PT2413957T - Composição farmacêutica - Google Patents

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PT2413957T
PT2413957T PT107131724T PT10713172T PT2413957T PT 2413957 T PT2413957 T PT 2413957T PT 107131724 T PT107131724 T PT 107131724T PT 10713172 T PT10713172 T PT 10713172T PT 2413957 T PT2413957 T PT 2413957T
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aci
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mice
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Pfeifer Andrea
Muhs Andreas
Van Leuven Fred
Pihlgren Bosch Maria
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Univ Leuven Kath
Ac Immune Sa
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Description

DESCRIQAO "COMPOSIQAO FARMACEUTICA" A presente invengao diz respeito a metodos e composigdes para utilizagao terapeutica e diagndstica no tratamento de doengas e distdrbios que sao causada(o)s por ou associada(o)s a emaranhados neurofibrilares. Em particular, a presente invengao refere-se a metodos e composigdes para utilizagao terapeutica e diagnostica no tratamento de tauopatias (ou taupatias) incluindo a Doenga de Alzheimer [(AD) Alzheimer's Disease].
Emaranhados neurofibrilares sao na AD uma caracteristica neuropatologica major. Esses emaranhados originam-se pela agregagao de proteina Tau hiperfosforilada e seus conformeros. A AD comparte essa patologia com muitas tauopatias neurodegenerativas, em particular com tipos especificos de demencia frontotemporal [ (FTD) frontotemporal dementia].
Tau e uma proteina muito soldvel, "naturalmente desenrolada" que se liga avidamente aos microthbulos (MT) para promover a montagem (assembly) e a estabilidade dos mesmos. Os MT sao de uma importancia major para a integridade do citoesqueleto dos neuronios - e assim para a formagao adequada e o funcionamento correcto dos circuitos neuronais, consequentemente, para a aprendizagem e memoria. A ligagao da tau aos MT (microtdbulos) e controlada por fosforilagao e desfosforilagao dinamicas, como demonstrado principalmente in vitro e em celulas nao neuronais. Devido ao grande ndmero de possiveis sitios de fosforilagao (>80), a exacta contribuigao de cada um, e a identidade das cinases (ou quinases) responsaveis permanece em grande parte indefinida in vivo.
No cerebro com AD (Doenga de Alzheimer) a patologia tau desenvolve-se mais tarde do que a patologia amiloide, e por conseguinte provavelmente em resposta a esta hltirna, isto e, a patologia amiloide que constitui a essencia da hipdtese da cascata amiloide. Isto baseia-se e surge em estudos sobre a AD e pacientes com sindrome de Down, e e corroborado por estudos em murganhos transgenicos com patologias amiloide e tau associadas (Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al., 2006; 2008; Terwel et al., 2008) . 0 momento exacto de ambas as patologias em pacientes humanos com AD bem como os mecanismos que ligam a patologia amiloide a patologia tau permanecem em grande parte desconhecidos, mas propde-se a implicagao da activagao de vias de sinalizagao neuronais que actuam em ou atraves de GSK3 e cdk5 como as "tau-cinases" major (revisto por Muyllaert et al., 2006, 2008). A hipotese de que na AD a tauopatia nao e um efeito colateral inocente mas um executor patologico major baseia-se em observagdes geneticas, patoldgicas e experimentais fundamentadas que corroboram plenamente umas e outras: □ em casos de inicio precoce de AD familiar que sao devidos a mutagdes no precursor da proteina amiloide [(APP) amyloid protein precursor] ou nas presenilinas, a causa patogenica obrigatoria e a acumulagao de proteina amiloide, mas invariavelmente a patologia compreende uma tauopatia colateral, identica a dos casos de inicio tardio de AD esporadica, □ a gravidade da disfungao cognitiva e da demencia correlacionam-se com uma tauopatia, nao com a patologia amiloide, exemplificada mais recentemente por varios ensaios clinicos fases 1 & 2 que incluem imagem por PIB-PET [Imagem por tomografia por emissao de positrbes (PET) que utiliza o radiofarmaco 11C-PIB (Pittsburg compound B)] da proteina amiloide e identificam muitos "falsos positivos": individuos normais sob o ponto de vista cognitivo com elevada carga amiloide cerebral. □ na FTD familiar, a tauopatia e provocada pela tau mutante e causa neurodegeneragao directamente, sem patologia amiloide □ em modelos experimentais murinos os defeitos cognitivos causados pela patologia amiloide sao quase completamente atenuados pela ausencia de proteina tau (Roberson et al., 2007).
Os argumentos associados suportam a hipotese de que a proteina tau e uma interveniente major no declinio cognitivo na AD e em tauopatias neurodegenerativas relacionadas.
Urn proeminente tratamento emergente da AD e a imunoterapia passiva com anticorpos monoclonais (mAbs) especificos, para "limpar" (clear) os peptidos amiloides e seus agregados que se presume serem neurotoxicos ou sinaptotoxicos . A imunoterapia que visa a patologia tau, tal como proposta na presente invengao, esta prevista neutralizar os conformeros patologicos dessa proteina tau que se sabe ou se pressupde causarem neurodegeneragao. Suspeita-se que a patologia amiloide no caso de sequela na AD e agregados intraneuronais de proteina tau hiperfosforilada actuam sinergicamente na cascata cognitiva e degenerativa de eventos patologicos que levam do comprometimento cognitivo leve [(MCI) mild cognitive impairment] a demencia grave na AD. A associagao de medicagao (nenhuma outra) orientada para a proteina tau com a orientada para a proteina amiloide constituira o tratamento preferido da AD e, principalmente o mais eficaz.
Outras abordagens terapeuticas que visam a proteina tau sao escassas e compreendem principalmente: □ inibidores das cinases que se acredita aumentarem a fosforilagao da proteina tau para niveis patologicos □ compostos que bloqueiam a agregagao citoplasmatica da proteina tau hiperfosforilada.
Essas abordagens apresentam varias desvantagens de especificidade e eficacia, urn problems que compartilham com tentativas para modificar o metabolismo do precursor da proteina amiloide [(APP) amyloid protein precursor] e da proteina amiloide, todas enfatizando a importancia de uma busca continua de mais opgdes de tratamento, incluindo a imunoterapia contra a proteina tau.
De facto nao se dispensou qualquer esforgo a definir - e muito menos a fixar como objectivo - os conformeros patologicos da proteina tau in vivo. No ensaio clinico de fase II sobre Αβ42 (proteina amiloide β42), a patologia de emaranhados nao pareceu ser satisfatoriamente estudada nem analisada em grande profundidade (Nicoll et al., 2003; Masliah et al., 2005) . Por outro lado, a imunoterapia experimental que visa a proteina amiloide em urn modelo murino pre-clinico com patologia associada como a da AD demonstrou tambem urn efeito sobre a patologia tau embora os agregados tau persistam (Oddo et al., 2004) .
Sobre a viabilidade de se atingir a proteina intracelular tau por imunoterapia langaram-se algumas diividas. Essas duvidas foram combatidas pelo mais recente estudo experimental em urn modelo murino de tauopatia por Asuni e colegas (Asuni et al., 2007). Eles mostraram redugao na patologia de emaranhados e melhorias funcionais por vacinagao com urn fosfopeptido derivado da proteina tau. Esses dados corroboram relatos previos de imunoterapia visando (targeting) a proteina α-sinucleina em urn modelo da doenga de Parkinson [(PD) Parkinson's disease] (Masliah et al., 2005) e de superoxido dismutase em urn modelo de esclerose lateral amiotrofica [(ALS) amyotrophic lateral sclerosis] (Urushitiani et al., 2007) . Essas duas doengas sao exemplos de proteinas intracelulares que conduzem a neurodegeneragao por mecanismos ainda nao totalmente compreendidos. Por outro lado, a proteina tau recombinante completa (full-length) produzida em bacterias e isolada a partir das mesmas nao parece adequada como vacina, embora os adjuvantes utilizados, isto e adjuvante de Freund completo e toxina pertussis, possam ter contribuido para o resultado negativo daquele estudo (Rosenmann et al., 2006). A publicagao do pedido da patente de invengao norte-ame-ricana US 2008/050383 Al (Sigurdsson et al.) descreve urn metodo de prevengao e de tratamento da doenga de Alzheimer e de inibigao da acumulagao de emaranhados neurofibrilares de proteina tau em um paciente por administragao de uma proteina tau, seus epitopos imunogenicos, ou anticorpos que reconhecem a proteina Tau ou seus epitopos imunogenicos em condigoes eficazes para tratar ou prevenir a doenga de Alzheimer ou de outras tauopatias. A publicagao do pedido da patente de invengao internacional WO 96/20218 Al (Ghanbari et al.) descreve um antigenio, a sua purificagao e um metodo para o detectar em individuos com doenga de Alzheimer como um metodo de diagnostico. A publicagao do pedido da patente de invengao internacional WO 2005/080986 Al (Lee et al.) descreve o desenvolvimento de novas composigoes e metodos adequados para detectar proteina tau anormal em pessoas com DA, proporcionando ainda um metodo para a produgao de um anticorpo contra a referida proteina. A publicagao do pedido da patente de invengao norte-ame-ricana US 2005/261475 Al (Tseng et al.) descreve um novo metodo com base quimica de "capture-release-tag" para o isolamento de, por exemplo, peptidos que contem o complexo fosforo-Ser/Thr por β-eliminagao liquida em associagao com uma reacgao de adigao de Michael em fase solida, por exemplo para efeitos de enriquecimento em fosfopeptidos. A publicagao do pedido da patente de invengao internacional WO 2007/068105 Al (Strong et al.) descreve a identificagao de um novo biomarcador pThrl75-Tau para o diagnostico da doenga neurodegenerativa dependente da idade a esclerose lateral amiotrofica (ALS), bem como anticorpos selectivos para o biomarcador. A publicagao do pedido da patente de invengao internacional WO 98/22120 A1 (Otvos et al.) descreve de um modo geral composigoes, que contem, por exemplo, peptidos resultantes da proteina tau, hteis no diagnostico da doenga de Alzheimer, metodos de produgao dos mesmos utilizando tecnicas de sintese. Assim, os peptidos podem originar-se de acordo com procedimentos padrao utilizando um sintetizador automatico disponivel no comercio. A publicagao do pedido da patente de invengao norte-ame-ricana US 5843779 A (Vandermeeren et al.) descreve novos anticorpos monoclonais dirigidos contra a proteina tau humana associada a microthbulos. 0 anticorpo e produzido por hibridomas que segregam esses anticorpos monoclonais. Alem disso, a utilizagao desses anticorpos monoclonais e descrita, por exemplo, em um processo para diagnosticar doengas cerebrais que inclui o epitopo especifico (da proteina tau) que e reconhecido pelos referidos anticorpos monoclonais. A publicagao do pedido da patente de invengao norte-americana US 2002/086009 Al (Ishiguro et al.) apresenta anticorpos contra um peptido parcial que contem sitios de fosforilagao da proteina Tau fosforilada no filamento helicoidal emparelhado, um kit de reagentes contendo o mesmo, e metodos para a detecgao da doenga de Alzheimer utilizando os anticorpos ou o kit. A publicagao do pedido da patente de invengao internacional WO 97/34145 Al (Ishiguro et al.) descreve a preparagao de um anticorpo, utilizando como um imunogenio um peptido parcial que contem o sitio fosforilado de uma proteina tau fosforilada no filamento helicoidal emparelhado. Depois, examina-se a reactividade do anticorpo assim obtido com amostras provenientes de individuos com suspeita de doenga de Alzheimer, para desse modo detectar a doenga.
Existe a necessidade nao satisfeita de imunoterapias passivas e/ou activas que exergam a fungao de neutralizagao de conformeros patologicos de proteinas que sao conhecidos por causarem - ou presume-se que causam - distdrbios neurodegenerativos, como patologia amiloide em DA causada, por exemplo, por agregados intraneuronais de proteina tau hiperfosforilada que sao tao caracteristicos da DA como os da proteina amiloide.
Essa necessidade nao satisfeita poderia ser satisfeita no ambito da presente invengao proporcionando metodos de imunizagao passiva e activa utilizando vacinas com base em lipossomas (Nicolau et al., 2002; Muhs et al., 2007) e anticorpos monoclonais (mAbs) baseados em fosfopeptidos que imitam fosfoepitopos patologicos major da proteina tau. Essas acgoes associadas geram novos mAbs especificos contra fosfoepitopos lineares e conformacionais, simples e complexos da proteina tau que se pensa serem responsaveis por sinaptotoxicidade e neurotoxicidade em tauopatias, incluindo a DA. A presente descrigao proporciona metodos e peptidos antigenicos de acordo com a presente invengao e tal como descritos na mesma e seus fragmentos funcionais incluindo composigoes que contem os referidos peptidos antigenicos ou seus fragmentos para fazer surgir em urn organismo uma resposta imunitaria muito especifica, especialmente uma especifica conformagao, mais especificamente em urn animal, principalmente um mamifero ou um humano, que e altamente eficaz e capaz de prevenir ou aliviar tauopatias, ou os sintomas associados a tauopatias, um grupo de doengas e desordens associadas a formagao de lesoes neurofibrilares, a patologia cerebral predominante nesse grupo de desordens neurodegenerativas. A presente descrigao tambem se refere a anticorpos, em particular anticorpos monoclonais, incluindo as suas partes funcionais, e composigoes farmaceuticas que contem os referidos anticorpos, que resultam da altamente especifica resposta imunitaria, particularmente da conformagao especifica, em um organismo apos a administragao do peptido antigenico de acordo com a presente invengao e tal como descrito na mesma invengao ou de um seu fragmento funcional e a composigoes que contem o referido peptido antigenico ou um seu fragmento, para prevenir ou aliviar tauopatias, ou os sintomas associados a tauopatias, um grupo de doengas e distiirbios associados com a formagao de lesoes neurofibrilares, a patologia cerebral predominante neste grupo de doengas neurodegenerativas. 0 ambito da presente invengao define-se pelo conteiido das reivindicagoes.
Por conseguinte, a presente invengao refere-se a um peptido antigenico modificado (a) atraves de ligagao a um fragmento lipofilico ou hidrofobico que facilita a insergao na bicamada lipidica de um lipossoma e (b) por reconstituigao em um lipossoma de modo a que o peptido se apresente sobre a superficie do lipossoma, em que o referido peptido apresenta uma sequencia de aminoacidos escolhida no grupo constituido pelas sequencias apresentadas em SEQ ID N2 2, SEQ ID N2 3, SEQ ID N2 4, SEQ ID N2 5, SEQ ID N2 6, SEQ ID N2 7, SEQ ID N2 8, e SEQ ID N2 9, mas especialmente a um peptido antigenico que possui a sequencia de aminoacidos como apresentada em SEQ ID N2 5. 0 fragmento lipofilico ou hidrofobico do peptido antigenico pode ser um acido gordo, um triglicerido, ou um fosfolipido, especialmente um acido gordo, um triglicerido, ou um fosfolipido que contem uma cadeia de carbono de entre Cio a C24, mas especialmente um acido palmitico. A presente invengao refere-se ainda ao peptido antigenico tal como definido antes, ou a uma sua associagao, para utilizagao no tratamento de distdrbios neurodegenerativos, especialmente para utilizagao no tratamento de tauopatias, principalmente para utilizagao no tratamento da Doenga de Alzheimer. A presente invengao refere-se ainda a uma composigao farmaceutica que contem o peptido antigenico como definido antes, ou uma sua associagao, juntamente com um veiculo ("carrier") aceitavel sob o ponto de vista farmaceutico. A composigao farmaceutica pode conter ainda um adjuvante e/ou imunomodulador aceitaveis/aceitavel sob o ponto de vista farmaceutico, especialmente o adjuvante Lipido A monofosforilo.
Em especial, a presente invengao refere-se a composigao farmaceutica como definida antes, que compreende o peptido antigenico de SEQ ID N2 5, que e tetrapalmitoilado e e o Lipido A monofosforilo. A presente invengao refere-se ainda a composigao farmaceutica como definida antes para utilizagao no tratamento de um disthrbio neurodegenerat ivo, em especial para utilizagao no tratamento de tauopatias, principalmente para utilizagao no tratamento de doengas e de distiirbios que sao causada(o)s pela formagao de lesoes neurofibrilares ou estao associada(o)s a essa formagao, a patologia cerebral predominante em tauopatias que compreendem um grupo heterogeneo de doengas ou de distiirbios neurodegenerativa (o) s que incluem doengas ou distiirbios que apresentam coexistencia de patologias tau e amiloides incluindo, mas nao se limitando a, Doenga de Alzheimer, doenga de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilistica, Sindrome de Down, doenga de Gerstmann-Straussler--Scheinker, miosite de corpos de inclusao, e angiopatia amiloide cerebral causada por proteina prionica, lesao cerebral traumatica e outras doengas ou distiirbios que nao apresentam uma patologia amiloide distinta incluindo, mas nao se limitando a, complexo esclerose lateral amiotrofica/parkinsonismo-demencia de Guam, doenga do neuronio motor nao guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demencia do grao argirofilico, degeneragao corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificagao, demencia frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, doenga de Hallevorden-Spatz, atrofia de mhltiplos sistemas, doenga de Niemann-Pick tipo C, doenga de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, Panencefalite esclerosante subaguda, demencia senil do tipo caracterizado por emaranhados neurofibrilares (Tangle only dementia),
Parkinsonismo pos-encefalitico, Distrofia miotonica, especialmente para utilizagao no tratamento da Doenga de Alzheimer. A presente invengao refere-se ainda a um metodo de utilizagao do peptido ou do fragmento antigenico como definido antes ou de uma sua associagao, ou a composigao farmaceutica como definida antes, para a preparagao de um medicamento para utilizagao no tratamento de i. um distdrbio neurodegenerativo; ii. doengas e disthrbios gue sao causada (o) s pela formagao de lesbes neurofibrilares ou estao associada(o)s a essa formagao e gue apresentam coexistencia de patologias tau e amiloides; ou iii. Doenga de Alzheimer, doenga de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilistica, Sindrome de Down, doenga de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusao, e angiopatia amiloide cerebral causada por proteina prionica, lesao cerebral traumatica e outras doengas ou disthrbios que nao apresentam uma patologia amiloide distinta incluindo, mas nao se limitando a, complexo esclerose lateral amiotrofica/parkinsonismo-de-mencia de Guam, doenga do neuronio motor nao guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demencia do grao argirofilico, degeneragao corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificagao, demencia frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, doenga de Hallevorden-Spatz, atrofia de multiplos sistemas, doenga de Niemann-Pick tipo C, doenga de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, Panencefalite esclerosante subaguda, demencia senil do tipo caracterizado por emaranhados neurofibrilares (Tangle only dementia), Parkinsonismo pos-encefalitico, Distrofia miotonica, mas especialmente para utilizagao no tratamento da Doenga de Alzheimer.
Toda e qualquer exposigao seguinte sobre o assunto que e mais vasto do que o reivindicado ou qualquer referenda a presente invengao ou aos aspectos ou as formas de realizagao da mesma invengao, que excedam o ambito dessa invengao tal como representada pelas reivindicagoes nao fazem parte da invengao mas representam informagao sobre os antecedentes apenas litil para a compreensao da mesma.
Esse grupo de doengas neurodegenerativas pode subdividir-se em duas subcategorias. Em uma primeira categoria incluem-se doengas ou distiirbios que mostram a co--existencia de patologias tau e amiloide incluindo, mas nao se limitando a, Doenga de Alzheimer, doenga de Creutzfeldt--Jacob, Demencia pugilistica, Sindrome de Down, doenga de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusao, angiopatia amiloide cerebral causada por proteina prionica, e lesao cerebral traumatica.
Em uma segunda categoria incluem-se doengas ou distiirbios sem patologia amiloide distinta incluindo, mas nao se limitando a, complexo esclerose lateral amiotrofica/parkinsonismo-demencia de Guam, demencia do grao argirofilico, degeneragao corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificagao, demencia frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, doenga de Hallevorden-Spatz, atrofia de mtltiplos sistemas, doenga de Niemann-Pick tipo C, doenga de Pick, gliose subcortical progressiva, Panencefalite supranuclear progressiva .
Em particular, a presente descrigao refere-se a processos e composigtes farmaceuticas que contem os peptidos antigenicos de acordo com a presente invengao e tal como descritos na mesma descrigao ou seus fragmentos funcionais e anticorpos, em particular anticorpos monoclonais, incluindo as suas partes funcionais que se podem obter depois da administragao dos peptidos antigenicos de acordo com a presente invengao e tal como descritos na mesma descrigao ou seus fragmentos funcionais a urn animal hospedeiro, para manter ou melhorar, mas especialmente para o restabelecimento, mais particularmente para restaurar completamente a capacidade da membria cognitiva em urn mamifero, especialmente urn humano, afectado por uma doenga ou disturbio associada(o) a formagao de lesoes neurofibrilares.
Constitui urn objectivo da presente invengao proporcionar urn peptido antigenico, especialmente urn peptido antigenico modificado ou urn seu fragmento funcional e composigoes farmaceuticas que contem o referido peptido antigenico ou urn seu fragmento funcional, peptido que se obtem a partir de uma proteina tau. Especificamente, a presente invengao refere-se a urn peptido antigenico, especialmente a urn fosfopeptido antigenico, ou a urn seu fragmento funcional, que mimetiza urn fosfoepitopo patologico major da proteina tau, cujo peptido ou fragmento e posteriormente modificado atraves de fixagao a urn transportador ou suporte ("carrier") ou reconstituigao em urn veiculo ("carrier") , uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou urn seu fragmento funcional e urn processo de produgao de urn tal peptido ou de um seu fragmento funcional e uma composigao farmaceutica, respectivamente, para o tratamento de doengas e distiirbios que sao causada(o)s pela formagao de lesbes neurofibrilares ou estao associada(o)s a essa formagao, a patologia cerebral predominante em tauopatia que formam um grupo heterogeneo de doengas ou de disturbios neurodegenerativa (o)s incluindo doengas ou distiirbios que demonstram a coexistencia de patologias tau e amiloide, bem como, mas nao se limitando a, Doenga de Alzheimer, doenga de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilistica, Sindrome de Down, doenga de Gerstmann-Straussler--Scheinker, miosite de corpos de inclusao, angiopatia amiloide cerebral causada por proteina prionica, e lesao cerebral traumatica e outras doengas ou distiirbios que nao apresentem uma patologia amiloide distinta, incluindo, mas nao se limitando a, complexo esclerose lateral amiotrofica/parkinsonismo-demencia de Guam, doenga do neuronio motor nao guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demencia do grao argirofilico, degeneragao corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificagao, demencia frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, doenga de Hallevorden-Spatz, atrofia de multiplos sistemas, doenga de Niemann-Pick tipo C, doenga de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, Panencefalite esclerosante subaguda, demencia senil do tipo caracterizado por emaranhados neurofibrilares (Tangle only dementia), Parkinsonismo pos-encefalitico, Distrofia miotonica.
Em uma forma de realizagao, a presente descrigao refere--se a urn peptido antigenico ou urn seu fragmento funcional e a composig0es farmaceuticas que contem o referido peptido antigenico ou urn seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que compreende entre 5 restos de aminoacidos e 30 restos de aminoacidos, particularmente entre 10 restos de aminoacidos e 25 restos de aminoacidos, principalmente entre 12 restos de aminoacidos e 22 restos de aminoacidos, especificamente entre 14 restos de aminoacidos e 20 restos de aminoacidos, especialmente entre 16 restos de aminoacidos e 18 restos de aminoacidos, respectivamente, de uma sequencia de aminoacidos escolhida no grupo de sequencias representadas por SEQ ID N2 : 2, SEQ ID N2 : 3, SEQ ID N2 : 4, SEQ ID N2 : 5, SEQ ID N2: 6, SEQ ID N2: 7, SEQ ID N2: 8, e SEQ ID N2: 9, em que as referidas sequencias apresentam um padrao de fosforilagao caracteristico que esta associado a uma situagao ou distiirbio patologica/patologico particularmente uma situagao ou distdrbio associada/associado a formagao de lesdes neurofibrilares. A presente descrigao refere-se a uma molecula de acido nucleico ou seus fragmentos que codificam o peptido antigenico ou um seu fragmento funcional escolhido no grupo de sequencias representadas por SEQ ID N2: 2, SEQ ID N2: 3, SEQ ID N2: 4, SEQ ID N2 : 5, SEQ ID N2 : 6, SEQ ID N2 : 7, SEQ ID N2 : 8, e SEQ ID P: 9. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, especificamente a um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos que manifesta pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, principalmente pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, especialmente pelo menos 98%, sobretudo pelo menos 99%, de identidade de sequencia com a sequencia representada em SEQ ID NO: 2 e tern praticamente a mesma actividade imunogenica que o referido peptido antigenico de SEQ ID NO: 2, em que o resto de aminoacidos que corresponde ao resto do aminoacido 18 (PTyri8) de SEQ ID NO: 2 e fosforilado (Tl) . A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular a um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou urn seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos como representada em SEQ ID NO: 2, em que o resto do aminoacido 18 (P-Tyris) e fosforilado (Tl) . A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos que manifesta pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, principalmente pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, especialmente pelo menos 98%, sobretudo pelo menos 99%, de identidade de sequencia com as sequencias representadas em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente, e tem praticamente a mesma actividade imunogenica que o referido peptido antigenico de SEQ ID NO: 3, em que pelo menos um, em particular pelo menos 2, principalmente pelo menos 3, mas em especial todos os restos de aminoacidos correspondentes aos restos de aminoacidos 202 (P-Ser2o2) , 205 (P-Thr2os) , 212 (P--Thr2i2), e 214 (P-Ser2i4) de SEQ ID NO: 3 e 4, respectivamente, sao fosforilados. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que exibe uma sequencia de aminoacidos tal como a representada nas SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente, em que pelo menos um, em particular pelo menos 2, principalmente pelo menos 3, mas em especial todos os restos de aminoacidos 202 (P-Ser2o2) , 205 (P-Thr205 ) , 212 (P-Thr2i2) , e 214 (P-Ser2i4) sao fosforilados. A presente descrigao refere-se a urn peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos que manifesta pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, principalmente pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, especialmente pelo menos 98%, sobretudo pelo menos 99%, de identidade de sequencia com a sequencia representada em SEQ ID NO: 4 e tern praticamente a mesma actividade imunogenica que o referido peptido antigenico de SEQ ID NO: 4, em que pelo menos um, em particular pelo menos 2 dos restos de aminoacidos que correspondem aos restos de aminoacidos 202 (P-Ser202) , e 205 (P-Thr2os) de SEQ ID NO: 4 sao fosforilados. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos como representada em SEQ ID NO: 4, em que pelo menos um, em particular pelo menos 2 dos restos de aminoacidos 202 (P--Ser202) , e 205 (P-Thr205 ) sao f osf orilados. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos que manifesta pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, principalmente pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, especialmente pelo menos 98%, sobretudo pelo menos 99%, de identidade de sequencia com a sequencia representada em SEQ ID NO: 3 e tern praticamente a mesma actividade imunogenica que o referido peptido antigenico de SEQ ID NO: 3, em que pelo menos um, em particular pelo menos 2 dos restos de aminoacidos que corresponded! aos restos de aminoacidos 212 (P-Thr2i2) e 214 (P-Ser2i4) de SEQ ID NO: 3 sao fosforilados. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos como representada em SEQ ID NO: 3, em que pelo menos um, em particular pelo menos 2 dos restos de aminoacidos 212 (P--Thr212) e 214 (P-Ser2i4) sao f osf orilados. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos que manifesta pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, principalmente pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, especialmente pelo menos 98%, sobretudo pelo menos 99%, de identidade de sequencia com a sequencia representada em SEQ ID NO: 5 e tem praticamente a mesma actividade imunogenica que o referido peptido antigenico de SEQ ID NO: 5, em que pelo menos urn, mas especialmente todos os restos de aminoacidos que correspondem aos restos de aminoacidos 396 (P-Ser396) e 404 (P-Ser404) de SEQ ID NO: 5 sao fosforilados. A presente descrigao refere-se a urn peptido antigenico, em particular urn peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou urn seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou urn seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos como a representada em SEQ ID NO: 5, em que pelo menos urn, mas especialmente todos os restos de aminoacidos 396 (P-Ser395) e 404 (P-Ser404 ) sao f osf orilados . A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos que manifesta pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, principalmente pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, especialmente pelo menos 98%, sobretudo pelo menos 99%, de identidade de sequencia com a sequencia representada em SEQ ID NO: 6 e tem praticamente a mesma actividade imunogenica que o referido peptido antigenico de SEQ ID NO: 6, em que pelo menos um, mas especialmente todos os restos de aminoacidos que correspondem aos restos de aminoacidos 404 (P-Ser404) e 409 (P-Ser409) de SEQ ID NO: 6 sao f osf orilados. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos como representada em SEQ ID N2: 6, em que pelo menos um, mas especialmente todos os restos de aminoacidos 404 (P-Ser404 ) e 409 (P-Ser4o9) sao fosforilados . A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos que manifesta pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, principalmente pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, especialmente pelo menos 98%, sobretudo pelo menos 99%, de identidade de sequencia com a sequencia representada em SEQ ID NO: 7 e tern praticamente a mesma actividade imunogenica que o referido peptido antigenico de SEQ ID NO: 7, em que pelo menos um, em particular pelo menos 2, principalmente pelo menos 3, mas em especial todos os restos de aminoacidos que correspondem aos restos de aminoacidos 202 (P-Ser202), 205 (P-Thr205) , 212 (P-Thr2i2) , e 214 (P-Ser2i4) de SEQ ID N2: 7 sao fosforilados. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende 0 referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos como a representada em SEQ ID N2 : 7, em que pelo menos um, em particular pelo menos 2, principalmente pelo menos 3, mas em especial todos os restos de aminoacidos 202 (P-Ser202) » 205 (P-Thr205) , 212 (P-Thr2i2) , e 214 (P-Ser2i4) sao fosf orilados. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos que manifests pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, principalmente pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, especialmente pelo menos 98%, sobretudo pelo menos 99%, de identidade de sequencia com a sequencia representada em SEQ ID N2: 8 e tern praticamente a mesma actividade imunogenica que o referido peptido antigenico de SEQ ID N2: 8, em que o resto de aminoacidos que corresponde ao resto de aminoacidos 409 (P-Ser409 ) de SEQ ID N2: 8 e fosforilado. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos como a representada em SEQ ID N2: 8, em que o resto de aminoacidos que corresponde ao resto de aminoacidos 409 (P-Ser409 ) de SEQ ID N2: 8 e fosforilado. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos que manifesta pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, principalmente pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, especialmente pelo menos 98%, sobretudo pelo menos 99%, de identidade de sequencia com a sequencia representada em SEQ ID N2 : 9 e tern praticamente a mesma actividade imunogenica que o referido peptido antigenico de SEQ ID N2: 9, em que o resto de aminoacidos que corresponde ao resto de aminoacidos 404 (P-Ser404 ) de SEQ ID N2: 9 e fosforilado. A presente descrigao refere-se a um peptido antigenico, em particular um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao, ou um seu fragmento funcional e a uma composigao farmaceutica que compreende o referido peptido antigenico ou um seu fragmento funcional, peptido ou fragmento que apresenta uma sequencia de aminoacidos como a representada em SEQ ID N2: 9, em que o resto de aminoacidos que corresponde ao resto de aminoacidos 404 (P-Ser404) de SEQ ID N2: 9 e fosforilado. A presente descrigao abrange tambem um peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao ou um seu fragmento funcional e composigdes farmaceuticas que contem o referido peptido antigenico modificado ou um seu fragmento funcional, peptido que e essencialmente identico aos peptidos antigenicos referidos antes, como apresentado na SEQ ID N2: 2 a 9 e que tern praticamente a mesma actividade imunogenica dos peptidos antigenicos referidos das SEQ ID N2: 2 a 9, mas em particular uma variante do fragmento do peptido que e uma variante conservativamente modificada dos referidos fragmentos, em que as alteragoes surgem da substituigao de um ou mais aminoacido(s), em particular de entre um a 10 aminoacidos, mais particularmente de entre um a 6 aminoacidos, ainda mais especificamente de entre um a 4 aminoacidos, mas sobretudo de entre um a 3 aminoacidos, com um aminoacido similar sob o ponto de vista quimico. Na arte conhecem-se bem tabelas de substituigao conservative descritas seguidamente na presente descrigao que proporcionam aminoacidos similares sob o ponto de vista funcional. A substituigao conservative realiza-se de preferencia de tal modo que a carga liquida total do peptido e tambem a distribuigao da carga atraves da molecula peptidica permanece essencialmente a mesma. A presente descrigao abrange tambem uma variante de um fragmento de um peptido, especialmente uma variante do peptido antigenico modificado de acordo com a presente invengao e uma composigao farmaceutica que contem a referida variante do fragmento do peptido, peptido que e essencialmente identico aos fragmentos da presente invengao identificados antes e tern praticamente a mesma actividade biologica que os referidos fragmentos, em que se eliminam um ou mais resto(s) de aminoacidos. 0 peptido de acordo com a presente descrigao ou um seu fragmento funcional apresenta-se sob a forma de um polimero escolhido no grupo constituido por um 2-mer, um 3-mer, um 4--mer, um 5-mer, um 6-mer, um 7-mer, um 8-mer, um 9-mer, um 10-mer, um 11-mer, um 12-mer, um 13-mer, um 14-mer, um 15--mer, um 16-mer, um 20-mer, um 30-mer, e um 50-mer, em que as unidades monomericas que constituem o referido polimero sao sempre identicas ou sao diferentes unidades monomericas e escolhidas no grupo constituido por um peptido de acordo com a invengao e tal como descrito na presente descrigao, especialmente um peptido tal como apresentado em SEQ ID N2: 2, SEQ ID N2: 3, SEQ ID N2: 4, SEQ ID N2: 5, SEQ ID N2: 6, SEQ ID N2: 7, SEQ ID N2: 8, e SEQ ID N2: 9, ou um seu fragmento funcional e peptidos variantes. 0 peptido antigenico de acordo com a presente descrigao e tal como descrito na presente invengao ou um seu fragmento funcional, e modificado atraves de fixagao a um transportador ou suporte {"carrier") ou reconstituigao em um veiculo {"carrier"), particularmente um veiculo gue apresenta tambem fungoes como adjuvante resultando uma construgao antigenica supramolecular. 0 peptido antigenico de acordo com a presente descrigao e tal como descrito na presente invengao ou um seu fragmento funcional, e modificado atraves de fixagao a um lipossoma ou reconstituigao em um lipossoma como para produzir uma "construgao antigenica supramolecular" como descrita na publicagao da patente de invengao internacional WO 2005/081872. 0 peptido antigenico ou um seu fragmento funcional modifica-se ainda de tal forma que exibe uma ilnica apresentagao do peptido antigenico sobre a superficie do transportador ou suporte {"carrier"), o que conduz a uma exposigao melhorada do antigenio e finalmente a geragao de anticorpos que apresentam um elevado grau de sensibilidade conformacional. Em particular, o peptido antigenico de acordo com a presente invengao e como descrito na presente descrigao modifica-se mediante associagao com um radical lipofilico ou hidrofobico, que facilita a insergao na bicamada lipidica do transportador lipossoma/adjuvante imunitario, especialmente utilizando um radical lipofilico ou hidrofobico que para o peptido funciona como uma ancora na bicamada do lipossoma e apresenta uma dimensao que leva o peptido a posicionar-se e estabilizar bem proximo da superficie do lipossoma.
Em uma outra forma de realizagao da presente invengao, o radical lipofilico ou hidrofobico e urn acido gordo, um triglicerido ou um fosfolipido, especialmente um acido gordo, um triglicerido ou um fosfolipido gue contem uma cadeia carbonada entre C12 e C24, mas especialmente um acido palmitico.
Apresenta-se um peptido antigenico de acordo com a presente descrigao e tal como descrito na presente invengao, ou um seu fragmento funcional, modificado por pelo menos duas moleculas de acido palmitico ligadas covalentemente as extremidades N-terminal e C-terminal do referido peptido antigenico ou de um seu fragmento funcional, e por reconstituigao em um veiculo ("carrier") lipossomico.
Nos conjugados os peptidos ou fragmentos estao acoplados, cada um, a quatro moleculas de acido palmitico; eles sao portanto tetrapalmitoilados.
Duas moleculas de acido palmitico sao acopladas a extremidade N-terminal e duas moleculas de acido palmitico sao acopladas a extremidade C-terminal do peptido ou do fragmento.
A presente descrigao proporciona um peptido antigenico de acordo com a presente invengao e tal como descrito na mesma descrigao, ou um seu fragmento funcional, modificado mediante associagao com um radical lipofilico ou hidrofobico como, por exemplo, acido palmitico e reconstituido em um lipossoma, em que a preparagao lipossomica podem conter adicionalmente um adjuvante como, por exemplo, lipido A, aliimen, fosfato de calcio, interleucina 1, e/ou microcapsulas de polissacaridos e proteinas, mas especialmente um lipido A purificado, como monofosforilo ou difosforilo lipido A, ou aliimen, surgindo uma construgao antigenica supramolecular. A presente descrigao refere-se a uma construgao supramolecular da presente invengao e tal como descrita na mesma descrigao, gue compreende por molecula transportadora ("carrier") urn ou mais peptido(s) antigenico(s), em particular dois ou mais peptidos antigenicos, de acordo com a presente invengao e tal como descrito na presente descrigao, ou urn seu fragmento funcional. A referida molecula transportadora ou de suporte ("carrier") e urn lipossoma.
Em urn aspecto, os dois ou mais peptidos antigenicos sao peptidos iguais ou diferentes, especialmente peptidos escolhidos no grupo constituido por SEQ ID N2 : 2, SEQ ID N2: 3, SEQ ID N2: 4, SEQ ID N2 : 5, SEQ ID N2 : 6, SEQ ID N2 : 7, SEQ ID N2: 8, e SEQ ID N2: 9 ou seus fragmentos funcionais e peptidos variantes. A presente descrigao refere-se a uma construgao supramolecular da presente invengao e tal como descrita na mesma descrigao, que compreende por molecula transportadora ou de suporte ("carrier") uma associagao de dois ou mais peptidos antigenicos de SEQ ID N2: 3 e SEQ ID N2: 4, ou seus fragmentos funcionais. A presente descrigao refere-se a urn anticorpo, especialmente a urn anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo que reconhece e se liga a urn conformero da proteina tau patologico fosforilado ou as partes do conformero que sao responsaveis pelas propriedades patologicas do referido conformero, especialmente um fosfoepitopo patologico da proteina tau.
Em particular, a presente descrigao proporciona um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo que reconhece e se liga a um conformero da proteina tau patologico fosforilado ou as partes do conformero que sao responsaveis pelas propriedades patologicas do referido conformero, especialmente um fosfoepitopo patologico da proteina tau, com uma elevada especificidade. 0 anticorpo, particularmente o anticorpo monoclonal que inclui qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais de acordo com a presente descrigao liga-se ao conformero patologico da proteina tau ou as partes do conformero que sao responsaveis pelas propriedades patologicas do referido conformero com uma afinidade que e pelo menos 40%, particularmente pelo menos 50%, principalmente pelo menos 60%, especificamente pelo menos 70%, especialmente pelo menos 80%, sobretudo pelo menos 90%, essencialmente pelo menos 95% e ate 100% maior do que a afinidade de ligagao do conformero da proteina tau nao patologico nao fosforilado.
Prepara-se um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais de acordo com a presente invengao que se liga especificamente a emaranhados neurofibrilares [(NFT) neurofibrillar tangles] e fios do neuropilo em cerebros humanos com Doenga de Alzheimer.
A presente descrigao proporciona anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais ou suas partes funcionais, que directamente e especificamente se ligam a urn epitopo na proteina tau, ou a uma associagao de epitopos, particularmente a urn epitopo especifico em urn conformero da proteina tau fosforilado, patologico, especialmente um fosfoepitopo patologico da proteina tau como, por exemplo, um epitopo como representado por ou incluido em uma sequencia peptidica escolhida no grupo de sequencias indicadas em SEQ ID N2 : 2, SEQ ID N2 : 3, SEQ ID N2 : 4, SEQ ID N2 : 5, SEQ ID N2: 6, SEQ ID N2 : 7, SEQ ID N2: 8, e SEQ ID N2 : 9 e seus fragmentos variantes.
Em particular, a presente descrigao proporciona um anticorpo incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais obtenivel por imunizagao de um animal adequado com um peptido antigenico, em particular uma composigao peptidica de acordo com a presente invengao e tal como descrito antes na presente descrigao, em particular uma composigao que contem um peptido antigenico que compreende uma sequencia de aminoacidos como indicada em SEQ ID N2: 2,
SEQ ID N2: 3, SEQ ID N2: 4, SEQ ID N2: 5, SEQ ID N2: 6, SEQ ID N2: 7, SEQ ID N2: 8, e SEQ ID N2: 9, incluindo um fragmento funcional ou um seu fragmento variante. A presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo esse que apresenta as propriedades caracteristicas de um anticorpo produzido pela linha de celulas de hibridoma ACl-41-Abl depositada em 03 de Margo de 2010 como DSM ACC3043. Mais especialmente, a presente descrigao refere-se a um anticorpo, principalmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais produzido por linha de celulas de hibridoma AC1--41-Abl depositada em 03 de Margo de 2010 como DSM ACC3043. A presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo esse que apresenta as propriedades caracteristicas de um anticorpo produzido pela linha de celulas de hibridoma 2B6 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3044.
Mais particularmente, a presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais produzido pela linha de celulas de hibridoma 2B6 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3044 . A presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo esse que apresenta as propriedades caracteristicas de um anticorpo produzido pela linha de celulas de hibridoma 3A8 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3045. A presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais produzido pela linha de celulas de hibridoma 3A8 deposit ada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3045. A presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo esse que apresenta as propriedades caracteristicas de um anticorpo produzido pela linha de celulas de hibridoma 4C1 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3046.
Mais particularmente, a presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais produzido pela linha de celulas de hibridoma 4C1 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3046. A presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo esse que apresenta as propriedades caracteristicas de um anticorpo produzido pela linha de celulas de hibridoma 5D10A3 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3047.
Mais particularmente, a presente invengao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais produzido pela linha de celulas de hibridoma 5D10A3 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3047. A presente descrigao refere-se a urn anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo esse que apresenta as propriedades caracteristicas de um anticorpo produzido pela linha de celulas de hibridoma 6C10 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3048.
Mais particularmente, a presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais produzido pela linha de celulas de hibridoma 6C10 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3048 . A presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo esse que apresenta as propriedades caracteristicas de um anticorpo produzido pela linha de celulas de hibridoma 6H1 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3049.
Mais particularmente, a presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais produzido pela linha de celulas de hibridoma 6H1 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3049. A presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais, anticorpo esse que apresenta as propriedades caracteristicas de um anticorpo produzido pela linha de celulas de hibridoma 7C2 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3050.
Mais particularmente, a presente descrigao refere-se a um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais produzido pela linha de celulas de hibridoma 7C2 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3050 . 0 anticorpo pode preparar-se sob a forma de um anticorpo quimerico ou um anticorpo humanizado exibindo ainda as caracteristicas de ligagao especificas como descritas antes. A presente descrigao refere-se a uma linha de celulas que produz um anticorpo de acordo com a presente invengao tal como descrito na presente descrigao. A presente descrigao refere-se a linha de celulas de hibridoma ACl-41-Abl depositada em 03 de Margo de 2010 como DSM ACC3043. A presente descrigao refere-se a linha de celulas de hibridoma 2B6 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3044 . A presente descrigao refere-se a linha de celulas de
hibridoma 3A8 deposit ada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3045. A presente descrigao refere-se a linha de celulas de
hibridoma 4C1 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3046. A presente descrigao refere-se a linha de celulas de hibridoma 5D10A3 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3047. A presente descrigao refere-se a linha de celulas de
hibridoma 6C10 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3048. A presente descrigao refere-se a linha de celulas de
hibridoma 6H1 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3049. A presente descrigao refere-se a linha de celulas de
hibridoma 7C2 depositada em 10 de Margo de 2010 como DSM ACC3050.
Tambem incluidos na presente descrigao encontram-se subclones e clones variantes das linhas de celulas de hibridomas especificas apresentadas antes, que produzem da mesma forma um anticorpo com as propriedades especificas de ligagao a proteina tau de acordo com a presente invengao. A presente descrigao proporciona uma composigao farmaceutica e um processo para a produgao de uma composigao farmaceutica que compreende um fragmento peptidico antigenico, especialmente um fragmento peptidico antigenico modificado atraves de fixagao a e/ou reconstituigao em um veiculo (transportador ou suporte) ("carrier") , em particular um veiculo (transportador ou suporte) lipossomico, de acordo com a presente invengao e tal como descrito na presente descrigao ou um seu fragmento funcional, em associagao com um veiculo ("carrier") e/ou um diluente e/ou um excipiente aceitavel(eis) sob o ponto de vista farmaceutico, para manutengao ou melhoria, especialmente para o restabelecimento completo da capacidade da memoria cognitiva de um animal, principalmente um mamifero como um paciente humano, afectado por perda de memoria.
Prepara-se uma composigao farmaceutica que compreende um anticorpo incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo equivalente sob o ponto de vista funcional ou suas partes funcionais de acordo com a presente descrigao em uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapeutico conjuntamente com um veiculo ("carrier") e/ou um diluente e/ou um excipiente aceitavel (eis) sob o ponto de vista farmaceutico.
Constitui tambem um objectivo da presente invengao proporcionar uma composigao farmaceutica de acordo com a mesma invengao e tal como descrita na presente descrigao, e/ou um processo, para o tratamento de doengas e distiirbios que sao causada(o)s pela formagao de lesoes neurofibrilares ou estao associada (o)s a esta formagao, a patologia cerebral predominante em tauopatias que compreendem um grupo heterogeneo de doengas ou de distiirbios neurodegenerativa (o) s que incluem as doengas ou os distiirbios que apresentam coexistencia de patologias tau e amiloides que incluem, mas nao se limitam a, Doenga de Alzheimer, doenga de Creutzfeldt--Jacob, Demencia pugilistica, Sindrome de Down, doenga de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusao, e angiopatia amiloide cerebral causada por proteina prionica, lesao cerebral traumatica e outras doengas ou disturbios que nao apresentam uma patologia amiloide distinta incluindo, mas nao se limitando a, complexo esclerose lateral amiotrofica/parkinsonismo-demencia de Guam, doenga do neuronio motor nao guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demencia do grao argirofilico, degeneragao corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificagao, demencia frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, doenga de Hallevorden-Spatz, atrofia de mhltiplos sistemas, doenga de Niemann-Pick tipo C, doenga de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, Panencefalite esclerosante subaguda, demencia senil do tipo caracterizado por emaranhados neurofibrilares (Tangle only dementia), Parkinsonismo pos-encefalitico, Distrofia miotonica, compreendendo o referido metodo a administragao a urn animal, especialmente um mamifero como urn ser humano, uma composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao e tal como descrita na presente descrigao em uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapeutico conjuntamente com um veiculo e/ou um diluente e/ou um excipiente aceitavel sob o ponto de vista farmaceutico. A presente descrigao permite a obtengao de composigdes farmaceuticas de acordo com a presente invengao e tal como descritas na mesma descrigao, e/ou de um processo, para manter ou aumentar a capacidade da memoria cognitiva mas, em particular, para restaurar completamente a capacidade da memoria cognitiva de um animal, especialmente urn mamifero como um ser humano, afectado por perda de memoria, compreendendo o referido processo a administragao a um animal, especialmente a um mamifero como um humano, uma composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao e tal como descrita na presente descrigao em uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapeutico conjuntamente com um veiculo ("carrier") e/ou um diluente e/ou um excipiente aceitavel (eis) sob o ponto de vista farmaceutico.
Constitui um outro objectivo da presente invengao proporcionar uma composigao farmaceutica e um processo para a produgao de uma tal composigao, bem como um processo para induzir uma resposta imunitaria em um animal, especialmente um mamifero como um humano afectado por uma doenga e situagao que sao causadas pela formagao de lesdes neurofibrilares ou estao associadas a esta formagao, atraves da administragao ao referido animal ou ser humano de uma composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao em uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapeutico conjuntamente com um veiculo ("carrier") e/ou um diluente e/ou um excipiente aceitavel(eis) sob o ponto de vista farmaceutico.
Prepara-se um processo para induzir uma resposta imunitaria em um animal, especialmente um mamifero como um humano afectado por lesdes neurofibrilares que resultam em uma tauopatia, de tal forma que pode obter-se a manutengao ou a melhoria dos sintomas associados a essa doenga ou situagao como, por exemplo, perda de memoria, em particular uma restauragao completa da situagao original. A composigao farmaceutica que compreende um peptido antigenico de acordo com a presente invengao e tal como descrito na presente descrigao apos administragao a um animal, particularmente um mamifero, mas especialmente um ser humano, resulta principalmente na geragao de anticorpos de subtipo Th2 nao inflamatorios como, por exemplo, isotipos IgGl e IgG2b e/ou anticorpos da subclasse IgG independente de celulas T como, por exemplo, IgG3 e/ou nao leva a um aumento significativo dos marcadores de inflamagao no cerebro, especialmente dos marcadores de inflamagao escolhidos no grupo constituido por IL-Ιβ, IL-6, IFN-γ e TNFa.
Em um outro aspecto adicional, a composigao farmaceutica que compreende um peptido antigenico de acordo com a presente invengao e tal como descrito na presente descrigao pode utilizar-se para induzir uma resposta imunitaria independente de celulas T para tratamento de uma doenga, situagao ou distiirbio em um paciente, especialmente um animal ou um paciente humano, principalmente um paciente que necessita de uma tal resposta independente de celulas T como, por exemplo, um paciente imunotolerante ou um paciente imunoactivado pelas celulas T em que o referido peptido antigenico e modificado atraves de fixagao a e/ou reconstituigao em um veiculo [("carrier"), transportador, suporte], em particular um veiculo lipossomico de tal modo que o antigenio e apresentado sobre a superficie desse veiculo ("carrier") , principalmente do lipossoma. A composigao antigenica descrita na presente descrigao e eficaz como um estimulante imunitario.
Em um aspecto especifico, o referido antigenio peptidico apresenta-se sob a forma de um arranjo ("array") altamente repetitivo na superficie do lipossoma. Em um outro aspecto especifico, o referido antigenio nao contem um epitopo de celula T. A composigao antigenica da presente invengao tal como descrita na presente descrigao utiliza-se para o tratamento de um paciente imunotolerante ou de um paciente imunoactivado por celulas T, particularmente um paciente imunocomprometido, especialmente um doente afectado por uma doenga autoimunitaria, principalmente um paciente que sofre de uma deficiencia de celulas T, especificamente uma deficiencia de celulas T, que e causada por uma deplegao nos referidos pacientes de celulas T CD4 e/ou uma expressao reduzida de CD14 e/ou do CD40L (CD40 ligante) sobre celulas T CD4.
Os anticorpos de acordo com a presente descrigao podem utilizar-se em um processo para o diagnostico de uma doenga ou situagao associada a proteina tau em um paciente que consiste em detectar a ligagao imunoespeclfica de um anticorpo ou de um seu fragmento activo a um epitopo da proteina tau em uma amostra ou in situ que inclui as fases de (a) colocagao da amostra ou de uma parte ou de uma area especifica do corpo suspeita de conter a proteina tau em contacto com o referido anticorpo, anticorpo esse que se liga a um epitopo da proteina tau; (b) permissao para o anticorpo se ligar a proteina tau para formar um complexo imunologico; (c) detecgao da formagao do complexo imunologico; e (d) correlagao entre a presenga ou ausencia do complexo imunologico e a presenga ou ausencia da proteina tau na amostra ou parte ou area especifica do corpo.
Proporciona-se um processo para o diagnostico da predisposigao de um paciente para uma doenga ou situagao associada a proteina tau que consiste em detectar a ligagao imunoespecifica de um anticorpo monoclonal ou de um seu fragmento activo a um epitopo da proteina tau em uma amostra ou in situ que inclui as fases de (a) colocagao da amostra ou de uma parte ou de uma area especifica do corpo suspeita de conter a proteina tau em contacto com um anticorpo de acordo com a presente invengao e como descrito antes na presente descrigao, anticorpo esse que se liga a um epitopo da proteina tau; b) permissao para o anticorpo se ligar ao antigenio tau para formar um complexo imunologico; (c) detecgao da formagao do complexo imunologico; e (d) correlagao entre a presenga ou ausencia do complexo imunologico e a presenga ou ausencia do antigenio tau na amostra ou parte ou area especifica do corpo. (e) comparagao da quantidade do referido complexo imunologico com um valor de controlo normal, em que um aumento na quantidade do referido agregado em comparagao com um valor de controlo normal indica que o referido paciente sofre de ou esta em risco de desenvolver uma doenga ou afecgao associada a proteina tau. A presente descrigao refere-se a um processo para monitorizagao de doenga residual minima em um paciente a seguir ao tratamento com um anticorpo ou uma composigao farmaceutica de acordo com uma qualquer das reivindicagoes anteriores, compreendendo esse processo: (a) colocagao da amostra ou de uma parte ou de uma area especifica do corpo suspeita de conter o antigenio tau em contacto com um anticorpo de acordo com a presente invengao e como descrito antes na presente descrigao, anticorpo esse que se liga a um epitopo da proteina tau; b) permissao para o anticorpo se ligar ao antigenio tau para formar um complexo imunologico; (c) detecgao da formagao do complexo imunologico; e (d) correlagao entre a presenga ou ausencia do complexo imunologico e a presenga ou ausencia do antigenio tau na amostra ou parte ou area especifica do corpo. (e) comparagao da quantidade do referido complexo imunologico com um valor de controlo normal, em que um aumento na quantidade do referido agregado em comparagao com um valor de controlo normal indica que o referido paciente ainda sofre de uma doenga residual minima. A presente descrigao proporciona um processo para prever a capacidade de resposta de um paciente a ser tratado com um anticorpo ou uma composigao farmaceutica de acordo com uma qualquer das reivindicagdes anteriores, compreendendo esse processo (a) colocagao da amostra ou de uma parte ou de uma area especifica do corpo suspeita de conter o antigenio tau em contacto com um anticorpo de acordo com a presente invengao e como descrito antes na presente descrigao, anticorpo esse que se liga a um epitopo da proteina tau; (b) permissao para o anticorpo se ligar ao antigenio tau para formar um complexo imunologico; (c) detecgao da formagao do complexo imunologico; e (d) correlagao entre a presenga ou ausencia do complexo imunologico e a presenga ou ausencia do antigenio tau na amostra ou parte ou area especifica do corpo. (e) comparagao da quantidade do referido complexo imunologico antes e depois do inicio do tratamento, em que uma diminuigao na quantidade do referido agregado indica que o referido paciente apresenta urn elevado potencial de ser responsivo ao tratamento. 0 anticorpo de acordo com a presente descrigao pode utilizar-se em urn kit de ensaio ou de teste para a detecgao e diagnostico de doengas e afecgoes associadas a proteina tau.
Em particular, para a detecgao e diagnostico de doengas e situagdes associadas a proteina tau prepara-se urn kit de ensaio que contem anticorpos de acordo com a presente descrigao, em particular urn kit de ensaio que compreende urn recipiente que contem urn ou mais anticorpo(s) de acordo com a presente descrigao e instrugdes para utilizar esses anticorpos com o proposito de se ligarem ao antigenio tau para formarem um complexo imunologico e detectar a formagao do complexo imunologico tal que a presenga ou a ausencia do complexo imunologico se correlaciona com a presenga ou a ausencia do antigenio tau.
Estes e outros objectivos, caracteristicas e vantagens da presente invengao serao evidentes apos uma revisao da seguinte descrigao detalhada da forma de realizagao exposta e das reivindicagoes anexas.
Breve Descrigao das Figures e das Sequencias
Figura la: Anticorpos IgG anti-Tau5-20 [pYl8] de murganhos WT ("wild-type") imunizados com ACI-33. Analise de anticorpos IgG anti-Tau 5-20 [ p Y18 ] nos soros de murganhos de tipo selvagem C57BL/6 tratados com 3 injecgdes de ACI-33 nos dias dO, dl3 e d28 e sangrados nos dias d-1, d27 e d47. Os resultados obtidos em urn grupo de 6 murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao.
Figura lb: Anticorpos IgG anti-Tau5-20 [pY18] de murganhos TKO imunizados com ACI-33. Analise de anticorpos IgG anti-Tau 5-20 [pY18] nos soros de murganhos de tipo selvagem C57BL/6 tratados com 3 injecgdes de ACI-33 nos dias dO, dl3 e d28 e sangrados nos dias d-1, d27 e d47. Os resultados obtidos em urn grupo de 6 murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao.
Figura 2a: Anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] de murganhos WT ("wild-type") imunizados com ACI-35. Analise de anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] nos soros de murganhos de tipo selvagem C57BL/6 tratados com 5 injecgdes de ACI-33 nos dias dO, dl6, d30, d99 e dll3 e sangrados nos dias d-1, d28, d42, d98 e dl26. Os resultados obtidos em urn grupo de 6 murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao.
Figura 2b: Anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] de murganhos TKO imunizados com ACI-35. Analise de anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] nos soros de murganhos TKO tratados com 5 injecgdes de ACI-35 nos dias dO, dl6, d30, d99 e d!13 e sangrados nos dias d-1, d28, d42, d98 e dl26. Os resultados obtidos em urn grupo de 6 murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao.
Figura 3a: Anticorpos IgG anti-Tau401-418 [pS404/S409] de murganhos WT ("wild-type") imunizados com ACI-36. Analise de anticorpos IgG anti-Tau401-418 [pS404/S409] nos soros de murganhos de tipo selvagem C57BL/6 tratados com 3 injecgdes de ACI-36 nos dias dO, dl3 e d28 e sangrados nos dias d-1, d27 e d47. Os resultados obtidos em urn grupo de 6 murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao.
Figura 3b: Anticorpos IgG anti-Tau401-418 [pS404/S409] de murganhos TKO imunizados com ACI-36. Analise de anticorpos IgG anti-Tau401-418 [pS404/S409] nos soros de murganhos TKO tratados com 3 injecgdes de ACI-36 nos dias dO, dl3 e d28 e sangrados nos dias d-1, d27 e d47. Os resultados obtidos sao expressos como D.O. media + desvio padrao em urn grupo de 6 murganhos para d-l/d27 e em urn grupo de 5 murganhos para d47.
Figura_4a/4b: Anticorpos IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214] e anti-Taul96-211 [pS202/pT205] de murganhos WT ("wild-type") imunizados com ACI-41. Analise de anticorpos IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214] e anti-Taul96-211 [pS202/pT205] nos soros de murganhos de tipo selvagem C57BL/6 tratados com 3 injecgdes de ACI-41 nos dias dO, d20 e d35 e sangrados nos dias d-1, d34 e d48. Os resultados obtidos no grupo de 6 murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao. Os soros analisaram-se relativamente a ambos os peptidos pTau.
Figura_4c/4d: Anticorpos IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214] e anti-Taul96-211 [pS202/pT205] de murganhos TKO imunizados com ACI-41. Analise de anticorpos IgG anti- -Tau20 6-221 [pT212/pS214] e anti-Taul96-211 [pS202/pT205] nos soros de murganhos TKO tratados com 3 injecgdes de ACI-41 nos dias dO, d20 e d35 e sangrados nos dias d-1, d34, e d48. Os resultados obtidos no grupo de 6 murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao. Os soros analisaram-se relativamente a ambos os peptidos pTau.
Figura 5a: Anticorpos anti-Tau5-20 [pY18] isotipos IgG e IgM de murganhos WT {"wild-type") imunizados com ACI-33. Analise de anticorpos anti-Tau5-20 [pY18] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos C57BL/6 47 dias depois da primeira imunizagao com ACI-33. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/3200 (IgM) apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 6 murganhos.
Figura 5b: Anticorpos anti-Tau5-20 [pY18] isotipos IgG e IgM de murganhos TKO imunizados com ACI-33. Analise dos anticorpos anti-Tau5-20 [pY18] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos TKO 47 dias depois da primeira imunizagao com ACI-33. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/3200 (IgM) apresentando desvios medio + padrao obtidos no grupo de 6 murganhos.
Figura 6a: Anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/pS404] isotipos IgG e IgM de murganhos WT ("wild-type") imunizados com ACI 35. Analise de anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/pS404 ] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos C57BL/6 42 dias depois da primeira imunizagao com ACI-33. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao 1/100 (IgGl), 1/1600 (IgG2a), 1/1600 (IgG2b), 1/800 (IgG3) e 1/1600 (IgM) apresentando desvios medio + padrao obtidos no grupo de 6 murganhos.
Figura 6b: Anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/pS404] isotipos IgG e IgM de murganhos TKO imunizados com ACI-35. Analise de anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/pS404] isotipos
IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos TKO 42 dias depois da primeira imunizagao com ACI-35. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/1600 (IgG2a), 1/1600 (IgG2b), 1/800 (IgG3) e 1/1600 (IgM) apresentando desvios medio + padrao obtidos no grupo de 6 murganhos.
Figura 7a: Anticorpos anti-Tau401-418 [pS404/S409] isotipos IgG e IgM de murganhos WT ("wild-type") imunizados com ACI 36. Analise de anticorpos anti-Tau401-418 [pS404/S409] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos C57BL/6 47 dias depois da primeira imunizagao com ACI-36. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/400 (IgG2a), 1/400 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/400 (IgM) apresentando desvios medio + padrao obtidos no grupo de 6 murganhos.
Figura 7b: Anticorpos anti-Tau401-418 [pS404/S409] isotipos IgG e IgM de murganhos TKO imunizados com ACI-36. Analise de anticorpos anti-Tau401-418 [pS404/S409] isotipos
IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos TKO 47 dias depois da primeira imunizagao com ACI-36. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/100 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/400 (IgM) apresentando desvios medio + padrao obtidos no grupo de 5 murganhos.
Figura 8a: Anticorpos anti-Taul96-211 [pS202/pT205] isotipos IgG e IgM de murganhos WT {"wild-type") imunizados com ACI 41. Analise de anticorpos anti-Taul96-211 [pS202/pT205] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos C57BL/6 48 dias depois da primeira imunizagao com ACI-41. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/100 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b), 1/1600 (IgG3) e 1/3200 (IgM) apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 6 murganhos.
Figura 8b: Anticorpos anti-Taul96-211 [pS202/pT205] isotipos IgG e IgM de murganhos TKO imunizados com ACI-41. Analise de anticorpos anti-Taul96-211 [pS202/pT205] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos TKO 48 dias depois da primeira imunizagao com ACI-41. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/100 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b), 1/1600 (IgG3) and 1/3200 (IgM) apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 6 murganhos.
Figura 9a/9b: Sobrenadantes de hibridomas provenientes de frascos T-125 (para cultura de celulas) que segregam anticorpos ACI-36: selecgao por TAUPIR (Tau-Pathology Immuno--Reaction) e Tau ELISA. 9a. coloragao por TAUPIR em murganho biGT de idade avangada utilizando sobrenadante nao diluido. 9b. Analise dos titulos das amostras nao diluidas dos sobrenadantes dos clones peptido T4.5 anti-pTau, peptido T4.6 anti-Tau, proteina anti-pTau e proteina anti-Tau. Os resultados sao expressos em D.O..
Figura lOa/lOb/lOc: Sobrenadantes de hibridomas provenientes de frascos T-125 (para cultura de celulas) que segregam anticorpos ACI-41: selecgao por TAUPIR (Tau-Pathology
Immuno-Reaction) e Tau ELISA. 10a. coloragao por TAUPIR em murganho biGT de idade avangada utilizando sobrenadante nao diluido. 10b. Analise dos titulos das amostras nao diluidas dos sobrenadantes dos clones peptido T8.5 anti-pTau, peptido T8.6 anti-Tau, proteina anti-pTau e proteina anti-Tau. Os resultados sao expressos em D.O.. 10c. Analise dos titulos das amostras nao diluidas dos sobrenadantes dos clones peptido T9.5 anti-pTau, peptido T9.6 anti-Tau, proteina anti-pTau e proteina anti-Tau. Os resultados sao expressos em D. 0. .
Figura 11: Sobrenadante de hibridoma na placa revestida com T8: Tau206-221 [pT212/pS214], T9: Taul96-211[pS202/pT205] e hP-Tau. Analise dos anticorpos anti-Tau206-221 [pT212/pS214], anti-Taul96-211 [pS202/pT205] e antihP-Tau provenientes do sobrenadante do clone do hibridoma. Os resultados sao expressos em D.O.. 0 mesmo sobrenadante foi ensaiado nao diluido para ambos os peptidos pTau e hP-Tau.
Figura 12: Clone do anticorpo ACI-41-Abl (T89-F4) cora NFT [(Neurofibrillar tangles) emaranhados neurofibrilares] em cerebros de humanos com AD (Doenga de Alzheimer). Coraram-se cortes de cerebros de pacientes com AD (a, b, e c) , PSP [(progressive supranuclear palsy) paralisia supranuclear progressiva] (d, e, e f), e saudaveis para controlo (g, h, e i) utilizando AT100 (a, d, eg), ou ACI-41-Abl (T89-F4) nas diluigoes 1/1 (b, e, e h) ou 1/30 (c, f, e i).
Figura 13: Anticorpo 5D10 cora NFT [(Neurofibrillar tangles) emaranhados neurofibrilares] em cerebros de humanos com AD (Doenga de Alzheimer). Utilizando anticorpos 5D10 (a) ou AT100 (b) coraram-se cortes corticais de cerebros de pacientes com AD (Doenga de Alzheimer).
Fiqura 14: Anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/pS404] isotipo IgG em murganhos imunizados com ACI-35. Analise de anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/pS404] isotipo IgG no plasma de murganhos C57BL/6 tratados com 3 injecgdes de ACI-35 nos dias dO, dl4 e d28 e sangrados nos dias d-7, d7, d21, d35 e d56. Os resultados obtidos nos grupos de 10 murganhos sao expressos como D.0. media + desvio padrao.
Figura 15: Anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/pS404] isotipos IgG em murganhos imunizados com ACI-35. Analise de anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/pS404] isotipos IgGl, 2a, 2b e 3 no plasma de murganhos C57BL/6 35 dias apos a primeira imunizagao com ACI-35. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao nao saturada de 1/1600 (IgGl), 1/3200 (IgG2a), 1/3200 (IgG2b) e 1/800 (IgG3) representando os desvios medio + padrao obtidos nos grupos de 10 murganhos.
Figura 16a: Anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/S404] isotipo IgM em murganhos imunizados com ACI-35. Analise de anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/S404] isotipo IgM no plasma de murganhos C57BL/6 35 dias apos a primeira imunizagao com ACI-35. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao 1/6400 representando os desvios medio + padrao obtidos nos grupos de 10 murganhos.
Figura 16b: Anticorpos anti-Tau393-408 isotipo IgG em murganhos imunizados com ACI-35. Analise de anticorpos anti-Tau393-408 isotipo IgG no plasma de murganhos C57BL/6 35 dias apos a primeira imunizagao com ACI-35. Os resultados sao expressos como D.O. em uma diluigao 1/100 apresentando os desvios medio + padrao obtidos nos grupos de 10 murganhos.
Figura 17: Proliferagao de celulas do bago reestimuladas com ConA (Concanavalin A) ou peptido pTau/Tau. Analise da proliferagao de celulas T especificas da proteina tau utilizando o reagente colorimetrico MTT [(3-(4,5-dimethylthi-azol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) brometo de 3--(4,5-dimetiltiazol-2,5-difenil-tetrazolio] no dia d56. Reuniram-se os esplenocitos provenientes de 10 murganhos de cada grupo e reestimularam-se com ConA, peptidos Tau393-408 [pS396/S404] ou Tau393-408.
Figura 18: Produgao de citocinas por ELISPOT de esplenocitos reestimulados com peptidos Tau393-408 [pS396/S404] e Tau393-408. Analise ELISPOT da produgao de citocinas por celulas T especificas de P-Tau/Tau. A partir de 10 murganhos de cada grupo reuniram-se esplenocitos e reestimularam-se com peptidos Tau393-408 [pS396/S404] e Tau393-408.
Figura 19: Anticorpos IgG Anti-Tau5-20 [pY18] de murganhos imunizados com ACI-33. Analise de anticorpos IgG anti-Tau5-20 [pY18] em soros de murganhos TPLH tratados com 5 injecgoes de ACI-33 nos dias dO, dl3, d28, d91 e dl33 e sangrados nos dias d-1, d27, d41, d76, dl04 e dl35. Os resultados obtidos no grupo dos murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao. d-1 n=10. d27, d41 e d76 n=9 murganhos, 1 murganho morreu por causa dos confrontos ("fighting") . dl04 n=6, 3 murganhos morreram da patologia. dl35 n=2, 4 murganhos morreram da patologia.
Figura 20: Anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] em murganhos imunizados com ACI-35. Analise dos anticorpos IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] nos soros de murganhos TPLH tratados com 5 injecgdes de ACI-35 nos dias dO, dl3, d27, d91 e dl33 e sangrados nos dias d-1, d26, d40, d75, dl03, dl45 e dl55. Os resultados obtidos no grupo dos murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao. d-1, d26 n=10 murganhos. d40 n=9 murganhos. d75 n=6. dl03 e dl45 n=4. dl55 n=3. Todos os murganhos morreram da patologia.
Figura 21: Anticorpos IgG Anti-Tau206-221 [pT212, pS214] em murganhos imunizados com ACI-39. Analise dos anticorpos IgG anti-Tau206-221 [pT212, pS214] nos soros de murganhos TPLH tratados com 5 injecgdes de ACI-39 nos dias dO, dl3, d28, d91 e dl33 e sangrados nos dias d-1, d27, d41, d76, dl04 e dl35. Os resultados obtidos no grupo dos murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao. d-1, d27 e d41 n=10 murganhos, d76 n=7 murganhos, dl04 n=6, dl35 n=2 . Todos os murganhos morreram da patologia.
Figura 22: Anticorpos IgG anti-Taul96-211 [pS202, pT205] em murganhos imunizados com ACI-40. Analise de anticorpos IgG anti-Taul96-211 [pS202, pT205] nos soros de murganhos TPLH tratados com 5 injecgdes de ACI-40 nos dias dO, dl3, d28, d91 e dl33 e sangrados nos dias d-1, d27, d41, d76, dl04 e dl35. Os resultados obtidos no grupo dos murganhos sao expressos como D.O. media + desvio padrao. d-1, d27 e d41 n=10 murganhos, d76 n=8 murganhos, dl04 n=6, dl35 n=5. Todos os murganhos morreram da patologia.
Figura 23: Anticorpos isotipos IgG e IgM anti-Tau5-20 [pY18] em murganhos imunizados com ACI-33. Analise de anticorpos anti-Tau5-20 [pY18] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos TPLH no dia d41 depois de tres imunizagoes com ACI-33. Os resultados sao expressos como D.O. de solugoes insaturadas a uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/200 (IgG2a), 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/100 (IgM) apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 9 murganhos.
Figura 24: Anticorpos IgG e IgM anti-Tau393-408 [pS396/pS404] em murganhos imunizados com ACI-35. Analise de anticorpos anti-Tau393-408 [pS396/pS404] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos TPLH no dia d40 apos tres imunizagdes com ACI-35. Os resultados sao expressos como D.O. de solugdes insaturadas a uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/100 (IgG2a) , 1/100 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/100 (IgM) apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 9 murganhos.
Figura 25: Anticorpos IgG e IgM anti-Tau206-221 [pT212, pS214] em murganhos imunizados com ACI-39. Analise de anticorpos anti-Tau206-221 [pT212, pS214] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos TPLH no dia d41 apos tres imunizagdes com ACI-39. Os resultados sao expressos como D.O. de solugdes insaturadas a uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/200 (IgG2a) , 1/200 (IgG2b), 1/100 (IgG3) e 1/100 (IgM) apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 10 murganhos.
Figura 26: Anticorpos IgG e IgM Anti-Taul96-211 [pS202, pT205] em murganhos imunizados com ACI-40. Analise de anticorpos anti-Taul96-211 [pS202, pT205] isotipos IgGl, 2a, 2b, 3 e IgM nos soros de murganhos TPLH no dia d41 apos tres imunizagdes com ACI-40. Os resultados sao expressos como D.O. de solugdes insaturadas a uma diluigao de 1/100 (IgGl), 1/400 (IgG2a), 1/200 (IgG2b), 1/800 (IgG3) e 1/100 (IgM) apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 10 murganhos.
Figura 27: Titulos de anticorpos IgG de diferentes peptidos e proteinas Tau em murganhos imunizados com ACI-33. Analise de titulos de anticorpos IgG nos soros dos dias d-1 e d41 de murganhos TPLH apos 3 injecgdes de ACI-33. Os resultados sao expressos como D.O. apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 9 murganhos.
Figura 28: Titulos de anticorpos IgG de diferentes peptidos e proteinas Tau em murganhos imunizados com ACI-35. Analise de titulos de anticorpos IgG nos soros dos dias d-1 e d40 de murganhos TPLH apos 3 injecgdes de ACI-35. Os resultados sao expressos como D.O. apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 9 murganhos.
Figura 29: Titulos de anticorpos IgG de diferentes peptidos e proteinas Tau em murganhos imunizados com ACI-39. Analise de titulos de anticorpos IgG nos soros dos dias d-1 e d41 de murganhos TPLH apos 3 injecgdes de ACI-39. Os resultados sao expressos como D.O. apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 10 murganhos.
Figura 30: Titulos de anticorpos IgG de diferentes peptidos e proteinas Tau em murganhos imunizados com ACI-40. Analise de titulos de anticorpos IgG nos soros dos dias d-1 e d41 de murganhos TPLH apos 3 injecgdes de ACI-40. Os resultados sao expressos como D.O. apresentando os desvios medio + padrao obtidos no grupo de 10 murganhos.
Figura 31: Murganhos imunizados com ACI-33 versus murganhos injectados com PBS submetidos ao teste de RotaRod. Realizaram-se ensaios RotaRod em cinco ocasides diferentes tendo por referenda a idade (meses) dos murganhos TPLH.
Figura 32: Correlagao entre titulos de anticorpos anti--tau 5-20 [pY18] e o teste de RotaRod. A correlagao avaliou- -se para os murganhos TPLH injectados com ACI-33 com a idade de 7,8 meses. 0 titulo dos anticorpos no soro do murganho determinou-se por ELISA (D. 0.) tendo-se determinado atraves do ensaio RotaRod a duragao do periodo que os animais permaneceram em equilibrio ("on") no dispositivo utilizado no ensaio (tempo).
Definigao de Termos e de Frases ou Expressoes
Os termos "polipeptido", "peptido" e "proteina", tal como utilizados na presente descrigao, sao permutaveis entre si e definem-se de modo a significar uma biomolecula constituida por aminoacidos ligados por uma ligagao peptidica. 0 termo "peptidos" significa cadeias de aminoacidos (normalmente L-aminoacidos) cujos carbonos alfa se ligam atraves de ligagdes peptidicas formadas mediante uma reacgao de condensagao entre o grupo carboxilo do carbono alfa de urn aminoacido e o grupo amino do carbono alfa de urn outro aminoacido. 0 aminoacido terminal em uma extremidade da cadeia (isto e, o terminal amino) tern urn grupo amino livre, enquanto o aminoacido terminal na outra extremidade da cadeia (isto e, o terminal carboxilo) tern urn grupo carboxilo livre. Como tal, o termo "terminal amino" (abreviado N-terminal) refere-se ao grupo alfa-amino livre do aminoacido no terminal amino do peptido, ou ao grupo alfa-amino (grupo imino quando participa em uma ligagao peptidica) de urn aminoacido em qualquer outro local no peptido. Da mesma forma, a expressao "terminal carboxilo" (abreviatura C-terminal) refere-se ao grupo carboxilo livre do aminoacido no terminal carboxilo de urn peptido, ou ao grupo carboxilo de urn aminoacido em qualquer outro local do peptido. A expressao "o seu fragmento" ou o termo "fragmento" tal como utilizada(o) na presente descrigao refere-se a urn fragmento peptidico funcional que tem essencialmente a mesma actividade (biologica) que os peptidos definidos na mesma descrigao (por exemplo, como apresentado em SEQ ID Nos 2 a 9, respectivamente), isto e os referidos fragmentos sao ainda capazes de desencadear em urn organismo uma resposta imunitaria, especialmente de urn tipo caracteristico, altamente especifica, sobretudo no seio de um animal, essencialmente um mamifero como o homem, o que e altamente eficaz e capaz de prevenir ou aliviar tauopatias, ou os sintomas associados a tauopatias. Em particular, os mencionados fragmentos contem ainda o(s) fosfoepitopo (s) do peptido tau especifico(s) patologico (s), como usado(s) e definido(s) na presente invengao.
Normalmente, os aminoacidos que constituem um peptido estao numerados sequencialmente, comegando no terminal amino e progredindo em direcgao ao terminal carboxilo do peptido. Assim, quando se diz que um aminoacido e a seguir a um outro, esse aminoacido posiciona-se mais proximo do terminal carboxilo do peptido do que o aminoacido anterior. 0 termo "resto" utiliza-se na presente invengao para designar um aminoacido que se incorpora em um peptido atraves de uma ligagao amida. Como tal, o aminoacido pode ser um aminoacido que ocorre naturalmente ou, a menos que limitado de outra forma, pode abranger analogos conhecidos de aminoacidos naturais que funcionam de um modo semelhante ao dos aminoacidos de ocorrencia natural (quer dizer, mimeticos de aminoacidos). Alem disso, um mimetico de ligagao amida inclui modificagoes do esqueleto peptidico bem conhecidas dos peritos na especialidade. A expressao "que consiste essencialmente em" ou "constituido essencialmente por" ("consisting essentially of") utiliza-se na presente invengao para excluir quaisquer elementos que possam alterar realmente as propriedades essenciais dos peptidos aos quais a frase se refere. Assim, a descrigao de um peptido "que consiste essencialmente em" ou "constituido essencialmente por" exclui quaisquer substituigdes, adigdes ou delegoes de aminoacidos que alterem realmente a actividade biologica desse peptido.
Alem disso, um perito reconhecera que, tal como mencionado antes, substituigoes individuals, eliminagdes ou adigdes que alteram, adicionam ou eliminam um so aminoacido ou uma pequena percentagem de aminoacidos (normalmente menos de 5%, mais caracteristicamente menos de 1%) em uma sequencia codificada sao variagoes modificadas de modo conservative donde as alteragoes resultam na substituigao de um aminoacido por um outro quimicamente similar. Na arte sao do conhecimento geral tabelas de substituigao conservativa que proporcionam aminoacidos similares sob o ponto de vista funcional. Os seis grupos seguintes contem, cada um, aminoacidos que constituem substituigoes conservadoras entre si : 1) Alanina (A), Serina (S), treonina (T); 2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M),
Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W). 0 termo "isolado(a)" ou a frase "puro(a) sob o ponto de vista biologico" referem-se a material que e praticamente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham quando obtido no seu estado nativo. Assim, os peptidos descritos na presente invengao nao contem materials normalmente associados aos seus ambientes in situ. Normalmente, os peptidos imunogenicos isolados descritos na presente invengao, quando avaliados atraves da intensidade das bandas em urn gele corado pela prata sao, pelo menos, cerca de 80%, geralmente pelo menos cerca de 90%, e de preferencia pelo menos cerca de 95% puros. A pureza ou a homogeneidade das proteinas pode reconhecer-se atraves de uma serie de metodos bem conhecidos na arte, como electroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteina, seguida por visualizagao por coloragao. Para determinados objectivos sera necessario urn elevado grau de separagao e utilizar-se-a HPLC ou urn meio semelhante de purificagao.
Quando os peptidos imunogenicos sao relativamente curtos em comprimento (isto e, menos do que cerca de 50 aminoacidos) , os mesmos sintetizam-se frequentemente utilizando tecnicas convencionais de sintese quimica de peptidos.
Sintese em fase solida na qual o aminoacido do C-termi-nal da sequencia se liga a urn suporte insoliivel seguindo-se a adigao sequencial dos aminoacidos restantes na sequencia e urn metodo preferido para a sintese quimica dos peptidos imunogenicos descritos na presente invengao. Tecnicas para a sintese em fase solida sao conhecidas dos peritos na especialidade.
Alternativamente, sintetizam-se os peptidos imunogenicos descritos na presente invengao utilizando metodologia de acidos nucleicos recombinante. Geralmente, isso envolve a criagao de uma sequencia de acido nucleico que codifica o peptido, colocando o acido nucleico em uma cassete de expressao sob o controlo de um promotor especifico, que expressa o peptido em um hospedeiro, isola o peptido ou o polipeptido expresso e, se necessario, renatura o peptido. Na bibliografia encontram-se tecnicas suficientes para orientar um perito atraves desses procedimentos.
Uma vez expressos, os peptidos recombinantes podem purificar-se de acordo com procedimentos padrao, incluindo precipitagao com sulfato de amonio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, electroforese em gele e similares. Preferem-se composigdes praticamente puras de cerca de 50% a 95% de homogeneidade, sendo as de 80% a 95% ou mais de homogeneidade as mais preferidas para utilizagao como agentes terapeuticos.
Um perito na especialidade reconhecera que apos sintese quimica, expressao biologica ou purificagao, os peptidos podem possuir uma conformagao essencialmente diferente das conformagdes nativas dos peptidos constituintes. Nesse caso, e muitas vezes necessario desnaturar e reduzir o peptido antiproliferativo e em seguida induzindo o peptido a enrolar novamente (refold) na conformagao preferida. Os peritos na especialidade conhecem bem metodos de redugao e de desnaturagao de proteinas e de indugao de refolding (reenrolamento). A antigenicidade da proteina purificada pode confirmar- -se, por exemplo, mediante a demonstragao da reacgao com soro imunitario, ou com anti-soros produzidos contra a propria proteina.
Os termos urn, uma, uns, umas ("a" e "an") e o, a, os, as ("the") quando utilizados na presente descrigao definem-se como significando "urn ou mais" e incluem por isso o plural a menos que o contexto seja inadequado.
Os termos "detecgao" ou "detectar" ("detecting") ou "detectado" ("detected"), tal como utilizados na presente invengao significam a utilizagao de tecnicas conhecidas para a detecgao de moleculas biologicas, como metodos imunoquimicos ou histologicos e referem-se a determinagao quantitativa ou qualitativa da presenga ou da concentragao da biomolecula sob investigagao.
Por "isolado" entende-se uma molecula biologica livre de pelo menos alguns dos componentes com os quais ocorre naturalmente.
Os termos "anticorpo" e "anticorpos" ou a frase "suas partes funcionais" quando se utilizam na presente invengao constituem termos ou uma frase que se reconhecem na tecnica e se compreende que se referem a moleculas ou fragmentos activos de moleculas que se ligam a antigenios conhecidos, especialmente a moleculas de imunoglobulinas e a porgdes activas sob o ponto de vista imunologico de moleculas de imunoglobulinas, isto e moleculas que contem urn sitio de ligagao que se liga a urn antigenio de urn modo imunoespecifico. Uma imunoglobulina de acordo com a presente invengao pode ser de qualquer tipo (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) ou classe (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse das moleculas de imunoglobulinas.
No ambito da presente invengao pretende-se que o termo "anticorpos" inclua anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, quimericos, de cadeia simples (ou de cadeia dnica), biespecificos, simianizados ("simianized"), humanos e humanizados bem como os seus fragmentos activos. Exemplos de fragmentos activos de moleculas que se ligam a antigenios conhecidos incluem fragmentos Fab e F(ab')2r incluindo os produtos de uma biblioteca de expressao de Fab de imunoglobulina e fragmentos de ligagao ao epitopo de qualquer urn dos anticorpos e fragmentos mencionados antes. Esses fragmentos activos podem derivar de urn anticorpo de acordo com a presente invengao realizando uma serie de tecnicas. Por exemplo, anticorpos monoclonais purificados podem clivar-se com uma enzima, como pepsina, e submeterem-se a filtragao em gele por HPLC. A fracgao apropriada contendo fragmentos Fab pode colher-se seguidamente e concentrar-se por filtragao em membrana e tecnicas similares. Para uma descrigao adicional de tecnicas gerais para o isolamento de fragmentos activos de anticorpos, ver por exemplo, Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986.
Urn "anticorpo humanizado" refere-se a urn tipo de anticorpo manipulado por tecnicas de engenharia genetica ("engineered") que possui as suas CDR derivadas de uma imunoglobulina de dador nao humano, sendo as restantes partes da molecula derivadas de imunoglobulina provenientes de uma (ou mais) imunoglobulina(s) humana(s).
Urn anticorpo humanizado pode ainda referir-se a urn anticorpo que possui uma regiao variavel onde uma ou mais das suas regibes "framework" (estruturais ou esqueleto) apresentam aminoacidos humanos ou de outros primatas. Alem disso, os restos do suporte da "framework" podem alterar-se para preservar a afinidade da ligagao. Os peritos na especialidade conhecem bem metodos para obter "anticorpos humanizados". (ver, por exemplo, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al.,
Bio/Technoloy, 9:421 (1991)).
Um "anticorpo humanizado" pode tambem obter-se atraves de uma nova abordagem de engenharia genetica que permite a produgao de anticorpos policlonais "human-like" (como humanos ou humanizados) maturados por afinidade em animais como, por exemplo, coelhos (http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php). A expressao "anticorpo monoclonal" e igualmente bem reconhecida na especialidade e refere-se a um anticorpo que em laboratorio e produzido em massa a partir de um linico clone e que reconhece apenas um antigenio. Anticorpos monoclonais preparam-se normalmente mediante fusao de uma celula B produtora de anticorpos, habitualmente de vida curta com uma celula de crescimento rapido, como uma celula de cancro (por vezes referida como uma celula "imortal") . A celula hibrida resultante, ou hibridoma, multiplica-se rapidamente, criando um clone que produz grandes quantidades do anticorpo. 0 termo "antigenio" refere-se a uma entidade ou um seu fragmento que pode induzir uma resposta imunitaria em um organismo, particularmente um animal, mais especialmente um mamifero incluindo o homem. 0 termo inclui imunogenios e regides responsaveis pela antigenicidade ou determinantes antigenicos.
Quando utilizado na presente invengao, o termo "soldvel" significa parcialmente ou completamente dissolvido em uma solugao aquosa.
Tambem quando utilizado na presente invengao, o termo "imunogenico" refere-se a substancias que induzem ou aumentam a produgao de anticorpos, de celulas T e de outras celulas imunitarias reactivas dirigidas contra um agente imunogenico e contribuem para uma resposta imunitaria em seres humanos ou animais.
Uma resposta imunitaria ocorre quando um individuo produz anticorpos, celulas T e outras celulas imunitarias reactivas suficientes contra composigbes imunogenicas da presente invengao administradas para moderar ou aliviar o distiirbio a tratar. 0 termo "hibridoma" e reconhecido na arte e os peritos experientes na especialidade mencionam-no para referir uma celula produzida pela fusao de uma celula produtora de anticorpos com uma celula imortal, por exemplo uma celula de mieloma miiltiplo. Esta celula hibrida e capaz de produzir um fornecimento continuo do anticorpo. Para uma descrigao mais detalhada do processo de fusao ver a definigao anterior de "anticorpo monoclonal" e os Exemplos seguintes. 0 termo "veiculo" tal como utilizado na presente invengao significa uma estrutura na qual se pode incorporar um peptido antigenico ou a qual se pode associar uma construgao supramolecular, apresentando ou expondo assim peptidos antigenicos ou parte desses peptidos ao sistema imunitario de um humano ou de outro animal. No contexto da presente invengao qualquer particula que se possa utilizar de um modo adequado em terapia animal ou humana como, por exemplo, uma vesicula, uma particula ou um corpo particulado pode utilizar-se como um veiculo. 0 termo "veiculo" ("carrier") compreende ainda metodos de administragao ou de libertagao ("delivery") em que composigdes de construgao antigenica supramolecular que compreendem o peptido antigenico podem transportar-se para sitios desejados por mecanismos de administragao ou de libertagao. Um exemplo de um tal sistema de libertagao utiliza metais coloidais como ouro coloidal.
Proteinas de transporte ("carrier proteins") que se podem utilizar nas composigdes de construgoes antigenicas supramoleculares de acordo com a presente invengao incluem, mas nao sao limitadas a, proteinas ligantes de maltose [ ("MBP") maltose binding proteins]; albumina de soro bovino ["BSA" bovine serum albumin]; hemocianina de lapa (conhecida por "KLH" keyhole lympet hemocyanin); ovalbumina; flagelina; tiroglobulina ou tireoglobulina; albumina serica de qualquer especie; gamaglobulinas de quaisquer especies; celulas singeneicas; celulas singeneicas que possuem antigenios; e polimeros de D- e/ou L-aminoacidos.
Na "construgao antigenica supramolecular" de acordo com a presente invengao, o lipossoma pode ter uma dupla fungao na medida em que se pode utilizar como um veiculo ("carrier") que comporta a construgao supramolecular como descrito antes na presente descrigao e, ao mesmo tempo, funcionar como um adjuvante para aumentar ou estimular a resposta imunitaria no animal alvo ou no paciente humano a ser tratado com a vacina terapeutica de acordo com a presente invengao. Deve entender--se tambem que as composigdes de construgoes antigenicas supramoleculares da presente invengao podem ainda comportar adjuvantes adicionais incluindo, mas nao se limitando a, hemocianina de lapa (conhecida por "KLH" keyhole lympet hemocyanin) , albumina de soro bovino [(BSA) Bovine serum albumin] e outros adjuvantes como, por exemplo, lipido A, aliimen, fosfato de calcio, interleucina-1, e/ou microcapsulas de polissacaridos e proteinas, mas especialmente urn lipido A purificado, como lipido A monofosforilo ou difosforilo, ou aliimen, mais conservantes, diluentes, emulsionantes, estabilizadores, e outros componentes que sao conhecidos e utilizados em vacinas do estado anterior da tecnica. Alem disso, qualquer sistema adjuvante conhecido na arte pode utilizar-se na composigao da presente invengao. Tais adjuvantes incluem, mas nao estao limitados a, adjuvante incompleto de Freund, adjuvante completo de Freund, β-(1,4)--manano acetilado (manano acetilado constituido por cadeias de β-manose unidas por ligagdes l->4 polidispersas) ("Acemannan"), TITERMAX® (adjuvantes copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno fornecidos por CytRx Corporation), adjuvantes lipidicos modificados fornecidos por Chiron Corporation, adjuvantes derivados de saponinas fornecidos por Cambridge Biotech, Bordetella pertussis desactivada (morta), o lipopolissacarido [(LPS) lipopolysaccharide] de bacterias Gram-negativas, grandes anides polimericos como sulfato de dextrano, e geles inorganicos como aliimen, hidroxido de aluminio ou fosfato de aluminio.
Ainda, a expressao "quantidade eficaz" refere-se a quantidade de uma composigao antigenica/imunogenica que, quando administrada ao homem ou a urn animal, induz uma resposta imunitaria. Qualquer perito experiente na arte calcula facilmente a quantidade eficaz seguindo os procedimentos de rotina. A expressao um "paciente imunotolerante" quando utilizada na presente invengao refere-se a um animal ou um paciente humano que apresenta uma capacidade limitada para responder aos antigenios, especialmente antigenios nao proprios (non-self) , mas especialmente novos antigenios como, por exemplo, novos antigenios presentes em doengas emergentes. Esta limitagao pode ser devida, pelo menos em parte, a idade cronologica das celulas T CD4+. Assim, por exposigao a um antigenio um "paciente imunotolerante" pode apresentar uma resposta imunitaria mediada por celulas T CD4+ alterada a longo prazo devido a defeitos na proliferagao e na secregao de citocinas pelas celulas T de memoria durante respostas de recall (respostas de memoria). A frase "um paciente imunoactivado por celulas Ί" quando utilizada na presente invengao refere-se a um animal ou a um paciente humano que apresenta activagao de celulas T e em que uma outra estimulagao de resposta dessas celulas T poderia causar um risco medico. A frase "um paciente imunocomprometido" quando utilizada na presente invengao refere-se a um animal ou paciente humano que apresenta um sistema imunitario alterado pela idade, por uma doenga como a provocada pelo HIV [Human Immunodeficiency virus (Virus da Imunodeficiencia humana)], ou um cancro, ou por um tratamento como, por exemplo, tratamento de doengas inflamatorias incluindo, mas nao se limitando a, artrite reumatoide, psoriase, ldpus eritematoso sistemico, granulomatose de Wegener, etc.
Dentro do ambito da presente invengao, demonstrou-se que a resposta de anticorpo induzida pela composigao antigenica de acordo com a presente invengao e em grande parte independente de celulas T. Sobre esse assunto utilizou-se um modelo de murganho nu tendo-se vacinado murganhos nus e medido respostas de anticorpos para avaliar a resposta A -es-pecifica desses anticorpos induzida pela composigao antigenica de acordo com a presente invengao nos murganhos nus imunizados. Os murganhos nus sao portadores da mutagao Foxnlnu e como consequencia, apresentam reduzida fungao das celulas T na ausencia do respectivo timo. A frase "uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmaceutico" quando utilizada na presente invengao refere-se a uma dose do componente activo em uma composigao farmaceutica adequada para curar, ou pelo menos controlar ("arrest") parcialmente, os sintomas da doenga, do disthrbio ou da situagao a tratar ou quaisquer complicagoes que lhes estejam associadas. A presente descrigao faz uso de uma apresentagao de antigenios, em particular sobre a superficie de uma molecula transportadora ("carrier molecule") como um lipossoma que resulta em exposigao melhorada e estabilizagao de uma conformagao preferida de antigenio, que em liltima analise conduz a uma intensa resposta imunitaria especifica, especialmente uma resposta imunitaria independente de celulas T, e resulta na geragao de anticorpos com propriedades unicas.
Em particular, o peptido antigenico ocorre na superficie da molecula transportadora em um "array" altamente repetitivo, especialmente um "array" repetitivo que compreende pelo menos 10 unidades antigenicas repetitivas/molecula transportadora, particularmente pelo menos 50 unidades antigenicas repetitivas/molecula transportadora, especialmente pelo menos 100 unidades antigenicas repetitivas/molecula transportadora, principalmente pelo menos 200 unidades antigenicas repetitivas/molecula transportadora, essencialmente pelo menos 300 unidades antigenicas repetitivas/molecula transportadora, especificamente pelo menos 400 unidades antigenicas repetitivas/molecula transportadora, sobretudo pelo menos 500 unidades antigenicas repetitivas/molecula transportadora. 0 antigenio fosfopeptidico modificado de acordo com a presente invengao e tal como descrito na presente descrigao, particularmente urn antigenio fosfopeptidico gue imita urn fosfoepitopo patologico major da proteina tau, pode sintetizar-se seguindo urn metodo modificado descrito em Nicolau et. al. (2002) Proc Natl. Acad. Sci USA 99, 2332-2337. Essa abordagem implica a montagem passo a passo da construgao mediante sintese de peptidos em fase solida em uma resina de amida utilizando a quimica padrao de Fmoc/tBu. Seguidamente removeram-se os grupos protectores ortogonais das lisinas terminals e acilaram-se os grupos amino livres com acido palmitico. A desprotecgao dos grupos protectores da cadeia lateral e a libertagao concomitante do peptido proveniente da resina obteve-se sob condigoes acidas, proporcionando o fosfopeptido tetrapalmitoilado desejado sob a forma de urn produto bruto. 0 produto final pode obter-se seguidamente com pureza elevada e confirmar-se a sua identidade e pureza por metodos conhecidos na arte como, por exemplo, analise por espectrometria de massa com ionizagao por electrospray e/ou por HPLC.
Em uma forma de realizagao, a presente descrigao proporciona composigdes imunogenicas que compreendem urn antigenio fosfopeptidico de acordo com a mesma descrigao e tal como nela descrito imitando urn fosfoepitopo patologico major de proteina tau, peptido antigenico que se modifica de tal modo que e capaz de manter e estabilizar uma conformagao definida do antigenio. Essa conformagao definida leva a indugao de uma resposta imunitaria intensa e altamente especifica apos introdugao em urn animal ou no homem.
Uma forma de conseguir a formagao e a estabilizagao da conformagao desejada do peptido antigenico e atraves da apresentagao desse peptido antigenico ligado a, ou incorporado em ou reconstituido em, parcialmente ou totalmente, urn veiculo ("carrier"), em particular urn veiculo que tambem pode actuar como adjuvante.
Urn veiculo ("carrier") que se pode considerar no ambito da presente invengao e, por exemplo, uma vesicula, urn corpo ou uma molecula particulado(a); proteinas da membrana bacteriana, proteinas Omp [Outer Membrane Protein (Proteina da membrana externa)] enterobacterianas, nanoparticulas, micelas, particulas de ouro, microesferas e/ou virossomas ou quaisquer outros meios que podem adequadamente servir como urn veiculo/adjuvante para o peptido antigenico, mas, em particular, urn lipossoma.
Em urn aspecto especifico da presente descrigao, o peptido antigenico liga-se ao, ou incorpora-se no ou reconstitui-se no veiculo ("carrier") atraves de interacgoes fracas, como, por exemplo, interacgao de Van der Waals, hidrofobica ou electrostatica, ou de uma associagao de duas ou mais das referidas interacgdes, de tal modo que o peptido e apresentado com uma conformagao especifica, que e mantida e estabilizada restringindo o referido peptido antigenico na sua liberdade de movimento tridimensional de modo que as alteragoes conformacionais sao impedidas ou severamente restringidas.
Quando se utiliza uma vesicula, uma particula ou um corpo particulado como veiculo/adjuvante como, por exemplo, um lipossoma, a composigao do peptido antigenico pode escolher-se de tal modo que a sua carga liquida global seja identica a da superficie do veiculo/adjuvante a qual o peptido se liga. Sendo eficazes as forgas de repulsao electrostaticas entre a superficie do veiculo/adjuvante carregada de forma identica e o peptido antigenico, mas especialmente a superficie do veiculo carregada de forma identica e os restos dos aminoacidos que constituem o peptido antigenico e mais particularmente a superficie do veiculo carregada de forma identica e os restos dos aminoacidos carregados de forma identica incorporados no peptido antigenico, podem conduzir ao peptido antigenico que assume uma conformagao definida, altamente especifica e estabilizada que garante uma elevada actividade biologica. Como resultado, o peptido antigenico e exposto e apresentado em uma conformagao que e altamente activa sob o ponto de vista biologico na medida em que permite que o sistema imunologico do organismo alvo para interagir livremente com os determinantes antigenicos contidos na construgao antigenica na conformagao activa sob o ponto de vista biologico, que, apos administragao a um animal ou a um ser humano, conduz a uma resposta imunitaria forte e especifica da conformagao, resultando em, por exemplo, um elevado titulo de anticorpos no organismo alvo. A resposta imunogenica pode ainda aumentar-se atraves da utilizagao de um lipossoma como veiculo, lipossoma que pode funcionar como adjuvante para aumentar ou estimular a resposta imunitaria no animal ou no homem alvo a ser tratado com a composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao. Eventualmente, o lipossoma pode, alem disso, conter um outro adjuvante como, por exemplo, lipido A, alumen, fosfato de calcio, interleucina 1, e/ou microcapsulas de polissacaridos e de proteinas, mas especialmente um lipido A purificado, como lipido A monofosforilo ou difosforilo, ou aliimen .
Em um aspecto especifico da presente descrigao, um peptido antigenico de acordo com a mesma descrigao e nela descrito, em particular um peptido antigenico cuja carga liquida total e negativa, utiliza-se reconstituido em um lipossoma, em particular um lipossoma cujos constituintes se escolhem de tal modo que a carga total liquida do "head grupo" ("grupo de cabega") do lipossoma e negativa. Essencialmente, o lipossoma e formado por constituintes escolhidos no grupo que consta de dimiristoilfosfatidilcolina [((DMPC)) dimyristoyl phosphatidyl choline], dimiristoilfosfatidiletanolamina [(DMPEA) dimyristoyl phosphatidyl ethanolamine], dimiristoilfosfatidilglicerol [(DMPG) dimyristoyl phosphatidyl glycerol] e colesterol e, eventualmente, contem ainda lipido A monofosforilo ou qualquer outro adjuvante que se pode utilizar de um modo adequado no ambito da presente invengao como, por exemplo, aliimen, fosfato de calcio, interleucina 1, e/ou microcapsulas contendo polissacaridos e proteinas.
Em um outro aspecto especifico da presente descrigao fornece-se um antigenio peptidico modificado de acordo com a presente invengao e tal como descrito antes na mesma descrigao ligado de um modo covalente a uma molecula do tipo ancora que e capaz de se inserir no veiculo/adjuvante fixando desse modo o peptido ao veiculo/adjuvante e apresentando-o bem proximo, sobre a superficie ("on") ou no interior ("in"), de uma molecula transportadora/adjuvante de tal modo que as forgas electrostaticas podem tornar-se eficazes tal como descrito antes na presente descrigao.
Quando se utilizam lipossomas como veiculo/adjuvante, a construgao peptidica antigenica apresenta geralmente uma cauda hidrofobica que se insere na membrana do lipossoma a medida que se forma. Adicionalmente, podem modificar-se peptidos antigenicos de modo a incluir uma cauda hidrofobica para que se possam inserir no lipossoma. A descrigao da composigao antigenica compreende essencialmente peptidos modificados para intensificar o efeito antigenico sendo que tais peptidos se podem modificar por peguilagao (utilizando polietilenoglicol ou polietilenoglicol modificado), ou por meio de outros metodos modificados tais como utilizando acido palmitico como descrito antes na presente descrigao, poliaminoacidos (exemplo poliglicina, poli-histidina), polissacaridos (exemplo, acido poligalacturonico, acido polilactico, poliglicolido ou acido poliglicolico, quitina, quitosano), polimeros sinteticos (poliamidas, poliuretanos, poliesteres) ou co-polimeros [exemplo, poli(acido metacrilico) e N-(2-hi-droxi) propil metacrilamida] e outros.
Em um aspecto especifico da presente descrigao, proporcionam-se peptidos antigenicos de acordo com a mesma e tal como nela descritos antes, que se modificam de modo a conterem uma cauda hidrofobica de forma que os referidos peptidos se possam inserir no lipossoma. Em particular, o antigenio fosfopeptidico de acordo com a presente invengao e tal como descrito na presente descrigao que imita um fosfoepitopo patologico major da proteina tau, pode modificar-se utilizando um radical lipofilico ou hidrofobico que facilita a insergao na bicamada lipidica do veiculo/adjuvante. Os radicals lipofilicos ou hidrofobicos da presente invengao podem ser acidos gordos, trigliceridos e fosfolipidos, especialmente acidos gordos, trigliceridos e fosfolipidos, em que a cadeia de carbono ["carbon backbone" (espinha dorsal carbonada ou esqueleto de carbono)] dos acidos gordos tern pelo menos 10 atomos de carbono particularmente radicals lipofilicos que comportam acidos gordos com uma cadeia de carbono de pelo menos aproximadamente 14 atomos de carbono e ate aproximadamente 24 atomos de carbono, com cada niimero individual de atomos de carbono que caiam dentro desses limites fazendo igualmente parte da presente invengao. Em particular, a presente invengao refere-se a um peptido antigenico de acordo com a mesma e tal como descrito antes na presente descrigao, que se modifica para incluir uma cauda hidrofobica, especialmente uma cauda hidrofoba que comporta radicals hidrofobicos que possuem uma cadeia de carbono de pelo menos 14 atomos de carbono, mas sobretudo 16 atomos de carbono. Exemplos de radicals hidrofobicos incluem, mas nao estao limitados a, acido palmitico, acido estearico, acido miristico, acido laurico, acido oleico, acido linoleico, acido linolenico e colesterol ou 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanol-Amina [(DSPE) 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanol-amine] . Em uma forma de realizagao especifica da presente invengao, o radical hidrofobico e acido palmitico. 0 peptido antigenico de acordo com a presente descrigao e tal como descrito na mesma liga-se de um modo covalente a um radical lipofilico ou hidrofobico. No contexto da presente invengao, a ligagao covalente do peptido antigenico pode ser mediada atraves de restos de aminoacidos, que alongam as sequencias dos mesmos que correspondent as sequencias do peptido antigenico de acordo com a presente invengao, em particular na(s) sua(s) extremidade(s), especialmente na(s) sua(s) extremidade(s) N- e/ou C-terminal (ais), e as quais sao acoplados os restos de acidos gordos.
Em particular, cada conjugado comporta pelo menos quatro moleculas de acido gordo contendo uma cadeia de atomos de carbono entre C12 e C24, especialmente uma cadeia com 16 atomos de carbono, em que as moleculas de acidos gordos se ligam de um modo covalente nas extremidades N- e C-terminais dos peptidos antigenicos. Podem tambem prever-se outras distribuigdes, incluindo na sequencia de aminoacidos. Esses peptidos podem tambem acoplar-se de forma covalente as moleculas de acidos gordos.
As composigdes farmaceuticas da presente descrigao podem assim comportar lipossomas preparados utilizando lipossomas de reconstituigao na presenga de peptidos antigenicos purificados ou parcialmente purificados ou modificados de acordo com a presente invengao e tal como descritos na presente descrigao. Adicionalmente, podem reconstituir-se fragmentos peptidicos em lipossomas. A presente invengao tambem inclui fragmentos de peptidos antigenicos modificados de modo a aumentar a sua antigenicidade. Por exemplo, radicals e adjuvantes antigenicos podem ligar-se a ou misturar-se com o peptido. Exemplos de radicals e adjuvantes antigenicos incluem, mas nao estao limitados a, derivados lipofilicos de dipeptidos de muramilo [(MDP) muramyl dipeptides], polimeros de blocos nao ionicos, adjuvante hidroxido de aluminio ou fosfato de aluminio, e suas misturas.
Lipossomas que se podem utilizar nas composigoes da presente invengao incluem os que qualquer perito experiente na arte conhece. Para a preparagao de lipossomas podem utilizar-se qualquer dos lipidos convencionais liteis. Para preparar composigoes da presente invengao podem utilizar-se lipossomas convencionais de bicamadas e de multicamadas. Embora qualquer perito experiente na arte possa utilizar qualquer metodo que conhega para a preparagao de lipossomas os mais preferidos preparam-se de acordo com o metodo de Alving et al. , Infect. Immun. 60:2438-2444, 1992. 0 lipossoma pode conter facultativamente urn adjuvante ou urn imunomodulador ou ambos. Urn imunomodulador preferido e o lipido A, especialmente um lipido A purificado como, por exemplo, o lipido A monofosforilo ou difosforilo.
Lipossomas podem preparar-se pela tecnica de injecgao com fluxo cruzado como descrito, por exemplo, em Wagner et al. (2002) Journal of Liposome Research Vol 12 (3), pp 259-270.
Durante a injecgao de solugoes lipidicas em um sistema de tampao aquoso, os lipidos tendem a formar "precipitados", seguidos por auto-arranjo em vesiculas. 0 tamanho obtido das vesiculas depende de factores como concentragao lipidica, velocidade de agitagao, velocidade de injecgao, e a escolha de lipidos. 0 sistema de preparagao pode consistir em um modulo de injecgao com fluxo cruzado, recipientes para a fase polar (por exemplo, uma solugao tampao PBS), um recipiente com uma solugao de etanol/lipido e um dispositivo de pressao, mas especialmente um dispositivo de pressao de azoto.
Enquanto a solugao aquosa ou polar e bombeada atraves do modulo de injecgao com fluxo cruzado a solugao etanol/lipido e injectada na fase polar com pressdes variaveis aplicadas. 0 peptido antigenico modificado de acordo com a presente descrigao e como descrito na mesma pode ainda modificar-se mais por reconstituigao em lipossomas constituidos por fosfolipidos e colesterol ( (fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, colesterol) em proporgdes molares variadas. Podem utilizar-se outros fosfolipidos. Utiliza-se o lipido A em uma concentragao de aproximadamente 40 mg/pmol de fosfolipidos. 0 lipossoma pode ter uma dupla fungao em que se pode utilizar como urn veiculo que comporta a construgao supramolecular como descrito antes na presente descrigao e, ao mesmo tempo, funciona como urn adjuvante para aumentar ou estimular a resposta imunitaria no animal ou no humano alvo a tratar com a vacina terapeutica de acordo com a presente invengao. Eventualmente, o lipossoma pode, adicionalmente, conter urn outro adjuvante ou/e imunomodulador ou ambos como, por exemplo, lipido A, aliimen, fosfato de calcio, interleucina 1, e/ou microcapsulas de polissacaridos e de proteinas, mas especialmente urn lipido A, sobretudo urn lipido A purificado, como lipido A monofosforilo ou lipido A difosforilo, ou aliimen.
Em urn aspecto especifico da presente descrigao lipossomas com o lipido A utilizam-se como adjuvante para preparar a composigao farmaceutica da presente invengao. Misturam-se dimiristoilfosfatidilcolina, -glicerol e -colesterol, especialmente em uma proporgao molar de 9:1:7. Seguidamente adiciona-se urn imunomodelador forte como, por exemplo, lipido A monofosforilo em uma concentragao adequada, essencialmente em uma concentragao entre 20 mg e 50 mg por mmol, mais especificamente em uma concentragao entre 30 mg e 40 mg por mmol de fosfolipidos. Seguidamente adiciona-se o peptido antigenico modificado em uma proporgao molar entre o peptido e os fosfolipidos compreendida entre 1:30 e 1:200, especialmente em uma proporgao molar compreendida entre 1:50 e 1:120, mais especificamente entre 1:100. Os solventes eliminam-se, por exemplo por evaporagao, e hidrata-se a pelicula resultante com uma solugao tampao esteril como, por exemplo, PBS.
Em urn aspecto especifico da presente descrigao proporciona-se urn peptido antigenico de acordo com a presente invengao e tal como descrito na mesma descrigao modificado por pelo menos duas moleculas de acido palmitico ligadas de urn modo covalente as extremidades N- e C-terminais do referido peptido antigenico e por reconstituigao em urn veiculo lipossomal.
Palmitoilagao, ao mesmo tempo que proporciona uma ancora para o peptido na bicamada dos lipossomas, devido ao relativo comprimento reduzido do radical Ci6:o do acido gordo conduz ao peptido a ser apresentado exposto bem proximo, sobre ("on") ou no interior ("in"), da superficie do lipossoma. A composigao farmaceutica da presente descrigao que compreende urn antigenio peptidico de acordo com a mesma e tal como nela descrito, em particular urn fosfopeptido que imita fosfoepitopos patologicos major da proteina tau, especialmente em uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmaceutico, pode preparar-se sob a forma de urn solugao liquida, ou de uma suspensao injectavel, ou de uma forma solida adequada para a solubilizagao antes da injecgao como, por exemplo, um kit para utilizar a presente composigao, como descrito seguidamente.
Veiculos ("carriers") , diluentes e/ou excipientes farmaceuticos adequados sao bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, solugoes salinas tamponadas com fosfato, agua, emulsoes como emulsoes oleo em agua, varios tipos de agentes molhantes, solugoes estereis, etc.. A formulagao da composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao pode realizar-se de acordo com a metodologia convencional que os peritos na especialidade conhecem. A composigao farmaceutica da presente descrigao que compreende um antigenio peptidico de acordo com a mesma descrigao e tal como nela descrito, em particular um fosfopeptido que imita fosfoepitopos patologicos major da proteina tau, especialmente em uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmaceutico, pode administrar-se ao homem ou a outro animal afectado por uma tauopatia ou por sintomas associados a uma tauopatia, para induzir uma resposta imunitaria no referido ser humano ou animal para aliviar os sintomas associados a doenga ou para restabelecer a situagao que se encontra em individuos saudaveis que nao sao afectados pela doenga.
As composig5es da presente descrigao administram-se ao homem ou a um outro animal por quaisquer vias de administragao convencionais apropriadas sob a forma de um solido, liquido ou aerossol em uma dose adequada, eficaz sob o ponto de vista farmaceutico. Na generalidade, a composigao pode administrar-se atraves das vias oral topica, rectal, nasal ou parenterica (por exemplo, intravenosa, subcutanea, ou intramuscular). Alem disso, a composigao pode incorporar--se em matrizes de libertagao continua ["sustained" (constante)] como polimeros biodegradaveis, sendo os polimeros implantados proximo do local onde se pretende a libertagao ("delivery") , por exemplo, no local de um tumor. 0 metodo inclui a administragao de uma dose individual, a administragao de doses repetidas em intervalos de tempo pre--determinados, e a administragao continua ["sustained" (constante)] durante um periodo de tempo pre-determinado.
Em um aspecto especifico da presente descrigao a construgao antigenica de acordo com a mesma descrigao, especialmente uma composigao vacinica que compreende a referida construgao antigenica sob uma forma aceitavel sob o ponto de vista farmaceutico, administra-se em doses repetidas, em particular em 1 a 15 doses, mais especialmente em 2 a 10 doses, mais especificamente, em 3 a 5 doses e ainda sobretudo em 3 doses, em intervalos de tempo entre uma semana e 20 semanas, em particular em intervalos de tempo entre 1 e 10 semanas, essencialmente em intervalos de tempo entre 1 e 6 semanas, mais especificamente em intervalos de tempo entre 1 e 4 semanas, e sobretudo em intervalos de tempo entre 2 e 3 semanas. A resposta imunitaria pode monitorizar-se mediante colheita de amostras de soro/plasma no momento apropriado apos o reforgo ("boosting") , especialmente 3 a 10 dias apos o reforgo, mais especialmente 4 a 8 dias apos o reforgo e sobretudo 7 dias apos o reforgo e determinar-se a imunogenicidade da construgao antigenica utilizando uma metodologia conhecida, especialmente um dos imunoensaios vulgarmente utilizados como, por exemplo, um ensaio ELISA.
Em particular, a composigao que contem peptidos antigenicos de acordo com a presente descrigao administra-se por via parenterica, especialmente por injecgao intraperito-neal, intravenosa, subcutanea e intramuscular.
Preparagoes para administragao parenterica incluem solugdes aquosas ou nao aquosas, suspensoes e emulsbes estereis. Solventes nao aquosos incluem sem caracter limitativo, propilenoglicol, polietilenoglicol, urn oleo vegetal como azeite, e esteres organicos injectaveis como oleato de etilo. Solventes aquosos podem escolher-se no grupo constituido por agua, solugdes alcool/agua, emulsdes ou suspensdes incluindo meios salinos e tamponados. Veiculos parentericos incluem solugao de cloreto de sodio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sodio, Ringer com lactato, ou oleos nao volateis. Veiculos intravenosos incluem agentes "replenishers" (agentes que repoem o que se perdeu, consumiu ou que esta em falta) de fluidos e de nutrientes, agentes "replenishers" de electrolitos (como os baseados em dextrose de Ringer) e outros. Conservantes podem tambem estar presentes como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, etc. A dosagem da composigao dependera da afecgao a tratar, da composigao especifica utilizada, e de outros factores clinicos como peso, estatura e condigao do paciente, area da superficie corporal, o composto ou a composigao especifico(a) a ser administrado(a), outros farmacos a serem administrados simultaneamente, e a via de administragao. A composigao farmaceutica de acordo com a presente descrigao pode administrar-se em associagao com outras substancias activas sob o ponto de vista biologico e procedimentos para o tratamento de doengas, especialmente doengas neurodegenerativas. As outras substancias activas sob o ponto de vista biologico podem ja fazer parte da mesma composigao gue contem a composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao, sob a forma de uma mistura, em que a composigao farmaceutica da presente invengao e a outra substancia activa sob o ponto de vista biologico misturam-se entre si no ou com o mesmo solvente e/ou veiculo aceitavel sob o ponto de vista farmaceutico ou podem preparar-se separadamente como parte de uma composigao separada, que se pode apresentar em separado ou em conjunto sob a forma de urn kit composto por partes. A composigao farmaceutica de acordo com a presente descrigao pode administrar-se concomitantemente com a(s) outra ou outras substancia(s) activa(s) sob o ponto de vista biologico, de forma intermitente ou sequencialmente. Por exemplo, a composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao pode administrar-se em simultaneo com uma primeira substancia adicional activa sob o ponto de vista biologico ou sequencialmente apos ou antes da administragao da composigao farmaceutica. Quando se escolhe urn esquema de administragao onde se dispensa mais do que uma substancia adicional activa sob o ponto de vista biologico em conjunto com pelo menos uma composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao, os compostos ou as substancias podem administrar-se parcialmente em simultaneo, parcialmente de urn modo sequencial em associagdes varias.
Constitui urn outro objectivo da presente descrigao preparar misturas de uma composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao e, facultativamente, uma ou mais outras substancias activas sob o ponto de vista biologico, bem como metodos para a utilizagao de uma composigao farmaceutica de acordo com a presente descrigao, ou suas misturas incluindo composigoes que compreendem a referida composigao farmaceutica ou misturas da composigao farmaceutica para a prevengao e/ou tratamento terapeutico e/ou alivio dos efeitos de tauopatias, urn grupo de doengas e de disturbios associada(o)s a formagao de lesoes neurofibrilares, a patologia cerebral predominante neste grupo de distiirbios neurodegenerativos incluindo, mas nao se limitando a, Doenga de Alzheimer, doenga de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilistica, Sindrome de Down, doenga de Gerstmann--Straussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusao, e angiopatia amiloide cerebral causada por proteina prionica, lesao cerebral traumatica e ainda complexo esclerose lateral amiotrofica/parkinsonismo-demencia de Guam, doenga do neuronio motor nao guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demencia do grao argirofilico, degeneragao corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificagao, demencia frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, doenga de Hallevorden-Spatz, atrofia de miiltiplos sistemas, doenga de Niemann-Pick tipo C, doenga de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, Panencefalite esclerosante subaguda, demencia senil do tipo caracterizado por emaranhados neurofibrilares (Tangle only dementia), Parkinsonismo pos-encefalitico, Distrofia miotonica.
As misturas de acordo com a presente descrigao podem comportar, alem do mais uma composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao, uma substancia activa sob o ponto de vista biologico como, por exemplo, compostos conhecidos utilizados no tratamento de tauopatias e/ou de amiloidoses, urn grupo de doengas e disthrbios associada(o)s a proteina amiloide ou a uma proteina similar a amiloide como a proteina amiloide β implicada na Doenga de Alzheimer.
Em um outro aspecto da descrigao, a(o) outra(o) substancia ou composto activa(o) sob o ponto de vista biologico pode tambem ser um agente terapeutico gue se pode utilizar no tratamento de doengas e distiirbios que sao causada (o)s por ou estao associada(o)s a proteinas amiloides ou similares a amiloides incluindo amiloidose causada por amiloide β ou que se pode utilizar no tratamento de outros distiirbios neurologicos . A(o) outra(o) substancia ou composto activa(o) sob o ponto de vista biologico pode exercer o seu efeito biologico pelo mesmo ou por um mecanismo semelhante ao da vacina terapeutica de acordo com a presente invengao ou por um mecanismo de acgao nao relacionado ou por uma multiplicidade de mecanismos de acgao relacionados e/ou nao relacionados.
Geralmente, o outro composto activo sob o ponto de vista biologico pode incluir potenciadores da transmissao de neutroes, farmacos psicoterapeuticos, inibidores da acetilcolinesterase, bloqueadores dos canais de calcio, aminas biogenicas, tranquilizantes de benzodiazepinas, a sintese de acetilcolina, potenciadores de acumulagao ("storage") ou de libertagao, agonistas dos receptores pos--sinapticos da acetilcolina, inibidores da monoamina-oxidase--A ou B, antagonistas dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) do glutamato, farmacos anti-inflamatorios nao esteroides; antioxidantes, e antagonistas dos receptores serotoninergicos.
Em particular, a mistura de acordo com a presente descrigao pode comportar pelo menos urn outro composto activo sob o ponto de vista biologico escolhido no grupo constituido por compostos contra o stresse oxidativo, compostos anti-apo-ptoticos, quelantes de metais, inibidores de reparagao do ADN como pirenzepina e metabolitos, acido 3-amino-l-propanossul-fonico (3APS) , 1,3-propanodissulfonato (1,3PDS), activadores de secretase, inibidores da P- e da γ-secretase, proteinas tau, neurotransmissor, β-sheet breakers (uma nova classe de farmacos que sao concebidos para se ligarem especificamente ao peptido beta-amiloide e bloquearem e/ou inverterem essa alteragao conformacional anormal), moleculas anti-inflamato-rias, ou inibidores da colinesterase [ (ChEls) cholinesterase inhibitors] como tacrina, rivastigmina, donepezilo, e/galantamina e outros farmacos e suplementos nutritivos, em associagao com uma vacina terapeutica de acordo com a presente invengao e, facultativamente, urn veiculo e/ou urn diluente e/ou um excipiente aceitavel/aceitaveis sob o ponto de vista farmaceutico.
Em um aspecto adicional, as misturas de acordo com a presente descrigao podem comportar niacina ou memantina em associagao com uma vacina terapeutica de acordo com a presente invengao e, facultativamente, um veiculo e/ou um diluente e/ou um excipiente aceitavel/aceitaveis sob o ponto de vista farmaceutico.
Em ainda um outro aspecto da presente descrigao preparam-se misturas que comportam "antipsicoticos atipicos" como, por exemplo clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina para o tratamento de sintomas psicoticos positivos e negativos incluindo alucinagdes, delirios, perturbagoes do pensamento (que se manifestam por acentuada incoerencia, descarrilamento ("derailment"), tangencialidade) , e comportamento bizarro ou desorganizado, bem como anedonia, apatia afectiva ("flattened affect'') , apatia, e retraimento social, em associagao com uma vacina terapeutica de acordo com a presente invengao e, facultativamente, urn veiculo e/ou urn diluente e/ou urn excipiente aceitavel/aceitaveis sob o ponto de vista farmaceutico.
Em urn aspecto especifico da presente descrigao, as composig5es e misturas de acordo com a mesma e como nela descritas antes comportam a composigao farmaceutica de acordo com a mesma descrigao e a substancia activa sob o ponto de vista biologico, respectivamente, em uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapeutico ou profilactico.
Outros compostos que se podem utilizar de um modo adequado em misturas em associagao com a composigao farmaceutica de acordo com a presente invengao sao descritos, por exemplo, na patente de invengao internacional WO 2004/058258 (ver especialmente paginas 16 e 17) incluindo alvos de farmacos utilizados na terapeutica de doengas (paginas 36 a 39), acidos alcanossulfonicos e acido alcanossulfiirico (paginas 39 a 51) , inibidores da colinesterase (paginas 51 a 56) , antagonistas dos receptores NMDA (paginas 56 a 58), estrogenios (paginas 58 e 59), farmacos anti-inflamatorios nao esteroides (paginas 60 e 61), antioxidantes (paginas 61 e 62), agonistas dos receptores dos proliferadores activados de peroxissoma [(PPAR) peroxisome proliferators-activated receptors] (paginas 63 a 67), agentes redutores de colesterol (paginas 68 a 75), inibidores da proteina amiloide (paginas 75 a 77), inibidores da formagao da proteina amiloide (paginas 77 a 78), quelantes de metais (paginas 78 a 79), antipsicoticos e antidepressivos (paginas 80 a 82), suplementos nutricionais (paginas 83 a 89), e compostos que aumentam a disponibilidade no cerebro de substancias activas sob o ponto de vista biologico (paginas 89 a 93) e pro-farmacos (paginas 93 e 94).
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Vacinas
Para o desenvolvimento de vacinas desenharam-se oito sequencias derivadas da proteina fosfo-tau como antigenios. Como controlo utilizou-se um peptido imunogenico utilizado anteriormente (Asuni et al., 2007).
Quadro 1: Descrigao das sequencias Tau
EXEMPLO 2 Preparaqao dos fosfopeptidos tetrapalmitoilados derivados da proteina Tau
A sequencia peptidica antigenica flanqueada pelos 2 pares de Lisinas montou-se por etapas atraves de sintese de peptidos em fase solida em uma resina amida utilizando a quimica Fmoc/tBu convencional. Seguidamente eliminaram-se os grupos de protecgao ortogonal das lisinas dos terminals e acilaram-se os grupos amino livres com acido palmitico. A desprotecgao dos grupos protectores da cadeia lateral e a separagao concomitante do peptido da resina conseguiu-se sob condigdes acidas, proporcionando o desejado fosfopeptido tetrapalmitoilado sob a forma de urn produto bruto. A identidade e a pureza confirmaram-se ainda por espectrometria de massa pela tecnica de MALDI-TOF [Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (Tempo de voo)] e analise por HPLC.
Sequencias dos fosfopeptidos tetrapalmitoilados derivados da proteina Tau T1: H-K{Pal)-K(Pal)- RQEFEVMEDHAGTY(P>GL-K(Pa!)-K(Pal)-NH2 T2:H-K(Pal)-K(Pai)-PGS(p)PGT(p)PGSRSRT(p)PS(p)LP-K(Pal)-K(Pa!)-NH2 T3: H-K(Pal)-K(Pal)-VYKS(p)PWSGDTS(p)PRHL-K(Pal)-K(Pal)-NH? T4: H-K(Pal)-K(Pal)-GDTS(p)PRHLS(p)NVSSTGSID-K<Pal)-K(Pal)-NH2 T8 : H-K(Pat)-K(Pal)- PGSRSRT(p)PS(p)LPTPPTR-K(Pal)-K(Pal)-NH2 T9 :H-K(Pal)-K(Pal)- GYSSPGS(p)PGT(p)PGSRSR-K(Pal)-K(Pai)-NH2 T10: H-K(Pal)-K(Pal)-HLS(p)NVSSTGS1D-K(Pa!)-K(Pal)-NH2 T11: H-K(Pal)-K(Pal)-VSGDTS(p)PRHL-K(Pal)-K(Pal)-NH2 2.1: Sintese do antigenio peptidico Tl 0 aminoacido Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 eq) protegido segundo a estrategia de protecgao ortogonal incorporou-se ("was loaded") manualmente em resina amida de Rink (resina MBHA amida de Rink, 1 eq, 0,26 mmol) na presenga de 2 eq de DIC/HOBt em DMF. Lavou-se depois a resina com DMF (3 x 1 m) . Depois de eliminar o grupo Fmoc do N-terminal com piperidina a 25% em DMF (Ixlme2xl5m) acoplou-se automaticamente o segundo resto de Fmoc-Lys (Mtt)-OH (3 eq) utilizando 5 eq da mistura PyBOP/HOBt/DIEA em DMF (2 x 15 m). Os seguintes 16 aminoacidos que contem os grupos de protecgao convencionais Fmoc da cadeia lateral incorporaram-se automaticamente aplicando o protocolo de acoplamento descrito anteriormente. Os fosfoaminoacidos introduziram-se como esteres monobenzilicos no grupo fosfato. A cada etapa de acoplamento seguiu-se uma etapa de lavagem com DMF (3 x 30 s) , etapa de eliminagao de Fmoc com piperidina a 25% em DMF (3 x 3 m) e uma segunda etapa de lavagem com DMF (6 x 30 s) . Apos o acoplamento da Tyr (PO (OBzl) 2), utilizou-se DBU a 0,5% em DMF na etapa de desprotecgao dos grupos Fmoc. A montagem da sequencia peptidica terminou com a adigao dos dois liltimos derivados Fmoc-Lys(Mtt)-OH utilizando 2 eq de PyBOP/HOBt/DIEA em DMF.
Em seguida, clivaram-se selectivamente os grupos Mtt (metiltritilo) dos restos das lisinas terminals sob azoto mediante tratamento da resina (1 eq, 600 mg, 0.092 mmol) com 10 ml de uma mistura desgaseificada de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante alguns ciclos de 10 m. Lavou-se a resina com DCM (3x) e DMF (x3) . Em seguida, acoplou-se o acido palmitico (20 eq, 473 mg, 1,85 mmol) a esses grupos amino desprotegidos utilizando TBTU (20 eq, 593 mg, 1.85 mmol) e DIEA (40 eq, 643 μΐ, 3.70 mmol) em DCM/DMF (1:1) (6 ml). Lavou-se a resina com DCM (5x) e DMF (5x). Em seguida, removeu-se o grupo Fmoc do N-terminal com piperidina desgaseificada a 20% em DMF (3 x 10 m) e lavou-se a resina com DMF (3x) e DCM (5x) . Finalmente realizaram-se simultaneamente a clivagem da resina e as desprotecgdes das cadeias laterals sob atmosfera de azoto com uma mistura desgaseificada de TFA/TIPS/H20/EDT (95:1:2,5:2,5) (4 ml) durante 4,5 h. Trituragao no eter dietilico frio forneceu o produto T1 bruto sob a forma de urn solido branco (189 mg, rendimento 60%) com uma pureza de 56% (determinada por HPLC). Por espectrometria de massa pela tecnica de MALDI-TOF confirmou-se a identidade do produto major (m/z esperado: 3427,12 [MH+], encontrado: 3426,87). 2.2: Sintese do antigenio peptidico T3 0 aminoacido Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 eq) protegido segundo a estrategia de protecgao ortogonal incorporou-se ("was loaded") manualmente em resina amida de Rink (resina MBHA amida de Rink, 1 eq, 0,4 mmol) na presenga da mistura PyBOP/HOBt/DIEA em DMF. Seguidamente lavou-se a resina com DMF (3 x 1 m). Apos a remogao do grupo Fmoc do N-terminal com piperidina a 25% em DMF (1 x 1 m e 2 x 15 m) , acoplou-se o segundo resto de Fmoc-Lys (Mtt) -OH (3 eq) , utilizando as mesmas condigdes de incorporagao ("the same loading conditions") . Os seguintes 16 aminoacidos que contem os grupos de protecgao convencionais Fmoc da cadeia lateral incorporaram-se manualmente aplicando o protocolo de acoplamento descrito anteriormente. Os fosfoaminoacidos introduziram-se como esteres monobenzilicos no grupo fosfato. 0 tempo de acoplamento determinou-se por urn ensaio com TNBT ou por urn ensaio com cloranilo depois da Prolina. No caso de necessidade, realizou-se urn segundo acoplamento com 2 eq de Fmoc-aminoacido na presenga de DIC/HOBt ou HATU/DIEA. A cada etapa de acoplamento seguiu-se uma etapa de lavagem com DMF (3 x 1 m) , etapa de eliminagao de Fmoc com piperidina a 25% em DMF (Ixlme2xl5m) e uma segunda etapa de lavagem com DMF (7 x 1 m) . Apos o acoplamento do primeiro Ser (PO (OBzl) OH) , utilizou-se DBU a 0,5% em DMF para a etapa de desprotecgao dos Fmoc. A montagem da sequencia do peptido terminou com a adigao dos dois dltimos Fmoc-Lys(Mtt)-OH.
Em seguida, clivaram-se selectivamente os grupos Mtt (metiltritilo) dos restos das lisinas terminals mediante tratamento da resina (1 eq, 195 mg, 0,01 mmol) com 10 ml de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante alguns ciclos de 10 m. Lavou-se a resina com DCM (3x) e DMF (3x) . Em seguida, acoplou-se o acido palmitico (20 eq, 51 mg, 0,2 mmol) a esses grupos amino desprotegidos utilizando TBTU (20 eq, 64 mg, 0,2 mmol) e DIEA (40 eq, 70 μΐ, 0,4 mmol) em DCM/DMF (1:1) (2 ml). Lavou-se a resina com DCM (5x) e DMF (5x) . Em seguida, removeu-se o grupo Fmoc do N-terminal com piperidina desgaseificada a 20% em DMF (3 x 10 m) e lavou-se a resina com DMF (3x) e DCM (5x). Finalmente realizaram-se simultaneamente a clivagem da resina e as desprotecgoes das cadeias laterals com uma mistura de TFA/TIPS/H20 (95:2,5:2,5) (2 ml) durante 2 h. Trituragao no eter dietilico frio forneceu o produto T3 bruto sob a forma de urn solido branco (34 mg, rendimento 100%) com uma pureza de 67% (determinada por HPLC). Por espectrometria de massa pela tecnica de MALDI-TOF confirmou-se a identidade do produto major (m/z esperado: 3365,15 [MH+], encontrado: 3369,66). 2.3 Sintese do antigenio peptidico T4 0 aminoacido Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 eq) protegido segundo a estrategia de protecgao ortogonal (5 vezes em excesso) fixou--se automaticamente ligado a resina amida Tentagel R RAM (0,19mm/g, 750 mg, 0,1425 mmol) utilizando DCCI e HOBt como agentes de activagao no seio de DMF. Apos a remogao do grupo Fmoc do N-terminal, acoplou-se urn segundo resto da Fmoc-Lys-- (MTT) - OH (5 vezes em excesso) na presenga de DCCI e de HOBt. Os seguintes 16 aminoacidos que contem os grupos de protecgao convencionais da cadeia lateral incorporaram-se automaticamente aplicando protocolos similares de acoplamento/desprotecgao. Os fosfoaminoacidos introduziram-se como esteres monobenzilicos no grupo fosfato. Para todos os restos realizaram-se acoplamentos duplos de 60 m seguidos por uma etapa de capping com anidrido acetico. A montagem da sequencia do peptido terminou com a adigao das duas illtimas Fmoc-Lys(Mtt)-OH.
Em seguida, clivaram-se selectivamente os grupos Mtt (metiltritilo) dos restos das lisinas terminals mediante tratamento da resina (1 eq, 750 mg, 0,075 mmol) com 10 ml de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante alguns ciclos de 10 m. Lavou-se a resina com DCM (3x) e DMF (3x) . Em seguida, acoplou-se o acido palmitico (20 eg, 51 mg, 0,2 mmol) a esses grupos amino desprotegidos utilizando TBTU (20 eq, 482 mg, 1,5 mmol) e DIEA (40 eq, 536 μΐ, 3,0 mmol) em DCM/DMF (1:1) (7 ml).
Lavou-se a resina com DCM (5x) e DMF (5x) . Em seguida, removeu-se o grupo Fmoc do N-terminal com piperidina a 20% em DMF (3 x 10 m) e lavou-se a resina com DMF (3x) e DCM (5x). Finalmente realizaram-se simultaneamente a clivagem da resina e as desprotecgdes das cadeias laterals utilizando uma mistura de TFA/TIPS/H20 (95:2,5:2,5) (6 ml) durante 3,5 h.
Trituragao no eter dietilico frio forneceu o produto T4 bruto sob a forma de urn solido branco (96 mg, rendimento 37%) com uma pureza de 50% (determinada por HPLC). Por espectrometria de massa pela tecnica de MALDI-TOF confirmou-se a identidade do produto major (m/z esperado: 3455,10 [MH+], encontrado: 3456,13). 2.4: Sintese do antigenio peptidico T8 0 aminoacido Fmoc-Lys (Mtt) -OH (5 eq, 781 mg, 1,25 mmol) protegido segundo a estrategia de protecgao ortogonal fixou--se manualmente a resina PEGA amida de Rink (1 eq, 0,33 mmol/g, 758 g) utilizando DIPCDI (5 eq, 196 ml, 1,25 mmol) e HOBt (5 eq, 169 mg, 1,25 mmol) em DMF (5 ml) para dois acoplamentos de 8 h. Seguidamente lavou-se a resina com DMF (5x). Apos a remogao do grupo Fmoc do N-terminal com piperidina a 20% em DMF (7 ml x 3 x 5 m) , acoplou-se urn segundo resto de Fmoc-Lys(Mtt)-OH (10 eq, 1,56 g, 2,5 mmol), na presenga de na presenga de HBTU (10 eq, 803 mg, 2,5 mmol), HOBt (10 eq, 338 mg, 2,5 mmol) e DIEA (20 eq, 871 ml, 5,0 mmol) . Os seguintes 16 aminoacidos que contem os grupos de protecgao convencionais da cadeia lateral incorporaram-se manualmente atraves de ciclos similares de acoplamento/desprotecgao/lavagem. Excepcionalmente, introdu-ziram-se os fosfoaminoacidos como esteres monobenzilicos no grupo fosfato (10 eq) com TBTU (10 eq) , HOBt (5 eq) e DIEA (15 eq) em DMF. Ao longo da sintese utilizou-se urn tempo de acoplamento de 1 h. A montagem da sequencia do peptido terminou com a adigao dos dois dltimos Fmoc-Lys(Mtt)-OH.
Em seguida, clivaram-se selectivamente os grupos Mtt (metiltritilo) dos restos das lisinas terminals mediante tratamento da peptidil-resina (1 eq, 385 mg, 0,019 mmol) com 10 ml de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante alguns ciclos de 10 m. Lavou-se a resina com DCM (3x) e DMF (3x) . Em seguida, acoplou-se acido palmitico (20 eq, 968 mg, 3,8 mmol) a esses grupos amino desprotegidos utilizando TBTU (20 eq, 1,21 mg, 3,8 mmol) e DIEA (40 eq, 1,31 ml, 7,6 mmol) em DCM/DMF (1:1) (4 ml) . Lavou-se a resina com DCM (5x) e DMF (5x) . Em seguida, eliminou-se o grupo Fmoc do N-terminal com piperidina a 20% em DMF (3 x 10 m) e lavou-se a resina com DMF (3x) e DCM (5x). Finalmente realizaram-se simultaneamente a clivagem da resina e as desprotecgdes das cadeias laterals utilizando uma mistura de TFA/TIPS/H20 (95:2,5:2,5) (4 ml) durante 3,5 h. Trituragao no eter dietilico frio forneceu o produto T8 bruto sob a forma de urn solido branco (50,2 mg, rendimento 10%) com uma pureza de 55% (determinada por HPLC) . Por espectrometria de massa pela tecnica de MALDI-TOF confirmou-se a identidade do produto major (m/z esperado: 3331,17 [MH+], encontrado: 3335,19). 2.5: Sintese do antigenio peptidico T9 0 aminoacido Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 eq) protegido segundo a estrategia de protecgao ortogonal incorporou-se ("was loaded") manualmente em resina amida de Rink (resina MBHA amida de Rink, 1 eq, 0,4 mmol) na presenga de PyBOP/HOBt/DIEA em DMF. Lavou-se depois a resina com DMF (3 x 1 m). Depois de eliminar o grupo Fmoc do N-terminal com piperidina a 25% em DMF (Ixlme2xl5m) acoplou-se o segundo resto de Fmoc-Lys (Mtt) -OH (3 eq) utilizando as mesmas condigdes de incorporagao. Os seguintes 16 aminoacidos que contem os grupos de protecgao convencionais Fmoc da cadeia lateral incorporaram-se aplicando o protocolo de acoplamento descrito anteriormente. Os fosfoaminoacidos introduziram-se como esteres monobenzilicos no grupo fosfato. 0 tempo de acoplamento determinou-se por urn ensaio com TNBT ou por urn ensaio com cloranilo depois da Prolina. No caso de necessidade, realizou-se urn segundo acoplamento com 2 eq de Fmoc-aminoacido na presenga de DIC/HOBt ou HATU/DIEA. A cada etapa de acoplamento seguiu-se uma etapa de lavagem com DMF (3 x 1 m) , etapa de eliminagao de Fmoc com piperidina a 25% em DMF (Ixlme2xl5m) e uma segunda etapa de lavagem com DMF (7 x 1 m) . Apos o acoplamento do primeiro Thr (PO (OBzI) OH) , utilizou-se DBU a 0,5% em DMF para a etapa de desprotecgao dos Fmoc. A montagem da sequencia do peptido terminou com a adigao dos dois dltimos Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Em seguida, clivaram-se selectivamente os grupos Mtt (metiltritilo) dos restos das lisinas terminals mediante tratamento da resina (1 eq, 650 mg, 0,156 mmol) com 10 ml de TIPS/TFA/DCM (1:1:98) durante alguns ciclos de 10 m. Apos lavagem com DCM (3x) e DMF (3x), acoplou-se o acido palmitico (20 eq, 1,01 g, 3,15 mmol) a esses grupos amino desprotegidos utilizando TBTU (20 eq, 814 mg, 3,15 mmol) e DIEA (40 eq, 1,1 ml, 6,30 mmol) em DCM/DMF (1:1) (6 ml). Lavou-se muito bem a resina com DCM (5x) e DMF (5x) . Em seguida, removeu-se o grupo Fmoc do N-terminal com piperidina a 20% em DMF (3 x 10 m) e lavou-se a resina novamente com DMF (3x) e DCM (5x) . Finalmente realizaram-se simultaneamente a clivagem da resina e as desprotecgdes das cadeias laterals com uma mistura de TFA/TIPS/H20 (95:2,5:2,5) (9 ml) durante 3 h. Trituragao no eter dietilico frio forneceu 0 produto T9 bruto sob a forma de urn solido branco (291 mg, rendimento 59%) com uma pureza de 69% (determinada por HPLC) . Por espectrometria de massa pela tecnica de MALDI-TOF confirmou-se a identidade do produto major (m/z esperado: 3172,98 [MH+], encontrado: 3172, 90) .
2.6: Sintese do antigenio peptidico TIP 0 peptido tetrapalmitoilado T10 preparou-se seguindo urn protocolo semelhante ao do T9 (escala de sintese peptidica: 0,25 mmol). Alem do mais, utilizou-se uma pseudo prolina [psi (Gly-Ser)] como bloco de construgao antes da problematica sequencia Asn-Val-Ser-Ser. 0 produto bruto T10 obteve-se sob a forma de um solido branco (809 mg, rendimento quantitative) com uma pureza de 56% (determinada por HPLC) . Por espectrometria de massa pela tecnica de MALDI-TOF confirmou-se a identidade do produto major (m/z esperado: 2761,9 [MH+], encontrado: 2759,2). 2.7: Sintese do antigenio peptidico Til. 0 peptido tetrapalmitoilado Til preparou-se seguindo um protocolo semelhante ao do T9 (escala de sintese peptidica: 0,25 mmol). 0 produto bruto Til obteve-se sob a forma de um solido branco (495 mg, rendimento 76%) com uma pureza de 80% (determinada por HPLC). Por espectrometria de massa pela tecnica de MALDI-TOF confirmou-se a identidade do produto major (m/z esperado: 2613,8 [MH+], encontrado: 2612,2). EXEMPLO 3: Preparagao da vacina (Processo A)
Pesou-se o fosfopeptido tetrapalmitoilado derivado da proteina tau (relativamente a quantidade consultar o Quadro 2 que se segue) , e colocou-se em um balao de fundo redondo de 250 ml. Seguidamente pesaram-se Dimiristoil-fosfatidilcolina [(DMPC) Dimyrlstoyl phosphatidylcholine] , Dimiristoil-fosf atidilglicerol [(DMPG) Dimyristoyl phosphatidylglycerol], Colesterol e adjuvante Lipido A monofosforilo [(MPLA) Monophosphoryl Lipid A] (todos fornecidos por Avanti Polar Lipids Inc. AL, USA) e adicionaram-se na proporgao molar de 9:1:7:0,2, respectivamente. Seguidamente juntou-se cloroformio para se obter uma solugao transparente com delicadas {"fine") particulas. Apos agitagao suave durante 15 m, eliminou-se o solvente organico por evaporagao sob pressao reduzida a temperatura de 40 °C e depois sob alto vacuo durante 3 h. Re-hidratou-se a fina pelicula resultante por adigao de PBS esteril em uma hotte laminar e agitou-se suavemente a temperatura ambiente durante 18 h. A proporgao molar final entre peptido/fosfolipido foi de 1:100.
Seguidamente dividiu-se a suspensao lipossomal em aliquotas para tubos Falcon estereis de 15 ml (5 ml do produto por tubo) antes da armazenagem a uma temperatura entre 2 e 8 °C. A concentragao do peptido final foi de 40 μΜ. EXEMPLO 4: Caracterizagao de vacinas de Tau lipossomais 4.1. Metodos
4.1.1. Quantificagao do Peptido, da DMPC e do Colesterol por HPLC
Para analise das vacinas de tau lipossomais (ACi-33, ACI-35, ACI-36, ACi-39, ACI-40 e ACi-41 todas preparadas de acordo com o processo A descrito no Exemplo 3), prepararam-se amostras mediante a adigao de agua (20 μΐ) a amostra da vacina (20 μΐ) em um vial de vidro para HPLC, seguida por isopropanol (140 μΐ) e TFA (20 μΐ). A amostra diluida 5 vezes foi rapidamente agitada com formagao de vortice antes da injecgao (20 μΐ). A analise realizou-se utilizando uma coluna Zorbax 300SB-B3 de fase reversa C3 (250 x 4, 6mm, 5pm, 300A, Agilent) com a temperatura controlada por termostato ate 75 2C com detecgao a 207 e a 214 nm. Os solventes de eluigao foram os seguintes: Solvente B, 95% de Isopropanol, 5% de agua, 0,1% de TFA (acido trifluoroacetico); Solvente A, 10% de acetonitrilo, 90% de agua, 0,1% de TFA. Um gradiente de 40% de B a 60% de B aplicou-se durante 20 m com um caudal de 1 ml/m. Para fins de calibragao utilizaram-se separadamente em diferentes concentragdes padroes de peptidos tau (ΤΙ, T3, T4, T8 e T9) e de DPPC (Dipalmitoilfosfatidilcolina)/Colesterol. Para peptidos tau, preparou-se uma solugao stock de 1 mg/ml em TFA/iPrOH/H20 (1:7:2) e diluiu-se (1:1) em serie a partir de 400 pg/ml ate 12,5 pg/ml. Para os lipidos, prepararam-se solugdes stock de 8,0 mg/ml de DMPC (Dimiristoil-fosfatidilcolina) e 3,5 mg/ml de Colesterol em 70% de isopropanol e 30% de agua e diluiram-se (1:5), (1:10) e (1:50) com a mesma mistura.
4.1.2. Quantificagao do MPLA por HPLC
Na vacina tau lipossomal quantificou-se o MPLA (Lipido A monof osf orilo) por HPLC com detecgao por UV a seguir a derivatizagao do adjuvante com o cromoforo activo na regiao UV 3,5-dinitrobenziloxiamina (DNBA) . Rapidamente, adiciona-ram-se 20 μΐ de construgdes de tau lipossomais a uma solugao de DNBA em piridina (10 mg/ml, volume total 100 μΐ), aqueceram-se a temperatura de 60 2C durante 3 horas e eliminou-se depois a piridina por evaporagao. Para analise por HPLC resolubilizou-se o pellet resultante em cloroformio/metanol (2:1, v/v). Para fins de calibragao utilizou-se em quatro concentragoes diferentes MPLA (Avanti Polar Lipids) tendo-se derivatizado e analisado como para as construgdes tau lipossomais. A analise por HPLC realizou-se utilizando uma coluna Agilent XDB-C18 de fase reversa (250 x 4,6mm, 120 A, 5pm) com a temperatura controlada por termostato ate 50 -C com detecgao a 254 nm. Os solventes de eluigao foram os seguintes: Solvente A, 95% de acetonitrilo, 5% de agua, 4,8 mM de Acido fosforico; Solvente B, 95% de Isopropanol, 5% de agua, 4,8 mM de Acido fosforico. Urn gradiente de 10% de B a 70% de B aplicou-se durante 30 m com urn caudal de 1 ml/m. 4.1.3. Potencial da superficie lipossomal
Diluiram-se amostras de construgdes Tau lipossomais 100 vezes com PBS. A analise realizou-se utilizando urn Zetasizer Nano (Malvern, USA) a temperatura de 25 2C. A duragao da medigao e a selecgao de tensao realizaram-se automaticamente, com uma tensao caracteristica aplicada de 50 mV. Para calcular o potencial zeta transformaram-se os dados aplicando automaticamente a equagao de Smoluchowski utilizando software DTS 5.0 (Malvern). Uma vez que as construgdes de tau lipossomais sao constituidas por uma mistura de DMPC/DMPG/Colesterol/MPLA na proporgao molar de 9:1:7:0,2/ a carga liguida esperada sera negativa. 4.1.4. Analise conformacional por Dicroismo Circular
Diluiram-se (1:1) construgoes de Tau lipossomais com PBS para se obter uma concentragao final de peptidos de 18 μΜ. Lipossomas com composigao identica mas a que falta o peptido Tau utilizaram-se como a solugao considerada como o branco para a subtracgao da linha de base. Espectros de DC (Dicroismo Circular) obtiveram-se utilizando urn espectropolarimetro Jasco-815 com uma cuvette de quartzo com urn percurso optico de 0,1 cm (Hellma, Germany) a temperatura de 23 2C. As medigoes realizaram-se em uma faixa de comprimento de onda entre 195 e 250 nm com uma largura de banda de 1,0 nm e 0,5 nm resolugao. A velocidade de digitalizagao de 50 nm / min com tempo de resposta de 1 seg foi empregado. Aplicou-se a velocidade de digitalizagao de 50 nm/m com tempo de resposta de 1 s. Calculou-se a media dos espectros dos brancos (a partir de 8 varrimentos) e subtraiu-se da media dos 8 varrimentos de cada urn dos espectros das amostras. Alisou-se ("was smoothed") o espectro obtido ([9]0bsf graus) depois de se converter em elipticidade molar media por residuo ( [Θ] , graus cm2 dmol-1) com a equagao [Θ] = [0]Obs x (MRW/10Ic) , em que MRW representa o peso molecular medio por residuo (MW/niimero de residuos) , I e o percurso optico (cm) e c e a concentragao (g/cm3) .
4.1.5. Ensaio de fluorescencia com Th T
Utilizando urn leitor de microplacas Infinite M200 (Tecan Group Ltd, Switzerland) obtiveram-se medigoes de fluorescencia emitida pela Th T (tioflavina T) . Como urn procedimento geral, diluiram-se construgdes de Tau lipossomais ate diferentes concentragoes com PBS (Quadro 2).
Lipossomas com a mesma composigao mas sem o peptido tau diluiram-se de forma semelhante para se utilizarem como controlo negativo (lote ACI-35-081015-B) . A 98 μΐ de cada vacina ou solugao utilizada como o branco, adicionou-se a Th T (2 μΐ, 1,2 mM em agua) para se obter uma concentragao final de 24 μΜ. Apos rapida agitagao com formagao de vortice, adicionou-se uma aliquota de cada amostra (70 μΐ) a uma placa de microtitulagao preta opaca de 384 cavidades ("wells") da Perkin Elmer e mediu-se a emissao de fluorescencia a 485 nm apos 30 minutos sob excitagao a 440 nm. A largura da banda de excitagao foi de 9 nm e a largura da banda de emissao foi de 20 nm. Como controlo interno utilizou-se γ-ciclodextrina. Para se obterem solugoes controlo de 320, 160, e 80 mM de γ--ciclodextrina em PBS realizaram-se diluigdes em serie (2x) com PBS a partir de uma solugao stock a 640 mM.
Quadro 2. Amostras preparadas por ensaio com Th T
4.2. Resultados
4.2.1. Quantificagao do peptido, da DMPC e do colesterol por HPLC 0 cromatograma obtido por HPLC no comprimento de onda de detecgao de 207 nm a partir da injecgao das amostras das vacinas demonstrou a presenga do peptido Tau, da DMPC e do colesterol (ver Quadro 4) . A partir das curvas de calibragao determinadas com padroes, calculou-se a quantidade de cada componente na vacina. 0 teor do peptido Tau, da DMPC e do colesterol detectado nas suspensoes lipossomais que continham a proteina Tau esteve perto dos valores a atingir.
4.2.2. Quantificagao do MPLA por HPLC 0 cromatograma obtido por HPLC no comprimento de onda da detecgao de 254 nm a partir da injecgao da amostra da vacina de Tau derivatizada com a DNBA revelou a presenga de MPLA marcado (ver Quadro 4) . Utilizando a curva de calibragao obtida com o padrao, calculou-se a quantidade do MPLA nas vacinas de Tau lipossomais. 0 teor do MPLA detectado nas suspensoes lipossomais que continham a proteina Tau esteve perto dos valores a atingir. 4.2.3. Potencial da superficie lipossomica
No Quadro 4 apresenta-se o potencial zeta medido de vacinas de tau lipossomais.
4.2.4. Analise conformacional dos peptidos Tau em vacinas lipossomais por DC A conformagao de vacinas de Tau lipossomais preparadas de acordo com a descrigao anterior determinou-se por dicroismo circular (DC). No Quadro 3 apresentam-se os resultados. 4.2.5. Ensaio com Th T do peptido Tau nas vacinas lipossomais
No Quadro 4 apresentam-se os estados agregados de peptidos tau das vacinas lipossomais (preparadas pelo processo A descrito antes) determinados por ensaio fluorimetrico utilizando a Th T.
Quadro 3. Resumo das caracteristicas das vacinas
EXEMPLO 5: Imunogenicidade de Antigenios Tau Palmitoilados em murganhos Wild Type e Tau-/-KO 5.1. Metodos 5.1.1. Murganhos Tau-Knock-out (TKO)
Conseguiu-se a desactivagao (Knocking out) do gene tau utilizando um vector para alvejamento (targeting vector) que inseriu a EGFP [(Enhanced Green Fluorescent protein) Proteina fluorescente verde reforgada] cDNA no exao 1 do gene in-frame (no quadro de leitura) com o codao de iniciagao endogeno. Isso produziu uma proteina de fusao com os primeiros 31 aa de tau seguidos pela EGFP (descrito por Tucker KL. et al.r Nature Neuroscience, 2001) . A delegao do gene confirmou-se por Western blot em lisados de cerebros inteiros. Utilizando alguns anticorpos anti-Tau os niveis de proteina tau revelaram que todas as isoformas de tau estiveram ausentes no mutante homozigotico, com uma redugao de 50% no mutante heterozigotico. A mutagao manteve-se no background genetico dos murganhos C57BL/6. 5.1.2. Preparagao da vacina
As vacinas prepararam-se pelo processo A descrito no EXEMPLO 3. 5.1.3. Imunizagdes A murganhos C57BL/6 ou Tau-/-KO (TKO) administraram-se injecgdes intraperitoneais da vacina (ACI-33, ACI-35, ACI-36 e ACI-41) em tres ocasides (Esquema 1) (Quadro 4).
Para imunizagao com ACI-33, ACI-35, ACI-36 e ACI-41, as tres imunizagoes realizaram-se com urn intervalo de 2 semanas entre cada administragao [dia (d)0, dl3,d28] de acordo com o Esquema 1. Urn dia (d-1) antes das primeiras imunizagdes e em seguida apos a segunda (d27) e a terceira (d47) imunizagdes colheram-se amostras de sangue e prepararam-se soros. 0 soro preparou-se deixando as amostras de sangue coagularem durante a noite e tomando em seguida o sobrenadante apos centrifugagao. Por ELISA determinaram-se titulos de anticorpos IgG e IgM especificos de fosfopeptidos Tau e padroes de isotipos de IgG. Como controlo, determinaram-se tambem por ELISA titulos de anticorpos IgG especificos de peptidos nao-pTau (Tau nao fosforilada).
Quadro 4: Imunizagao de murganhos
Esquema 1: Escala de imunizagoes e de sangramentos relativamente a ACI-33, ACI-35, ACI-36 e ACI-41
5.1.4. Quantificagao de anticorpos especificos do peptido Tau
Nas 3 amostras de soros provenientes de sangramentos determinaram-se por ELISA anticorpos IgG especificos para peptidos pTau. Nos soros das amostras colhidas nos dias d-1 (um dia antes das primeiras imunizagoes) e D47 (apos a terceira imunizagao) determinaram-se IgG especificas de peptidos Tau. Na amostra de soros obtidos a partir de sangramentos realizados no dia D47 (terceira imunizagao) determinaram-se por ELISA anticorpos dos isotipos IgM e IgG especificos de peptidos pTau. Durante a noite a temperatura de 4 0 C revestiram-se placas com 10 pg/ml do peptido Tau correspondente. Apos a lavagem de cada cavidade ("well") com PBS-0,05% de Tween 20 e o bloqueio com 1% de BSA em PBS-0,05% de Tween 20, adicionaram-se as placas diluigdes em serie de soros e incubaram-se a temperatura de 37 °C durante 2 horas. Apos lavagem, incubaram-se as placas com um anticorpo total anti-IgG murino conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) ou anticorpos especificos de isotipos [anti-IgM murino conjugado com peroxidase de rabano (HRP), anti-IgGl murino conjugado com AP, anti IgG2a e IgG3 murino conjugado com biotina, adquirido a Pharmingen BD, San Diego, CA, USA e anti-IgG2b murino conjugado com HRP proveniente de Zymed Laboratories, San Francisco, CA] durante 2 horas a temperatura de 37 eC. Apos lavagem, incubaram-se placas com pNPP (para-nitro-fenil- fosfato), o substrato de fosfatase para AP, ou ABTS [acido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulf0nico)], o substrato para HRP e leram-se a 405 nm utilizando um leitor de placas ELISA. Relativamente aos anticorpos conjugados com biotina realizou-se uma fase suplementar em que se incubaram as placas durante 45 m em estreptavidina-HRP [Horseradish Peroxidase (Peroxidase de rabano)] (R&amp;D Systems, Minneapolis, MN, USA) antes da detecgao utilizando ABTS. Os resultados sao expressos como D.O. (Densidade Optica) na primeira diluigao e em uma diluigao nao saturada para IgG e em uma D.O. nao saturada para isotipos de IgG e IgM. 5.1.5. Ligaqao de anticorpos anti-Tau a emaranhados fibrilares de Tau (Tau tangles) em cortes de cerebros de um animal transgenico [(TAUPIR) Tau-Pathology Immuno-Reaction] A ligagao de anticorpos presentes no soro de animais vacinados contra emaranhados fibrilares (tangles) em cortes de cerebro realizou-se por imuno-histoquimica TAUPIR.
Os cortes de cerebro utilizados provieram de um animal transgenico Tau P301L (TPLH: isoforma mais longa (441aa) da Tau humana com a mutagao P301L) em uma fase terminal e com o dobro da idade (> 15 meses) de murganhos transgenicos biGT (murganhos GSK-3 transgenicos cruzados com murganhos TPLH).
Lavaram-se cortes de cerebro durante 5 m com PBS incubaram-se depois durante 15 m a temperatura ambiente em 1,5% de H2O2 em PBS:MeOH (1:1) para bloquear a peroxidase endogena. Apos lavagem dos cortes 3 vezes com PBST (PBS/0,1% de Triton X-100) incubaram-se durante 30 m a temperatura ambiente em solugao de bloqueio de PBST + 10% de FCS (soro fetal de vitela) . A incubagao com 0 soro que contem os anticorpos anti-Tau realizou-se durante a noite a temperatura de 4 °C. Diluiu-se o soro em PBST/10% de FCS utilizando algumas diluigoes diferentes de 1/2 500 a 1/10 000. Em PBST lavaram-se cortes 3 vezes antes da incubagao com um anticorpo secundario de cabra anti-murino conjugado com HRP (fornecido por Dako, Glostrup, Denmark) em PBST/10% de FCS durante 1
hora a temperatura ambiente. Antes da detecgao lavaram-se cortes 3 vezes com PBST e incubaram-se em 50 mM Tris/HCl pH 7,6 durante 5 m. A detecgao realizou-se mediante incubagao dos cortes durante 3 m em Diaminobenzidina (DAB: 1 comprimido
em 10 ml de 50 mM Tris.HCl + 3 μΐ de H202 30%) (MP
Biomedicals, Solon, OH, USA) . A reacgao interrompeu-se por lavagem dos cortes 3 vezes em PBST. Seguidamente transferiram-se os cortes para placas de vidro silanizado e secaram-se ao ar sobre uma placa de aquecimento a temperatura de 50 °C durante 2 horas. Procedeu-se a contracoloragao mediante incubagao com hematoxilina de Mayer (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) durante 1 m seguida por uma fase de lavagem durante 4 m com agua corrente da torneira. Desidrataram-se os cortes fazendo-os passar por banhos de etanol a 50%, 70%, 90% e duas vezes a 100% e depois por Xilol durante 1 m (2 vezes). Finalmente montaram-se os cortes com DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, England) sob lamelas de vidro. 5.1.6. Western Blot (WB) A ligagao de anticorpos presentes no soro de animais vacinados contra a pTau do extracto do cerebro de um animal transgenico realizou-se por WB. A homogeneizagao de cerebros de murganhos wild-type, FVB, TPLH, biGT e Tau knock-out (TKO) realizou-se no seguinte
tampao: 25 mM Tris/HCl pH7,6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 30 mM NaF, 0.2 mM Na3V04, 1 nM acido ocadaico, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 5 mM Na4P207, cocktail completo de inibidores de proteases sob a forma de 1 comprimido para urn total de 12 ml. Para obter urn homogenato ou homogeneizado total dos cerebros homogeneizaram-se os mesmos em gelo com 1 vol/peso dos hemisferios (ml/g) utilizando urn dispositivo semelhante a urn homogeneizador accionado por motor Potter-Elvehjem [tubo de vidro/pestle (pistilo ou pilao) de teflon] a 700 rpm.
Metade do homogeneizado total de cerebros diluiu-se em tampao de amostra [125 mM de Tris/HCl pH6,8, 4% (p/v) de dodecilsulfato de sodio (SDS) , 20% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol] + 5% de beta-mercapto-ethanol e seguidamente aqueceu-se rapidamente ate a temperatura de 95 2C.
Mantiveram-se as amostras 5 m, diluiram-se em tampao de amostra, aqueceram-se novamente ate a temperatura de 95 °C arrefeceram-se seguidamente e centrifugaram-se a 14 000 rpm durante 5 minutos para eliminar os fragmentos (debris) que nao foram solubilizados. Colheram-se os sobrenadantes e aplicaram-se sobre urn gele para realizar a tecnica de SDS--PAGE (electroforese em gele de poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sodio). A transferencia para a membrana de nitrocelulose (Hybond-ECL) realizou-se em tampao de transferencia (25 mM Tris pH 8,6, 190 mM de Glicina, 20% de metanol). Transferiu-se a membrana para a solugao de bloqueio [0,1 % de Tween em TBS, (50 mM de Tris.HCl, pH7,6, 150 mM de
NaCl) + 5% de leite em ρό] antes da incubagao durante a noite (overnight) a temperatura de 4 2C com o soro de murganho diluido com solugao de bloqueio. A incubagao com anticorpo secundario anti-murino de cabra conjugado com HRP (Dako,
Glostrup, Denmark) diluido a 1/10 000 em solugao de bloqueio realizou-se durante 1 hora a temperatura ambiente. Procedeu--se a detecgao utilizando Reagentes ECL™ para Detecgao em Western Blotting da GE Healthcare. 5.2. Resultados 5.2.1. Especificidade de anticorpos provenientes de soros de murganhos vacinados
Soros de murganhos vacinados analisaram-se guanto a especificidade dos seus anticorpos por ensaio ELISA contra ambos os peptidos pTau e Tau, por TAUPIR contra emaranhados (tangles) de Tau e por western blot contra pTau. A vacina ACI-33 induziu uma resposta anti-Tau5-20 [pY18] de isotipo IgG apos a administragao de injecgao i.p.. Apos 2 imunizagoes (d27), a resposta IgG permaneceu estavel sem gualguer aumento com terceira imunizagao (d47) (Figura la: murganho WT, Anova one-way P< 0,05 d-lvs d27, P<0,001 d-1 vs d47 e Figura lb: murganho TKO, Anova one-way P< 0,001 d-1 vs d27/47) . A vacina ACI-35 induziu uma intensa resposta IgG anti--Tau393-408 [pS396/pS404] apos injecgao i.p.. Depois de 2 imunizagoes (d28), a resposta IgG permaneceu estavel (d42, 98 e 126) sem gualguer aumento com terceira imunizagao (D42) e nenhuma diminuigao do sangramento anterior, entre e apos o reforgo ou rappel (boosting) (Figura 2a: murganho WT: Anova one-way P<0,0001 d-1 vs d28/42/98/126 e Figura 2b: murganho TKO: Anova one-way P<0,0001 d-1 vs d28/42/98/126). A vacina ACI-36 induziu uma resposta Tau401-418 [pS404/S409] isotipo IgG apos injecgao i.p.. Apos 2 imunizagdes (621), a resposta IgG permaneceu estavel sem gualguer aumento com terceira imunizagao (d47) (Figura 3a: murganhos WT: Anova one-way P< 0,001 d-lvs d27, P<0,0001 d-1 vs d47 e (Figura 3b: murganhos TKO: Anova one-way P<0,0001 d--1 vs d27/47).
Apos injecgao i.p. a vacina ACI-41 induziu uma intensa resposta IgG sobre ambos os peptidos Tau206-221 [pT212/pS214] e Taut96-211 [pS202/pT205]. Apos 2 imunizagoes (d34), a resposta IgG permaneceu estavel (d48) sem gualguer aumento apos terceira imunizagao (d48) (Figura 4a: murganho WT, anti--Tau206-221 [pT212/pS214]-IgG, Anova one-way P<0,0001 d-1 vs d34/48) (Figura 4b: murganho WT, IgG anti-Taul96-211 [pS202/pT205), Anova one-way P<0,0001 d-1 vs d34/48). (Figura 4c: murganho TKO, IgG anti-Tau206-221 [pT212/pS214, Anova one-way P<0,0001 d-1 vs d34/48) (Figura 4d: murganho TKO, IgG anti-Taul96-211 [pS202/pT205]], Anova one-way P<0,0001 d-1 vs d34/48) .
Analisaram-se ainda por imuno-histoguimica TAUPIR e Western blot os soros de murganhos vacinados guanto a especificidade dos anticorpos anti-Tau. No seguinte Quadro 5 apresenta-se o resumo dos dados provenientes de todas as construgoes lipossomais e de cada urn dos modelos murinos.
Quadro 5: Resumo da especificidade de anticorpos de soros de murganhos vacinados
5.2.2. Analise da resposta de isotipos dos murganhos C57BL/6 Wild-type e Tau-/-KO (TKO) imunizados ACI-33 A vacina ACI-33 induziu em murganhos WT titulos de anticorpos de todos os isotipos IgG2a, 2b e 3 bem como de IgM apos 3 imunizagdes i.p. (Figura 5a; murganhos WT). Quase nao ocorreu IgGl e existe uma diferenga significativa entre IgGl e IgG2b e 3 (Figura 5a; murganhos WT, Anova one-way P<0,05 IgGl vs IgG3, P<0,001 IgGl vs IgG2b). A vacina ACI-33 induziu em murganhos TKO titulos de anticorpos de todos os isotipos IgG2a, 2b e 3 bem como de IgM apos 3 imunizagdes i.p. (Figura 5b; murganhos TKO). Quase nao ocorreu IgGl com uma diferenga significativa entre essa subclasse e os outros isotipos IgG (Figura 5b, Anova one-way P<0,05 IgGl vs IgG2a/IgG3, P<0,001 IgGl vs IgG2b). ACI-35 A vacina ACI-35 induziu em murganhos WT elevados titulos de anticorpos de todos os isotipos de IgG bem como de IgM apos 3 imunizagdes i.p. (Figura 6a; murganhos WT) . A linica diferenga significativa e uma maior resposta de IgM em comparagao com IgG3 (Figura 6a; murganho WT, Anova one-way P<0,05 IgM vs IgG3). A vacina ACI-35 induziu em murganhos TKO elevados titulos de anticorpos de todos os isotipos de IgG bem como de IgM apos 3 imunizagdes i.p. (Figura 6b; murganhos TKO). ACI-36 A vacina ACI-36 induziu em murganhos WT titulos de anticorpos de todos os isotipos de IgG bem como de IgM apos 3 imunizagoes i.p. (Figura 7a; murganhos WT). A vacina ACI-36 induziu em murganhos TKO titulos de anticorpos de todos os isotipos de IgG bem como de IgM apos 3 imunizagoes i.p. (Figura 7b; murganhos TKO) . Em comparagao com IgGl ocorreu urn elevado nivel significativo sob o ponto de vista estatistico de IgG2b (Figura 7b; murganho TKO, Anova one-way P<0,05 IgG2b vs IgGl). ACI-41 A vacina ACI-41 induziu em murganhos WT elevados titulos de anticorpos anti-Taul96-211 [pS202/pT205] de todos os isotipos de IgG bem como de IgM apos 3 imunizagoes i.p. (Figura 8a; murganhos WT). A vacina ACI-41 induziu em murganhos TKO elevados titulos de anticorpos anti-Taul96-211 [pS202/pT205] de todos os isotipos de IgG bem como de IgM apos 3 imunizagoes i.p. (Figura 8b; murganhos TKO). 5.3. Conclusao A vacina Tau induziu titulos de IgG em todos os murganhos. Ocorreu uma baixa resposta de anticorpos IgGl em comparagao com IgG2b e IgG3 em murganhos imunizados com ACI--33. Em todos os outros murganhos vacinados com Tau, os titulos de anticorpos induzidos para todos os isotipos IgG2a, 2b e 3, bem como IgM foram comparaveis.
Anticorpos gerados a partir de murganhos imunizados com a vacina Tau ligam-se especificamente a pTau com ligagao marginal a peptidos Tau. Os anticorpos gerados foram assim capazes de reconhecer por WB (western blot) emaranhados (tangles) no extracto dos cerebros de murganhos transgenicos Tau e a proteina pTau proveniente do mesmo extracto dos cerebros de murganhos transgenicos Tau. EXEMPLO 6: Produgao e selecgao de hibridomas e de anticorpos 0 objectivo deste estudo foi o de produzir ("to generate") e seleccionar ("to screen") mAbs (anticorpos monoclonais) anti-Tau. Mediante a fusao de bago de murganho imunizado com vacina Tau com uma linha celular de mieloma produziram-se hibridomas. Os hibridomas avaliaram-se quanto a reactividade contra a proteina Tau completa quer fosforilada quer nao fosforilada, bem como contra peptidos Tau antigenicos fosforilados e nao fosforilados utilizados na preparagao da vacina. Realizou-se tambem a selecgao ("screening") de hibridomas quanto a reactividade dos sobrenadantes desses hibridomas relativamente aos emaranhados ("tangles") da Tau realizando ensaios imunoquimicos em cortes de cerebro de murganho transgenico Tau. 6.1. Metodos 6.1.1. Fusao
Para a produgao de hibridomas utilizou-se urn murganho C57BL/6 wild type vacinado com ACI-33 (Tau5-20 [pY18]) e ACI--35. Ao murganho administrou-se urn reforgo ("was boosted") da vacina ACI-33 no dia 0 em seguida novamente no dia 4 e realizou-se a fusao no dia 7. 173xl05 (ACI-33), esplenocitos de murganho imunizado fundiram-se com celulas de mieloma SP2--0-Agl4 em uma proporgao de 5 esplenocitos/l celula de mieloma.
Para a produgao de hibridomas utilizou-se urn murganho C57BL/6 wild type vacinado com ACI-36 (Tau-401-418 [pS404/S409]). Ao murganho administrou-se urn reforgo ("was boosted") da vacina ACI-36 no dia 0 em seguida novamente no dia 4 e realizou-se a fusao no dia 7. 84xl06 esplenocitos de murganho imunizado fundiram-se com celulas de mieloma SP2-0--Agl4 em uma proporgao de 5 esplenocitos/l celula de mieloma.
Para a produgao de hibridomas utilizou-se urn murganho C57BL/6 wild type vacinado com ACI-41 (mistura de Tau206-221 [pT212/pS214] e Taul96-211 [pS202/pT205]). Ao murganho administrou-se urn reforgo ("was boosted") da vacina ACI-41 no dia 0 em seguida novamente no dia 4 e realizou-se a fusao no dia 8. 162x10s esplenocitos de murganho imunizado fundiram-se com celulas de mieloma SP2-0-Agl4 em uma proporgao de 5 esplenocitos/l celula de mieloma.
As tres fusdes deram lugar a 8 placas de 96 cavidades ("wells") e os clones designaram-se de acordo com a placa (1--8) depois a linha (A-G) e finalmente a coluna (1-12). 6.1.2. Metodo de screening para seleccionar clones
As 8 placas de 96 cavidades seleccionaram-se duas vezes quanto a expressao de IgG. Seguidamente transferiram-se clones de expressao positiva para placas de 24 cavidades e analisaram-se sobrenadantes celulares (=clones) de celulas em crescimento atraves de selecgao por Tau ELISA kit e por imuno-histoquimica TAUPIR (Tau-Pathology Immuno-Reaction).
Sobrenadantes positivos em ELISA e/ou TAUPIR transferiram-se para frascos T25 e seleccionaram-se clones novamente quanto a expressao de IgG, selecgao por Tau ELISA kit e TAUPIR.
6.1.3. Selecgao de IgG
Revestiram-se placas ELISA com 50 μΐ/cavidade ("well") de anticorpo anti-IgG murina (CER Groupe, Marloie, Belgium) em tampao de revestimento durante 16 horas a temperatura de 4 °C. Apos lavagem de placas com PBS/Tween aplicaram-se 100 μΐ/cavidade de uma solugao de bloqueio durante 1 h a temperatura ambiente. Durante 1 h incubaram-se a temperatura ambiente 50 μΐ de sobrenadante de hibridomas nao diluido. Apos uma fase de lavagem, aplicou-se sobre as placas durante 1 h a temperatura ambiente uma mistura do anti-IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 murina conjugado com peroxidase de rabano (HRP) (Ab Serotec, Raleigh, NC, USA). Apos uma lavagem final, procedeu-se a detecgao com TMB (3-3',5,5'-tetrametilbenzidi-na), o substrato fosfatase para HRP, e leram-se placas a 405 nm utilizando um leitor de placas ELISA. Os resultados expressam-se em D.O. (Densidade Optica).
6.1.4. Selecgao de hibridomas por Tau ELISA A selecgao de hibridomas por ELISA realizou-se contra peptido pTau (ACI-33, T1.5: Tau5-20 [pY18]; ACI-36, T4.5:Tau401-418 [pS404/S409]; ACI-41, T8.5: Tau206-221 [pT212/pS214] e T9.5: Taul96-211 [pS202/pT205] PolyPeptide
Laboratories, Hiller0d, Denmark)), correspondente a peptido Tau (ACI-33, T1.6: Tau5-20; ACI-36, T4.6: Tau401-4; ACI-41, T8.6: Tau206-221 e T9.6: Taul96-211, PolyPeptide
Laboratories, Hiller0d, Denmark), proteina Tau fosforilada completa (441aa) (pTau protein, Vandebroek et al., 2005) e proteina Tau completa (441aa) (Tau protein, SignalChem, Richmond, Canada). Por Ultimo utilizou-se Albumina de Soro Bovino (BSA) como controlo negativo.
Durante a noite a temperatura de 4 °C revestiram-se placas com 10 pg/ml do peptido Tau correspondente e 1 pg/ml da proteina Tau tambem correspondente. Apos lavagem de cada cavidade ("well") com PBS-0,05% de Tween 20 e bloqueio com 1% de BSA em PBS-0,05% de Tween 20, adicionou-se as placas sobrenadante de hibridomas nao diluido ou meio controlo negativo e incubaram-se a temperatura de 37 2C durante 2 horas. Apos lavagem incubaram-se as placas com anticorpo anti-IgG murina total conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) durante 2 horas a temperatura de 37 2C. Apos lavagem incubaram-se as placas com pNPP (fosfato de paranitrofenilo), o substrato de fosfatase para AP, e leram-se a 405 nm utilizando urn leitor de placas ELISA. Os resultados expressam-se em D.O. (Densidade Optica). 6.1.5. Selecgao de hibridomas por IHC: Ligagao de anticorpos anti-Tau a emaranhados ("tangles") em cortes de cerebros de murganhos transqenicos (TAUPIR)
Experiencias TAUPIR ("Tau-Pathology Immuno-Reaction") realizaram-se de acordo com o protocolo do EXEMPLO 5.1.5.. 6.1.6. Selecgao de IgG em frascos T25
Revestiram-se placas ELISA com 5 pg/ml de anticorpo anti-IgG de murganho especifico para fragmento F(ab')2 (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) em tampao de revestimento: tampao de carbonato/bicarbonato pH 9,6 (Sigma, Buchs, Switzerland) durante a noite ("overnight") a temperatura de 4 2C. Apos lavagem de placas, incubaram-se durante 1 h a temperatura ambiente sobrenadante de hibridomas nao diluido, controlo positivo para anticorpo IgGl (6E10 a lpg/ml: Covance, Emeryville, CA, USA) ou controlo negativo (so meio de cultura) . Apos uma fase de lavagem, incubou-se o anticorpo secundario de cabra anti-IgG (subclasses l+2a+2b+3) de murganho especifico para fragmento Fey conjugado com AP (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) nas placas durante 2 horas a temperatura de 37 2C. Apos uma lavagem final, procedeu-se a deteegao com pNPP (fosfato de paranitrofenilo), o substrato de fosfatase para AP, e leram-se as placas a 405 nm utilizando urn leitor de placas ELISA. Os resultados expressam-se em D.O. (Densidade Optica). 6.2. Resultados
Hibridomas ACI-33
Os sobrenadantes de celulas das 8 placas de 96 cavidades ("wells") resultantes da fusao analisaram-se quanto a produgao de IgG. Nas 768 cavidades (8x96 cavidades) 277 dessas cavidades ensaiadas foram positivas para a expressao de IgG tendo-se transferido para placas de 24 cavidades. Nessas placas de 24 cavidades cultivaram-se 79 clones tendo--se analisado sobrenadantes dessas celulas. Posteriormente transferiram-se clones positivos para frascos T25 e seleccionaram-se sobrenadantes quanto a produgao de IgG, ELISA e TAUPIR (Quadro 6) .
Quadro 6:
0 clone 6C10 foi ο ύηίοο positivo nas 3 selecgoes tendo--se seleccionado para subclonagem.
Hibridomas ACI-36
Os sobrenadantes de celulas das 8 placas de 96 cavidades ("wells") resultantes da fusao analisaram-se quanto a produgao de IgG. Nas 768 cavidades (8x96 cavidades) 333 dessas cavidades ensaiadas foram positivas para a expressao de IgG tendo-se transferido para placas de 24 cavidades. Nessas placas de 24 cavidades cultivaram-se 75 clones tendo--se analisado sobrenadantes dessas celulas. Posteriormente transferiram-se clones positivos para frascos T25 e seleccionaram-se sobrenadantes quanto a produgao de IgG, ELISA e TAUPIR (Quadro 7).
Quadro 7:
A fim de seleccionar clones para as proximas fases procedeu-se com base nos resultados obtidos por ELISA e TAUPIR a uma classificagao de todos os sobrenadantes positivos em selecgoes de IgG/ELISA /TAUPIR. Procedeu-se a classificagao dos resultados obtidos por ELISA e TAUPIR tal como explicado na parte dos metodos. A coloragao por TAUPIR foi quase identica para os cinco primeiros clones tendo correspondido aos resultados por ELISA. Rejeitou-se 4C12 porque se encontrou na mesma placa que 4C1 o que aumenta a probabilidade de os 2 clones serem o mesmo (que reconhece o mesmo epitopo). Os melhores 4 clones seleccionados foram 3A8, 2B6, 4C1 e 6H1. Os outros 6 clones (4C12, 2G1, 2F9, 7D6, 3B9, 4E12) conservaram-se como copia de seguranga ("backup").
Para seleccionar os melhores procedeu-se a uma classificagao dos 10 clones que apresentaram positividade em selecgao por ELISA e selecgao por TAUPIR (Quadro 8) . Os 5 melhores clones apresentam-se marcados a cinza.
Quadro 8: Classificagao para clones positivos em ELISA e
TAUPIR
Hibridomas ACI-41
Os sobrenadantes de celulas das 8 placas de 96 cavidades ("wells") resultantes da fusao analisaram-se quanto a produgao de IgG. Nas 768 cavidades (8x96 cavidades) analisadas 215 foram positivas para a expressao de IgG tendo--se transferido para placas de 24 cavidades. Nessas placas de 24 cavidades cultivaram-se 81 clones tendo-se analisado sobrenadantes dessas celulas. Posteriormente transferiram-se clones positivos para frascos T25 e seleccionaram-se sobrenadantes quanto a produgao de IgG, ELISA e TAUPIR (Quadro 9).
Quadro 9:
Os clones 5D10 e 7C2 foram os linicos positivos nas 3 selecgoes tendo-se seleccionado para subclonagem. 0 clone 5D10 liga-se apenas ao peptido T8.5, enquanto o clone 7C2 se liga aos dois peptidos da vacina ACI-41 (T8.5 e T9.5) (Figura 10) . 0 subclone 5D10A4 proveniente de 5D10 apresentou-se especifico para o peptido pTau. 8.3. Conclusao
Os anticorpos produzidos tern exibido elevada especificidade para peptidos pTau com apenas ligagao marginal a peptidos nao fosforilados.
Depois das 3 fusoes (ACI-33, ACI-36 e ACI-41), depositou-se urn total de 7 clones no DSMZ (Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (Quadro 10) e seleccionaram-se para subclonagem posterior.
Quadro 10: Lista de hibridomas depositados
EXEMPLO 7: Coloragao especif ica de cortes de cerebros humanos com AD por dois anticorpos 0 objectivo deste estudo foi o de corar emaranhados neurofibrilares [(NFT) neurofibrillary tangles] em cerebros humanos com a doenga de Alzheimer utilizando anticorpos ACI--41-Abl (9H3 subclone T89-F4) e o clone 5D10, produzido a partir de duas diferentes fusdes em murganhos imunizados com a vacina ACI-41. Para o conseguir, realizou-se urn ensaio de imunorreactividade da protelna fosfo-Tau revelada por coloragao (TAUPIR) utilizando cortes de cerebros humanos com AD. 7.1. Metodos 7.1.1. Produgao do anticorpo 5D10 0 clone 5D10 produziu-se como descrito no EXEMPLO 9. 7.1.2. Produgao de ACI-41-Abl 7.1.2.1. Fusao
Para a produgao de hibridomas utilizou-se um murganho C57BU6 wild type vacinado com ACI-41 (a vacina ACI-41 contem uma mistura de dois peptidos fosfo-Tau, Tau206-221 [pT212/pS214] e Taul96-211 [pS202/pT205]). Cinco dias antes da fusao administrou-se ao murganho um reforgo do peptido ACI-41. Fundiram-se 58xl06 esplenocitos provenientes do murganho imunizado com celulas de mieloma SP2/0-O-Ag 14 em uma proporgao de 5 esplenocitos/l celula de mieloma. A fusao resultou em 10 placas de 96 cavidades ("wells") que se seleccionaram depois para averiguar clones de interesse.
7.1.2.2. Selecgao de hibridomas por ELISA A selecgao de hibridomas por ELISA realizou-se sobre placas revestidas com T8: Tau206-221 [pT212/pS214], T9: Taul96-211 [pS202/pT205] ou hp-Tau (proteina Tau hiperfosforilada) (explicado na secgao dedicada a Western Blot) .
Durante a noite a temperatura ambiente revestiram-se placas com 2 pg/ml de hp-Tau. Apos lavagem de cada cavidade ("well") com PBS e bloqueio com 2% de FCS em PBS, adicionou--se as placas sobrenadante de hibridomas e incubaram-se durante 1 hora a temperatura ambiente. Apos uma fase de lavagem, incubaram-se as placas com anticorpo anti-Ig murina total AffiniPure produzido em cabra conjugado com peroxidase (Detecgao de IgG + IgM, Dako Glostrup, Denmark) em 1% de FCS em PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Revelaram-se ("were developed") as placas com TMB (3,3',5,5'-tetrametil-benzidina). Interrompeu-se a reacgao com H2S04 2N e procedeu--se a leitura a 450nm utilizando urn leitor de placas ELISA. Os resultados expressaram-se em densidade optica (D.O.) para cada urn dos clones de hibridoma.
Para os peptidos, revestiram-se as placas durante toda a noite ("overnight") a temperatura de 4 2C com 10 pg/ml de Tau20 6-221 [pT212/pS214] ou Taul96-211 [pS202/pT205] . Apos lavagem com PBS e bloqueio com 2% de NHS em PBS, adicionou-se as placas sobrenadante de hibridomas e incubaram-se durante 1 hora a temperatura ambiente. Apos uma fase de lavagem, incubaram-se as placas com anti-IgG murina biotinilada (adquirida a Vector labs) em 1% de NHS em PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Relativamente aos anticorpos conjugados com biotina realizou-se uma fase suplementar tendo-se incubado as placas durante 30 minutos com estreptavidina-HRP (Kit ABC, Vector labs) antes da detecgao. Apos uma fase de lavagem, revelaram-se ("were developed") as placas com TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina). Interrompeu--se a reacgao com H2S04 2N e procedeu-se a leitura a 450nm utilizando urn leitor de placas ELISA. Os resultados expressaram-se em densidade optica (D.O.) para cada urn dos clones de hibridoma. 7.1.2.3. Selecgao de hibridomas por IHC: Ligagao de anticorpos anti-Tau a emaranhados ("tangles") em cortes de cerebros de murganhos transgenicos (TAUPIR) A ligagao de anticorpos produzidos por celulas de hibridoma a emaranhados ("tangles") realizou-se por imuno--histoquimica (IHC) em cortes de cerebros de murganhos transgenicos Tau.
Cortes de cerebros provenientes de murganhos duplos transgenicos biGT de idade avangada (>2 0 meses) [murganhos GSK-3 transgenicos cruzados com TPLH (isoforma mais longa (441aa) da Tau humana que resulta de murganhos que expressam a mutagao P301L)] e de murganhos Tau knock-out (TKO) como controlo negativo. A coloragao e TAUPIR ( (Tau-Pathology Immuno-Reaction)) realizaram-se de acordo com o protocolo do EXEMPLO 5.1.5.. 7.1.2.4. Selecgao de hibridomas por Western Blot A ligagao de anticorpos produzidos por celulas de hibridoma a pTau no extracto do cerebro de urn animal transgenico e/ou no extracto com hpTau realizou-se por WB. A homogeneizagao de cerebros de murganhos wild-type, FVB, TPLH, biGT e Tau knock-out (TKO) realizou-se no seguinte tampao: 25 mM Tris/HCl pH7,6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 30 mM NaF, 0.2 mM Na3V04, 1 nM acido ocadaico, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 5 mM Na4P207, cocktail completo de inibidores de proteases [(CPIO) Complete protease inhibitor cocktail] sob a forma de 1 comprimido para urn total de 12 ml. Para obter urn homogenato ou homogeneizado total dos cerebros homogeneizaram-se os mesmos em gelo com 10 vol/peso dos hemisferios (ml/g) utilizando urn dispositivo semelhante a um homogeneizador accionado por motor Potter-Elvehjem [tubo de vidro/pestle (pistilo ou pilao) de teflon] a 700 rpm.
Para a extracgao de hp-Tau, homogeneizaram-se cerebros de murganhos TPLH e TKO com o seguinte tampao: 100 mM de MES pH 6,8, ImM de □-mercapto-etanol, 5mM de EDTA, 2,5 mM de PMSF, 5 mg/ml de tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK), 100 mM de NaF, InM de acido ocadaico, 0,2 mM de Na3V04 e cocktail completo de inibidores de proteases [(CPIO) Complete protease inhibitor cocktail] sob a forma de 1 comprimido para um total de 12 ml. Homogeneizaram-se os cerebros em gelo com 6 vol/peso dos hemisferios (ml/g) utilizando um dispositivo semelhante a um homogeneizador accionado por motor Potter--Elvehjem [tubo de vidro/pestle (pistilo ou pilao) de teflon] a 700 rpm. Centrifugaram-se os homogenatos ou homogeneizados a 20 OOOxg 30 m a temperatura de 4 2C e transferiram-se os sobrenadantes e aqueceram-se rapidamente ate a temperatura de 95 2C temperatura a qual se mantiveram durante 10 m apos arrefecimento dos mesmos em gelo fundente. Realizou-se uma fase de centrifugagao antes de se fraccionar o sobrenadante em aliquotas e de se armazenarem essas aliquotas a temperatura de -20 °C como "hp-Tau".
Metade do homogenato ou homogeneizado total de cerebros diluiu-se em tampao de amostra [125 mM de Tris/HCl pH6,8, 4% (p/v) de dodecilsulfato de sodio (SDS), 20% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol] + 5% de beta-mercapto-ethanol e seguidamente aqueceu-se rapidamente ate a temperatura de 95 2C. Mantiveram-se as amostras 5 m, diluiram-se em % em tampao de amostra, aqueceram-se novamente ate a temperatura de 95 °C arrefeceram-se seguidamente e centrifugaram-se a 14 000 rpm durante 5 minutos para eliminar os fragmentos (debris) que nao foram solubilizados. Colheram-se os sobrenadantes e aplicaram-se sobre urn gele de SDS-PAGE. A transferencia para a membrana de nitrocelulose (Hybond-ECL) realizou-se em tampao de transferencia (25 mM Tris pH 8,6, 190 mM de Glicina, 20% de metanol). Transferiu-se a membrana para a solugao de bloqueio [0,1 % de Tween em TBS, (50 mM de Tris.HCl, pH7,6, 150 mM de NaCl) + 5% de leite em ρό] antes da incubagao durante a noite (overnight) a temperatura de 4 2C com os sobrenadantes de hibridomas nao diluidos. A incubagao com anticorpo secundario anti-murino de cabra conjugado com HRP (Dako, Glostrup, Denmark) diluido a 1/10000 em solugao de bloqueio realizou-se a temperatura ambiente durante 1 hora. Procedeu-se a detecgao utilizando Reagentes ECL™ para Detecgao em Western Blotting da GE Healthcare. 7.1.3. Ligagao de anticorpos anti-fosfo-Tau a emaranhados ("tangles") de Tau em um cerebro humano com a AD (Doenga de Alzheimer)
Os clones ACI-41-Abl (subclone 9H3 T89-F4) (isotipo IgM murina) e 5D10 (isotipo IgG murina) de anticorpos anti-fosfo Tau produziram-se a partir de duas fusdes separadas em murganhos vacinados com ACI-41. A vacina ACI-41 contem uma mistura de dois peptidos fosfo-Tau, Tau206-221 [pT212/pS214] and Taul96-211 [pS202]pT205] . A ligagao do clone T89-F4 de anticorpos a emaranhados {"tangles") em cortes de cerebros provenientes de cerebros humanos com AD realizou-se por imuno-histoquimica TAUPIR (Tau-Pathology Immuno-Reaction). Utilizaram-se cortes cerebrals corticais de individuos com AD, e paralisia supranuclear progressiva [(PSP) "Progressive supranuclear palsy"], e de controlos saudaveis. Lavaram-se cortes do cerebro durante 5 m em PBS seguidamente incubaram--se durante 15 m a temperatura ambiente em 1,5% de H2O2 em PBS:MeOH (1:1) para bloquear a peroxidase endogena. Depois de se lavarem os cortes 3 vezes em PBST (PBST/0, 1% de TritonxlOO) os mesmos incubaram-se durante 30 m a temperatura ambiente em solugao de bloqueio PBST + 10% de FCS (soro fetal de vitela). A incubagao com os anticorpos primarios (clone 9H3 T89-F4, 5D10 e AT100 como controlo positivo) realizou-se durante a noite ("overnight") a temperatura de 4 2C. Lavaram--se os cortes 3 vezes em PBST antes da incubagao com urn anticorpo secundario de cabra anti-murino conjugado com HRP (fornecido por Dako, Glostrup, Denmark) em PBST/10% de FCS durante 1 hora a temperatura ambiente. Antes da detecgao, lavaram-se os cortes 3 vezes com PBST e incubaram-se em 50 mM de Tris/HCl pH 7,6 durante 5 m. A detecgao realizou-se por incubagao dos cortes durante 3 m em Diaminobenzidina (DAB: 1 comprimido em 10 ml de 50 mM de Tris.HCl + 3 μΐ de H2C>2 a 30%; MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Interrompeu-se a reacgao mediante lavagem dos cortes (3 vezes) em PBST. Seguidamente transferiram-se os cortes para placas de vidro silanizado e secaram-se ao ar em uma placa de aquecimento a temperatura de 50 2C durante 2 horas. Procedeu-se a contracoloragao mediante incubagao com hematoxilina de Mayer (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) durante 1 m seguida por uma fase de lavagem durante 4 m com agua corrente da torneira. Desparafinaram-se os cortes fazendo-os passar por xilol 2 vezes durante 5 m e por 100% de EtOH 2 vezes durante 1 m, seguindo-se uma lavagem de 1 m em 90%, 70%, 50% de EtOH e agua destilada. Para a recuperagao do antigenio, ferveram--se os cortes durante 10 m em uma solugao de acido citrico a 0,01 (pH 6,0) e arrefeceram-se durante 20 m. Finalmente, montaram-se os cortes com DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, England) sob lamelas de vidro. Examinaram-se os cortes corados com urn microscopio de epi-fluorescencia e uma camara 3CCD (Leica, Wetzlar, Germany). Capturaram-se imagens e analisaram-se utilizando software dedicado (IM500, Leica). 7.2. Resultados 7.2.1. Selecgao de hibridomas
Realizaram-se selecgoes por ELISA como descritas nos metodos e seleccionaram-se 172 clones de hibridomas e transferiram-se para placas de 12 cavidades ("wells") . Realizaram-se ensaios ELISA posteriores para avaliar a especificidade dos anticorpos produzidos contra os peptidos pTau Tau 206-221 [pT212/pS214], Tau 196-211 [PS 202/pT205] e/ou extracto hp-Tau. Desses ensaios resultaram 25 clones positivos para os peptidos pTau e 21 clones apresentaram especificidade para ΗΡ-Tau (Figura 11) .
Em paralelo com a analise ELISA realizaram-se estudos de imuno-histoquimica. Nos clones transferidos para placas de 12 cavidades ("wells") observaram-se diferentes padrdes de coloragao. Em alguns cortes de biGT incubados com sobrenadantes nao diluidos provenientes dos clones seleccionados observou-se coloragao nao especifica em celulas da glia, nucleares e citoplasmaticas. 0 sobrenadante do clone 9H3 (ACI-41-Ab 1) corou com grande especificidade estruturas citoplasmaticas tangles (emaranhados neurofibrilares)
Selecgao por WB (Western Blot) em extractos de cerebros e de hp-Tau provenientes de diferentes murganhos realizou-se utilizando o sobrenadante nao diluido a partir de hibridomas escolhidos. Para qualquer um dos sobrenadantes de hibridomas ensaiados nao se observou nenhuma reacgao com Tau. 7.2.2._Coloragao_de_Emaranhados_Neurof ibrilares (Neurofibrillary Tangles) em Cortes de Cerebros Humanos com a Doenga de Alzheimer
Por imuno-histoquimica TAUPIR (Tau-Pathology Immuno--Reaction) examinou-se a capacidade dos clones de anticorpos ACI-41 Ab-1 (subclone 9H3 T89-F4) e 5D10 para se ligarem a NFT ("Neurofibrillar tangles") em cerebros humanos com AD (Doenga de Alzheimer). 0 clone T89-F4 de anticorpos anti-fos-fo Tau ligou-se a NFT que em cerebros humanos com AD contem fosfo-Tau (Figura 12). A capacidade do anticorpo 5D10 para se ligar a NFT em cortes corticais de cerebros humanos com AD examinou-se por imuno-histoquimica TAUPIR. 0 clone 5D10 de anticorpos anti--fosfo Tau ligou-se a NFT e a fios do neuropilo que contem fosfo-Tau em cortes corticais de cerebros humanos com AD (Doenga de Alzheimer) (Figura 13). 7.3. Conclusao
Selecgao por ELISA de clones de hibridomas gerados por ACI-41 produziu 36 clones que se ligam a peptidos fosforilados e/ou extracto completo de hp-Tau. Selecgao por TAUPIR desses 36 clones confirmou a coloragao da estrutura citoplasmatica tangle em um clone (9H3), ACI-41-Abl.
Os dois anticorpos ACI-41-Abl (9H3-F4) e 5D10 exibiram ligagao especlfica aos NFT ("Neurofibrillar tangles") e fios do neuropilo em cortes cerebrals humanos co AD (Doenga de Alzheimer). EXEMPLO 8: Potencia da ACI-35 produzida por 2 processos diferentes para induzir respostas de IgG especificas de pTau apos imunizagdes i.p. ou s.c. em murganhos wild-type (C57BL/6) 0 objectivo desse estudo foi avaliar a potencia da ACI--35 (Tau393-408 [pS396/pS404]) produzida por 2 processos diferentes, Processo A ACI ou Processo L3 ACI para induzir titulos de anticorpos a seguir a injecgao subcutanea (s.c.) ou intraperitoneal (i.p.) em murganhos C57BL/6 wild-type. Imunizaram-se murganhos 3 vezes com intervalos de 2 semanas e sangraram-se 1 semana antes da primeira injecgao e em seguida 1 semana apos cada imunizagao. Avaliaram-se as respostas totais de IgG anti-Tau (Tau 393-408 [pS396/pS404]) por ELISA. Alem do mais, analisou-se a resposta dos padrdes de isotipos do anticorpo apos 3 imunizagdes para avaliar a distribuigao das diferentes subclasses das IgG bem como da IGM. Analisaram-se os titulos de anticorpos contra o correspondente peptido nao-pTau (Tau 393-408) . Respostas de celulas T induzidas por ACI-35 analisaram-se utilizando a tecnica ELISPOT. 8.1. Metodos
8.1.1. Preparagao da vacina ACI-35 Processo A ACI
Vacinas ACI-35 prepararam-se de acordo com o protocolo do EXEMPLO 3. Seguidamente dividiu-se a suspensao lipossomal (lote ACI-35-081103-B) em aliquotas antes da armazenagem a uma temperatura entre 2 e 8 2C. A proporgao molar final peptido/fosfolipido foi de 1:100.
8.1.2. Preparaqao da vacina ACI-35 Processo L3 ACI
Pesaram-se 4,0 mg do fosfopeptido Tau393-408 [pS396/pS404] tetrapalmitoilado derivado da Tau (Tau 393-408 humana com o grupo fosforo em S396 e S404) para urn frasco ampola ("vial") de vidro de 25 ml ao qual se adicionou hexafluoroisopropanol (HFIP) (5 ml). Seguidamente adicionou--se essa solugao limpida a uma solugao agitada de Dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), Dimiristoilfosfatidilgli-cerol (DMPG), Colesterol e adjuvante Lipido A monofosforilo (MPLA) (todos do fabricante Avanti Polar Lipids Inc. AL, USA) em cloroformio (35 ml) (proporgao molar 9:1:7:0,2, respectivamente). Seguidamente filtrou-se a solugao resultante atraves de uma membrana filtrante hidrofobica de PTFE (politetraf luoroetileno) de 0,2 pm para urn balao de vidro de fundo redondo de 250 ml. Seguidamente eliminou-se o solvente organico por evaporagao sob pressao reduzida a temperatura de 40 °C e depois sob vazio alto durante 3 horas. Re-hidratou-se a fina pelicula resultante por adigao de PBS (40 ml) e agitagao suave a temperatura ambiente durante 18 horas. Seguidamente dividiu-se a suspensao lipossomal (lote ACI-35-081103-A) em aliquotas antes da armazenagem a uma temperatura entre 2 e 8 2C. A proporgao molar final peptido/fosfolipido foi de 1:100. 8.1.3. Imunizagdes A murganhos C57BL/6 com 13 semanas de idade (10 murganhos por grupo) injectaram-se vacinas por via s.c. ou i.p. em tres ocasioes com urn intervalo de 2 semanas entre cada administragao [dia(d)0, dl4, d28] de acordo com o Quadro 11. Uma semana (d-7) antes das primeiras imunizagoes, em seguida 7 dias apos as injecgoes (isto e, d7, d21, d35) , e ate ao momento do sacrificio (D56) colheram-se amostras de sangue e preparou-se plasma. Por ELISA determinaram-se titulos de anticorpos IgG e IgM e padroes de isotipos de IgG especificos de Tau393-408 [pS396/pS4041. Como controlo
determinaram-se por ELISA titulos de anticorpos IgG especificos de nao-pTau393-408.
Quadro 11: Imunizagao de Murganhos
8.1.4. Quantificagao de anticorpos especificos do peptido Tau
Nas 5 amostras de plasma obtido por sangramento determinaram-se por ELISA anticorpos IgG especificos contra
Tau393-408 [pS396/pS404]. Por ELISA averiguaram-se na amostra de plasma obtido por sangramento no d35 anticorpos IgG especificos de Tau393-408, anticorpos isotipos IgM e IgG especificos de Tau393-408 [pS396/pS404]. Durante a noite ("overnight") e a temperatura de 4 2C revestiram-se placas com 10 pg/ml do peptido Tau correspondente. Apos lavagem de cada cavidade ("well") com PBS-0,05% de Tween 20 e bloqueio com 1% de BSA em PBS-0,05% de Tween 20 adicionaram-se as placas diluigdes em serie de plasma e incubaram-se a temperatura de 37 2C durante 2 horas. Apos lavagem, incubaram-se as placas com urn anticorpo anti IgG murina conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) ou anticorpos isotipicos especificos [anti-IgM murino conjugado com Peroxidase de rabano (HRP), anti-IgGl murino conjugado com AP, anti IgG2a e IgG3 murinos conjugados com biotina, adquiridos a Pharmingen BD, San Diego, CA, USA e anti-IgG2b murinos conjugados com HRP fornecido por Zymed Laboratories, San Francisco, CA] durante 2 horas a temperatura de 37 2C. Apos lavagem, incubaram-se as placas com pNPP (para-nitrofenilfosfato) , o substracto fosfatase da AP, ou ABTS (acido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzo-tiazolina-6-sulfonico), o substracto da HRP e leram-se a 405 nm utilizando urn leitor de placas ELISA. Para os anticorpos conjugados com biotina realizou-se uma fase suplementar em que se incubaram as placas durante 45 m em estreptavidina-HRP (R&amp;D Systems, Minneapolis, MN, USA) antes da detecgao utilizando ABTS. Os resultados sao expressos como D.O. (Densidade Optica) a primeira diluigao e a uma diluigao nao saturada para IgG e em D.O. nao saturada para isotipos IgG e IgM. 8.1.5. Quantificagao por ELISPOT de celulas T produtoras de citocinas especificas do peptido Tau A produgao de citocinas pelas celulas T especificas de Tau393-408 [pS396/pS404] e de Tau393-408 avaliou-se por ELISPOT. Revestiram-se placas Multiscreen de nitrocelulose de 96 cavidades {"wells") (Millipore, Molsheim, France) durante a noite {"overnight") com anticorpos anti-IFN-D murino e IL-4 monoclonal de acordo com as instrugoes do fabricante (Pharmingen BD, San Diego, CA, USA). Prepararam-se suspensdes de celulas individuals {"single") provenientes de bagos de murganhos imunizados e incubaram-se em diluigoes em serie com Tau393-408 [pS396/pS404] e Tau393-408 (10 e 1 pg/ml) e
Concanavalina A (ConA) (5 pg/ml, Amersham) a temperatura de 37 2C sob CO2 a 5% durante 72 horas. Seguidamente lavaram-se as placas e incubaram-se 1 hora a temperatura de 37 °C com anticorpos anti-IFN-γ murino e IL-4 monoclonal biotinilados. Apos lavagem, incubaram-se as placas durante 1 hora a temperatura de 37 °C com Estreptavidina-HRP e apos lavagem, revelaram-se as manchas {"spots") mediante a adigao de urn substrato (AEC, 3-amino-9-etilcarbazole) . Contou-se 0 niimero de manchas {"spots") por cavidade {"well") a olho sob urn microscopio estereo e expressaram-se os resultados como manchas por 106 celulas. Como controlos negativos utilizaram--se bagos de murganhos naive. 8.1.6. Ensaio nao Radioactivo de Proliferagao Celular
Prepararam-se suspensdes de celulas individuals ("single") provenientes de bagos de murganhos imunizados e incubaram-se em diluigoes em serie com Tau393-408 [pS396/pS404] and Tau393-408 (10 e 1 pg/ml) e Concanavalina A (ConA) (5 pg/ml, Amersham) a temperatura de 37 2C sob C02 a 5% durante 72 horas. Para medir a proliferagao, utilizou-se um kit de ensaio nao radioactivo de proliferagao celular (reagente MTT) (Promega, Dubendorf, Switzerland) de acordo com as instrugoes do fabricante. Rapidamente, adicionaram-se 15 μΐ de solugao Corante a cada cavidade {"well") e incubaram-se as placas incubaram-se durante 4 horas a temperatura de 37 °C. Em seguida, adicionaram-se por cavidade {"well") 100 μΐ de solugdes de solubilizagao/Stop e incubaram-se as placas a temperatura de 4 2C durante pelo menos 1 hora suplementar. A D.O. mediu-se nos comprimentos de onda 570 nm e 690 nm. 8.2. Resultados 8.2.1. Avaliagao da resposta ao anticorpo induzida por vacinas diferentes A vacina ACI-35 induziu uma intensa resposta anti--pTau-393-408 [pS396/pS404] isotipo IgG apos injecgao i.p. ou s.c. independente do processo utilizado. Em geral titulos potentes de anticorpos ja se encontravam presentes nos 7 dias apos a primeira imunizagao vacinal. Pelo mesmo processo observou-se uma resposta mais elevada relativamente a injecgao s.c. em comparagao com a injecgao i.p. nos d21 e d35 dos animais vacinados pelo Processo L3 ACI (Figura 14, Anova two-way, P<0,001 d21/d35) e nos d21, d35 e d56 dos animais injectados pelo Processo A ACI (Figura 14, Anova two-way, P<0,001 d21/d35, P<0,01 d56) . Para animais injectados por via i.p., a resposta foi superior com o Processo L3 ACI em comparagao com o processo A ACI no sangramento inicial em d7 e d21 (Figura 14, Anova two-way, P<0,001 d7/d21) enquanto para animais injectados por via s.c. nao houve diferenga. Em resumo, os dois processos pareceram equivalentes quando se procedeu a administragao por injecgao s.c..
Analises dos resultados na condigao de D.O em uma diluigao nao saturada confirmaram a diferenga entre injecgao i.p. e injecgao s.c. nos diferentes processos para a vacina ACI-35. Em resumo, os resultados permaneceram os mesmos mostrando que a injecgao s.c. proporcionou titulos de anticorpos mais elevados do que a injecgao i.p. e que para a injecgao s.c nao houve diferengas significativas entre os 2 processos. Para determinar os isotipos de anticorpos induzidos pela vacina, analisaram-se plasmas do d35 por ELISA IgG de isotipos especificos. A ACI-35 induziu em todos os grupos isotipos IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 de IgG anti-pTau393--408 [pS396/pS404]. IgG2b foi o isotipo dominante com elevada D.O. mesmo em uma diluigao de 1/3200. Para a subclasse IgGl houve uma resposta mais elevada para a injecgao s.c. em comparagao com a injecgao i.p. para ambos os processos (Figure 15, Anova one-way, P<0,05). Observou-se a mesma diferenga para a subclasse IgG3. Para as subclasses IgG2a e 2b nao houve nenhuma diferenga entre os 2 processos ensaiados nem entre injecgao i.p. ou s.c. da vacina.
Nao houve nenhuma diferenga entre os 2 processos ensaiados no que respeita a respostas aos anticorpos IgM anti--pTau393-408 [pS396/pS404] enquanto se observaram elevados titulos significativos de IgM com injecgao i.p. em comparagao com injecgao s.c. (Figure 16a, ANOVA one-way, P<0,001).
Em todos os grupos analisaram-se tambem titulos de anticorpos contra nao-fosfoTau 393-408. Em todos os grupos detectaram-se anticorpos IgG especificos anti-Tau 393-408 mas esses titulos foram menores do que os anti-pTau 393-408 [pS396/pS404). Entre os 2 processos ou o modo de injecgao nao houve nenhuma diferenga nos titulos de IgG anti-tau 393-408 (Figura 16b, ANOVA one-way, P>0,05).
No Quadro 12 apresenta-se a media dos tres primeiros titulos de IgG para os diferentes peptidos Tau:
Quadro 12: Media dos tres primeiros titulos IgG anti-Tau393-408 [pS396/S404] (D.O. em diluigao a 1/100)
8.2.2. Avaliagao da resposta das celulas T induzida por ACI-35
In vitro a reestimulagao de esplenocitos com ConA, peptidos pTau393-408 [pS396/pS404] ou Tau393-408 nao resultou em diferengas de proliferagao entre os grupos ensaiados (Figura 17) enquanto foi positiva para ConA.
Reestimulagao utilizando 10 pg/ml de Tau393-408
[pS396/S404] induziu a secregao de citocinas que foi maior nos esplenocitos provenientes de murganhos vacinados em comparagao com os murganhos naive (Figura 18). A injecgao por via s.c. no Processo L3 ACI induz o nivel mais elevado de ambas as citocinas analisadas sem diferenga nitida entre o IFN-γ e a IL-4. A injecgao i.p. ou s.c. do Processo A ACI induz a secregao de uma citocina que e principalmente a IL-4 sendo os niveis mais elevados para a injecgao i.p.. Reestimulagao, utilizando 1 pg/ml de Tau 393-408 [pS396/S404] induziu resultados comparaveis para a reestimulagao, utilizando 10 pg/ml de Tau 393-408 [pS396/S404]. A reestimulagao utilizando o peptido nao-pTau939-408 induziu resultados comparaveis para os homologos do peptido pTau (Figura 18). Mais uma vez a utilizagao do Processo A ACI induz a secregao de uma citocina que e principalmente a IL-4. 8.3. Conclusao A vacina ACI-35 induziu potentes titulos de IgG ja apos imunizagao independentemente do Processo ou do modo de injecgao ensaiado. Em termos de comparagao, a injecgao s.c. das vacinas independentemente do processo utilizado conseguiu os maiores titulos de anticorpos IgG. A injecgao i.p. da vacina ACI-35 no Processo A ACI resultou em menos titulos de IgGl e de IgG3 em relagao ao outro grupo. A injecgao i.p. de ACI-35 resultou em titulos significativos mais elevados de IgM do que a injecgao s.c.. A reestimulagao utilizando peptidos pTau ou Tau induziu a produgao de citocinas no estudo ELISPOT que constava principalmente de IL-4 nos murganhos vacinados pelo Processo A ACI.
Exemplo 9: Imunogenicidade da vacina Tau em murganhos Tau P301L transgenicos (TPLH) 0 objectivo desse estudo foi analisar a imunogenicidade da vacinagao anti-Tau administrando injecgbes subcutaneas (s.c.) das vacinas tau lipossomais (ACI-33, ACI-35, ACI-39 e ACI-40) em murganhos Tau P301L transgenicos. 9.1. Metodos 9.1.1. Murganhos Tau P301L (TPLH) transgenicos
Para analisar a eficacia da vacinagao s.c com ACI-33 ou ACI-35 utilizaram-se murganhos homozigotos TauP301L transgenicos (TPLH) com background FVB/N. Esses murganhos expressam a mais longa isoforma Tau humana com a mutagao P301L sob controlo do promotor murino Thyl. Os sintomas clinicos surgem na idade dos 6 aos 7 meses, e murganhos TPLH em processo de envelhecimento desenvolvem uma taupatia agonizante com disfungao neuronal progressiva e formagao de emaranhados neurofibrilares (NFT). Em fase terminal perdem peso e morrem repentinamente [provavelmente por problemas respiratorios (asfixia)], a maioria deles com 9 a 11 meses e sem excepgao antes dos 12 meses. 9.1.2. Preparacao das vacinas ACI-33 e ACI-35
As vacinas prepararam-se de acordo com o processo A descrito no Exemplo 3. A suspensao de Lipossomas (lote ACI-33-081031-A e lote ACI-35-081015-A + ACI-35-090402-A) dividiu-se entao em aliquotas antes da armazenagem a uma temperatura entre 2 e 8 2C. A proporgao molar final peptido/fosfolipido foi de 1:100. 9.1.3. Imunizagdes ACI-33, ACI-39 e ACI-40 A murganhos TPLH entre 21 e 31 semanas [8-10 murganhos por grupo: mistura de femeas (p) e machos (q)] administraram--se injecgdes s.c. da vacina em cinco ocasides (Quadro 14) . As tres primeiras imunizagdes realizaram-se com urn intervalo de 2 semanas entre cada administragao (dia (d)0, dl3, d28) de acordo com o Esquema 1. Seguidamente administraram-se aos animais reforgos ("were boosted") uma vez por mes durante dois meses (d91 e dl33) . Urn dia (d-1) antes das primeiras imunizagdes, em seguida, apos a segunda (0.21) e a terceira (d41) imunizagdes colheram-se amostras de sangue. A colheita de sangue realizou-se tambem antes, entre e depois dos reforgos (d76, dl04, dl35). Com o sangue preparou-se soro permitindo que as amostras coagulem durante a noite utilizando depois o sobrenadante apos centrifugagao. Por ELISA determinaram-se titulos de anticorpos IgG e IgM especificos de peptidos fosfo-Tau e configuragoes de isotipos IgG. Por ELISA determinaram-se tambem titulos de anticorpos IgG especificos para nao-pTau, proteina Tau completa (441aa) e proteina Tau fosforilada completa (441aa). ACI-35 A murganhos TPLH entre 22 e 31 semanas [10 murganhos por grupo: mistura de femeas (p) e machos (q) ] administraram-se injecgoes s.c. da vacina em cinco ocasides (Quadro 13) . As tres primeiras imunizagdes realizaram-se com urn intervalo de 2 semanas entre cada administragao (dia (d)0, dl3, d27) de acordo com o Esquema 1. Seguidamente administraram-se aos animais reforgos ("were boosted") uma vez por mes durante dois meses (d91 e dl33) . Urn dia (d-1) antes das primeiras imunizagdes, em seguida, apos a segunda (d26) e a terceira (d40) imunizagdes colheram-se amostras de sangue. A colheita de sangue realizou-se tambem antes, entre e depois dos reforgos (d75, dl03. dl45, dl55). Com o sangue preparou-se soro permitindo que as amostras coagulem durante a noite e utilizando depois o sobrenadante apos centrifugagao. Por ELISA determinaram-se titulos de anticorpos IgG e IgM especificos de peptidos Tau393-408 [pS396/pS404] e configura-goes de isotipos IgG. Por ELISA determinaram-se tambem titulos de anticorpos IgG especificos para nao-pTau393-408, proteina Tau completa (441aa) e proteina Tau fosforilada completa (441aa).
Quadro 13: Imunizagao de Murganhos
9.1.4. Quantificaqao de anticorpos especificos do peptido Tau
Em murganhos tratados com ACI-33, ACI-39 e ACI-40, determinaram-se por ELISA nas 6 amostras de soro obtido por sangramento anticorpos IgG especificos contra respectivamente Tau5-20[pY18], Tau206-221[pT212,pS214] e Taul96-211[pS202,pT205].
Na amostra de soro obtido nos d-1 e d41 determinaram-se IgG especifica de proteina Tau5-20, proteina Tau completa (441aa) e proteina Tau completa fosforilada (441aa). Por ELISA averiguaram-se na amostra de soro obtido por sangramento no d41 anticorpos isotipos IgM e IgG especificos do peptido fosfo-Tau.
Em murganhos tratados com ACI-35, anticorpos IgG especificos de Tau393-408 [pS396/pS404] averiguaram-se por ELISA nas 7 amostras de soro obtido por sangramento. No soro do d-1 e d40 determinaram-se IgG especificas de proteina Tau393-408, proteina Tau completa (441aa) e proteina Tau completa fosforilada (441aa). Por ELISA nas amostras de soro obtido por sangramento no d40 determinaram-se anticorpos isotipos IgM e IgG especificos de Tau393-408 [pS396/pS404].
Durante a noite ("overnight") e a temperatura de 4 -C revestiram-se placas com 10 pg/ml do peptido Tau correspondente e 1 pg/ml da proteina Tau correspondente. Apos lavagem de cada cavidade ("well”) com PBS-0,05% de Tween 20 e bloqueio com 1% de BSA em PBS-0,05% de Tween 20, adicionaram--se as placas diluigoes em serie de plasma e incubaram-se a temperatura de 37 2C durante 2 horas. Apos lavagem, incubaram-se as placas com urn anticorpo anti IgG murina total conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) ou anticorpos especificos dos isotipos [anti-IgM murino conjugado com Peroxidase de rabano (HRP), anti-IgGl murino conjugado com AP, anti-IgG3 murino conjugado com biotina, adquiridos a Pharmingen BD, San Diego, CA, USA; anti-IgG2a murino conjugado com biotina adquirido a Invitrogen CA, USA e anti-IgG2b murino conjugado com HRP fornecido por Zymed Laboratories, San Francisco, CA] durante 2 horas a temperatura de 37 2C. Apos lavagem, incubaram-se as placas com pNPP (para-nitrofenilfosfato) , o substracto fosfatase da AP, ou ABTS (acido 2, 2'-azino-bis(3-etilbenzo-tiazolina-6-sulfonico), o substracto da HRP e leram-se a 405 nm utilizando um leitor de placas ELISA. Para os anticorpos conjugados com biotina realizou-se uma fase suplementar em que se incubaram as placas durante 45 m em estreptavidina-HRP (R&amp;D Systems, Minneapolis, MN, USA) antes da detecgao utilizando ABTS. Os resultados sao expressos como D.O. (Densidade Optica) a uma D.O. nao saturada para IgG, isotipos IgG e IgM. 9.1.5. Ligagao de anticorpos anti-Tau a smaranhados ("tangles") Tau em cortes de cerebros de animals transgenicos (TAUPIR) A ligagao de anticorpos presentes no soro de animais vacinados com ACI-33, ACI-35, ACI-39 e ACI-40 contra emaranhados fibrilares ("tangles") em cortes de cerebros realizou-se por imuno-histoquimica TAUPIR. A coloragao TAUPIR realizou-se de acordo com o protocolo do EXEMPLO 5.1.5. 9.1.6. Western Blot (WB) 0 ensaio Western Blot realizou-se de acordo com o protocolo do EXEMPLO 5.1.6 excepto que se procedeu a lavagem antes da detecgao com a solugao do conjugado Qdot (Quantum dot) 625 com a estreptavidina ((Invitrogen, CA, USA)) durante 30 a 60 m a temperatura ambiente. 9.2. Resultados
9.2.1. Resposta do anticorpo IgG
Todas as construgoes vacinais geraram titulos de anticorpos IgG especificos. A vacina ACI-33 induziu uma resposta IgG especifica apos a administragao de injecgao s.c.. Apos 2 imunizagoes (d27), a resposta IgG permaneceu estavel sem qualquer aumento com a terceira imunizagao (d41) (Figura 19: Anova one-way P< 0,001 d-1 vs d27, P>0,05 d27 vs d41). No d76 observou-se um decrescimo dos titulos de anticorpos (Figura 19: Anova one--way P<0,001 d41 vs d76) tendo a administragao de um reforgo ("boosting") aos animais aumentado ligeiramente de novo os titulos no dl04. A vacina ACI-35 induziu uma resposta IgG anti-Tau393-408 [pS396/pS404] apos injecgao s.c.. Depois de 2 imunizagoes (d26), a resposta IgG nao aumentou com a terceira imunizagao (d40) (Figura 20, ANOVA one-way P<0,001 d-1 vs d26 e d40) . A administragao de um reforgo ("boosting") aos animais aumentou de novo os titulos no dl03 (Figura 20, ANOVA one-way P< 0,05 d-1 vs dl04 e P<0,001 d-1 vs dl45). A vacina ACI-39 induziu uma resposta IgG anti-Tau206-221 [pT212, pS214] apos injecgao s.c.. Depois de 2 imunizagoes (d27), a resposta IgG permaneceu estavel sem qualquer aumento com a terceira imunizagao (d41) (Figura 21, ANOVA one-way P<0,001 d-1 vs d27/d41) . Houve uma queda nos titulos no d76 tendo a administragao aos animais de um reforgo ("boosting") restaurado os titulos para um nivel igual ao observado apos 3 imunizagoes (Figura 21, ANOVA one-way P< 0,05 d-1 vs d76 e P> 0,05 d41 vs dl04).
Analises dos resultados das D.O. em diluigao nao saturada apresentaram conclusoes iguais a da diluigao saturada a 1/100 (ANOVA one-way P<0,05 d-1 vs d27/d41/dl04 e P>0,05 d-1 vs d76). A vacina ACI-40 induziu uma resposta IgG anti-Taul96-211 [pS202,pT205] apos injecgao s.c.. Depois de 2 imunizagbes (d27) , a resposta IgG permaneceu estavel sem qualquer aumento com a terceira imunizagao (d41) (Figura 22, ANOVA one-way P<0,001 d-1 vs d27, P>0,05 d27 vs d41). No d76 observou-se um decrescimo dos titulos de anticorpos (Figura 22: Anova one--way P<0,001 d41 vs d76) tendo a administragao de um reforgo ("boosting") aos animais aumentado ligeiramente de novo os titulos no dl04.
Analises dos resultados das D.O. em diluigao nao saturada apresentaram conclusoes iguais a da diluigao saturada a 1/100 (ANOVA one-way P< 0,001 d-1 vs d27, P>0,05 d27 vs d41 e P<0,01 d41 vs d76) . 9.2.2. Analise de isotipos A vacinagao com ACI-33 induziu titulos de anticorpos que exibiram principalmente as subclasses IgG2a e 2b apos 3 imunizagbes s.c.. (Figura 23). Os niveis de IgG, IgG3 e IgM foram baixos nao tendo havido uma diferenga significativa entre os niveis de IgG2a/2b e de IgGl/IgM (Figura 23, Anova one-way P<0,05 IgGl vs IgG2a/2b, P<0,001 IgM vs IgG2a/2b). A vacinagao com ACI-35 induziu titulos de anticorpos que exibiram principalmente as subclasses IgG2a e 2b apos 3 imunizagbes s.c.. (Figura 24). Os niveis de IgGl foram minimos ("lower") com uma diferenga significativa entre IgGl e IgG2a (Figura 24, Anova one-way P<0,05 IgGl vs IgG2a). Os niveis de IgG3 e de IgM foram baixos tendo havido uma diferenga significativa entre os niveis de IgG2a/2b e de IgG3/IgM (Figura 24, Anova one-way P<0,05 IgG3/IgM vs IgG2b, P<0,0001 IgG3/IgM vs IgG2a). A vacinagao com ACI-39 induziu titulos de anticorpos que exibiram principalmente as subclasses IgG2a e 2b apos 3 imunizagbes s.c.. (Figura 25). Os niveis de IgGl, IgG3 e IgM foram significativamente inferiores aos niveis de IgG2a/2b. (Figura 25, Anova one-way P<0,05 IgG2b vs IgGl/IgG3, P<0,01 IgG2a vs IgGl/IgG3, P<0,001 IgG2a/2b vs IgM). A vacinagao com ACI-40 induziu titulos de anticorpos que exibiram principalmente a subclasse IgG2b apos 3 imunizagbes s.c.. (Figura 26, Anova one-way P<0,05 IgG2b vs IgG2a e P<0,001 IgG2b vs IgGl/IgG3/IgM). Os titulos de IgG2a foram tambem superiores aos de IgM (Figura 26, Anova one-way P<0,01 IgG2a vs IgM). 9.2.3. Especificidade do anticorpo
Os titulos de IgG induzidas apos 3 injecgoes s.c. de vacinas Tau analisaram-se tambem relativamente aos diferentes peptidos Tau (o peptido pTau e o peptido Tau) e proteinas [proteina anti-Tau fosforilada completa (441aa) = proteina anti-pTau e proteina anti-Tau completa (441aa) = proteina anti-Tau] .
Em murganhos vacinados com ACI-33, o sangramento ("bleeding") do d-1 utilizou-se como controlo tendo-se observado para cada diferente aplicagao ("coating") uma diferenga entre o pre-sangramento e os soros colhidos apos 3 imunizagdes no caso das aplicagoes {"coatings") de Tau5-20 [pY18] e proteina Tau (Figura 27, Anova one-way P<0,001 d-1 vs d41 para Tau5-20 [pY18], P<0,05 d-1 vs d41 para proteina Tau) .
Em murganhos vacinados com ACI-35, o sangramento ("bleeding") do d-1 utilizou-se como controlo tendo-se observado uma diferenga significativa entre d-1 e d40 apenas para os titulos de anti-Tau393-408 [pS396/pS404] (Figura 28, Anova one-way P<0,0001 d-1 vs d40 para titulos anti-Tau393--408 [pS396/pS404]). Os niveis de anticorpos no d40 obtidos a partir do peptido Tau 393-408 [pS396/pS404] tambem foram entao significativamente diferentes dos niveis obtidos em todas as outras aplicagoes ("coatings") (Figura 28, Anova one-way P<0,0001 d40 anti-Tau393-408 [pS396/pS404] vs d40 anti-Tau393-408/proteina pTau/proteina Tau).
Em murganhos vacinados com ACI-33, o sangramento ("bleeding") do d-1 utilizou-se como controlo tendo-se observado apenas no caso da aplicagao ("coating") de Tau206--221 [pT212, pS214] uma diferenga entre o pre-sangramento e os soros colhidos apos 3 (Figura 29, Anova one-way P<0,001 d-1 vs d41 no caso de Tau206-221 [pT212, pS214]).
Em murganhos vacinados com ACI-40, o sangramento ("bleeding") do d-1 utilizou-se como controlo tendo-se observado diferenga entre o pre-sangramento e os soros colhidos apos 3 imunizagdes no caso das aplicagoes ("coatings") de Taul96-211 [pS202,pT205] e de Tau 196-211 (Figura 30, Anova one-way P<0,001 d-1 vs d41 para Tautl96-211 [pS202,pT205], P<0,05 d-1 vs d41 para Taul96-211).
Em experiencias TAUPIR utilizou-se ainda soro de murganho para determinar se anticorpos anti-tau presentes no soro poderiam reconhecer emaranhados ("tangles") em cortes de cerebros de animais transgenicos Tau.
No extracto de cerebros de diferentes murganhos realizaram-se tambem ensaios de WB realizando a detecgao de todas as formas Tau (pTau e Tau) com soros de murganhos ou o anticorpo controlo Tau-5.
No Quadro 14 seguinte apresenta-se o resumo dos dados.
Quadro 14: Resumo de experiencias TAUPIR e WB em murganhos TPLH vacinados
9.3. Conclusao
Os titulos dos anticorpos anti-Tau analisaram-se guanto a sua ligagao a diferentes peptidos Tau e pTau bem como a proteina completa pTau ou Tau. A imunizagao com Tau lipossomal originou anticorpos IgG gue se ligam especificamente a peptidos pTau e a proteina fosfo-Tau com ligagao mais fraca a peptidos e proteinas nao fosfori1ado (a)s.
Em termos de isotipos de IgG houve uma baixa resposta de anticorpos IgGl baixo em comparagao com IgG2b e IgG3. Observou-se uma baixa resposta de IgM o gue esta de acordo com o modo (s.c.) de imunizagao. A especificidade dos anticorpos produzidos pelos murganhos imunizados com a vacina Tau avaliou-se por ensaio TAUPIR tendo quase todos os soros dos murganhos apresentado elevada ligagao a emaranhados Tau presentes nos cortes de cerebros de animais Tau mutantes. EXEMPLO 10: Eficacia de modelo de murganho Tau P301L transgenico apos vacinagao com ACI-33 ou ACI-35 0 objectivo desse estudo foi o de analisar a eficacia da vacinagao anti-Tau administrando por via subcutanea (s.c.) injecgdes das vacinas ACI-33 (Tau5-20 [pY18]) ou ACI-35 (Tau393-408 [pS396/pS404]) a murganhos Tau P301L transgeni-cos. Imunizaram-se os murganhos 5 vezes e analisaram-se as alteragdes de comportamento realizando um teste Rotarod durante o tempo de vida do animal. 10.1. Metodos 10.1.1. Preparagao das vacinas
As vacinas ACI-33 e AIC-35 prepararam-se de acordo com o protocolo do EXEMPLO 3. 10.1.2. Imunizagao
Os animais imunizaram-se com ou ACI-33 ou ACI-35 de acordo com o protocolo descrito no EXEMPLO 9 (Esquema 2 no caso de ACI-33 e Esquema 3 no caso de ACI-35).
Esquema 2 Plano de imunizagoes, sangramentos e testes de
RotaRod para ACI-33
Esquema 3 Plano de imunizagoes, sangramentos e testes de
RotaRod para ACI-35
10.1.3. Comportamento no dispositivo RotaRod
Para observar a condigao motora dos animais, realizou-se o teste RotaRod automatizado. Submeteram-se 5 murganhos simultaneamente a ensaio em um eixo ou haste ("rod") com movimento orbital e rotativo (diametro de 3 cm) , separados por divisorias nao translucidas. Durante o teste, o eixo acelera 4 a 40 rpm em 5 m. Para cada murganho registou-se sob a forma de classificagao ("was scored") o tempo que permaneceu sobre a haste giratoria, com um maximo de 5 m. 10.2. Resultados
Para avaliar a condigao motora do TPLH apos os tratamentos com ACI-33 ou PBS, submeteram-se os murganhos ao teste RotaRod em cinco ocasioes diferentes (Figura 31) . Uma diferenga significativa entre os animais injectados com ACI- -33 e PBS observou-se na idade de 7,3 meses (Figura 31, ANOVA two-way P<0,001 idade 7,3 meses). Esse efeito da ACI-33 sobre o comportamento motor do murganho correlacionou-se com titulos de anticorpos anti-Tau 5-20 [pY18] no soro dos murganhos aos 7,8 meses (Figura 32, Spearman r P< 0,001).
Para avaliar a condigao motora dos TPLH apos tratamentos com ACI-35 ou PBS, submeteram-se os murganhos ao teste RotaRod (Figura 33) . Embora nao se tivessem observado diferengas significativas entre o grupo de tratamento e o de controlo, pode observar-se uma tendencia para a eficacia da ACI-35 na experiencia com o dispositivo RotaRod realizada quando os murganhos atingiram 9,5 meses de idade (Figura 33, teste de Mann-Whitney P= 0,1905 idade 9,5 meses). 10.3. Conclusao A vacinagao com ACI-33 em murganhos TPLH mostrou urn efeito benefico sobre defices motores desses murganhos durante a experiencia com o dispositivo RotaRod versus animais injectados com PBS. Esse efeito positivo correlacionou-se com os titulos de anticorpos anti-tau dos soros dos murganhos. A vacinagao com ACI-35 em murganhos TPLH mostrou uma tendencia em termos de eficacia sobre defices motores desses murganhos aos 9,5 meses durante a experiencia com o dispositivo RotaRod versus animais injectados com PBS. EXEMPLO 11: Resposta de anticorpos anti-pTau em murganhos nus femeas 0 objectivo desse estudo consistiu em avaliar a resposta de anticorpos anti-pTau induzida pela injecgao da vacina ACI--33 (Tau5-20 [pY18]) em murganhos femeas nus. Os murganhos nus portadores da mutagao Foxnlnu apresentam reduzida fungao de celulas T devido a ausencia de adequado funcionamento da glandula timo. Assim, o objectivo desse estudo foi analisar se a resposta de anticorpos induzida pela ACI-33 e independente das celulas T.
Por via subcutanea (s.c.) injectaram-se murganhos nus com urn background C57BL/6 e correspondentes ninhadas wild type com a idade de 11 ou 13 semanas. Imunizaram-se os murganhos 3 vezes com intervalos de 2 semanas e sangraram-se uma semana apos cada imunizagao. Por ELISA mediu-se o total de respostas IgG peptido anti-pTau (Tau5-20 [pY18]). Alem disso, analisou-se o padrao de isotipos da resposta ao anticorpo apos 3 imunizagdes para avaliar a distribuigao das diferentes subclasses de IgG, bem como de IgM. Analisaram-se tambem titulos de anticorpos contra as correspondentes nao--pTau (Tau5-20), proteina Tau completa (441aa) e proteina Tau completa (441aa) fosforilada.
Para verificar a ausencia de celulas T auxiliares em murganhos nus, avaliou-se a percentagem de celulas CD3+/CD4+ utilizando a Separagao de celulas activadas por fluorescencia [(FACS) Fluorescence-activated cell sorting]. 11.1. Metodos 11.1.1. Preparagao da vacina ACI-33
As vacinas ACI-33 prepararam-se de acordo com o EXEMPLO 3.
Seguidamente dividiu-se a suspensao lipossomal (lote ACI-33-090818-A) em aliquotas antes da armazenagem a uma temperatura entre 2 e 8 °C. A proporgao molar final peptido/fosfolipido foi de 1:100. As vacinas foram expedidas para JSW Life Sciences GmbH (Austria). 11.1.2. Imunizagdes A murganhos nus JSW Life Sciences GmbH (B6.Cg-Foxnlnu/J) com urn background C57BL/6 e correspondentes ninhadas wild type (6 murganhos/grupo) administraram-se injecgoes s.c. de ACI-33 em tres ocasioes com urn intervalo de 2 semanas entre cada administragao (dias 0, 14, 28) de acordo com o Quadro 15. Sete dias antes e 2, 4, 7, 21, 35 e 56 dias apos as primeiras injecgoes colheram-se as amostras de plasma provenientes da veia/arteria facial. Por ELISA determinaram--se titulos de anticorpos IgG e IgM especificos de Tau5-20 [ pY18] e configuragoes de isotipos de IgG. Por ELISA determinaram-se tambem titulos de anticorpos IgG especificos relativos a nao-pTau5-20, proteina Tau completa (441aa) e proteina Tau completa fosforilada (441aa). No d-7 recolheram--se tambem amostras de sangue para analise por FACS para determinar a percentagem de celulas CD3+/CD4+. 11.1.3. Quantificagao de anticorpos especificos do peptido Tau
Por ELISA avaliaram-se anticorpos IgG especificos contra Tau5-20 [pY18] em 5 amostras de soro obtido por sangramento (d2, d7, d21, d35 e d56). Tau5-20-, completa (441aa). No soro obtido no d35 determinaram-se IgG-especificas da proteina Tau e da proteina Tau completa fosforilada (441aa). Por ELISA determinaram-se na amostra de soros obtida por sangramento anticorpos isotipos IgM e IgG especificos de Tau5-20 [pY18].
Durante a noite ("overnight") a temperatura de 4 °C revestiram-se placas com 10 pg/ml do peptido Tau correspondente e 1 pg/ml de proteina Tau correspondente. Apos a lavagem de cada cavidade ("well") com PBS-0,05% de Tween 20 e o bloqueio com 1% de BSA em PBS-0,05% de Tween 20, adicionaram-se as placas diluigdes em serie de soros e incubaram-se a temperatura de 37 °C durante 2 horas. Apos lavagem, incubaram-se as placas com urn anticorpo total anti--IgG murino conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) ou anticorpos especificos de isotipos [anti-IgM murino conjugado com peroxidase de rabano (HRP), anti-IgGl murino conjugado com AP, anti-IgG3 murino conjugado com biotina, adquirido a Pharmingen BD, San Diego, CA, USA; anti-IgG2a murina conjugado com biotina adquirido a Invitrogen CA, USA e anti-IgG2b murino conjugado com HRP proveniente de Zymed Laboratories, San Francisco, CA] durante 2 horas a temperatura de 37 2C. Apos lavagem, incubaram-se placas com pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), o substrato de fosfatase para AP, ou ABTS [acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico) ] , o substrato para HRP e leram-se a 405 nm utilizando urn leitor de placas ELISA. Relativamente aos anticorpos conjugados com biotina realizou-se uma fase suplementar em que se incubaram as placas durante 45 m em estreptavidina-HRP [Horseradish Peroxidase (Peroxidase de rabano)] (R&amp;D Systems, Minneapolis, MN, USA) antes da detecgao utilizando ABTS. Os resultados sao expressos como D.O. (Densidade Optica) em uma D.O. nao saturada para IgG, isotipos de IgG e IgM. 11.1.4. Quantificagao de celulas CD3+/CD4+
Lisaram-se amostras de sangue murino com cloreto de amonio ate se apresentarem limpidas, centrifugaram-se depois a 400xg durante 7 minutos e suspenderam-se de novo os pellets (pequenos aglomerados esfericos) em PBS contendo EDTA. Em seguida bloquearam-se as celulas com reagente de bloqueio CD16/CD32 e coraram-se com CD4 (conjugado PE) e anticorpos CD3 (PE-Cy5) durante 30 m a temperatura de 4 °C. Lavaram-se amostras com PBS, suspenderam-se de novo em solugao fixadora (CellFix™ DB diluida 1:40 em BD FACS Flow) e introduziram-se em urn Citometro da marca BD modelo FACSCalibur. Avaliou-se a percentagem de celulas de interesse identificadas ("gated"), que coraram positivamente para CD3+ e CD4+ (celulas T-helper).
Quadro 15: Imunizagao de murganhos
11.2. Resultados 11.2.1. Observances Gerais
Nenhum dos animais morreu prematuramente e nao foram relatados efeitos colaterais devido ao tratamento. Em todos os animais B6.Cg-Foxnlnu/J, esteve presente o fenotipo caracteristico nu, enquanto as ninhadas Wild Type (WT) exibiram uma pele normal (o corpo coberto de pelos). 11.2.2. Quantificagao de celulas CD3+/CD4+ A coloragao de CD3+/CD4+ seguida por analise FACS revelou uma redugao significativa nas contagens de celulas T--helper (auxiliares) (celulas CD3+/CD4+) em murganhos nus, em comparagao com animais WT (Figura 34). 11.2.3. Analise da resposta imunitaria
Para estudar a imunogenicidade da vacina em murganhos WT e nus analisaram-se os titulos de IgG anti-Tau 5-20 [pY18] gerados pela administragao da vacina ACI-33. Os titulos de IgG anti-Tau 5-20 [pY18] nos murganhos nus analisaram-se para estudar se a resposta induzida pela ACI-33 foi independente da acgao das celulas T. A vacina induziu uma resposta IgG anti-Tau5-20 [pY18] em murganhos nus nao se tendo observado em todos os periodos de tempo analisados qualquer diferenga significativa entre a resposta de anticorpos induzida pela ACI-33 em murganhos WT ou nus (Figura 35; ANOVA two-way P<0,05 para todos os sangramentos entre murganhos nus e WT) . A vacina ACI-33 induziu em ambos os tipos de murganhos uma resposta IgG anti-Tau5-20 [pY18] apos injecgao s.c. que atingiu o valor mais elevado depois de 2 imunizagdes (d27) (Figura 35). A vacinagao com ACI-33 induziu entre murganhos nus e WT titulos de anticorpos do mesmo perfil para as diferentes subclasses de IgG e IgM visto que nao se observaram diferengas significativas entre os dois tipos de murganhos apos 3 imunizagoes subcutaneas com a vacina (Figura 36, ANOVA one-way P>0,05 IgGl nu versus IgGl WT, IgG2a/2b nu versus IgG2a/2b WT, IgG3 nu versus IgG3 WT, IgM nu versus IgM WT) . Em ambos os tipos de murganhos observou-se urn significativo nivel minimo ("lower") de IgGl comparado com IgG2b e IgM (Figura 36, ANOVA one-way, murganho nu: P<0,01 IgGl versus IgG2b ou IgM; murganho WT: P<0,05 IgGl versus. IgG2b ou IgM). Alem disso murganhos nus apresentaram urn significativo nivel minimo de IgGl comparado com IgG3 (Figura 36, ANOVA one-way, murganho nu: P>0,05 IgGl versus IgG3) tendo os niveis de IgG2a sido tambem mais baixos comparados com IgG2b, IgG3 e IgM (Figura 36, ANOVA one-way, murganhos nus: P<0,05 IgG2a vs. IgG2b, IgG3 ou IgM).
Titulos de IgG induzidos apos 3 injecgdes s.c. da ACI-33 analisaram-se tambem relativamente a diferentes peptidos Tau (anti-Tau5-20 [pY18] e anti-Tau5-20) e proteinas (proteina anti-Tau fosforilada completa (441aa) = proteina anti-pTau e proteina anti-Tau completa (441aa) = proteina anti-Tau (Figura 37) ) . Entre murganhos WT e nus nao se observou diferenga quanto aos titulos respeitantes aos/as diferentes peptidos e proteinas. No grupo de murganhos nus observou-se uma diferenga significativa no sentido de os titulos de anti--Tau5-20 [pY18] serem mais elevados do que os titulos anti--Tau5-20 (Figura 37, ANOVA one-way, P<0,05 titulos anti-Tau5--20 [pY18] versus titulos anti-Tau5-20). 11.3. Conclusao
Apesar da pequena percentagem de celulas CD3+ e CD4+ em murganhos nus, a vacina ACI-33 induziu uma potente resposta IgG anti-Tau 5-20 [pY18] . A persistencia da resposta de anticorpos e a distribuigao dos isotipos IgG foram semelhantes em murganhos WT e nus sugerindo que, no contexto da vacinagao com ACI-33, esses parametros sao independentes relativamente as celulas T. Em comparagao com os murganhos imunocompetentes, a imunizagao com a ACI-33 induziu urn tltulo de anticorpos identico e cineticas dos perfis da classe IgG similares em murganhos deficientes em celulas T. Alem disso os titulos de anticorpos respeitantes a diferentes peptidos e proteinas Tau apresentaram-se similares entre murganhos imunocompetentes e deficientes em celulas T. Esses dados indicaram que em murganhos nus e WT a vacina ACI-33 induziu a resposta de anticorpos independentemente das celulas T.
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Depositos
As seguintes linhas de celulas de hibridoma depositaram--se em nome de AC IMMUNE S.A. no "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Inhoffenstr. 7B, D-28124 Braunschweig, ao abrigo das disposigoes do Tratado de Budapeste:
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<210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> VARIANT <222> (18) .. (18) <223> /replace="phosphorylated serine" <22 0> <221> VARIANT <222> (26) .. (26) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 1
Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu lie val Tyr 1 5 10 IS
Lys Ser Pro val val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 20 25 30
<210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> VARIANT <222> (14) .. (14) <223> /replace="phosphorylated tyrosine" <400> 2
Arg Gin Glu Phe Glu val. Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu 15 10 15
<210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> VARIANT <222> (7) .. (7) <223> /replace="phosphorylated threonine" <22 0> <221> VARIANT <222> (9) .. (9) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 3
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 IS
<210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> VARIANT <222> (7) .. (7) <223> /replace="phosphorylated serine" <22 0> <221> VARIANT <222> (10) .. (10) <223> /replace="phosphorylated threonine" <400> 4
Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr pro Gly ser Arg ser Arg 15 10 15
<210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> VARIANT <222> (4) .. (4) <223> /replace="phosphorylated serine" <22 0> <221> VARIANT <222> (12) .. (12) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 5 val Tyr Lys ser pro val val ser Gly Asp Thr ser Pro Arg His Leu 1 5 10 15
<210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> (4) .. (4) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> VARIANT <222> (9) .. (9) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 6
Gly Asp Thr ser Pro Arg His Leu ser Asn val ser Ser Thr Gly ser 1 5 10 15 lie Asp
<210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> VARIANT <222> (3) .. (3) <223> /replace="phosphorylated serine" <22 0> <221> VARIANT <222> (6) .. (6) <223> /replace="phosphorylated threonine" <22 0> <221> VARIANT <222> (13) .. (13) <223> /rep'lace="phosphorylated threonine" <22 0> <221> VARIANT <222> (15) .. (15) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 7
Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu 15 10 15
Pro
<210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> VARIANT <222> (3) .. (3) <223> /replace="phosphorylated serine" <4Ο0> 8
His Leu Ser Asn val ser ser rhr Gly Ser lie Asp 1 5 10
<210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> VARIANT <222> (6) .. (6) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 9 val ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 1 5 10
Lisboa, 26 de Setembro de 2016.

Claims (16)

REIVINDICAQOES
1. Peptido antigenico modificado (a) atraves de ligagao a um fragmento ou radical ("moiety") lipofilico ou hidrofobico que facilita a insergao na bicamada lipidica de um lipossoma e (b) por reconstituigao em um lipossoma de modo que o peptido e exibido na superficie do lipossoma, apresentando o referido peptido uma sequencia de aminoacidos escolhida no grupo constituido pelas sequencias apresentadas em: SEQ ID N2: 2, SEQ ID N2: 3, SEQ ID N2 : 4, SEQ ID N2 : 5, SEQ ID N2 :
2. Peptido antigenico de acordo com a reivindicagao 1., em que o fragmento ou radical lipofilico ou hidrofobico e um acido gordo, um triglicerido ou um fosfolipido, especialmente um acido gordo, um triglicerido ou um fosfolipido que contem uma cadeia carbonada entre Cio e C24, mas especialmente um acido palmitico.
3. Peptido antigenico de acordo com a reivindicagao 1. ou a reivindicagao 2., que possui a sequencia de aminoacidos como apresentada em SEQ ID N2 5.
4. Peptido antigenico de acordo com a reivindicagao 1., ou uma sua associagao, ou de acordo com a reivindicagao 2. ou 3., para utilizagao no tratamento de distiirbios neurodegenerativos.
5. Peptido antigenico de acordo com a reivindicagao 4., para utilizagao no tratamento de tauopatias ou taupatias.
6. Peptido antigenico de acordo com a reivindicagao 4., para utilizagao no tratamento da Doenga de Alzheimer.
6, SEQ ID N2: 7, SEQ ID N2: 8, e SEQ ID N2: 9.
7. Composigao farmaceutica que contem o peptido de uma qualquer das reivindicagdes 1. a 3., ou uma sua associagao, simultaneamente com urn veiculo aceitavel sob o ponto de vista farmaceutico.
8. Composigao farmaceutica de acordo com a reivindicagao 7., que contem ainda urn adjuvante e/ou urn imunomodelador aceitaveis sob o ponto de vista farmaceutico.
9. Composigao farmaceutica de acordo com a reivindicagao 8., em que o adjuvante e o Lipido A momofosforilo.
10. Composigao farmaceutica de acordo com a reivindicagao 7., que compreende o peptido de SEQ ID N2 5, que e tetrapalmitoilado e e o Lipido A momofosforilo.
11. Composigao farmaceutica de acordo com uma qualquer das reivindicagdes 7. a 10., para utilizagao no tratamento de urn distiirbio neurodeqenerativo.
12. Composigao farmaceutica de acordo com uma qualquer das reivindicagdes 7. a 10., para utilizagao no tratamento de tauopatias.
13. Composigao farmaceutica de acordo com uma qualquer das reivindicagdes 7. a 10., para utilizagao no tratamento de doengas e de disturbios que sao causada(o)s pela formagao de lesoes neurofibrilares ou estao associada(o)s a esta formagao, a patologia cerebral predominante em tauopatias que compreendem urn grupo heterogeneo de doengas ou de distiirbios neurodegenerativa (o) s que incluem as doengas ou os distiirbios que apresentam coexistencia de patologias Tau e amiloides e incluem Doenga de Alzheimer, doenga de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilistica, Sindrome de Down, doenga de Gerstmann--Straussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusao, e angiopatia amiloide cerebral causada por proteina prionica, lesao cerebral traumatica e outras doengas ou disthrbios que nao apresentam uma patologia amiloide distinta incluindo, mas nao se limitando a, complexo esclerose lateral amiotrofica/parkinsonismo-demencia de Guam, doenga do neuronio motor nao guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demencia do grao argirof1lico, degeneragao corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificagao, demencia frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, doenga de Hallevorden-Spatz, atrofia de miiltiplos sistemas, doenga de Niemann-Pick tipo C, doenga de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, Panencefalite esclerosante subaguda, demencia senil do tipo caracterizado por emaranhados neurofibrilares (Tangle only dementia) , Parkinsonismo pos-encefalitico, Distrofia miotonica.
14. Composigao farmaceutica de acordo com uma qualquer das reivindicagdes 7. a 10., para utilizagao no tratamento da Doenga de Alzheimer.
15. Processo para utilizagao do peptido ou do fragmento de acordo com uma gualquer uma reivindicagdes 1. a 3., ou uma associagao dos mesmos, ou da composigao farmaceutica de acordo com uma gualquer das reivindicagdes 7. a 10, para a preparagao de urn medicamento para utilizagao no tratamento de a. urn disthrbio neurodegenerativo; b. doengas e distiirbios que sao causada (o) s pela formagao de lesoes neurofibrilares ou estao associada(o)s a essa formagao e que apresentam coexistencia de patologias Tau e amiloide; ou c. Doenga de Alzheimer, doenga de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilistica, Sindrome de Down, doenga de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusao, e angiopatia amiloide cerebral causada por proteina prionica, lesao cerebral traumatica e outras doengas ou disthrbios que nao apresentam uma patologia amiloide distinta incluindo, mas nao se limitando a, complexo esclerose lateral amiotrofica/parkinsonismo-de-mencia de Guam, doenga do neuronio motor nao guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demencia do grao argirofilico, degeneragao corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificagao, demencia frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, doenga de Hallevorden-Spat z, atrofia de miiltiplos sistemas, doenga de Niemann-Pick tipo C, doenga de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, Panencefalite esclerosante subaguda, demencia senil do tipo caracterizado por emaranhados neurofibrilares (Tangle only dementia) , Parkinsonismo pos-encefalitico, Distrofia miotonica.
16. Processo de acordo com a reivindicagao 15., para a preparagao de urn medicamento para utilizagao no tratamento da Doenga de Alzheimer. Lisboa, 26 de Setembro de 2016.
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