CN101420983A - 包含超分子抗原构建体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涵盖用于引发高特异性高免疫应答产生构象敏感性抗体的新组合物和方法。这些抗体识别广泛种类抗原的特异性表位，包括但不限于淀粉样蛋白、朊蛋白或P170糖蛋白。本发明的新组合物包括通常含有肽序列的超分子抗原构建体，其中肽序列共价连接于聚乙二醇化的赖氨酸，导致肽呈递得到修饰和增强。本发明独特的修饰方法可应用于多种肽，最终能够用于诸如阿尔茨海默氏病的疾病和紊乱的治疗制剂和疫苗。

Description

包含超分子抗原构建体的组合物和方法
发明领域
本发明涉及用于引发高免疫应答的组合物和方法。特别地，本发明包括用于产生构象敏感性抗体的新的组合物和方法。
发明背景
免疫系统是机体复杂的应答系统，涉及到许多具有不同活性的不同种类的细胞。一部分免疫系统的激活通常导致多种应答，这是由于系统中其它相关部分不期望的激活所致。目前，没有令人满意的通过靶向免疫系统的特定组分产生特异的期望应答的方法或组合物。
免疫系统是机体复杂的互作系统，涉及到与体内体外刺激相互作用的广泛种类的组分，包括细胞和细胞因子。除了自身直接的作用外，免疫系统的应答也受机体其它系统的影响，包括神经系统、呼吸系统、循环系统和消化系统。
免疫系统更为著名的方面之一在于其对外来抗原应答的能力，所述外来抗原是由入侵生物、机体内的细胞变化或者接种疫苗所呈递的。对这样的免疫系统激活应答的第一类细胞有些是吞噬细胞和自然杀伤细胞。在吞噬细胞之中包括单核细胞、巨噬细胞和多形核嗜中性粒细胞。这些细胞一般结合、中和并通常消灭外来抗原。它们也产生介导诸如炎性应答的其它免疫应答的可溶性分子。自然杀伤细胞能够识别和消灭某些感染了病毒的胚细胞和肿瘤细胞。免疫应答的其它因子包括补体途径，它们能够不依赖于外源抗原应答或者与细胞或抗体协同作用。
一般地，认为对抗原的应答既包括体液应答又包括细胞应答。体液免疫应答由非细胞因子介导，这些因子由细胞释放且在血浆或胞内液中可能是游离或非游离的。免疫系统体液应答的主要部分由B淋巴细胞所产生的抗体介导。细胞介导的免疫应答是由细胞相互作用而产生的，包括抗原提呈细胞和B淋巴细胞(B细胞)以及T淋巴细胞(T细胞)。
免疫应答能力最为广泛采用的方面之一是单克隆抗体的生产。二十世纪七十年代中期单克隆抗体(Mab)技术的出现提供了一种新的有价值的治疗和诊断工具。研究者和临床医师第一次得到了无限量的能够结合预定抗原位点且具有多种免疫效应功能的均一抗体。目前，生产单克隆抗体的技术是本领域众所周知的。然而对特异性抗体依然存在着持续的需求。本质上，所期望的是生产定制抗体的能力。这种需求在抗击传染病领域中尤其大，其中病原体对常用抗生素获得了抗性。此外，还需要抗生素，以对付除传染性因子之外的因素所致的病理状态。
阿尔茨海默氏病(AD)认为主要是由大脑中蛋白质的异常沉积造成的淀粉样斑的形成而导致的一种神经障碍。科学证据表明AD是由导致神经细胞死亡的β淀粉样蛋白斑的产量增加或者积累而引起的。脑决策区中神经细胞的丧失依次导致神经递质的减少和记忆的损伤。主要地参与斑形成的蛋白质包括淀粉样前体蛋白(APP)和两个早老蛋白(presenillin)(早老蛋白I和早老蛋白II)。APP的降解很可能增加了其聚集成斑的倾向。需要能够靶向和减弱淀粉样斑形成的特异性抗体。
AD的症状缓慢显现，最初的症状可能只是轻度健忘。在这个阶段，个体可能遗忘近期的事件、活动、熟人的名字或事物的名称，并且可能不能解决简单的数学题。随着疾病的发展，症状更加容易察觉，变得严重，足以使AD患者或他们的家属寻求医学帮助。AD的中期症状包括遗忘怎样完成诸如清洁这样的简单任务，问题逐渐发展到说话、理解、阅读或书写。晚期的AD患者可能变得焦虑或攻击性，可能会离家出走，最终需要完全护理。
目前，诊断AD唯一明确的方法是在个体死亡后的尸检中鉴定脑组织中蛋白斑和混乱。因此，病人活着时，医生只能做出“可能是”或者“大概是”AD的诊断。利用现有方法，利用数种工具诊断“大概的”AD，多达90％的情况，医师能够正确诊断AD。医师询问病人有关总体健康，过去的病况以及进行日常活动出现任何困难的病史的问题。记忆、解决问题、关注、计算和语言的行为测试提供认知退化方面的信息，而诸如血液、尿液或脊髓液的医学测试和脑扫描能够提供一些进一步的信息。
AD的治疗包括药物治疗和非药物治疗。旨在改变潜在的病程(推迟或者逆转进程)的治疗迄今为止大部分是不成功的。恢复神经细胞化学信使(神经递质)的不足(缺陷)或功能障碍的药物，比如胆碱酯酶抑制剂(ChEIs)，已经表明改善了症状。也有了针对AD精神病学表现的药物治疗。
胆碱酯酶抑制剂如他克林(Tacrine)和利斯的明(Rivastgmine)是目前唯一的一类FDA批准的用于治疗AD的试剂。这些试剂是恢复脑中化学神经传递的缺陷或者功能障碍的药物。ChEIs阻止了神经递质的酶促降解，由此增加了脑中可用的传递神经信号的化学信使的量。对于处于疾病早期和中期的有些患者，药物他克林(
Figure A200580012587D00061
Morris Plains，NJ)，多奈哌齐(
Figure A200580012587D00062
Tokyo， JP)，利斯的明
Figure A200580012587D00063
East Hanover， NJ)或者加兰他敏(
Figure A200580012587D00064
New Brunswick，NJ)可能会有助于在一段时间内预防某些症状的恶化。另一种药物美金刚(memantine)(
Figure A200580012587D00065
New York，NY)已被批准治疗中度到重度的AD。还有一些药物会帮助控制诸如失眠、兴奋、精神恍惚、焦虑和抑郁的AD行为症状。治疗这些症状通常会使患者更舒适些，从而使护理者对他们的护理更容易些。不幸地，尽管重大的治疗进展表明这类试剂一直比安慰剂好，然而虽有治疗，疾病仍继续发展，对于智力功能的平均功效仅仅是中等。ChEIs也有包括肠胃功能紊乱、肝中毒和体重减轻的副作用。
对AD中出现的脑异常的了解进展有希望提供新的治疗靶标的框架，以更集中于改变疾病的过程和发展。人们正在积极地研究包括抗炎剂的许多化合物。使用诸如罗非昔布(rofecoxib)和塞来昔布(celecoxib)的特异性环加氧酶抑制剂(COX-2)的临床试验也在进行中。
研制新药时考虑的其它因素是目标患者使用的舒适度。因为方便患者服用，口服药物递送—特别是片剂、胶囊和软胶—占据消费的所有剂型的70％。药物研制人员认同患者优选口服递送而不是对其进行注射或其它更为侵入的给药方式。还优选导致给药间隔低(即一天一次或持续释放)的制剂。口服剂型给药的抗生素的舒适导致了患者治疗期间的依从提高。
所需要的是生产高特异性和高效抗体的有效方法和组合物。优选这样的抗体将识别诸如淀粉样蛋白、朊蛋白或P170糖蛋白的多种抗原上的特定表位。
因此同样需要的是对付与诸如阿尔茨海默氏病的淀粉样斑形成相关神经疾病相关的综合症的有效方法和组合物。特别需要能够对抗疾病的生理学表现(比如与β片层构象的淀粉样肽纤维的聚集相关的斑形成)的特异性抗体。
发明概述
本发明包括用于产生高特异性和高效抗体的新的方法和组合物。与目前可用的产品不同，本发明提供了产生具有识别多种抗原的特定表位能力的抗体的独特的方法和组合物。
本发明满足了对能产生特异性识别表位(如淀粉样蛋白、朊蛋白或P170糖蛋白的表位)的抗体的组合物的长期需求。
本发明涵盖独特的抗原呈递，其导致增强的暴露，并最终产生更高程度构象敏感性的抗体。在一个实施方案中，本发明包括含有超分子抗原构建体的组合物，所述超分子抗原构建体含有肽序列，其每个末端共价连接于一个聚乙二醇化的氨基酸(如聚乙二醇化的赖氨酸)。
因此，本发明的一个目的是提供引发特异和有效免疫应答的方法和组合物。
本发明的另一个目的是提供治疗和预防疾病发生或传播的方法和组合物。
本发明的另一目的是提供通过引发宿主的主动细胞应答和体液应答而预防、治疗或减轻疾病的方法和组合物。
本发明的又一目的是提供减少和预防神经紊乱发生的方法和组合物。
本发明的另一个目的是提供减少和预防过度增生性紊乱发生的方法和组合物。
本发明的又一目的是提供神经紊乱的治疗性免疫干预的方法和组合物。
本发明的又一目的是提供针对所选的传染性生物接种人或动物的方法和组合物。
本发明的又一目的是提供针对所选的传染性生物被动免疫人或动物的方法和组合物。
本发明的另一个目的是提供超分子构建体组合物，其具有抗原性且引发人或动物抗病理表现的免疫应答。
本发明的又一目的是提供超分子构建体组合物，其具有抗原性且引发人或动物抗病理表现的免疫应答，其中这样的病理表现包括异常，如淀粉样斑。
本发明的另一个目的是提供超分子构建体组合物，其具有抗原性且引发人或动物抗传染性生物的免疫应答。
本发明的另一个目的是提供包含超分子构建体和载体的疫苗组合物，所述构建体对待用该组合物免疫的人或动物是非免疫原性的；其中抗原肽独特地呈递在载体表面，从而向人或动物给药时产生高特异性和具有高度构象敏感性的抗体。
本发明的又一目的是提供含有修饰的抗原部分以提高个体对疾病和紊乱的应答的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供包含超分子构建体的疫苗组合物，其中肽被修饰以增强抗原性作用。
本发明的又一目的是提供包含超分子构建体的疫苗组合物，所述超分子构建体含有经修饰以增强抗原性作用的肽，其中这样的肽通过聚乙二醇化(利用聚乙二醇或修饰的聚乙二醇)修饰、或通过其它方法修饰，如多聚氨基酸(例如多聚甘氨酸、多聚组氨酸)、多糖(聚半乳糖醛酸、聚乳酸、聚羟基乙酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖)、合成聚合物(聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚酯)或共聚物(聚(甲基丙烯酸)和N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺)等。
本发明的又一目的是提供免疫原性组合物，其中抗原肽的载体含有修饰的脂质体。
本发明的另一个目的是提供免疫原性组合物，其中抗原肽的载体含有胶态金属。
本发明的另一个目的是提供免疫原性组合物，其中抗原肽的载体含有衍生自杆状病毒的囊泡(vesicle)。
本发明的又一目的是提供与可药用的佐剂联合以刺激免疫应答的免疫原性组合物。
本发明的又一目的是提供可通过肌内、静脉内、经皮、口服或皮下给药的免疫原性组合物。
本发明的这些目的和其它目的、特点以及优点在阅读了下面公开的实施方案的详述描述和所附的权利要求书后会变得显而易见。
附图说明
图1提供了化学修饰的β淀粉样抗原的示意图。
图2提供了用化学修饰的淀粉样抗原重构的脂质体的代表性示意图。
图3提供了多重P170抗原的示意图。
图4提供了与PrPC不同片段同源的合成肽，用于研究它们对初级大鼠海马神经元生存能力的影响。
图5提供了衍生自Aβ序列4-11(SEQ ID NO：2)、1-16(SEQ ID NO：5)、22-35(SEQ ID NO：3)和29-40(SEQ ID NO：4)的肽的示意图。
图6提供了衍生自含有或没有内部His或Lys残基的肽序列的抗原的一般合成路径的示意图。
图7提供了用聚乙二醇化淀粉样肽/脂质体/脂质A免疫的C57BL/6小鼠的1:5000稀释血清进行的ELISA结果。PEG-Aβ1-16(--黑色)，PEG-Aβ1-16+ALUM(--灰色)，PEG-Aβ4-11(——灰色)。每种抗原取10只小鼠的平均值；Aβ1-16+ALUM显示了2只小鼠的平均值。作为对照，显示了12只棕榈酰化Aβ1-16(--亮灰色)注射动物的平均值(2002年发表)。
图8提供了用PEG-Aβ4-11免疫的C5 7BL/6小鼠的血清评价Aβ1-42纤维的溶解性的测定结果。硫黄素(thioflavin)荧光发射强度与溶液中存在的纤维状(fbrillar)淀粉样肽的量相关。7天内37℃ pH＝7.1的PBS中形成Aβ1-42纤维。第七天加入血清，孵育24小时。柱1-9代表用接种动物的血清进行的溶解性试验。显示了4个样品的平均值+SD。
图9提供了棕榈酰化Aβ1-16免疫的C57BL/6小鼠的杂交瘤克隆的上清液对Aβ1-42纤维的溶解性分析结果。7天内37℃ pH＝7.1的PBS中形成Aβ1-42纤维。上清液孵育24小时。sfr培养基＝没有FCS的培养基。杂交瘤克隆在无血清培养基中培养1天。显示了4个样品的平均值+SD。
图10提供了由在10Tyr和12Val标记的淀粉样β肽组成的淀粉样纤维的13C-13C相关光谱。
图11提供了Aβ肽纤维(A)及与抗体孵育12天后(B)的13C-13C相关光谱的发射。
图12提供了评估单克隆抗体对淀粉样β纤维的作用的NMR光谱数据。
图13提供了聚乙二醇化和棕榈酰化抗原的比较数据的图表。
图14提供了聚乙二醇化β淀粉样肽(1-16、4-11、22-35、1-15)和棕榈酰化β淀粉样肽的比较数据的图表。
发明详述
通过参照下面本文囊括的具体实施方案的详细说明可以更加容易地理解本发明。虽然本发明参照其中某些实施方案的具体细节来描述，但是不意味着这些细节应当视为对本发明范围的限制。特此将文中提及的文献的内容全文引用作为参考，包括美国临时申请流水号No.60/449573和2004年2月20日提交的美国专利申请流水号No.10/783975。
这里我们报道了高特异性地引发高免疫应答、产生构象敏感性抗体的的方法。这些抗体识别包括但不限于淀粉样蛋白、朊蛋白或P170糖蛋白的多种抗原上的特定表位。更具体地，这里我们报道了修饰肽(如淀粉样肽)以引发增强的免疫应答的概念。在某些实施方案中，肽通过聚乙二醇化修饰。
定义
如此处所用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是可互换的，定义为由两个或多个氨基酸通过肽键连接组成的生物分子。
术语“肽”是氨基酸(通常是L氨基酸)链，它们的α碳通过由一个氨基酸的α碳的羧基基团和另一个氨基酸的α碳的氨基基团之间的缩合反应形成的肽键而连接。肽链一端(即氨基端)的末端氨基酸具有游离氨基，而肽链另一端(即羧基端)的氨基酸具有游离羧基。这样，术语“氨基末端”(简写N-末端)是指位于肽氨基端的氨基酸上的游离α-氨基基团，或指肽内任何其它位置上的氨基酸的α-氨基基团(当参与形成肽键时是亚氨基)。类似地，术语“羧基末端”(简写C-末端)是指位于肽羧基端的氨基酸上的游离羧基基团，或指肽内任何其它位置上的氨基酸的羧基基团。
通常地，组成肽的氨基酸按顺序编号，即从肽的氨基端开始，朝肽的羧基端的方向递增。因而，当提到一个氨基酸接着另一个氨基酸时，是指该氨基酸的位置比前一个氨基酸的位置更靠近肽的羧基端。
如此处所用的，术语“残基”是指通过酰胺键掺入到肽中的氨基酸。这样，氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者，除非另有限制，可以包括以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的天然氨基酸的已知类似物(即氨基酸模拟物)。而且，酰胺键模拟物包含本领域技术人员熟知的肽骨架修饰。
如此处所用的，用语“基本上由......组成”排除了会实质上改变该用语述及的肽的基本性质的任何要素。因而，“基本上由......组成”的肽的描述排除了会实质上改变该肽的生物活性的任何氨基酸取代、添加或缺失。
此外，本领域技术人员将会理解，如上文所述的，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或者小百分比的氨基酸(通常少于5％，更通常地少于1％)的个别取代、缺失或添加是保守性修饰的变异，其中变化导致用化学相似的氨基酸替换另一氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守性取代表是本领域公知的。下面6组，每组都含有互为保守性取代的氨基酸。
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
术语“分离的”或“生物纯的”是指这样的物质，其实质上或基本上不含有自然状态发现的通常伴随的组分。因而，文中所述的肽不含有它们原位环境中通常伴随的物质。通常地，文中所述的分离的免疫原性肽，以银染色凝胶上的带强度衡量，至少是约80％纯，通常至少约90％，优选至少约95％。
蛋白质的纯度或均一性可用本领域熟知的许多方法表示，如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后通过染色观察。对于某些目的，需要高分辨率，因此用HPLC或类似的方法来纯化。
当免疫原性肽的长度相对短时(即少于约50个氨基酸)，它们通常用标准的化学肽合成技术合成。
固相合成是化学合成文中所述的免疫原性肽的优选方法，其中序列的C末端氨基酸连接于不溶性支持物，接着向序列中顺次添加其余的氨基酸。固相合成技术是本领域技术人员公知的。
可选地，文中所述的免疫原性肽通过重组核酸方法合成。通常地，这包括创建编码肽的核酸序列，将核酸置于处于特定启动子控制下的表达盒中，在宿主中表达肽，分离表达的肽或多肽，并且如果需要的话使肽复性。在文献中可以找到足以指导本领域技术人员完成这些操作的技术手段。
一旦表达，重组肽可以按照标准操作来纯化，包括硫酸胺沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等等。优选约50％-95％均一性的基本纯的组合物，最优选80％-95％或更大均一性的组合物用作治疗剂。
本领域技术人员将会意识到在化学合成、生物表达或纯化后，免疫原性肽可能拥有与其组成肽的天然构象的实质有别的构象。在这种情况下，通常需要变性和减少抗增生(antiproliferative)肽，然后使肽重折叠成优选的构象。减少和变性蛋白质以及诱导重折叠的方法是本领域技术人员熟知的。
例如，纯化蛋白的抗原性可以通过表现出与免疫血清或针对该蛋白本身产生的抗血清的反应来证实。
如此处所用的，术语“一”，“一个”或“所述”是指“一个或多个”且包括复数，除非上下文是不合适的。
如此处所用的，术语“检测”或“检测的”是指用已知技术检测生物分子，如免疫化学或组织学方法，并且指定性或定量地测定所研究生物分子的存在或浓度。
“分离的”是指生物分子不含至少一些与之一起天然存在的组分。
如此处所用的，术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异抗体、猿化(simianized)抗体、人源化抗体以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物。
术语“抗原”是指能在哺乳动物中诱导免疫应答的实体或其片段。该术语包括免疫原和负责抗原性的区域或抗原决定簇。
如此处所用的，术语“可溶性的”是指部分或全部溶解在水溶液中。
同样如文中所述的，术语“免疫原性的”是指引发或增强产生针对免疫原性试剂的抗体、T细胞和其它反应性免疫细胞，且促成人类或动物的免疫应答的物质。
当个体针对所施用的本发明的免疫原性组合物产生足够的抗体、T细胞和其它反应性免疫细胞时，则发生免疫应答，以缓和或减轻待治疗的紊乱。
如此处所用的，术语“载体”是指抗原肽或超分子构建体能够掺入到其中或与之相结合的结构，由此向人或动物的免疫系统呈递或暴露抗原肽或肽的部分。术语“载体”还包括递药方法，其中含有抗原肽的超分子抗原构建体可以通过递药机制运输到期望位点。这样的递药系统的一个实例利用胶态金属如胶体金。
此外，术语“载体”还包括本领域技术人员公知的递药机制，包括但不限于钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和其它佐剂。还应当理解本发明超分子抗原构建体组合物能进一步包含佐剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂、稳定剂和现有技术已知的用于疫苗中的其它组分。本领域已知的任何佐剂系统能用于本发明的组合物。弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、多分散β-(1，4)连接的乙酰化甘露聚糖(“Acemannan”)、(CytRx公司的聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物佐剂)、Chiron公司的修饰脂质佐剂，Cambridge Biotech的皂角苷衍生物佐剂、杀死的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、大分子多聚阴离子如右旋糖苷硫酸盐以及无机凝胶如明矾、氢氧化铝或磷酸铝。
能用于本发明超分子抗原构建体组合物的载体蛋白包括但不限于：麦芽糖结合蛋白“MBP”；牛血清白蛋白(BSA)；钥孔血蓝蛋白(KLH)；卵清蛋白；鞭毛蛋白；甲状腺球蛋白；任何物种的血清白蛋白；任何物种的γ球蛋白；同系细胞；携带Ia抗原的同系细胞；以及D氨基酸和/或L氨基酸的聚合物。
此外，术语“有效量”是指向人或动物施用时引发免疫应答的抗原性/免疫原性组合物的量。本领域技术人员按照常规操作可容易地确定有效量。
例如，每个患者可肠胃外给予或口服约1.0μg到10.0mg范围的超分子抗原构建体组合物，然而此范围无意于限制。引发免疫应答所需的组合物的实际用量会随每位个体患者而变，取决于所给予的组合物的免疫原性和个体的免疫应答。因此，个体的具体给药量将根据常规实验并基于本领域技术人员的训练和经验而确定。
本发明的组合物用于产生针对抗原肽的抗体。向个体给予所得的抗体以使他们对多种疾病或紊乱产生被动免疫，包括但不限于：阿尔茨海默氏病、多药物抗性癌症或朊病毒疾病。
本发明的免疫原性组合物可包括脂质体，其通过在纯化的或部分纯化的或修饰的抗原肽的存在下重构脂质体而制成。此外，肽片段可重构为脂质体。本发明也包括经修饰以增强其抗原性的抗原肽片段。例如，抗原性部分和佐剂可与肽连接或混合。抗原性部分和佐剂的实例包括但不限于：亲脂性胞壁酰二肽衍生物、非离子嵌段共聚物、氢氧化铝或磷酸铝佐剂，以及它们的混合物。
本发明还涵盖用疏水性部分如棕榈酸修饰的抗原肽，这利于其插入到载体的疏水脂双层中。本发明的疏水部分可以是脂肪酸、甘油三酸酯和磷脂，其中脂肪酸碳骨架具有至少10个碳原子。最优选亲脂性部分具有至少约14个碳原子并长达约24个碳原子的碳骨架的脂肪酸。最优选疏水性部分具有至少14个碳原子的碳骨架。疏水性部分的例子包括但不限于：棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。最优选的疏水性部分是棕榈酸。
向人或动物给予本发明的超分子抗原构建体组合物，以诱导针对抗原试剂如传染性生物的免疫力。免疫的人或动物产生了抗传染性生物的循环抗体，由此降低或灭活了它刺激疾病的能力。
本发明的超分子抗原构建体组合物还用于生产特异于多种紊乱(例如包括阿尔茨海默氏病)的系列单克隆抗体或多克隆抗体。抗体用本领域技术人员熟知的方法制备。
通过任何合适的手段向人或动物给药本发明的组合物，优选注射。例如，脂质体中重构的修饰的抗原肽通过皮下注射给药。无论是内部产生还是由外部来源提供，循环抗体都结合抗原，降低或灭活抗原刺激疾病的能力。
能用于本发明组合物的脂质体包括本领域技术人员公知的那些。可以使用用于制备脂质体的任何标准脂质。标准的双层和多层脂质体可用于制备本发明的组合物。虽然可使用本领域技术人员已知的生产脂质体的任何方法，但是最优选的脂质体按照Alving等Infect.Immun.60：2438-2444，1992的方法制备，特此引用作为参考。脂质体任选地可含有佐剂。优选的佐剂是脱毒的脂质A，如单磷酰基脂质A或双磷酰基脂质A。
当囊泡(vesicles)为脂质体时，抗原肽形成时通常具有插入脂质体膜的疏水性尾巴。另外，可修饰抗原肽使其含有疏水性尾巴，以便能够插入脂质体之中。例如，抗原肽可通过化学连接或电插入暴露在先前形成的脂质体的表面。
文中提供的抗体是对传染性生物或代表诸如阿尔茨海默氏病、多药物抗性癌症和朊病毒疾病的多种紊乱的抗原肽有结合特异性的单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体通过用本发明的超分子抗原构建体组合物免疫动物如小鼠或兔制备。从免疫动物中收获脾细胞，通过融合致敏的脾细胞和骨髓瘤细胞系如鼠SP2/O骨髓瘤细胞(ATCC，Manassas，VA)而产生杂交瘤。通过加入聚乙二醇诱导细胞融合。通过将细胞涂布于含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT)的选择培养基上化学筛选杂交瘤。
随后对杂交瘤产生抗特点疾病或紊乱的单克隆抗体的能力进行筛选。克隆产生目的抗体的杂交瘤，扩增和冷冻保藏以备将来生产。优选的杂交瘤生产具有IgG同型的单克隆抗体，更优选IgG1同型。
多克隆抗体通过用上文所述本发明的超分子抗原构建体组合物免疫动物如小鼠或兔制备。随后从动物中收集血清，筛选血清中抗体对靶试剂的结合反应性。
单克隆抗体或多克隆抗体任一或两者均可用可检测标记直接标记，以鉴定如下文所述的生物样品中的靶试剂。用于免疫测定的标记通常是本领域技术人员已知的，包括酶、放射性同位素和荧光、化学发光以及发色物质，包括染色粒子，如胶体金和乳胶珠。抗体还可结合到固相载体上以利于在免疫测定中从未反应的组分中分离出抗体-抗原复合物。示例性的固相物质包括但不限于：微量滴定板、试管、磁珠、塑料珠或玻璃珠和载片。将抗体偶联到固相载体的方法是本领域技术人员熟知的。
可选地，抗体可通过与对免疫球蛋白有亲和力的标记物质(如A蛋白或G蛋白或二抗)发生反应而被间接标记。抗体可与第二物质缀合，并用对和抗体缀合的第二物质有亲和力的标记的第三物质检测。例如，抗体可与生物素缀合，并用标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测抗体-生物素缀合物。类似地，抗体可与半抗原缀合，并用标记的抗半抗原抗体检测抗体-半抗原缀合物。标记抗体和测定缀合物的这些方法和其它方法是本领域技术人员熟知的。
在优选的实施方案中，通过与已被可检测标记标记了的二抗的反应性来间接标记抗体。二抗优选是与获取单克隆抗体的动物的抗体结合的二抗。换句话说，如果单克隆抗体是小鼠抗体，则标记的二抗是抗小鼠抗体。对于待用于如下所述的检测中的单克隆抗体，标记优选抗体包埋珠，特别是磁珠。对于如此所述的免疫测定中使用的多克隆抗体，标记优选可检测分子，如放射性物质、荧光物质或电化学发光物质。
制剂
天然存在或合成的蛋白质、肽或蛋白质片段，其含有免疫原性蛋白质或肽的全部或活性部分，可制备成生理上可接受的剂型，如用已知的技术将其置于可药用载体之中。例如，蛋白质、肽或蛋白质片段与可药用赋形剂混合以形成治疗组合物。
可选地，可利用基因治疗技术以持续给药的载体递送含有免疫原性肽的全部或活性部分的蛋白质、肽或蛋白质片段的基因。载体可用对靶位点如肿瘤有特异性的赋形剂给药。
本发明的组合物可用固体、液体或气溶胶的形式施用。固体组合物的实例包括丸剂、霜剂和可植入剂量单位。丸剂可口服施用。治疗性霜剂可局部施用。可植入剂量单位可在例如肿瘤位点进行局部施用，或通过例如皮下植入进行治疗组合物的系统释放。液体组合物的实例包括适于肌内、皮下、静脉内、动脉内注射的制剂以及用于局部和眼内施用的制剂。气溶胶药物的实例包括用于肺部施用的吸入器制剂。
组合物可通过标准的给药途径施用。一般而言，该组合物可通过局部、口服、直肠、经鼻或肠胃外(例如静脉内、皮下或肌内)途径施用。此外，可将组合物掺入到持续释放基质如生物可降解聚合物中，所述聚合物被植入到期望递送部位(例如肿瘤位点)的附近。方法包括单剂量给药、预定时间间隔重复剂量给药和预定时间段持续给药。
如本文所用的持续释放基质是由这样的物质制成的，其通常为通过酶促或酸/碱水解或分解可降解的聚合物。一旦插入到体内，该基质受酶和体液的作用。期望持续释放基质从生物相容材料中选择，如脂质体、聚交酯(聚交酯酸)、聚羟基乙酸(乙醇酸聚合物)、聚交酯共羟基乙酸(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原质、软骨素硫酸盐、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、多聚氨基酸、氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅。优选的生物可降解基质是聚交酯、聚羟基乙酸或聚交酯共羟基乙酸(乳酸和乙醇酸的共聚物)之一的基质。
组合物的剂量取决于治疗的病情、使用的特定组合物和其它临床因素如患者的体重和状况以及给药途径。
组合物可与其它组合物和操作联合进行给药以治疗疾病。例如，治疗有害的细胞增殖可经外科、放射或化学疗法联合施用所述组合物进行常规治疗，随后可以向患者施用额外剂量的组合物以稳定和抑制任何残余的有害细胞增殖的生长。
超分子抗原构建体
本发明的超分子抗原构建体通常包括修饰的肽以增强抗原性作用，其中这样的肽通过聚乙二醇化(用聚乙二醇或修饰的聚乙二醇)修饰，或通过其它方法修饰，如棕榈酸、多聚氨基酸(例如多聚甘氨酸、多聚组氨酸)、多糖(聚半乳糖醛酸、聚乳酸、聚羟基乙酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖)、合成聚合物(聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚酯)或共聚物(如，聚(甲基丙烯酸)和N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺)等。
在某些实施方案中，本发明的超分子抗原构建体含有这样的肽序列，其每个末端共价连接于一个聚乙二醇化的赖氨酸。PEG(聚乙二醇)链的长度可在8到150000上下变动。游离的PEG末端与一分子的磷脂酰乙醇胺共价连接(其中脂肪酸可以是：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等，或它们的组合)。超分子构建体可在包括磷脂和胆固醇的脂质体(不同摩尔比的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和胆固醇)中重构。可使用其它磷脂。脂质A使用的浓度是约40μg/pmol磷脂。
在某些实施方案中，超分子抗原构建体包含具有β淀粉样肽氨基酸序列的肽。所述肽也可包含完整的淀粉样β肽及其活性片段或与之相应。另外，用于本发明的肽还包括Aβ4-11(SEQ ID NO：2)、Aβ22-35(SEQ ID NO：3)、Aβ29-40(SEQ ID NO：4)和Aβ1-16(SEQ ID NO：5)及其活性片段。
在某些其它实施方案中，超分子1抗原构建体含有这样的肽序列，所述肽序列包含P170糖蛋白的胞外环1、4和6。在某些其它实施方案中，超分子1抗原构建体含有这样的肽序列，所述肽序列包含朊蛋白的氨基酸序列109-129。
本发明还包括针对脂质体中重构的超分子抗原构建体所产生的单克隆抗体，例如，其中肽序列包括来自淀粉样蛋白的氨基酸序列。另外，本发明也包括针对超分子抗原构建体所产生的单克隆抗体，其中肽序列是来自P-糖蛋白(P170)胞外环的一个或几个氨基酸序列。
本发明也包括针对超分子抗原构建体所产生的单克隆抗体，其中肽序列包括选自目的蛋白的氨基酸序列。例如，更具体地，本发明包括针对脂质体中重构的超分子抗原构建体所产生的单克隆抗体，其中肽序列是选自β淀粉样蛋白(4-10或1-8或8-16等)的氨基酸序列，其在人阿尔茨海默氏病的转基因小鼠中不会诱导脑出血。本发明还包括对抗原肽的构象特征敏感的单克隆抗体。在下面的实施例中提供了生产本发明抗体的具体流程和有关这样的抗体的特征描述的具体信息。
淀粉样蛋白
合成β淀粉样蛋白的七氨基酸序列：FRHDSGY(SEQ ID NO：1)。序列的每个末端共价连接一个赖氨酸(1)。在与上述序列连接之前，赖氨酸与聚乙二醇链(PEG，n＝8-2000)反应。一端与赖氨酸结合的聚乙二醇链共价连接一分子的二油烯基-磷脂酰胆碱乙醇胺(或任何脂肪酸-磷脂酰胆碱)，如(2)所述。
Figure A200580012587D00201
化学修饰的β淀粉样抗原
所述化学修饰的抗原随之在包括磷脂和胆固醇的脂质体中重构(3)。合适脂质体的实例包括但不限于：DOPG、DOPEA、Chol.(脂质A的浓度是40μg/μmol磷脂)。用化学修饰的淀粉样抗原重构脂质体的代表性的示意图如图2所示。
本发明的超分子抗原构建体比脂质体中重构的棕榈酰化抗原有巨大的优点。首先，长PEG链(n＝8-5000)显著地提高了肽序列的暴露和可及性。改善了抗原提呈并增强了所产生抗体的构象敏感性。本发明的另一个优点是可使用不同构象的肽序列。序列和脂质体表面之间距离的增加确保了表面不与序列相互作用，因为那样可能会影响肽序列的构象。所述构建体的抗原性也显著地高于脂质体中重构的棕榈酰化序列的抗原性。数周内小鼠获得了包括从1:5000到1:10000的高滴度抗体。此外，抗体对抗原的亲和性也显著地增加。在淀粉样序列FRHDSGY(SEQ ID NO：1)的情况下，用ip或iv注射所述构建体引发的抗体有效地溶解了Aβ1-40和Aβ1-42纤维，在体外保护PC12细胞抗Aβ1-40和Aβ1-42纤维诱导的细胞凋亡和代谢抑制(MTT减少)。
在本发明的一个实施方案中，使用了淀粉样蛋白的FRHDSGY(SEQID NO：1)序列，不过可替换为任何其它淀粉样蛋白序列。除了上述多克隆抗体的体外特性外，自所述构建体免疫小鼠获得的单克隆抗体还在人阿尔茨海默氏病APP[V717I]FVB转基因小鼠中表现出生物学活性。在这些小鼠中观察到显著水平的记忆恢复和好奇心觉醒。所述mAb在免疫的转基因小鼠脑中不会诱导出血。
虽然不希望受下面理论的束缚，基于抗淀粉样蛋白mAb(用本发明的方法生产的抗1-16序列mAb)相互作用的体外研究[主要是纤维溶解和CD光谱]，似乎抗体优先结合α-螺旋构象的β淀粉样蛋白。这从热力学角度解释了淀粉样纤维的溶解效应。既然抗体通过优先结合α-螺旋从如下平衡中除去了α-螺旋淀粉样蛋白，由此使得β-片层构象的β淀粉样蛋白经历构象转变、成为可溶性α-螺旋形式的量增加，以重建平衡。得到的化学剂量观察结果支持mAb直接影响构象平衡的观点：
Figure A200580012587D00211
正如Selkoe(2002)详述的那样，阿尔茨海默氏病似乎是突触故障。在疾病的早期阶段，记忆力丧失可能是源于这样的故障。例如，人们认为可溶性寡聚体Aβ1-40可能能够阻断突触。本发明方法产生的单克隆抗体结合可溶性寡聚体Aβ1-40。在存在和不存在抗体时测量突触的传导性允许在可溶性寡聚体存在时确定抗体对突触的作用。
本发明的发明人检测了用嵌入超分子抗原构建体的诸如Aβ4-11(SEQID NO：2)、Aβ22-35(SEQ ID NO：3)和Aβ29-40(SEQ ID NO：4)的表位得到的一些mAb的活性(见图5)。确定序列4-11为由棕榈酰化Aβ1-16抗原(SEQ ID NO：5)引发的mAb的表位。
按照本发明的方法，为了产生mAb，使用了新的经独特修饰的肽抗原：
残基22-35：EDVGSNKGAIIGLM(SEQ ID NO：3)
已经发现胞外结构域和跨膜(TM)结构域之间的连接是抑制性抗体(如Herceptin-Trastuzumab抗HER2/neu抗体)的靶点，而且在多跨膜TM蛋白中形成小分量抑制剂靶向的口袋(Dragic等，2000)。虽然不希望受下面理论的束缚，该序列很可能对Aβ1-42和Aβ1-40的寡聚化能力是至关重要的，因为它代表了极性区和疏水区之间的转变(其中术语“胞外序列”用于指Aβ1-42致淀粉样序列的胞外序列)。所述序列含有Aβ1-42和Aβ1-40的头两个GXXXGXXXG基序。GXXXG是疏水序列寡聚化的关键诱导剂(Russ和Engelmann，2000)。有趣地是，预测第一个GXXXG基序是在胞外，而接下来的两个位于膜中。虽然不希望受下面理论的束缚，以此类推，可认为Aβ肽的寡聚化由GXXXG基序特异性地触发。
残基29-40：GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO：4)
Aβ1-42和Aβ1-40的疏水序列含有GXXXGXXXGG基序，已发现其诱导疏水序列的强寡聚化(Eilers等，2002；Leeds等，2001；Lemmon等，1994；Russ和Engelmann，1999；Russ和Engelmann，2000；Smith和Bormann，1995)。这个基序被视为治疗方法的主要靶点；因为它必然在导致Aβ1-42和Aβ1-40的形成、寡聚化和积聚的治病过程中起着重要作用。在APP的完整序列中，如SREBP裂解所示，很可能该基序覆盖住需要解折叠以供γ-分泌酶加工的下游序列(Ye等，2000)。该序列先前没有被抗体鉴定为对淀粉样蛋白的寡聚化有重要作用。如这里所教导的，本发明的超分子修饰的(优选聚乙二醇化的)抗原具有更高的抗原性，而且由它们所引发的抗体具有更高的亲和性。除了Aβ1-16之外，本发明的超分子构建体还包括用于疫苗的以Aβ4-11(SEQ ID NO：2)、Aβ22-35(SEQ ID NO：3)和Aβ29-40(SEQID NO：4)为代表的肽。
在N-α位置对肽进行单聚乙二醇化的方法是已知且广泛使用的。遵循固相或肽移植方法的对中等大小肽的中间、N-末端或C-末端氨基酸残基进行位点特异性单聚乙二醇化也已有描述。然而，双聚乙二醇化肽的固相合成方法已经表明受到位阻效应的严重阻碍，且在本研究项目开始之际，尚无有关这些化合物有效合成方法的报道。此外，先前没有报道过用PEG和脂质部分共同在N-末端和C-末端进行位点特异性修饰以得到衍生肽。这里本发明人描述了合成这样的Aβ肽缀合物的新方法。
为了实现本发明，尝试了几种方法，大部分没有成功。例如，最初的合成方法集中于在树脂上将含有末端氨基基团的脂质-PEG缀合物移植到含有末端谷氨酸残基的侧链已保护的肽(Aβ4-11、Aβ1-16、Aβ22-35和Aβ29-40)上。在很多种反应条件下没有观察到偶联产物。如实施例2和图5所示，文中所述的超分子构建体通常利用Fmoc/tBu氨基酸侧链保护来合成。
用保护的肽合成N-末端和C-末端脂质-PEG β淀粉样抗原的新方法可适用于很多种肽序列，例如包括多药物抗性蛋白质P-糖蛋白。
为了试图评价这里所述的抗原肽的功效，用ELISA和解聚分析进行实验比较了PEG化抗原和棕榈酰化抗原的免疫原性(见实施例B和图7)。ELISA数据表明脂质体PEG-Aβ1-16比棕榈酰化Aβ1-16明显具有更高的免疫原性。此外，ALUM没有提高小鼠中PEG-Aβ1-16的免疫原性。PEG-Aβ4-11诱导的抗体应答比PEG-Aβ1-16要慢。
因此，总而言之，本发明提供了新的抗暴露不同淀粉样序列的超分子抗原的单克隆抗体。特别地，为了使两个聚乙二醇(n＝70)链与所选的淀粉样序列共价结合，设计了新颖独创的合成途径。在PEG链的游离末端，共价连接了磷脂酰乙醇胺。虽然不希望受下面理论的束缚，据信其功能在于锚定脂质体双层中的聚乙二醇化淀粉样序列。文中表明与棕榈酰化相比，聚乙二醇化增强了抗原的免疫原性。目前我们的实验室中正在进行亲和性研究、表位测定和这些单克隆抗体诱导的构象转变。本发明的独特修饰方法可应用于多种肽，而且能够最终在疾病和紊乱的治疗制剂和疫苗中使用，这包括但不限于：阿尔茨海默氏病、癌症和传染性疾病。
如本文所述，本发明的超分子抗原构建体包括经修饰以增强抗原性效应的肽，其中这样的肽通过聚乙二醇化(用聚乙二醇或修饰的聚乙二醇)修饰、或通过其它方法修饰，如棕榈酸、多聚氨基酸(例如多聚甘氨酸、多聚组氨酸)、多糖(聚半乳糖醛酸、聚乳酸、聚羟基乙酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖)、合成聚合物(聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚酯)或共聚物(聚(甲基丙烯酸)和N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺)等。对于诸如阿尔茨海默氏病的神经紊乱的治疗性干预，本发明包括淀粉样β肽的修饰。
癌细胞的多药物抗性1(MDR1)
癌细胞的多药物抗性1由P-糖蛋白(P170)的过表达引起，该糖蛋白是从癌细胞中喷射出很多种无关化疗剂的细胞膜泵。
用脂质体重构的棕榈酰化P170胞外序列免疫，在体外导致MDR1 L1210小鼠白血病细胞敏感性表型的恢复(3)。体内获得的进一步结果(Madoulet，Tosi，Nicolau等，2002)表明接种MDR癌细胞经历化疗的免疫小鼠存活半寿期有70％的增长。
这里本发明的发明人证明，按照本发明的方法构建的包括P170胞外序列1、4和6的抗原，可更为有效地产生抗体，在体内和体外很大程度地将MDR表型逆转为敏感性表型。
按照本发明的方法，合成对应于P170胞外环1、4和6的肽，然后在每个末端连接一个聚乙二醇化的赖氨酸，其依次在每个末端共价连接一分子的二油烯基磷脂酰乙醇胺。可使用任何脂肪酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或多不饱和脂肪酸。
在包括PC-PEA-PG-胆固醇(或任何其它磷脂和胆固醇组合)的脂质体中重构了3个构建体。脂质A的加入的浓度是40μg/μmol磷脂。肽:磷脂比为1:200(也可使用其它比例)。
聚乙二醇链的长度是可变的：肽序列越长，需要链中PEG分子的数目越高。对于所用的三个序列，PEG链的长度自10到5000上下变动。可使用其它链长度。图3提供了代表性的多重P170抗原的示意图。
IP接种抗原，随后每隔2周进行3次加强免疫，引发了高滴度的抗P170抗体(1:5000-1:10000)，能够在体内和体外阻断P170的泵运输活性。
朊病毒疾病
朊病毒引起神经退行性疾病，例如绵羊的瘙痒症、牛的牛海绵状脑病和人的克-雅氏病。该粒子唯一已知的成分是瘙痒症同工型蛋白，PrPSc。虽然朊病毒繁殖，但是没有证据表明它们含有核酸。PrPSc由非传染性的细胞蛋白PrPc通过翻译后加工衍生而来，该过程中发生了深刻的构象变化。
瘙痒蛋白PrPSc在神经元的退化中扮演重要角色，在疾病发展期间经历了以下三阶段的转变：(正常细胞同工型蛋白)PrPc-传染形式(瘙痒症同工型蛋白)PrPSc-蛋白PrP27-30。
在人类克-雅氏病(CJD)、库鲁病(Kuru)、格-施-沙综合症(GSS)、致命家族失眠病、绵羊和山羊的瘙痒症、貂的脑病和牛的牛海绵状脑病的发展期间，发生这样的级联事件。
细胞非毒性蛋白(PrPc)是一个主要在神经元中表达的分子量为33-35K的唾液酸糖蛋白。在以上提到的疾病中，PrPc转变为改变了的形式(PrPSc)，因对蛋白酶消化的相对抗性而有别于其正常同系物。PrPSc在感染动物和个体的中枢神经系统积聚，而它的蛋白酶抗性核心在细胞外聚集。发病机理的其它分子基础还不清楚。
有关蛋白片段的神经毒性得到了非常有意义的结果，其可能影响到理解相关脑病中发生神经细胞退化的机理。
在观察到阿尔茨海默氏病中负责淀粉样纤维和斑的胞外沉积的J-淀粉样片段有神经毒性的基础上，人们猜测相关脑病中神经元的死亡可能由于PrPSc和/或其降解产物的异常胞外聚集的毒性效应所致。
利用与PrPc不同片段同源的合成肽研究它们对初级海马神经元生存力的影响(图4)。
本发明人证实当初级鼠海马培养物长期接触微摩尔浓度的对应于由人PrPc cDNA推断的氨基酸序列的106-126位残基的肽时，神经元以浓度依赖性方式发生死亡(实施例1)。
如实施例1详述，发明人表明，PrP 106-126以剂量依赖性方式通过细胞凋亡诱导神经元死亡。在亚急性脑病如瘙痒症的末期，PrPSc在整个脑中的浓度比PrPc高10-20倍，这与表1列出的PrP 106-126的2个浓度的数据其非常惊人地相似。
其中，PrP 106-126诱导程序性细胞死亡的过程与睾丸抑制前列腺信使-2基因(TRPM-2)的诱导有关。虽然不知道相关脑病期间，在体内是否激活了细胞凋亡，但是在感染瘙痒症的仓鼠中TRPM-2 mRNA的表达增加了10倍。
这些数据似乎表明神经毒性机制可能负责相关脑病中神经元细胞的丧失，而且还与阿尔茨海默氏病相关。
用旨在检测和分析肽或蛋白与脂质双层的相互作用时形成的离子通道的模型系中研究了神经毒性的可能机制。
低PH有利于PrP 106-126形成离子通道，也使该肽由α-螺旋构象转变为R-片层构象。然而用Edman测序和质谱获得的PrPSc肽谱显示它的氨基酸序列和根据PrPc基因序列预测的氨基酸序列之间没有差异；没有发现可以区分PrPSc和PrPc的化学修饰；然而，傅立叶转换红外光谱和圆二色谱揭示PrPSc和PrPc之间存在显著的构象差异。
PrPc基本上是α-螺旋，很少有或者没有R-片层，而PrPSc具有高含量的β-片层，少有α-螺旋结构。
序列KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG(PrP106-126)(SEQ IDNO：6)不仅极为疏水，且在低pH值下也转换成β-片层构象。此外，它能在溶液中将其它的肽转换成β-片层构象。
基于这些结果和本发明人开发的技术，研制了抗病“疫苗”，在小鼠体内产生针对神经毒性PrP 106-126的强体液免疫应答和细胞免疫应答，然后用来自瘙痒症小鼠的脑抽提物对免疫小鼠进行攻击。
如前面的例子中那样，聚乙二醇化的赖氨酸共价连接在PrP 106-126序列的每个末端。PEG链的长度是12-4000。每个PEG链与一分子的磷脂酰乙醇胺相互偶联，并在PGPEA-胆固醇脂质体-脂质A中重构。
给小鼠注射这些超分子抗原构建体，引发生了强烈的体液免疫应答，产生的抗体对PrP106-126序列有高亲和力，其具有溶解效应。
应当理解前述内容仅仅涉及本发明的优选实施方案，可以做许多更改或变化而不偏离本发明的精神和如所附权利要求所述的本发明的范围。特此将通篇引用的文献全文并入作为参考。
实施例1
本发明人证实当初级鼠海马培养物长期接触微摩尔浓度的对应于由人PrPc cDNA推断的氨基酸序列的106-126位残基的肽时，神经元以浓度依赖性方式发生死亡。数据如表1所示。
表1
海马神经元为期9天的长期处理
 
肽 细胞死亡％20μm 80μm
PrP 106-126 18±8 100±8
PrP 57-64 0±5 3±4
PrP 89-106 5±2 2±6
PrP 106-114 0±3 12±6
PrP 127-135 3±6 15±9
PrP 127-147 1±7 18±7
随机的PrP 106-126 3±2 8±3
数据是6-10次测定的平均值±s.e.，并相对于PrP 106-126的毒性效应标准化(指定为100％应答)。
表1表明PrP 106-126以剂量依赖性方式通过细胞凋亡诱导神经元死亡。在亚急性脑病如瘙痒症的末期，PrPSc在整个脑中的浓度比PrPc高10-20倍，这与表1列出的PrP 106-126的2个浓度的数据非常惊人地相似。
其中，PrP 106-126诱导程序性细胞死亡的过程与睾丸抑制前列腺信使-2基因(TRPM-2)的诱导有关。虽然不知道相关脑病中，在体内是否激活了细胞凋亡，但是在感染瘙痒症的仓鼠中TRPM-2 mRNA的表达增加了10倍。
实施例2
制备超分子抗原构建体的方法
用标准的Fmoc/tBu氨基酸侧链保护独特性地合成本文所述的超分子构建体。以前没有报道过在C-末端和N-末端均用PEG-脂质部分修饰的肽。通常地，肽的聚乙二醇化产生区异构体混合物。这里本发明人展示了一种用部分保护肽将PEG-脂质缀合物位点特异性地连接到Aβ的C-末端和N-末端的方便的方法。
对那些含有内部Lys或His残基(4-11、1-16、22-35)的肽序列来说，向每个末端添加正交(orthogonally)保护的Lys(ivDde)。将附加的Gly加到C-末端以利于合成。用20％的DMF哌啶溶液除去Fmoc基团，用乙酸酐进行N-乙酰化。3％的DMF水合肼溶液选择性裂解ivDde基团一小时。2-氯三苯甲基树脂优于更广泛使用的Wang树脂，因为前者证明对肼解作用具有更高抗性。此外，2-氯三苯甲基树脂是极度酸敏感的，因而与Wang树脂不同，能够分离保护的肽。事实上，必须在液相中进行偶联反应，因为树脂上结合的肽与预活化的聚乙二醇化脂质试剂DSPE-PEG-SPA偶联不会产生任何偶联产物。因而在温和条件下(乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷，1:1:8，1h，室温)从树脂上选择性裂解得到了内部保护的肽(图5)。
在DMSO和过量的碱中，成功地完成了衍生自序列Aβ4-11(SEQ IDNO：2)、Aβ1-16(SEQ ID NO：4)和Aβ22-35(SEQ ID NO：3)的肽与DSPE-PEG-SPA的液相偶联(图6)。加入过量乙醇胺作用2h以猝灭反应，然后冻干溶液。用HPLC纯化(半制备性反相C4柱)得到50-70％纯度的N-末端和C-末端PEG-脂质缀合物，通过MALDI(基质辅助激光解吸)证实其身份。关于偶联反应是否易于进行，每个序列表现出相当大的差异，因而相应地调整条件(温度、DSPE-PEG-SPA的摩尔当量数和时间)。HPLC纯化证明从期望产物中极其出色地分离出过量的DSPE-PEG-SPA，然而，因为DSPE-PEG-SPA对柱没有亲和力，所以从期望产物中分离出单-PEG-脂质(N-末端和C-末端)肽产物经证明是困难的。试图用大小排阻层析分离这些产物经证实也是不成功的，大概是由于它们相对大的多分散性。尽管如此，本发明人用阳离子交换层析分离单偶联和双偶联产物，之后进行最后的侧链去保护。随后的肽侧链去保护和过量猝灭DSPE-PEG-SPA的分离使得能够以高得多的纯度分离期望缀合物。
实施例3
PEG化抗原和棕榈酸酰化抗原的免疫原性比较，ELISA以及解聚分析
脂质体抗原如上所述制备。序列PEG-Aβ1-16、PEG-Aβ4-11和PEG-Aβ22-35在含有单磷酰基脂质A(40mg/mM磷脂)、包括由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPEA)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和胆固醇(摩尔比0.9:0.1:0.1:0.7)制成的脂质体的结构中重构。
ELISA
利用该抗原和棕榈酰化的Aβ1-16以2周间隔免疫C57BL/6小鼠。每种抗原免疫10-12只动物。取加强免疫后5天的血清，用血清的几个稀释物进行ELISA。图7提供了不同抗原的免疫原性的对比结果。
ELISA数据表明脂质体PEG-Aβ1-16比棕榈酰化Aβ1-16明显具有更高的免疫原性。附加的ALUM没有提高小鼠中PEG-Aβ1-16的免疫原性。PEG-Aβ4-11诱导的抗体应答比PEG-Aβ1-16更慢。
解聚分析
来自脂质体PEG-Aβ4-11免疫小鼠的9份血清(1:100稀释)用于检测，其中预形成的Aβ1-42纤维与抗血清孵育。如(Nicolau等，2002)所述进行检测。
孵育24小时后，观察不同血清对Aβ1-42纤维的溶解(图8)。一些血清溶解了75％程度的纤维(来自小鼠5和6的血清)。这些小鼠的脾细胞用于生产单克隆抗体。
实施例4
溶解性分析
从两只棕榈酰化Aβ1-16/脂质体/脂质A免疫的动物中，从最近产生的分泌Aβ1-42特异性抗体的杂交瘤克隆中获得25份上清液。按照PNAS 2002，99，2332-2337描述的方法和流程通过溶解性分析进行测试。结果总结于图9。
发现5个杂交瘤克隆的上清液能够在体外溶解程度高达75％的β淀粉样纤维。选择两个最好的克隆15和27用于纯化单克隆抗体。它们作为阳性对照mAb用于体内进一步研究。
实施例5
用固态NMR光谱对Aβ1-42的β-折叠到α-螺旋的转变的研究
为了避免损失13C标记的氨基酸，通过Fmoc肽合成的Aβ1-42合成通过没有标记氨基酸的检测合成来证实。通过MALDI质谱证实获得的Aβ1-42肽的身份，可确立用反相柱HPLC的纯化操作和氨水缓冲的乙腈水梯度4。
在成功设置了淀粉样β肽的合成和纯化流程之后，接着合成了包含13C标记的12位缬氨酸(12val)和13C标记的10位酪氨酸(10tyr)的标记肽后。
利用标记的Aβ1-42通过在PBS缓冲液中于37℃孵育肽溶液一周产生纤维。冻干纤维的13C NMR光谱证实了β-片层结构，与已发表的结果一致。该纤维与Aβ1-16特异性抗体孵育2天后，没有表现出显著的13C光谱变化。首次NMR测量评估表明了二级结构的变化(图10)。
实施例6
超分子抗原构建体引发的抗体
mAb的制备：如(Nicolau等，2002，PNAS，99，2332-37)所述制备脂质体抗原。序列PEG-Aβ1-15、PEG-Aβ1-16、PEG-Aβ4-11、PEG-Aβ22-35和PEG-Aβ29-40在含单磷酰基脂质A(40mg/mM磷脂)、包含由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPEA)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和胆固醇(摩尔比0.9:0.1:0.1:0.7)制成的脂质体的结构中重构。利用这些抗原和棕榈酰化Aβ1-16以2周间隔免疫C57BL/6小鼠。每种抗原免疫10-12只动物。3-6次加强免疫后，选择具有治疗性滴度(1:5000稀释血清呈ELISA阳性)的小鼠用于融合。用来自小鼠脾脏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞系SP2-0进行融合。选择产生IgG的杂交瘤克隆，并通过ELISA检测其对Aβ1-42肽的特异性结合。
mAb的特征描述：利用解聚分析、NMR研究、QELS测量和SPR测量描述mAb的特征。mAb对预形成的淀粉样纤维表现出高达80％的解聚(表1)。观察到抗体诱导淀粉样蛋白β-片层向α-螺旋的转变(图11，12)。准弹性光散射(QELS)测量表明淀粉样纤维与单克隆抗体孵育产生了尺寸≤800nm的纤维(占所有纤维的40-60％)，而淀粉样蛋白自身仅得到非常大的聚合体(>4μm)。
表1
通过PEG-Aβ1-15、PEG-Aβ4-11和棕榈酸酰化Aβ1-16免疫获得的mAb
 
抗原 Mab/杂交瘤 解聚[％] 离解常数
PEG Aβ1-15 ET-1H6 75 nd
PEG Aβ1-15 ET-7E3 55 2 x 10-7
PEG Aβ4-11 EN-4H7 80 nd
PEG Aβ4-11 EN-9H2 35 nd
棕榈酸酰化Aβ1-16 EJ-1A9 55 8 x 10-8
棕榈酸酰化PEG Aβ1-16 EJ-7H3 60 7 x 10-8
棕榈酸酰化PEG Aβ1-16 AN9C-E4 60 nd
NMR研究：为了评估mAb对纤维的作用，将Aβ纤维溶液与抗体孵育12天。进行质子驱动自旋扩散测量(PDSD)以测量2维13C-13C相关光谱。图11-13提供了NMR数据和分析：NMR：淀粉样β肽纤维与EN4H7、ET1H6或AN9C-E4孵育前和孵育12天后的13C-13C相关光谱(A，B)。从相关光谱中提取的柱(D)和行(C)。光谱(-抗体)表示纯纤维的光谱，而(+抗体)表示mAb存在下的光谱。
冻干纤维的13C光谱使得能够进行共振分配。Val12和Tyr10的Cα和Cβ化学移位值证实了纯纤维的β-片层结构(图11)。12Val的Cα和Cβ核共振移位清楚地表明β-片层向α-螺旋的转变。而Tyr10的Cα和Cβ共振移位没有清楚地表明二级结构的转变。Tyr10共振的行为可通过Tyr10位于淀粉样纤维中Aβ肽的β片层区和环区之间的交界面处的模型来解释。
在第二个实验中，用EN4H7和ET1H6抗体与富含13C的纤维孵育12天(见表1)。孵育的纤维表现出12Val Cβ核的共振从32ppm到28ppm的移位，表明两抗体能使相当部分的肽从β片层向α螺旋转变(图12和13)。10Tyr的Cα和Cβ共振在有抗体时变得更广。这表明10Tyr位置转变成颇为非结构性的构象。
实施例7
ELISA中测试的PEG化抗原和棕榈酰化抗原的免疫原性的比较
ELISA数据表明脂质体PEG-Aβ1-16比棕榈酰化Aβ1-16有更强的免疫原性(图14)。额外的ALUM没有提高小鼠中PEG-Aβ1-16的免疫原性。例外是PEG-Aβ4-11诱导的抗体应答，要比PEG-Aβ1-16更慢。一般而言，聚乙二醇化的肽看起来比棕榈酰化的肽有更强的免疫原性(图14)。
实施例8
评价抗体功效的行为测试
为了评价本文所述方法，即通过使用包含经修饰的淀粉样肽(如聚乙二醇化的淀粉样肽)的超分子抗原构建体所引发的抗体的功效，治疗小鼠，然后用下文列出的行为测试进行评价。
莫里斯水迷宫
游泳池(直径1米的白色圆形容器)含有二氧化钛作为无味无毒的添加剂的20摄氏度的水以隐藏逃生平台(水平面下1厘米)。对每只小鼠的游泳进行录像和分析(Ethovision，Noldus information Technology，Wageningen，荷兰)。训练前，每只小鼠在平台顶上放置15秒。为了进行导航测试，连续三天内，三次试验分五批训练小鼠寻找隐藏的平台。每次试验包括最大限度为120秒的强迫游泳测试，接着休息60秒。测量每只小鼠寻找平台需要的时间。五次连续的试验产生了学习曲线。
在末次训练的24小时后，在移开平台的情况下，对每只动物进行探测试验。给予小鼠60秒的搜寻时间，测量象限搜寻时间和原始平台位置的穿越。
拒绝游泳和搜寻平台，而是等待试验者将其移出游泳池的小鼠，即所谓的“漂浮者”排除在分析之外。
开放空间
树脂玻璃的开放空间的盒子(52×52×40cm)用于测试，其具有黑色垂直壁和半透明底，盒子的下面放置一盏灯微光照明。通过计算机化系统分配不同的区域(Ethovision，Noldus information Technology，Wageningen，荷兰)：角落(9×9cm)，四边(离壁9cm)和开放空间的盒子的中心(43×43cm)。对每只小鼠录像并通过测量小鼠轨迹的距离(cm)、速率(cm/sec)，与边界(角落+边侧)相比在中央花费的持续时期/时间，以及穿越两区域之间的频率来分析其活动(Ethovision)。每只小鼠放置在盒子的中央，允许其探测盒子10分钟。每次实验之间，在引入新的小鼠前，清扫和干燥开放空间的盒子。
新目标识别测试
小鼠熟悉有黑色垂直壁和半透明底的树脂玻璃的开放空间盒子(52×52×40cm)1小时，盒子的下面放置一盏灯微光照明。第二天将动物放在相同的盒子内，进行10分钟的习得实验(acquisition trial)。在该试验期间，小鼠分别放置在有目标A(蓝色球或红色立方体，±4cm的相似尺寸)的开放空间，记录探测目标的频率(FreqA)(小鼠鼻子朝向目标的距离<1cm和主动朝目标方向嗅闻)。在3小时后进行10分钟的记忆力实验(第二次实验)，其中新的目标(目标B，红色立方体或蓝色球)和熟悉的目标(目标A)共同放置在开放空间中。记录动物探测两个目标的频率(FreqA和FreqB)。
识别指数(RI)定义为探索新目标的频率和探索两个目标的频率的比值[FreqB/(FreqA+FreqB)×100]，其用于衡量非空间记忆。习得试验中探测目标A的频率用于衡量好奇心。
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Claims (20)

1、包含超分子抗原构建体的组合物，
其中所述超分子抗原构建体含有抗原肽或其活性片段，
并且其中所述抗原肽或其活性片段被修饰以增强抗原性。
2、权利要求1的组合物，其中所述抗原肽或其活性片段利用聚乙二醇或修饰的聚乙二醇通过聚乙二醇化修饰。
3、权利要求1的组合物，抗原肽或其活性片段通过棕榈酸、多聚氨基酸、多聚甘氨酸、多聚组氨酸、多糖、聚半乳糖醛酸、聚乳酸、聚羟基乙酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、合成聚合物、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚酯、共聚物或聚(甲基丙烯酸)和N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺修饰。
4、权利要求1的组合物，其中超分子抗原构建体含有：
肽序列，其每个末端共价连接于一个聚乙二醇化的赖氨酸；
其中游离的PEG末端与一分子的磷脂酰乙醇胺共价连接。
5、权利要求1的组合物，其中抗原构建体在由磷脂和胆固醇组成的脂质体中重构。
6、权利要求1的组合物，其中抗原肽包括淀粉样肽。
7、权利要求6的组合物，其中淀粉样肽包括SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。
8、权利要求1的组合物，还包括药用载体。
9、权利要求1的组合物，其中超分子抗原构建体可用于治疗包括阿尔茨海默氏病、癌细胞的多药物抗性或朊病毒疾病的紊乱。
10、诱导免疫应答的方法，包括施用超分子抗原构建体，
其中超分子抗原构建体含有抗原肽或其活性片段，
其中所述抗原肽或其活性片段被修饰以增强抗原性。
11、权利要求10的方法，其中所述抗原肽或其活性片段用聚乙二醇或修饰的聚乙二醇通过聚乙二醇化修饰。
12、权利要求10的方法，其中所述抗原肽或其活性片段通过棕榈酸、多聚氨基酸、多聚甘氨酸、多聚组氨酸、多糖、聚半乳糖醛酸、聚乳酸、聚羟基乙酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、合成聚合物、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚酯、共聚物或聚(甲基丙烯酸)和N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺修饰。
13、权利要求10的方法，其中超分子抗原构建体含有：
肽序列，其每个末端共价连接于一个聚乙二醇化的赖氨酸；
其中游离的PEG末端与一分子的磷脂酰乙醇胺共价连接。
14、权利要求10的方法，其中超分子抗原构建体在由磷脂和胆固醇组成的脂质体中重构。
15、权利要求10的方法，其中抗原肽包括淀粉样肽。
16、权利要求10的方法，其中淀粉样肽包括SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。
17、权利要求10的方法，还包括药用载体。
18、权利要求10的方法，其中超分子抗原构建体可用于治疗包括阿尔茨海默氏病、癌细胞的多药物抗性或朊病毒疾病的紊乱。
19、治疗阿尔茨海默氏病的方法，包括施用超分子抗原构建体，
其中超分子抗原构建体含有抗原肽或其活性片段，
其中所述抗原肽或其活性片段被修饰以增强抗原性。
20、权利要求19的方法，其中所述抗原肽或其活性片段通过聚乙二醇化、棕榈酸、多聚氨基酸、多聚甘氨酸、多聚组氨酸、多糖、聚半乳糖醛酸、聚乳酸、聚羟基乙酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、合成聚合物、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚酯、共聚物或聚(甲基丙烯酸)和N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺修饰。
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