 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0114] Figura 5b: Isotipos IgG Anti-Tau5-20 [pY18] e anticorpos IgM em camundongos TKO imunizados com ACI-33. Análise de anti-Tau5-20 [pY18] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de camundongos TKO 47 dias após a primeira imunização de ACI-33. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/3200 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0115] Figura 6a: Isotipos IgG Anti-Tau393-408 [pS396/pS404] e anticorpos IgM em camundongos WT imunizados com ACI- 35. Análise de anti-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de C57BL/6 camundongos 42 dias após a primeira imunização de ACI-35. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/1600 (IgG2a), 1/1600 (IgG2b), 11800 (IgG3) e 1/1600 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos
[0116] Figura 6b: Isotipos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] e anticorpos IgM em camundongos TKO imunizados com ACI-35, análise de anti-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de camundongos TKO 42 dias após a primeira imunização de ACI-35. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/1600 (IgG2a), 1/1600 (IgG2b), 1/800 (IgG3) e 1/1600 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0117] Figura 7a: Isotipos IgG Anti-Tau401-418 [pS404IS409] e anticorpos IgM em camundongos WT imunizados com ACI- 36. Análise de anti-Tau401-418 [pS404/S409] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de C57BL/6 camundongos 47 dias após a primeira imunização ACI-36. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/100 (IgG1), 11400 (IgG2a), 1/400 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/400 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0118] Figura 7b: Isotipos IgG anti-Tau401-418 [pS404/S409] e anticorpos IgM em camundongos TKO imunizados com ACI- 36. Análise de anti-Tau401-418 [pS404/8409] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de camundongos TKO 47 dias após a primeira imunização ACI-36. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/400 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 5 camundongos.
[0119] Figura 8a: Isotipos IgG anti-Tau196-211 [pS202/pT205] e anticorpos IgM em camundongos WT imunizados com ACI- 41. Análise de anti-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de C57BL/6 camundongos 48 dias após a primeira imunização ACI-41. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b), 1/1600 (IgG3) e 1/3200 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0120] Figura 8b: Isotipos IgG Anti-Tau196-211 [pS202/pT205] e anticorpos IgM em camundongos TKO imunizados com ACI-41. Análise de anti-Tau196-211 [pS202/pT205] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de camundongos TKO 48 dias após a primeira imunização ACI-41. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b), 1/1600 (IgG3) e 1/3200 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0121] Figura 9a/9b: Frascos T25 de sobrenadantes de hibridoma ACI-36: avaliação de TAUPIR e Tau ELISA. 9a. tingimento TAUPIR de camundongo biGT idoso usando-se sobrenadante não diluído. 9b. Análise de peptídeo anti-pTau T4.5, peptídeo anti-Tau T4.6, proteína anti- pTau e tituladores anti-proteína tau de amostras de sobrenadante de clone não diluído. Os resultados são expressados como O.D.
[0122] Figura 10a/10b/10c: Sobrenadantes de hibridoma ACI-41 de frascos T25: avaliação de TAUPIR e Tau ELISA. 10a. tingimento TAUPIR de camundongo biGT idoso usando-se sobrenadante não diluído. 10b. Análise de peptídeo anti-pTau T8.5, peptídeo anti-Tau T8.6, proteína anti-pTau e tituladores anti-proteína tau de amostras de sobrenadante de clone não diluído. Os resultados são expressados como O.D. 10c. Análise de peptídeo anti-pTau T9.5, peptídeo anti-Tau T9.6, proteína anti-pTau e tituladores anti-proteína tau de amostras de sobrenadante de clone não diluído. Os resultados são expressados como O.D.
[0123] Figura 11: Sobrenadante de hibridoma na placa revestida com T8: anticorpos Tau206-221 [pT212/pS214], T9: Tau196-211 [pS202/pT205] e hP-Tau. Análise de anti-Tau206-22I [pT2121pS214], anti- Tau196-211 [pS2021pT205] e anti-hP-Tau de sobrenadante de clones de hibridoma. Os resultados são expressados como O.D. O mesmo sobrenadante foi testado não diluído em ambos os peptídeos pTau e hP-Tau.
[0124] Figura 12: tingimento de clone de anticorpo ACI- 41-Ab1 (T89-F4) NFTs em cérebros humanos com AD. As seções cerebrais de AD (a, b e c), PSP (paralisia supranuclear progressiva) (d, e f) e pacientes de controle saudáveis (g, h e i) foram tingidos usando-se AT100 (a, d e g), ACI-41-Ab1 (T89-F4) em 1/1 (b, e h) ou em diluições 1/30 (c, f e i).
[0125] Figura 13: Tingimentos de anticorpo 5D10 NFTs em cérebros com AD humanos. As seções cerebrais corticais de pacientes com AD foram tingidas usando-se anticorpos 5D10 (a) ou AT100 (b).
[0126] Figura 14: Anticorpos IgG Anti-Tau393-408 [pS396/pS404] em camundongos imunizados com ACI-35. Análise de anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] no plasma de C57BU6 camundongos recebendo 3 injeções de ACI-35 em d0, d14 e d28 e sendo sangrados em d-1, d7, d21, d35 e d56. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido nos grupos de 10 camundongos.
[0127] Figura 15: anticorpos de isotipos IgG Anti-Tau393- 408 [pS396/pS404] em camundongos imunizados com ACI-35. Análise de anticorpos IgG1 anti-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b e 3 no plasma de C57BL/6 camundongos 35 dias após a primeira imunização de ACI-35. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição não saturada de 1/1600 (IgG1), 1/3200 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b) e 1/800 (IgG3) que mostra média + desvio padrão obtido nos grupos de 10 camundongos.
[0128] Figura 16a: anticorpos IgM anti-Tau393-408 [pS396/S404] em camundongos imunizados com ACI-35. Análise de anticorpos IgM Tau393-408 [pS396/S404] no plasma de C57BL/6 camundongos 35 dias após a primeira imunização de ACI-35. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/6400 que mostra média + desvio padrão obtido nos grupos de 10 camundongos.
[0129] Figura 16b: Anticorpos IgG anti-Tau393-408 em camundongos imunizados com ACI-35. Análise de Tau393-408 anticorpos IgG no plasma de C57BL/6 camundongos 35 dias após a primeira imunização de ACI-35. Os resultados são expressados como O.D. em uma diluição de 1/100 que mostra média + desvio padrão obtido nos grupos de 10 camundongos.
[0130] Figura 17: Proliferação de células de baço reestimuladas com Con A ou peptídeo pTau/Tau. Análise de Proliferação de célula T específica de Tau por MTT em d56. Os esplenócitos foram unidos a partir de 10 camundongos de cada grupo e reestimulados com ConA, Tau393- 408 [pS396/S404] ou peptídeos Tau393-408.
[0131] Figura 18: Produção de citocina por ELISPOT de esplenócitos reestimulados com peptídeos Tau393-408 [pS396/S404] e Tau393-408, análise de produção de citocina ELISPOT por células T específicas de P-Tau/Tau. Os esplenócitos foram unidos a partir de 10 camundongos de cada grupo e re-estimulados com peptídeos Tau393-408 [pS396/S404] e Tau393-408.
[0132] Figura 19: Anticorpos IgG Anti-Tau5-20 [pY18] em camundongos imunizados com ACI-33. Análise de anticorpos IgG anti-Tau5- 20 [pY18] nos soros de camundongos TPLH recebendo 5 injeções de ACI-33 em d0, d13, d28, d91 e d133 e sendo sangrados em d-1, d27, d41, d76, d104 e d135. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtidos nos camundongos do grupo. d-1 n = 10 camundongos. d27, d41 e d76 n = 9 camundongos, 1 camundongo morreu por causa de luta. d104 n = 6, 3 três camundongos morreram por causa da patologia. d135 n = 2, 4 camundongos morreram da patologia.
[0133] Figura 20: Anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] em camundongos imunizados com ACI-35. Análise de Anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] nos soros de camundongos TPLH recebendo 5 injeções de ACI-35 em d0, d13, d27, d91 e d133 e sendo sangrados em d-1, d26, d40, d75, d103, d145 e d155. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido nos camundongos do grupo. d-1, d26 n = 10 camundongos. d40 n = 9 camundongos. d75 n = 6, d103 e d145 n = 4, d155 n = 3. Todos os camundongos morreram da patologia.
[0134] Figura 21: Anticorpos IgG Anti-Tau206-221 [pT212, pS214] em camundongos imunizados com ACI-39. Análise de Anticorpos IgG anti-Tau206-221 [pT212, pS214] nos soros de TPLH camundongos receberam 5 injeções de ACI-39 em d0, d13, d28, d91 e d133 e sendo sangrados em d-1, d41, d76, d104 e d135. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido nos camundongos do grupo. d-1, d27 e d41 n = 10 camundongos, d76 n = 7 camundongos, d104 n = 6, d135 n = 2. Todos os camundongos morreram da patologia.
[0135] Figura 22: Anticorpos IgG Anti-Tau196-211 [pS202, pT205] em camundongos imunizados com ACI-40. Análise de anticorpos IgG anti-Tau196-211 [pS202, pT205] nos soros de camundongos TPLH recebendo 5 injeções de ACI-40 em d0, d13, d28, d91 e d133 e sendo sangrados em d-1, d27, d41, d76, d104 e d135. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido nos camundongos do grupo. d- 1, d27 e d41 n = 10 camundongos, d76 n = 8 camundongos, d104 n = 6, d135 n = 5. Todos os camundongos morreram da patologia.
[0136] Figura 23: Isotipos IgG Anti-Tau5-20 [pY18] e anticorpos IgM em camundongos imunizados com AU-33. Análise de anti- Tau5-20 [pY18] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de TPLH camundongos em d41 após três imunizações de ACI-33. Os resultados são expressados como O.D não saturado em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/200 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/100 (IV) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 9 camundongos.
[0137] Figura 24: Isotipos de IgG Anti-Tau393-408 [pS396/pS404] e anticorpos IgM em camundongos imunizados com ACI-35. Análise de anti-Tau393-408 [pS396/pS404] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de TPLH camundongos em d40 após três imunizações de ACI-35. Os resultados são expressados como O.D. não saturado em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/100 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 9 camundongos.
[0138] Figura 25: Isotipos IgG Anti-Tau206-221 [pT212, pS214] e anticorpos IgM em camundongos imunizados com ACI-39. Análise de anti-Tau206-221 [pT212, pS214] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de TPLH camundongos em d41 após três imunizações ACI-39. Os resultados são expressados como O.D. não saturado em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/200 (IgG2a), 1/200 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/100 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 10 camundongos.
[0139] Figura 26: Isotipos anti-Tau196-211 [pS202, pT205] e anticorpos IgM em camundongos imunizados com ACI-40. Análise de anti- Tau196-211 [pS202, pT205] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de TPLH camundongos em d41 após três imunizações de ACI-40. Os resultados são expressados como O.D. não saturado em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/400 (IgG2a), 1/200 (IgG2b), 1/800 (IgG3) e 1/100 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 10 camundongos.
[0140] Figura 27: Tituladores de anticorpos de IgG em peptídeos Tau diferentes e proteínas em camundongos imunizados com ACI- 33. A análise de tituladores de anticorpos de IgG no d-1 e d41 soros de camundongos TPLH após 3 injeções de AU-33. Os resultados são expressados como O.D. que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 9 camundongos.
[0141] Figura 28: O tituladores de anticorpos de IgG em peptídeos Tau diferentes e proteínas em camundongos imunizados com ACI- 35. A análise de tituladores de anticorpos IgG no d-1 e d40 os soros de TPLH camundongos após 3 injeções de ACI-35. Os resultados são expressados como O.D. que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 9 camundongos,
[0142] Figura 29: Os tituladores de anticorpos IgG em peptídeos Tau diferentes e proteínas e camundongos imunizados com ACI-39. A análise de tituladores de anticorpos IgG no d-1 e d41 soros de camundongos TPLH após 3 injeções de ACI-39. Os resultados são expressados como O.D. que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 10 camundongos.
[0143] Figura 30: Tituladores de anticorpos de IgG em peptídeos e proteínas Tau diferentes em camundongos imunizados com ACI- 40. A análise de tituladores de anticorpos IgG nos d-1 e d41 soros de camundongos TPLH após 3 injeções de ACI-40. Os resultados são expressados como O.D, que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 10 camundongos.
[0144] Figura 30: Rotarod de camundongos imunizados com ACI-33 versus camundongos injetados com PBS. Os ensaios rotarod foram realizados em cinco ocasiões diferentes referidas por idade (meses) dos camundongos TPLH.
[0145] Figura 32: Correlação entre tituladores de anticorpo anti-Tau5-20 [pY18] e teste rotarod. A correlação foi medida quanto ao TPLH injetado com ACI-33 em idade de 7,8 meses. Os tituladores de anticorpos em soro de camundongo foram medidos por ELISA (O.D.) e o teste rotarod mediu o tempo que os animais ficaram no mecanismo (tempo).
[0146] Figura 33: Rotarod de camundongos imunizados com ACI-35 versus camundongos injetados com PBS. Os resultados de rotarod de 9,5 camundongos TPLH imunizados com ACI-35 vs grupo de controle de PBS. ACI-35 n=5 e PBS n = 4 os outros camundongos morreram por causa da patologia apresentada pelo modelo.
[0147] Figura 34: Quantificação de CD3+CD4+ por FAGS em camundongos do nus e do tipo selvagem tratados com ACI-33. As células auxiliadas por porcentagem, que foram positivamente tingidas por CD3 e CD4 de camundongos nus e do tipo selvagem ou que recebem ACI-33. Painel esquerdo: representação esquemática da análise de FAGS em dois camundongos dos grupos nus e do tipo selvagem. Painel direito: Cada coluna representa média e SD para grupos de 6 camundongos. Camundongo #5 e 6: camundongos nus; Camundongo#7 e 8: camundongos do tipo selvagem.
[0148] Figura 35: Anticorpos IgG Anti-Tau5-20 [pY18] em camundongos nus e do tipo selvagem imunizados com ACI-33. A análise de Anticorpos IgG Anti-Tau5-20 [pY18] nos soros de camundongos nus e do tipo selvagem recebendo 3 injeções de ACI-33 em d0, d14 e d28 e sendo sangrado em d2, d7, d21, d35 e d56. Os resultados são expressados como uma média O.D + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0149] Figura 36: Isotipos IgG anti-Tau5-20 [pY18] e anticorpos IgM em camundongos nus e do tipo selvagem imunizados com ACI-33. Análise de anti-Tau5-20 [pY18] IgG1, 2a, 2b, 3 e anticorpos IgM nos soros de camundongos nus e do tipo selvagem em d35 após 4 imunizações com ACI-33. Os resultados são expressados como O.D. não saturado em uma diluição de 1/100 (IgG1), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (1gG3) e 1/100 (IgM) que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0150] Figura 37: Os tituladores de anticorpos IgG em peptídeos e proteína Tau diferentes em camundongos nus e do tipo selvagem imunizados com ACI-33. A análise de tituladores de anticorpos IgG no d35 soros de camundongos nus e do tipo selvagem após 3 injeções de ACI-33. Os resultados são expressados como O.D. que mostra média + desvio padrão obtido no grupo de 6 camundongos.
[0151] SEQ ID N°: 1 Sequência de aminoácido dasequência de controleT5: Tau 379-408 [pS396, pS404]
[0152] SEQ ID N°: 2 Sequência de aminoácido daSequência I (T1):Tau 5-20 [pY18]
[0153] SEQ ID N°: 3 Sequência de aminoácido daSequência 8 (T8): Tau206-221 [pT212, pS214]
[0154] SEQ ID N°: 4 Sequência de aminoácido daSequência 9 (T9): Tau196-211 [pS202, pT205
[0155] SEQ ID N°: 5 Sequência de aminoácido daSequência 3 (T3): Tau393-408 [pS396, pS404]
[0156] SEQ ID N°: 6 Sequência de aminoácido daSequência 4 (T4): Tau401-418 [pS404, pS409]
[0157] SEQ ID N°: 7 Sequência de aminoácido daSequência 2 (T2): Tau200-216 [p5202+ pT205 & pT212+pS214]
[0158] SEQ ID N°: 8 Sequência de aminoácido daSequência 10 (T10): Tau407-418 [pS409]
[0159] SEQ ID N°: 9 Sequência de aminoácido daSequência 11 (T11): Tau399-408 [pS404]
Definição de termos
[0160] Os termos “polipeptídeo, “peptídeo e “proteína” usados neste são intercambiáveis e definidos significar uma biomolécula composta de aminoácidos ligados por uma ligação de peptídeo.
[0161] O termo “peptídeos”, são cadeias de aminoácido (tipicamente L-aminoácidos) cujos alfa-carbonos são ligados através de ligações de peptídeo formadas por uma reação de condensação entre o grupo carboxila do alfa carbono de um aminoácido e o grupo amino do alfa carbono de um outro aminoácido. O aminoácido terminal em uma extremidade da cadeia (isto é, o terminal amino) tem um grupo amino livre, enquanto o aminoácido terminal e a outra extremidade da cadeia (isto é, o terminal carbóxi) tem um grupo carboxila livre. Como tal, o termo “terminal amino” (abreviado terminal N) refere-se ao grupo alfa-amino-livre no aminoácido no terminal amino do peptídeo ou o grupo alfa-amino (o grupo imino quando participa de uma ligação de peptídeo imino quando participa de uma ligação de peptídeo) de um aminoácido em qualquer outro local dentro do peptídeo. Similarmente, o termo “terminal carbóxi” (abreviado terminal C) refere-se ao grupo carboxila livre no aminoácido e o terminal carbóxi de um peptídeo ou ao grupo carboxila de um aminoácido em qualquer outro local dentro do peptídeo.
[0162] Os termos “fragmento deste” ou “fragmento” como usado neste refere-se a um fragmento de peptídeo funcional que tem essencialmente a mesma a atividade (biológica) como os peptídeos definidos neste (por exemplo, como mostrado na SEQ ID N° 2 a 9, respectivamente), isto é, os ditos fragmentos ainda são capazes de evocar uma conformação específica particularmente altamente específica, resposta imune em um organismo, mas particularmente sem um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que é altamente eficaz e capaz de evitar ou aliviar tauopatias ou os sintomas associados com as tauopatias. Em particular, os ditos fragmentos ainda contém o fosfo-epítopo ou fosfo-epítopos patológicos específicos do peptídeo tau, como usado e definido neste.
[0163] Tipicamente, os aminoácidos que formam um peptídeo são numerados em ordem, começando no terminal amino e aumentando na direção do terminal carbóxi do peptídeo. Desta maneira, quando um aminoácido é dito “seguir” um outro, aquele aminoácido é posicionado mais próximo ao terminal carbóxi do peptídeo do que no aminoácido precedente.
[0164] O termo “resíduo” é suado aqui para referir-se a um aminoácido que é incorporado em um peptídeo por uma ligação de amida. Como tal, o aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural ou, a não ser que limitado de outra maneira, pode abranger análogos conhecidos de aminoácidos naturais que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural (isto é, miméticos de aminoácido). Além disso, um mimético de ligação de amida inclui modificações de cadeia principal de peptídeo bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
[0165] A frase “consistindo essencialmente de” é usado aqui para excluir quaisquer elementos que devem substancialmente alterar as propriedades essenciais dos peptídeos aos quais as frases referem-se. Desta maneira, a descrição de um peptídeo “que consiste essencialmente de” exclui quaisquer substituições, adições ou anulações de aminoácido que devem, substancialmente, alterar a atividade biológica daquele peptídeo.
[0166] Além disso, uma pessoa habilitada reconhece que, como mencionado acima, substituições, anulações ou adições individuais que alteram adicionam ou anulam um aminoácido simples ou uma porcentagem pequena de aminoácidos (tipicamente menos do que 5 %, mais tipicamente menos do que 1 %) em uma sequência codificada são variações conservativamente modificadas onde as alterações resultam na substituição de aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituição conservativas fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidos na técnica. Os seguintes seis grupos cada um contendo aminoácidos que são substituições conservativas para um outro:1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T)2) ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E);3) Asparagina (N), Glutamina (Q):4) Arginina (R), Lisina (K);5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V) e6) fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).
[0167] A frases “isolado” ou “biologicamente puro” refere- se ao material que é substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente o acompanham quando encontrado em seu estado natural. Desta maneira, os peptídeos descritos neste não contém materiais normalmente associados como seu ambiente in situ. tipicamente, os peptídeos imunogênicos isolados descritos neste são pelo menos cerca de 80 % puros, usualmente pelo menos cerca de 90 % e preferivelmente pelo menos cerca de 95 % como medido pela intensidade de faixa em um gel tingido com prata.
[0168] A pureza e a homogeneidade de proteína podem ser indicados por diversos métodos bem conhecidos na técnica, tal como eletroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína, seguido pela visualização no tingimento. Para certos propósitos, a resolução alta será necessária e HPLC ou um meio similar de purificação utilizado.
[0169] Quando os peptídeos imunogênicos são relativamente curtos em comprimento (isto é, menores do que cerca de 50 aminoácidos), estes são frequentemente sintetizados usando-se técnicas de síntese de peptídeo usando-se técnicas de síntese de peptídeo químicas padrão.
[0170] A síntese de fase sólida em que o aminoácido de terminal C da sequência é ligada a um suporte insolúvel seguido pela adição seqüencial dos aminoácidos remanescentes na sequência é um método preferido para a síntese química dos peptídeos imunogênicos descritos neste. As técnicas para a síntese de fase sólida são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[0171] Alternativamente, os peptídeos imunogênicos descritos neste são sintetizados usando-se metodologia de ácido nucléico recombinante. Em geral, isto envolve a criação de uma sequência de ácido nucléico que codifica o peptídeo, colocando-se o ácido nucléico em um cassete de expressão sob o controle de um promotor particular, que expressa o peptídeo em um hospedeiro, isolar o peptídeo ou polipeptídeo expressados e, se requerido, renaturando-se o peptídeo. As técnicas suficientes para guiar uma pessoa de habilidade na técnica através de tais procedimentos são encontradas nas literaturas.
[0172] Uma vez expressados, os peptídeos recombinantes podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão, incluindo a precipitação de sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, eletroforese em gel e outros, Substancialmente, as composições puras de cerca de 50 % a 95 % de homogeneidade são preferidos e 80 % a 95 % ou homogeneidade maior são mais preferidas para o uso como agentes terapêuticos.
[0173] Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que, após a síntese química, expressão biológica ou purificação, os peptídeos imunogênicos podem possuir uma conformação substancialmente diferente do que as conformações naturais dos peptídeos constituintes. Neste caso, é frequentemente necessário desnaturar e reduzir o peptídeo antiproliferativo e então fazer com que o peptídeo dobre-se novamente na conformação preferida. Os métodos de reduzir e desnaturar as proteínas e induzir a re-dobra são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[0174] A antigenicidade da proteína purificada pode ser confirmada, por exemplo, demonstrando reação com o soro imune ou com o anti-soro produzido contra a proteína por si só.
[0175] Os termos “um”, “uma” e “o” como usado nestes são definidos significar “um ou mais” e incluem o plural a não ser que o contexto seja inapropriado.
[0176] Os termos “detecção” ou “detectado” como usado neste significa usar técnicas conhecidas para a detecção de moléculas biológicas, tais como métodos imunoquímicos ou histológicos e referem-se quantitativamente ou qualitativamente à determinação da presença ou concentração da biomolécula sob investigação.
[0177] Por “isolado” é entendida uma molécula biológica livre de pelo menos alguns dos componentes com os quais este ocorre naturalmente.
[0178] O termos “anticorpo” “anticorpos” ou “partesfuncionais destes” como usado neste é um termo reconhecido na técnica e é entendido referir-se às moléculas ou fragmentos ativos de moléculas que ligam-se a antígenos conhecidos, particularmente, a moléculas de imunoglobulina e a porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contém um local de ligação que liga-se imunoespecificamente a um antígeno. A imunoglobulina de acordo com a invenção pode ser de qualquer tipo (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) ou classe (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasses de molécula de imunoglobulina.
[0179] Os “anticorpos” são pretendidos dentro do escopo da presente invenção para incluir os anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, quiméricos, de cadeia simples, biespecíficos, simianizados, humanos e humanizados bem como os seus fragmentos ativos. Os exemplos de fragmentos ativos de moléculas que ligam-se a antígenos conhecidos incluem fragmentos Fab e F(ab')z, incluindo os produtos da biblioteca de expressão de imunoglobulina de Fab e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos anticorpos e fragmentos mencionados acima. Estes fragmentos ativos podem ser derivados de um anticorpo da presente invenção por diversas técnicas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais purificados podem ser clivados com uma enzima, tais como pepsina e submetido a filtração em gel de HPLC. A fração apropriada contendo fragmentos Fab pode ser então coletada e concentrada pela filtração em membrana e outros. Para a descrição adicional de técnicas gerais para o isolamento de fragmentos ativos de anticorpos, ver, por exemplo, Khaw, B. A, et al. J. Nucl. Med. 23:10111019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986.
[0180] Um “anticorpo humanizado” refere-se a um tipo de anticorpo projetado tendo seus CDRs derivados de uma imunoglobulina de doador não humano, as partes derivadas de imunoglobulina remanescentes da molécula sendo derivados de uma (ou mais) imunoglobulinas humanas.
[0181] Um anticorpo humanizado ainda pode referir-se a um anticorpo tendo uma região variável onde uma ou mais de suas regiões de estrutura têm aminoácidos de humano ou primata. Além disso, os resíduos de suporte de estrutura podem alterados para preservar a afinidade de ligação. Os métodos para obter “anticorpos humanizados” são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. (ver, por exemplo, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991)).
[0182] Um “anticorpo humanizado” também pode ser obtido por um novo método de engenharia genética que permite a produção de anticorpos policlonais semelhante ao humano maturado por afinidade em animais grandes, tais como, por exemplo, coelhos (http//retech.com/bioventures/therapeutic.php).
[0183] O termo “anticorpo monoclonal” também foi bem reconhecido na técnica e refere-se a um anticorpo que é produzido em massa no laboratório a partir de um clone simples e que reconhece apenas um antígeno. Os anticorpos monoclonais são tipicamente fabricados fundindo-se um anticorpo de vida normalmente curta que produz célula B para uma célula de desenvolvimento rápido, tal como uma célula cancerígena (algumas vezes referida como uma célula “imortal”). A célula híbrida resultante ou hibridoma, multiplica-se rapidamente, criando um clone que produz grandes quantidades do anticorpo.
[0184] O termo “antígeno” refere-se a uma entidade ou fragmento deste que pode induzir uma resposta imune em um organismo, particularmente, um animal, mais particularmente um mamífero que inclui um ser humano. O termo inclui imunogênios e regiões responsáveis pela antigenicidade ou determinantes antigênicos.
[0185] Como usado neste, o termo “solúvel” significa parcial ou completamente dissolvido em uma solução aquosa.
[0186] Também, como usado aqui, o termo “imunogênico” refere-se a substâncias que evocam ou intensificam a produção de anticorpos, células T e outras células imunes reativas direcionadas contra um agente imunogênico e contribui para uma resposta imune em seres humanos ou animais.
[0187] Uma resposta imune ocorre quando um procedimento individual produz anticorpos, células T e outras células imunes reativas suficientes contra as composições imunogênicas administradas da presente invenção para moderar ou aliviar o distúrbio a ser tratado.
[0188] O termo “hibridoma” é reconhecido na técnica e é entendido por aqueles de habilidade comum na técnica para referir-se a uma célula produzida pela fusão produzida por uma fusão de uma célula produtora de anticorpo e uma célula imortal, por exemplo, uma célula de mieloma múltiplo. Esta célula híbrida é capaz de produzir um fornecimento contínuo de anticorpo. Ver a definição de “anticorpo monoclonal” acima e os exemplos abaixo para uma descrição mais detalhada do método de fusão.
[0189] O termo “carregador” como usado neste significa uma estrutura em que o peptídeo antigênico ou a construção supramolecular podem ser incorporados em ou podem ser associados com, desse modo, apresentando ou expondo os peptídeos antigênicos ou parte do peptídeo ao sistema imune de um ser humano ou animal. Qualquer partícula que pode ser usada na terapia animal ou humana, tal como, por exemplo, uma vesícula, uma partícula ou um corpo particulado pode ser usado como um carregador dentro do contexto da presente invenção.
[0190] O termo “carregador” ainda compreende métodos de liberação em que as composições de construção antigênica supramolar que compreendem o peptídeo antigênico podem ser transportadas aos locais desejados por mecanismos de liberação. Um exemplo de um tal sistema de liberação utiliza metais coloidais, tais como ouro coloidal.
[0191] As proteínas carregadoras que podem ser usadas nas composições de construção antigênica supramolar da presente invenção incluem, mas não limitam-se a, proteína de ligação de maltose “MBP”; albumina de soro bovino “BSA”; hemocianina de lapa buraco de fechadura “KLH”; ovalbumina; flagelina; tiroglobulina; albumina de soro de quaisquer espécies; gama globulina de quaisquer espécies; células singenéicas; células singenéicas que carregam antígenos 1a e polímeros de D- e/ou L- aminoácidos.
[0192] Na “construção antigênica supramolar” de acordo com a presente invenção, a lipossoma pode ter uma função dupla em que esta pode ser usada como um carregador que compreende a construção supra- molecular como descrito anteriormente e, ao mesmo tempo, funciona como um adjuvante para aumentar ou estimular a resposta imune dentro do animal ou ser humano alvos a serem tratados com a vacina terapêutica de acordo com a invenção. Também deve ser entendido que as composições de construção antigênica supramolar da presente invenção ainda podem compreende adjuvantes adicionais que incluem, mas não limitam-se a, hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH), albumina de soro bovino (BSA) e outros adjuvantes, tais como, por exemplo, lipídeo A, alume, fosfato de cálcio, interleucina 1 e/ou microcápsulas de polissacarídeos e proteínas, mas, particularmente um lipídeo desintoxicado A, tal como lipídeo de monofosforila ou difosforila A ou alume, preservantes, diluentes, emulsificadores, estabilizadores e outros componentes que são conhecidos e usados em vacinas da técnica anterior. Além disso, qualquer sistema de adjuvante conhecido na técnica pode ser usado na composição da presente invenção. Tais adjuvantes incluem, mas não limitam-se a, adjuvante incompleto de Freund, adjuvante completo de Freund, manano acetilado ligado por β-(1,4) polidispersado (''Acemannan”), TITERMAX(R) (adjuvantes de copolímero polioxietileno-polioxipropileno da CytRx Corporation), adjuvantes de lipídeo modificados da Chiron Corporation, adjuvantes derivados de saponina da Cambridge Biotech, Bordetella pertussis morto, o lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias de gram-negativo, ânions poliméricos grandes, tais como sulfato de dextrano e géis inorgânicos, tais como alume, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio.
[0193] Além disso, o termo “quantidade eficaz” refere-se à quantidade de composição antigênica/imunogênica que, quando administrada a um ser humano ou animal, evoca uma resposta humana. A quantidade eficaz é facilmente determinada por uma pessoa de habilidade na técnica seguindo os procedimentos de rotina.
[0194] Um “paciente tolerante imune” como usado neste refere-se a um animal ou paciente humano que apresenta uma capacidade limitada para responder aos antígenos, particularmente não-auto antígenos, mas especialmente novos antígenos, tais como, por exemplo, novos antígenos presentes em doenças recentemente emergentes. Esta limitação pode ocorrer devido, pelo menos em parte à idade cronológica de células CD4+ T. Além disso, um “paciente tolerante imune” pode apresentar uma resposta imune de célula CD4+ T de período longo prejudicada à exposição do antígeno devido aos defeitos na proliferação e secreção de citocina de células T de memória durante respostas de recordação.
[0195] Um “paciente ativado com célula T” como usado neste refere-se a um animal ou paciente humano que apresenta ativação de célula T e onde um estímulo adicional da resposta à célula T causaria um risco médico.
[0196] Um paciente “imunocomprometido” como usado aqui, refere-se a um animal ou paciente humano tendo um sistema imune que foi prejudicado pela idade, doença tal como HIV ou câncer ou pelo tratamento, tal como, por exemplo, tratamento contra doenças inflamatórias que incluem mas não limitam-se a, Artrite Reumatóide, Psoríase, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Granulomatose de Wegener, etc.
[0197] Dentro do escopo da presente invenção, foi demonstrado que o anticorpo que induziu a resposta a uma composição antigênica de acordo com a invenção é grandemente independente da célula T. Um modelo de camundongo nu neste aspecto e os camundongos nus foram vacinados e as respostas de anticorpo medidas para avaliar a resposta de anticorpo específica de Aβ induzida pela composição antigênica de acordo com a invenção nos camundongos nus imunizados. Os camundongos nus carregam a mutação Foxn1nu e como uma consequência, têm função de célula T reduzida devido à perda de um timo apropriado.
[0198] Uma “quantidade farmaceuticamente eficaz” como usado neste refere-se a uma dose do ingrediente ativo em uma composição farmacêutica adequada para a cura ou pelo menos parcialmente impedir os sintomas da doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou quaisquer complicações associadas com estes.
[0199] Uma forma de realização específica, a presente invenção faz uso de uma apresentação de antígeno, particularmente na superfície de uma molécula carregadora, tal como um lipossoma que resulta na exposição e na estabilização intensificadas de uma conformação de antígeno preferida, que, ultimamente, leva a uma resposta imune altamente específica, particularmente uma resposta imune independente de célula T e resulta na geração de anticorpos com propriedades únicas.
[0200] Em particular, o peptídeo antigênico é apresentado na superfície da molécula carregadora em uma série altamente repetitiva, que compreende pelo menos 10 unidades antigênicas repetitivas/molécula de carregador, particularmente pelo menos 50 unidades antigênicas repetitivas/molécula de carregador, particularmente pelo menos 100 unidades antigênicas repetitivas/molécula de carregador, particularmente pelo menos 200 unidades antigênicas repetitivas/molécula de carregador, particularmente pelo menos 300 unidades antigênicas repetitivas/molécula de carregador; particularmente pelo menos 400 unidades antigênicas repetitivas/molécula de carregador, particularmente pelo menos 500 unidades antigênicas repetitivas/molécula de carregador,
[0201] O antígeno de fosfo-peptídeo modificado de acordo com a invenção e como descrito neste, particularmente, um antígeno de fosfo- peptídeo que imita um fosfo-epítopo patológico de proteína tau, pode ser sintetizado seguindo um método modificado relatado em Nicolau et. al. (2002) Proc Natl. Acad. Sci USA 99, 2332-2337. Este método envolve a montagem por etapas da construção pela síntese de peptídeo de fase sólida em uma resina de amida usando-se a química de Fmoc/tBu padrão. Os grupos de proteção ortogonais das lisinas terminais foram então removidos e os grupos amino livres acilados com ácido palmítico.
[0202] A desproteção dos grupos de proteção de cadeia secundária e liberação concomitante do peptídeo da resina foi atingida sob condições ácidas, fornecendo o fosfopeptídeo tetrapalmitoilado desejado como um produto.
[0203] O produto final pode ser então obtido em pureza alta e sua identidade e pureza confirmadas pelos métodos conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, espectrometria de massa de eletropulverização e/ou análise de HPLC.
[0204] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece composições inunogênicas que compreende um antígeno de fosfo- peptídeo de acordo com a invenção e como descrito neste que imita um fosfo- epítopo patológico de proteína tau, cujo antígeno de peptídeo é modificado, tal que este é capaz de manter e estabilizar uma conformação definida do antígeno. Esta conformação definida leva à indução de uma resposta imune forte e altamente específica na introdução em um animal ou um ser humano.
[0205] Uma maneira de atingir a formação e a estabilização da conformação do peptídeo antigênico ocorre pela apresentação do peptídeo antigênico ligado a, ou incorporado ou reconstituído, parcial ou totalmente, em um carregador, particularmente um carregador que também pode funcionar como um adjuvante.
[0206] Um carregador que pode ser considerado dentro do escopo da presente invenção é, por exemplo, uma vesícula, um corpo particulado ou molécula; proteínas de membrana bacteriana, proteínas Omp enterobacterianas, nanopartículas, micelas, partículas de ouro, microcontas e/ou virossomas ou quaisquer outros meios que podem adequadamente servir como um carregador/adjuvante para o peptídeo antigênico, mas, particularmente, um lipossoma.
[0207] Em uma forma de realização da invenção, o peptídeo antigênico é ligado a, ou incorporado ou reconstituído no carregador através de interações fracas, tais como, por exemplo, interação hidrofóbica ou eletrostática de van der Waal's, ou uma combinação de duas ou mais das ditas interações, tal que o peptídeo seja apresentado com uma conformação específica, que é mantida e estabilizada restringindo-se o dito em sua liberdade tridimensional de movimento de modo que as mudanças de conformação sejam evitadas ou severamente restritas.
[0208] Quando uma vesícula, uma partícula ou um corpo particulado é usado como um carregador/adjuvante tal como, por exemplo, um lipossoma, a composição do peptídeo antigênico pode ser escolhido, tal que sua carga de rede total seja idêntica àquela da superfície de carregador/adjuvante à qual o peptídeo está ligado. As forças de repulsão eletrostáticas sendo eficazes entre a superfície de carregador/adjuvante identicamente carregado e o peptídeo antigênico, mas particularmente a superfície de carregador identicamente carregada e o resíduos de aminoácido constituindo o peptídeo antigênico e, mais particularmente, a superfície de carregador identicamente carregada e os resíduos de aminoácido identicamente carregados compreendidos no peptídeo antigênico, pode levar ao peptídeo antigênico adotando uma conformação definida altamente específica e estabilizada que garante uma atividade biológica alta. Como um resultado, o peptídeo antigênico é exposto e apresentado em uma conformação que é altamente ativo de maneira biológica e apresentado em uma conformação em que esta permite que o sistema imune do organismo alvo para interagir livremente com os determinantes antigênicos contidos na construção antigênica na conformação biologicamente ativa, que, na administração a um animal ou a um ser humano, leva a uma respota imune forte e específica da conformação, resultando em, por exemplo, um titulador de anticorpo alto no organismo alvo.
[0209] A resposta imunogênica ainda pode ser aumentada usando-se um lipossoma como um carregador cuja lipossoma pode funcionar como um adjuvante para aumentar ou estimular a resposta imune dentro do animal ou ser humano alvos a serem tratados com a composição farmacêutica de acordo com a invenção. Opcionalmente, o lipossoma pode, além disso, conter um adjuvante adicional, tal como, por exemplo, lipídeo A, alume, fosfato de cálcio, interleucina 1 e/ou microcápsulas de polissacarídeos e proteínas, mas particularmente um lipídeo desintoxicado A, tal como monofosforila ou difosforil lipídeo A ou alume.
[0210] Em uma forma de realização da invenção, um peptídeo antigênico de acordo com a invenção e descrito neste, particularmente um peptídeo antigênico cuja carga de rede total é negativa, é usado reconstituído em um lipossoma, particularmente um lipossoma, cujos constituintes são escolhidos tal que a carga de rede total do grupo superior de lipossoma é negativa. Em particular, o lipossoma é composto de constituentes selecionados do grupo que consiste de dimiristoil fosfatidil colina (DMPC), dimiristoil fosfatidil etanolamina (DMPEA), dimiristoil fosfatidil glicerol (DMPG) e colesterol e opcionalmente, ainda contém monofosforil lipídeo A ou qualquer outro adjuvante que pode ser adequadamente usado dentro do escopo da presente invenção tal como, por exemplo, alume, fosfato de cálcio, interleucina 1 e/ou microcápsulas de polissacarídeos e proteínas.
[0211] Em uma outra forma de realização específica da invenção, um antígeno de peptídeo modificado de acordo com a invenção e como descrito anteriormente é fornecido covalentemente ligado a uma molécula tipo âncora que é capaz de inserir no carregador/adjuvante desse modo fixando o peptídeo ao carregador/adjuvante e que o apresenta em proximidade próxima à superfície de uma molécula de carregador/adjuvante tal que as forças eletrostáticas podem tornar-se eficazes como descrito anteriormente.
[0212] Quando os lipossomas são usados como um carregador/adjuvante, a construção de peptídeo antigênico, em geral, tem uma cauda hidrofóbica que insere na membrana da lipossoma quando esta é formada. Adicionalmente, os peptídeos antigênicos podem ser modificados para conter uma cauda hidrofóbica de modo que esta possa ser inserida no lipossoma.
[0213] A composição antigênica da presente invenção particularmente compreende peptídeos modificados para intensificar o efeito antigênico em que tais peptídeos podem ser modificados por intermédio da peguilação (usando-se polietileno glicol ou polietileno glicol modificado) ou modificado por intermédio de outros métodos tais como por ácido palmítico como descrito anteriormente, poli-aminoácidos (por exemplo, poli-glicina, poli-histidina), poli-sacarídeos (por exemplo, ácido poligalacturônico, ácido poliláctico, poliglicolida, quitina, quitosan), polímeros sintéticos (poliamidas, poliuretanos, poliésteres) ou co-polímeros (por exemplo, poli(ácido metacrílico) e N-(2-hidróxi) propil metacrilamida) e outros.
[0214] Em uma forma de realização da invenção, os peptídeos antigênicos de acordo com a invenção e como descrito anteriormente são fornecidos, sendo modificados para conter uma cauda hidrofóbica de modo que os ditos peptídeos possam ser inseridos no lipossoma. Em particular, o antígeno de fosfo-peptídeo de acordo com a invenção e como descrito neste que imita um fosfo-epítopo patológico de proteína tau, pode ser modificado por uma porção lipofílica ou hidrofóbica que facilita a inserção na bicamada de lipídeo do carregador/adjuvante. As porções lipofílicas ou hidrofóbicas da presente invenção podem ser ácidos graxos, triglicerídeos e fosfolipídeos, particularmente, ácidos graxos, triglicerídeos e fosfolipídeos, em que a cadeia principal de carbono de ácido graxo tem pelo menos 10 átomos de carbono particularmente as porções lipofílicas tendo ácidos graxos com a cadeia principal de carbono de pelo menos aproximadamente 14 átomos de carbono e até aproximadamente 24 átomos de carbono, com cada número do indivíduo de átomos de carbono estando dentro desta faixa também sendo parte da presente invenção. Em particular, a invenção diz respeito a um peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito anteriormente, que é modificado para conter uma cauda hidrofóbica, particularmente uma cauda hidrofóbica que compreende porções hidrofóbicas tendo uma cadeia principal de carbono de pelo menos 14 átomos de carbono, mas especialmente 16 átomos de carbono. Os exemplos de porções hidrofóbicas incluem, mas não limitam-se a, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido oléico, ácido linolênico, e colesterol ou I,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DSPE). Em uma forma de realização da invenção a porção hidrofóbica é ácido palmítico.
[0215] Em uma forma de realização, o peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste é covalentemente ligado a uma porção lipofílica ou hidrofóbica. No contexto da presente invenção, a ligação covalente do peptídeo antigênico pode ser mediado por meio dos resíduos de ácido de amina, que estende-se a sequência de aminoácidos correspondente as sequências do peptídeo antigênico de acordo com a invenção, particular aos seus finais, particularmente em seus finais de terminal N- e C- e no qual os resíduos de ácido graxo são ligados.
[0216] Em particular, cada conjugado compreende pelo menos quatro moléculas de ácido graxo contendo uma cadeia de carbono entre C12 e C24, particularmente a cadeia de carbono de C16, em que as moléculas de ácido graxo são covalentemente ligadas nos finais de terminais N- e C dos peptídeos antigênicos. Outras distribuições também podem ser prevenidos, incluindo dentro da sequência de aminoácido. Estes peptídeos também são ligados covalentemente as moléculas de ácido graxo.
[0217] As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender deste modo os lipossomas feitos pela reconstituição de lipossomos na presença de peptídeos antigênicos modificados, purificados ou parcialmente purificados de acordo com a invenção e como descrito neste. Adicionalmente, os fragmentos de peptídeo podem ser reconstituídos nos lipossomos. A presente invenção também inclui os fragmentos de peptídeo antigênico modificados de modo como para aumentar sua antigenicidade. Por exemplo, porções antigênicas e adjuvantes podem ser ligados ou misturados com o peptídeo. Exemplos de porções e adjuvantes incluem, mas não limitado a, derivados de dipeptídeo muramil lipofílico, polímeros de bloco não iônicos, hidróxido de alumínio ou adjuvante de fosfato de alumínio e misturas destes.
[0218] Os lipossomos que podem ser usados nas composições da presente invenção incluem aqueles conhecidos a pessoa habilitada na técnica. Qualquer um dos lipídeos padrões úteis para a fabricação de lipossomos podem ser usados. Os lipossomos de bicamada e camadas múltiplas padrões podem ser usados para fabricar as composições da presente invenção. Enquanto qualquer método de fabricação de lipossomos conhecidos aquela pessoa habilitada na técnica pode ser usado, os lipossomos mais preferidos são feito de acordo com o método Alving et al., Infect. Immun. 60:2438-2444, 1992, portanto incorporado por referência. O lipossomo pode conter opcionalmente um adjuvante ou imunomodulador ou ambos. Um imunomodulador preferido é lipídeo A, particularmente um lipídeo A desintoxicado tal como, por exemplo, monofosforil ou difosforil lipídeo A.
[0219] Os lipossomos podem ser preparados pela técnica de injeção de fluxo cruzado como descrito, por exemplo, em Wagner et al (2002) Journal of Liposome Research Vol 12(3), pp 259 - 270. Durante a injeção das soluções de lipídeos em um sistema de tampão aquoso, os lipídeos tende-se a formar “precipitados”, seguindo pela própria disposição nas vesículas. O tamanho da vesícula obtida depende dos fatores tal como concentração de lipídeo, taxa de agitação, taxa de injeção e a escolha de lipídeos. O sistema de preparação pode consistir de um módulo de injeção de fluxo cruzado, recipientes para a fase polar (por exemplo uma solução de tampão PBS), um recipiente de solução de etanol/lipídeo e um dispositivo de pressão, mas particularmente um dispositivo de pressão de nitrogênio. Enquanto a solução polar ou aquosa é bombeada através do módulo de injeção de fluxo cruzado a solução de etanol/lipídeo é injetada na fase polar com variação das pressões aplicadas.
[0220] Em uma forma de realização o peptídeo antigênico modificado de acordo com a invenção e como descrito neste pode deste modo ser ainda modificado pela reconstituição nos lipossomos que consistem de fosfolipídeos e colesterol (fosfatidiletanol amina, fosfatidil glicerol, colesterol em razões molares variadas. Outros fosfolipídeos podem ser usados. O lipídeo A é usado em uma concentração de aproximadamente 40 μg/pmol de fosfolipídeos.
[0221] O lipossomo pode ter uma função dupla em que este pode ser usado como um carregador que compreende a construção supramolecular como descrito neste antes e, ao mesmo tempo, função como um adjuvante para aumentar ou estimular a resposta imune dentro do animal alvo e humano a ser tratado com a vacina terapêutica de acordo com a invenção. Opcionalmente, o lipossomo pode, além disso, conter um adjuvante adicional ou imunomodulador ou ambos tal como, por exemplo, lipídeo A, alume, fosfato de cálcio, interleucina 1 e/ou microcápsulas de polissacarídeos e proteínas, mas particularmente um lipídeo A, mais particularmente um lipídeo A desintoxicado, tal como monofosforil ou difosforil lipídeo A, ou alume.
[0222] Em uma forma de realização da invenção, os lipossomos com lipídeo A são usados como adjuvante para preparar a composição farmacêutica da invenção. Dimiristoilfosfatidil-colina, -glicerol e -colesterol são misturados, particularmente em uma razão molar de 9:1:7. Um imunomodulador forte tal como, por exemplo, monofosforil lipídeo A é então adicionado em uma concentração adequada, particularmente em uma concentração entre 20 mg e 50 mg por mmol, mais particularmente em uma concentração entre 30 mg e 40 mg por mmol de fosfolipídeos. O peptídeo antigênico modificado é então adicionado em um peptídeo de razão molar aos fosfolipídeos entre 1:30 e 1:200, particularmente em uma razão molar entre 1:50 e 1:120, mais particularmente de 1:100. Os solventes são removidos, por exemplo através da evaporação e a película resultante hidratada com solução de tampão estéril tal como, por exemplo PBS.
[0223] Em uma forma de realização da invenção um peptídeo antigênico de acordo com a invenção e como descrito neste é fornecido modificado por pelo menos duas moléculas de ácido palmítico covalentemente ligados aos finais de terminal N- e C- do dito peptídeo antigênico e pela reconstituição em um carregador lipossomal.
[0224] A palmitoilação, enquanto fornecendo uma âncora para o peptídeo na bicamanda de lipossomo, devido ao comprimento reduzido relativo de porção de ácido graxo C16:0 conduz ao peptídeo sendo apresentado, exposto ou na proximidade à superfície de lipossomo.
[0225] A composição farmacêutica da presente invenção que compreende um antígeno de peptídeo de acordo com a invenção e como descrito neste, particularmente um fosfo-epítopo patológicos de proteína tau imitando fosfopeptídeos, particularmente em uma quantidade farmaceuticamente efetiva, pode ser preparada na forma de uma solução líquida, ou de uma suspensão injetável, ou outro em uma forma sólida adequada para a solubilização antes da injeção no contexto de, por exemplo, um kit para a fabricação do uso da presente composição, como descrito abaixo.
[0226] Os carregadores farmacêuticos adequados, diluentes e/ou excipientes são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, soluções salinas tamponadas por fosfato, água, emulsões tal como emulsões óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc.
[0227] A formulação da composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser acompanhada de acordo com a metodologia padrão conhecida aquela pessoa habilitada na técnica.
[0228] A composição farmacêutica da presente invenção que compreende um antígeno de peptídeo de acordo com a invenção e como descrito neste, particularmente um fosfo-epítopos patológicos de proteína tau imitando fosfopeptídeos, particularmente em uma quantidade farmaceuticamente efetiva, pode ser administrado a um humano ou animal que sofre de uma tauopatia, ou os sintomas associados com uma tauopatia, para induzir uma resposta imune no dito humano ou animal para aliviar os sintomas associados com a doença ou para restaurar uma condição observada nos indivíduos saudáveis não são afetados pela doença.
[0229] As composições da presente invenção são administradas a um humano ou animal por qualquer via padrão apropriada de administração na forma de um sólido, líquido ou aerossol em uma dosagem efetiva farmaceuticamente adequada. Em geral, a composição pode ser administrada pelas vias tópicas, orais, retais, nasais ou parenterais (por exemplo, intravenosa, subcutânea ou intramuscular). Além disso, a composição pode ser incorporada nas matrizes de liberação sustentadas tal como polímeros biodegradáveis, os polímeros sendo implantados na adjacência de onde a liberação é desejada, por exemplo, no local de um tumor. O método inclui a administração de uma dosagem simples, administração de dosagens repetidas nos intervalos de tempo pré- determinados e administração adequada por um período de tempo pré- determinado.
[0230] Em uma forma de realização da invenção a construção antigênica de acordo com a invenção, particularmente uma composição de vacina que compreende a construção antigênica em uma forma farmaceuticamente aceitável, é administrada em dosagem repetidas, em particular em 1 a 15 doses, mais particularmente em 2 a 10 doses, mais particularmente em 3 a 5 doses e ainda mais particularmente em 3 doses, em intervalos de tempo entre 1 semana e 20 semanas, particularmente em intervalos de tempo entre 1 e 10 semanas, particularmente em intervalos de tempo entre 1 e 6 semanas, mais particularmente em intervalos de tempo entre 1 e 4 semanas e ainda mais particularmente em intervalos de tempo entre 2 e 3 semanas. A resposta imune pode ser monitorada deixando as amostras de soro/plasma em um período adequado após intensificação, particularmente 3 a 10 dias após intensificação, mais particularmente 4 a 8 dias após intensificação e mais particularmente 7 dias após intensificação e determinando a imunogeneicidade da construção antigênica usando metodologia conhecida, particularmente um dos imunoensaios comumente usados tal como, por exemplo, um ensaio ELISA.
[0231] Em particular, a composição de peptídeo antigênico de acordo com a invenção é administrada parenteral, particularmente pela injeção intra-peritoneal, intravenoso, subcutâneo e intra-muscular.
[0232] As preparações para a administração incluem soluções aquosos ou não aquosos estéreis, suspensões e emulsões. Os solventes não aquosos incluem sem ser limitado a, propileno glicol, polietileno glicol, óleo vegetal tal como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila: solventes aquosos podem ser escolhidos a partir do grupo que consiste de água, soluções aquosas/álcool, emulsões ou suspensões incluindo meio tamponado e solução salina. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado, ou óleo fixos. Os veículos intravenosos incluem os reabastecedores de nutriente e fluido, reabastecedores de eletrólito (tal como aqueles com base na dextrose de Ringer) e outros. Os preservantes também podem estar presentes tal como, por exemplo, anti-microbianos, anti- oxidantes, agentes quelantes, gases inertes, etc.
[0233] A dosagem de uma composição dependerá da condição sendo tratada, a composição particular usada e outros fatores clínicos tal como peso, tamanho e condição do paciente, área de superfície corporal, o composto particular ou composição a ser administrada, outros medicamentos administrados concorrentemente e a via de administração.
[0234] A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser administrada em combinação com outras substâncias biologicamente ativas e procedimentos para o tratamento de doenças, particularmente doenças neurodegenerativas. As outras substâncias biologicamente ativas pode ser parte da mesma composição prontamente que compreendem a composição farmacêutica de acordo com a invenção, na forma de uma mistura, em que a composição farmacêutica da invenção e as outras substâncias biologicamente ativas são intermisturadas ou com o mesmo solvente farmaceuticamente aceitável e/ou carregador pode ser fornecido separadamente como parte de uma composição separada, que pode ser oferecida separadamente ou junto na forma de um kit de partes.
[0235] A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser administrada concomitantemente com outras substâncias biologicamente ativas ou substâncias intermitentemente ou sequencialmente. Por exemplo, a composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser administrada simultaneamente com a primeira substância biologicamente ativa adicional ou sequencialmente antes ou após a administração da composição farmacêutica. Se um esquema de aplicação é escolhida onde mais do que uma substância biologicamente ativa adicional são administradas junto com pelo menos uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, os compostos ou substratos podem ser parcialmente simultâneos, parcialmente sequenciais em várias combinações.
[0236] É um outro objetivo da presente invenção fornecer as misturas da composição farmacêutica de acordo com a invenção e, opcionalmente, uma ou mais substâncias biologicamente ativas adicionais, bem como aos métodos de uso da composição farmacêutica de acordo com a invenção, ou misturas destes incluindo as composições que compreendem a dita composição farmacêutica ou misturas da composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento terapêutico e/ou alívio das tauopatias, grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante neste grupo de distúrbios neurodegenerativos que inclui mas não limita-se a, mal de Alzheimer, Doença de Creutzfeldt- Jacob, Demência pugilistica, Síndrome de Down, doença de Gerstmann- Straussler-Scheinker, miosita de corpo de inclusão e angiopatia amilóide cerebral de proteína priônica, dano cerebral traumático e ainda complexo de esclerose lateral amiotrófica/Demência do parkinsonismo de Guam, Doença de neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência do grão angirofílico, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de sistema múltiplo, doença de Niemann-Pick, tipo C, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo Pós-encefálico, Distrofia Miotônica.
[0237] As misturas de acordo com a invenção pode compreender, além disso a composição farmacêutica de acordo com a invenção, uma substância biologicamente ativa tal como, por exemplo, compostos conhecidos usados na medicação de tauopatias e/ou de amiloidoses, um grupo de doenças e distúrbios associados com proteína semelhante a amilóide ou amilóide tal como a proteína β amilóide envolvida na Mal de Alzheimer:
[0238] Em uma outra forma de realização da invenção, a outra substância biologicamente ativa ou composto também pode ser um agente terapêutico que pode ser usado no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com proteínas semelhantes a amilóide ou amilóide incluindo amiloidose causada por β amilóide ou pode ser usado na medicação de outros distúrbios neurológicos.
[0239] A outra substância biologicamente ativa ou composto pode enxertar seus efeitos biológicos pelo mesmo ou mecanismo similar como a vacina terapêutica de acordo com a invenção ou pelo mecanismo não relacionado de ação ou pela multiplicidade dos mecanismos relacionados e/ou não relacionados de ação.
[0240] Geralmente, o outro composto biologicamente ativo pode incluir intensificadores de transmissão de nêutron, medicamentos psicoterapêuticos; inibidores de acetilcolina esterase, bloqueadores de canal de cálcio, aminas biogênicas, tranquilizantes de benzodiazepina, síntese de acetilcolina, armazenagem ou intensificadores de liberação, agonistas receptores de acetilcolina pós-sinápticos, inibidores de monoaminaoxidase-A ou -B, antagonistas receptores de N-metil-D-aspartato de glutamamto, medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais, antioxidantes e serotonérgicos, antagonistas receptores.
[0241] Em particular, a mistura de acordo com a invenção pode compreender pelo menos um outro compostos biologicamente ativo selecionado do grupo que consiste de contra a tensão oxidativa, compostos anti-apoptóticos, quelantes metálicos, inibidores de reparo de DNA tal como pirenzepina e metabólitos, ácido 3-amino-1-propanossulfônico (MPS), 1,3- propanodissulfonato (1RDS), ativadores de secretase, inibidores de β e y, proteína taus, neurotransmissores, quabradores de lâminae, moléculas anti- inflamatórias ou inibidores de colinesterase (ChEls) tal como tacrina, rivastigmina, donepezil e/ou galantamina e outros medicamentos e suplementos nutritivos, junto com uma vacina terapêutica de acordo com a invenção e, opcionalmente, um carregador e/ou diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0242] Em uma forma de realização adicional, as misturas de acordo com a invenção podem compreender niacina ou memantina junto com uma vacina terapêutica de acordo com a invenção e opcionalmente um carregador e/ou diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0243] Ainda, em uma outra forma de realização da invenção as misturas são fornecidas que compreendem “anti-psicóticos atípicos” tal como, por exemplo clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina para o tratamento de sintomas psicóticos e negativos incluindo alucinações, ilusões, através de distúrbios (manifestado por incoerência marcada, descarrilhamento, tangencialidade) e comportamento bizarro ou desorganizado, bem como anedonia, afeto enfraquecido, apatia e afastamento social, junto com uma vacina terapêutico de acordo com a invenção e, opcionalmente, um carregador e/ou diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0244] Em uma forma de realização da invenção, as composições e misturas de acordo com a invenção e como descrito anteriormente compreendem a composição farmacêutica de acordo com a invenção e substância biologicamente ativa, respectivamente, em uma quantidade terapeuticamente ou profilativamente efetiva.
[0245] Outros compostos que podem ser adequadamente usados nas misturas em combinação com a composição farmacêutica de acordo com a invenção são descritos, por exemplo, em WO 2004/058258 (ver especialmente páginas 16 e 17) incluindo os alvos de medicamento terapêuticos (páginas 36-39), ácidos alcanossulfônicos e ácido alcanolsulfúrico (páginas 39-51), inibidores de colinesterase (páginas 51-56), antagonistas do receptor NMDA (páginas 56-58), estrogênios (páginas 5859), medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais (páginas 60-61), antioxidantes (páginas 61-62), proligeradores de peroxissomo-agonistas receptores ativadores (PPAR) (páginas 63-67), agentes de diminuição de colesterol (páginas 68-75); inibidores amilóides (páginas 75-77), inibidores de formação amilóide (páginas 77-78), queladores metálicos (páginas 78-79), anti-psicóticos e anti-depressivos (páginas 80-82), suplementos nutricionais (páginas 83-89) e compostos que aumentam a disponibilidade das substâncias biologicamente ativas no cérebro (ver páginas 89-93) e pró-medicamentos (páginas 93 e 94 ), no qual o documento é incorporado neste por referência, mas especialmente os compostos mencionados nas páginas indicadas acima.
EXEMPLOS
[0246] EXEMPLO 1: Vacinas
[0247] Oito sequências derivadas de proteína-fosfa tauforam projetados como antígeno para o desenvolvimento de vacina. Um peptídeo imunogênico previamente usado foi usado como um controle (Asuniet aL, 2007).Tabela 1: Descrição da sequência Tau
Figure img0001
[0248] EXEMPLO 2: Preparação de fosfo-peptídeos detetrapalmitoilado derivado de Tau
[0249] A sequência de peptídeo antigênico flanqueada por 2 pares de lisinas foi montado gradualmente pela síntese de peptídeo de fase sólida em uma resina de amida usando química Fmoc/tBu padrão. Os grupos de proteção ortogonal das lisinas terminais foram então seletivamente removidas e os grupos de amino livres acilados com ácido palmítico.
[0250] A desproteção dos grupos de proteção de cadeia secundária e liberação concomitante do peptídeo a partir da resina foi atingido sob condições ácidas, fornecendo o fosfopeptídeo tetrapalmitoilado desejado como um produto bruto. A identidade e pureza ainda foi confirmado pela espectrometria de massa MALDI-TOF e análise HPLC.
[0251] Sequências de fosfopeptídeos de tetrapalmitoilado derivado de Tau:T1: H-K(Pal)-K(Pal)-RQEFEVIVtEDHAGTY(P)GL-K(Pal)- K(P.al)-NH2T2: H-K(Pal)-K(Pal)-PGS(p)PGT(p)PGSRSRT(p)PS(p)LP- K(Pal)-K(Pal)-NH2T3: H-K(Pal)-K(Pal)-VYKS(p)PVVSGDTS(p)PRHL-K(Pal)- K(Pal)-NH2T4: H-K(Pal)-K(Pal)-GDTS(O)PRHLS(p)NVSSTGSID-K(Pal)-K(Pal)- NH2T8: H-K(Pal)-K(Pal)-PGSRSRT(p)PS(p)LPTPPTR-K(Pal)- K(Pal)-NH2 T9: H-K(Pal)-K(Pal)-GYSSPGS(p)PGT(p)PGSRSR-K(Pal)- K(Pal)-NH2 T10: H-K(Pal)-K(Pal)-HLS(p)NVSSTGSID-K(Pal)-K(Pal)-NH2T11: H-K(Pal)-K(Pal)-VSGDTS(p)PRHL-K(Pal)-K(Pal)-NH2 2.1: Síntese de antígeno de peptídeo T1
[0252] O aminoácido ortogonalmente protegido Fmoc- Lys(Mtt)-OH (3 eq) foi manualmente carregado a uma resina de amida (resina de amida Rink MBHA, 1 eq, 0,26 mmol) na presença de 2 eq de DlC/HOBt em DMF. A resina foi então lavada com DMF (3 x 1 min). Após remoção do grupo Fmoc de terminal N com 25 % de piperidina em DMF (1 x 1 min e 2 x 15 min), o segundo resíduo de Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 eq), foi automaticamente ligado usando 5 eq de PyBOP/HOBt/DIEA em DMF (2 x 15 min). Os 16 aminoácidos seguintes carregam os grupos de proteção de cadeia secundária padrão Fmoc foram automaticamente incorporados aplicando-se previamente ao protocolo de ligação descrito. Os fosfoaminoácidos foram introduzidos como ésteres monobenzílicos no grupo de fosfato. Cada etapa de ligação foi seguida por uma etapa de lavagem com DMF (3 x 30 s), a etapa de remoção Fmoc com 25 % de piperidina em DMF (3 x 3 min) e uma segunda etapa de lavagem com DMF (6 x 30 s). Após a ligação do Tyr(PO(OBzl)2) 0,5 % de DBU em DMF foi usado pela etapa de desproteção Fmoc. A montagem da sequência de peptídeo finalizada com a adição dos dois últimos Fmoc-Lys(Mtt)-OH usando 2 eq de PyBOP/HOBUD/EA em DMF.
[0253] Então, os grupos Mtt dos resíduos de lisina terminal foram seletivamente clivados sob nitrogênio pelo tratamento de uma resina (1 eq, 600 mg, 0,092 mmol) com 10 mL de uma mistura desgaseificada de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante diversos ciclos de 10 minutos. A resina foi lavada com DCM (x3) e DMF (x3). Então o ácido palmítico (20 eq, 473 mg, 1,85 mmol) foi ligado a estes grupos amino desprotegidos usando TBTU (20 eq, 593 mg, 1,85 mmol) e DIEA (40 eq, 643 pL, 3:70 mmol) em DCM/DMF (1:1) (6 mL). A resina foi lavada com DCM (x5) e DMF (x5). Então o grupo Fmoc de terminal N foi removido com 20 % de piperidina desgaseificada em DMF (3 x 10 min) e a resina foi lavada com DMF (x3) e DCM (x5). Finalmente a clivagem de resina simultânea e desproteções de cadeia secundária foram realizados sob nitrogênio com uma mistura desgaseificada de TFAITIPS/H2O/EDT (95:125:2,5) (4 mL) durante 4,5 horas. A trituração de éter dietílico frio deu o produto bruto T1 como um sólido branco (189 mg, 60 % de rendimento) com uma pureza de 56 % (de análise HPLC). Espectrometria de massa MALDI-TOF confirmou uma identidade do produto maior (m/z esperado: 3427,12 [MH+], observado: 3426,87).
2.2: Síntese de antígeno de peptídeo T3
[0254] O aminoácido ortogonalmente protegido Fmoc- Lys(Mtt)-OH (3 eq) foi manualmente carregado a uma resina de amida (Resina Rink amida MBHA, 1 eq, 0,4 mmol) na presença de PyBOP/HOBt/DIEA em DMF. A resina foi então lavada com DMF (3 x 1 min). Após remoção do Grupo Fmoc de terminal N com 25 % de piperidina em DMF (1 x 1 min e 2 x 15 min), o segundo resíduo de Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 eq), foi ligado usando as mesmas condições de carregamento. Os 16 aminoácidos seguintes carregam os grupos Fmoc de proteção de cadeia secundária padrão que foram manualmente incorporados aplicando-se previamente o protocolo de ligação descrito, Os fosfoaminoácidos foram introduzidos como ésteres monobenzílicos no grupo de fosfato. O tempo de ligação foi determinado pelo teste TNBT ou teste de cloranila após uma Prolina. Se necessário, uma segunda ligação foi realizada com 2 eq de aminoácido Fmoc na presença de DIC/HOBt ou HATU/DIEA. Cada etapa de ligação foi seguida por uma etapa de lavagem com DMF (3 x 1 min), Etapa de remoção Fmoc com 25 % de piperidina em DMF (1 x 1 min e 2 x 15 min) e um a segunda etapa com DMF (7 x 1 min). Após a ligação do primeiro Ser(PO(OBzl)OH), 0,5 % de DBU em DMF foi usado pela etapa de desproteção Fmoc. A montagem da sequência de peptídeo finalizada com a adição dos dois últimos Fmoc-Lys(Mtt)-OH.
[0255] Então, os grupos Mtt dos resíduos de lisina terminal foram seletivamente clivados pelo tratamento de uma resina (1 eq, 195 mg, 0,01 mmol) com 10 mL de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante diversos ciclos de 10 min. A resina foi lavada com DCM (x3) e DMF (x3). Então o ácido palmítico (20 eq, 51 mg, 0,2 mmol) foi ligado a estes grupos amino desprotegidos usando TBTU (20 eq, 64 mg, 0,2 mmol) e DIEA (40 eq, 70 μL, 0,4 mmol) em DCM/DMF (1:1) (2 mL). A resina foi lavada com DCM (x5) e DMF (x5). Então o grupo Fmoc de terminal N foi removido com 20 % de piperidina em DMF (3 x 10 min) e a resina foi lavada com DMF (x3) e DCM (x5). Finalmente clivagem de resina simultânea e desproteções de cadeia secundária foram realizados usando uma mistura de TFAITIPS/H2O (95:2,5:2,5) (2 mL) durante 2 horas. A trituração de éter dietílico frio deu o produto bruto T3 como um sólido branco (34 mg, 100 % de rendimento) com uma pureza de 67 % (de análise HPLC). A espectrometria de massa MALDI- TOF confirmou uma identidade do produto maior (m/z esperou: 3365,15 [MH+], observado: 3369,66).
2.3: Síntese de antígeno de peptídeo T4
[0256] O aminoácido ortogonalmente protegido Fmoc- Lys(Mft)-OH (excesso de 5 vezes) foi automaticamente ligado a resina de amida Tentagel R RAM (0,19 mm/g, 750 mg, 0,1425 mmol) usando DCCl e HOBt como agentes de ativação em DMF. Após remoção do grupo Fmoc de terminal N, um segundo resíduo de Fmoc-Lys(Mtt)-OH (excesso de 5 vezes) foi ligado na presença de DCCI e HOBt. Os 16 aminoácidos seguintes conduzem os grupos de proteção de cadeia secundária padrão que foram automaticamente incorporados aplicando-se os protocolos de desproteção/ligação similares. Os fosfoaminoácidos foram introduzidos como ésteres monobenzílicos no grupo de fosfato. As ligações duplas de 60 minutos foram realizadas para todos os resíduos seguido pela etapa de revestimento com anidrido acético. A montagem da sequência de peptídeo finalizada com a adição dos dois últimos Fmoc-Lys(Mft)-OH.
[0257] Então, os grupos MU dos resíduos de lisina terminal foram seletivamente clivados pelo tratamento de uma resina (1 eq, 750 mg, 0,075 mmol) com 10 mL de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante diversos ciclos de 10 min. A resina foi lavada com DCM (x3) e DMF (x3). Então, o ácido palmítico (20 eq, 51 mg, 0,2 mmol) foi ligado a estes grupos amino desprotegidos usando TBTU (20 eq, 482 mg, 1,5 mmol) e DIEA (40 eq, 536 μL, 3,0 mmol) em DCM/DMF (1:1) (7 mL). A resina foi lavada com DCM (x5) e DMF (x5). Então o grupo Fmoc de terminal N foi removido com 20 % de piperidina em DMF (3 x 10 min) e a resina foi lavada com DMF (x3) e DCM (x5). Finalmente a clivagem de resina simultânea e desproteções de cadeia secundária foram realizados usando uma mistura de TFAITIPS/H2O (95:2,5:2,5) (6 mL) durante 3,5 horas. A trituração de éter dietílico frio deu o produto bruto T4 como um sólido branco (96 mg, 37 % de rendimento) com uma pureza de 50 % (de análise HPLC). A espectrometria de massa MALDI- TOF confirmou uma identidade do produto maior (m/z esperou 3455,10 [MH+], observado: 3456,13).
2.4: Síntese de antígeno de peptídeo T8
[0258] O aminoácido ortogonalmente protegido Fmoc- Lys(Mtt)-OH (5 eq, 781 mg, 1,25 mmol) foi manualmente ligado a resina Rink amida PEGA (1 eq, 0,33 mmol/g, 758 g) usando DIPCDl (5 eq, 196 mL, 1,25 mmol) e HOBt (5 eq, 169 mg, 1,25 mmol) em DMF (5 mL) por duas ligações de 8 horas. A resina foi então lavada com DMF (x 5). Após remoção do grupo Fmoc de terminal N com 20 % de piperidina em DMF (7 mL x 3 x 5 min), um segundo resíduo de Fmoc-Lys(Mtt)-OH (10 eq, 1,56 g, 2,5 mmol) foi ligado na presença de TBTU (10 eq, 803 mg, 2,5 mmol), HOBt (10 eq, 338 mg, 2,5 mmol) e DIEA (20 eq, 871 mL, 5,0 mmol). Os 16 aminoácidos seguintes conduzem os grupos de proteção de cadeia secundária padrão foram manualmente incorporados através da desproteção de ligação similar/ciclos de lavagem. Excepcionalmente, os fosfoaminoácidos foram introduzidos como ésteres monobenzílicos no grupo de fosfato (10 eq) com TBTU (10 eq), HOBt (5 eq) e DIEA (15 eq) em DMF. Um tempo de ligação de 1 hora foi usado através da síntese. A montagem da sequência de peptídeo finalizada com a adição dos dois últimos Fmoc-Lys(Mtt)-OH.
[0259] Então, os grupos Mt dos resíduos de lisina terminal foram seletivamente clivados pelo tratamento da resina de peptidila (1 eq, 385 mg, 0,019 mmol) com 10 mL de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante diversos ciclos de 10 minutos. A resina foi lavada com DCM (x3) e DMF (x3). Então o ácido palmítico (20 eq, 968 mg, 3,8 mmol) foi ligado a estes grupos aminos desprotegidos usando TBTU (20 eq, 1,21 g, 3,8 mmol) e DIEA (40 eq, 1,31 mL, 7,6 mmol) em DCM/DMF (1:1) (4 mL). A resina foi lavada com DCM (x5) e DMF (x5). Então o grupo Fmoc de terminal N foi removido com 20 % de piperidina em DMF (3 x 10 min) e a resina foi lavada com DMF (x3) e DCM (x5). Finalmente a clivagem de resina simultânea e a desproteção da cadeia secundária foram realizadas usando uma mistura de TFAITIPS/H2O (95:2,5:2,5) (4 mL) durante 3,5 horas. A trituração de éter dietílico frio deu o produto bruto T8 como um sólido branco (50,2 mg, 10 % de rendimento) com uma pureza de 55 % (de análise HPLC). A espectrometria de massa MALDI- TOF confirmou uma identidade do produto maior (m/z esperou: 3331,17 [MH+], observado: 3335,19).
2.5: Síntese de antígeno de peptídeo T9
[0260] O aminoácido ortogonalmente protegido Fmoc- Lys(Mtt)-OH (3 eq) foi manualmente carregado a uma resina de amida (Resina Rink amida MBHA, 1 eq, 0,4 mmol) na presença de PyBOP/HOBt/DIEA em DMF. A resina foi então lavada com DMF (3 x I min). Após remoção do Grupo Fmoc de terminal N com 25 % de piperidina em DMF (I x 1 min e 2 x 15 min), o segundo resíduo de Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 eq), foi ligado usando as mesmas condições de carregamento. Os 16 aminoácidos seguintes carregam os grupos Fmoc de proteção de cadeia secundária padrão e foram incorporados aplicando-se previamente protocolo de ligação descrito. Os fosfoaminoácidos foram introduzidos como ésteres monobenzílicos no grupo de fosfato. O tempo de ligação foi determinado pelo teste TNBT ou teste de quioranila após uma prolina. Se necessário, uma segunda ligação foi realizada com 2 eq de aminoácido Fmoc na presença de DIC/HOBt ou HATU/DIEA. Cada etapa de ligação foi seguida por uma etapa de lavagem com DMF (3 x 1 min), Etapa de remoção Fmoc com 25 % de piperidina em DMF (1 x 1 min e 2 x 15 min) e uma segunda etapa de lavagem com DMF (7 x 1 min). Após a ligação do Thr(PO(OBzl)OH), 0,5 % de DBU em DMF foi usado para a etapa de desproteção Fmoc. A montagem da sequência de peptídeo finalizada com a adição dos dois últimos Fmoc- Lys(Mtt)-OH.
[0261] Então, os grupos Mtt dos resíduos de lisina terminal foram seletivamente clivados pelo tratamento de uma resina (1 eq, 650 mg, 0,156 mmol) com 10 mL de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante diversos ciclos de 10 min. Após lavagem com DCM (x3) e DMF (x3), o ácido palmítico (20 eq, 1,01 g, 3,15 mmol) foi ligado aqueles grupos amino desprotegidos usando TBTU (20 eq, 814 mg, 3,15 mmol) e DIEA (40 eq, 1,1 mL, 6,30 mmol) em DCM/DMF (1:1) (6 mL). A resina foi lavada inteiramente com DCM (x5) e DMF (x5). Então o grupo Fmoc de terminal N foi removido com 20 % de piperidina em DMF (3 x 10 min) e a resina foi lavada novamente com DMF (x3) e DCM (x5). Finalmente clivagem de resina simultânea e desproteções de cadeia secundária foram realizadas usando uma mistura de TFA/TIPS/H2O (95:2,5:2,5) (9 mL) durante 3 horas. A trituração de éter dietílico frio deu o produto bruto T9 como um sólido branco (291 g, 59 % de rendimento) com uma pureza de 69 % (de análise HPLC). A espectrometria de massa MALDI- TOF confirmou uma identidade do produto maior esperado: 3172,98 [MH+], observado: 3172,90).
2.6: Síntese de antígeno de peptídeo T10
[0262] O peptídeo tetrapalmitoilado T10 foi preparado seguindo um protocolo similar como por T9 (escala de síntese de peptídeo: 0,25 mmol). Além disso, um pseudo prolina [psi(Gly-Ser)] foi usado como bloco de construção antes da sequência problemática Asn-Val-Ser-Ser. O produto bruto T10 foi obtido como um sólido branco (809 mg, rendimento quantitativo) com uma pureza de 56 % (de análise HPLC). A espectrometria de massa MALDI-TOF confirmou uma identidade do produto maior (m/z esperou: 2761,9 [MH+], observado: 2759,2).
2.7: Síntese de antígeno de peptídeo T11
[0263] O peptídeo tetrapalmitoilado T11 foi preparado seguindo um protocolo similar como por T9 (escala de síntese de peptídeo: 0,25 mmol). O produto bruto T11 foi obtido como um sólido branco (495 mg, 76 % de rendimento) com uma pureza de 80 % (de análise HPLC). A espectrometria de massa MALDI-TOF confirmou uma identidade do produto maior (m/z esperou: 2613,8 [MH+], observado: 2612,2).EXEMPLO 3: Preparação de vacina (Processo A)O fosfopeptídeo tetrapalmitoilado derivado de Tau foi pesado (ver tabela 2 abaixo para quantidade) e colocado em 250 ml de frasco de fundo redondo de vidro. Então Dimiristoil fosfatidilcolina (DWG), Dimiristol fosfatidilglicerol (DWG), Colesterol e adjuvante Monofosforil lipídeo A (MPLA) (todos da Avant Polar Lipids Inc. AL, USA) foram pesados e adicionados na razão molar de 9:1:7:0,2 respectivamente. Então o clorofórmio foi adicionado dando uma solução clara com partículas finas. Após agitação levemente durante 15 minutos, o solvente orgânico foi removido pela evaporação sob pressão reduzida a 40° C e então sob alto vácuo por 3 horas. A película fina resultante foi hidratada novamente pela adição de PBS estéril em um cobertura lamelar e levemente agitada em temperatura ambiente por 18 horas. A razão molar de fosfolipídeo/peptídeo final foi de 1:100. A suspensão lipossomal foi então fracionada em tubos falcon de 15 ml estéril (5 ml de produto/tubo) antes do armazenagem a 2-8° C. A concentração de peptídeo final foi de 40 μM.
[0264] EXEMPLO 4: Caracterização de vacinas lipossomais de Tau
4.1. Métodos 4.1.1 Peptídeo, DMPC e quantificação de colesterol por HPLC
[0265] Para análise de vacinas de tau lipossomais (ACl-33,ACl-35, ACl-36, ACl-39, ACl-40 e ACl-41 todas preparadas de acordo com o processo A descrito no EXEMPLO 3), amostras foram preparadas pela adição de água (20 μl) a amostra de vacina (20 μl) em um frasco HPLC de vidro, seguido por isopropanol (140 μl) e TFA (20 μl). A amostra diluída 5 vezes foi brevemente vertida antes da injeção (20 μl). A análise foi realizada usando uma Coluna Zorbax 300SB-B3 de fase reversa C3 (250 x 4,6 mm, 5 μm, 300Â, Agilent) termofixado a 75° C, com detecção a 207 e 214 nm. Solventes eluentes foram como seguem: solvente B, 95 % de Isopropanol, 5 % de água, 0,1 % de TFA; solvente A, 10 % de Acetonitrila, 90 % de água, 0,1 % de TEA. Um gradiente de 40 % B a 60 % B foi aplicado durante 20 minutos com uma taxa de fluxo de 1 ml/min. Padrões de peptídeos Tau (T1, T3, T4, T8 e T9) e DMPC/Colesterol foram usados separadamente nas concentrações diferentes para os propósitos de calibração. Para os peptídeos Tau, uma solução de estoque de 1 mg/ml em TFA/iPrOH/H2O (1:7:2) foi preparado e (1:1) periodicamente diluído de 400 μg/ml a 12,5 μg/ml. Para os lipídeos, uma solução de estoque de 8,0 mg/ml de DMPC e 3,5 mg/ml de Colesterol em 70 % de isopropanol e 30 % de água e diluído (1:5), (1:10) e (1:50) com a mesma mistura.
4.1.2 Quantificação MPLA por HPLC
[0266] O MPLA dentro da vacina lipossomal tau foi quantificada por HPLC com detecção UV seguindo a derivação do adjuvante com 3,5-Dinitrobenziloxiamina cromoforo ativo UV (DNBA). Brevemente, 20 μl de construções de tau lipossomais foram adicionadas a uma solução de DNBA em piridina (10 mg/ml, volume total 100 μl), aquecido a 60° C por 3 horas e então a piridina foi removida pela evaporação. O grânulo resultante foi solubilizado novamente em clorofórmio/metanol (2:1, v/v) pela análise HPLC. O MPLA (Avanti Polar Lipids) foi usado para os propósitos de calibração em quatro concentrações diferentes e foi derivatizado e analisado como pelas construções tau lipossômicas. A análise HPLC foi realizada usando uma coluna de fase reversa Agilent XDB-C18 (250 x 4,6 mm, 120 Â, 5 μm), termofixado a 50° C, com detecção a 254 nm. Os solventes eluentes foram como seguem: solvente A, 95 % de Acetonitrila, 5 % de água, 4,8 mM de ácido fosfórico; solvente B, 95 % de Isopropanol, 5 % de água, 4,8 mM de ácido fosfórico. Um gradiente de 10 % B a 70 % B foi aplicado durante 30 minutos com uma taxa de fluxo de 1 ml/min.
4.1.3 Potencial de superfície lipossomal
[0267] As amostras de construção lipossomal Tau foram diluídas 100 vezes com PBS. A análise foi realizada usando a Zetasizer Nano (Malvern, USA) a 25° C. A duração de medição e seleção de voltagem foram realizadas no modo automático, com uma voltagem aplicada típica de 50 mV. O dado foi transformado usando a equação Smoluchowski automática usando software DTS 5,0 (Malvern) para calcular o potencial zeta. Como as construções lipossomais tau são compostas de uma mistura de DMPC/DMPG/Colesterol/MPLA na razão molar de 9:1:7:0,2; a carga de rede esperada será negativa.
4.1.4 Análise conformacional pelo dicroísmo circular
[0268] As construções lipossomais tau foram diluídas (1:1) com PBS para dar a concentração de peptídeo final de 18 μM. Os lipossomos com composição idêntica mas perdem o peptídeo tau foram usados como a solução vazia para a subtração de linha de base. Os espectros CD foram adquiridos em um espectropolarimetro Jasco-815 com um cadinho de quartzo de comprimento de path 0,1 cm (Hellma, Germany) a 23° C. As medições foram feitas em uma faixa de comprimento de onda 195-250 nm com uma amplitude de faixa 1,0 nm e resolução de 0,5 nm. Uma velocidade de varredura de 50 nm/min com tempo de resposta de 1 segundo foi utilizado. Os espectros vazios (de 8 varreduras) fora medidos e subtraídos da média de 8 varreduras de cada espectro de amostra. Os espectros obtidos ([θ]obs, graus) foi uniformizado após ser convertido significar a eplipticidade molar do resíduo ([θ], graus cm2 dmol-1) com a equação [θ] [θ]obs x (MRW/10lc), onde MRW é o peso molecular do resíduo médio (MW/número de resíduos), 1 é o comprimento de caminho óptico (cm) e c é a concentração (g/cm3).
4.1.5 Ensaio de fluorescência ThT
[0269] As medições de fluorescência foram adquiridas em um leitor de microplaca Infinite M200 (Tecan Group Ltd, Switzerland). Como um procedimento geral, as construções lipossomais tau foram diluídas as concentrações diferentes com PBS (Tabela 2). Os lipossomos da mesma composição mas perdem o peptídeo tau foram diluídos similarmente a ser usados como o controle negativo (batelada ACE-35-081015-B). Ao 98 μl de cada vacina ou solução vazia, ThT (2 μl, 1,2 mM em água) foi adicionado para dar a concentração final de 24 μM. Após breve turbilhonamento, uma alíquota de cada amostra (70 μl) foi adicionada em uma placa microtituladora Perkin Elmer de 384 reservatórios opaca preta e emissão de fluorescência foi medida a 485 nm após 30 minutos na excitação a 440 nm. A amplitude de faixa de excitação foi de 9 nm e a amplitude de faixa de emissão 20 nm. y- Ciclodextrina foi usado como um controle interno. As diluições duas vezes em séries em PBS foram feitos de uma solução de estoque 640 mM em PBS para obter 320, 160 e 80 mM de soluções de controle de Y-ciclodextrina.Tabela 2: Amostras preparadas pelo ensaio ThT
Figure img0002
4.2. Resultados4.2.1 Peptídeo, DMPC e quantificação de colesterol por HPLC
[0270] O cromatograma HPLC no comprimento de onda de detecção de 207 nm obtido a partir da injeção das amostras de vacina que mostra a presença do peptídeo tau, DMPC e colesterol (ver tabela 4). A partir das curvas de calibração determinada com os padrões, a quantidade de cada componente na vacina foi calculado. O peptídeo tau detectado, DMPC e conteúdo nas suspensões lipossomais tau está próximo aos valores alvos.
4.2.2 Quantificação MPLA por HPLC
[0271] O cromatograma HPLC no comprimento de detecção de 254 nm obtido a partir da injeção da amostra de vacina tau derivado por DNBA mostrou a presença de MPLA rotulado (ver tabela 4). Usando a curva de calibração obtida com o padrão, a quantidade de MPLA nas vacinas lipossomais de Tau foi calculada. O conteúdo MPLA detectado nas suspensões lipossomais tau está próximo aos valores alvos.
4.2.3 Potencial de superfície lipossomal
[0272] O potencial zeta medido de vacinas lipossomais de Tau é mostrado na tabela 4.
4.2.4 Análise conformacional de peptídeo tau dentro das vacinas lipossomais por CD
[0273] O conformação de vacinas lipossomais de Tau preparada de acordo com a descrição antes foi determinado pelo dicroísmo circular. Os resultados são mostrados na tabela 3.
4.2.5. Ensaio ThT do peptídeo tau dentro das vacinas lipossomais
[0274] Os estados agregados de peptídeos tau das vacinas lipossomais (preparado pelo processo A descrito acima) determinado pelo ensaio fluorimétrico ThT são mostrados na tabela 4. Tabela 3. Resumo de características de vacinas
Figure img0003
[0275] EXEMPLO 5: Imunogenicidade de antígenos palmitoilados tau em tipo selvagem e camundongos Tau-/- KO
5.1 Métodos5.1.1 Camundongos nocaute Tau (TKO)
[0276] O nocaute do gene tau foi atingido usando um vetor de alvejamento que insere EGFP (Proteína fluorescente verde intensificada) cDNA em éxon 1 do gene em estrutura com o códon de iniciação endógeno. Este produziu uma proteína de fusão com o primeiro 31 como de tau seguido por EGFP (descrito por Tucker KL. et al., Nature Neuroscience, 2001). A anulação do gene foi confirmado pelo western blot dos lisados cerebrais totais. Os níveis de proteína tau usando diversos anticorpos anti-tau mostrou que todas as isoformas tau estão ausentes no mutante homozigoto, com uma redução de 50 % no mutante heterozigoto. A mutação foi mantida no fundamento C57BL/6.
5.1.2 Preparação de vacina
[0277] As vacinas foram preparadas pelo processo A descrito no EXEMPLO 3.
5.1.3 Imunizações
[0278] Os camundongos C57BL/6 ou Tau-/- KO (TKO) receberam injeções i.p. da vacina (ACl-33, ACl-35, ACl-36 e ACl-41 ) nas três ocasiões (Esquema I) (Tabela 4),
[0279] Para a imunização ACl-33, ACl-35, ACl-36 e ACl- 41, as três imunizações foram feitas com 2 semanas de intervalo de cada administração (dia (d)0, d13, d28) de acordo com Esquema 1. 1 dia (d-1) antes da primeira imunização então após a segunda (d27) e terceira (d47) amostra sanguínea de imunização foi coletada e o soro preparado. O soro foi preparado para permitir o coágulo das amostras sanguíneas durante a noite então obtendo a sobrenadante após a centrifugação. O IgG específico por fosfopeptídeo e tituladores de anticorpo IgM e modelos de isotipo IgG foram determinados por ELISA. Como controle, titulador de anticorpo IgG específico por peptídeo não-pTau também foram determinados por ELISA. Tabela 4: Imunização de camundongos
Figure img0004
a: volume teóricob: i.p.: intra-peritonealc: quantidade medida determinada após análise
[0280] Esquema 1: Lista de imunizações e sangria por ACl-33, ACl-35, ACl-36 e ACl-41
Figure img0005
5.1.4 Quantificação de anticorpos específicos por peptídeo Tau
[0281] Anticorpos IgG específicos por peptídeos pTau foram determinados por ELISA nas 3 amostras de sangria de soro. IgG específico por peptídeos Tau foram determinados no soro de d-l e d47. Os IgM específico por peptídeo pTau e anticorpos de isotipo IgG foram determinados por ELISA na amostra de sangria de soro d47. As placas com revestidas com 10 ug/ml de peptídeo Tau correspondente durante a noite a 4° C. Após lavagem cada reservatório com PBS-0,05 % de Tween 20 e bloqueando com 1 % de BSA em PBS-0,05 % de Tween 20, diluições periódicas de soro foram adicionadas as placas e incubadas a 37° C por 2 horas. Após lavagem, as placas foram incubadas com um anticorpo total IgG anti-camundongo conjugado por fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) ou anticorpos específicos por isotipo (horseradish Peroxidase (HRP)-conjugated anti-camundongo IgM, AP- conjugated anti-camundongo IgG1, biotin-conjugated anti-camundongo IgG2a and IgG3, adquirido de Pharmingen BD, San Diego, CA, USA and HRP-conjugated anti-camundongo IgG2b from Zymed Laboratories, San Francisco, CA) por 2 horas a 37° C. Após lavagem, as placas foram incubadas com pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), o substrato de fosfatase por AP, ou ABTS (2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenztiazolina-6)), o substrato por HRP e lido a 405 nm usando um leitor de placa ELISA. Uma etapa complementar foi realizada pelos anticorpos conjugados por biotina onde as placas foram incubadas por 45 minutos em estreptavidina-HRP (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) antes da detecção usando ABTS. Os resultados são expressados como O.D. (Densidade óptica) na primeira diluição e uma diluição não saturada por IgG e em uma O.D. para os isotipos IgG e IgM.
5.1.5 Ligação de anticorpos anti-Tau aos emaranhados Tau nas fatias cerebrais do animal transgênico (TAUPIR)
[0282] Ligação de anticorpos presentes no soro de animais vacinados aos emaranhados nas fatias cerebrais foi feita pela imunoistoquímica TAUPIR.
[0283] As fatias cerebrais usadas foram de Tau P301L (TPLH: isoforma mais longa (441aa) de Tau humano com a mutação P301L) animal transgênico no estágio terminal e de idade (>15 meses) camundongos biGT transgênicos duplos (camundongos transgênicos GSK-3 cruzado com camundongos TPLH).
[0284] As seções cerebrais foram lavadas por 5 minutos em PBS então incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente em 1,5 % de H2O2 em PBS:MeOH (1:1) para bloquear peroxidase endógena. Após lavagem as seções 3 vezes em PBST (PBS/0,1 % TritonX100) estas foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente em PBST+10 % de solução de bloqueamento FCS (soro bovino fetal). A incubação com o soro contendo os anticorpos anti-Tau foi feito durante a noite a 4° C. O soro foi diluído em PBST/10 % de FCS usando diversas diluições diferentes de 1/2'500 a 1/10'000. As seções foram lavadas 3 vezes em PBST antes da incubação com um anticorpo secundário anti-camundongo de cabra conjugado por HRP (adquirido de Dako, Glostrup, Denmark)) em PBST/10 % de FCS por 1 hora em temperatura ambiente. Antes da detecção das seções foram lavadas 3 vezes com PBST e incubadas em 50 mM de Tris/HCl pH7,6 por 5 minutos. A detecção foi feita usando a incubação das seções por 3 minutos em Diaminobenzidina (DAB: 1 tablete em 10 ml de 50 mM de Tris, HCl + 3 ul de H2O2 30 %) (MP Biomedicals, Solon, OH, USA). a reação foi interrompida pela lavagem das seções 3 vezes em PBST. As seções então foram transferidas em placas de vidro silanizadas e secas em ar em placa de aquecimento a 50° C por 2 horas. O contra tingimento foi feito usando incubação com hematoxilina Mayers (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) por 1 minuto pela etapa de lavagem por 4 minutos usando-se água de torneira. As seções foram desidratadas pela passagem em 50 %, 70 %, 90 % e duas vezes em 100 % de banho de etanol então em Xilol por 2 vezes 1 min. Finalmente as seções foram montadas com DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, England) sob tampas de vidro deslizantes.
5.1.6 Western Blot (WB)
[0285] A ligação de anticorpos presentes no soro de animais vacinados ao pTau no extrato cerebral a partir do animal transgênico foi feita pela WB.
[0286] A homogeneização cerebral de FVB tipo selvagem, TPLH, biGT e camundongo nocaute Tau (TKO) foi feito no seguinte tampão: 25 mM de pH 7,6, 150 mM de NaCl, mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 30 mM de NaF, 0,2 mM de Na3VO4, 1 nM de ácido Ocadáico, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), 5 mM de Na4P207, 1 tablete de coquetel inibidor de protease completo (CPIC) por 12 ml total. Para obter o homogeneizado cerebral total o cérebro foi homogeneizado em gelo em 1 vol / hemisfério de peso (m/g) com um potter semelhante conduzido por motor (tubo de vidro / pilão de teflon) usado a 700 rpm.
[0287] Homogenado cerebral total foi diluído metade do tampão de amostra (125 mM de Tris/HCl pH 6,8, 4 % de sulfato de dodecil de sódio (p/v) (SDS), 20 % de glicerol, 0,01 % de bromofenol azul) + 5 % de beta-mercapto-etanol então rapidamente aquecido a 95° C. As amostras mantidas 5 minutos, ^ diluído no tampão de amostra, aquecido novamente a 95° C então esfriado e rotacionado 14000 rpm por 5 minutos em escombros claros que não solubilizados. Os sobrenadantes foram coletados e carregados em um gel SDS-PAGE. A transferência à membrana de nitrocelulose (Hybond-EGL) foi feita em tampão de transferência (25 mM de Tris pH 8,6, 190 mM de glicina, 20 % de metanol). A membrana foi transferida à solução de bloqueamento (0,1 % de Tween em TBS (50 mM de Tris.HCl, 017,6, 150 mM de NaCl) + 5 % de leite em pó) antes da incubação durante a noite a 4° C com o soro de camundongo diluído na solução de bloqueamento. A incubação com o anti-camundongo de cabra conjugado HRP de anticorpo secundário (Dako, Glostrup, Denmark) diluído 1/10'000 na solução de bloqueamento foi realizada em temperatura ambiente por 1 hora. A detecção foi feita usando os reagentes de detecção ECI Western Blotting a partir de GE Healthcare.52. Resultados
5.2.1 Especificidade de anticorpo do soro de camundongos vacinados
[0288] O soro dos camundongos vacinados foram testados para a especificadade de seus anticorpos no ensaio ELISA contra tanto o peptídeo pTau quanto Tau, emaranhados tau em TAPIR e pTau em western blot.
[0289] A vacina ACl-33 induz uma resposta IgG anti-Tau5- 20 [pY18] seguindo injeção i.p.. Após 2 imunizações (d27), a resposta IgG permaneceu estável com nenhum aumento com a terceira imunização (d47) (Figura 1a: camundongos WT, 1 caminho Anova P< 0,05 d-1 vs d27, P<0,001 d-1 vs d47 e Figura 1b: camundongos TKO, 1 caminho Anova P< 0,001 d-1 vs d27147).
[0290] Vacina ACl-35 induz uma resposta IgG anti- Tau393-408 [pS396/pS404] robusta seguindo injeção i.p.. Após 2 imunizações (d28), a resposta IgG permaneceu estável (d42, 98 e 126) com nenhum aumento com a 3 ° imunização (d42) e nenhuma diminuição nas sangrias antes, em entre e após a intensificação (Figura 2a: WT Anova P<0,0001 d-1 vs d28/42/98/126 e Figura 2b: camundongos TKO:1 caminho Anova P<0,0001 d-1 vs d28/42/98/126).).
[0291] Vacina ACl-36 induz uma resposta IgG Tau401-418 [pS404/S409] seguindo injeção i.p.. Após 2 imunizações (d27), a resposta IgG permaneceu estável com nenhum aumento com a terceira imunização (d47) (Figura 3a: camundongos WT: 1 caminho Anova P< 0,001 d-1 vs d27, P<0,0001 d-1 vs d47 e (Figura 3b: camundongos TKO: 1 caminho Anova P<0,0001 6-1 vs d27147).
[0292] Vacina ACl-41 induz uma resposta IgG robusta seguindo injeção i.p. tanto nos peptídeos Tau206-221 [pT212/pS214] quanto Tau196-211 [pS202/pT205]. Após 2 imunizações (d34), a resposta IgG permaneceu estável (d48) com nenhum aumento após terceira imunização (d48) (Figura 4a: camundongos WT, anti-Tau206-221 [pT212/pS214]-IgG, 1 caminho Anova P<0,0001 d-1 vs 04/48) (Figura 4b: camundongos WT, anti-Tau196-211 [pS202/pT205]-IgG, 1 caminho Anova P<0,0001 d-1 vs d34/48). (Figura 4c: camundongos TKO, anti-Tau206-22I [pT212/pS214]-IgG, 1 caminho Anova P<0,0001 d-1 vs d34/48) (Figura 4d:, camundongos TKO, anti-Tau196-211 [pS202/pT205]]-IgG, 1 caminho Anova P<0,0001 d-1 vs d34/48).
[0293] O soro de camundongos vacinados ainda foram testados pela especificidade dos anticorpos anti-tau na imunoistoquímica TAUPIR e western blot. Os dados de todas as construções lipossomais e para cada modelo de camundongo são resumidos na tabela 5 abaixo.Tabela 5: Sinopse da especificidade de anticorpo a partir do soro de camundongos vacinados
Figure img0006
Figure img0007
5.2.2 Análise da resposta de isotipo de C57BL/6 de tipo selvagem e camundongos imunizados Tau-I- KO (TKO)ACl-33
[0294] A vacina ACl-33 induz os tituladores de anticorpos em camundongos WT para todos os isotipos IgG28, 2b e 3 bem como IgM seguindo 3 i.p. imunizações (Figura 5a; camundongos WT). Quase não existe IgG1 e existe uma diferença significante entre IgG1 e IgG2b e 3 (Figura 5a; camundongos WT; 1 caminho Anova P<0,05 IgG1 vs IgG3, P<0,001 IgG1 vs IgG2b). Vacina ACl-33 induz os tituladores do anticorpos em camundongos TKO para todos os isotipos 1gG2a, 2b e 3 bem como IgM seguindo 3 imunizações i.p. (Figura 5b; camundongos TKO). Quase não existe IgG1 com a diferença significante entre esta subclasse e outros isotipos IgG (Figura 5b, 1 caminho Anova P<0,05 IgG1 vs IgG2a/IgG3, P<0,001 IgG1 vs IgG2b).ACl-35
[0295] A vacina ACl-35 induz os tituladores de anticorpos altos em camundongos para todos os isotipos IgG bem como as 3 seguintes imunizações i.p.. (Figura 6a; camundongos WT). Apenas a diferença significante é uma resposta IgM maior comparada ao IgG3, (Figura 6a; camundongos WT, 1 caminho Anova P<0,05 IgM vs IgG3).
[0296] A vacina ACl-35 induz os tituladores de anticorpos altos em camundongos TKO para todos os Isotipos IgG bem como IgM seguindo 3 imunizações i. p. (Figura 613; camundongos TKO).ACl-36
[0297] A vacina ACl-36 induz os tituladores de anticorpo em camundongos WT para todos os Isotipos IgG bem como IgM seguindo 3 imunizações i.p. (Figura 7a; camundongos WT).
[0298] A vacina ACl-36 induz os tituladores de anticorpos em camundongos TKO para todos os isotipos IgGs bem como IgM seguindo 3 imunizações i.p. (Figura 713; camundongos TKO). Existe um nível maior estatisticamente significante de IgG2b comparado ao (Figura 7b; camundongos TKO, 1 caminho Anova P<0,05 IgG2b IgG1),ACl-41
[0299] A vacina ACl-41 induz os tituladores de anticorpos anti-Tau196-211 altos em camundongos WT [pS202/pT205] para todos os Isotipos IgG bem como IgM seguindo 3 imunizações i.p. (Figura 8a; camundongos WT).
[0300] A vacina ACl-41 induz os tituladores de anticorpos altos em camundongos TKO anti-Tau196-211 [pS202/pT205] para todos os Isotipos IgG bem como IgM seguindo 3 imunizações i.p. (Figura 81); camundongos TKO).5.3. Conclusão
[0301] A vacina Tau induzida pelos tituladores IgG em todos os camundongos. Existe uma resposta de anticorpo IgG1 inferior comparado ao IgG2b e IgG3 nos camundongos imunizados ACl-33. Em todos os outros camundongos vacinados tau, os tituladores de anticorpos induzem para todos os isotipos IgG2a, 2b e 3 bem como IgM foram comparáveis.
[0302] Os anticorpos gerados a partir da vacina tau dos camundongos imunizados especificamente ligam-se pTau com ligação marginal aos peptídeos Tau. Os anticorpos gerados foram também capazes de reconhecer os emaranhados no cérebro de camundongo transgênico Tau e pTau de extrato cerebral de camundongo transgênico Tau por WB
[0303] EXEMPLO 6: Geração e avaliação de hibridomas e anticorpos
[0304] O objetivo deste estudo foi gerar e avaliar anti-Thu mAbs (anticorpos monoclonais). Os hibridomas foram gerados pela fusão da vacina tau imunizada pelo baço de camundongo com uma linha celular de mieloma. Os hibridomas foram avaliados pela reatividade contra tanto a proteína tau de comprimento total fosforilada quanto não fosforilada, bem como os peptídeos antigênicos tau fosforilado e não fosforilado usados na preparação de vacina. A avaliação de hibridoma também foi realizada pela reatividade de sobrenadante de hibridomas para os emaranhados tau usando imunoquímica em fatias cerebrais de camundongo transgênico.
6.1. Métodos6.1.1 Fusão
[0305] O camundongo C57BL/6 de tipo selvagem vacinado com ACl-33 (Taus-20 [pY18]) e ACl-35 foi usado pela produção de hibridoma. O camundongo foi reforçado com Vacina ACl-33 no dia 0 então novamente no dia 4 e a fusão foi realizada no dia 7. 173 x 106 (ACl-33), esplenócitos a partir do camundongo imunizado foram fundidos com células de mieloma SP2 O-Ag14 em uma razão de 5 esplenócitos/ 1 célula de mieloma.
[0306] Um camundongo C57BL/6 de tipo selvagem vacinado com ACl-36 (Tau401-418 [pS404/S409]) foi usado pela produção de hibridoma. O camundongo foi reforçado com vacina ACl-36 no dia 0 então novamente no dia 4 e a fusão foi realizada no dia 7. 84 x 106 esplenócitos a partir do camundongo imunizado foram fundidos com células de mieloma SP2-0-Ag14 em uma razão de 5 esplenócitos/ 1 célula de mieloma.
[0307] Um camundongo C57BL/6 de tipo selvagem vacinado com ACl-41 (mistura de Tau206-221 [pT212/pS214] e Tau196-211 [pS202/pT205]) foi usado pela produção de hibridoma. O camundongo foi reforçado com vacina ACl-41 no dia 0 então novamente no dia 4 e a fusão foi realizada no dia 8. 162 x 106 esplenócitos a partir do camundongo imunizado foram fundidos com células de mielomas SP2-0-Ag14 em uma razão de 5 esplenócitos / 1 célula de mieloma.
[0308] As três fusões resultam em placas de 8 x 96 reservatórios e os clones foram nomeados de acordo com a placa (1-8) então a linha (A-G) e finalmente a coluna (1-12).
6.1.2 Método de avaliação para selecionar os clones
[0309] As placas de 8 x 96 reservatórios foram primeiro avaliados duas vezes pela expressão IgG. Os clones que expressam positivo foram então transferidos nas placas de 24 reservatórios e sobrenadantes celulares (=clones) de células de desenvolvimento foram testados em uma avaliação Tau ELISA e uma avaliação de imunoistoquímica TAUPIR. Os sobrenadantes positivos em ELISA e/ou TAUPIR foram transferidos ao frascos T25 e clones foram avaliados novamente pela expressão IgG, avaliação Tau ELISA e TAUPIR.
6.1.3 Avaliação IgG
[0310] As placas de Elisa com revestidas com 50 ul/reservatório de anticorpo IgG anti-camundongo (CER Groupe, Marloie, Belgium) em tampão de revestimento por 16 horas a 4° C. Após lavagem as placas com PBS/Tween 100 ul/reservatório de uma solução de bloqueamento foi aplicado por 1 hora em temperatura ambiente. 50 ul de sobrenadante de hibridoma não diluído foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. Após a etapa de lavagem, a mistura de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 anti- camundongo conjugado por peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Ab Serotec, Raleigh, NC, USA) foi aplicado nas placas por 1 hora em temperatura ambiente. Após a lavagem final, a detecção foi realizada com TMB (3-3’,5,5’-tetrametilbenzidina), o substrato de fosfatase por HRP e placas foram lidas a 405 nm usando um leitor de placa ELISA. Os resultados são expressados como O.D. (Densidade óptica).
6.1.4 Avaliação de hibridomas Tau ELISA
[0311] A avaliação de hibridomas ELISA foi realizada no peptídeo pTau (ACl-33, T1,5: Tau5-20 [pY18]; ACl-36, T4.5: Tau401-418 [pS404/S409]; ACl-41, T8,5: Tau206-221 [pT212/pS214] e T9,5: Tau196-211 [pS202/pT205] PolyPeptide Laboratories, Hillerod, Denmark), correspondente ao peptídeo Tau (ACl-33, T1,6: Tau5-20; ACl-36, T4.6: Tau401-4; ACl-41, T8,6: Tau206-221 and T9,6: Tau196-211, PolyPeptide Laboratories, Hillerod, Denmark), proteína Tau de comprimento total fosforilada (441aa) (Proteína ptau, Vandebroek et al., 2005) e proteína Tau de comprimento total (441aa) (Tau protein, SignalChem, Richmond, Canada). Finalmente albumina de soro bovino (BSA) foi usado como controle negativo.
[0312] As placas com revestidas com 10 ug/ml de peptídeo Tau correspondente e 1 ug/ml de proteína tau correspondente durante a noite a 4° C. Após lavagem cada reservatório com PBS-0,05 % de Tween 20 e bloqueando com 1 % de BSA em PBS-0,05 % de Tween 20, sobrenadante de hibridoma não diluído ou controle negativo médio foram adicionadas as placas e incubadas a 37° C por 2 horas. Após lavagem as placas foram incubadas com um anticorpo total IgG anti-camundongo conjugado por fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) por 2 horas a 37° C. Após lavagem placas foram incubadas com pNPP (para-nitro- fenil-fosfato), o substrato de fosfatase por AP e lido a 405 nm usando um leitor de placa ELISA. Os resultados são expressados como O.D. (Densidade óptica).
6.1.5 Avaliação de hibridoma IHC: Ligação de anticorpos anti- Tau aos emaranhados nas seções cerebrais a partir dos camundongos transgênicos (TAUPIR)
[0313] Os experimentos TAUPIR foram feitos de acordo com protocolo do EXEMPLO 5.1.5.
6.1.6 Avaliação IgG dos frascos T25
[0314] As placas Elisa com revestidas com 5 ug/ml de anticorpo específico de fragmento anti-camundongo IgG F(ab')2 (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) no tampão de revestimento de carbonato- bicarbonato pH 9.6 (Sigma, Budhs, Switzerland) durante a noite a 4° C. Após lavagem as placas, sobrenadante de hibridoma não diluído, anticorpo IgG1 de controle positivo (6E10 a 1 ug/ml: Covance, Emeryville, CA, USA) ou controle negativo (meio de cultura sozinho) foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. Após a etapa de lavagem, anticorpo específico por fragmento FCY IgG anti-camundongo de cabra conjugado por AP secundário (subclasses 1+2a+2b+3) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) foi incubada nas placas por 2 horas a 37° C. Após uma lavagem final, a detecção foi realizada com pNPP (para-nitro-fenilfosfato), o substrato de fosfatase por AP e placas foram lidas a 405 nm usando um leitor de placa ELISA. Os resultados são expressados como O.D. (Densidade óptica).
6.2. ResultadosHibridomas ACl-33
[0315] Os sobrenadantes celulares a partir das placas de 8 x 96 reservatórios resultando da fusão e foram avaliados pela produção de IgG. Nos 768 reservatórios (8 x 96 reservatórios) testados 277 foram positivos pela expressão IgG e foram transferidos em placas de 24 reservatórios. Nas placas de 24 reservatórios os 79 clones foram desenvolvidos e sobrenadante das células foram analisadas. Os clones positivos ainda foram transferidos em frascos T25 e sobrenadantes avaliados pela produção G, ELISA e TAUPIR (Tabela 6).
Figure img0008
O clone 6010 foi apenas um positivo nas avaliações 3 e foi selecionado pela subclonagem.
Hibridomas ACl-36
[0316] Os sobrenadantes celulares de placas 8 x 96 reservatórios resultando da fusão foram avaliados pela produção de IgG. Nos 768 reservatórios (8 x 96 reservatórios) testados 333 reservatórios foram positivos pela expressão G e foram transferidos as placas de 24 reservatórios. Nas placas de 24 reservatórios 75 clones foram desenvolvidos e sobrenadante das células foram analisados. Clones positivos ainda foram transferidos em frascos T25 e sobrenadantes avaliados pela produção IgG, ELISA e TAUPIR (Tabela 7).
Figure img0009
[0317] A fim de selecionar os clones para a próxima etapa de uma classificação de todos os sobrenadantes positivos pelas avaliações IgG/ELISA/TAUPIR foi realizada com base nos resultados de ELISA e TAUPIR. A classificação dos resultados de ELISA e TAUPIR foi realizado como explicados na seção dos métodos. O tingimento TAUPIR foi quase idêntico pelos cinco primeiros clones e este corresponde aos resultados ELISA. 4C12 foi descartado como este foi observado na mesma placa como 4C1 que aumentou a semelhança dos 2 clones sendo o mesmo (reconhecimento do mesmo epítopo). Os 4 melhores clones selecionados foram 3A8, 2B6, 4C1 e 6H1. Os outros 6 clones (4C12, 2G1, 2F9, 706, 389, 4E12) foram mantidos como back-up.
[0318] Uma classificação de 10 clones que mostraram a positividade na avaliação de ELISA e avaliação TAUPIR foi realizada para selecionar os melhores (Tabela 8). Realçados em cinza estão os 5 melhores clones.
Figure img0010
[0319] Os sobrenadantes celulares das placas de 8 x 96 reservatórios resultando da fusão foram avaliados pela produção de IgG. Nos 768 reservatórios (8 x 96 reservatórios) testados, 215 reservatórios foram positivos pela expressão IgG e foram transferidos as placas de 24 reservatórios. Nas placas de 24 reservatórios 81 clones foram desenvolvidos e sobrenadante das células foram analisados. Clones positivos ainda foram transferidos em frascos T25 e sobrenadantes avaliados pela produção IgG, ELISA e TAUPIR (tabela 9).
Figure img0011
[0320] Os clones 5D10 e 702 foram apenas um positivo nas 3 avaliações e foram selecionados pela subclonagem. O clone 5D10 liga-se apenas o peptídeo T8,5, enquanto o clone 7C2 liga-se a dois peptídeos da vacina ACl-41 (T8,5 e T9,5) (Figura 10).
[0321] O subclone 5D10A4 origina-se de 5D10 foi específico para o peptídeo pTau.
8.3. Conclusão
[0322] Os anticorpos gerados tem mostrado especificidade alta aos peptídeos pTau com apenas ligação marginal aos peptídeos não fosforilados.
[0323] A partir das 3 fusões (ACl-33, ACl-36 e ACl-41), um total de 7 clones foram depositados a DSMZ (tabela 10) e selecionado pela clonagem adicional. Tabela 10: Lista de hibridoma depositado.
Figure img0012
[0324] EXEMPLO 7: Tingimento específico de fatia decérebro com AD humano por dois anticorpos (ACl-41-Ab1 e 5D10 ), derivado de camundongos vacinados ACl-41
[0325] O objetivo deste estudo foi para tingir emaranhados neurofibrilares (NFTs) no cérebro humano com mal de Alzheimer (AD) usando o anticorpo ACl-41-Ab1 (9H3 subclone T89-F4) e 5D10 gerado de duas fusões diferentes de camundongos imunizados com a vacina ACT-41. Para testar este, um ensaio de tingimento de imunorreatividade de tau fosfo- Proteína (TAUPIR) usando seções cerebrais humanas com AD, foi utilizado.
7.1. Métodos7.1.1 Geração de anticorpo 5D10
[0326] 5D10 foi gerado como descrito no EXEMPLO 9.
7.1.2 Geração ACl-4l-Ab17.1.2.1 Fusão
[0327] Um camundongo C57BL/6 de tipo selvagem vacinado com ACl-41 (vacina ACl-41 contém uma mistura de dois peptídeos fosfo-Tau, Tau206-221 [pT212/pS214] e Tau196-211 [pS202/pT205]) foi usado pela produção de hibridoma. O camundongo foi reforçado com peptídeo ACl-41 cinco dias antes da fusão, 58 x 106 esplenócitos de camundongo imunizado foram fundidos com SP2/0-O-Ag 14 células de mielomas em uma razão de 5 esplenócitos / 1 célula de mieloma. A fusão resultou em placas de 10 x 96 reservatórios que foram então avaliadas para determinar os clones de interesse.
7.1.2.2 Avaliação de hibridoma ELISA
[0328] A avaliação de hibridomas ELISA foi realizada em T8: Tau206-221 [pT212/pS2141, T9: Tau196-211 [pS202/pT205] ou placas revestidas por (hP)-Tau hiperfosforilado (explicado sob a seção Western Blot).
[0329] As placas com revestidas com 2 ug/ml de hP-Tau durante a noite a temperatura ambiente (RT). Após lavagem cada reservatório com PBS e bloqueando com 2 % de FOS em PBS, sobrenadante de hibridoma foi adicionado as placas e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. Após a etapa de lavagem, as placas foram incubadas com peroxidase conjugado por Ig total anti-camundongo de cabra AffiniPure (detecção de IgG + IgM, Dako Glostrup, Denmark) em PBS 1 % de FCS por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram desenvolvidas com TMB (3,3',5,5'- tetrametilbenzidina). A reação foi interrompida com 2N H2SO4 e lido a 450 nm usando um leitor de placa ELISA. Os resultados foram expressados na densidade óptica (O.D.) para cada clones de hibridoma.
[0330] Para os peptídeos, as placas com revestidas com 10 ug/ml de Tau206-221 [pT212/pS214] ou Tau196-211 [pS202/pT205] durante a noite a 4° C. Após lavagem com PBS e bloqueando com 2 % de NHS em PBS, sobrenadante de hibridoma foi adicionado as placas e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente (RT). Após a etapa de lavagem, as placas foram incubadas com IgG anti-camundongo biotinilado (adquirido de Vector labs) em PBS 1 % de NHS por 1 hora em temperatura ambiente. Uma etapa complementar foi realizada pelos anticorpos conjugados por biotina e as placas foram incubadas por 30 minutos em estreptavidina-HRP (ABC kit, Vector labs) antes da detecção. Após a etapa de lavagem, as placas foram desenvolvidas com TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). A reação foi interrompida com 2N de H2SO4 e lido a 450 nm usando um leitor de placa ELISA. Os resultados foram expressados na densidade óptica (O.D.) para cada clones de hibridoma.
7.1.2.3 Avaliação de hibridomas IHG: Ligação de anticorpos anti-Tau aos emaranhados nas seções cerebrais de camundongos transgênicos (TAUPIR)
[0331] A ligação de anticorpos aos emaranhados produzidos pelas células de hibridoma foi feita pela imunoistoquímica (NC) nas seções cerebrais de camundongos transgênicos Tau.
[0332] As seções cerebrais de camundongos biGT transgênicos duplos idosos (>20 meses) (CASK-3 camundongos transgênicos cruzados com TPLH (isoforma mais longo Tau humano (441aa) com a mutação P301L que expressa o camundongo) e de camundongo de nocaute Tau (TKO) como controle negativo.
[0333] O tingimento TAUPIR foi feito de acordo com protocolo do EXEMPLO 5.1.5.
7.1.2.4 Avaliação de hibridoma Western Blot OMB)
[0334] As ligações de anticorpos produzidos pelas células de hibridoma ao pTau no extrato cerebral de animal transgênico e/ou extrato hP-Tau foi feita por WB.
[0335] A homogeneização cerebral de FVB de tipo selvagem, TPLH, biGT e camundongo de nocaute Tau (TKO) foi feito no seguinte tampão: 25 mM de Tris/HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 30 mM de NaF, 0,2 mM de Na3VO4, 1 nM de ácido ocadáico, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), 5 mM de Na4P207, I tablete de coquetel inibidor de protease completa (CPlC) por 12 ml total. Para obter homogeneizado cerebral total o cérebro foi homogeneizado em gelo 10 vol / hemisfério de peso (m/g) com um potter semelhante conduzido por motor (tubo de vidro / pilão de teflon) usado a 700 rpm.
[0336] Para a extração hP-Tau, o cérebro de camundongo TPLH e TKO foi homogeneizado com o seguinte tampão: 100 mM de MES pH 6,8, 1mM de β-mercapto-etanol, 5 mM de EDTA, 2,5 mM de PMSF, 5 μg/ml de tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK), 100 mM de NaF, 1 nM de ácido ocadáico, 0,2 mM de Na3VO4 e 1 tablete de coquetel inibidor de protease completa (CPlC) por 12 ml total. O cérebro foi homogeneizado em gelo em 6 vol / hemisfério de peso (ml g) com um potter semelhante conduzido por motor (tubo de vidro / pilão de teflon) usado a 700 rpm. O homogenado foi centrifugado a 20000 xg 30 min a 4° C e o sobrenadante transferido e rapidamente aquecido a 95° C onde este foi mantido por 10 minutos após esfriar em gelo fundindo. Uma etapa de centrifugação foi feita antes das alíquotas de sobrenadante serem feitas e armazenadas a -20° C como "hP-Tau".
[0337] O homogenado cerebral total foi diluído metade do tampão de amostra (125 mM de Tris/HCl pH 6,8, 4 % de sulfato de dodecil de sódio (p/v) (SDS), 20 % de glicerol, 0,01 % de bromofenol azul) + 5 % de beta-mercapto-etanol então rapidamente aquecido a 95° C. As amostras mantidas 5 min, diluídas no tampão de amostra, aquecido novamente a 95° C então esfriado e rotação a 14000 rpm por 5 Minutos aos emaranhados claros que não foram solubilizados. Os sobrenadantes foram coletados e carregados em um gel SDS-PAGE. A transferência a membrana de nitrocelulose (Hybond-ECL) foi feito no tampão de transferência (25 mM de Tris pH 8, 190 mM de glicina, 20 % de metanol). A membrana foi transferida à solução de bloqueamento (0,1 % de Tween em TBS (50 mM de Tris.HCl, pH 7,6, 150 mM de NaCl) + 5 % de leite em pó) antes da incubação durante a noite a 4° C com o sobrenadante de hibridoma não diluído. A incubação com anti- camundongo de cabra conjugado HRP de anticorpo secundário (Dako, Glostrup, Denmark) diluído 1/10'000 na solução de bloqueamento foi realizada em temperatura ambiente por 1 hora. A detecção foi feita usando os reagentes de detecção ECI Western Blotting de GE Healthcare.
7.1.3. Ligação de anticorpos anti-fosfo-Tau aos emaranhados Tau em um cérebro humano com AD
[0338] Os clones de anticorpo anti-fosfo Tau ACl-41-Ab1 (subclone 9H3 T89-F4) (isotipo de camundongo IgM) e 5D10 (isotipo IgG de camundongo) foram gerados de duas fusões separadas de camundongos vacinados ACl-41. A vacina ACl-41 contém uma mistura de dois peptídeos fosfo-Tau, Tau206-221 [pT212/pS214] e Tau196-211 [pS202/pT205].
[0339] A ligação de clone de anticorpo T89-F4 aos emaranhados nas fatias cerebrais de cérebro humano com AD foi feito pela imunoistoquímica TAUPIR. As seções cérebros corticais de indivíduos com AD, paralisia supranuclear progressiva (PSP) e controles saudáveis foram usados. As seções cerebrais foram lavadas por 5 minutos em PBS então incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente em 1,5 % de H2O2 em PBS:MeOH (1:1) para bloquear peroxidase endógena. Após lavagem as seções 3 vezes em PBST (PBS/0,1 % de TritonX100) estes foram incubados por 30 minutos em temperatura ambiente em PBST+10 % de FCS (soro bovino fetal) solução de bloqueamento. A incubação com os anticorpos primários (clone 9H3 T89-F4, 5D10 e AT100 como um controle positivo) foi feito durante a noite a 4° C. As seções foram lavadas 3 vezes em PBST antes da incubação com um anti-camundongo de cabra conjugado por HRP (adquirido de Dako, Glostrup, Denmark) anticorpo secundário em PBST/10 % de FCS por 1 hora em temperatura ambiente. Antes da detecção, as seções foram lavadas 3 vezes com PBST e incubadas em 50 mM de Tris/HCl 017,6 por 5 minutos. A detecção foi feita pela incubação das seções por 3 minutos em Diaminobenzidina (DAB: 1 tablete em 10 ml de 50 mM de Tris.HCl + 3 ul de H2O2 30 %; MP Biomedicals, Solon, OH, USA). A reação foi interrompida pela lavagem das seções 3 vezes em PBST. As seções foram então transferidas em placas de vidro silanizadas e secadas em ar em uma placa de aquecimento a 50° C por 2 horas. O contra tingimento foi feito pela incubação com hematoxilina Mayers (Fluka Cherie, Buchs, Switzerland) por 1 minuto seguido pela etapa de lavagem por 4 minutos usando-se água de torneira. As seções foram desparafinadas pela passagem em Xilol 2 vezes por 5 min e 2 vezes por 1 min em 100 % de EtOH, seguido por 1 min de lavagem em 90 %, 70 %, 50 % de EtOH e água destilada. Para as seções de recuperação de antígeno foram colocadas em ebulição por 10 min em uma solução de ácido cítrico 0,01 M (pH 6,0) e esfriado por 20 minutos. Finalmente, as seções foram montadas com DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, England) sob tampas de vidro deslizantes. As seções tingidas foram examinadas microscopicamente com ópticos de iluminação de epifluorescência e uma câmera 3CCD (Leica, Wetzlar, Germany). As imagens foram capturadas e analisadas usando software dedicado (IM 500, Leica).
7.2. Resultados7.2.1 Avaliação de hibridomas
[0340] As avaliações de ELISA foram realizadas como descrito nos métodos e 172 clones de hibridoma foram selecionados e transferidos as placas de 12 reservatórios. Os ELISAs subsequentes foram realizadas para avaliar a especificidade dos anticorpos produzidos contra os peptídeos pTau Tau206-221 [pT212/pS214], Tau196-211 [pS202/pT205] e/ou extrato hP-Tau. Este resultou em 25 clones positivos pelos peptídeos pTau e 21 os clones mostraram a especificidade para hP-Tau (Figura 11).
[0341] Os estudos de imunoistoquímica foram feitos e paralelo com análise ELISA. Os modelos de tingimento diferentes foram observados nos clones transferidos as placas de 12 reservatórios. Tingimento citoplásmico e nuclear e glial não específico foi observado em algumas seções biGT incubadas com sobrenadantes não diluídos a partir dos clones selecionados
[0342] O sobrenadante de clone 9H3 (ACl-41-Ab1) foi tingido com estruturas de emaranhados citoplásmico de especificidade alta.
[0343] A avaliação WB no cérebro e extratos hP-Tau de camundongos diferentes foi realizada usando o sobrenadante não diluído a partir de hibridomas selecionados. Nenhuma reação com Tau foi observada para qualquer um do sobrenadante de hibridoma testado.
7.2.2 Tingimento de Emaranhados neurofibrilares nas seções cerebrais humanas com Mal de Alzheimer
[0344] A capacidade dos clones de anticorpo ACl-41-Ab1 (9H3 subclone T89-F4) e 5D10 para ligar-se aos NFTs no cérebro humano com AD foi examinado pela imunoistoquímica TAUPIR. O clone de anticorpo anti-fosfo Tau T89-F4 ligado ao fosfo-Tau contendo NFTs no cérebro humano com AD (Figura 12).
[0345] A capacidade de anticorpo 5D10 para ligar-se aos NFTs em seções cerebrais corticais humanas com AD foi examinada pela imunoistoquímica TAUPIR. O clone de anticorpo anti-fosfo Tau 5DI0 ligado ao fosfo-Tau contendo NFTs e filamentos neuropil nas seções corticais humanas com AD (Figura 13).
7.3. Conclusão
[0346] A avaliação de clones de hibridomas gerados ACl- 41 por ELISA produziram 36 clones de ligação aos peptídeos fosforilados e/ou extrato hP-Tau de comprimento total. A avaliação por TAUPIR destes 36 clones confirmaram o tingimento das estruturas de emaranhados citoplásmicos por um clone (9H3), ACl-41-Ab1.
[0347] Os dois anticorpos ACl-41-Abl (9H3-F4) e 5D10 demonstraram a ligação específica e filamentos neuropil nas seções de cérebro humano com AD.
[0348] EXEMPLO 8: Potência de ACl-35 produzido por 2 processos diferentes para induzir resposta IgG específica por Tau-s após imunizações i.p. ou s.c. nos camundongos de tipo selvagem (C57BL/6)
[0349] O objetivo deste estudo foi avaliar a potência de ACl-35 (Tau393-408 [pS396/pS4041) produzido por 2 processos diferentes, Processo A ACl ou Processo L3 ACl para induzir os tituladores de anticorpos seguindo a injeção subcutânea (s.c.) ou Intraperitoneal (i.p.) no camundongos C57BL/6 de tipo selvagem. Os camundongos foram imunizados 3 vezes com 2 semanas de intervalos e foram sangrados 1 semana antes da primeira injeção e então 1 semana após cada imunização. As respostas IgG anti-pTau (Tau393- 408 [pS396/pS404]) totais foram medidas por ELISA. Além disso, o modelo de isotipo da resposta de anticorpo foi analisado após 3 imunizações para avaliar a distribuição de subclasses diferentes de IgGs bem como IgM. Os tituladores de anticorpos contra o peptídeo pTau (Tau393-408) não correspondente foram analisados, as respostas da célula T induzidas pelo ACl- 35 foram analisadas usando a técnica ELISPOT.
8.1. Métodos8.1.1 Preparação de vacina ACl-35 Processo A ACl
[0350] As vacinas ACl-35 foram preparadas de acordo com protocolo do EXEMPLO 3. A suspensão lipossomal (batelada ACl-35- 081103-B) foi então fracionada antes do armazenagem a 2-8° C. A razão molar de fosfolipídeo/peptídeo final foi de 1:100.
8.1.2 Preparação de vacina ACl-35 Processo L3 ACl
[0351] Fosfopeptídeo tetrapalmitoilado derivado de Tau Tau393-408 [pS396/pS404] (Tau 393-408 humano com grupo fosfo em 5396 e 5404) (4,0 mg) foi pesado em um frasco de vidro 25 ml em que foi adicionado hexafluoroisopropanol (HFIP) (5 ml). Esta solução clara foi então adicionada em uma solução agitada de Dimiristoil fosfatidilcolina (OMPC), Dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG), Colesterol e adjuvante de monofosforil lipídeo A (MPLA) (todos de Avanti Polar Lipids Inc. AL, USA) em clorofórmio (35 ml) (razão molar 9:1:7:0,2 respectivamente). A solução resultante foi então filtrada através de uma membrana de filtro PTFE hidrofóbico 0,2 um em um frasco fundo redondo de vidro 250 ml. O solvente orgânico foi então removido pela evaporação sob pressão reduzida a 40° C e então sob alto vácuo por 3 horas. A película fina resultante foi hidratada novamente pela adição de PBS (40 ml) e levemente agitação em temperatura ambiente por 18 horas. A suspensão lipossomal (batelada ACl-35-081103-A) foi então fracionada antes do armazenagem a 2-8° C. A razão molar de fosfolipídeo/peptídeo final foi de 1:100.
8.1.3 Imunizações
[0352] Os camundongos C57BL/6 de 13 semanas de idade (10camundongos por grupo) receberam injeção s.c. ou i.p. da vacina em três ocasiões com 2 semanas de intervalo entre cada administração (dia(d)0, d14, d28) de acordo com Tabela 1 semana (d-7) antes da primeira imunização então 7 dias após as injeções (isto é d7, d21, d35) e nas amostras sanguíneas de sacrifício (d56) foram coletadas e plasma preparados. IgG específico por Tau393-408 [pS396/pS404] e tituladores de anticorpos IgM e modelos IgG de isotipos foram determinados por ELISA. Como controle tituladores de anticorpos IgG não específicos por pTau393-408 foram determinados por ELISA.Tabela 11: Imunização de camundongos
Figure img0013
a: volume teóricob: s.c.: subcutâneoc: quantidade medida determinada pela análise
8.1.4 Quantificação de anticorpos específicos por peptídeo Tau
[0353] Os anticorpos IgG específicos por Tau393-408 [pS396/pS404] foram determinados por ELISA nas 5 amostras de sangria de plasma 5. Os anticorpos IgG específicos por Tau393-408, IgM específico Tau393-408 [pS396/pS404] e anticorpos de Isotipos IgG foram determinados por ELISA na amostra de sangria de plasma d35. as placas foram revestidas com 10 ug/ml de peptídeo Tau correspondente durante a noite a 4° C. Após lavagem cada reservatório com PBS-0,05 % de Tween 20 e bloqueando com 1 % de BSA em PBS-0,05 % de Tween 20, diluições periódicas de plasma foram adicionadas as placas e incubadas a 37° C por 2 horas. Após lavagem, placas foram incubadas com um anticorpo IgG de camundongo conjugado de fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) ou anticorpos específicos por isotipo (IgM anti-camundongo conjugado por peroxidase de rábano silvestre (HRP), IgG1 anti-camundongo conjugado por AP, IgG2a e IgG3 anti-camundongo conjugado por biotina, adquirido de Pharmingen BD, San Diego, CA, USA e IgG2b anti-camundongo conjugado por HRP de Zymed Laboratories, San Francisco, CA) por 2 horas a 37° C. Após lavagem, as placas foram incubadas com pNPP (para-nitro-fenil- fosfato), o substrato de fosfatase por AP, ou ABTS (2,2’-azinobis(ácido 3- etilbenztiazolina-6-sulfônico)), o substrato por HRP e lido a 405 nm usando um leitor de placa ELISA. Uma etapa complementar foi realizada pelos anticorpos conjugados por biotina onde as placas foram incubadas por 45 minutos em estreptavidina-HRP (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) antes da detecção usando ABTS, Os resultados são expressados como O.D. (Densidade óptica) na primeira diluição e uma diluição não saturada por IgG e O.D. não saturado pelos isotipos IgG e IgM.
8.1.5 Quantificação de peptídeo Tau produzindo as células T por ELISPOT
[0354] A produção de citocina de Tau393-408 [pS396/pS404] e células T específicos por Tau393-406 foi avaliado por ELISPOT. As placas de nitrocelulose de 96 reservatórios Multiscreen (Millipore, Molsheim, France) foram revestidas durante a noite com IFN-y anti-camundongo e anticorpos monoclonais IL-4 de acordo com as instruções do fabricante (Pharmingen BE, San Diego, GA, USA). As suspensões de células simples foram preparadas a partir dos baços de camundongos imunizados e incubados em diluições periódicas com Tau393-408 [pS396/pS404] e Tau393-408 (10 e 1 ug/ml) e Conoavalin A (5 ug/ml, Amersham) a 37° C sob 5 % de CO2 por 72 horas. As placas foram então lavadas e incubadas por 1 hora a 37° C com IFN-Y anti-camundongo biotinilado e anticorpos monoclonais IL-4. Após lavagem, as placas foram incubadas por 1 hora a 37° C com Estreptavidina-HRP e após lavagem, as manchas foram desenvolvidas pela adição de um substrato (AEC, 3-amino-9- etilcarbazol). O número de manchas por reservatório foi contada por olho sob um microscópio estéreo e os resultados foram expressados como manchas por 106 células. O baço de camundongos naturais foram usados como controles negativos.
8.1.6 Ensaio de proliferação celular não radioativo
[0355] As suspensões de células simples foram preparadas a partir dos baços de camundongos imunizados e incubados em diluições periódicas com Tau393-408 [pS396/pS404] e Tau393-408 (10 e 1 ug/ml) e Concavalin A (5 ug/ml, Amersham) a 37° C sob 5 % de CO2 por 72 horas. Para medir a proliferação, um kit de ensaio de proliferação de célula não radioativa (MTT) foi usado (Promega, Dübendorf, Switzerland), de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, 15 ul da solução Dye foi adicionada a cada reeservatório e as placas foram incubadas durante 4 horas a 37° C. Próximo, 100 ul de solubilização/soluções de interrupção foi adicionado por reservatório e as placas foram incubadas a 4° C por um mínimo de uma 1 adicional. O O.D. foi medido a 570 nm e 690 nm de comprimento de onda.
8.2. Resultados8.2.1 Avaliação de resposta de anticorpo induzida pelas vacinas diferentes
[0356] A Vacina ACl-35 induz uma resposta IgG anti- pTau393-408 [pS396/pS404] robusta seguindo a injeção i.p. ou s.c. independente do processo usado. Em geral os tituladores de anticorpos robustos já estão presentes nos 7 dias após a primeira imunização da vacina. Para o mesmo processo existe uma resposta maior para a injeção s.c. comparada a injeção i.p. por d21 e d35 pelos animais vacinados do Processo L3 ACl (Figura 14, 2-caminhos Anova, P<0,001 d21/d35) e por d2l, d35 e d56 pelos animais injetados do Processo A ACl (Figura 14, 2-caminhos Anova, P<0,001 d21/d35, P<0,01 d56). Para animais injetados i.p., a resposta foi mais alta com o processo L3 AC1 em comparação com o processo A AC1 no sangramento anterior d7 e d21 (Figura 14, 2-caminhos Anova, P<0,001 d7/d21) considerando que não existem diferenças para os animais injetados s.c.. Em resumo os dois processos parecem equivalentes quando estes foram injetados s.c.
[0357] A análise dos resultados em uma diluição O.D. não saturada confirma a diferença entre a injeção i.p. e s.c. do processo de vacina ACl-35 diferente. Em resumo os resultados permanecem o mesmo mostrando que a injeção s.c. dão tituladores Ab maiores então injeção i. p. E que pela injeção s.c. não existe diferença significante entre os 2 processos.
[0358] Para determinar os isotipos de anticorpos que induz a vacina, o plasma de d35 foi analisado por IgG ELISA específico por ELISA. ACl-35 induz todos os grupos antipTau393-408 [pS396/pS404] IgG de isotipos IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3. O IgG2b foi o isotipo dominante com O.D. maior ainda em uma diluição de 113200. para a subclasse IgG1 existe uma resposta maior por s.c. comparado a injeção i.p. para ambos processos (Figura 15, 1 caminho Anova, P<0,05). A mesma diferença foi observada pela subclasse IgG3. Para as subclasses IgG2a e 2b não existe diferença entre os 2 processos testados entre a injeção da vacina i.p. ou s.c..
[0359] Não existe diferença entre os 2 processos testados em termo de respostas de anticorpo anti-pTau393-408 [pS396/pS4041 IgM considerando que existe um titulador IgM mais significante com injeção i.p. comparado a injeção s.c. (Figura 16a, 1 caminho Anova, P<0,001).
[0360] Os tituladores de anticorpos contra não fosfo Tau393-408 também foram analisados ou todos os grupos. Os anticorpos IgG específicos por anti-Tau393-408 foram detectados para todos os grupos mas estes tituladores foram inferiores do que o anti-pTau393-408 [pS396/pS404]. Não existe diferença nos tituladores anti-Tau393-408 IgG entre os 2 processos ou modo de injeção (Figura 16 b, 1 caminho Anova, P>0,05).
[0361] A média dos primeiros três tituladores IgG para o peptídeo Tau diferentes são mostrados na Tabela 12:Tabela 12: Média dos primeiros três tituladores IgG anti- Tau393-408 [pS396/S404] (O.D. em diluição 1/100)
Figure img0014
8.2.2 Avaliação da resposta de célula T induzida por AG1-35
[0362] O re-estímulo in vitro de esplenócitos com peptídeosConA, pTau393-408 [pS3961pS404] ou Tau393-408 não resultam nas diferenças de proliferação entre os grupos testados (Figura 17) considerando que este foi positivo por ConA.
[0363] O re-estímulo usando 10 ug/ml de secreção de citocina induzida por Tau393-408 [pS396/S404] foi maior para esplenócitos de camundongos vacinados comparados aos camundongos naturais (Figura 18). O processo 1-3 ACl injetado s.c. induz o nível maior de ambas citocinas analisadas com nenhuma diferença clara entre IFN-7 e IL-4. A injeção i.p. ou s.c. do Processo A ACl induz a secreção de citocina que é principalmente 1L-4 e os níveis são maiores para a injeção i.p.. O re-estímulo usando 1 ug/ml de Tau393-408 [pS396/S404] induz os resultados comparáveis ao re-estímulo usando 10 ug/ml de Tau393-408 [p 396/5404].
[0364] O re-estímulo usando o não peptídeo pTau939-408 induz os resultados comparáveis as contra partes de peptídeo pTau (Figura 18). Novamente o uso do Processo A AGl induz a secreção de citocina que é principalmente IL-4.
8.3. Conclusão
[0365] A vacina ACl-35 induz tituladores IgG robustos já após a imunização I independentemente do processo ou o modo de injeção testado. Em termo de comparação, a injeção s.c. da vacinas independentemente do processo usado dá os tituladores de anticorpos IgG maiores. A injeção i.p. do processo A ACl AG1-35 resultou em menos tituladores IgG1 e IgG3 comparados a outros grupos. A injeção i.p. de ACl-35 resultou em tituladores IgM significantemente maiores do que a injeção s.c.. Finalmente, todos os grupos tem os tituladores IgG contra o não peptídeo pTau393-408.
[0366] O re-estímulo usando peptídeos pTau ou Tau induz a produção de citocina no estudo ELISPOT que foi principalmente IL-4 pelos camundongos vacinados do processo A AG1.
[0367] Exemplo 9: Imunogenicidade de vacina tau em camundongos transgênicos Tau P301L (TPLH)
[0368] O objetivo deste estudo foi analisar a imunogeneicidade da vacinação anti-Tau usando injeção subcutânea (s.c.) da vacina lipossomal de Tau (ACl-33, ACl-35, AGl-39 e ACl-40) nos camundongos transgênicos Tau P301L.
9.1. Métodos9.1.1 Camundongos transgênicos Tau P301L (TPLH)
[0369] Os camundongos transgênicos Tau P301L homozigotos (TPLH) com fundamento FVB/N foram usados para testar a eficácia da vacinação s.c. ACl-33 ou ACl-35. Estes camundongos expressam o isoforma tau humano mais longo com a mutação P301L sob controle de promotor de camundongo thy1. Os sintomas clínicos apresentados na idade 6 a 7 meses e camundongos TPLH envelhecidos desenvolvem uma tauopatia no agonizante com dano neuronal progressivo e formação de emaranhados neurofibrilares (NFT). Nos estágios terminais estes perdem peso e morrem repentinamente (semelhante aos problemas de respiração (asfixia), mas estes na idade de 9 a 11 meses e sem exceção antes de 12 meses.
9.1.2 Preparação de vacina ACl-33 e ACl-35
[0370] As vacinas foram preparadas de acordo com processo A descrito no EXEMPLO 3.
[0371] A suspensão lipossomal (batelada ACl-33-481031- A e batelada AO-36-081015A + ACl-35-090402-A) foi então fracionada antes do armazenagem a 2-8° C. A razão molar de fosfolipídeo/peptídeo final foi de 1:100.
9.1.3 ImunizaçõesACl-33 ACl-39 e ACl-40
[0372] Os camundongos TPLH entre 21 e 31 semanas (810 camundongos por grupo: mistura de fêmeas ($) e machos (^)) receberam as injeções s.c. da vacina em cinco ocasiões (Tabela 14). As três primeiras imunizações foram feitas com um intervalo de 2 semanas entre cada administração (dia(d)0, d13, d28) de acordo com Esquema 1. Os animais foram então intensificados uma vez por mês por dois meses (d91 e d133). 1 dia (d-1) antes da primeira imunização então após a segunda (d27) e terceira (d41) imunizações das amostras sanguíneas foram coletadas. A coleta sanguínea também foi realizada antes, na entrada e depois da intensificação (d76, dI04, d135). O soro foi preparado com o sangue deixando-se as amostras coagular durante a noite então obtendo o sobrenadante após centrifugação. O IgG específico por peptídeo fosfo-tau e tituladores de anticorpos IgM e modelos de isotipo IgG foram determinados por ELISA. Os tituladores de anticorpos IgG específicos pela proteína Tau de comprimento total, não p-tau (441aa) e proteína tau de comprimento total fosforilada (441aa) também foram determinadas por ELISA.ACl-35
[0373] Os camundongos TPLH entre 22 e 31 semanas (10 camundongos por grupo: mistura de fêmeas ($) e machos ($) receberam as injeções s.c. da vacina em cinco ocasiões (Tabela 13). As três primeiras imunizações foram feitas com intervalo de 2 semanas entre cada administração (dia(d)0, d13, d27) de acordo com Esquema 1. Os animais foram então intensificados uma vez por mês por dois meses (d91 e d133). 1 dia (d-1) antes da primeira imunização então após o segundo (d26) e terceiro (d40) imunizações das amostras sanguíneas foram coletadas. A coleta do sangue também foi realizado antes, na entrada e após a intensificação (d75, d103, d145, d155). O soro foi preparado com o sangue deixando as amostras coagularem durante a noite então obtendo o sobrenadante após centrifugação. O IgG específico por Tau393-408 [pS396JpS404] e tituladores de anticorpos IgM e modelos de isotipo IgG foram determinados por ELISA. Os tituladores de anticorpos IgG específicos pela proteína Tau de comprimento total, não pTau393-408, (441aa) e proteína tau de comprimento total fosforilado (441aa) também foram determinados por ELISA.Tabela 13: Imunização de camundongos
Figure img0015
N.A.: não aplicávela: volume teóricob: s.c.: subcutâneac: quantidade medida determinada pela análise
9.1.4 Quantificação de anticorpos específicos por peptídeo Tau
[0374] Para os camundongos tratados por ACl-33, ACl-39e ACl-40, os anticorpos IgG específicos respectivamente Tau5-20 [pY18], Tau206-221 [pT212, pS214] e Tau196-211 [pS202, pT205] foram determinados por ELISA nas 6 amostras de sangria de soro. Proteína Tau de comprimento total Tau5-20- (441aa) e proteína tau de comprimento total fosforilado (441aa) específica por IgG foram determinados no soro de d-1 e d41. O IgM específico por peptídeo de fosfo-tau e anticorpos de isotipo IgG foram determinados por ELISA na amostra de sangria de soro d41.
[0375] Para os camundongos tratados por ACl-35, anticorpos IgG específicos para Tau393-408 [pS396/pS404] foram determinados por ELISA nas 7 amostras de sangria de soro. Proteína Tau de comprimento total Tau393-408- (441 aa) e proteína tau de comprimento total fosforilada (441 aa) específica por IgG foram determinados no soro de d-1 e d40. IgM específico por Tau393-408 [pS396/pS404] e anticorpos de isotipo IgG foram determinados por ELISA nas d40 amostras de sangria de soro.
[0376] As placas com revestidas com 10 ug/ml de peptídeo Tau correspondente e 1 ug/ml de Proteína tau correspondente durante a noite a 4° C. Após lavagem cada reservatório com PBS-0,05 % de Tween 20 e bloqueando com 1 % de BSA em PBS-0,05 % de Tween 20, diluições periódicas de soro foram adicionadas as placas e incubadas a 37° C por 2 horas. Após lavagem, placas foram incubadas com um anticorpo total IgG anti-camundongo conjugado por fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) ou anticorpos específicos por isotipo (IgM anti-camundongo conjugado por peroxidase de rábano silvestre (HRP), IgG1 anti-camundongo conjugado por AP, IgG3 anti-camundongo conjugado por biotina, adquirido de Pharmingen BD San Diego, CA, USA; IgG2a anti- camundongo conjugado por biotina adquirido de Invitrogen CA, USA e 1gG2b anti-camundongo conjugado por HRP de Zyrned Laboratories, San Francisco, CA) por 2 horas a 37° C. Após lavagem, as placas foram incubadas com pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), o substrato de fosfatase por AP, ou ABTS (2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenatiazolina-6-sulfônico)), o substrato por HRP e lido a 405 nm usando um leitor de placa ELISA. Uma etapa complementar foi realizada pelos anticorpos conjugados por biotina onde as placas foram incubadas por 45 minutos em estreptavidina-HRP (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) antes da detecção usando ABTS. Os resultados são expressados como O.D. (Densidade óptica) em um O.D. não saturado por IgG, isotipos e IgM.
9.1.5 Ligação de anticorpos anti-tau aos emaranhados nas fatias cerebrais do animal transgênico (TAUPIR)
[0377] A ligação de anticorpo presente no soro de animais vacinados ACl-33, ACl-35, ACl-39 e ACl-40 aos emaranhados nas fatias cerebrais foi feito pela imunoistoquímica TAUPIR.
[0378] O tingimento TAUPIR foi feito de acordo com protocolo do EXEMPLO 5.1.5.
9.1.6 Western Blot (WB)
[0379] O Western Blot foram feitos de acordo com protocolo do EXEMPLO 5.1.6 exceto que a lavagem seja realizada antes da detecção com a solução de conjugado de estreptavidina Qdot 625 (Invitrogen, CA, USA) por 30-60 minutos em temperatura ambiente.
9.2. Resultados9.2.1 Resposta de anticorpo IgG
[0380] Todas as construções de vacina tem gerado os tituladores de anticorpos específicos por IgG.
[0381] A vacina ACl-33 induz uma resposta específica IgG seguindo a injeção s.c.. Após 2 imunizações (d27), a resposta IgG permaneceu estável com nenhum aumento com a terceira imunização (d41) (Figura 19 1 caminho Anova P< 0,001 d-l vs d27, P>0,05 d27 vs A diminuída nos tituladores de anticorpos foi observado a d76 (Figura 19, 1 caminho Anova P<0,001 d41 vs d76) e intensificação dos animais levemente aumentam novamente os tituladores a d104.
[0382] A vacina ACl-35 induz uma resposta IgG anti- Tau393-408 [pS396/pS404] seguindo a injeção s.c.. Após 2 imunizações (d26), a resposta IgG não foi aumentada com a terceira imunização (d40) (Figura 20, 1 caminho Anova P< 0,001 d-1 vs d26 e d40). A intensificação dos animais aumentam novamente os tituladores a d103 (Figura 20, 1 caminho Anova P< 0,05 d-1 vs d104 e P<0,001 d-1 vs d145).
[0383] A vacina ACl-39 induz uma resposta IgG anti- Tau206-221 [pT212, pS214] seguindo injeção s.c.. Após 2 imunizações (d27), a resposta IgG permaneceu estável com nenhum aumento com a terceira imunização (d41) (Figura 21, 1 caminho Anova P<0,001 vs d27/d41). Existe uma gota nos tituladores a d76 e intensificação dos animais restaurando os tituladores ao mesmo nível como após 3 imunizações (Figura 21, 1 caminho Anova P< 0,05 d-1 vs d76 e P> 0,05 d41 vs d104).
[0384] A análise dos resultados em uma diluição O.D. não saturada mostrou a mesma conclusão como a diluição 1/100 saturada (1 caminho Anova P<0,05 d-1 vs d27/d41/d104 e P>0,05 d-1 vs d76).
[0385] A vacina ACl-40 induz uma resposta IgG anti- Tau196-211 [pS202, pT205] seguindo injeção s.c.. Após 2 imunizações (d27), a resposta IgG permaneceu estável com nenhum aumento com a terceira imunização (d41) (Figura 22, 1 caminho Anova P< 0,001 d-1 vs d27, P>0,05 d27 vs d41). Uma diminuição nos tituladores de anticorpos foi observada a d76 (Figura 22, 1 caminho Anova P<0,001 d41 vs d76) e intensificação dos animais levemente aumentam novamente os tituladores a d104.
[0386] As análises dos resultados em uma diluição O.D. não saturada mostrou as mesmas conclusões como a diluição 1/100 saturada (1 caminho Anova P< 0,001 d-1 vs d27, P>0,05 d27 vs d41 e P<0,01 d41 vs d76).
9.2.2. Análise de isotipo
[0387] A vacinação ACl-33 induz tituladores de anticorpos que foram principalmente das subclasses IgG2a e 2b seguindo 3 imunizações s.c. (Figura 23). Os níveis IgG1, IgG3 e IgM estão abaixo e existem uma diferença significante entre os níveis de IgG2a/2b e IgG1/IgM (Figura 23, 1 caminho Anova P<0,05 IgG1 vs IgG2a/2b, P<0,001 IgM vs IgG2a/2b).
[0388] A vacinação ACl-35 induz os tituladores de anticorpos que foram principalmente de subclasses IgG2a e 2b seguindo 3 imunizações s.c. (Figura 24). O nível IgG1 foi inferior com uma diferença significante entre IgG1 e 1gG2a (Figura 24, 1 caminho Anova P<0,05 IgG1 vs IgG2a). Os níveis IgG3 e IgM foram inferiores e existem uma diferença significante entre os níveis de IgG2a/2b e IgG3/IgM (Figura 24, 1 caminho Anova P<0,05 IgG311gM vs IgG2b, P<0,0001 IgG3/IgM vs IgG2a).
[0389] A vacinação ACl-39 induz os tituladores de anticorpos que foram principalmente das subclasses IgG2a e 2b seguindo 3 imunizações s.c. (Figura 25). Os níveis IgG1, IgG3 e IgM foram significantemente inferiores do que tituladores IgG2a12b (Figura 25, 1 caminho Anova P<0,05 IgG2b vs IgG1/IgG3, P<0,01 IgG2a vs IgG1/IgG3, P<0,001 IgG2a/2b vs IgM).
[0390] A vacinação ACl-40 induz os tituladores de anticorpos que foram principalmente de subclasses IgG2b seguindo 3 imunizações s.c. (Figura 26, 1 caminho Anova P<0,05 IgG2b vs igG2a e P<0,001 IgG2b vs IgG1/IgG3/IgM). Os tituladores IgG2a também foram maiores então IgM (Figura 26, 1 caminho Anova P<0,01 IgG2a vs IgM).
9.2.3 Especificidade de anticorpo
[0391] Os tituladores IgG induz após 3 injeções s.c. de vacinas tau também foram analisados nos peptídeos Tau diferentes (peptídeo pTau e peptídeo Tau) e proteínas (proteína tau de comprimento total anti- fosforilado (441 aa) = proteína anti-ptau e proteína tau anti-comprimento total (441aa) = proteína anti-tau.
[0392] Nos camundongos vacinados ACl-33, a sangria d-1 foi usada como um controle e para cada revestimento diferente existe uma diferença entre a pré-sangria e o soro coletado após 3 imunizações por Tau5- 20 [018] e revestimentos de proteína tau (Figura 27, 1 caminho Anova P<0,001 d-1 vs d41 por Tau5-20 [pY18], P<0,05 d-1 vs d41 pela Proteína tau).
[0393] Nos camundongos vacinados ACl-35, a sangria d-1 foi usada como um controle e existe uma diferença significante entre d-1 e d40 apenas para os tituladores anti-Tau393-408 [pS396/pS404] (Figura 28, 1 caminho Anova P<0,0001 d-1 vs d40 pelos tituladores anti-Tau393-408 [pS3961pS404]). Os níveis de anticorpos d40 obtidos no peptídeo Tau393- 408 [pS396/pS404] também foram significantemente diferentes então os níveis obtidos podem todos os outros revestimentos (Figura 28, 1 caminho Anova P<0,0001 d40 anti-Tau393-408 [pS396/pS404] vs d40 anti-Tau393- 408 /Proteína p-tau/Proteína tau).
[0394] Nos camundongos vacinados ACl-39, a sangria d-1 foi usada como um controle e apenas para o revestimento Tau206-221 [pT212, pS2I4] existe uma diferença entre a pré-sangria e o soro coletado após 3 (Figura 29; 1 caminho Anova P<0,001 d-1 vs d41 por Tau206-221 [pT212, pS214]).
[0395] Nos camundongos vacinados ACl-40, a sangria d-1 foi usada como um controle e existe uma diferença entre a pré-sangria e o soro coletado após 3 imunizações por revestimentos Tau196-211 [pS202, pT205] e Tau 196-211 (Figura 30, 1 caminho Anova P<0,001 d-1 vs d41 por Tau196-211 [pS202, pT205], P<0,05 d-1 vs d41 por Tau196-211).
[0396] O soro de camundongo ainda foi usado nos experimentos TAUPIR para determinar se os anticorpos anti-Tau presentes no soro devem reconhecer os emaranhados nas fatias cerebrais do animal transgênico Tau.
[0397] No extrato cerebral WB de camundongos diferentes também foram realizados usando soro de camundongo ou a detecção de anticorpo de controle Tau-5 todas as formas de Tau (pTau e Tau).
[0398] Os dados são resumidos na tabela 14 em seguida.Tabela 14: Resumo de experimentos TAUPIR e WB nos camundongos vacinados TPLH
Figure img0016
9.3. Conclusão
[0399] Os tituladores de anticorpos anti-tau foram analisados por sua ligação aos peptídeos de Tau e pTau diferentes bem como o pTau de comprimento total ou Proteína tau. A imunização lipossomal Tau gerou a ligação de anticorpos IgG especificamente os peptídeos pTau e fosfo- proteína tau com ligação mais fraca aos peptídeos não fosforilados e proteína.
[0400] Em termos de isotipos IgG existe uma resposta de anticorpo IgG1 inferior comparado ao IgG2b e IgG3. A resposta IgM inferior foi observada que é de acordo com o modo de imunização (s.c.).
[0401] A especificidade dos anticorpos gerados pela tau dos camundongos imunizados foi testada em TAUPIR e quase todos os soros de camundongos mostra a alta ligação aos emaranhados Tau presentes nas fatias do cérebro para os animais Tau mutantes.
[0402] EXEMPLO 10: Eficácia no modelo de camundongo transgênico Tau P301L seguindo vacinação ACl-33 ou ACl-35
[0403] O objetivo deste estudo foi analisar a eficácia da vacinação anti-Tau usando a injeção subcutânea (s.c.) das vacinas ACl-33 (Tau5-20 [pY18]) ou ACl-35 (Tau393-408 [pS396/pS404]) em camundongos transgênicos Tau P301L. Os camundongos foram imunizados 5 vezes e as mudanças de comportamento foram analisados pelas análises rotarod realizadas durante a vida total do animal.
10.1 Métodos10.1.1 Preparação de vacina
[0404] As vacinas ACl-33 e ACl-35 foram preparadas de acordo com o protocolo do EXEMPLO 3.
10.1.2. Imunização
[0405] Os animais foram imunizados com ACl-33 ou ACl- 35 de acordo com o protocolo descrito no EXEMPLO 9 (Esquema 2 por ACl- 33 e esquema 3 por ACl-35)
[0406] Esquema 2 Lista de imunizações, sangrias e ensaiosrotarod por ACl-33
Figure img0017
Esquema 3: Lista de imunizações, sangrias e ensaio rotarod por ACl-35
Figure img0018
10.1.3 Comportamento (rotarod)
[0407] Para observar a condição motoras dos animais, oteste rotarod automático foi realizado. Cinco camundongos foram simultaneamente testados em um haste rotativa recorrente (diâmetro 3 cm), separada pelos divisores não translúcidos. Durante o teste, a haste acelera de 4 a 40 rpm em 5 minutos. Para cada camundongo o tempo permanece na haste rotativa recorrente foi armazenado, com um máximo de 5 minutos.
10.2 Resultados
[0408] Para avaliar a condição motora do TPLH após ACl- 33 ou tratamentos PBS, os camundongos foram submetidos ao teste rotarod em cinco ocasiões diferentes (Figura 31). A diferença significante entre os animais ACl-33 e PBS injetados foi observado na idade de 7,3 meses (Figura 31, 2-caminhos Anova P<0,001 idade 7,3 meses). Este efeito de ACl-33 no comportamento motor de camundongo foi correlacionado aos tituladores de anticorpos anti-Tau5-20 [pY18] no soro de camundongos a 7,8 meses (Figura 32, Spearman r P< 0,001).
[0409] Para avaliar a condição motora de TPLH após os tratamentos ACl-35 ou PBS, os camundongos foram submetidos ao teste rotarod (Figura 33). Embora não exista diferença significante entre o tratamento e o grupo de controle, uma direção para a eficácia ACl-35 deve ser observada no ensaio rotarod realizado quando os camundongos estão com 9,5 meses de idade (Figura 33, teste Mann-Whitney P= 0,1905 idade 9,5 meses).
10.3 Conclusão
[0410] A vacinação ACl-33 nos camundongos TPLH mostraram um efeito benéfico nos déficits motores de camundongo durante o ensaio rotarod versus animais injetados por PBS. Este efeito positivo foi correlacionado aos tituladores de anticorpos anti-Tau no soro de camundongo.
[0411] A vacinação ACl-35 nos camundongos TPLH mostraram uma direção na eficácia nos déficits motores de camundongo durante o ensaio rotarod nos 9,5 meses versus animais injetados com PBS.
[0412] EXEMPLO 11: Resposta de anticorpo anti-pTau nos camundongos nus fêmeas
[0413] O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta de anticorpo anti-pTau induzido pela injeção da vacina ACl-33 (Tau5-20 [pY18]) nos camundongos nus fêmeas. Os camundongos nus realizam a mutação “Fowl”, tendo uma função de célula T reduzida devido a perda da glândula tímica que funciona de maneira apropriada. Deste modo, o objetivo deste estudo foi analisar se a resposta de anticorpo induzida pelo ACl-33 é independente da célula T.
[0414] Os camundongos nus com um fundamento C57BL/6 e littermates do tipo selvagem correspondentes em uma idade de 11 ou 13 semanas foram subcutaneamente injetados (s.c.). Os camundongos foram imunizados 3 vezes com intervalos de 2 semanas e foram sangrados 1 semana após cada imunização. As respostas IgG de peptídeo anti-pTau (Tau5-20 [p18]) totais foram medidas por ELISA. Além disso, o modelo de isotipo da resposta de anticorpo foi analisado após 3 imunizações para avaliar a distribuição de subclasses diferentes de IgGs bem como IgM. Os tituladores de anticorpos contra a proteína tau de comprimento total (441aa), não-pTau (Tau5-20) correspondente e proteína tau de comprimento total fosforilada (441aa) também foram analisadas.
[0415] Para verificar a ausência das células auxiliares T nos camundongos nus, a porcentagem das células CD3+/CD4+ foi avaliada pelo separador de célula ativada por fluorescência (FACS).
11.1 Métodos11.1.1 Preparação da vacina ACl-33
[0416] As vacinas ACl-33 foram preparadas de acordo com EXEMPLO 3.
[0417] A suspensão lipossomal (batelada ACl-33-090818- A) foi então fracionada antes do armazenagem a 2-8° C. A razão molar de fosfolipídeo/peptídeo final foi de 1:100. As vacinas foram transportadas por JSW Life Sciences GmbH (Austria).
11.1.2 Imunizações
[0418] Nos camundongos nus JSW Life Sciences GmbH (B6.Cg-Foxn1nu/J) com um fudamento C57BL/6 e littermates do tipo selvagem correspondente (6 $ camundongos/grupo) recebem a injeção s.c. de ACl-33 em três ocasiões com o intervalo de 2 semanas entre cada administração (dia 0, 14, 28) de acordo com Tabela 15. As amostras de plasma a partir da artéria/veia facial foram coletadas 7 dias antes e 2, 4, 7, 21, 35 e 56 dias depois das primeiras injeções. Os tituladores de anticorpos IgG e IgM específicos por Ta05-20 [pY18] e modelos de isotipo IgG foram determinados por ELISA. Os tituladores de anticorpos IgG específicos para proteína tau de comprimento total (441aa), não-pTau5-20 e proteína tau de comprimento total fosforilado (441aa) também foi determinado por ELISA. As amostras sanguíneas também foram coletadas em d-7 pela análise FAGS para determinar a porcentagem de células CD3+/CD4+.
11.1.3 Quantificação de anticorpos específicos por peptídeo Tau
[0419] Os anticorpos IgG específicos por Tau5-20 [pY18] foram medidos por ELISA nas 5 amostras de sangria de soro (d2, d7, d21, d35 e d56). Proteína tau de comprimento total (441aa), Tau5-20- e IgG específico pelo proteína tau de comprimento fosforilado (441 aa) foram determinados no soro de d35. O IgM específico por Tau5-20 [pYI8] e anticorpos de isotipo IgG foram determinados por ELISA na amostra de sangria de soro d35. As placas revestidas com 10 ug/ml de peptídeo tau correspondente e 1 ug/ml de Proteína tau correspondente durante a noite a 4° C. Após lavagem cada reservatório com PBS-0,05 % de Tween 20 e bloqueando com 1 % de BSA em PBS-0,05 % de Tween 20, diluições periódicas de soro foram adicionadas as placas e incubadas a 37° C por 2 horas. Após lavagem placas foram incubadas com um anticorpo total IgG anti-camundongo conjugado por fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) ou anticorpos específicos por isotipo (IgM anti-camundongo conjugado por Peroxidase de rábano silvestre (HRP), IgG1 anti-camundongo conjugado por AP, IgG3 anti-camundongo conjugado por biotina, adquirido de Pharmingen BD San Diego, CA, USA; IgG2a anti-camundongo conjugado por biotina adquirido de Invitrogen CA, USA e IgG2b anti-camundongo conjugado por HRP de Zymed Laboratories, San Francisco, CA) por 2 horas a 37° C. Após lavagem as placas foram incubadas com pNPP (para.-nitro-fenil-fosfato), o substrato de fosfatase por AP, ou ABTS (2,2'-azino-bis(ácido 3- etilbenztiazolina-6-sulfônico)), o substrato por HRP e lido a 405 nm usando um leitor de placa ELISA. Uma etapa complementar foi realizada pelos anticorpos conjugados por biotina onde as placas foram incubadas por 45 minutos em estreptavidina-HRP (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) antes da detecção usando ABTS. Os resultados são expressados como O.D. (Densidade óptica) em um O.D. não saturado por IgG, Isotipos IgG e IgM.
11.1.4 Quantificação de célula CD3+/CD4+
[0420] As amostras sanguíneas de camundongo foram lisadas com cloreto de amônio até clareadas, então centrifugadas em 400 x g por 7 minutos e grânulos foram recolocados em suspensão em PBS contendo EDTA. Então as células foram bloqueadas com reagente de bloqueamento CD16/CD32 e tingidas com CD4 (conjugado PE) e anticorpos CD3 (PE-Cy5) por 30 minutos a 4° C. As amostras foram lavadas com PBS, recolocadas em suspensão na solução fixa (DB Celifix diluída 1:40 em fluxo BD FACS) e adquirida em um citômetro BD FACS Calibur. A porcentagem das células de entrada, que tingem positivamente quanto a CD3+ e CD4+ (células auxiliares T) foi avaliado.Tabela 15: Imunização de camundongos
Figure img0019
a: volume teóricob: s.c.: subcutâneoc: quantidade medida determinada pela análise
11.2 Resultados11.2.1 Observações gerais
[0421] Nenhum dos animais prematuramente mortos e nenhum efeito colateral devido ao tratamento foram relatados. Para todos os animais B6.Cg-Foxn1nu/J, o fenotipo nu típico está presenta, enquanto os littermates de tipo selvagem (wt) tem uma pele normal.
11.2.2 Quantificação de célula CD3+/CD4+
[0422] O tingimento CD3+/CD4+ seguido pela análise FACS revelou uma redução significante nas contagens de células auxiliares T (células CD3+/CD4+) nos camundongos nus, comparados aos animais Wt (Figura 34).
11.2.3 Análise da resposta imune
[0423] Os tituladores IgG anti-Tau5-20 [pY18] gerados pela vacinação ACl-33 foram analisados para estudar a imunogeneicidade da vacina nos camundongos nus e wt. Os tituladores IgG anti-Tau5-20 [pYI8] nus foram analisados para estudar se a resposta induzida por ACl-33 foi independente na função da célula T. A vacina induz uma resposta IgG anti- Tau5-20 [pYl8] em camundongos nus e não existe diferença significante entre a resposta de anticorpo induzido por ACl-33 nos camundongos nus ou wt em todos os períodos de tempo testados (Figura 35; 2-caminhos ANOVA P<0,05 para todos as sangrias entre camundongos nus e wt).
[0424] A vacina ACl-33 induz os ambos os tipos de camundongo em resposta IgG anti-Taus-20 [pY18] seguindo injeção s.c. que chegaram ao pico após 2 imunizações (d27) (Figura 35).
[0425] A vacinação ACl-33 induz os tituladores de anticorpos do mesmo perfil para a subclasse IgG diferente e IgM entre camundongos nu e wt como não existe diferença significante entre os dois tipos de camundongos seguindo as 3 imunizações s.c. da vacina (Figura 36, 1 caminho Anova P>0,05 IgG1 nu Vs. IgG1 wt, IgG2a/2b nu vs. IgG2a/2b wt, IgG3 nu vs. IgG3 wt, IgM nu vs. IgM wt). Em ambos tipos de camundongos existe um nível inferior significante de IgG1 comparado ao IgG2b e IgM (Figura 36, 1 caminho Anova, camundongos nus: camundongos P<0,01 IgG1 vs. IgG2b ou IgM; Wt: P<0,05 IgG1 vs. IgG2b ou 10). Além disso os camundongos nus mostraram um nível inferior significante de IgG1 comparado ao IgG3 (Figura 36, 1 caminho Anova, camundongos nus: P<0,05 IgG1 vs. IgG3) e o nível de IgG2a também foram inferiores comparados aos IgG2b, IgG3 e IgM (Figura 36, 1 caminho Anova, camundongos nus: P<0,05 IgG2a vs. IgG2b, IgG3 ou IgM).
[0426] Os tituladores IgG induzidos após 3 injeções s.c. de ACl-33 também foram analisados em peptídeos Tau diferentes (anti-Tau5-20 [pY18] e anti-Tau5-20) e proteínas (proteína tau de comprimento total anti- fosforilado (441aa) = Proteína anti-ptau e Proteína tau anti-comprimento total (441aa)= Proteína anti-tau (Figura 37). Não existe diferença nos tituladores nos peptídeos diferentes e proteína entre os camundongos nus e wt. No grupo de camundongos nus existe uma diferença significante no anti-Tau5-20 [pY18] sendo maior então os tituladores anti-Tau5-20 (Figura 37, 1 caminho Anova, tituladores P<0,05 anti-Tau5-20 [pY18] vs, tituladores anti-Tau5-20).
11.3 Conclusão
[0427] Apesar da porcentagem menor de células CD3+ e CD4+ em camundongos nus. A vacina ACl-33 induz uma resposta IgG anti- Tau5-20 [pY18] robusta. A persistência da resposta de anticorpo e a distribuição de isotipo IgG foi similar nos camundongos nus e wt sugerindo que estes parâmetros são independentes nas células T no contexto da vacinação ACl-33. Comparados aos camundongos competentes imunes, a imunização ACl-33 induz um titulador de anticorpo idêntico e cinético com o perfil IgG similar nos camundongos deficiente de célula T. Além disso os tituladores de anticorpo nos peptídeos Tau diferentes e proteínas foram similares entre camundongos deficientes de célula T e competente imune. Estes dados indicam que ACl-33 induz uma resposta do anticorpo independente de célula T tanto nos camundongos nus quanto nos camundongos wt. LISTA DE REFERÊNCIAAlving et al.,(1992) Infect. Immun. 60:2438-2444Asuni et al., (2007) J Neurosc. 27 (34), 9115-29Hodgson et al.,(1991) Bio/technoloy, 9:421Khaw, B. A. et al. (1982) J. Nuel. Med. 23:1011-1019Lewis et al., (2000) Nature Genetics, 25:402-405Masliah et al., (2005) Neuron, 46(6), 857-68Muhs et al., (2007) Proc Natl Acad Sci USA, 104(23), 9810-5Muyllaert et al, (2006) Rev Neurol, 162(10), 903-907Muyllaert et al, (2008) Genes Brain Behav., Suppl, 1, 57-66Nicolau et. al, (2002) Proc Natl. Acad. Sci USA 99, 2332-2337Nicoll et al., (2003) Nature Med, 9, 448-452Oddo et al., (2004) Neuron, 43, 321-332Queen et ail.,(1989) Proc. Natl Acad Sci USA, 86:1002910032Ribe et al., (2005) Neurobiol Ds, 20(3). 814722Roberson et al, (2007) Science, 316 (5825), 750-4Rosenmann et al., (2006) Arch Neurol, 63(10), 1459-67Rousseaux et al. Methods Enzymology, (1986), AcademicPress 121:663-69Terwel et al., (2006) J Biol Chem, 280, 3963-3973Terwel et al, (2008) Am J pathol., 172(3), 786-98Urushitiani et al., (2007) Pros. Natl Acad Sci USA, 104(79, 2495-500Wagner et al (2002) Journal of Liposome Research Vol 12(3), pp 259-270Depósitos:As seguintes linhas celulares de hibridomas foram depositadasno mesmo nome de AC IMMUNE S.A. com o "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Inhoffenstr. 7B, D-28124 Braunschweig, sob as cláusulas do Budapest Treaty:
Figure img0020

Claims (14)

1. Peptídeo antigênico caracterizado pelo fato de ser modificado (a) através da ligação a uma fração lipofílica ou hidrofóbica que facilita a inserção na bicamada lipídica de um lipossoma e (b) por reconstituição em um lipossoma de modo que o peptídeo seja apresentado na superfície do lipossoma, em que o referido peptídeo tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de o grupo que consiste nas sequências mostradas na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 9.
2. Peptídeo antigênico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração lipofílica ou hidrofóbica é um ácido graxo, um triglicerídeo ou um fosfolipídeo.
3. Peptídeo antigênico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a porção lipofílica ou hidrofóbica é um ácido graxo, um triglicerídeo ou um fosfolipídeo contendo uma cadeia de carbono entre C10 e C24.
4. Peptídeo antigênico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a porção lipofílica ou hidrofóbica é um ácido palmítico.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 4 ou uma combinação dos mesmos, em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende um adjuvante e/ou imunomodulador farmaceuticamente aceitáveis.
7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é monofosforil Lipídeo A.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é uma vacina compreendendo um peptídeo da SEQ ID NO: 5, que é tetrapalmitoilado e monofosforil Lipídeo A.
9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de um distúrbio neurodegenerativo.
10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de uma tauopatia.
11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante na tauopatia compreendendo um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos incluindo doenças ou distúrbios que mostram a coexistência de tau e patologias amilóides que incluem, mas não limita-se a, Mal de Alzheimer, Doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilistica, Síndrome de Down, Doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite de corpo de inclusão e angiopatia amilóide cerebral de proteína priônica, dano cerebral traumático e doenças ou distúrbios adicionais que não apresentam uma patologia amilóide distinta que inclui mas não limita-se a, complexo de esclerose lateral amiotrófica/Demência do parkinsonismo de Guam, Doença de neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência do grão angirofílico, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de sistema múltiplo, doença de Niemann-Pick, tipo C, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo Pós-encefálico, Distrofia Miotônica..
12. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento da doença de Alzheimer.
13. Uso do peptídeo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 ou uma combinação dos mesmos, ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para uso no tratamento dea. um distúrbio neurodegenerativo;b. doenças e distúrbios que são causados por ou associados com a formação de lesões neurofibrilares e que mostram co-existência de tau e patologias amiloides; ouc. Mal de Alzheimer, Doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilistica, Síndrome de Down, Doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite de corpo de inclusão e angiopatia amilóide cerebral de proteína priônica, dano cerebral traumático e doenças ou distúrbios adicionais que não apresentam uma patologia amilóide distinta que inclui mas não limita-se a, complexo de esclerose lateral amiotrófica/Demência do parkinsonismo de Guam, Doença de neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência do grão angirofílico, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de sistema múltiplo, doença de Niemann-Pick, tipo C, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo Pós-encefálico, Distrofia Miotônica.
14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar Mal de Alzheimer.
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