ES2337226B2 - Sistemas lipidicos funcionalizados con vinilsulfonas. sintesis y usos. - Google Patents
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- C07C323/65—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and sulfur atoms, not being part of thio groups, bound to the same carbon skeleton containing sulfur atoms of sulfone or sulfoxide groups bound to the carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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Abstract
Sistemas lipídicos funcionalizados con
vinilsulfonas. Síntesis y usos.
Compuesto que comprende una molécula de
naturaleza lipídica y un grupo vinilsulfona que permite llevar a
cabo la lipidación de biomoléculas de una forma altamente eficaz y
sencilla. La invención también se refiere a sus procedimientos de
obtención y a sus usos. Más concretamente se refiere al uso de estos
compuestos en el desarrollo de dos nuevas aplicaciones de los ISCOMs
basadas en la capacidad de nanoencapsulación y la incorporación de
anticuerpos a la membrana de los mismos: a) Su empleo en
inmunomarcaje fluorescente; b) Desarrollo de sistemas para el
transporte dirigido de fármacos.
Description
Sistemas lipídicos funcionalizados con
vinilsulfonas. Síntesis y usos.
La presente invención se refiere a un nuevo
compuesto de fórmula general (I) que comprende una molécula de
naturaleza lipídica y un grupo vinilsulfona que permite llevar a
cabo la lipidación de biomoléculas de una forma altamente eficaz y
sencilla. La presente invención también se refiere a sus
procedimientos de obtención y a sus usos. Más particularmente se
refiere al uso de estos compuestos en el desarrollo de dos nuevas
aplicaciones de los ISCOMs basadas en la capacidad de
nanoencapsulación y la incorporación de anticuerpos a la membrana de
los mismos: a) Su empleo en inmunomarcaje fluorescente; b)
Desarrollo de sistemas para el transporte dirigido de fármacos.
Tras el gran desarrollo de la genómica y la
proteómica, la lipidómica (Wenk, M. R. Nature Reviews Drug
Discovery (2005), vol. 4 (7), pp 594-610.) ha
surgido como un nuevo campo de investigación que avanza rápidamente
y que tiene una gran importancia ya que, al igual que los genes y
las proteínas, los lípidos también desempeñan funciones cruciales en
las células. La lipidómica se dedica al estudio y caracterización
del conjunto de las especies lipídicas celulares, las moléculas y
macromoléculas con las que interactúan y sus funciones
biológicas.
A diferencia de lo que ocurre con otro tipo de
biomoléculas, los lípidos no se definen mediante una característica
estructural común sino por un comportamiento
físico-químico: su insolubilidad en agua.
Clásicamente se ha considerado que los lípidos cumplen dos funciones
generales, una estructural, en las biomembranas, y como reserva
energética. Sin embargo, los avances tecnológicos han puesto de
manifiesto la existencia de miles de especies lipídicas diferentes
en el cuerpo humano sugiriendo la existencia de funciones aún no
exploradas como son la señalización celular, el direccionamiento de
proteínas hacia su destino celular, el anclaje de proteínas a
membranas y la entrada de toxinas, virus y bacterias. Así por
ejemplo, los lípidos de membrana, a través de sus interacciones con
las proteínas integrales o asociadas a membrana modulan la función
de éstas, su anclaje y tráfico. De hecho, existen enfermedades
asociadas a un balance defectuoso de lípidos como la aterosclerosis,
la obesidad, la diabetes y la enfermedad de Alzheimer.
Los principales objetivos de la lipidómica
son:
- -
- Nuevas aproximaciones analíticas para la caracterización del lipidoma.
- -
- Aplicación de métodos biofísicos para el estudio de las interacciones lípido-proteína principalmente en los micro- y nanodominios de las membranas biológicas. Para este tipo de estudios es necesaria, entre otras cosas, la síntesis de lípidos específicos, análogos y sondas.
- -
- Identificación de la red lipídica, incluyendo los mediadores lipídicos para la regulación metabólica y génica y su integración en sistemas de señalización no lipídicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de las proteínas no está únicamente
controlada por la velocidad de síntesis y degradación sino también
por procesos específicos y selectivos de modificación covalente o
modificación post-transduccional que modulan
interacciones moleculares, localización de proteínas y estabilidad.
De las diferentes modificaciones
post-transduccionales que pueden sufrir las
proteínas una de ellas es la lipidación, siendo la más relevante la
acilación con ácidos grasos. La acilación de proteínas con ácidos
grasos implica principalmente a dos de ellos el palmítico y el
mirístico. La unión a las proteínas puede darse a través de la
formación de distintos tipos de enlaces:
- -
- Formación de un enlace amida con un residuo de glicina N-terminal, o con el grupo \varepsilon-amino de las lisinas.
- -
- Formación de un enlace tioéster con un residuo de cisteína a través de una S-acilación.
- -
- Formación de un enlace éster con residuos de serina o treonina.
\vskip1.000000\baselineskip
La incorporación de ácidos grasos a la
estructura de las proteínas facilita la interacción de éstas con las
membranas así como su transporte a través de las mismas. Además,
modula ciertas interacciones proteína-proteína y
diversos procesos de señalización. Debido al gran número de
mecanismos celulares en los que las proteínas modificadas con grupos
de naturaleza lipídica se encuentran implicadas, tiene un gran
interés el estudio físico-químico de este tipo de
proteínas y de las interacciones en las que intervienen
(proteína-proteína y
proteína-membrana). La purificación de péptidos y
proteínas modificadas con grupos lipídicos no es sencilla debido a
su baja concentración celular y a la solubilidad de las mismas. Una
posible alternativa consiste en la acilación química de proteínas
para su posterior utilización en este tipo de estudios (Draper, J.
M. et al. Journal of Lipid Research (2007), vol. 48 (8), pp
1873-1884).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Sin embargo, la acilación de proteínas presenta
muchas otras aplicaciones. Así por ejemplo, se ha observado que
aunque la modificación con ácidos grasos de péptidos antimicrobianos
es bastante rara la obtención de conjugados sintéticos mejora esta
actividad (Chu-Kung, A. F. et al. Bioconjugate
Chemistry (2004), vol. 15 (3), pp 530-535). Los
lipopéptidos pueden ser utilizados también en el etiquetado de
receptores intracelulares (Thiam, K. et al. Journal of Medicinal
Chemistry (1999), vol.42 (18), pp 3732-3736) y
en el desarrollo de vacunas sintéticas (Deprez, B. et al.
Vaccine 1996, vol. 14 (5), pp 375-382).
El empleo de proteínas o péptidos terapéuticos
para el tratamiento de ciertas enfermedades presenta una enorme
importancia en farmacología y biotecnología, además, tiene un gran
potencial debido a su elevada especificidad. Sin embargo, su
aplicación clínica está limitada, entre otros motivos, por su baja
permeabilidad a través de membranas biológicas debido al carácter
hidrofílico de estas proteínas. La modificación de péptidos y
proteínas con grupos hidrofóbicos, como los ácidos grasos,
constituye hoy día una de las posibilidades para aumentar su
transporte a través de membranas biológicas (Kocevar, N. et al.
Chemical Biology & Drug Design (2007), vol. 69 (2), pp
124-131). Mediante esta metodología no sólo se
mejora la capacidad de las proteínas para interaccionar con las
membranas sino que, además, se mantiene la actividad biológica de
las mismas. De hecho, esta es una de las metodologías que se utiliza
para el transporte de agentes terapéuticos hasta el sistema nervioso
central a través de la barrera hematoencefálica (Kabanov, A. V.
et al. Current Pharmaceutical Design (2004), vol. 10 (12), pp
1355-1363) para el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas.
Los sistemas proteína-lípido van
más allá. La incorporación de proteínas a liposomas está adquiriendo
día a día un mayor interés debido, fundamentalmente, a dos
razones:
- -
- Estudios de procesos en membranas. El estudio de interacciones proteína-liposoma puede contribuir a entender los procesos que tienen lugar en las membranas naturales.
- -
- Dirección de fármacos. La unión de ciertas proteínas a liposomas puede ayudar a crear sistemas de dirección de fármacos.
\vskip1.000000\baselineskip
La incorporación de péptidos y proteínas a
liposomas se puede llevar a cabo mediante dos estrategias
diferentes: a través de la inclusión de proteínas en el liposoma
durante la formación del mismo o mediante la unión de la proteína a
la bicapa lipídica del liposoma. En esta última opción es necesario
que la proteína contenga una región hidrofóbica para que se
establezca la asociación y para ello, en muchas ocasiones, se ha
llevado a cabo la incorporación química de ácidos grasos mediante
unión covalente sobre la estructura de la proteína.
En terapia génica, la incorporación in
vivo de material genético en el interior de células somáticas
constituye la metodología ideal. De hecho, la incorporación de
material genético en cultivos de células eucariotas es una técnica
estándar de gran importancia para el desarrollo de la Biología
Molecular moderna. Los vectores víricos, como los retrovirus o los
adenovirus, son muy efectivos pero llevan asociados problemas de
toxicidad e inmunogenicidad. Una alternativa es el empleo de métodos
no virales entre los cuales los liposomas catiónicos parecen muy
prometedores, de hecho ya se están empleando para llevar a cabo
transfecciones en cultivos celulares. Sin embargo, los polímeros con
cargas positivas, como la
poli-L-lisina (PLL) o la
polietilenimina (PEI), constituyen una alternativa muy atractiva ya
que son capaces de unirse al ADN y facilitar su entrada a la célula.
La incorporación de unidades hidrofóbicas a estos polímeros, como
son los ácidos grasos, mejora la eficiencia de los procesos de
transfección (Han, S. O. et al. Bioconjugate Chemistry
(2001), vol. 12 (3), pp 337-345).
Para la modificación química de proteínas con
grupos hidrofóbicos o la incorporación de éstos a polímeros
catiónicos se pueden utilizar diversas metodologías. Así por
ejemplo, se puede llevar a cabo la reacción de los grupos amino de
las proteínas o los polímeros con cloruros de ácido (Kocevar, N.
et al. Chemical Biology & Drug Design (2007), vol. 69
(2), pp 124-131) o anhídridos (Pato, C. et al.
Journal of Protein Chemistry (2002), vol. 21 (3), pp
195-201) dando lugar a la formación de enlaces
amida. También es posible conseguir esta unión mediante el empleo de
ésteres activados (Abbasi, M. et al. Biomacromolecules
(2007). vol. 8 (4), pp 1059-1063). Otros métodos que
se han utilizado han sido las modificaciones quimioselectivas
(Bonnet, D. et al. Tetrahedron Letters (2000), vol. 41 (1),
pp 45-48) o el empleo de la
"click-chemistry" (Musiol, H. J. et
al. Chembiochem (20051 vol. 6 (4), pp
625-628).
Uno de los problemas que presenta este tipo de
modificaciones es la insolubilidad de los agentes acilantes en
disoluciones acuosas. Para solucionar este problema algunos autores
han propuesto el empleo de miscelas reversibles (Michel, F. et
al. Langmuir (1994), vol. 10 (2), pp 390-394)
como microreactores o han desarrollado agentes acilantes solubles en
agua (Ekrami, H. M. et al. Febs Letters (1995), vol. 371 (3),
pp 283-286).
El acrónimo ISCOMs (Barr, I. G. et al.
Immunology and Cell Biology (1996), vol. 74 (1), pp
8-25)("immunostimulating complex")
deriva de la capacidad que estas partículas presentan para actuar
como complejos inmunoestimuladores cuando se utilizan en vacunas
para animales. Las investigaciones de este tipo de sistemas explotan
su capacidad para actuar como adyuvante (compuestos que actúan de
manera no específica para incrementar la inmunidad frente a un
antígeno).
\global\parskip1.000000\baselineskip
En bibliografía se describen dos tipos de ISCOMs
que difieren en su composición:
- -
- ISCOM clásico, constituido por saponina, colesterol, fosfolípidos y proteínas.
- -
- ISCOM básico, también denominado ISCOM matrix, formado únicamente por saponina, colesterol y fosfolípidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La base de la arquitectura de los ISCOMs son las
interacciones que se establecen entre la saponina y el colesterol.
Desde un punto de vista estructural son partículas esféricas, huecas
y con forma de caja, con un tamaño heterogéneo en torno a los 40 nm
de diámetro y con carga negativa. Cada ISCOM está constituido por 20
o más subunidades globulares ensambladas en un dodecaedro
pentagonal, y una vez formados son tremendamente estables.
Los ISCOMs pueden ser preparados por diversos
procedimientos, muchos de los cuales son adaptaciones de los métodos
de preparación de liposomas. Hasta la fecha se han descrito en
bibliografía cinco métodos diferentes: diálisis, centrifugación,
hidratación de película lipídica, inyección de etanol e inyección de
éter. De todos ellos los más extendidos son el de diálisis y el de
centrifugación debido a su simplicidad y mayor facilidad para su
escalado.
Para la incorporación de proteínas a un liposoma
se dispone de dos estrategias diferentes. Sin embargo, en el caso de
los ISCOMs el atrapamiento de proteínas no es posible debido al
pequeño tamaño y volumen interno de los mismos. Por lo tanto, para
conseguir la incorporación de proteínas a su estructura es necesario
que éstas estén provistas de una región hidrofóbica y una de las
alternativas existentes es la modificación química de la proteína
con grupos de naturaleza lipídica.
Las aplicaciones de los ISCOMs se han centrado,
sobre todo, en su empleo en vacunas (Sanders, M. T. et al.
Immunology and Cell Biology (2005), vol. 83 (2), pp
119-128). La incorporación de antígenos a la
estructura del ISCOM conduce a la obtención de una respuesta inmune
mayor, posiblemente debido a la suma del efecto del anticuerpo y a
la inmunoestimulación que produce la saponina. Sin embargo, también
han encontrado aplicación como sistemas de vehiculización de
anfotericina B y otros fármacos de naturaleza lipídica (Morein, B.
et al. Proceedings of the International Symposium on Controlled
Release of Bioactive Materials (1997), 24th, 118). Además, se
han utilizado como antígenos en inmunoensayos (Bjorkman, C. et
al. Parasite Immunology (1994), vol. 16 (12), pp
643-648).
En la presente invención se proporciona un nuevo
compuesto de fórmula general (I) que comprende una molécula de
naturaleza lipídica y un grupo vinilsulfona que permite llevar a
cabo la lipidación de biomoléculas de una forma altamente eficaz y
sencilla. Estos compuestos constituyen una alternativa a las
derivatizaciones empleadas en lipidómica para la incorporación de
restos lipídicos en biomoléculas. Además, se proporciona el empleo
de estos compuestos en el desarrollo de dos nuevas aplicaciones de
los ISCOMs basadas en su capacidad de nanoencapsulación y la
incorporación de anticuerpos a la membrana de los ISCOMs: a) Su
empleo en inmunomarcaje fluorescente; b) Desarrollo de sistemas para
el transporte dirigido de fármacos.
Por tanto, un primer aspecto de la presente
invención se refiere a los compuestos de fórmula general (I) (a
partir de ahora compuestos de la invención):
donde:
Y es un grupo
-CH_{2}-SO_{2}R^{1}- o -CH_{2}-;
preferiblemente Y es -CH_{2}-
R^{1} es un radical seleccionado del grupo que
comprende un alquilo (C_{1}-C_{10}), un
alquenilo (C_{1}-C_{10}), un alquinilo
(C_{1}-C_{10}), un dialquilarilo
(C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10})
o un grupo (CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2};
preferentemente R^{1} es un grupo
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2};
n toma valores de 1 a 20; preferiblemente n toma
valores de entre 2 a 10, más preferidamente n es de 2 a 5 y aún más
preferiblemente n es 2.
X es un grupo
-CO-NH-R^{2}-Z-CH_{2}-,
-Z-CH_{2}- o -CH_{2}-;
Z es S ó O;
R^{2} es un radical seleccionado del grupo que
comprende un alquilo (C_{1}-C_{10}), un
alquenilo (C_{1}-C_{10}), un alquinilo
(C_{1}-C_{10}), un dialquilarilo
(C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10})
ó un grupo (CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2};
m toma valores de 1 a 20; preferiblemente m toma
valores de entre 2 a 10, más preferidamente m es de 2 a 5 y aún más
preferiblemente m es 2; y representa un lípido.
\vskip1.000000\baselineskip
Por "lípido" se entiende en la presente
invención a una molécula de naturaleza apolar, como por ejemplo,
hidrocarburos saturados o insaturados, como por ejemplo pero sin
limitarse a grupos alquilos (C_{1}-C_{30}),
alquenos (C_{2}-C_{30}), alquinos
(C_{2}-C_{30}) o esteróles. La mayoría de este
tipo de moléculas son biomoléculas, compuestas principalmente por
carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, aunque también pueden
contener fósforo, azufre y nitrógeno, que tienen como característica
principal el ser hidrofóbicas o insolubles en agua y sí en
disolventes orgánicos. Preferiblemente, el lípido es un esteral o un
hidrocarburo alifático saturado o insaturado.
Por "hidrocarburo alifático" se refiere, en
la presente invención, a moléculas orgánicas constituidas por
carbono e hidrógeno, en los cuales los átomos de carbono forman
cadenas lineales o ramificadas, saturadas o insaturada. Es decir,
que pueden ser, tanto grupos alquilo (saturados) como alquenilos o
alquinilos (insaturados). Preferiblemente el lípido se puede
seleccionar de entre un hidrocarburo
(C_{4}-C_{30}), saturado o insaturado. Y más
preferiblemente el número de carbono es de entre 10 y 20.
Por "esteral" se refiere en la presente
invención a esferoides con 27 a 29 átomos de carbono. Su estructura
química deriva del ciclopentanoperhidrofenantreno o esterano, una
molécula de 17 carbonos formada por tres anillos hexagonales y uno
pentagonal. Se puede seleccionar de la lista que comprende, pero sin
limitarse a colesterol, epicolesterol, estigmasterol, lanosterol,
ergosterol y coprostenol. Más preferiblemente el esteral es
colesterol.
Por "alquilo" se refiere en la presente
invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, por ejemplo,
metilo, etilo, n-propilo, i-propilo,
n-butilo, t-butilo,
n-pentilo, etc. Cuando nos referimos a lípidos
serían cadenas alifáticas que tienen de 1 a 30 átomos de carbonos,
más preferiblemente de 4 a 30 átomos de carbono y aún más
preferiblemente de 10 a 20 átomos de carbono. Cuando nos referimos
al grupo R^{2}, independientemente, preferiblemente serían cadenas
alifáticas que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, más
preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono y aún más preferiblemente
es un etilo.
Por "alquenilo" se refiere en la presente
invención a un radical alquilo, descrito anteriormente, y que tiene
uno o más enlaces insaturados, concretamente tiene al menos un
enlace doble, aunque también puede tener al menos un enlace triple.
Los radicales alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos por
uno o más sustituyentes tales como un arilo, halógeno, hidroxilo,
alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo,
nitro, etc.
Por "alquinilo" se refiere en la presente
invención a un radical alquilo, descrito anteriormente, y que tiene
uno o más enlaces insaturados, concretamente tiene al menos un
enlace triple, aunque también puede tener al menos un enlace doble.
Los radicales alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos por
uno o más sustituyentes tales como un arilo, halógeno, hidroxilo,
alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo,
nitro, etc.
Por "dialquilarilo" se entiende en la
presente invención a un grupo arilo que está sustituido con dos
grupos alquilo, alquenilo o alquinilo que tienen de 1 a 10 átomos de
carbono, más preferiblemente tienen de 1 a 5 átomos de carbono. Los
grupos alquilo, alquenilo o alquinilo pueden ser iguales o
diferentes, preferiblemente son iguales. Y por "arilo" se
entiende en la presente invención a un sistema aromático o
heteroaromático que tienen de 6 a 12 átomos de carbono o algún otro
átomo, como por ejemplo O, N, S, etc..., pueden ser de anillo único
ó múltiple, separado y/o condensado. Los grupos arilo típicos
contiene de 1 a 3 anillos separados o condensados y desde 6 hasta 10
aproximadamente 18 átomos de carbono de anillo, tales como radicales
fenilo, naftilo, indenilo, fenantrilo o antracilo.
Cuando X es un grupo
-CO-NH-R^{2}-Z-CH_{2}-
los compuestos de la invención tienen la fórmula general (II):
\vskip1.000000\baselineskip
donde: R^{2}, Z, Y y
5 , están definidos
anteriormente.
\newpage
Cuando X es un grupo
-Z-CH_{2}- los compuestos de la invención tienen
la fórmula general (III):
donde: Z, Y y 7 ,
están definidos
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto de la invención sería de fórmula
general (I), excepto el compuesto
1-(vinilsulfonil)octadecano, es decir, cuando el lípido es un
hexadecanilo, X e Y no pueden ser -CH_{2}-. En una realización
preferida, el compuesto de la invención se selecciona de la lista
que comprende:
N-(2-(2-(vinilsulfonil)etil-tio)etil)oleamida,
N-(2-(2-(vinilsulfonil)etoxi)etil)oleamida,
N-(2-(2-(vinilsulfonil)etoxi)etil)estearamida,
N-(2-(2-(vinilsulfonil)etoxi)etil)dodecanamida,
3-(2-(vinilsulfonil)etoxi)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-
il)-1 H-ciclopenta[a]fenantreno, y
il)-1 H-ciclopenta[a]fenantreno, y
(Z)-1-(vinilsulfonil)octadec-9-eno.
\vskip1.000000\baselineskip
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a un método de obtención de los compuestos de la invención
de fórmula general (II) y (III) y que comprende:
Para el caso de los compuestos de fórmula
general (II):
- a)
- La reacción de un cloruro de ácido de fórmula general (IV):
- donde
9 se ha definido anteriormente.
- -
- con una amina de fórmula general H_{2}N-R^{2}-ZH o una diamina de fórmula general H_{2}N-R^{2}-S-S-R^{2}-NH_{2} donde Z y R^{2} están definidos anteriormente.
- Dependiendo del tipo de amina que se utilice en la reacción de este paso (a) se obtendrá un compuesto de fórmula (V) o un compuesto de fórmula (VI), representados mediante los siguientes esquemas:
- donde: Z,
R^{2} y
12 , están definidos anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
- b)
- cuando tiene lugar la reacción en la que se forma el compuesto de fórmula (VI), sería necesaria la reducción del puente disulfuro del compuesto de fórmula general (VI) que conduce al compuesto de fórmula general (VII), que es mismo que el compuesto (V) cuando Z es S.
\vskip1.000000\baselineskip
- c)
- reacción de un compuesto de fórmula general (V), incluido el compuesto de fórmula general (VII), con una bis-vinilsulfona de fórmula general (VIII):
- donde: Z, Y y
15 , están definidos anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la presente
invención la bis-vinilsulfona es la divinilsulfona
DVS (es decir, Y es -CH_{2}-).
Para el caso de los compuestos de fórmula
general (III), el método de obtención de los compuestos de la
invención comprende hacer reaccionar:
- -
- un compuesto de fórmula general (IX) con una bis-vinilsulfona de fórmula (VIII):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- donde: Z, Y y
17 , están definidos anteriormente.
\newpage
En una realización preferida de la presente
invención la bis-vinilsulfona es la divinilsulfona
DVS (es decir, Y es -CH_{2}-).
Los agentes de lipidación conteniendo
vinilsulfonas (compuestos de fórmula general (I)) pueden ser ligados
a cualquier biomolécula que contenga grupos funcionales
complementarios (como por ejemplo, los grupos amino, tioles e
imidazoles) presentes en las mismas de forma natural o artificial a
través de una reacción de adición tipo Michael. Además, los
compuestos son compatibles con la naturaleza biológica de las
biomoléculas y la reacción de lipidación no requiere ninguna
estrategia de activación.
El uso de la vinilsulfona como derivatización de
los reactivos de lipidación para llevar a cabo la unión covalente
biomolécula-compuesto de la invención, formando lo
que llamamos bioconjugado covalente, presenta las siguientes
ventajas:
- a)
- Estabilidad de los agentes de etiquetado.
- b)
- Formación de una unión covalente estable.
- c)
- La reacción es rápida y con altos rendimientos no generándose ningún tipo de subproducto.
- d)
- Las reacciones pueden llevarse a cabo bajo condiciones fisiológicas, medio acuoso, rango de pH estrecho, temperaturas suaves.
- e)
- Procesos de purificación y aislamiento sencillos.
- f)
- Existe una tolerancia hacia los otros grupos funcionales presentes en las biomoléculas distintos a los grupos amino, tioles e imidazoles con los que reaccionan las vinilsulfonas.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I) como agente
de lipidación de moléculas, y más preferiblemente de
biomoléculas.
\vskip1.000000\baselineskip
donde: Z, Y y 19 ,
están definidos
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, los compuestos de
fórmula (I) que se utilizan como agentes de lipidación de moléculas
se pueden seleccionar de la lista que comprende:
N-(2-(2-(vinilsulfonil)etil-tio)etil)oleamida,
N-(2-(2-(vinilsulfonil)etoxi)etil)oleamida,
N-(2-(2-(vinilsulfonil)etoxi)etil)estearamida,
N-(2-(2-(vinilsulfonil)etoxi)etil)dodecanamida,
3-(2-(vinilsulfonil)etoxi)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-
il)-1 H-ciclopenta[a]fenantreno,
il)-1 H-ciclopenta[a]fenantreno,
(Z)-1-(vinilsulfonil)octadec-9-eno,
y
1-(vinilsulfonil)octadecano.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la presente
invención, las biomoléculas seleccionas son proteínas. En una
realización aún mas preferida de la presente invención, la proteína
seleccionada es la proteína A (polipétido de 42 kDa constituyente
habitual de la pared de Staphilococcus aureus que posee
afinidad por los anticuerpos a través de la porción Fe) o la
proteína G (polipétptido de entre 30000 y 35000 Daltons aislado de
la pared celular del estreptococo beta-hemolítico
de las cepas C o G. Al igual que la proteína A posee afinidad por
anticuerpos).
En una realización preferida de la presente
invención la lipidación de proteínas, o de las moléculas en general,
se realiza en una solución de las mismas en un tampón que no
contenga aminas libres como por ejemplo, pero sin limitarse a,
fosfato, HEPES o carbonato, de fuerza iónica moderada
(50-200 mM) y pH básico (7,5 -8,7) y reacción con un
exceso de los reactivo de etiquetado de fórmula general (I) durante
un tiempo suficiente (habitualmente durante unas horas a temperatura
ambiente o a 4ºC) eliminándose el exceso de reactivo mediante
diálisis.
Otro aspecto de la presente invención es la
incorporación de las biomoléculas modificadas con los agentes de
lipidación de fórmula general (I), formando los bioconjugado
covalentes, a ISCOMs. En una realización preferida de la presente
invención, las biomoléculas seleccionas son proteínas. En una
realización aún más preferida de la presente invención, la proteína
seleccionada es la proteína A o la proteína G.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al empleo de los compuestos de fórmula general (I) en la preparación
de ISCOMs funcionalizados con grupos vinilsulfona y la utilización
de estos grupos vinilsulfona para ligar cualquier biomolécula que
contenga grupos funcionales complementarios (grupos amino, tioles e
imidazoles) presentes en las mismas de forma natural o artificial a
través de una reacción de adición tipo Michael.
En una realización preferida de la presente
invención, las biomoléculas seleccionas son proteínas y compuesto de
fórmula general (I) contiene una molécula de colesterol como
molécula de naturaleza lipídica. En una realización aún más
preferida de la presente invención, la proteína seleccionada es la
proteína A o la proteína G.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a la incorporación de anticuerpos a la membrana de los ISCOMs, a
través de su unión con la biomolécula, preferiblemente proteína A o
proteína G incorporada previamente (por cualquiera de las
metodologías anteriormente descritas). En una realización preferida
de la presente invención los anticuerpos son IgG frente a un
parásito como Trypanosoma cruzi.
Otro aspecto más de la presente invención se
refiere al empleo de estos sistemas,
ISCOMs-anticuerpo, en el desarrollo de dos nuevas
aplicaciones de los ISCOMs o sistemas similares, aprovechando su
capacidad de nanoencapsulación: a) Su empleo en inmunomarcaje
fluorescente; b) Desarrollo de sistemas para el transporte dirigido
de fármacos.
En una realización preferida de la presente
invención el sistema fluorescente encapsulado contiene una molécula
fluorescente, preferiblemente la ficocianina.
En otra realización preferida de la presente
invención, el sistema ISCOM-anticuerpo además
contiene principio activo.
Por "principio activo" se entiende en la
presente invención a un fármaco o o una molécula de origen
biológico, por ejemplo proteínas o ácidos nucleicos, y que son
capaces de actuar bloqueando una reacción enzimática o afectar la
biosíntesis de macro-moléculas por parte de la
célula. Como principio activo se puede adicionar al sistema
anterior, por ejemplo la actinomicina-D.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Micrografía tomada con microscopía
láser confocal. Control negativo del inmunofluoroensayo:
epimastigotes de Trypanosoma cruzi con ficocianina.
Figura 2. Micrografía tomada con microscopia
láser confocal. Control negativo del inmunofluoroensayo:
epimastigotes de Trypanosoma cruzi con
ISCOMs-ficocianina.
Figura 3. Micrografía tomada con microscopia
láser confocal. Control negativo del inmunofluoroensayo:
epimastigotes de Trypanosoma cruzi con
ISCOMs-ficocianina-proteína A
modificada con 4.
Figura 4. Micrografía tomada con microscopia
láser confocal. Inmunofluoroensayo: epimastigotes de Trypanosoma
cruzi con
ISCOMs-ficocianina-proteína A
modificada con 4-IgG frente a Trypanosoma
cruzi.
Figura 5. Micrografía tomada con microscopia
láser confocal. Control negativo del inmunofluoroensayo:
epimastigotes de Trypanosoma cruzi con
ISCOMs-ficocianina-proteína A
modificada con 25.
Figura 6. Micrografía tomada con microscopia
láser confocal. Inmunofluoroensayo: epimastigotes de Trypanosoma
cruzi con
ISCOMs-ficocianina-proteína A
modificada con 25-IgG frente a Trypanosoma
cruzi.
\newpage
Figura 7. Micrografía tomada con microscopia
láser confocal. Control negativo del inmunofluoroensayo:
epimastigotes de Trypanosoma cruzi con ISCOMs obtenidos con
el compuesto 15 (proporción
1:1)-ficocianina-proteína A.
Figura 8. Micrografía tomada con microscopía
láser confocal. Inmunofluorensayo: epimastigotes de Trypanosoma
cruzi con ISCOMs obtenidos con el compuesto 15 (proporción
1:1)-ficocianina-proteína
A-IgG frente a Trypanosoma cruzi.
Figura 9. Micrografía tomada con microscopía
láser confocal. Control negativo del inmunofluoroensayo:
epimastigotes de Trypanosoma cruzi con ISCOMs obtenidos con
el compuesto 15 (proporción
2:3)-ficocianina-proteína A.
Figura 10. Micrografía tomada con microscopía
láser confocal. Inmunofluorensayo: epimastigotes de Trypanosoma
cruzi con ISCOMs obtenidos con el compuesto 15 (proporción
2:3)-ficocianina-proteína A- IgG
frente a Trypanosoma cruzi.
Figura 11. Tasa de supervivencia en los
distintos ensayos de citotoxicidad: A.- Epimastigotes de T.
cruzi tratados con Actinomicina D. (0,05 \mug); B.-
Epimastigotes de T. cruzi tratados con
ISCOM-IgG frente a T. cruzi conteniendo un
total de 2,88x10^{-5} \mug de Actinomicina D; C.- Epimastigotes
de T. cruzi tratados con ISCOM-IgG frente a
T. cruzi conteniendo un total de 5,76X10^{-5} \mug de
Actinomicina D; D.- Epimastigotes de T. cruzi tratados con
ISCOM-IgG frente a T. cruzi conteniendo un
total de 11.52 X10^{-5} \mug de Actinomicina D
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores.
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Ejemplo
1.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 3: Una disolución de ácido oleico (850
mg, 3 mmol) en Cl_{2}SO (10 mL) se mantuvo con agitación magnética
a temperatura ambiente durante 1 hora. El exceso de Cl_{2}SO se
eliminó por evaporación a vacío coevaporándose sucesivamente con
tolueno anhidro (3x15 mL). El crudo obtenido (1) se disolvió en
Cl_{2}CH_{2} anhidro (30 mL) y se añadió sobre una disolución de
cistamina 2 (260 mg, 1.15 mmol) y Et_{3}N (0.98 mL, 6.9 mmol) en
Cl_{2}CH_{2} anhidro (30 mL). La mezcla de reacción se mantuvo a
temperatura ambiente con agitación durante 15 minutos. El disolvente
se evaporó a presión reducida y el crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (éter-hexano 2:1
\rightarrow éter) obteniéndose 3 como un sólido (720 mg, 92%).
Compuesto 4: A una disolución de 3 (960 mg, 1.4
mmol) en AcOH (20 mL) se le añadió Zn (1.1 g, 17 mmol). La mezcla de
reacción se mantuvo con agitación a 50ºC durante 40 minutos. La
disolución se dejó enfriar y se filtró sobre celita. Se adicionó
Cl_{2}CH_{2} (70 mL) y se lavó con H_{2}O (2x30 mL),
NaHCO_{3}sat (2x30 mL) y con H_{2}O (30 mL). La fracción
orgánica secó con Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y el
disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo se disolvió
en THF:isopropanol (2:1, 25 mL), al cual se le burbujeó previamente
Ar durante 5 minutos, y se le añadió divinilsulfona (DVS) (809
\muL, 5.65 mmol) y Et_{3}N (40 \muL, 0.28 mmol). La disolución
resultante se mantuvo bajo agitación magnética a temperatura
ambiente y en atmósfera de Ar durante 1.5 horas. El disolvente se
evaporó a presión reducida y el crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (éter) obteniéndose 4 como un sólido (890
mg, 69%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.2
Compuesto 6: Una disolución de ácido oleico (1.9
g, 6.7 mmol) en Cl_{2}SO (15 mL) se mantuvo con agitación
magnética a temperatura ambiente durante 1 hora. El exceso de
Cl_{2}SO se eliminó por evaporación a vacío coevaporándose
sucesivamente con tolueno anhidro (3x15 mL). El crudo obtenido (1)
se disolvió en Cl_{2}CH_{2} anhidro (50 mL) y se añadió sobre
una disolución de 2-aminoetanol (0.608 mL, 10.1
mmol) y Et_{3}N (1.9 mL, 13.5 mmol) en Cl_{2}CH_{2} anhidro
(50 mL). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente
durante 15 minutos. El disolvente se evaporó a presión reducida y el
crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna
(AcOEt-hexano 2:1 \rightarrow AcOEt) obteniéndose
6 como un sólido (1.93 g, 88%).
Compuesto 7: A una disolución de 6 (780 mg, 2.4
mmol) en THF (100 mL) se le añadió DVS (497 \muL, 4.8 mmol) y
t-BuOK (30 mg, 0.27 mmol). La mezcla de reacción se
mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 15 minutos. El
disolvente se evaporó a presión reducida y el crudo obtenido se
purificó por cromatografía en columna (AcOEt-hexano
2:1 \rightarrow AcOEt) obteniéndose 7 como un sirope (538 mg,
51%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.3
Compuesto 9: Una disolución de ácido esteárico
(1.8 g, 6.3 mmol) en Cl_{2}SO (7 mL) se mantuvo con agitación
magnética a temperatura ambiente durante 1 hora. El exceso de
Cl_{2}SO se eliminó por evaporación a vacío coevaporándose
sucesivamente con tolueno anhidro (3x15 mL). El crudo obtenido (8)
se disolvió en THF anhidro (30 mL) y se añadió sobre una disolución
de 2-aminoetanol (0.570 mL, 9.5 mmol) y Et_{3}N
(1.8 mL, 12.7 mmol) en THF anhidro (30 mL). La mezcla de reacción se
mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos. El disolvente se
evaporó a presión reducida y el crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (Cl_{2}CH_{2}-MeOH 15:1
\rightarrow 5:1) obteniéndose 9 como un sólido (1.89 g, 91%).
Compuesto 10: A una disolución de 9 (480 mg, 1.5
mmol) en THF (100 mL) se le añadió DVS (310 \muL, 2.9 mmol) y
t-BuOK (20 mg, 0.18 mmol). La mezcla de reacción se
mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 25 minutos. El
disolvente se evaporó a presión reducida y el crudo obtenido se
purificó por cromatografía en columna (AcOEt) obteniéndose 10 como
un sólido (365 mg, 56%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.4
Compuesto 12: Una disolución de ácido laúrico
(2.7 g, 13.2 mmol) en Cl_{2}SO (10 mL) se mantuvo con agitación
magnética a temperatura ambiente durante 1 hora. El exceso de
Cl_{2}SO se eliminó por evaporación a vacío coevaporándose
sucesivamente con tolueno anhidro (3x15 mL). El crudo obtenido (11)
se disolvió en Cl_{2}CH_{2} anhidro (30 mL) y se añadió sobre
una disolución de 2-aminoetanol (1.2 mL, 19.8 mmol)
y Et_{3}N (3.75 mL, 26.4 mmol) en Cl_{2}CH_{2} anhidro (30
mL). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante
15 minutos. El disolvente se evaporó a presión reducida y el crudo
obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt)
obteniéndose 12 como un sólido (2.98 g, 93%).
Compuesto 13: A una disolución de 12 (500 mg,
2.1 mmol) en THF (50 mL) se le añadió DVS (420 \muL, 4 mmol) y
t-BuOK (23 mg, 0.2 mmol). La mezcla de reacción se
mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 25 minutos. El
disolvente se evaporó a presión reducida y el crudo obtenido se
purificó por cromatografía en columna (AcOEt-hexano
2:1 \rightarrow AcOEt) obteniéndose 13 como un sólido (394 mg,
53%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2.1
Compuesto 15: A una disolución de colesterol 14
(300 mg, 0.77 mmol) en THF (20 mL) se le añadió DVS (0.12 mL, 1.16
mmol) y t-BuOK (9 mg, 0.077 mmol). La mezcla de
reacción se dejó con agitación a temperatura ambiente durante 1
hora. Se le adicionaron resinas ácidas (amberlita IR 120H) y se
mantuvo bajo agitación a t.a durante 30 minutos. Las resinas se
filtraron, el disolvente se evaporó a presión reducida y al crudo se
le adicionó Ac_{2}O (8 mL) y piridina (4 mL) y se mantuvo a
temperatura ambiente una noche. El Ac_{2}O y la piridina se
eliminaron a presión reducida y el crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (éter-hexano 1:2)
obteniéndose 15 como un sólido (204 mg, 52%).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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Compuesto 17: Una disolución de alcohol oleico
(300 mg, 1.12 mmol) en 10 mL de THF se enfrió en un baño de hielo y
se le adicionó Et_{3}N (0.47 mL, 3.35 mmol) y cloruro de mesilo
(0.13 mL, 1.67 mmol). Tras 10 minutos el disolvente se evaporó en el
rotavapor y el crudo obtenido se purificó mediante cromatografía en
columna (hexano:éter 1:1) obteniéndose 17 como sirope (372 mg,
96%).
Compuesto 19: A una disolución de
2-tioetanol 18 (0.14 mL, 1.99 mmol) en 15 mL de
CH_{3}CN se le pasó una corriente de argón y se le adicionó el
compuesto 17 (347 mg, 1,01 mmol) y Cs_{2}CO_{3} (652 mg, 2.00
mmol). La disolución se mantuvo bajo agitación magnética a
temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se eliminó a
presión reducida y el crudo obtenido se purificó mediante
cromatografía en columna (hexano:éter 1:1) obteniéndose 19 como un
sirope (310 mg, 94%).
Compuesto 20: A una disolución del compuesto 19
(221 mg, 0.67 mmol) en 3.4 mL de AcOH se le adicionaron 1.3 mL de
H_{2}O_{2} 33%. El matraz se protegió de la luz y se mantuvo
bajo agitación magnética a temperatura ambiente durante 7 horas. El
disolvente se eliminó a presión reducida y el crudo obtenido se
purificó mediante cromatografía en columna (hexano:AcOEt 1:1)
obteniéndose 20 como un sirope (164 mg, 68%).
Compuesto 21: Una disolución del compuesto 20
(134 mg, 0.37 mmol) en 10 mL de CH_{2}Cl_{2} anhidro se enfrió
en un baño de hielo y se le añadió Et_{3}N (0.32 mL, 2.24 mmol) y
cloruro de mesilo (0.09 mL, 1.16 mmol). Se dejó que la disolución
alcanzara la temperatura ambiente y se mantuvo bajo agitación
magnética durante 6 horas. El disolvente se eliminó en el rotavapor
y el crudo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna
(hexano:AcOEt 5:1) obteniéndose 21 como un líquido (102 mg,
80%).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 23: A una disolución de
2-tioetanol 18 (200 mg, 2.56 mmol) en 30 mL de
DMSO:THF (1:1) se le pasó una corriente de argón y se le adicionó el
compuesto 22 (1.33 g, 3.84 mmol) y K_{2}CO_{3} (531 mg, 3.84
mmol). La disolución se mantuvo bajo agitación magnética a
temperatura ambiente durante 24 horas. La sal se filtró a vacío y el
disolvente se eliminó a presión reducida. Al crudo se adicionaron 60
mL de agua y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2x60 mL). El extracto
orgánico se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró, el
disolvente se evaporó a presión reducida y el crudo obtenido se
purificó mediante cromatografía en columna (hexano:éter 1:1)
obteniéndose 23 como sólido (775 mg, 92%).
Compuesto 24: A una disolución del compuesto 23
(425 mg, 1.29 mmol) en 6.4 mL de AcOH se le adicionaron 2.6 mL de
H_{2}O_{2} 33%. El matraz se protegió de la luz y se mantuvo
bajo agitación magnética a temperatura ambiente durante 24 horas. El
disolvente se eliminó a presión reducida y el crudo obtenido se
purificó mediante cromatografía en columna (AcOEt) obteniéndose 24
como un sólido (397 mg, 85%).
Compuesto 25: Una disolución del compuesto 24
(173 mg, 0.48 mmol) en 10 mL de CH_{2}Cl_{2} anhidro se enfrió
en un baño de hielo y se le añadió Et_{3}N (0.2 mL, 1.42 mmol) y
cloruro de mesilo (57 \muL, 0.73 mmol). Se dejó que la disolución
alcanzara la temperatura ambiente y se mantuvo bajo agitación
magnética durante 24 horas. El disolvente se eliminó en el rotavapor
y el crudo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna
(hexano:éter 1:1) obteniéndose 25 como un sólido (133 mg, 81%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5.1
Los compuestos 4 y 25 se solubilizan en metanol
y tampón carbonato 0.125 M, pH 8 hasta alcanzar una concentración
final de 20 mg/ml. Los compuestos se adicionan a una solución de
proteína A (100 mg/mL) en una proporción 5:1. La disolución final se
incuba 12 horas a 4ºC. Una vez transcurrido ese tiempo se le añaden
20 \mul de tampón carbonato 0.125M-glicina 1M y se
incuban 3 horas a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una solución en 2 mi de agua
destilada que contenga colesterol y fosfatidilcolina (1:1) a una
concentración final de 15 mg/ml y 0.400 mg de
Mega-10. Por otra parte se prepara una solución de
Quii A a una concentración de 100 mg/ml. Una vez están preparadas
las dos soluciones se toma la cantidad adecuada para obtener una
proporción 1:1:5 de colesterol:fosfatidilcolina:Quil A en un volumen
final de 12 mililitros. Se incuba una hora a temperatura ambiente y
se concentra a un volumen de aproximadamente 1/5 del inicial. El
concentrado se dializa durante 40 horas en PBS con cuatro cambios.
Una vez se ha recogido el dializado se procede a purificar los
ISCOMs formados mediante una centrifugación en gradiente de sacarosa
a 50000 g durante 18 horas, y finalmente se vuelve a dializar
\vskip1.000000\baselineskip
Tomamos 1 mL de una concentración de 1 mg/ml de
ficocianina con 1 mg de ISCOMs liofilizados. La disolución final se
incuba 12 horas a 4ºC. Una vez incubados con la ficocianina fueron
centrifugados a 50000 g durante 18 horas a fin de eliminar la
ficocianina no encapsulada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcla en una proporción 1:3 (v/v) la
solución que contiene los ISCOMs con ficocianina (20 \muL) y la
solución que contiene la proteína A modificada (60 \muL de una
concentración de 100 mg/mL). La disolución final se incuba 12 horas
en agitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcla la solución obtenida en el apartado
anterior en proporción 1:3 con la IgG frente a T. cruzi. (457
\mug/mL). La disolución resultante se incuba al menos 1 hora a 4ºC
en agitación.
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de comprobar la especificidad de la unión
de los ISCOMs con el anticuerpo IgG frente a Trypanosoma
cruzi a través de la proteína A modificada con los compuestos 4
y 25 se lleva a cabo un ensayo de inmunofluorescencia directa y los
resultados se observan mediante microscopía láser confocal.
\vskip1.000000\baselineskip
Los portaobjetos deben de estar limpios y libres
de grasa, para lo cual se sumergen en acetona durante 24 horas y
luego se dejan secar a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Epismastigotes de Trypanosoma cruzi
fueron cultivados en medio MTL suplementado con suero bovino fetal
al 10% a 28ºC durante 5 días.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Contar los parásitos en cámara de Neubauer. Se necesitan 1x10^{8} parásitos totales.
- -
- Centrifugar los parásitos a 1600 g durante 10 minutos a 4ºC.
- -
- Retirar el sobrenadante y resuspender en 10 mL de PBS.
- -
- Lavar tres veces con PBS.
- -
- Resuspender el botón de parásitos (1x10^{8}) en 1 mL de PBS.
- -
- Añadir 1 mL de PBS al 4% de formaldehído para una concentración final de formaldehído del 2%.
- -
- Leer la absorbancia de la mezcla de parásitos PBS con 2% de formaldehído.
- -
- Dejar incubando toda la noche a temperatura ambiente.
- -
- Centrifugar 10 minutos a 3000 rpm.
- -
- Eliminar el sobrenadante y lavar el botón de parásitos dos veces con PBS.
- -
- Resuspender en PBS y ajustar la concentración de parásitos observando al microscopio de tal forma que en 10 \muL los parásitos estén separados.
- -
- Agregar 10 \muL de la suspensión a cada pozo en los portaobjetos y dejar secar a temperatura ambiente.
- -
- Guardar las placas a -20ºC hasta el momento de su uso
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Añadir 10 \muL a cada pocillo de la muestra a ensayar.
- a)
- Control con ficocianina purificada (figura 1).
- b)
- Control con ISCOMs-ficocianina (figura 2).
- c)
- Control con ISCOMs-ficocianina-proteína A modificada con 4 (figura 3).
- d)
- ISCOMs-ficocianina-proteína A modificada con 4-IgG frente a Trypanosoma cruzi (figura 4).
- e)
- Control con ISCOMs-ficocianina-proteína A modificada con 25 (figura 5).
- f)
- ISCOMs-ficocianina-proteína A modificada con 25-IgG frente a Trypanosoma cruzi (figura 6).
- -
- Poner los portas en la cámara húmeda e incubar durante 30 minutos a 37 \pm 0.5ºC
- -
- Retirar la cámara fría de la incubadora. También retirar el conjugado del almacenaje. Aclarar los pocillos con PBS durante 10 minutos. Retirar el sobrenadante de PBS y repetir el lavado sin dejar que los pocillos se sequen.
- -
- Añadir 2 ó 3 gotas de medio de montaje (glicerina tamponada) a cada porta y tapar con un cubreobjeto evitando que se formen burbujas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ISCOMATRIX se preparan de la misma manera
descrita anteriormente, pero se varía la composición del colesterol
empleando distintas proporciones de colesterol:15. Se prepara por
una parte ISCOMATRIX con la formulación normal que va a servir de
control positivo y por otra parte, manteniendo la concentración
final de 15 mg/ml de colesterol, 15 y fosfatidilcolina, vamos a
variar la composición usando 1:1 colesterol: 15 y 3:2 colesterol:
15.
\vskip1.000000\baselineskip
A los ISCOMs funcionalizados obtenidos en la
etapa anterior se adicionan 10 ó 20 \muL de disolución de proteína
A (100 mg/mL). La disolución final se incuba 12 horas a 4ºC. Una vez
transcurrido ese tiempo se le añaden 20 \mul de tampón carbonato
0.125M-glicina 1M y se incuban 2-3
horas más a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Tomamos 1 mL de una solución de 1 mg/ml de
ficocianina con 1 mg de ISCOMs-proteína A
liofilizados. La disolución final se incuba 12 horas a 4ºC. Una vez
incubados con la ficocianina fueron centrifugados a 50000 g durante
18 horas a fin de eliminar la ficocianina no encapsulada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcla la solución obtenida en el apartado
anterior en proporción 1:3 con la IgG frente a T. cruzi. La
disolución resultante se incuba al menos 1 hora a 4ºC en
agitación.
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de comprobar la especificidad de la unión
de los ISCOMs con el anticuerpo IgG frente a Trypanosoma
cruzi a través de la proteína A unida covalentemente a la
estructura del los ISCOMs aprovechando la reactividad de los grupos
vinilsulfona incorporados mediante el compuesto 15 se lleva a cabo
un ensayo de inmunofluorescencia directa y los resultados se
observan mediante microscopía láser confocal. El protocolo seguido
es el mismo descrito anteriormente y en este caso las muestras
ensayadas son:
- a)
- Control con ficocianina purificada (figura 1).
- b)
- Control con ISCOMs-ficocianina (figura 2).
- c)
- Control con ISCOMs obtenidos con el compuesto 15 (proporción 1:1)-ficocianina-proteína A (figura 7).
- d)
- ISCOMs obtenidos con el compuesto 15 (proporción 1:1)-ficocianina-proteína A-IgG frente a Trypanosoma cruzi (figura 8).
- e)
- Control con ISCOMs obtenidos con el compuesto 15 (proporción 2:3)-ficocianina-proteína A (figu- ra 9).
- f)
- ISCOMs obtenidos con el compuesto 15 (proporción 2:3)-ficocianina-proteína A-IgG frente a Trypanosoma cruzi (figura 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una disolución en 2 mi de agua
destilada que contenta colesterol y fosfatidilcolina (1:1) a una
concentración final de 15 mg/ml además de 0.400 mg de
Mega-10. Por otra parte se prepara una solución de
Quil A, a una concentración de 100 mg/ml. Una vez preparadas ambas
disoluciones se toma la cantidad adecuada de cada una de ellas para
obtener una proporción 1:1:5 de colesterol:fosfatidilcolina:Quil A
en un volumen final de 10 mL y se adicionan 2 mL de una solución
stock de Actinomicina D (5 mg/ml). Se incuba una hora a temperatura
ambiente y se concentra en un concentrador de proteínas hasta 1/5
del volumen inicial. Dializar durante 40 horas en PBS con cuatro
cambios. Una vez se ha recogido el dializado se procede a purificar
los ISCOMs formados mediante una centrifugación en gradiente de
sacarosa a 50000 g durante 18 horas. Finalmente se procede de nuevo
a dializar.
\vskip1.000000\baselineskip
A 20 \muL de la solución de
ISCOMs-actinomicina-D se le añaden
60 \muL de la solución de proteína A modificada con 4. La solución
final se incuba 12 horas en agitación.
\vskip1.000000\baselineskip
A 30 \muL de la solución de
ISCOMs-actinomicina-D-proteína
A modificada con 4 se le añaden 90 \muL de IgG frente a
Trypanosoma cruzi (457 mg/mL). La solución final se incuba al
menos 1 hora a 4ºC con agitación.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de antibiótico atrapado en las
nanopartículas (ISCOM-actinomicina
D-IgG \rightarrow 0.192 mg/mL de suspensión) se
determinó espectrofotométricamente.
\newpage
Para poder determinar la supervivencia de los
Trypanosomas tras el tratamiento con los ISCOMs cargados de
Actinomicina D y ligados en superficie con los anticuerpos frente al
parásito usamos el kit CytoTox 96 Non-Radiactive
Cytotoxicity Assay (promega) capaz de medir la liberación al medio
del enzima lactato deshidrogenasa presente en el citoplasma de
células intactas. Para ello se ajustó el numero de organismos
(epimastigotes de T. cruzi) a 1x10^{5}/100 \mul en cada
uno de los pocillos de una placa de microtitulación de fondo plano y
se le añadió a cada uno de dichos pocillo una suspensión de ISCOMs
cargados de Actinomicina D de 5, 15 y 30 \mul. El tiempo de
interacción fue de 24 horas. Tras lo cual se determino la
citotoxicidad en cada pocillo de una forma colorimétrica a 490 nm en
un lector de placas. Cada una de los diferentes ensayos se llevó a
cabo por triplicado. Para ello y siguiendo las instrucciones del Kit
a cada uno de los pocillos se le añaden 15 mul de una solución de
lisis y se incuba en estufa de CO_{2} a 28ºC durante 45 minutos.
Una vez transcurrido el tiempo se centrifuga a 250 g durante 4
minutos. Se toman 50 \mul del sobrenadante y se transfieren a otro
pocillo de la placa donde además se le agregará 50 \mul del
sustrato, incubándose 30 minutos a temperatura ambiente y en
oscuridad. A fin de frenar la reacción enzimático del kit se añaden
50 \mul de la solución de parada. Las placas como se indicó
anteriormente fueron leídas en un lector de placas de ELISA a 490 nm
(figura 11).
Claims (38)
1. Complejo no covalente que comprende al menos
un compuesto de fórmula general (I) incorporado a la estructura de
un ISCOM,
- donde:
- Y es un grupo -CH_{2}-SO_{2}R^{1}- o -CH_{2}-;
- R^{1} es un radical seleccionado del grupo que comprende un alquilo (C_{1}-C_{10}), un alquenilo (C_{1}-C_{10}), un alquinilo (C_{1}-C_{10}), un dialquilarilo (C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10}) o un grupo (CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2};
- n toma valores de 1 a 20;
- X es un grupo -CO-NH-R^{2}-Z-CH_{2}-, -Z-CH_{2}- o -CH_{2}-;
- Z es S ó O;
- R^{2} es un radical seleccionado del grupo que comprende un alquilo (C_{1}-C_{10}), un alquenilo (C_{1}-C_{10}), un alquinilo (C_{1}-C_{10}), un dialquilarilo (C_{1}-C _{10})Ar(C_{1}-C_{10}) ó un grupo (CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2};
- m toma valores de 1 a 20; y
-
28 representa un lípido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Complejo según la reivindicación 1, donde el
lípido del compuesto es un esteral.
3. Complejo según la reivindicación 2, donde el
esteral se selecciona de la lista que comprende colesterol,
epicolesterol, estigmasterol, lanosterol, ergosterol y
coprostenol.
4. Complejo según la reivindicación 3, donde el
esteral es colesterol.
5. Complejo según la reivindicación 1, donde el
lípido del compuesto es un hidrocarburo alifático
(C_{4}-C_{30}) saturado.
6. Complejo según la reivindicación 1, donde el
lípido del compuesto es hidrocarburo alifático
(C_{4}-C_{30}) insaturado.
7. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6, donde el lípido es hidrocarburo alifático
(C_{10}-C_{20}).
8. Complejo según las reivindicaciones 1 a 7,
donde X es un grupo -CO-NH-R^{2}-
Z-CH_{2}- y Z se ha definido en la reivindicación
1.
9. Complejo según la reivindicación 8, donde
R^{2} es un grupo alquilo (C_{2}-C_{5}).
10. Complejo según la reivindicación 9, donde
R^{2} es un grupo etilo.
11. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde X es el grupo
-Z-CH_{2}- y Z se ha definido en la reivindicación
1.
12. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, donde Z es O.
13. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, donde Z es S.
14. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde X es -CH_{2}-,
15. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, donde el grupo Y es -CH_{2}-,
16. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, donde R^{1} es un grupo
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2} y n toma valores de
entre 1 a 10.
17. Complejo según la reivindicación 16, donde n
toma valores de entre 2 a 5.
18. Complejo según la reivindicación 17, donde n
es 2.
19. Sistema que comprende el complejo según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, y una biomolécula unida
covalentemente a través de los grupos vinilsulfona.
20. Sistema según la reivindicación 19 donde la
biomolécula es una proteína.
21. Sistema según la reivindicación 20 donde la
biomolécula es la proteína A o la proteína G.
22. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, que además comprende un anticuerpo unido al
ISCOM a través de la biomolécula.
23. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, donde el ISCOM además contienen una
molécula fluorescente.
24. Sistema según la reivindicación 23, donde la
molécula fluorescente es ficocianina.
25. Uso de un complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, para la unión de biomoléculas mediante los
grupos vinilsulfona.
26. Uso del complejo según la reivindicación 25,
donde las biomoléculas son proteínas.
27. Uso del complejo según la reivindicación 26,
donde la proteína es proteína A o proteína G.
28. Uso del sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 24, para inmunomarcaje fluorescente.
29. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 24, que además comprende la incorporación de
un principio activo.
30. Sistema según la reivindicación 29, donde el
principio activo es actinomicida D.
31. Uso del sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 29 o 30, en la elaboración de una composición
farmacéutica.
32. Uso del sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 29 o 30, para el transporte dirigido de
fármacos.
33. Compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
34. Compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
35. Compuesto de fórmula:
\newpage
36. Compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
37. Compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
38. Compuesto de fórmula:
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PCT/ES2010/000525 WO2011073473A1 (es) | 2009-12-16 | 2010-12-15 | Sistemas lipídicos funcionalizados con vinilsulfonas. síntesis y usos |
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US6066446A (en) * | 1997-12-19 | 2000-05-23 | Nen Life Science Products, Inc. | Assay member and method for its manufacture |
TWI321054B (en) * | 2000-12-19 | 2010-03-01 | California Inst Of Techn | Compositions containing inclusion complexes |
FR2912410B1 (fr) * | 2007-02-12 | 2009-04-17 | Specific Polymers Sarl | Silicones sulfones formant des elastomeres par autoassemblage,procedes de preparation de tels silicones et leurs utilisations. |
WO2008156327A2 (en) * | 2007-06-20 | 2008-12-24 | Lg Household & Health Care Ltd. | Lipid having specific functional group and personal care composition comprising the lipid |
-
2009
- 2009-12-16 ES ES200902389A patent/ES2337226B2/es active Active
-
2010
- 2010-12-15 WO PCT/ES2010/000525 patent/WO2011073473A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MOREIN, B. & LÖVGREN BENGTSSON, K: "{}Immunomodulation by Iscoms, Immune Stimulating Complexes"{}. Methods 1999, Volumen 19, páginas 94-102. Ver especialmente páginas 94-95, apartado 1; página 102, columna 1. * |
SUN, H.-X. et al. "{}ISCOMs and ISCOMATRIX$^{TM}$"{}. Vaccine 2009, Volumen 27, páginas 4388-4401. [Disponible en línea el 28.05.2009]. Ver especialmente página 4388, resumen; página 4389, apartado 2. * |
Also Published As
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