KR101208173B1

KR101208173B1 - 초분자 구조체를 포함하는 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR101208173B1
Application number: KR1020067019374A
Authority: KR
Inventors: 이브스 크라우드 니코라우; 루쓰 그레페라쓰; 데이비드 히크만
Original assignee: 에이씨 이뮨 에스.에이.
Priority date: 2004-02-20
Filing date: 2005-02-22
Publication date: 2013-01-14
Also published as: PL2465533T3; US20120045463A9; JP2011251964A; EP1763364B9; US20060073158A1; AU2005216100B2; EP2465533A1; US20070281006A1; CA2556479A1; CA2556479C; EP1763364B1; WO2005081872A2; ATE552848T1; AU2005216100A1; CN101420983A; EP2465533B1; EP1763364A2; EP1763364A4; US20150183857A1; WO2005081872A3

Abstract

본 발명은 입체 형태적으로 민감한 항체를 우수한 특이성으로 수득하는, 높은 면역 반응을 유도하기 위한 신규 조성물 및 방법을 포함한다. 이들 항체는 제한되는 것은 아니지만, 아밀로이드 단백질, 프리온 단백질, P₁₇₀ 글리코단백질을 포함하는 광범위하고 다양한 항원에 대한 특이적 에피토프를 인지한다. 본 발명의 신규 조성물은 일반적으로 변성되고 향상된 펩티드 제시를 초래하는 페길화된 리신에 공유적으로 부착된 펩티드 서열을 포함하는 초분자 항원 구조체를 포함한다. 본 발명의 독특한 변성 방법론은 다양한 펩티드에 적용될 수 있으며 궁극적으로 알츠하이머 질환과 같은 질환 및 장애를 위한 치료 제제 및 백신에 사용될 수 있다.

Description

초분자 구조체를 포함하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING SUPRAMOLECULAR CONSTRUCTS}

본 발명은 높은 면역 반응을 이끌어 내기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 입체 형태 민감성 항체를 얻기 위한 신규 조성물 및 방법을 포함한다.

면역계는 제각기 다른 활성도를 갖는 많은 여러 종류의 세포를 포함하는 신체의 복잡한 반응계이다. 면역계의 한 부분의 활성화는 일반적으로 계의 다른 관련 부분의 요구되지 않은 활성화로 인하여 다양한 반응을 야기한다. 현재, 면역계의 특이 성분을 표적화하여 특이적으로 원하는 반응을 생성하기 위한 만족스러운 방법 또는 조성물은 없다.

면역계는 세포, 및 세포 인자를 포함하는 광범위하고 다양한 성분을 포함하는 신체의 복잡한 상호 작용계이며, 이것은 신체의 내부 및 신체의 외부 양자로부터의 자극과 상호작용한다. 그의 직접적인 행동 이외에, 면역계의 반응은 또한 신경, 호흡, 순환, 및 소화계를 포함하는 신체의 다른 계에 의해 영향을 받는다.

면역계의 잘 알려진 양상 중의 하나는 미생물의 침입, 신체 내의 세포 변화에 의해 또는 백신접종으로부터 존재하게 된 외부 항원에 반응하는 그의 능력이다. 면역계의 이러한 활성화에 반응하는 세포의 제 1 종류 중의 몇몇은 식세포(phagocyte) 및 자연 살해 세포(natural killer cell)이다. 식세포는 다른 세포들 중에서도, 단핵세포(monocyte), 대식세포(macrophage), 및 다형핵 중성구(polymorphonuclear neutrophil)를 포함한다. 이들 세포는 일반적으로 외부 항원에 결합하고, 그것을 내재화하고 종종 그것을 파괴한다. 또한 이들은 염증성 반응과 같은 다른 면역 반응을 매개하는 가용성 분자를 생성한다. 자연 살해 세포는 특정 바이러스에 의해- 감염된 배세포 및 종양 세포를 인지하고 파괴할 수 있다. 면역 반응의 다른 인자는 보체 경로를 포함하며, 이것은 독립적으로 외부 항원에 반응할 수 있거나 또는 세포 또는 항체와 협력하여 작용할 수 있다.

일반적으로, 항원에 대한 반응은 체액 반응 및 세포 반응 양자를 포함한다고 여겨진다. 체액 면역 반응은 혈장 또는 세포 내액 중에서 자유롭게 발견될 수 있거나 발견될 수 없으며 세포에 의해 방출되는 비세포 인자에 의해 매개 된다. 면역계의 체액 반응의 주성분은 B 림프구에 의해 생성된 항체에 의해 매개 된다. 세포 매개된 면역 반응은 항원 제시 세포 및 B 림프구(B 세포) 및 T 림프구(T 세포)를 포함하는 세포의 상호작용을 초래한다.

가장 광범위하게 사용된 면역 반응 능력의 양상 중의 하나는 단일클론 항체의 생성이다. 1970년대 중반에 단일클론 항체(Mab) 기술의 출현은 가치있는 새로운 치료 및 진단 수단을 제공한다. 처음으로, 연구원 및 임상학자는 미리 결정된 항원 부위에 결합할 수 있으며 다양한 면역학적 작동체(effector) 기능을 갖는 균일한 항체의 비제한적인 양에 접근하였다. 현재, 단일클론 항체의 제조 기술은 당 업계에 공지되어 있다. 그러나, 특수화된 항체에 대한 필요가 계속 남아있다. 본질적으로, 요구되는 것은 세밀하게 맞추어진 항체를 생성하는 능력이다. 그 필요성은 병원균이 통상적으로 사용된 항생물질에 대한 내성을 획득한 감염증 억제의 분야에서 특히 크다. 게다가, 감염체 이외의 원인에 기인한 병리적 상태를 다루기 위하여, 항생물질에 대한 필요가 있다.

알츠하이머 질환(AD)은 뇌에서 단백질의 비정상적인 침착(deposit)에 의해 유발된 아밀로이드 플라크(plaques)의 형성에 의해 유발된다고 우선 생각되는 신경계 장애이다. 과학적인 증거는 AD가 신경세포사를 유발하는 플라크 내의 베타-아밀로이드 단백질의 생성 또는 축적의 증가에 기인하는 것임을 논증한다. 전략상 중요한 뇌영역에서 신경 세포의 손실은, 차례로, 신경전달 물질의 감소 및 기억의 손상을 유발한다. 플라크 형성에 주로 책임이 있는 단백질은 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 및 두 프리세닐린(프리세닐린 I 및 프리세닐린 II)를 포함한다. APP의 분해는 플라크 내에서의 응집하는 이들의 성향을 아마도 증진한다. 아밀로이드 플라크 형성을 표적화하여 흩어지게 할 수 있는 특수한 항체가 필요하다.

AD의 증상은 명백히 느리며 제1 증상은 단지 가벼운 건망증일 수 있다. 이 단계에서, 개체는 최신 사건, 활동, 친근한 사람들 또는 물건들의 이름을 잊을 수 있으며 간단한 수학 문제를 풀지 못할 수 있다. 질환이 진행됨에 따라, 증상은 더 용이하게 인지될 수 있으며 AD가 있는 사람들 또는 그들의 가족 구성원이 의학적 도움을 모색할만큼 심각해진다. AD의 중간단계 증상은 몸 치장하기(grooming)와 같은 간단한 일을 어떻게 하는지 잊으며 말하기, 이해하기, 듣기, 또는 쓰기의 전개 에 대한 문제를 포함한다. 더 나중 단계의 AD 환자는 불안하거나 공격적일 수 있으며, 가정에서 떠나 헤맬 수 있고 궁극적으로는 간호가 필요하다.

현재, AD를 진단하는 오로지 확실한 방법은 개체의 죽음 후 검시 해부에서 뇌 조직 내의 플라크 및 엉킴을 확인하는 것이다. 따라서, 의사는 사람이 살아 있는 동안 "가능성" 또는 "유망성" AD 의 진단 만을 할 수 있다. 현재의 방법을 사용하여, 내과의사는 "유망성" AD 진단을 위한 몇몇 수단을 사용하여 90% 까지 정확하게 AD를 진단할 수 있다. 내과 의사는 개인의 일반적인 건강, 과거의 건강상의 문제, 및 개인이 일상적인 활동을 수행하는데 있어서의 모든 병력을 질문한다. 기억, 과제해결, 주의, 계산, 및 언어의 행동 시험은 인식력의 퇴화에 대한 정보를 제공하며 혈액, 소변, 또는 척수액, 및 뇌 주사(brain scan)의 시험과 같은 의약 시험은 몇몇 추가의 정보를 제공할 수 있다.

AD의 취급은 약제-기재(medication-based) 및 비약제 기재 치료로 구성된다. 질환의 잠재적인 진행을 변화시키는 데 목적을 둔 치료(진행의 지연 또는 후퇴)는 지금까지 대부분 실패하였다. 콜린에스터라제 저해제(ChEIs)와 같은 신경 세포의 화학 전령(신경 전달 물질)에서 결손(결함) 또는 기능 부전을 복원하는 약물은 증상을 개선하는 것으로 나타났다. 약물은 또한 AD의 정신 의학 징후를 처리하기 위해 이용할 수 있다.

타크린(Tacrine) 및 리바스트그마인(Rivastgmine)과 같은 콜린에스터라제 저해제는 현재 AD의 치료를 위해 FDA에 의해 승인된 유일한 종류의 약품이다. 이들 약품은 뇌의 화학 신경 전달 물질 내에서 결함, 또는 기능 부전을 재생하는 의약이 다. ChEIs는 신경전달 물질의 효소 분해를 방해함으로써 뇌에서의 신경 신호를 전하기 위해 유용한 화학 전령의 양을 증진시킨다.

초기 및 중간 단계의 질환에서의 몇몇 사람들을 위해, 약물 타크린(COGNEX

, 모리스 플레인, 뉴저지주), 도네페질(ARICEPT

, 도쿄, 일본), 리바스티그마인(EXELON

, 이스트 하노버, 뉴저지주) 또는 갈란타민(REMINYL

뉴 브륀스 윅, 뉴저지주)는 제한된 시간 동안 몇몇 증상이 더 악화되는 것을 방지할 수 있다. 또 다른 약물, 메만틴(NAMENDA

, 뉴욕, 뉴욕주)은 심한 AD에 대하여 적당한 치료로써 인가되었다. 또한, 몇몇 약물은 불면증, 흥분, 유주성(wandering), 불안, 및 우울과 같은 AD의 행동 증상의 조절을 도울 수 있다. 이들 증상의 치료는 종종 환자들이 보다 더 편안하게 하고 돌보는 사람에 대하여 이들의 돌봄을 더 쉽게 한다. 유감스럽게도, 이러한 약품의 부류가 플라시보(placebo)보다 일관되게 우수하다는 것을 나타내는 유의한 치료의 개선에도 불구하고, 질환은 치료에 상관없이 계속해서 진행되며, 정신 작용에 대한 평균 효과는 별로 크지 않다. ChEIs는 또한 위장 장애, 간 독성 및 체중 감소를 포함하는 부작용을 갖는다.

AD에서 일어나는 뇌 비정상성의 이해에서 개선은 질환의 원인 및 전개의 변경에 더 촛점을 둔 치료의 신규 표적을 위한 골격(framework)을 제공하도록 희망된다. 항염증제를 포함하는 많은 화합물이 활발하게 연구되고 있다. 로페콕시브 및 세레콕시브와 같은 특정 시클로옥시게나제 저해제(COX-2)를 사용한 임상적 시도가 또한 진행중이다.

새로운 약물을 개발할 때 고려해야 할 또 다른 요소는 표적 환자를 위한 사용의 용이성이다. 환자 편의성의 이유로 경구 약물 전달-특히 정제, 캡슐 및 연질젤이- 모든 투약 형태의 70% 소비된다. 약물 개발자들은 환자들이 주사 또는 기타, 더 침투성인 형태의 약물 투여에 그들 자신이 대상이 되는 것보다는 경구 전달을 선호한다는 것에 동의한다. 낮은 투여 간격(즉, 하루에 한번 또는 서방성)을 초래하는 제제가 또한 바람직하다. 경구 투여 형태로 항생물질을 투여하는 것의 용이성은 치료 동안 환자의 편의성 증진을 초래한다.

필요로 하는 것은 높은 특이적 및 높은 효율성의 항체의 생성을 위한 효과적인 방법 및 조성물이다. 바람직하게는 이러한 항체는 아밀로이드 단백질, 프리온 단백질 또는 P₁₇₀ 글리코단백질과 같은 다양한 항원에 대한 특이적 에피토프를 인지한다.

그러므로 또한 필요로 하는 것은 알츠하이머 질환과 같은 아밀로이드 플라크 형성과 연관된 신경계 질환과 관련된 합병증을 처리하기 위한 효과적인 조성물 및 방법이다. 특히 필요한 것은 그의 베타 시이트(beta sheet) 형태에서 아밀로이드 펩티드 섬유의 응집과 연관된 플라크의 형성과 같은 질환의 생리적인 징후를 저지할 수 있는 특수화된 항체이다.

발명의 요약

본 발명은 매우 특이적이고 매우 효과적인 항체를 유도하기 위한 신규 방법 및 조성물을 포함한다. 현재의 유용한 제품과는 달리, 본 발명은 항원의 범위로부터 특이적 에피토프를 인지하는 능력을 갖는 항체를 초래하는 독특한 방법 및 조성물을 제공한다.

본 발명은 아밀로이드 단백질, 프리온 단백질 또는 P₁₇₀ 글리코단백질과 같은 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체를 생성할 수 있는 조성물에 대한 필요성에 대한 오랜 열망을 만족한다.

본 발명은 증진된 노출 및 궁극적으로 높은 정도의 형태 민감성을 갖는 항체를 초래하는 독특한 항원 제시(antigen presentation)를 포함한다. 한 실시 형태에서, 본 발명은 각각의 말단에서 페길화된(pegylated) 아미노산(예컨대, 페길화된 리신)-1 에 공유적으로 부착된 펩티드 서열을 포함하는 초분자 항원 구조체를 포함하는 조성물을 포함한다.

따라서, 본 발명의 목적은 특이적이고 효과적인 면역 반응을 유도하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 질환의 발생 또는 퍼짐을 예방 및 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 숙주 내의 활성 세포 및 체액 반응을 유도하여 질환을 예방, 치료 또는 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

또다른 본 발명의 추가의 목적은 신경계 장애의 발생을 감소 및 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 과대 증식성(hyperproliferative) 장애의 발생을 감소 및 예방시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

또다른 본 발명의 추가의 목적은 신경계 장애에서의 치료적 면역 시술(intervention)을 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

또다른 본 발명의 추가의 목적은 선택된 감염성 유기체에 대하여 인간 또는 동물을 백신 접종하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

또다른 본 발명의 추가의 목적은 선택된 감염성 유기체에 대한 인간 또는 동물을 수동적으로 면역화(passively immunizing)하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 항원이며 인간 또는 동물에서 병리학적 징후에 대한 면역 반응을 이끌어 내는 초분자 구조체 조성물을 제공하는 것이다.

또다른 본 발명의 추가의 목적은 이러한 병리학적 징후가 아밀로이드 플라크와 같은 이상(abnormalities)을 포함하는 것인, 항원성이고 인간 또는 동물에서 병리학적 징후에 대한 면역 반응을 이끌어 내는 초분자 구조체 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항원성이고 인간 또는 동물에서 감염성 유기체에 대한 면역 반응을 이끌어 내는 초분자 구조체 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간 또는 동물에서 조성물로 면역화되는 비면역원성인 초분자 항원성 구조체; 및 수득한 항체가 인간 또는 동물에 투여되었을 때 높은 특이성이며 상당한 정도의 입체 형태 민감도를 갖도록 캐리어의 표면상에 항원 펩 티드가 독특하게 제시되는 캐리어를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

또다른 본 발명의 추가의 목적은 질환 및 장애에 대한 개별 반응을 증진시키기 위한 변성된 항원성 모이어티(moiety)를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 펩티드가 항원 효과를 증진시키도록 변성된 초분자 항원성 구조체를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

또다른 본 발명의 추가의 목적은 펩티드가 (폴리에틸렌 글리콜 또는 변성 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여) 페길화를 통해 변성되거나, 또는 폴리-아미노산(예컨대, 폴리-글리신, 폴리-히스티딘), 폴리-사카라이드(예컨대, 폴리갈락투론산, 폴리락트산, 폴리글리콜라이드, 키틴, 키토산), 합성 중합체(폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에스테르), 또는 공중합체(폴리(메타크릴산) 및 N-(2-히드록시)프로필메타크릴아미드) 등에 의한 기타 방법을 통해 변성된 항원 효과를 증진시키기 위해 변성된 펩티드를 포함하는 초분자 항원성 구조체를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

또다른 본 발명의 추가의 목적은 항원 펩티드를 위한 캐리어가 변성된 리포솜을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항원 펩티드에 대하여 캐리어가 콜로이드 금속을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항원 펩티드에 대하여 캐리어가 배큘로바이러스 유도 소포(baculovirus-derived vesicle)를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

또다른 본 발명의 추가의 목적은 면역 반응을 자극하기 위한 약학적으로 허 용 가능한 항원보강제(adjuvant)와 조합된 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

발명의 또 다른 목적은 근육내, 정맥내, 경피, 경구 또는 피하 투여될 수 있는 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 이들 및 다른 목적, 특징 및 장점은 하기에 개시된 실시 형태의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위를 재검토한 후 명백하게 될 것이다.

도1은 화학적으로 변성된 β-아밀로이드 항원을 나타내는 도식을 제공한다.

도2는 화학적으로 변성된 아밀로이드 항원으로 재구성된 리포솜을 나타내는 대표적인 도식을 제공한다.

도3은 다중 P₁₇₀ 항원을 나타내는 도식을 제공한다.

도4는 제1 래트 해마 뉴론의 생존 능력에 대한 이들의 영향을 조사하기 위해 사용된 PrP^c 의 다른 단편에 상동성인 합성 펩티드를 제공한다.

도5는 Aβ 서열 4-11(서열 번호: 2), 1-16(서열 번호: 5), 22-35(서열 번호 : 3) 및 29-40(서열 번호: 4)로부터 유도된 펩티드의 도식을 제공한다.

도6은 내부 His 또는 Lys 잔기와 함께 또는 없이 펩티드 서열로부터 유도된 항원으로의 일반적인 합성 접근을 나타내는 도식을 제공한다.

도7은 페길화된 아밀로이드/리포솜/지질A 면역화된 C57BL/6 마우스로부터 1:5000으로 희석된 혈청을 사용하여 수행된 ELISA의 결과를 제공한다. PEG-Aβ_1-16(- -흑색), PEG-Aβ_1-16+ ALUM(- -회색), PEG-Aβ_4-11(--회색). 항원당 10 마우스의 값의 평균; 2 마우스로부터의 값의 평균은 Aβ_1-16+ ALUM에 대해 나타낸다. 대조로써 12 팔미토일화된 Aβ_1-16(- -담회색) 주입된 동물의 평균값을 나타낸다(2002년 발표).

도8은 PEG-Aβ_4-11면역화된 C57BL/6 마우스의 혈청에 의한 Aβ_1-42섬유의 용해화의 평가 시험 결과를 제공한다. 티오플라빈 형광 방출 강도는 용액 내에 존재하는 fbrillar 아밀로이드의 양과 관련이 있다. pH=7.1, PBS 내의 37℃에서 7일 동안 Aβ_1-42섬유 형성. 혈청은 7일에 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 1-9 막대는 백신화된 동물의 혈청으로 만들어진 용해화 실험을 나타낸다. 4 샘플 + SD의 평균을 나타낸다.

도9는 palm.-Aβ_1-16면역화된 C57BL/6 마우스로부터 하이브리도마 클론의 상청액에 의한 Aβ_1-42섬유의 용해화 시험의 결과를 제공한다. pH=7.1, PBS 내의 37℃에서 7일 동안 Aβ_1-42섬유 형성. 상청액은 24시간 동안 인큐베이션 하였다. sfr 배지=FCS 가 없는 배지. 하이브리도마 클론은 1일 동안 혈청이 없는 배지에서 성장하였다. 4 샘플 + SD의 평균을 나타낸다.

도10은 ¹⁰Tyr 및 ¹²Val에 표식된(labelled) 아밀로이드 β-펩티드로 만들어진 아밀로이드 섬유의 ¹³C-¹³C 상관관계 스펙트럼을 제공한다.

도11은 Aβ-펩티드 섬유(A) 및 12일 동안 항체와 인큐베이션 한 후(B)의 ¹³C-¹³C 상관관계 스펙트럼의 사영을 제공한다.

도12는 아밀로이드 베타 섬유에 대한 단일클론 항체의 효과를 평가하기 위한 NMR 스펙트럼 자료를 제공한다.

도13은 페길화 및 팔미토일화 항원에 대한 비교 자료를 나타내는 그래프를 제공한다.

도14는 페길화 베타 아밀로이드(1-16, 4-11, 22-35, 1-15) 및 팔미토일화 베타 아밀로이드(1-16)에 대한 비교 자료를 나타내는 그래프를 제공한다.

본 발명은 여기에서 포함된 하기의 구체적인 실시 형태의 상세한 설명을 참고로 하여 좀 더 용이하게 이해될 것이다. 본 발명이 그의 특정 실시 형태의 상세한 설명을 참고로 하여 기술되었지만, 이러한 설명이 본 발명의 범주을 제한하는 것으로 간주되는 것을 의도하는 것은 아니다. 여기에서 기술된 참고 문헌은 미국 가특허 출원 일련 번호 제60/449,573호, 및 미국 특허 출원 일련 번호 제10/783,975(2004년 2월 20일 출원)을 포함하여 이들 전체를 참고로 혼입하였다.

우리는 입체 형태적으로 민감한 항체를 매우 특이적으로 수득하는 높은 면역 반응을 유도하는 방법을 여기에서 기술한다. 이들 항체는 제한되는 것은 아니지만 아밀로이드 단백질, 프리온 단백질, P₁₇₀ 글리코단백질을 포함하는 광범위하고 다양한 항원상의 특이 에피토프를 인지한다. 더 구체적으로, 우리는 개선된 면역원성 반응을 이끌어 내기 위해 아밀로이드 펩티드와 같은 변성 펩티드의 개념을 여기에서 보고한다. 특정 실시 형태에서, 펩티드는 페길화(pegylation)를 통해 변성된다.

정의

여기에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 호환성이 있으며, 펩티드 결합에 의해 연결된 2 이상의 아미노산으로 구성된 생체 분자를 의미하는 것으로 정의된다.

용어 "펩티드"는 아미노산의 알파 탄소가 1 아미노산의 알파 탄소의 카르복실기와 다른 아미노산의 알파 탄소의 아미노기 사이의 축합반응에 의해 형성된 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산(전형적으로 L-아미노산)의 사슬이다. 사슬의 한쪽 끝에서 말단 아미노산 (즉, 아미노 말단)은 유리 아미노기를 가지며, 반면, 사슬의 다른 끝에서 말단 아미노산(즉, 카르복시 말단)은 유리 카르복시기를 갖는다. 이와 같이 하여, 용어 "아미노 말단"(N-말단으로 축약)은 펩티드의 아미노 말단에서 아미노산 상의 유리 알파 아미노기를 의미하거나, 또는 펩티드 내의 임의의 다른 위치에서 아미노산의 알파 아미노기(펩티드 결합에 참여하고 있을 때는 이미노기)를 의미한다. 유사하게, 용어 "카르복시 말단"(C-말단으로 축약)은 펩티드의 카르복시 말단에서 아미노산 상의 유리 카르복실기를 의미하거나, 또는 펩티드 내의 임의의 다른 위치에서 아미노산의 카르복실기를 의미한다.

전형적으로, 펩티드를 만드는 아미노산은 아미노 말단에서 시작하여 순서 있게 번호를 매겼으며 펩티드의 카르복시 말단 쪽 방향으로 증가한다. 따라서, 한 아미노산이 다른 것의 "뒤에온다"라고 말할 때, 그 아미노산은 선행 아미노산보다 펩티드의 카르복시 말단에 더 근접하게 위치된다.

여기에서 사용된 용어 "잔기"는 아미드 결합에 의해 펩티드로 혼입된 아미노산을 의미한다. 이와 같이 하여, 아미노산은 자연 발생 아미노산일 수 있으며 또는, 다른 제한이 없다면, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 공지의 천연 아미노산의 유사체(즉, 아미노산 의태물(mimetics))를 포함할 수 있다. 더욱이, 아미드 결합 의태물은 당업계에서 공지된 펩티드 골격 변성을 포함한다.

구 "필수적으로 구성된"은 구에서 의미하는 펩티드의 필수적인 성질을 실질적으로 변경하는 모든 요소를 제외하는 것으로 사용된다. 따라서, "...로 필수적으로 구성된" 펩티드의 기재는 펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하는 아미노산 치환, 첨가, 또는 삭제는 제외한다.

더욱이, 당업자는 상술한 바와 같이 코딩된 서열에서 단일 아미노산의 첨가 또는 삭제, 또는 아미노산의 작은 백분율(전형적으로 5% 미만, 더 전형적으로 1% 미만)을 변경하는 개별적인 치환, 삭제 또는 첨가는, 변경이 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환을 초래하는 보전적으로 변성된 변이임을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보전적 치환 표는 당업계에 공지되어 있다. 하기 6 군은 서로에 대하여 보존적 치환기인 아미노산을 각기 함유한다:

1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

구 "단리된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 천연상태에서 발견되었을 때 일반적으로 동반하는 성분이 실질적으로 또는 필수적으로 없는 물질을 의미한다. 그러므로, 여기에서 기술된 펩티드는 이들의 본래의 환경과 일반적으로 연관된 물질을 함유하지 않는다. 전형적으로, 여기에 기술된 단리된 면역 펩티드는 은 착색 겔 상에서 띠 강도(band intensity)에 의해 측정된 바로 적어도 약 80% 순도, 일반적으로 적어도 약 90%, 및 바람직하게는 적어도 약 95% 이다.

단백질 순도 또는 상동성(homogeneity)은 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기이동에 이어, 착색시의 시각화와 같은 당업계의 다수의 공지 방법에 의해 나타낼 수 있다. 특정 목적을 위해 높은 분해(resolution)가 필요할 것이며 HPLC 또는 유사한 정제 수단이 이용된다.

면역원성 펩티드의 길이가 상대적으로 짧을 때(즉, 약 50 아미노산 미만), 이들은 종종 표준 화학 펩티드 합성 기술을 사용하여 합성된다.

서열의 C-말단 아미노산이 불용성 지지체에 결합되고 이어서 서열 내의 잔존 아미노산을 연속적으로 첨가하는 고체상 합성은 여기에서 기술된 면역 펩티드의 화학 합성을 위한 바람직한 방법이다. 고체상 합성에 대한 기술은 당업계에 공지되어 있다.

선택적으로, 여기에서 기술된 면역 펩티드는 재조합 핵산 방법론(recombinant nucleic acid methodology)를 사용하여 합성된다. 일반적으로 이것은 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 생성하고, 특정 프로모터의 조절하에서 발현 카세트 내의 핵산을 넣고, 숙주 내에서 펩티드를 발현하고, 발현된 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리하고, 필요하다면, 펩티드를 복원하는 것을 포함한다. 이러한 절차를 통해 당업자를 안내하기에 충분한 기술이 문헌에 알려져 있다.

일단 발현되면, 재조합 펩티드는 황산암모늄 침전화, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기이동 등을 포함하는 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 치료제로서 사용하기 위해서는 약 50% 내지 약 95% 상동성의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하며, 80 내지 95% 또는 더 큰 상동성이 가장 바람직하다.

당업자는 화학 합성, 생물학적 발현 또는 정제 후, 면역원성 펩티드가 구성 펩티드의 자연적인 입체형태와 실질적으로 다른 입체 형태를 보유할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이 경우, 항증식성 펩티드를 변성 및 감소하고 그 후 펩티드를 바람직한 입체 형태로 리폴딩 하도록 야기하는 것이 종종 필요하다. 단백질의 감소 및 변성과 리폴딩(re-folding)을 유발하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

정제된 단백질의 항원성은 예를 들어, 면역 혈청과, 또는 단백질 자체에 대하여 생성된 항혈청과의 반응을 나타냄으로써 확인될 수 있다.

여기에서 사용된 용어에서 단수는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 정의되며 문맥이 부적당한 것이 아니라면 복수를 포함한다.

여기에서 사용된 용어 "검출하는" 또는 "검출된"은 면역화학 또는 조직학적 방법과 같은 생물학적 분자의 검출을 위한 공지 기술을 사용하는 것을 의미하며 연구 하의 생체 분자의 존재 또는 농도를 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 것을 의미한다.

"단리된"은 자연적으로 발생하는 적어도 일부의 성분이 없는 생물 분자를 의미한다.

여기에서 사용된 용어 "항체" 또는 "항체들"은 단일클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 이중 특이성 항체, 유인원화된(simianized) 항체, 및 인간화된(humanized) 항체뿐만 아니라 Fab 면역글로불린 발현 라이브러리의 생성물을 포함하는 Fab 단편을 포함한다.

용어 "항원"은 포유류에서 면역 반응을 유도할 수 있는 그의 본체(entity) 또는 단편(fragment)을 의미한다. 상기 용어는 항원성 또는 항원 결정인자에 대하여 책임이 있는 면역원성 및 영역을 포함한다.

여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "가용성"은 수용액에서 부분적으로 또는 완전히 용해된 것을 의미한다.

또한, 여기에서 사용된 용어 "면역원성"은 면역원성 제제에 대하여 지시된 항체, T-세포 및 기타 반응성 면역 세포의 생성을 유도하거나 또는 증진시키고 인간 또는 동물에서 면역 반응에 기여하는 물질을 의미한다.

면역 반응은 개체가 치료될 장애를 완화하거나 경감하기 위해 본 발명의 투여된 면역원성 조성물에 대하여 충분한 항체, T세포 및 다른 반응성 면역 세포를 생성할 때 일어난다.

여기에서 사용된 용어 "캐리어"는 항원 펩티드 또는 초분자 구조체가 혼합될 수 있거나 또는 결합될 수 있으며, 그 때문에 항원 펩티드 또는 펩티드의 일부가 인간 또는 동물의 면역계에 제시 또는 노출하는 구조를 의미한다. 용어 "캐리어"는 항원 펩티드를 포함하는 초분자 항원 구조체 조성물이 전달 메커니즘에 의해 원하는 부위로 운송될 수 있는 전달 방법을 더 포함한다. 이러한 전달계의 한 예는 콜로이드 금과 같은 콜로이드 금속을 이용한다.

이밖에, 용어 "캐리어"는 제한되는 것은 아니지만, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 및 다른 항원보강제를 포함하는 당업자에게 알려진 전달 메커니즘을 더 포함한다. 또한, 본 발명의 초분자 항원 구조체 조성물은 항원보강제, 방부제, 희석제, 유화제, 안정화제, 및 당해 기술의 백신에서 공지되고 사용된 다른 성분을 더 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 항원보강제계가 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 항원보강제는 제한되는 것은 아니지만, 프로인드(Freund's) 불완전 항원보강제, 프로인드 완전 항원보강제, 다분산된 β-(1,4) 연결된 아세틸화된 만난("Acemannan"), TITERMAX

(CytRx 사 제조의 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 항원보강제), 키론 사 제조의 변성된 지질 항원보강제, 캠브리지 바이오테크 제조의 사포닌 유도 항원보강제, 치사 보르데텔라 페르투스시스(killed Bordetella pertussis), 그람 음성균의 리포폴리사카라이드(LPS), 덱스트란 술페이트와 같은 거대 고분자 음이온, 및 백반(alum), 수산화알루미늄, 또는 인산알루미늄과 같은 무기 겔을 포함한다.

본 발명의 초분자 항원 구조체 조성물에 사용될 수 있는 캐리어 단백질은 제한 되는 것은 아니지만, 말토스 결합 단백질 "MBP"; 소 혈청 알부민 "BSA"; 키호울 림펫 헤모시아닌 "KLH"; 난백알부민; 플라젤린; 갑상선글로불린; 모든 종의 혈청 알부민; 모든 종의 감마 글로불린; 동계 세포(syngeneic cells); Ia 항원을 함유 하는 동계 세포; 및 D- 및/또는 L-아미노산의 중합체를 포함한다.

또한, 용어 "유효량"은 인간 또는 동물에게 투여되었을 때 면역 반응을 이끌어 내는 항원/면역원성 조성물의 양을 의미한다. 유효량은 하기 관례적인 절차에 따라 당업자에 의해 용이하게 측정된다.

예를 들어, 초분자 항원 구조체 조성물은 환자당 약 1.0㎍ 내지 10.0mg의 범위 내에서 비경구 또는 경구 투여될 수 있으며, 이 범위로 제한하려는 것은 아니다. 면역 반응을 이끌어 내기 위해 요구되는 조성물의 실제 양은 투여된 조성물의 면역원성 및 개체의 면역 반응에 따라 각각의 개별 환자에 대해 변할 것이다. 결과적으로, 개체에 투여된 특정 양은 관례적인 실험에 의해 및 당업자의 훈련 및 경험을 근거로 하여 결정될 것이다.

본 발명의 조성물은 항원 펩티드에 대해 유도된 항체를 생성하기 위해 사용된다. 수득한 항체는 제한하는 것은 아니지만, 알츠하이머 질환, 다중 약물 내성암, 또는 프리온 병을 포함하는 다양한 질환 또는 장애에 대하여 이들을 잠복성으로(passively) 면역화하기 위해 개체에 투여된다.

본 발명의 면역원성 조성물은 정제 또는 부분적으로 정제되거나 또는 변성된 항원 펩티드의 존재에서 재구성 리포솜에 의해 만들어진 리포솜을 포함할 수 있다. 추가로, 펩티드 단편은 리포솜으로 재구성될 수 있다. 본 발명은 또한 이들의 항원성을 증진시키기 위해 변성된 항원 펩티드 단편을 포함한다. 예를 들어, 항원 모이어티 및 항원보강제는 펩티드에 결합되거나 혼합될 수 있다. 항원 모이어티 및 항원보강제의 예는, 제한하려는 것은 아니지만, 친유성 무라밀 디펩티드 유도체, 비이온성 블록 중합체, 수산화알루미늄 또는 인산 알루미늄 항원보강제, 및 그의 혼합물을 포함한다.

본 발명은 캐리어의 소수성 지질 이중 층으로의 삽입을 촉진하는 팔미트산과 같은 소수성 부분으로 변성된 항원 펩티드를 더 포함한다. 본 발명의 소수성 모이어티는 지방산 탄소 주쇄가 10 이상의 탄소 원자를 갖는 지방산, 트리글리세리드 및 인지질일 수 있다. 가장 바람직한 것은 대략 14 이상의 탄소 원자 및 대략 24 이하의 탄소 원자의 탄소 골격이 있는 지방산을 갖는 친유성 모이어티이다. 가장 바람직한 소수성 모이어티는 14 이상의 탄소 원자의 골격을 갖는다. 소수성 모이어티의 예로는 제한하려는 것은 아니지만, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산을 포함한다. 가장 바람직한 소수성 모이어티는 팔미트산이다.

본 발명의 초분자 항원 구조체 조성물은 감염성 유기체와 같은 항원체(antigenic agents)에 면역을 유발하는 인간 또는 동물에 투여된다. 면역화된 인간 또는 동물은 감염성 유기체에 대하여 순환하는 항체를 발달시키며, 그 때문에 질환을 자극하는 그의 능력을 감소 또는 불활성화한다.

본 발명의 초분자 항원 구조체 조성물은 예를 들어 알츠하이머 질환을 비롯한 다양한 질환에 대하여 특이적인 단일 클론 또는 다클론 항체의 패널을 생성하기 위해 또한 사용된다. 항체는 통상의 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 만들어진다.

본 발명의 조성물은 적당한 수단, 바람직하게는 주입에 의해 인간 또는 동물에 투여된다. 예를 들어, 리포솜 내의 변성된 항원 펩티드는 피하 주입에 의해 투여된다. 내부적으로 생성되거나 또는 외부 원으로부터 제공되는가에 상관없이 순환하는 항체는 항원에 결합하고 질환을 자극하는 그의 능력을 감소 또는 불활성화 한다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 리포솜은 당업자에게 공지된 것을 포함한다. 리포솜을 만들기 위해 유용한 표준 지질이 사용될 수 있다. 표준 이중층 및 다층 리포솜은 본 발명의 조성물을 만들기 위해 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 리포솜의 제조 방법이 사용될 수 있지만, 가장 바람직한 리포솜은 참고로 여기에서 혼입된 문헌『Alving et al., Infect . Immun. 60:2438-2444, 1992』의 방법에 따라 제조된다. 리포솜은 임의로 항원보강제를 함유할 수 있다. 바람직한 항원보강제는 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A와 같은 독성이 제거된(detoxified) 지질A 이다.

소포(vesicles)가 리포솜일 때, 항원 펩티드는 일반적으로 형성됨에 따라 리포솜 막으로 삽입하는 소수성 말단을 갖는다. 추가적으로, 항원 펩티드는 리포솜에 삽입될 수 있도록 소수성 말단을 함유할 수 있게 변성될 수 있다. 예를 들어, 항원 펩티드는 화학 결합 또는 전기삽입(electroinsertion)에 의해 미리 형성된 리포솜의 표면상에 노출될 수 있다.

여기에서 제공된 항체는 알츠하이머 질환, 다중 약품 내성 암 및 프리온 병과 같은 대표적인 다양한 질환의 감염성 유기체 또는 항원 펩티드에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 또는 다클론 항체이다.

단일클론 항체는 마우스 또는 토끼와 같은 동물을 본 발명의 초분자 항원 구조체 조성물로 면역화하여 제작된다. 비장 세포는 마우스 SP2/O 골수종 세포(ATCC, 만나사스(Manassas), VA)와 같은 골수종 세포주를 갖는 감작된 비장 세포의 융합에 의하여 발생된 면역화된 동물 및 하이브리도마로부터 얻어진다. 세포는 폴리에틸렌 글리콜의 첨가에 의해 융합을 유도한다. 하이브리도마는 하이폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT)을 함유하는 선택 배지 내에서 세포를 평판 배양하여 화학적으로 선택된다.

하이브리도마는 후속하여 특정 질환 또는 장애에 대한 단일클론 항체를 생성하는 능력에 대하여 스크린된다. 관심있는 항체를 생성하는 하이브리도마는 나중의 생산을 위해 클론화, 증량 및 동결 저장된다. 바람직한 하이브리도마는 IgG 이성질체 형태(isotype), 더 바람직하게는 IgG1 이성질체 형태를 갖는 단일클론 항체를 생성한다.

다클론 항체는 상술한 본 발명의 초분자 항원 구조체 조성물로 마우스 또는 토끼와 같은 동물을 면역화함으로써 제조된다. 혈액 혈청은 후속하여 동물로부터 수집되며, 혈청 중의 항체는 표적제(target agent)에 대한 결합 반응성을 위해 스크린된다.

단클론 항체 또는 다클론 항체 또는 양자는 하기 기술된 바와 같은 생물 분자 내에서 표적제를 식별하기 위해 검출 가능한 수준으로 직접 표식될 수 있다. 면역측정에서 사용하기 위한 표식(label)은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며 효모, 방사성 동위 원소 및 형광, 발광, 및 콜로이드 금 및 라텍스 비드와 같은 착색 입자를 포함하는 색소 기질을 포함한다. 항체는 또한 면역 측정법에서 반응하지 않는 성분으로부터 항체-항원 착물의 분리를 용이하게 하는 고체상에 결합할 수 있다. 대표적인 고체상 물질은 제한되는 것은 아니지만, 마이크로타이터 플레이트, 시험관, 자기, 플라스틱 또는 유리 비드 및 슬라이드를 포함한다. 고체상에 항체를 결합하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

선택적으로, 항체는 면역글로블린, 예컨대 단백질 A 또는 G 또는 제2 항체에 대하여 친화도를 갖는 표식된 물질과 반응하여 간접적으로 표식될 수 있다. 항체는 제2 물질과 콘쥬게이트될 수 있으며 항체에 콘쥬게이트된 제2 물질에 대하여 친화도를 갖는 표식된 제3 물질과 함께 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 콘쥬게이트될 수 있으며 항체-비오틴 콘쥬게이트는 표식된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 사용하여 검출된다. 유사하게, 항체는 합텐에 콘쥬게이트될 수 있으며 항체-합텐 콘쥬게이트는 표식된 항-합텐 항체를 사용하여 검출된다. 항체를 표식하는 이들 및 다른 방법 및 콘쥬게이트 시험은 당업자에게 공지되어 있다.

바람직한 실시 형태에서, 항체는 검출가능한 표식(label)으로 표식된 제2 항체와의 반응성에 의해 간접적으로 표식된다. 제2항체는 바람직하게는 단일클론 항체가 유도된 동물의 항체에 결합한 것이다. 다시 말해, 단일클론 항체가 마우스 항체라면, 표식된 제2 항체는 항-마우스 항체이다. 하기 기술된 시험에서 사용될 단일클론 항체에 대하여, 이러한 표식은 바람직하게는 항체-피복된 비드, 특히, 자기 비드이다. 여기에서 기술된 면역측정법에서 사용된 다클론 항체에 대하여, 표식은 바람직하게는 방사성, 형광 또는 전기적화학발광 물질과 같은 검출 가능한 분자이다.

제제

면역원성 단백질 또는 펩티드 모두 또는 활성 부분을 함유하는, 자연 발생 또는 합성 단백질, 펩티드, 또는 단백질 단편은 생리학적으로 허용 가능한 제제, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 캐리어에서 공지 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질, 펩티드 또는 단백질 단편은 약학적으로 허용가능한 부형제와 결합하여 치료 조성물을 형성한다.

선택적으로, 면역원성 펩티드 모두 또는 활성 부분을 함유하는, 단백질, 펩티드, 또는 단백질 단편에 대한 유전자는 유전자 치료 기술을 사용하여 연속적으로 투여하기 위해 벡터 내에서 전달될 수 있다. 벡터는 종양과 같은 표적 부위에 대하여 특이성을 갖는 비히클로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 고체, 액체 또는 에어로솔의 형태로 투여될 수 있다. 고체 조성물의 예로는 환제, 크림, 및 이식성(implantable) 투약 단위를 포함한다. 환제는 경구로 투여될 수 있다. 치료 크림은 국소적으로 투여될 수 있다. 이식성 투약 단위는 국부적으로, 예컨대, 종양 부위로 투여될 수 있으며, 또는 치료 조성물의 조직적인 방출을 위해, 예컨대, 피하적으로 이식될 수 있다. 액체 조성물의 예는 근육내, 피하, 정맥 내, 동맥 내의 주입에 적당한 제제, 및 국소 및 안내(intraocular) 투여를 위한 제제를 포함한다. 에어로솔 제제의 예는 폐에 투여하기 위한 흡입 제제를 포함한다.

조성물은 표준 방식의 투여에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로 조성물은 국소, 경구, 직장, 비내(nasal), 또는 비경구(예컨대, 정맥, 피하, 또는 근육 내) 방식으로 투여될 수 있다. 이밖에, 조성물은 생분해성 중합체와 같은 서방성 매트릭스로 혼입될 수 있으며, 중합체는 전달이 요구되는 부근, 예컨대 종양 부위에 이식된다. 그 방법은 단일 투여의 투여, 소정 시간 간격에서 반복된 투여량의 투여, 및 소정 기간 동안 지속적인 투여를 포함한다.

여기에서 사용된 바와 같은 서방성 매트릭스는 효소 또는 산/염기 가수분해에 의해 또는 산/염기 가수분해에 의해 또는 용해에 의해 분해성인 물질, 일반적으로 중합체로 만들어진 매트릭스이다. 체내로 삽입되면, 매트릭스는 효소 및 체액에 의해 활동한다. 서방성 매트릭스는 바람직하게는 생체친화성 물질 예컨대 리보솜, 폴리락티드(폴리락티드산), 폴리글리콜라이드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜라이드(락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 술페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오타이드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘에 의해 선택된다. 바람직한 생분해성 매트릭스는 폴리락티드, 폴리글리콜라이드, 또는 폴리락티드 코-글리콜라이드(락트산 및 글리콜산의 공중합체)중의 하나의 매트릭스이다.

조성물의 투여량은 치료될 상태, 사용된 특정 조성물, 및 기타 임상학적 요인 예컨대 환자의 체중 및 상태, 및 투여 방식에 의존할 것이다.

조성물은 질환의 치료를 위한 절차 및 기타 조성물과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 불필요한 세포 증식은 조성물의 투여와 병행하여 외과, 방사 또는 화학요법을 사용하여 통상적으로 처리될 수 있으며, 조성물의 추가적인 투여량은 잔존하는 불필요한 세포 증식의 성장을 저해하고 안정화하기 위해 환자에게 후속적으로 투여될 수 있다.

초분자 항원 구조체

본 발명의 초분자 항원 구조체는 일반적으로 항원 효과가 증진되도록 변성된 펩티드를 포함하며, 이러한 펩티드는 페길화(폴리에틸렌 글리콜 또는 변성된 폴리에틸렌 글리콜 사용)를 통해 변성되거나, 또는 다른 방법 예컨대 팔미트산, 폴리-아미노산(예를 들어 폴리-글리신, 폴리-히스티딘), 폴리-사카라이드(예컨대 폴리갈락투론산, 폴리락트산, 폴리글리콜라이드, 키틴, 키토산), 합성 중합체 (폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에스테르) 또는 공중합체(예컨대, 폴리(메타크릴산) 및 N-(2-히드록시)프로필 메타크릴아미드) 등을 통해 변성된다.

특정 실시 형태에서, 본 발명의 초분자 항원 구조체는 각각의 말단에서 1개씩 페길화된 리신에 공유적으로 부착된 펩티드 서열을 포함한다. PEG(폴리에틸렌글리콜)사슬의 길이는 8 내지 150000으로 다양하다. 유리 PEG 말단은 포스파티딜에탄올아민의 분자에 공유적으로 부착된다(여기에서 지방산은 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산 등, 또는 그의 조합일 수 있다). 이러한 초분자 구조체는 인지질 및 콜레스테롤로 구성된 리포솜에서 재구성될 수 있다(다양한 몰비의 포스파티딜에탄올 아민, 포스파티딜 글리세롤, 콜레스테롤). 다른 인지질이 사용될 수 있다. 지질 A는 대략 40㎍/pmole의 인지질의 농도로 사용된다.

특정 실시 형태에서, 초분자 항원 구조체는 f3-아밀로이드의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 펩티드는 또한 전체의 아밀로이드 베타 펩티드 및 그의 활성 단편을 포함하거나 이에 상응할 수 있다. 추가로, 본 발명에서 유용한 펩티드는 Aβ_4-11(서열 번호: 2), Aβ_22-35(서열 번호: 3), 및 Aβ_29-40(서열 번호: 4) 및 Aβ_1-16(서열 번호: 5); 및 그의 활성 단편을 더 포함한다.

다른 특정 실시 형태에서, 초분자 1 항원 구조체는 P170 글리코단백질의 세포외 루프 1, 4 및 6을 포함하는 펩티드 서열을 포함한다. 특정의 다른 실시 형태에서, 초분자 1 항원 구조체는 프리온 단백질의 아미노산 서열 109-129를 포함하는 펩티드 서열을 포함한다.

본 발명은 리포솜에서 재구성된 초분자 구조에 대하여 상승된 단일클론 항체를 더 포함하며, 여기에서, 예를 들어, 펩티드 서열은 아밀로이드 단백질로부터 아미노산 서열을 포함한다. 추가적으로, 단일클론 항체는 펩티드 서열이 P-글리코단백질(P₁₇₀)로부터의 여러 아미노산 서열인 초분자 구조에 대하여 상승된다. 세포외 루프도 또한 본 발명에 포함된다.

펩티드 서열이 관심의 단백질로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 초분자 구조에 대하여 상승된 단일클론 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 더 구체적으로, 예를 들어, 본 발명은 펩티드 서열이 인간 알츠하이머 질환에 대해 트랜스제닉 마우스에서 뇌 출혈을 유발하지 않는 13-아밀로이드 단백질(4-10, 또는 1-8, 또는 8-16, 등)에서 선택된 아미노산 서열인 리포솜에서 재구성된 초분자 구조에 대하여 상승된 단일클론 항체를 포함한다. 본 발명은 항원 펩티드의 입체형태 특성에 대해 민감한 단일클론 항체를 더 포함한다. 본 발명의 항체의 제조를 위한 구체적인 프로토콜 및 이러한 항체의 특징 부여에 대한 구체적인 정보가 하기 실시예에서 제공된다.

아밀로이드

β-아밀로이드의 7 아미노산 서열: FRHDSGY(서열 번호:1)을 합성하였다. 한 리신은 서열(1)의 각각의 말단에 공유적으로 부착되었다. 상기 서열에 결합하기 전에 리신은 폴리에틸렌글리콜(PEG, n=8-2000)의 사슬과 반응되었다. 한 말단에서 리신에 결합된 폴리에틸렌글리콜 사슬은 기술된 바와 같이 디올레일-포스파티딜 콜린 에탄올아민(또는 지방산-포스파티딜콜린)의 분자에 공유적으로 부착되었다(2).

화학적으로 변성된 β-아밀로이드 항원

화학적으로 변성된 항원은 그후 인지질 및 콜레스테롤로 구성된 리포솜에서 재구성된다(3). 적당한 리포솜의 예는, 제한되는 것은 아니지만, DOPG, DOPEA, Cho1을 포함한다(지질 A는 40㎍/μmole 인지질의 농도이었다). 화학적으로 변성된 아밀로이드-항원과 재구성된 리포솜을 나타내는 대표적인 도식은 도2에 나타낸다.

본 발명의 초분자 항원 구조체는 리포솜에서 재구성된 팔미토일화 항원보다 매우 유리하다. 우선, 긴 PEG 사슬(n=8-5000)은 펩티드 서열의 노출 및 근접성을 상당히 향상한다. 항원 제시는 개선되며 유도된 항체의 입체 형태 민감성이 강화된다. 본 발명의 또 다른 장점은 다른 입체 형태의 펩티드 서열이 사용될 수 있다는 것이다. 서열 및 리포솜의 표면 간의 증진된 거리는 표면이 서열과 상호작용하지 않도록 확실히 하며, 따라서, 아마도 그의 입체 형태에 영향을 준다. 또한, 구조체의 항원성은 리포솜에서 재구성된 팔미토일화된 서열보다 상당이 더 높아진다. 1:5000 내지 1:10000을 포함하는 항체의 높은 타이터(titer)는 수주 내에 마우스에서 수득된다. 추가로, 항원에 대한 항체의 친화도는 상당히 증가된다. 아밀로이드 서열 FRHDSGY(서열 번호: 1)의 경우, 구조체의 ip 또는 iv 주입에 의해 유도된 항체는 Aβ_1-40 및 Aβ_1-42 섬유를 유효하게 용해화하고, Aβ_1-42 및 Aβ_1-40 섬유에 의해 유도된 아포토시스 및 대사 저해(MTT 환원)에 대해 PC12 세포를 시험관내에서 보호한다.

본 발명의 한 실시 형태에서, 아밀로이드 단백질의 FRHDSGY(서열 번호: 1)서열이 사용되지만, 임의의 다른 아밀로이드 단백질 서열이 치환될 수 있다. 다클론 항체에 대하여 상술한 시험관내 성질 이외에, 상술한 구조체로 면역화된 마우스로부터 수득된 단일클론 항체는 인간 알츠하이머 질환에 대한 APP[V717I] FVB 트랜스제닉 마우스에서의 생물학적 활성을 나타낸다. 이들 마우스에서 기억 회복 및 호기심 각성의 유의한 수준이 관측된다. mAb는 면역화된 형질변환 마우스의 뇌에서의 출혈을 유도하지 않는다.

하기 이론에 의해 속박됨이 없이, 주로 섬유 용해화 및 CD 스펙트럼의 항-아밀로이드 mAb(본 발명의 방법에 의해 발생된 1-16 서열에 대해)의 상호작용의 시험관 내 연구를 근거로, 항체는 그의 α-나선형 입체 형태로 β-아밀로이드에 우선적으로 결합하는 것으로 나타난다. 이것은 열역학 용어로 아밀로이드 섬유 용해화 효과를 설명한다. α-나선형에 우선적으로 결합함으로써 항체가 하기 평형식으로부터 α-나선형 아밀로이드를 제거하기 때문에 β-아밀로이드의 양은 증가하고, β-시이트 입체 형태는 평형을 복구하기 위해 가용성 α-나선형 형태로 입체형태 전이가 수행된다:

Aβ(α-나선형)↔Aβ(β-시이트)

화학량론적 관측은 입체 형태 평형에 직접적으로 영향을 주는 mAbs의 사상을 지지한다.

셀코에(Selkoe)(2002)는 시냅스 결핍으로써 나타나는 알츠하이머 질환을 상세히 설명하였다. 질환의 초기 단계에서, 기억 상실은 이러한 부전에서 발생할 수 있다. 예를 들어 가용성 올리고머 Aβ_1-40가 시냅스를 차단할 수 있는 것으로 여겨졌다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 단일클론 항체는 가용성 올리고머 Aβ_1-40에 결합한다. 항체의 존재 및 부재하에 시냅스의 전도성의 측정은 가용성 올리고머의 존재하에, 시냅스 상의 항체의 작용을 결정하도록 허용한다.

본 발명의 발명자는 초분자 구조체에 포함된 Aβ_4-11(서열 번호: 2), Aβ_22-35(서열 번호: 3), 및 Aβ_29-40(서열 번호: 4)와 같은 에피토프로 수득된 다수의 mAbs 의 활성을 체크 하였다(도5 참조). 서열 4-11은 팔미토일화된 Aβ 1-16 항원(서열 번호: 5)에 의해 유도된 mAb에 대한 에피토프인 것으로 측정되었다.

본 발명의 방법에 따라, 신규의 독특하게 변성된 펩티드 항원이 mAbs를 상승시키기 위해 사용되었다:

잔기 22-35: EDVGSNKGAIIGLM(서열 번호: 3)

세포외 및 막관통(TM) 부위 사이의 접합은 저해 항체(예컨대 헤르셉틴-트라스트즈맵 anti-HER2/neu 항체)에 의해 표적화 되는 것으로 발견되었으며, 멀티스패닝(multispanning) TM 단백질에서, 작은 분자량 저해제에 의해 표적화된 포켓을 형성하는 것으로 알려졌다(Dragic 등, 2000). 하기 이론에 의해 속박됨이 없이, 이러한 서열은 극성 및 소수성 영역 사이의 전이를 나타내기 때문에 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40의 올리고머화 능력에 대하여 중요할 것처럼 보인다 (여기에서, 구 "세포외 서열"은 Aβ_1-42 아밀로이드형성(amyloidogenic) 서열에서 세포외 서열을 의미하는 것으로 사용된다). 서열은 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40서열의 첫 번째 두 GXXXGXXXG 모티프를 함유한다. GXXXG는 소수성 서열의 올리고머화의 중요한 유도인자(inducers)이다(Russ and Engelmann, 2000). 흥미있게 첫 번째 GXXXG 모티프는 세포외에 있는 것으로 예상되며, 반면 다음의 두 모티프는 막 내에 위치하는 것으로 예상된다. 하기의 이론에 의해 속박됨이 없이, 유사하게 Aβ펩티드의 올리고머화는 GXXXG 모티프에 의해 특이적으로 유발되는 것으로 가정될 수 있다.

잔기 29-40: GAIIGLMVGGVV(서열 번호: 4)

Aβ_1-42 및 Aβ_1-40의 소수성 서열은 모티프 GXXXGXXXGG를 함유하며, 이것은 소수성 서열의 강한 올리고머화를 유도하는 것으로 알려졌다(Eilers 등, 2002; Leeds 등, 2001; Lemmon 등, 1994; Russ and Engelmann, 1999; Russ and Engelmann, 2000; Smith and Bormann, 1995). 이 모티프는 치료적 접근을 위한 중요한 표적으로써 판단된다; 그 이유는 이것이 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40형성, 올리고머화 및 축적을 유도하는 모든 발병 과정에 중요한 역할을 하여야 하기 때문이다. APP의 완전한 서열(intact sequence)에서, 이러한 모티프는 SREBP 분할에 대해 나타난 바와 같이 진행하기 위해 γ-세크리타제에 대하여 펼쳐질(unfold) 필요가 있을 것인 하류 서열에 붙을 가능성이 높다(Ye 등, 2000). 아밀로이드 올리고머화를 위해 중요한 것과 같이 이 서열은 이전에 아무도 확인하지 못하였다. 여기에서 교시된 바와 같이, 본 발명의 초분자 변성(바람직하게는 페길화됨) 항원은 높은 항원성을 가지며 그들에 의해 유도된 항체는 높은 친화도를 갖는다. Aβ_1-16 이외에, 본 발명의 초분자 구조체는 또한 백신에 사용하기 위한 Aβ_4-11(서열 번호: 2), Aβ_22-35(서열 번호: 3), 및 Aβ_29-40(서열 번호: 4)에 의해 표시된 펩티드를 포함한다.

N-α-위치에서 펩티드의 모노-페길화를 위한 방법론은 공지되어 있으며 광범위하게 사용된다. 배지 크기 펩티드의 내부, N- 또는 C- 말단 아미노산 잔기에서 부위 특이적 모노-페길화는 또한 하기 고체상 또는 펩티드 그라프트 접근을 기술한다. 그러나, 디-페길화 펩티드에 대한 고체상 합성 접근은 입체 장애에 의해 심하게 방해를 받는 것으로 나타났으며, 이 계획이 시작하자마자, 효율적인 합성 방법론이 이러한 화합물을 위해 전혀 보고되어 있지 않다. 더욱이, PEG 및 지질 모이어티 양자로 N- 및 C- 말단에서 부위 특이적으로 유도체화된 펩티드는 이전에 보고되어 있지 않다. 여기에서 본 발명자들은 이러한 Aβ 펩티드 콘쥬게이트의 합성을 위한 신규 방법론을 기술한다.

본 발명의 도달에서, 몇몇 접근이 시도되었으며, 이들 대부분은 실패하였다. 예를 들어, 합성의 초기 접근은 말단 글루탐산 잔기를 함유하는 측쇄 보호된 펩티드(Aβ_4-11,_1-16,_22-35 및 _29-40)에 말단 아민기를 함유하는 지질-PEG 콘쥬게이트의 수지 그라프팅에 중점을 두었다. 결합 생성물은 광범위하고 다양한 반응 조건하에서 관측되지 않았다. 실시예 2 에서 기술되고 도5에서 나타낸 바와 같이, 여기에서 기술된 초분자 구조체는 일반적으로 Fmoc/tBu 아미노산 측쇄 보호를 사용하여 합성되었다.

보호된 펩티드를 사용한 N- 및 C- 말단 지질-PEG β-아밀로이드 항원의 합성에 대한 새로운 접근은 예를 들어 다중 약물 내성 단백질 P-글리코단백질을 포함하는 광범위하고 다양한 펩티드 서열에 대하여 적용가능하다.

여기에서 기술된 항원 펩티드의 효능을 평가하기 위한 일환으로, 실험은 ELISA 및 분배 시험(disaggregation assays)을 사용한 PEG화 및 팔미토일화 항원의 면역원성을 비교하여 수행되었다(실시예 B 및 도7 참조). ELISA 자료는 리포솜 PEG-Aβ_1-16 이 팔미토일화된 Aβ_1-16 보다 유의하게 더 면역원성임을 나타낸다. 추가의 ALUM은 마우스에서의 PEG-Aβ_1- ₁₆ 의 면역원성을 향상시키지 못했다. PEG-Aβ_4-11 에 의해 유도된 항체 반응은 PEG-Aβ_1-16 에 비교시 더 느렸다.

그러므로 요약에서, 본 발명은 다른 아밀로이드 서열을 노출하는 초분자 항원에 대한 신규 단일클론 항체를 제공한다. 특히, 원래의 합성 경로는 선택된 아밀로이드 서열에 두 폴리에틸렌 글리콜(n=70) 사슬을 공유적으로 부착하기 위해 고안되었다. PEG 사슬의 유리 말단에서, 포스파티딜 에탄올 아민은 공유적으로 부착되었다. 하기 이론에 의해 속박됨이 없이, 그의 기능은 리포솜의 이중 층에서 페길화된 아밀로이드 서열을 고정하는 것으로 여겨진다. 페길화는 팔미토일화에서 비교된 바와 같은 항원의 면역원성을 증가시키는 것으로 여기에서 보여진다. 이들 단일 클론 항체에 의해 친화도 연구, 에피토프 결정, 입체 형태 전이의 유도는 현재 우리 실험실에서 수행되고 있다. 독특한 본 발명의 변성 방법은 다양한 펩티드에 적용될 수 있으며 궁극적으로 제한되는 것은 아니지만 알츠하이머 질환, 암, 및 감염성 질환을 포함하는 질환 및 장애를 위한 치료적 제제 및 백신에 사용될 수 있다.

여기에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 초분자 항원 구조체는 항원 효과가 증진되도록 변성된 펩티드를 포함하며, 이러한 펩티드는 페길화(폴리에틸렌 글리콜 또는 변성된 폴리에틸렌 글리콜 사용)를 통해 변성되거나 또는 다른 방법을 통해 예컨대 팔미트산, 폴리-아미노산(예를 들어 폴리글리신, 폴리히스티딘), 폴리-사카라이드(예컨대 폴리갈락투론산, 폴리락트산, 폴리글리콜라이드, 키틴, 키토산), 합성 중합체 (폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에스테르) 또는 공중합체(폴리(메타크릴산) 및 N-(2-히드록시)프로필 메타크릴아미드)등에 의해 변성된다. 알츠하이머 질환과 같은 신경계 장애에서 치료적 개입을 위해, 본 발명은 아밀로이드 베타 펩티드의 변성을 포함한다.

암세포에서의 다중 약물 내성 1(MDR 1)

암 세포 내에서 다중약물 내성 1은 암 세포로부터 많은 종류의 관련되지 않은 화학요법제를 배출하는 막 펌프, P-글리코단백질(P₁₇₀)의 과발현에 의해 야기된다.

리포솜에서 재구성된 P₁₇₀의 팔미토일화된 세포외 서열을 사용한 면역화는 시험관내 MDR1 L₁₂₁₀ 마우스 백혈병 세포에서 민감성 페노타입의 복원을 초래 하였다(3). 추가의 결과는 생체 내에서 (Madoulet, Tosi, Nicolau 등, 2002-비공고된 결과) MDR 암 세포로 접종된 화학요법을 수행하는 중의 면역화된 마우스의 생존 반감기의 70%가 증가한다는 것을 알아내었다.

본 발명의 발명자들은 여기에서 본 발명의 방법에 따라 구성된 P₁₇₀ 세포외 서열 1, 4 및 6으로 구성된 항원이 시험관 내 및 생체내의 민감성 페노타입으로 MDR 페노타입을 많이 복귀시키는 항체를 훨씬 더 효율적으로 이끌어 낸다는 것을 설명한다.

본 발명의 방법에 따라, P₁₇₀ 세포외 루프 1, 4 및 6에 상응하는 펩티드가 합성되고 그후 각 말단에서 1개씩 페길화된 리신에 결합되고 이것은 이번에는 각 말단에서 한개의 디올레일 포스파틸에탄올아민 분자에 공유적으로 부착되었다. 지방산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 또는 폴리불포화 지방산을 사용할 수 있다.

이들 3 구조체는 PC-PEA-PG-콜레스테롤(또는 임의의 다른 인지질 및 콜레스테롤의 조합)로 구성된 리포솜 내에서 재구성되었다. 지질 A는 40㎍/μmol의 인지질의 농도로 첨가되었다. 펩티드:인지질 비는 1:200(다른 비가 사용될 수 있다)이었다.

폴리에틸렌글리콜 사슬의 길이는 변한다:펩티드 서열이 길수록, 필요로 하는 사슬 내의 PEG 분자의 수는 증가한다. 사용된 3 서열에 대해, PEG 사슬 길이는 10 내지 5000으로 변한다. 다른 사슬 길이가 사용될 수 있다. 도3은 다중 P₁₇₀ 항원을 나타내는 대표적인 도식을 제공한다.

이 항원의 IP 접종에 이어, 2주 간격의 3회 부스팅(boostings)은 시험관 내 및 생체 내 P₁₇₀의 펌핑 활성(pumping activity)의 차단을 할 수 있는 높은 타이터의 항 P₁₇₀ 항체(1:5000-1:10000)를 이끌어낸다.

프리온 병

프리온은 양의 스크래피(scrapie), 가축의 소 해면 상뇌증 및 인간의 크로이츠펠트 야콥병과 같은 신경 질환을 야기한다. 입자의 유일하게 알려진 성분은 단백질 PrP^Sc의 스크래피 이소형태(scrapie isoform)이다. 프리온이 증식되지만, 이들이 핵산을 포함한다는 증거는 없다. PrP^Sc는 비감염성, 세포 단백질 PrP^c로부터 PrP^c가 심원한 입체형태 변화를 진행하는 동안 번역 후 공정(posttranslational process)에 의해 유도된다.

스크래피 단백질 PrP^Sc은 뉴런 변성(neuronal degeneration)에 중요한 역할을 가지며 질환 전개 동안 하기와 같은 3단계 전이가 진행된다:(단백질의 정상 세포 이소형태) PrP^c-감염 형태(단백질의 스크래피 이소형태)PrP^Sc - 단백질 PrP27-30. 이러한 사건의 일련의 단계적인 반응은 크로이츠펠트 야콥병(CJD), 쿠루병, 게르스트만-스트로이슬러-샤인케르 증후군(GSS), 인간의 치명적 가족성 불면증, 양 및 염소의 스크래피, 밍크의 뇌증(encephalopathy) 및 가축의 소 해면 상뇌증의 전개동안 일어난다.

세포 비-독성 단백질(PrP^c)은 뉴런에서 주로 발현되는 MW 33-35K의 시알로글리코단백질이다. 상술한 질환에서, PrP^c는 변경된 형태(PrP^Sc)로 전환되며, 이것은 프로테아제 소화에 대한 그의 상대적인 내성에 의해 그의 정상 상동성과 구분될 수 있다. PrP^Sc는 감염된 동물 및 개체의 중추 신경계에서 축적하며 그의 프로테아제 내성 코아는 세포 밖에서 응집한다. 발병의 분자 기준은 아직 밝혀지지 않았다.

단백질 단편의 신경 독성에 대하여 매우 흥미있는 관측이 있으며, 이것은 관련된 뇌증에서 일어나는 신경 세포 변성의 메커니즘을 이해할 수 있도록 하는 결실을 가질 수 있다.

그 관측을 근거로, 알츠하이머 질환에서의 플라크 및 아밀로이드 원섬유의 세포외 침착(deposition)을 담당하는 J-아밀로이드 단편은 신경독성이며, 관련된 뇌증에서 뉴런 치사는 PrP^Sc 및/또는 분해 생성물의 비정상적인 세포외 축적의 독성 효과에 기인하는 것이다라고 가정되었다.

PrP^c의 다른 단편에 대하여 상동성인 합성 펩티드는 제1 래트 해마 뉴런의 생존 능력에 대한 이들의 영향을 조사하기 위해 사용된다(도 4).

본 발명자들은 뉴런 치사가 제1 단계 래트 해마 배양액의 만성 노출로부터 농도 의존 방식으로 인간 PrP^c cDNA로부터 유래된 아미노산 서열의 잔기 106-126 에 상응하는 마이크로몰 농도의 펩티드에서 일어나는 것을 설명하였다(실시예 1).

실시예 1 에서 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 투여량 의존 방식으로 아포토시스에 의해 발생된 PrP 106-126에 의해 신경 치사가 유도된다는 것을 나타낸다. 스크래피와 같은 아급성 뇌증의 말기 단계에서, PrP^Sc는 PrP^c 보다 10 내지 20 배 더 높은 전체 뇌 농도에 도달되며, 이것은 PrP106-126의 2 농도에 대하여 표1에 명시된 자료와 현저히 유사하다.

PrP106-126에 의해 유도된 프로그램 세포 치사의 방법은 그중에서도 테스토스테론 억제 전립선 메시지-2 유전자(TRPM-2)를 유도하는 것과 연관된다. 관련된 뇌증 동안 생체 내에서 아포토시스가 활성이 되는지의 여부는 알려져 있지 않지만 TRPM-2 mRNA의 발현은 스크래피 감염 햄스터에서 10배 증가 된다.

이들 자료로부터, 신경독성 메커니즘은 관련된 뇌증에서 뉴런 세포 손실에 가능한 책임이 있을 수 있으며 알츠하이머 질환에서도 관련이 있을 수 있다.

이러한 신경독성의 가능한 메커니즘은 지질 이중 층과 펩티드 또는 단백질의 상호작용에 대하여 이온 채널 형성을 탐지 및 분석하는 것을 목적으로 하는 모델계에서 조사되었다.

PrP106-126에 의해 채널 형성을 선호하는 낮은 pH는 또한 이 펩티드를 나선형에서 R-시이트 입체 형태로 전환한다. 반면 질량 분석법 및 에드먼(Edmam) 서열분석법으로 PrP^Sc의 펩티드 맵핑은 그의 아미노산 서열 및 PrP^c 유전자 서열로부터 예상되는 것과의 차이가 없는 것으로 나타났다; PrP^p 로부터 PrP^Sc를 구분할 수 있는 화학 변성은 발견되지 않았다; 푸리에 변환 적외선 분광법 및 원편광 이색성 분광법은 PrP^Sc 및 PrP^p 간의 유의한 입체 형태 차이를 나타냈다.

PrP^c 는 필수적으로 R-시이트가 없거나 거의 없는 α-나선형인 반면, PrP^Sc 는 높은 β-시이트 함량 및 낮은 α-나선형 구조를 갖는다.

서열 KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG (PrP106-126)(서열 번호:6)은 매우 소수성일 뿐만 아니라 또한 낮은 pH 에서 β-시이트 입체형태로 전환한다. 더욱이, 용액에서 기타 펩티드를 β-시이트 입체형태로 전환할 수 있다.

본 발명자들에 의해 개발된 이러한 관측 및 기술을 근거로, 신경 독성 PrP106-126으로 마우스의 강한 체액 및 세포 면역 반응 유도하고 그후 스크래피 마우스로부터의 뇌 추출물로 면역화된 마우스를 공격함으로써 질환에 대한 "백신"을 개발하였다.

전술한 예에서와 같이, 페길화된 리신은 PrP106-126 서열의 각 말단에 공유적으로 부착되었다. PEG 사슬의 길이는 12-4000 이었다. PEG 사슬은 포스파티딜 에탄올 아민의 한 분자에 서로 결합되었으며 PG-PEA-chol 리포솜-지질 A에서 재구성되었다.

마우스로의 주입으로 이들 초분자 항원 구조체는 강한 체액 면역 반응을 이끌어내며, PrP106-126 서열에 대한 높은 친화도를 갖는 항체를 수득하며, 그 안에서 용해화 효과를 갖는다.

상술한 것은 단지 본 발명의 바람직한 실시 형태에 관한 것이며, 첨부된 청구의 범위에서 설명된 바와 같이 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남이 없이 그 안에서 다수의 변형 또는 변경될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 전체적으로 인용된 참고문헌은 이들의 실체를 참고로 하여 여기에서 혼입하였다.

실시예 1

본 발명자들은 뉴런 치사가 제1 단계 래트 해마 배양액의 만성 노출로부터 농도 의존 방식으로 인간 PrP^ccDNA로부터 유래된 아미노산 서열의 잔기 106-126 에 상응하는 마이크로몰 농도의 펩티드에서 일어나는 것을 설명하였다. 자료는 표1에 나타낸다.

[표1]

9일간 해마 뉴런의 만성 처치

펩티드	세포 치사% 20 ㎛	80 ㎛
Prp 106-126	18±8	100±8
PrP 57-64	0±5	3±4
PrP 89-106	5±2	2±6
PrP 106-114	0±3	12±6
PrP 127-135	3±6	15±9
PrP 127-147	1±7	18±7
PrP 106-126 스크램블드	3±2	8±3

자료는 6-10 측정의 평균 ± s.e. 이며 PrP106-126의 독성 효과로 표준화하였다(100% 반응으로 명시됨).

이것은 뉴런 치사가 투여량 의존 방식으로 아포토시스에 의해 발생된 PrP106-126에 의해 유도된다는 것을 나타내었다. 스크래피와 같은 아급성 뇌증의 말기 단계에서, PrP^Sc는 PrP^c 보다 10 내지 20 배 더 높은 전체 뇌 농도에 도달되며, 이것은 PrP106-126의 2 농도에 대하여 표1에 명시된 자료와 현저히 유사하다.

PrP106-126에 의해 유도된 프로그램 세포 치사의 방법은 그중에서도 테스토스테론- 억제 전립선 메시지-2 유전자(TRPM-2)를 유도하는 것과 연관된다. 관련된 뇌증 동안 생체 내에서 아포토시스가 활성이 되는지의 여부는 알려져 있지 않지만 TRPM-2 mRNA의 발현은 스크래피 감염 햄스터에서 10배 증가 된다.

실시예 2

초분자 항원 구조체의 제조 방법

여기에서 기술된 초분자 구조체는 표준 Fmoc/tBu 아미노산 측쇄 보호를 사용하여 독창적으로 합성되었다. PEG-지질 모이어티에 의해 C- 및 N- 말단 양자에서 변성된 펩티드는 이전에 보고되어 있지 않다. 전형적으로, 펩티드의 페길화는 위치이성질체(regioisomer)의 혼합물을 초래한다. 여기에서 본 발명자는 부분적으로 보호된 펩티드를 사용하여 Aβ의 C- 및 N- 말단 양자로 PEG-지질 콘쥬게이트의 부위-특이적 부착에 대한 편리한 방법을 나타낸다.

내부 Lys 또는 His 잔기(4-11, 1-16, 22-35)를 함유하는 이들 펩티드 서열에 대하여, 직교로(orthogonally) 보호된 Lys(ivDde)를 각 말단에 첨가하였다. 추가의 Gly는 C-말단에 첨가하여 합성을 용이하게 하였다. Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페리딘으로 제거하고 아세트산 무수물을 사용하여 N-아세틸화하였다. ivDde 기의 선택적 분열은 1시간 동안 DMF 내에서 3% 히드라진 수화물로 성취되었다. 2-클로로트리틸 수지는 더 광범위하게 사용된 왕(Wang) 수지보다 더 우수한 데 그 이유는 전자가 히드라진분해(hydrazinolysis)에 대하여 훨씬 더 내성이 있는 것으로 입증되었기 때문이다. 더욱이, 2-클로로트리틸 수지는 극단적으로 산 민감성이며, 따라서, 왕 수지와는 달리, 보호된 펩티드를 단리할 수 있다. 실제로, 예비 활성화된 페길화 지질 시약 DSPE-PEG-SPA에 수지 결합된 펩티드의 결합은 결합 생성물을 산출하지 못하기 때문에 용액 상에서 결합 반응을 수행할 필요가 있다. 따라서 온화한 조건하에(아세트산/트리플루오로에탄올/디클로로메탄, 1:1:8, 1시간, rt) 수지로부터의 선택적 분열은 내부적으로 보호된 펩티드를 제공하였다(도 5).

용액-상 결합은 서열 Aβ_4-11(서열 번호: 2), Aβ_1-16(서열 번호: 5), Aβ_22-35(서열 번호: 3)로부터 유도된 펩티드를 사용하여 DMSO 및 과량의 염기 내의 DSPE-PEG-SPA로 성공적으로 성취되었다(도 6). 반응은 그후 2시간 동안 과량의 에탄올아민을 첨가하여 급냉시키고 용액은 동결건조하였다. HPLC(반분취용(semi-preparative) 역상 C₄ 컬럼)에 의한 정제는 그의 실체가 MALDI (매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화)에 의해 확인된 N- 및 C-말단 PEG-지질 콘쥬게이트의 50-70% 순도를 제공하였다. 각각의 서열은 결합 반응의 용이성에서 상당한 변화를 나타냈으며 조건은 이에 따라 조절되었다(온도, 몰 당량 DSPE-PEG-SPA의 수, 시간). HPLC에 의한 정제는 요구되는 생성물로부터 과량의 DSPE-PEG-SPA의 분리에 대하여 우수하지만, 전자가 컬럼에 대한 친화도를 나타내지 않기 때문에, 원하는 생성물로부터 모노-PEG-지질(N- 및 C- 말단 양자) 펩티드 생성물의 분리는 어려운 것으로 입증되었다. 크기별 배제 크로마토그래피를 사용한 이들 생성물의 분리에 대한 시도 또한 이들의 상대적으로 큰 다분산도로 인해 실패인 것으로 입증되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 최종 측쇄 탈보호 전에 모노- 및 디- 결합된 생성물을 분리하기 위하여 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하였다. 후속한 펩티드 측쇄 탈보호 및 과량의 급냉 DSPE-PEG-SPA의 분리는 훨씬 높은 순도로 원하는 콘쥬게이트의 단리를 할 수 있게 한다.

실시예 3

PEG화 및 팔미토일화 항원의 면역원성의 비교, ELISA 및 분배 시험

리포솜 항원은 상술한 바와 같이 제조되었다. 서열 PEG-Aβ_1-16, -Aβ_4-11 및 -Aβ_22-35는 모노포스포릴 지질 A(40mg/mM 인지질)을 함유하는 디미리스토일 포스파티딜 콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPEA), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DMPG) 및 콜레스테롤(0.9: 0.1: 0.1: 0.7 몰비)로 만들어진 리포솜으로 이루어진 구조체로 재구성되었다.

ELISA

항원 및 팔미토일화된 Aβ_1-16 은 2주 간격으로 C57BL/6 마우스에서 면역화를 위해 사용되었다. 10-12 동물이 각각의 항원으로 면역화되었다. 혈청은 부스팅 (boosting) 후 5일 취하였으며 ELISA는 몇몇 혈청의 희석액으로 수행되었다. 다른 항원의 면역원성을 나타내는 비교 자료가 도 7 에 제시된다.

ELISA 자료는 리포솜 PEG-Aβ_1-16이 팔미토일화된 Aβ_1-16보다 유의하게 더 면역원성임을 나타냈다. 추가의 ALUM은 마우스에서의 PEG-Aβ_1-16의 면역원성을 향상시키지 못했다. PEG-Aβ_4-11에 의해 유도된 항체 반응은 PEG-Aβ_1-16에 비교시 느렸다.

분배 시험( Disaggregation Assays )

리포솜-PEG-Aβ_4-11면역화된 동물로부터의 9 혈청(1:100 희석)이 예비 형성된 Aβ_1-42섬유가 항혈청으로 배양된 시험에서 사용되었다. 시험은 상술한 바와 같이 수행되었다(Nicolau 등, 2002).

다른 혈청에 의한 Aβ_1-42섬유의 용해화는 24시간의 인큐베이션 시간으로 관측되었다(도 8). 혈청 중의 일부는 75% 정도로 섬유를 가용화 하였다(마우스 5 및 6으로부터의 혈청). 이들 마우스의 비장 세포는 단일클론 항체의 생성을 위해 사용되었다.

실시예 4

용해화 시험

두 팔미토일화된 Aβ_1-16/리포솜/지질 A-면역화된 동물들로부터, 25 상청액이 Aβ_1-42특이 항체에 대하여 특이성을 나타낸 최근 생성된 하이브리도마 클론으로부터 수득되었다. 이들은 PNAS 2002, 99, 2332-2337에서 기술된 방법 및 프로토콜에 따라 용해화 시험으로 실험되었다. 결과는 도9에 요약한다.

5 하이브리도마 클론의 상청액은 시험관 내에서 75% 이하의 정도까지 β-아밀로이드 섬유를 가용화할 수 있는 것으로 나타났다. 가장 우수한 두 클론 15 및 27을 단일클론 항체의 정제를 위해 선택하였다. 이들은 생체 내 양성 대조군 mAbs로써 더 연구되기 위하여 사용된다.

실시예 5

고체 상태 NMR 분광법에 의한 Aβ_1-42-펩티드의 α-나선형 전이로의 β-시이 트의 연구

¹³C-표식된 아미노산의 손실을 방지하기 위해, Fmoc 펩티드 합성에 의한 Aβ_1-42의 합성은 표식된 아미노산 없이 시험-합성에 의해 입증되었다. 수득된 Aβ_1-42펩티드의 동일성은 MALDI 질량 분광법 및 역상 컬럼의 HPLC를 사용한 정제 절차에 의해 입증될 수 있으며 암모니아 완충 아세토니트릴 물 구배⁴가 성립될 수 있다.

아밀로이드 β-펩티드의 합성 및 정제를 위한 프로토콜의 성공적인 설정은 위치 12에서 ¹³C-표식된 발린(¹²Val) 및 위치 10에서 ¹³C-표식된 티로신(¹⁰tyr)을 포함하는 표식된 펩티드의 합성을 따른다.

표식된 Aβ_1-42는 37℃에서 1주일 동안 PBS 완충액 내의 펩티드 용액을 인큐베이션 함으로써 섬유를 생성하기 위해 사용되었다. 동결건조된 섬유의 ¹³C NMR 스펙트럼은 β-시이트 구조를 확인하고 발표된 결과와 일치한다. 2일 동안 Aβ_1-16특이 항체가 있는 섬유의 인큐베이션은 ¹³C 스펙트럼의 유의한 변화를 나타내지 않았다. NMR 측정의 첫 번째 평가는 제2 구조 내에서의 변화를 나타낸다(도 10).

실시예 6

초분자 항원 구조체에 의해 유도된 항체

mAbs 의 제조: 리포솜 항원은 기술된 바와 같이 제조되었다(Nicolau 등, 2002, PNAS, 99, 2332-37). 서열 PEG-Aβ_1-15, -Aβ_1-16, Aβ_4-11-Aβ_22-35 및 Aβ_29-40 을 모노포스포릴 지질 A(40mg/mM 인지질)를 함유하는 디미리스토일 포스파타딜 콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPEA), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DMPG) 및 콜레스테롤(0.9: 0.1: 0.1: 0.7 몰비)로 만들어진 리포솜으로 이루어진 구조체로 재구성되었다. 이들 항원 및 팔미토일화된 Aβ_1-16은 2주 간격으로 C57BL/6 마우스에서 면역화하기 위해 사용되었다. 10-12 동물은 각 항원으로 면역화되었다. 3 내지 6 부스팅(boostings)후 (혈청의 1:5,000 희석액이 ELISA 에서 양성이었을 때)치료 타이터를 갖는 마우스가 융합을 위해 선택되었다. 비장으로부터 마우스의 B-림프구의 융합은 골수종 세포주 SP2-0로 수행되었다. IgG 생성 하이브리도마 클론은 ELISA에 의해 Aβ_1-42펩티드에 특이적으로 결합하기 위해 선택 및 시험되었다.

mAb 의 특징부여: 분해 시험, NMR-연구, QELS- 및 SPR- 측정은 mAbs의 특징부여를 위해 사용되었다. mAbs는 80% 이하의 예비 형성된 아밀로이드 섬유의 분해를 나타내었다(표 1). 아밀로이드의 α-나선형으로의 β-시이트의 전이는 항체에 의해 유도된 것으로 관측되었다(도 11, 12). 준 탄성 광 산란 (Quasi Elastic Light Scattering, QELS)에 의한 측정은 단일클론 항체를 사용한 아밀로이드 섬유의 인큐베이션이 ≤800nm의 크기를 갖는 섬유(존재하는 모든 섬유의 40-60%)를 초래하는 반면, 아밀로이드 만으로는 단지 매우 큰 응집물(>4㎛)만을 제공한다는 것을 나타낸다.

[표 1]

PEG-Aβ_1-15, -Aβ_4-11 및 Palm-Aβ_1- ₁₆의 면역화에 의해 수득된 mAb

항원	Mab/하이브리도마	분해(%)	해리 상수
PEG Aβ_1-15	ET-1H6	75	nd
PEG Aβ_1-15	ET-7E3	55	2 x 10^-7
PEG Aβ_4-11	EN-4H7	80	nd
PEG Aβ_4-11	EN-9H2	35	nd
PEG Aβ_1-16	EJ-1A9	55	8 x 10^-8
PEG Aβ_1-16	EJ-7H3	60	7 x 10^-8
PEG Aβ_1-16	AN9C-E4	60	nd

NMR 연구: 섬유에 대한 mAb의 효과를 평가하기 위해, Aβ-섬유의 용액은 12일 동안 항체와 인큐베이션 하였다. 양성자 구동 스핀 확산 측정(Proton Driven Spin Diffusion measurements(PDSD))는 2D ¹³C-¹³C 상관관계 스펙트럼을 측정하기 위 하여 수행되었다. 도 11-13은 NMR 자료 및 분석을 제공한다: NMR: 12일 동안 EN4H7, ET-1H6 또는 AN9C-E4로 인큐베이션 하기 전 및 후에 아밀로이드 β-펩티드섬유의 ¹³C-¹³C 상관관계 스펙트럼(A, B). 세로(D) 및 가로(C)는 상관관계 스펙트럼을 추론하였다. 스펙트럼(-항체)는 순수한 섬유의 스펙트럼을 나타내며 반면(+항체)는 mAb의 존재에서 스펙트럼을 나타낸다.

동결건조된 섬유의 ¹³C 스펙트럼은 공명을 할당할 수 있다. Val12 및 Tyr10의 C_α 및 C_β 의 화학적 이동 값은 순수한 섬유의 β-시이트 구조를 확인한다.(도 11). ¹²Val의 C_α 및 C_β 핵의 공명의 이동은 명백히 β-시이트로부터 α-나선형으로의 전이를 나타낸다. 반면 Tyr 10의 C_α 및 C_β 의 공명의 이동은 2차 구조로의 전이가 명료하게 나타나지 않았다. Tyr10 공명의 거동은 Tyr10이 아밀로이드 섬유 내의 Aβ-펩티드의 루프 부분 및 β-시이트 부분 사이의 경계면에 있는 모델에 의해 설명될 수 있다.

두 번째 실험에서 13C-농축 섬유는 12일 동안 EN4H7 및 ET1H6 항체(표 1 참조)로 인큐베이션 되었다. 인큐베이션된 섬유는 두 항체에 대하여 펩티드의 주 분획에 대한 β-시이트에서 α-나선형으로의 전이를 나타내는 32ppm 내지 28ppm의 ¹²Val의 C_β 핵의 공명의 이동을 나타낸다(도12 및 13). ¹⁰Tyr에 대한 C_α 및 C_β 의 공명은 항체의 존재로 넓어지게 된다. 이것은 ¹⁰Tyr의 위치에 대하여 다소 구조화 되지 않은 확증으로의 전이를 나타낸다.

실시예 7

ELISA에서 시험된 PEG화 및 팔미토일화 항원의 면역원성 비교

ELISA 자료는 리포솜 PEG-Aβ_1-16이 팔미토일화된 Aβ_1-16보다 더 면역원성임을 나타낸다(도14). 추가의 ALUM은 마우스의 PEG-Aβ_1-16의 면역원성을 향상시키지 않았다. PEG-Aβ_1-16와 비교시 더 느렸던, PEG-Aβ_4-11에 의해 유도된 항체 반응을 제외하고, 일반적으로 페길화된 펩티드는 팔미토일화 펩티드보다 더 면역원성인 것으로 나타난다(도 14).

실시예 8

항체의 효능 평가를 위한 행위 시험

여기에서 기술된 방법에 의해 유도된, 즉, 변성된 아밀로이드 펩티드를 포함하는 초분자 항원 구조체(예컨대 페길화된 아밀로이드 펩티드)의 사용에 의해 유도된 항체의 효능을 평가하기 위해, 마우스가 처리될 것이며 그후 하기 간략하게 한 행위 시험을 사용하여 평가되었다.

모리스 물 미로( Morris Water Maze )

풀(백색, 1m 직경의 원형 용기)은 탈출 플랫폼(물 레벨 아래 1cm)을 숨기기 위해 무향, 무독성의 첨가제로서 이산화티탄과 함께 20℃ 물을 함유한다. 각 마우스의 수영은 비디오테이프로 녹화하고 분석하였다(Ethovision, Noldus information Technology, 바게닝겐(Wageningen), 네덜란드). 훈련에 앞서, 각각의 마우스는 15초 동안 플랫폼의 상부에 놓는다. 항해 시험 장소를 위해, 마우스는 3일 연속으로 3 실험의 5블록에 숨겨진 플랫폼을 알아내도록 훈련을 받는다. 각 시험은 최대 120초의 강제 수영 시험에 이어 60초 휴식하는 것으로 구성된다. 플랫폼의 위치에 대하여 요구되는 각 마우스의 시간이 측정된다. 5 연속 실험은 학습 곡선을 초래한다.

마지막 훈련 24시간 후, 각각의 동물은 제거된 플랫폼으로 탐사 실험을 가졌다. 마우스는 60초 및 15초의 탐색 시간 동안 탐색하도록 허용되었으며 원래의 플랫폼 위치의 횡단이 측정되었다.

수영 및 플랫폼의 탐색을 거부하고, 그대신 실험자가 풀 밖으로 그들을 데리고 갈 때까지 기다리는 마우스, 소위 "뜨는 것(floaters)"은 분석에서 제외된다.

개방 필드

흑색 수직 벽 및 반투명 바닥이 있는 플렉시글래스 개방 필드 박스(52x52x40 cm)는 시험을 위해 사용된 박스 아래에 위치한 램프에 의해 희미하게 조명되었다. 다른 영역이 컴퓨터화된 시스템에 의해 할당되었다(Ethovision, Noldus information Technology, 바게닝겐, 네델란드): 코너(9 x 9 cm), 박스의 4 측 (벽으로부터 9cm) 및 개방 필드 박스의 중심(43 x 43 cm). 각각의 마우스는 비디오테 이프 녹화하였고 활동은 트랙의 거리(cm), 마우스의 속도(cm/sec), 가장자리(코너 + 측면)와 비교시 중심에서 보낸 지속기간/시간(초) 및 양 영역 사이를 횡단하는 빈도(N)를 측정하여 분석(Ethovision)하였다. 각각의 마우스는 박스의 중앙에 놓고 10분간 박스를 조사하도록 허용하였다. 시험 사이에 개방 필드 박스는 새로운 마우스의 도입 전에 깨끗하게 하고 건조하였다.

새로운 대상 인지 시험

마우스는 박스 아래에 위치한 램프에 의해 흐리게 조명되는 흑색 수직 벽 및 반투명 바닥이 있는 플렉시글래스 개방 필드 박스(52x52x40cm)에 1시간 동안 익숙하게 한다. 다음날 동물은 같은 박스 내에 위치시키고 10분 획득 시험을 수행하였다. 이 시험 동안, 마우스는 개별적으로 대상 A의 존재하에 개방 필드에 위치하게 하고(청색 공 또는 적색 입방체, ±4cm의 유사한 크기), 빈도 탐구 대상 A(동물코가 <1 cm의 거리에서 대상을 향해 가르킬 때 및 마우스가 대상의 방향으로 활발하게 킁킁거리며 냄새맡을 때)가 기록되었다(Freq_AA). 수행된 3 시간 후인 10 분 보유 실험 동안(두번째 실험), 새로운 대상(대상 B, 적색 입방체 또는 청색 공)을 개방 필드로 친숙한 대상(대상 A)와 함께 놓는다. 동물이 두 대상을 조사하는 빈도를 기록한다 (Freq_A 및 Freq_B).

두 대상이 조사된 빈도에 대한 신규한 대상이 조사된 빈도의 비로써 정의된 인지 지수(RI) [Freq_B/(Freq_A + Freq_B)x100]는 비 공간적 기억을 측정하기 위해 사 용되었다. 빈도 대상 A는 습득 실험이 사용되는 동안 호기심을 측정하기 위해 조사되어 진다.

참고문헌

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Claims

항원 아밀로이드 펩티드 또는 그 단편을 포함하는 항원 구조체를 포함하고, 상기 펩티드 또는 단편은, 항원성을 향상시키기 위해, 소수성 모이어티로 변성되고 리포솜에서 재구성되는,

알츠하이머 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물로서,

상기 소수성 모이어티는 14 내지 24 탄소 원자의 탄소 골격을 갖는 지방산인 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 소수성 모이어티는 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산 중 선택되는 것인, 약학적 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 소수성 모이어티는 팔미트산인 약학적 조성물.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원성 구조체는 인지질 및 콜레스테롤로 이루어지는 리포솜 내에서 재구성된 약학적 조성물.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드 펩티드가 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 또는 서열 번호: 5를 포함하는 약학적 조성물.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 캐리어를 더 포함하는 약학적 조성물.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항원성 펩티드 또는 그의 활성 단편이, 추가로, 폴리에틸렌 글리콜 또는 변성 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 페길화를 통해 변성된 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 항원 아밀로이드 펩티드 또는 그 단편을 포함하는 항원 구조체를 포함하고, 상기 펩티드 또는 단편은, 항원성을 향상시키기 위해, 팔미트산 모이어티로 변성되고 리포솜에서 재구성되는, 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물.
청구항 1 내지 청구항 3 및 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 이용하여, 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 약제를 제조하는 방법.
청구항 9에 있어서, 알츠하이머 질환에 걸린 환자의 기억 회복 및 호기심 각성의 수준을 상승시키기 위한 약제를 제조하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 및 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 이용하여 항체를 만드는 방법.
Aβ_1-40및 Aβ_1-42섬유의 인식 및 용해가 가능하고, 대상체에게 투여할 때, 치료 대상체의 뇌 속의 출혈을 유도하지 않으면서 기억 회복 및 호기심 각성의 수준을 유의 수준으로 유도시키는 항체로서, 상기 항체는 청구항 11의 방법에 의해 제조되는 것인 항체.
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