ES2338908T3 - Liofilizacion de virosomas. - Google Patents
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Abstract
Composición biológicamente activa que comprende, como mínimo, virosoma de influenza reconstituido inmunopotenciador (IRIV) y un derivado de colesterol catiónico para la liofilización y reconstitución eficaz del virosoma, en la que dicho derivado de colesterol catiónico para la liofilización y reconstitución eficaz del virosoma está presente en la membrana del virosoma.
Description
Liofilización de virosomas.
La presente invención se refiere a composiciones
y procedimientos para la liofilización y reconstitución eficaces de
virosomas.
La liofilización o "secado por congelación"
es un proceso técnico para eliminar agua. En éste, la solución
acuosa se enfría por debajo de su punto eutéctico, hasta su
congelación completa. A continuación, se reduce la presión
barométrica hasta hacer vacío, de manera que el agua se sublima y se
elimina de la solución. El agente solubilizado permanece como un
sólido poroso, que puede redisolverse en agua nuevamente. La
liofilización genera sólidos con un área superficial muy grande,
que provoca una alta solubilidad en agua.
La liofilización es ampliamente utilizada en
aplicaciones farmacéuticas, ya que la mayoría de los productos
farmacéuticos tienen un tiempo de vida de almacenamiento en solución
limitada. Su tiempo de vida en anaquel puede aumentarse
significativamente mediante la producción de liofilizados, que se
disuelven, poco antes de su utilización, en un disolvente adecuado.
Aunque la liofilización ha demostrado ser una técnica de
conservación superior comúnmente utilizada en la actualidad, tiene
desventajas inherentes. Estas están mayormente relacionadas con los
procesos de congelación y reconstitución, que a menudo pueden ser
perjudiciales para los agentes o composiciones bioactivas. Para
preservar la funcionalidad y la actividad, se han desarrollado
diferentes técnicas, especialmente el uso de crioprotectores que
incluyen, por ejemplo, azúcares como la sacarosa o trealosa.
Los liposomas y virosomas tienen propiedades
superiores como vehículos de administración de medicamentos.
Mientras que los liposomas son vesículas de lípidos esféricas, los
virosomas son envolturas de virus que no contienen el material
genético infectivo del virus original. La diferencia entre liposomas
y virosomas es que los virosomas contienen proteínas adicionales en
su superficie que los hace partículas de fusión activas, mientras
que los liposomas son portadores inactivos.
En consecuencia, los virosomas son sistemas
portadores/adyuvantes muy eficaces en la vacunación moderna, que
poseen propiedades superiores como vehículos de administración de
antígenos y un potencial inmunogénico fuerte, mientras que a la
minimizan el riesgo de efectos secundarios.
Hasta la fecha, los virosomas se han utilizado
de forma eficaz en una variedad de vacunas. Por ejemplo, vacunas
disponibles comercialmente contra la hepatitis A y la influenza
utilizan virosomas como adyuvantes y vehículos de administración de
antígeno seguros. Los anticuerpos desarrollados por la inoculación
con antígenos reconstituidos en virosomas han mostrado una elevada
afinidad por los antígenos contra los que se han dirigido. Virosomas
unilaminares que contienen 30% molar de Dodac y complejados con
plásmido se conocen de P. Schoen y otros. Gene Therapy (1999) 6,
823-832.
La liofilización de liposomas puede impedir la
hidrólisis de los fosfolípidos y la degradación física de las
vesículas durante el almacenamiento. Además, puede ayudar a
estabilizar la sustancia que se incorpora en los liposomas. La
liofilización de una formulación de liposomas da como resultado una
torta seca, que puede reconstituirse en segundos para obtener la
dispersión original, es decir, si se utilizan los excipientes
adecuados y se aplican condiciones de liofilización adecuadas. Por
otra parte, el proceso de liofilización por sí mismo puede inducir
cambios físicos de los liposomas, tales como pérdida del agente
encapsulado y alteraciones en el tamaño de la vesícula. La
ocurrencia de dicho daños no es sorprendente, porque la interacción
entre los grupos principales de fosfolípidos hidrofílicos y las
moléculas de agua juega un papel fundamental en la formación de
bicapas de liposomas. En consecuencia, eliminar el agua de los
liposomas mediante liofilización representa un reto excitante.
Además, la liofilización es un proceso que consume energía y tiempo,
que desde luego requiere algunos conocimientos a efectos de evitar
sus dificultades específicas. Afortunadamente, se han identificado
excipientes, tales como disacáridos, que protegen los liposomas
durante los procesos de congelación (lioprotectores) y la técnica
de liofilización se ha descrito de manera extensiva en la literatura
(Pikal y otros, 1990, Int. J. Pharm. Sci. 60, 203; Pikal, 1990,
Biopharm 10, 18; Essig y otros, 1993, Liofilización
("Lyophilization"), Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft,
Stuttgart; Jenning, 1999, Liofilización: Introducción y principios
básicos ("Lyophilization: Introduction and Basic principles"),
Interpharm Press, Englewood, CO).
Los lioprotectores protegen los liposomas
mediante (1) evitando la fusión de los liposomas, (2) evitando la
ruptura de las bicapas por los cristales de hielo y (3) manteniendo
la integridad de las bicapas en ausencia de agua. Para hacer esto,
los lioprotectores deben formar una matriz cristalina amorfa dentro
y alrededor de los liposomas. La interacción entre los
lioprotectores y los grupos principales de fosfolípidos se considera
especialmente importante para evitar la fuga durante la
rehidratación de los liposomas que tienen una bicapa cristalina
líquida en el estado hidratado a temperaturas ambiente.
Es posible distinguir diferentes tipos de
formulaciones de liposomas con respecto a la liofilización: (1)
liposomas vacíos, que se reconstituyen con una solución del
compuesto a ser encapsulado, (2) liposomas cargados con un
compuesto que esta fuertemente asociado con la bicapa y (3)
liposomas que contienen un compuesto soluble en agua que no
interactúa con la bicapa. El tercero representa el mayor reto, ya
que se requiere evitar la fuga de solutos encapsulados y la
conservación del tamaño de los liposomas. La composición de la
bicapa es un factor altamente significativo cuando se determina la
resistencia de los liposomas a la tensión de liofilización, pero
hasta la fecha ha sido difícil extraer reglas generales de la
literatura ya que están involucrados muchos otros parámetros,
incluyendo las condiciones de los procesos de liofilización, la
selección del lioprotector y el tamaño de la vesícula.
Tal como se ha descrito anteriormente, la
liofilización de liposomas ha probado ser la más demandada, pero la
liofilización de virosomas está enfrentando problemas aún mayores.
Es decir, en comparación con los liposomas, debido a las proteínas
adicionales en la envoltura, responsables de la actividad de fusión
del virosoma. Tal como las proteínas, éstos son muy susceptibles a
la tensión inducida por la liofilización, provocando pérdidas
significativas de actividad.
En consecuencia, existe una necesidad de
composiciones y procedimientos que superen los problemas asociados
a la liofilización y reconstitución eficaces de moléculas de fusión
activas, denominadas virosomas.
La presente invención da a conocer composiciones
biológicamente activas y procedimientos para preparar liofilizados
de virosomas hidratables, con alta resistencia a la tensión de
liofilización y procedimientos para su reconstitución. Según la
presente invención, composiciones biológicamente activas se refiere
a composiciones inmunogénicas o composiciones farmacéuticas que
comprenden virosomas y un lípido catiónico para la liofilización y
reconstitución eficaces del virosoma y, en particular, a una
composición inmunogénica o una composición farmacéutica en la que
un lípido catiónico está presente en la membrana del virosoma para
la liofilización y reconstitución eficaces del virosoma. Utilizando
la enseñanza de la presente invención, se pueden obtener virosomas
que tienen propiedades de liofilización y reconstitución superiores
y que son particularmente útiles para administrar antígenos,
medicamentos y otras sustancias farmacéuticas activas, incluyendo
ADN, ARN, o ARNsi en las células. Después de la liofilización, aún
son capaces de administrar dichas sustancias a distintas células a
través de un sistema de diana, que reconoce los marcadores de
superficie de tipos de células específicas y, de esta manera, son
específicamente superiores a otros vehículos de administración
conocidos.
Los lípidos catiónicos utilizados son derivados
de colesterol catiónicos.
En otra realización de la presente invención
dichos derivados de colesterol se representan mediante la siguiente
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R se selecciona del grupo
que comprende R'; R'-(C=O)-; R'-O-(C=O)-;
R'-NH-(C=O)-;
R'-O-(C=O)-R''-(C=O)-;
R'-NH-(C=O)-R''-(C=O)-,
en la que R' es un alquilo
C_{1}-C_{6} que ha sido sustituido, como mínimo,
por un grupo cargado positivamente, preferentemente un grupo que
contiene N de fórmula R_{1}R_{2}R_{3}N^{+}- y el contra ión
respectivo es X^{-};
en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se
seleccionan cada uno independientemente del grupo que comprende
hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{6};
en la que X^{-} se selecciona del grupo que
comprende halógeno, hidrógeno sulfato, sulfonato, dihidrógeno
fosfato, acetato, trihaloacetato y carbonato de hidrógeno; y
en la que R'' es alquileno
C_{1}-C_{6}.
Según la presente invención, R'' que es un
alquileno C_{1}-C_{6} representa una fracción de
alquileno C_{1}-C_{6} saturada que puede ser
-CH_{2}-, -(CH_{2})_{2}-, etc., que puede también estar
presente como una cadena ramificada, tal como
CH(CH_{3})-(CH_{2})_{2}-, etc.
En una realización adicional, los derivados de
colesterol se representan por la fórmula II:
en la que R_{1}, R_{2} y
R_{3} son seleccionadas independientemente cada uno del grupo que
comprende hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{6} y en
la que X^{-} es un anión de
halógeno.
En otra realización, el lípido catiónico se
representa mediante la fórmula II, en la que R_{1} y R_{2} son
metilo, R_{3} es hidrógeno y X^{-} es un anión de halógeno,
preferentemente cloruro, es decir, cloruro de
3\beta[N-(N',N'-dimetilamonioetano)-carbamoil]colesterol
(DC-Chol). En otra realización más preferente, el
lípido catiónico se representa mediante la fórmula II, R_{1,}
R_{2} y R_{3} son metilo y X^{-} es un anión de halógeno,
preferentemente cloruro, es decir, cloruro de
3\beta[N-(N',N',N'-trimetilamonioetano)-carbamoil]colesterol
(TC-Chol).
Los virosomas son vehículos de fusión activos
que administran a una célula una sustancia biológicamente activa
seleccionada entre un agente farmacéutico y una molécula antigénica.
Los virosomas son vehículos de administración de antígenos, capaces
de provocar una respuesta inmune contra un antígeno diana o
vehículos de administración de productos farmacéuticos, que
administran un producto farmacéutico a una célula y, debido a la
composición de su membrana, adecuados para liofilización. Los
virosomas son virosomas de influenza reconstituidos
inmunopotenciadores (IRIVs).
Las composiciones de la membrana del virosoma de
la presente invención comprenden preferentemente entre 1,9 y 37%
molar de DC-Chol o TC-Chol, en
relación con el contenido de lípidos total de la membrana del
virosoma. En una realización muy preferente, el contenido de
DC-Chol o TC-Chol en la membrana se
encuentra entre 1,9 y 16% molar del total del contenido de lípidos
de la membrana del virosoma. El contenido de lípidos residual de la
membrana consiste, preferentemente, en fosfolípidos, más
preferentemente, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina en una
proporción de 4:1. Adicionalmente, la membrana del virosoma puede
contener una cantidad de hemaglutinina suficiente para garantizar
actividad de fusión del virosoma.
En una realización de la presente invención, la
composición adicionalmente puede contener la sustancia
biológicamente activa deseada seleccionada entre un agente
farmacéutico y una molécula antigénica en la solución antes de la
liofilización. En otra realización, el agente farmacéutico o
antígeno seleccionado puede añadirse al liofilizado antes del
proceso de reconstitución o puede añadirse después de la
liofilización en el proceso de reconstitución en combinación con el
fluido disolvente, es decir solubilizado en éste.
En realizaciones adicionales, las composiciones
de la presente invención pueden además comprender lioprotectores,
tales como sacarosa o un adyuvante o sistema adyuvante.
La presente invención además comprende
procedimientos de liofilización y reconstitución de las
composiciones de virosomas mencionadas anteriormente y el
liofilizado obtenido en los mismos.
Además, además se pretende que sea una parte de
la presente invención el uso de las composiciones de la presente
invención para la fabricación de un producto farmacéutico para la
vacunación e inmunización de un individuo. Más preferentemente, el
individuo es un ser humano.
Adicionalmente, la presente invención también
comprende un kit que contiene los liofilizados obtenibles utilizando
el procedimiento de liofilización de la presente invención. Además,
el kit adicionalmente puede comprender un disolvente de
reconstitución y dicha sustancia biológicamente activa seleccionada
entre un agente farmacéutico y una molécula antigénica, siempre que
dicha sustancia biológicamente activa no sea ya una parte de la
composición o liofilizado. En una realización, el agente
farmacéutico o molécula antigénica se disolverá en el disolvente de
reconstitución antes de la reconstitución del liofilizado de
virosoma.
El kit proporciona los medios para preparar
fácilmente una composición inmunogénica con un antígeno diana
seleccionado, por ejemplo, para la vacunación, y a la vez
proporciona un tiempo de vida en anaquel prolongado y propiedades
de manipulación y almacenamiento superiores.
Además, la utilización de un lípido catiónico,
tal como se describe anteriormente, para aumentar la inmunogenicidad
de un virosoma es también parte de la presente invención.
La figura 1 muestra la actividad de fusión de
los IRIV con diferentes composiciones de membrana antes y después
de la liofilización, medida mediante un ensayo FRET (ver ejemplo 9).
Se compara con los IRIV sin un lípido adicional (A) con
DC-Chol (B), DOTAP (C) y DHAB (D).
La figura 2 muestra un ELISA (ver ejemplo 21) de
suero de ratón inmunizado con IRIV DC-Chol que
contiene péptido AMA49-CPE en la superficie del
virosoma. Se compara con
AMA49-IRIV-DC-Chol
antes de la liofilización,
AMA49-IRIV-DC-Chol
después de la liofilización y reconstitución con agua,
IRIV-DC-Chol después de la
liofilización y reconstitución con péptido
AMA49-CPE y suero de control
AMA49-IRIV.
La figura 3 muestra un ensayo CTL (ver ejemplo
20) de ratones inmunizados con
IRIV-DC-Chol que contiene péptido
de unión a HLA dentro del virosoma. Se compara con los
DC-Chol-IRIV reconstituidos con
agua, 200 \mug/ml y 650 \mug/ml de péptido de unión a HLA.
La presente invención da a conocer composiciones
biológicamente activas y procedimientos para la liofilización y
reconstitución de virosomas. Para lograr la preservación de la
actividad de fusión de los virosomas de la presente invención, se
dan a conocer en este documento composiciones especiales de
membrana. Estas composiciones son parte integral de la presente
invención y comprenden junto con los fosfolípidos y la proteína
viral hemaglutinina, lípidos catiónicos, para proporcionar una
mayor resistencia a la tensión de liofilización para los virosomas
de la presente invención.
La presente invención se refiere a una
composición inmumogénica que comprende virosomas y un lípido
catiónico para la liofilización y reconstitución eficaces del
virosoma y, en particular, a una composición inmunogénica, en la
que un lípido catiónico está presente en la membrana para la
liofilización y reconstitución eficaces del virosoma. Los lípidos
catiónicos utilizados como componentes integrales de la membrana son
derivados de colesterol.
Preferentemente, los derivados de colesterol se
representan por la siguiente fórmula:
en la que R se selecciona del grupo
que comprende R'; R'-(C=O)-; R'-O-(C=O)-;
R'-NH-(C=O)-;
R'-O-(C=O)-R''-(C=O)-;
R'-NH-(C=O)-R''-(C=O)-,
en la que R' es un alquilo
C_{1}-C_{6} que ha sido sustituido, como mínimo,
por un grupo cargado positivamente, preferentemente un grupo que
contiene N de fórmula R_{1}R_{2}R_{3}N^{+}- y el contra ión
respectivo es X^{-};
en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se
seleccionan independientemente cada uno del grupo que comprende
hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{6};
en la que X^{-} se selecciona del grupo que
comprende halógeno, hidrógeno sulfato, sulfonato, dihidrógeno
fosfato, acetato, trihaloacetato y carbonato de hidrogeno; y
en la que R'' es alquileno
C_{1}-C_{6}.
Según la presente invención, R'' que es un
alquileno C_{1}-C_{6} representa una fracción de
alquileno C_{1}-C_{6} saturada que puede ser
-CH_{2}-, -(CH_{2})_{2}-, etc., que puede también estar
presente como una cadena ramificada, tal como
CH(CH_{3})-(CH_{2})_{2}-, etc.
En una realización aún más preferente, los
derivados de colesterol se representan mediante la fórmula II:
en la que R_{1}, R_{2} y
R_{3} son seleccionadas independientemente entre cada uno del
grupo que comprende hidrógeno y alquilo
C_{1}-C_{6} y en la que X^{-} es un anión de
halógeno.
En la realización más preferente, el lípido
catiónico se representa mediante la fórmula II, R_{1} y R_{2}
son metilo, R_{3} es hidrógeno y X^{-} es un anión de halógeno,
preferentemente cloruro, para obtener cloruro de
3\beta[N-(N',N'-dimetilamoniometano)-carbamoil]colesterol
(DC-Chol).
En otra realización más preferente el lípido
catiónico se representa mediante la fórmula II, R_{1,} R_{2} y
R_{3} son metilo y X^{-} es un anión de halógeno,
preferentemente cloruro, para obtener cloruro de
3\beta[N-(N',N',N'-trimetilamonioetano)-carbamoil]colesterol
(TC-Chol). Se encontró que ambos,
DC-Chol y TC-Chol, proporcionan
propiedades superiores en la conservación de la actividad de fusión
del virosoma después de la liofilización y reconstitución.
Los virosomas son envolturas de los virus y no
contienen el material genético infectivo del virus original. Tal
como los liposomas, los virosomas pueden utilizarse para administrar
sustancias terapéuticas a una amplia variedad de células y tejidos,
pero a diferencia de los liposomas, los virosomas ofrecen la ventaja
de entrar de forma eficiente en la célula seguido por la liberación
intracelular del contenido del virosoma activado por la proteína de
fusión viral. Además, debido a la incorporación de proteínas de
fusión viral activas en sus membranas, los virosomas liberan su
contenido en el citoplasma inmediatamente después de ser absorbidos
por la célula, evitando de esta manera la degradación de la
sustancia terapéutica en el ambiente ácido del endosoma. Los
virosomas pueden además cargarse simultáneamente con varios epítopos
diferentes de células B y células T (Poltl-Frank y
otros, 1999, Clin. Exp. Immunol. 117:496; Moreno y otros, 1993, J.
Inmunol. 151: 489) que incluyen epítopos universales de células T
auxiliares (Kumar y otros, 1992, J. Inmunol 148:
1499-1505) y otros conocidos por los expertos en la
materia. De esta manera, los virosomas son adyuvantes altamente
eficaces en la vacunación moderna, que poseen propiedades
superiores como vehículos de administración de antígenos y un
potencial inmunogénico fuerte a la vez que minimizan de forma
concomitante el riesgo de efectos secundarios.
En la presente invención se dan a conocer
composiciones biológicamente activas, que comprenden una sustancia
biológicamente activa seleccionada entre un agente farmacéutico y
una molécula antigénica incorporada en virosomas esféricos
sintéticos denominados Virosomas de Influenza Reconstituidos
Inmunopotenciadores (IRIVs). Los IRIVs son vesículas unilaminares
esféricas con un diámetro promedio de 150 nm y comprenden una
membrana doble de lípido que consiste esencialmente en
fosfolípidos, preferentemente fosfatidilcolinas (PC) y
fosfatidiletanolaminas (PE). A diferencia de los liposomas, los
IRIVs contienen las glicoproteínas funcionales hemaglutinina (HA) y
neuraminidasa (NA) de la envoltura viral intercaladas en la membrana
bicapa de fosfolípidos. La HA biológicamente activa no sólo le
confiere estabilidad estructural y homogeneicidad a las
formulaciones de virosomas, sino que también contribuye de manera
significativa a las propiedades inmunológicas manteniendo la
actividad de fusión de un virus.
Según la presente invención, dichas
composiciones biológicamente activas son capaces de administrar
sustancias biológicamente activas a un compartimiento celular de un
organismo. Dicha sustancia biológicamente activa se selecciona
entre agentes farmacéuticos y moléculas antigénicas, que se
seleccionan preferentemente del grupo que comprende ADN, ARN,
ARNsi, proteínas, péptidos, aminoácidos, medicamentos,
pro-medicamentos y sustancias farmacéuticas activas
o derivados de las mismas. Preferentemente, la sustancia
biológicamente activa es un medicamento farmacéutico, un antígeno o
una mezcla de los mismos.
Ejemplos de agentes farmacéuticos se seleccionan
del grupo que comprende anestésicos, inhibidores de angiogénesis,
preparaciones antiacné, antialérgicos, antibióticos y
quimioterapéuticos para uso tópico, antiestaminas,
antinflamatorios/antinfecciosos, agentes antineoplásicos,
antígenos, antiprotozoos, antirreumáticos, vacunas antivirales,
antivirales, antiapoptóticos, vacunas bacterianas,
quimioterapéuticos, citostáticos, agentes inmunosupresores, laxantes
y psicolépticos. Ejemplos preferentes del medicamento farmacéutico
o la sustancia inmunoactiva son doxorubicina, vinblastina,
cisplatina, metotrexato, ciclosporina e ibuprofeno.
El término "molécula antigénica" se refiere
a una molécula contra la que se desea una respuesta inmune. Esta
molécula puede seleccionarse de un grupo que comprende, sin
constituir limitación, péptidos, proteínas, lípidos, monosacáridos,
oligosacáridos, polisacáridos, glicopéptidos, carbohidratos,
lipopéptidos, patógenos y toxinas bacterianas o virales, otras
moléculas inmunogénicas pequeñas y ADN/ARN que codifican para dichas
moléculas. "Inmunogénico" se refiere a la capacidad de una
molécula de provocar una respuesta inmune en un organismo inoculado
con ésta. Ejemplos de moléculas antigénicas son péptidos basados en
antígenos de células T y antígenos de células B. Ejemplos
preferentes de moléculas antigénicas son antígenos de células T
basados en HCV, antígenos asociados a tumores, toxina de pertusis,
toxoide de cólera y malaria y antígenos de péptidos de RSV y
Alzheimer (en particular el amiloide beta).
Para aplicaciones terapéuticas de cáncer de la
presente invención, cualquier medicamento quimioterapéutico podría
ser adecuado para la encapsulación por los virosomas. Los
procedimientos y composiciones de la presente invención además son
adaptables a cualquier aplicación terapéuticamente relevante que se
beneficie de la administración de sustancias dirigidas a dianas en
células y tejidos específicos. Dichas aplicaciones pueden incluir la
administración dirigida a diana de medicamentos anticáncer a
células cancerosas, medicamentos antivirales a tejidos y células
infectadas, medicamentos antinflamatorios y antimicrobianos a
tejidos afectados, así como la administración de productos
terapéuticos a sólo aquellos órganos y tejidos que están afectados
por la enfermedad en particular, aumentando de esta manera el
índice terapéutico del medicamento terapéutico y evitando la
toxicidad sistémica. Por ejemplo, en la terapia de tumores, puede
administrarse doxorubicina, un antibiótico antitumor de la clase
antraciclina, mediante los procedimientos y composiciones de la
presente invención. Las antraciclinas tienen un amplio espectro de
actividad antitumor y ejercen efectos pleiotrópicos sobre la célula.
Aunque son agentes de intercalado de ADN clásicos, su mecanismo de
citotoxicidad se piensa que está relacionado con la interacción con
la enzima topoisomerasa II, producción de rupturas de ADN de doble
cadena y posiblemente la generación de radicales libres
intracelulares que son altamente citotóxicos. De esta manera, los
virosomas conjugados pueden cargarse con doxorubicina para inhibir
de manera selectiva y eficiente la progresión de tumores de pecho
que sobreexpresan rNeu establecidos.
Hasta la fecha, los virosomas se han utilizado
de forma eficaz en una variedad de vacunas. Por ejemplo, vacunas
comercialmente disponibles contra los virus de la hepatitis A y la
influenza. Los virosomas han probado ser sistemas
adyuvantes/portadores excelentes y seguros. Los anticuerpos
desarrollados por la inoculación con antígenos reconstituidos en
virosomas han mostrado una alta afinidad por los antígenos contra
los cuales se han desarrollado.
Inyectados solos, la mayoría de los antígenos de
péptidos muestra una inmunogenicidad relativamente baja. Pero en
forma combinada de antígeno y virosoma, pueden producirse títulos
medibles de anticuerpos altamente específicos contra el antígeno.
Los péptidos antigénicos pueden administrarse a través de virosomas,
ya sea en la superficie del virosoma o encapsulados en el virosoma.
La diferencia radica en el tipo de respuesta inmune. Cuando los
virosomas se fusionan con los endosomas después de la endocitosis,
se libera su contenido en el citoplasma celular, incluyendo un
antígeno encapsulado. En el citoplasma, dicho contenido se procesa
y se presenta en forma de complejo con moléculas de MHC de clase I
en la superficie de la célula, desencadenando la respuesta inmune
citotóxica celular mediada por células CD8+. A diferencia de ese
mecanismo, un antígeno de superficie es reconocido y es endocitado
por las células B, que lo presentan en forma de complejo con
moléculas MHC clase II, y de esta manera, provocan la respuesta
inmune humoral y la producción de anticuerpos específicos.
Para aumentar la velocidad de incorporación de
sustancias biológicas activas en los virosomas, la manipulación y
para permitir mayores períodos de almacenamiento, la presente
invención da a conocer procedimientos y composiciones para la
liofilización eficaz de los virosomas de la presente invención.
Cuando se trata de desarrollar un liofilizado de virosomas eficaz,
es un factor crucial la composición de la bicapa, que debe ser
considerado cuidadosamente. En este contexto, "liofilizado" se
refiere a la composición liofilizada antes de la reconstitución con
un disolvente seleccionado. "Reconstitución" se refiere al
proceso de solubilizar el liofilizado con un disolvente adecuado.
Por lo tanto, la presente invención experimentalmente aborda la
eficiencia de diferentes composiciones de membranas que comprenden
lípidos catiónicos, con carga neutral y sin carga para preservar el
tamaño y la funcionalidad del virosoma después de la liofilización y
la reconstitución. Como resultado, la presente invención da a
conocer composiciones de membranas de virosomas que permiten la
liofilización y reconstitución de virosomas sin pérdida de
función.
Basado en estos resultados experimentales, la
presente invención da a conocer liofilizados de virosomas
hidratables, altamente resistentes a la tensión de liofilización,
que comprenden derivados de colesterol catiónicos, en particular
DC-Chol o TC-Chol como componentes
integrales de la membrana.
Opcionalmente, dicho liofilizado de virosomas
adicionalmente comprende una sustancia biológicamente activa
seleccionada entre agentes farmacéuticos y/o moléculas antigénicas.
Estas sustancias biológicamente activas están unidas a la
superficie del virosoma o contenidas en él antes de la
liofilización.
En otra realización, el agente farmacéutico y/o
molécula antigénica se añade junto con el disolvente de
reconstitución al liofilizado de virosomas. Este agente
farmacéutico y/o molécula antigénica se une a la superficie del
virosoma recién formado. Preferentemente, el agente farmacéutico
y/o molécula antigénica están conjugados a lípidos para que se unan
a la membrana del virosoma a través del lípido. En otra realización,
la presente invención da a conocer procedimientos y composiciones
para encerrar agentes farmacéuticos y/o moléculas antigénicas en el
lumen de los virosomas recién formados.
En una realización preferente, una composición
de la presente invención comprende de 1,9 a 37% molar del contenido
total de lípidos de la membrana del virosoma de
DC-Chol o TC-Chol.
En una realización más preferente la
concentración de DC-Chol o TC-Chol
se encuentra entre 1,9 y 16% molar del contenido total de lípidos
de la membrana del virosoma.
El contenido residual de lípidos de la membrana
del virosoma consiste en fosfolípidos, preferentemente
fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. En una realización
altamente preferente, la proporción de fosfatidilcolina y
fosfatidiletanolamina comprendida en la membrana del virosoma es de
4:1.
Todas las composiciones descritas anteriormente
comprenden una cantidad funcional de hemaglutinina viral. En este
contexto "cantidad funcional" se refiere a una cantidad
suficiente para garantizar la fusión activa de las partículas de
virosoma.
Una molécula antigénica seleccionada puede
añadirse directamente a una de las composiciones descritas
anteriormente en una cantidad suficiente para provocar una
respuesta inmune, o disuelta en el tampón de reconstitución,
añadido al liofilizado de una de las composiciones descritas
anteriormente, durante el proceso de reconstitución. De esta
manera, la presente invención comprende además composiciones
adecuadas para liofilización que adicionalmente comprenden un
antígeno diana seleccionado.
El compuesto farmacéutico seleccionado puede
añadirse directamente a una de las composiciones descritas
anteriormente en una cantidad suficiente para mostrar actividad
biológica o disolverse en el tampón de reconstitución, añadido al
liofilizado de una de las composiciones descritas anteriormente
durante el proceso de reconstitución. De esta manera, la presente
invención comprende además composiciones adecuadas para la
liofilización de un antígeno diana seleccionado.
Las composiciones de la presente invención,
además, pueden comprender ingredientes auxiliares, que ayudan en el
proceso de liofilización. Estos ingredientes auxiliares comprenden,
sin constituir limitación, lioprotectores tales como sacarosa,
trealosa, dextrosa, lactosa, manosa, xilosa y manitol. Dichos
compuestos del tipo azúcares son particularmente útiles en una
proporción de 0,1 a 5% en la solución antes de la liofilización. El
término "lioprotector" se refiere a una clase de compuestos
útiles como ingredientes auxiliares durante el proceso de
liofilización que son capaces de reducir el estrés de liofilización
para el virosoma.
Es también parte de la presente invención el
procedimiento de liofilización de una composición de la presente
invención basado básicamente en las etapas de congelación, secado
primario y secado secundario y el siguiente proceso de
reconstitución con un disolvente o tampón que puede contener
opcionalmente el antígeno diana deseado.
La utilización de las composiciones que se dan a
conocer para la fabricación de un producto farmacéutico para la
vacunación o inoculación a un individuo con las mismas, es también
parte de la presente invención. Preferentemente, dicho individuo es
un humano.
Es también parte de la presente invención un kit
que comprende los virosomas de la presente invención que están ya
liofilizados. Dicho kit, junto con el liofilizado de virosomas,
puede comprender además un disolvente de reconstitución. Siempre
que la molécula antigénica no sea parte ya de los virosomas
liofilizados, dicho kit puede adicionalmente comprender un antígeno
diana. En una realización de la presente invención, el kit
comprende una molécula antigénica que será disuelta en el disolvente
de reconstitución antes de utilizar dicho disolvente de
reconstitución para solubilizar los virosomas liofilizados.
Adicionalmente, la presente invención da a
conocer el uso del lípido catiónico descrito anteriormente para
aumentar más la inmunogenicidad del virosoma. En este sentido, los
presentes inventores han encontrado que las propiedades
inmunogénicas del propio IRIV pueden aumentarse aún más mediante el
uso de un lípido catiónico, preferentemente uno de los derivados de
colesterol descritos anteriormente, como un componente de la
membrana del virosoma. En este contexto, el término
"inmunogenicidad" se refiere a la capacidad para provocar una
respuesta inmune.
Las composiciones de la presente invención
además pueden estar suplementadas mediante la combinación de
cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente con un
compuesto adicional potenciador de la respuesta inmune. Los
compuestos potenciadores de la respuesta inmune se clasifican en
adyuvantes o citoquinas. Los adyuvantes adicionales pueden además
aumentar la respuesta inmunológica proporcionando un reservorio de
antígeno (de forma extracelular o dentro de macrófagos), activando
los macrófagos y estimulando conjuntos específicos de linfocitos.
Son bien conocidos en la técnica adyuvantes de muchos tipos;
ejemplos específicos incluyen los de Freund (completo o
incompleto), micobacterias tales como BCG, M. Vacaae o Lípido A o
corynebacterium parvum, mezclas de saponina Quils, tales como
QS-21 (Smithkline Beecham), MF59 (Chiron) y varias
emulsiones aceite en agua (por ejemplo IDEC-AF).
Otros adyuvantes que pueden utilizarse, incluyen, sin constituir
limitación, sales minerales o geles minerales, tales como hidróxido
de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio; derivados de
LPS, saponinas, sustancias tensioactivas, tales como, lisolecitina,
polioles plurónicos, polianiones, péptidos o fragmentos de
proteínas, hemocianinas del la lapa y dinitrofenol; moléculas
inmunoestimuladoras, tales como saponinas, dipéptidos de muramilo y
derivados de tripéptidos, dinucliótidos de CpG, oligonucleótidos de
CpG, monofosforilo lípido A y polifosfacenos; adyuvantes en
partículas y micropartículas, tales como emulsiones, liposomas,
virosomas, coquelatos o adyuvantes inmunoestimuladores del complejo
mucosal. Las citoquinas son también útiles en los protocolos de
vacunación como resultado de las propiedades estimuladoras de
linfocitos. Muchas citoquinas útiles para dichos propósitos serán
conocidas por los expertos en la materia, incluyendo
interleuquina-2 (IL-2), y
IL-12, GM-CSF y muchas otras.
Cuando se administran, las composiciones
terapéuticas de la presente invención se administran en
preparaciones farmacéuticamente aceptables. Dichas preparaciones,
de manera rutinaria, pueden contener concentraciones de sal,
agentes tampones, preservantes, portadores compatibles, agentes
potenciadores de la respuesta inmune suplementarios, tales como,
adyuvantes y citoquinas y, opcionalmente, otros agentes
terapéuticos, farmacéuticamente aceptables. Las preparaciones de la
presente invención se administran en cantidades eficaces.
Generalmente, se consideran eficaces dosis de inmunógenos en el
intervalo de 1 nanogramo/kilogramo a 100 miligramos/kilogramo,
dependiendo del modo de administración. Se cree que el intervalo
preferente se encuentra entre 500 nanogramos y 500 microgramos por
kilogramo. La cantidad absoluta dependerá de varios factores, que
incluyen la composición seleccionada para la administración, si la
administración es en dosis única o múltiples y de los parámetros de
los pacientes individuales que incluyen edad, condición física,
tamaño, peso y la etapa de la enfermedad. Estos factores son bien
conocidos por los expertos en el sector y pueden abordarse con no
más de una experimentación de rutina.
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos.
Productos químicos: se obtuvieron de Fluka o
Sigma (Buchs, Suiza)
octaetilenglicol-mono-(n-dodecil)éter
(OEG, C_{12}E_{8}), ácido trifluoracético (TFA), bromuro de
dihexadecildimetilamonio (DHAB),
L-A-fosfatidil-L-serina
de cerebro bovino (PS),
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
(DPPE),
1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DLPC), colesterol de lanolina, 1-miristol-sn-glicero-3-fosfocolina (Liso-PC), cloruro de palmotoil-DL-carnitina y cloruro de colesterol N-(trimetilamonioetil)carbamato. La fosfatidil colina de huevo se obtuvo de Lipoid (Cham, Suiza). Se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EEUU) sal sódica de dipalmitoil-sn-glicero-fosfo-rac-(1-glicerol) (PDG), hidrocloruro de 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol), sal monosódica de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (DPPA) y 1,2-dipalmitoil etilen glicol (DPEG). Se obtuvieron de R. Berchtold (Laboratorio de Bioquímica, Universidad de Bern, Suiza) 1-palmitoil-3-oleoil-sn-glicero-2-fosforil-etanolamina. Las Bio-perlas SM2 y Bio-Gel A-15m se obtuvieron de Laboratorios Bio-Rad (Galttbrugg, Suiza). Se obtuvieron de Molecular Probes Europe (Leiden, Países Bajos) Lissamine®, sal trietilamónica de rodamina B 1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Rh-DHPE), N-(4,4-difluoro-5,7-difenil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propionil)-1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Bodipy 530/550-DHPE). Se obtuvo de Roche Applied Science (Rotkreuz, Suiza) cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP). Doxorubicina HCl está disponible de Fluka (Buchs, Suiza).
(DLPC), colesterol de lanolina, 1-miristol-sn-glicero-3-fosfocolina (Liso-PC), cloruro de palmotoil-DL-carnitina y cloruro de colesterol N-(trimetilamonioetil)carbamato. La fosfatidil colina de huevo se obtuvo de Lipoid (Cham, Suiza). Se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EEUU) sal sódica de dipalmitoil-sn-glicero-fosfo-rac-(1-glicerol) (PDG), hidrocloruro de 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol), sal monosódica de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (DPPA) y 1,2-dipalmitoil etilen glicol (DPEG). Se obtuvieron de R. Berchtold (Laboratorio de Bioquímica, Universidad de Bern, Suiza) 1-palmitoil-3-oleoil-sn-glicero-2-fosforil-etanolamina. Las Bio-perlas SM2 y Bio-Gel A-15m se obtuvieron de Laboratorios Bio-Rad (Galttbrugg, Suiza). Se obtuvieron de Molecular Probes Europe (Leiden, Países Bajos) Lissamine®, sal trietilamónica de rodamina B 1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Rh-DHPE), N-(4,4-difluoro-5,7-difenil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propionil)-1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Bodipy 530/550-DHPE). Se obtuvo de Roche Applied Science (Rotkreuz, Suiza) cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP). Doxorubicina HCl está disponible de Fluka (Buchs, Suiza).
Virus: los virus de influenza de la cepa
X-31 y de la cepa A/Sing (A/Singapur/6/86),
propagados en la cavidad alantoica de huevos embrionados (Gerhard,
J. Exp. Med. 144:985-995, 1976), se obtuvieron de
Berna Biotech AG (Bern, Suiza).
Péptidos: el péptido de unión a HLA del virus de
la hepatitis C (HCV) de unión a HLA-A2.1 (DLMGYIPLV,
aa 132-140) (Cerny y otros, J. Clin. Invest.
95(2):521-30, 1995) así como un péptido de
control de unión a HLA-A2.1 y el mimético de la
malaria AMA49-CPE
((1,3-Dipalmitoil-glicero-2-fosfoetanolamino)-Suc-GGCYKDEIKKEIE
RESKRIKLNDNDDEGNKKIIAPRIFISDDKDSLKCG (Puente disulfuro)) (Moreno y otros, Chembiochem 2: 838-43, 2001) se obtuvieron de bachem AG (Bubendorf, Suiza).
RESKRIKLNDNDDEGNKKIIAPRIFISDDKDSLKCG (Puente disulfuro)) (Moreno y otros, Chembiochem 2: 838-43, 2001) se obtuvieron de bachem AG (Bubendorf, Suiza).
Ratones: los experimentos de inmunización se
llevaron a cabo dos veces en laboratorios independientes en ratones
HDD transgénicos para la molécula clase I de histocompatibilidad
monocadena HLA-A2.1 (A0201) y deficiente de
H-2D^{b} y microglobulina
\beta-2 murina (Pascolo y otros, J. Exp. Med.
185(12):2043-51, 1997). Los ratones se
alojaron en facilidades para el cuidado animal adecuadas y se
manejaron según directrices internacionales.
Preparación de virosomas de influenza
reconstituidos inmunopotenciadores (IRIV): Los virosomas se
prepararon el método descrito anteriormente (Bron y otros, Methods
Enzymol. 220:313-331, 1993; Zurbriggen y otros, Prog
Lipid Res 39(1):3-18, 2000). Brevemente, se
disolvieron 32 mg (41,7 \mumol) de PC de huevo y 8 mg (11,1
\mumol) de PE en 2 ml de PBS. Se centrifugaron 4 mg de HA del
virus de la influenza a 100.00 x g durante 1 h a 4ºC y el
precipitado se disolvió en 2 ml de PBS/OEG. Los fosfolípidos
solubilizados con detergente y los virus se mezclaron y se
sonicaron durante 1 minuto. Esta mezcla se centrifugó a 100.000 x g
durante 1 h a 20ºC y el sobrenadante se filtró de forma estéril
(0,22 \mum). A continuación, se formaron los virosomas por
eliminación de detergente utilizando 180 mg de SM2
Bio-Beads húmedas durante 1 h a temperatura ambiente
con agitación y tres veces durante 30 min con 90 mg de SM2
Bio-Beads cada vez. Las concentraciones finales de
lípidos fueron 8 mg/ml (10,4 \mumol/ml) de PC y 2 mg/ml
(2,7 \mumol/ml) de PE.
(2,7 \mumol/ml) de PE.
La proporción hemaglutinina/fosfolípido se
determinó mediante determinación de fosfolípidos según Böttcher
(Böttcher y otros, Anal. Chim. Acta 24:202-203,
1961) y la cuantificación de HA mediante SDS-PAGE
con el método de extracción de Coomassie según Ball (Ball, Anal.
Biochem. 155:23-27, 1986).
Preparación de virosomas de influenza
reconstituidos inmunopotenciadores que contienen
DC-Chol (DIRIV): Los virosomas se prepararon el
método descrito anteriormente (Bron y otros, Methods Enzymol.
220:313-331, 1993; Zurbriggen y otros, Prog Lipid
Res 39(1):3-18, 2000). Brevemente, se
disolvieron 32 mg (41,7 \mumol) de PC de huevo y 8 mg (11,1
\mumol) de PE y 0,3 - 5 mg (0,6-10 \mumol) de
DC-Chol en 2 ml de PBS, 100 mM OEG
(OEG-PBS). Se centrifugaron 4 mg de HA del virus de
la influenza a 100.00 x g durante 1 h a 4ºC y el precipitado se
disolvió en 1 ml de PBS/OEG. Los fosfolípidos solubilizados con
detergente y los virus y 1 ml de sacarosa al 20% (p/v) se mezclaron
hasta un volumen final de 4 ml y se sonicaron durante 1 minuto. Esta
mezcla se centrifugó a 100.000 x g durante 1 h a 20ºC y el
sobrenadante se filtró de forma estéril (0,22 \mum). A
continuación, se formaron los virosomas por eliminación de
detergente utilizando 180 mg de SM2 Bio-Beads
húmedas durante 1 h a temperatura ambiente con agitación y tres
veces durante 30 min con 90 mg de SM2 Bio-Beads
cada vez. Las concentraciones finales de lípidos fueron 8 mg/ml
(10,4 \mumol/ml) de PC, 2 mg/ml (2,7 \mumol/ml) de PE y
0,075-1,25 mg/ml (0,12-2,5
\mumol/ml) de DC-Chol.
La proporción hemaglutinina/fosfolípido se
determinó mediante determinación de fosfolípidos según Böttcher
(Böttcher y otros, Anal. Chim. Acta 24:202-203,
1961) y la cuantificación de HA mediante SDS-PAGE
con el método de extracción de Coomassie según Ball (Ball, Anal.
Biochem. 155:23-27, 1986).
Preparación de AMA49-DIRIV:
Métodos de construcción de DIRIV con antígeno unido a lípido: La
preparación de virosomas en la que los antígenos se unen a la
superficie del virosoma. Para la preparación de IRIV mimético de
PE, se centrifugó una solución de hemaglutinina de Influenza
A/Singapur (4 mg) en tampón fosfatos salino (PBS) durante 30 min a
100.000 x g y el precipitado se disolvió en PBS (1,33 ml) que
contenía 100 mM de octaetilenglicolmonodecileter
(PBS-OEG). Se disolvieron conjugados
AMA49-PE (4 mg), fosfatidilcolina (32 mg; Lipoid,
Ludwigshafen, Alemania) y fofatidiletanolamina (6 mg) en un volumen
total de 2,66 ml de PBS-OEG. Se mezclaron el
fosfolípido y la hemaglutinina y se sonicaron durante 1 min. A
continuación, esta solución se centrifugó durante 1 hora a 100.000
x g y se filtró el sobrenadante (0,22 \mum) en condiciones
estériles. A continuación, se formaron los virosomas por
eliminación del detergente utilizando BioRad SM BioBeads (BioRad,
Glattbrugg, Suiza). El DIRIV se almacenó en alícuotas a -70ºC antes
de la liofilización.
Método de construcción de DIRIV con ligando
diana y espaciador: Este ejemplo demuestra la conjugación dirigida
a sitio del fragmento Fab' al brazo espaciador flexible diseñado
para mantener el sitio de unión a antígeno disponible para la unión
a la célula diana. A efectos de colocar las moléculas Fab' en una
posición que les permita mantener disponible su potencial de unión
bivalente, se conjugaron fragmentos de fab' al brazo espaciador
flexible mediante conjugación dirigida a sitio. Se disolvieron 100
mg de NHS-PEG-MAL que contiene un
brazo espaciador de polietilenglicol (PEG) largo en 3 ml de metanol
anhidro que contiene 10 \mul de trietanolamina. A continuación,
se añadieron a la solución 45 mg de dioleoil fosfatidiletanolamina
en 4 ml de cloroformo y metanol (1:3; v/v). La reacción se llevó a
cabo en nitrógeno durante 3 h a temperatura ambiente (RT). Se
eliminó metanol/cloroformo bajo disminución de presión y los
productos se redisolvieron en cloroformo. La solución fue extraída
con NaCl al 1% para eliminar el material que no reaccionó y los
subproductos solubles en agua. El
PE-PEG-MAL se purificó
adicionalmente mediante cromatografía de ácido salicílico tal como
se describe en Martin y otros (1982), con algunas modificaciones:
la columna de gel de sílice tiene un diámetro de 1,5 cm y se carga
con gel de sílice 14 (Kieselgel 60, Fluka 60752). La elusión se
realizó con el gradiente siguiente: cloroformo/metanol 29:1, 28:2,
27:3, 26:4 ml (etc.) Se colectaron 6 ml de fracciones. El
PE-PEG-MAL se obtuvo en las
fracciones 13-31. Las fracciones y la pureza se
analizaron por TLC en silicio con
cloroformo-metanol-agua- 65:25:4.
Se disolvió PE-PEG-MAL en tampón
Tris-HCl (100 mM, pH 7,6) que contenía 10 mg/150
\mul de octaetilenglicol-monodecileter
(C_{12}E_{8}). Se añadieron a esta solución los fragmentos de
Fab' a una proporción
Fab'/PE-PEG-MAL de 1:10. La
solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h en nitrógeno.
Se añadió más C_{12}E_{8} hasta obtener una solución de
C_{12}E_{8} al 1% y la mezcla de reacción se agitó durante toda
la noche a 4ºC. Se eliminó el
PE-PEG-MAL que no reaccionó por
adición de 400 \mul de Tiopropil Sepharose 6B lavada. Después de
3 horas de incubación, se eliminó el gel por centrifugación. Se
esterilizó la solución de
PE-PEG-Fab' (3,6 ml) por el paso a
través de un filtro de 0,2 \mum y se almacenó como una solución
detergente de C_{12}E_{8} a 0,01 M.
Método de preparación de FAB'DIRIV: Este ejemplo
demuestra la preparación de virosomas conjugados que han fijado
como diana células específicas. Se aisló hemaglutinina (HA) de la
cepa A/Singapur/6/86 del virus de la influenza tal como se describe
en Waelti y Glueck, Int. J. Cancer 77: 728-733,
1998. Se utilizó sobrenadante que contenía trímero de HA
solubilizado (2,5 mg/ml) en solución detergente de C_{12}E_{8} a
0,01 M para la preparación de los virosomas. Se añadió
fosfatidilcolina (38 mg) en cloroformo a un matraz de fondo redondo
y el cloroformo se evaporó mediante un evaporador rotatorio para
obtener una película de PC (fosfatidilcolina) fina sobre la pared
de vidrio. Se añadió a este recipiente el sobrenadante (4 ml que
contenía fragmentos Fab') del ejemplo 3. Bajo agitación suave, se
solubilizó la película de PC fina que cubría la pared de vidrio del
recipiente mediante la mezcla que contenía detergente
C_{12}E_{8}. El detergente de la solución resultante se eliminó
mediante extracción con Biobeads SM-2 estériles. El
recipiente se agitó durante 1 h con un agitador REAX2 (Heidolph,
Kelheim, Alemania). Para eliminar completamente el detergente, este
procedimiento se repitió tres veces con 0,58 mg de Biobeads,
después de lo cual se obtuvo una solución de
Fab'-virosomas ligeramente transparente. El
análisis cuantitativo reveló que 1 ml de
Fab'-Virosomas contiene 1,3 mg de HA, 5 mg de PC y
0,53 mg de fragmentos de Fab'. Las concentraciones de Fab' se
determinaron mediante un inmunoensayo de las fracciones colectadas
de la filtración en gel en la columna High Load Superdex 200 tal
como se describe en Anticuerpos, Un Manual de Laboratorio
("Antibodies, A Laboratory Manual"). El procedimiento para la
preparación de virosomas sin Fab' es el mismo excepto que no se
añade PE-PEG-Fab'.
Preparación de virosomas de influenza
reconstituidos inmunopotenciadores que contienen
DC-Chol (DIRIV) y que tienen
PE-PEG-Fab': Los virosomas se
prepararon por el método descrito anteriormente (Bron y otros,
Methods Enzymol. 220:313-331, 1993; Zurbriggen y
otros, Prog Lipid Res 39(1):3-18, 2000).
Brevemente, se disolvieron 32 mg (41,7 \mumol) de PC de huevo, 8
mg (11,1 \mumol) de PE y 0,3 - 5 mg (0,6-10
\mumol) de DC-Chol y el
PE-PEG-Fab' previamente formado en 2
ml de PBS, 100 mM de OEG (PBS-OEG). Se centrifugaron
4 mg de HA del virus de la influenza a 100.00 x g durante 1 h a 4ºC
y el precipitado se disolvió en 1 ml de PBS/OEG. Los fosfolípidos
solubilizados con detergente y los virus y 1 ml de sacarosa al 20%
(p/v) se mezclaron hasta un volumen final de 4 ml y se sonicaron
durante 1 minuto. Esta mezcla se centrifugó a 100.000 x g durante 1
h a 20ºC y el sobrenadante se filtró de forma estéril (0,22 \mum).
A continuación, se formaron los virosomas por eliminación de
detergente utilizando 180 mg de SM2 Bio-Beads
húmedas durante 1 h a temperatura ambiente con agitación y tres
veces durante 30 min con 90 mg de SM2 Bio-Beads cada
vez. Las concentraciones finales de lípidos fueron 8 mg/ml (10,4
\mumol/ml) de PC y 2 mg/ml (2,7 \mumol/ml) de PE y
0,075-1,25 mg/ml (0,12-2,5
\mumol/ml) de DC-Chol.
La proporción hemaglutinina/fosfolípido se
determinó mediante determinación de fosfolípidos según Böttcher
(Böttcher y otros, Anal. Chim. Acta 24:202-203,
1961) y la cuantificación de HA mediante SDS-PAGE
con el método de extracción de Coomassie según Ball (Ball, Anal.
Biochem. 155:23-27, 1986).
Cargando los DIRIV con una composición
farmacéutica de interés: Se cargó doxorubicina en los virosomas a
través de un gradiente de protones generado por sulfato de amonio
atrapado en virosoma, tal como se describe en Gabizon y otros, J.
Natl. Cancer Inst. 81: 1484-1488, 1989. Para cargar
los virosomas con sulfato de amonio, se añade una solución de
sulfato de amonio (4,17 g/ml) a la solución de DIRIV (7,5 ml), se
sonicó durante 1 min y se dializó (Specvtra/Por 2,1, Biotech
DispoDialyzers, MWCO: 15.000, Spectrum Medical Industries, Houston
TX, EEUU) contra 1 litro de PBS que contiene 5% de glucosa durante
24 horas a 4ºC. Después de 24 horas se cambió el tampón de diálisis
y la solución de virosomas se dializó durante 24 horas más. Para
preparar la solución de carga de doxorubicina, se disolvieron 10 mg
de doxorubicina en 3 ml de agua y se esterilizaron a través de un
filtro de 0,2 \mum, a continuación se añadieron 750 \mul de PBS
concentrado 5X estéril y 5% de glucosa.
La solución de virosomas y la solución de carga
de doxorubicina se calentaron hasta 33ºC, y a continuación se
mezclaron 2 volúmenes de solución de virosomas con un volumen de
solución de carga de doxorubicina. La mezcla se incubó durante 10 h
a 33ºC y además se incubó durante toda la noche a 28ºC. La
doxorubicina no encapsulada se separó de los virosomas mediante
filtración en gel en una columna High Load Superdex 200 (Pharmacia,
Uppsala, Suecia), equilibrada con PBS estéril, 5% de glucosa. Las
fracciones de volumen vacío que contienen
Fab'-virosomas con doxorubicina encapsulada se
eluyen con 5% de glucosa en PBS y se colectan.
Liofilización de DIRIV: los DIRIV se almacenaron
en alícuotas a -70ºC antes de la liofilización. La liofilización se
llevó a cabo en un "speedvac" Savant AES1010, según las
instrucciones del fabricante. Las muestras secas se utilizaron
inmediatamente o se almacenaron a -70ºC. Para la reconstitución del
DIRIV liofilizado, se añadió un volumen de agua igual al volumen
antes de la liofilización a los DIRIV secos. Los DIRIV vacíos
reconstituidos se almacenaron a 4ºC.
Preparación de péptido de unión a
HLA-DIRIV: los DIRIV se almacenaron en alícuotas a
-70ºC antes de la liofilización. La liofilización se llevó a cabo
en un "speedvac" Savant AES1010, según las instrucciones del
fabricante. Las muestras secas se utilizaron inmediatamente o se
almacenaron a -70ºC. Para la reconstitución del DIRIV liofilizado,
se añadió un volumen de péptido de unión a HLA disuelto en agua
igual al volumen antes de la liofilización a los DIRIV secos. Los
péptidos de unión a HLA-DIRIV reconstituidos se
almacenaron a 4ºC. La determinación de la concentración de péptido
encapsulado se realizó por RP-HPLC.
Los DIRIV se almacenaron en alícuotas a -70ºC
antes de la liofilización. La liofilización se llevó a cabo en un
"speedvac" Savant AES1010, según las instrucciones del
fabricante. Las muestras secas se utilizaron inmediatamente o se
almacenaron a -70ºC. Para la reconstitución del DIRIV liofilizado,
se añadió un volumen de AMA49-CPE disuelto en agua
igual al volumen antes de la liofilización a los DIRIV secos. Los
péptidos de unión a HLA-DIRIV reconstituidos se
almacenaron a 4ºC. La determinación de la concentración de péptido
incorporado se realizó por RP-HPLC.
Preparación de
DOXRUBICINA-DIRIV: los DIRIV se almacenaron en
alícuotas a -70ºC antes de la liofilización. La liofilización se
llevó a cabo en un "speedvac" Savant AES1010, según las
instrucciones del fabricante. Las muestras secas se utilizaron
inmediatamente o se almacenaron a -70ºC. Para preparar la solución
de carga de doxorubicina, se disolvieron 10 mg de doxorubicina en 3
ml de agua y se esterilizó mediante un filtro de 0,2 \mum. Para
la reconstitución de los DIRIV liofilizados, se añadió un volumen de
DOXRUBICINA igual al volumen antes de la liofilización a los DIRIV
secos. Los DOXRUBICINA-DIRIV reconstituidos se
almacenaron a 4ºC.
Determinación de DOXRUBICINA incorporada: la
cantidad de fármaco incorporado, en este caso, doxrubicina, se
determina mediante absorbancia a 480 nm. Las preparaciones de DIRIV
contienen un promedio de 150 \mug/nl de doxrubicina. El diámetro
promedio de los virosomas se determina mediante espectroscopia de
correlación de fotones (PCS) con un Coulter N4Plus
Sub-Micron-Particle Size Analizar
(Miami, FL, EEUU). La expresión adecuada de actividad fusogénica
viral de los virosomas se mide tal como se ha descrito anteriormente
por Hoekstra y otros, Biochemistry 23: 5675-5681,
1984, mediante un ensayo basado en el aumento de la fluorescencia de
octadecilrodamina (R18).
Preparación de virosomas de influenza
reconstituidos inmunopotenciadores que contienen otros lípidos: los
virosomas se prepararon tal como se describe en el ejemplo 3 con la
única diferencia que se reemplazó DC-Chol por una
de las siguientes sustancias: DHAB, DOTAP, PS, colesterol, DPPE,
DLPC, Lyso-PC,
palmitoil-DL-carnitina, DPEG o
TC-Chol. Las concentraciones finales de lípidos
fueron8 mg/ml (10,4 \mumol/ml) de PC, 2 mg/ml (2,7 \mumol/ml)
de PE y 0,125 mg/ml (0,22 \mumol/ml) de DHAB, ó 0,125 mg/ml (0,18
\mumol/ml) de DOTAP, ó 2-8 mg/ml
(2,8-11,3 \mumol/ml) de PS, ó 0,125 mg/ml (0,23
\mumol/ml) de TC-Chol, respectivamente.
Los IRIV modificados se almacenaron en alícuotas
a -70ºC antes de la liofilización. La liofilización se llevó a cabo
en un "speedvac" Savant AES1010, según las instrucciones del
fabricante. Las muestras secas se utilizaron inmediatamente o se
almacenaron a -70ºC. Para la reconstitución de los virosomas
liofilizado, se añadió un volumen de agua o Péptido de unión a HLA
PBS en agua igual al volumen antes de la liofilización a los
virosomas secos. Los virosomas reconstituidos se almacenaron a
4ºC.
Cuantificación del péptido de unión a HLA: la
cuantificación del péptido se realizó por HPLC en un Agilent 1100
Series (Agilent Technologies, Suiza) usando una columna de fase
inversa CC 124/4,6 Nucleosil 100-5 C8
(Macherey-Nagel, Suiza) (RP-HPLC).
Se utilizaron los siguientes eluyentes: tampón A, 10 mM de TEAP en
agua; tampón B, acetonitrilo al 100%. Programa de HPLC: velocidad
de flujo 1,3 ml/min; temperatura del tampón y de la columna 25ºC;
concentración inicial de tampón: 25% de B; 0-7 min:
aumento de tampón B hasta 38%; 7-12,4 min: aumento
de tampón B hasta 100%; 12,4-16,4 min: 100% de
tampón B. Para la cuantificación del péptido encapsulado, se cargó
una fracción (5-30 \mul) de virosomas en columnas
"spin" de filtración en gel de 1 ml de Sephadex G50 Coarse
equilibradas con PBS recién preparadas. Las vesículas con el péptido
encapsulado sólo se obtuvieron después de la centrifugación de las
columnas "spin" a 300 x g durante 2 min, ya que el péptido no
encapsulado se retarda en la columna.
Cuantificación del péptido
AMA49-CPE: la cuantificación del péptido se realizó
por HPLC en un Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, Suiza)
usando una columna de fase inversa ZORBAX Eclipse
XDB-C8 (Agilent Technologies, Suiza)
(RP-HPLC). Se utilizaron los siguientes eluyentes:
tampón A, 0,1% de TFA en agua; tampón B, 0,1% de TFA en metanol.
Programa de HPLC: velocidad de flujo 1,0 ml/min; temperatura del
tampón y de la columna 60ºC; concentración inicial de tampón: 60%
de B; 0-7 min: aumento de tampón B hasta 100%;
15-20 min: 100% de tampón B. Para la cuantificación
del péptido encapsulado, se cargó una fracción (5-30
\mul) de virosomas en columnas "spin" de filtración en gel
de 1 ml de Sephadex G50 Coarse equilibradas con PBS recién
preparadas. Las vesículas con el péptido encapsulado sólo se
obtuvieron después de la centrifugación de las columnas "spin"
a 300 x g durante 2 min, ya que el péptido no encapsulado se
retarda en la columna.
Ensayo FRET: para las mediciones de fusión in
vitro mediante transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia (FRET) (Struck y otros, Biochemestry
20(14):4093-99, 1981; Loyter y otros, Methods
Biochem. Anal. 33:129-64, 1988), se desarrolló el
siguiente ensayo: se incorporaron a liposomas 0,75% molar de Bodipy
530/550-DHPE y 0,25% molar de
N-Rh-DHPE que comprendían PC/PDG
(70:30). Las mediciones de fluorescencia se llevaron a cabo a
temperaturas discretas entre 4ºC y 42ºC en 5 mM de tampón fosfato
saliano pH 7,5, 100 mM de NaCl, en un volumen final de 0,8 ml en
microcubetas PMMA de 2,5 ml (VWR, Suiza) bajo agitación continua.
Usualmente, se mezclaron 1 \mul de liposomas marcados (o,3 nmol
de fosfolípidos) con 5-20 \mul de virosomas
(0,1-0,4 nmol de fosfolípidos) y la fusión se
activó mediante la adición de 3,75-7 \mul de HCL
1M, lo que dio como resultado un pH de 4,5. El aumento de la
fluorescencia se registró cada 5 segundos en las longitudes de onda
de excitación y emisión de 538 nm y 558 nm, respectivamente, con una
rendija ("slit") de excitación de 2, nm y una rendija de
emisión de 15 nm. Las mediciones se llevaron a cabo con un
espectrómetro LS 55 Luminiscence (Perkin Elmer Instruments, USA)
equipado con un soporte de cubetas termostatado y un dispositivo de
agitación magnética. La fluorescencia máxima a dilución de sonda
infinita se alcanzó después de la adición de Triton
X-100 (0,5% v/v de concentración final). Para la
calibración de la escala de fluorescencia, se fijó a cero la
fluorescencia residual inicial de los liposomas y la fluorescencia a
dilución de sonda infinita al 100%.
La determinación del tamaño de partículas se
realizó mediante dispersión de la luz utilizando un instrumento
Zetasizer 1000HS (Malvern Instruments, UK) en cubetas PMMA de 2 ml
(Sarstedt AG, Suiza). Se diluyeron 5-20 \mul de
virosomas o liposomas, respectivamente, en PBS filtrado (0,22
\mum) y se midió tres veces durante 300 segundos a 25ºC y 633 nm
según las instrucciones del fabricante.
Preparación de liposomas que contienen
DC-Chol (DC-liposomas): se
disolvieron 32 mg (41,7 \mumol) de PC, 8 mg (11,1 \mumol) de PE
y 0,8 - 5 mg (1,6-10 \mumol) de
DC-Chol en 4 ml de PBS, 100 mM de OEG, 5% (p/v) de
sacarosa (PBS-OEG), a continuación se mezclaron y se
sonicaron durante 1 minuto. Esta mezcla se filtró de forma estéril
(0,22 \mum) y a continuación se formaron los liposomas por
eliminación de detergente utilizando 180 mg de SM2
Bio-Beads húmedas durante 1 h a temperatura ambiente
con agitación y tres veces durante 30 min con 90 mg de SM2
Bio-Beads cada vez. Las concentraciones finales de
lípidos fueron 8 mg/ml (10,4 \mumol/ml) de PC y 2 mg/ml (2,7
\mumol/ml) de PE y 0,2-1,25 mg/ml
(0,4-2,5 \mumol/ml) de DC-Chol.
Los liposomas se almacenaron en alícuotas a -70ºC antes de la
liofilización. La liofilización se llevó a cabo en un
"speedvac" Savant AES1010, según las instrucciones del
fabricante. Las muestras secas se utilizaron inmediatamente o se
almacenaron a -70ºC. Para la reconstitución de los
DC-liposomas liofilizados, se añadió un volumen de
agua o péptido de unión a HLA disuelto en agua, respectivamente, a
los DC-liposomas secos. Los
DC-liposomas-péptido de unión a HLA
se almacenaron a 4ºC.
Preparación de liposomas: se mezclaron en
conjunto 78 mg (101,6 \mumol) de PC (disuelto en metanol) y 32,68
mg (43,56 \mumol) de PDG (disuelto en metanol/cloroformo (1:1))
(proporción molar 70:30) y el disolvente se eliminó utilizando un
evaporador rotatorio (Rotavapor R-205, Büchi
Labortechnik, Suiza) a 40ºC a un vacío gradual de
30-10 kPa. La película de lípido seca se rehidrató
con 1,5 ml de sacarosa en agua al 5% (p/v). Los liposomas se
almacenaron en alícuotas a -70ºC antes de la liofilización. La
liofilización se llevó a cabo en un "speedvac" Savant AES1010,
según las instrucciones del fabricante. Las muestras secas se
utilizaron inmediatamente o se almacenaron a -70ºC. Para la
reconstitución de los liposomas liofilizados, se añadió PBS o
péptido de unión a HLA disuelto en PBS, respectivamente, a los
liposomas secos. Los liposomas-péptido de unión a
HLA se almacenaron a 4ºC.
Preparación de los liposomas que contienen
DC-Chol (DC-liposomas): se
disolvieron 66,8-75,2 mg (87,1-98
\mumol) de PC (disuelto en metanol) y 32,68 mg (43,56 \mumol)
de DPPG (disuelto en metanol/cloroformo (1:1)) y 1,82 - 7,26 mg
(3,6-14,5 \mumol) de DC-Chol
(disuelto en metanol) (proporción molar
60-67,5:30:2,5-10) y el disolvente
se eliminó utilizando un evaporador rotatorio (Rotavapor
R-205, Büchi Labortechnik, Suiza) a 40ºC a un vacío
gradual de 30-10 kPa. La película de lípido seca se
rehidrató con 1,0 ml de sacarosa en agua al 5% (p/v). Los liposomas
se almacenaron en alícuotas a -70ºC antes de la liofilización. La
liofilización se llevó a cabo en un "speedvac" Savant AES1010,
según las instrucciones del fabricante. Las muestras secas se
utilizaron inmediatamente o se almacenaron a -70ºC. Para la
reconstitución de los DC-liposomas liofilizados, se
añadió PBS o péptido de unión a HLA disuelto en PBS,
respectivamente, a los DC-liposomas secos. Los
DC-liposomas-péptido de unión a HLA
se almacenaron a 4ºC.
Inmunización y ensayo de citotoxicidad: se
inmunizaron ratones tg HLA 2.1 por vía subcutánea (sc) en la base de
la cola con 100 \mul de la formulación de virosomas
correspondiente. Los ratones recibieron 2 inyecciones en un
intervalo de 3 semanas y la respuesta se analizó 2 semanas después
de la última inyección. Células del bazo (4 x 10^{6}/pocillo) de
ratones inmunizados fueron reestimuladas durante 5 días en placas de
cultivo de tejidos de 24 pocillos con 2 x 10^{6} células de bazo
irradiadas (1500 rad) que habían recibido un pulso de 10 \mug/ml
de péptido, en medio RPMI completo (Sigma Aldrich, St. Louis, MO),
que contiene 2 mM de L-Glutamina, 100 U de
penicilina, 100 \mug/ml de streptomicina (Sigma Aldrich), 5 mM de
Hepes, 10% de FCS (Gibco BRL, Basel Suiza) y 5 x 10^{-5} M de
2-mercaptoetanol a 37ºC y 5% de CO_{2}. En el día
2, se añadieron 5 U/ml de IL-2 (EuroCetus B.V.,
Amsterdam, Holanda). Se ensayó la actividad citolítica específica en
un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar contra células diana
EL-4S3^{-}Rob HHD pulsadas con 10 \mug/ml de los
péptidos seleccionados o medio de control. Después de 4 horas de
incubación, se midió el 51Cr liberado utilizando un contador
\gamma. Se determinó la liberación espontánea y máxima de los
pocillos que contenían medio sólo o después de la lisis con HCL 1M,
respectivamente. La lisis se calculó mediante la fórmula:
(liberación en ensayo - liberación espontánea)/(liberación máxima -
liberación espontánea) x 100. La lisis específica de péptido se
determinó como el porcentaje de lisis obtenido en presencia o en
ausencia de péptido. La liberación espontánea fue siempre menos del
15% de la liberación máxima.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima ELISA
contra AMA49-CPE: se recubrieron placas de
microtitulación ELISA (Polysorb, Nunc, VWR Interbational AG, Suiza)
a 4ºC durante toda la noche con 100 \mul/pocillo de 10 \mug/ml
de AMA49-CPE en PBS. Los pocillos se lavaron tres
veces con 300 \mul/pocillo de PBS que contiene 0,05% de
Tween-20 antes de que se bloquearan con 5% de polvo
de leche durante 2 h a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con
300 \mul/pocillo de PBS que contiene 0,05% de
Tween-20. A continuación, las placas se incubaron
con diluciones dobles seriadas de suero de ratón en PBS que contiene
0,05% de Tween-20 y 5% de polvo de leche (100
\mul/pocillo) durante 2 h a 37ºC. Después de lavarse, las placas
se incubaron con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra
conjugada con fosfatasa alcalina (específica para la cadena
\gamma) (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 h a 37ºC y a
continuación se lavaron 3 veces. Se añadió sustrato de fosfatasa (1
mg/ml de fosfato de p-nitrofenilo (Signa) en 0,14%
(p/v) de Na_{2}CO_{3}, 0,3% (p/v) de NaHCO_{3}, 0,02% (p/v) de
MgCl_{2}, pH 9,6) y se incubó a temperatura ambiente en la
oscuridad. Después de un tiempo adecuado se detuvo la reacción
mediante la adición de 100 \mul/pocillo de ácido sulfúrico 1M. La
densidad óptica del producto de reacción se registró a 405 nm con
un lector de microplacas (Spectra MAX plus, Molecular Devices,
Bucher Biotech AG, Suiza).
Preparación de una formulación de vacuna contra
la influenza que contiene Dc-Chol: se prepararon
tres soluciones madre de virosomas de influenza por el método
descrito anteriormente (bron y otros, Methods Enzymol.
220:313-331, 1993; Zurbriggen y otros, Prog. Lipid
Res. 39(1):3-18, 2000). Brevemente, se
disolvieron 32 mg (41,7 \mumol) de PC de huevo y 0,3 - 5 mg
(0,6-10 \mumol) de DC-Chol en 2 ml
de PBS, 100 mM de OEG (OEG-PBS). Se centrifugaron 4
mg de virus de influenza (primera solución madre A/Nueva
Caledonia/20/99 (H1N1); segunda solución madre A/Fujian/411/2002
(H3N2), tercera solución madre B/Shangai/361/2002) a 100.000 x g
durante 1 h a 4ºC y el precipitado se disolvió en 1 ml de PBS/OEG.
Los fosfolípidos solubilizados con detergente y los virus y 1 ml de
sacarosa al 20% (p/v) se mezclaron hasta un volumen final de 4 ml y
se sonicaron durante 1 minuto. Esta mezcla se centrifugó a 100.000
x g durante 1 hora a 20ºC y el sobrenadante se filtró de forma
estéril (0,22 \mum). A continuación, las tres soluciones madre de
virosomas diferentes se formaron mediante la eliminación del
detergente utilizando 180 mg de SM2 Bio-Beads
húmedas durante 1 h a temperatura ambiente con agitación y tres
veces durante 30 min con 90 mg de SM2 Bio-Beads cada
vez. La concentración final de los lípidos fueron de 8 mg/ml (10,4
\mumol/ml) de PC, 2 mg/ml (2,7 \mumol/ml) de PE y
0,075-1,25 mg/ml (0,12-2,5
\mumol/ml) de DC-Chol.
Después de la cuantificación de HA, se mezclaron
las tres soluciones madre y se liofilizaron. La liofilización se
llevó a cabo en un "speedvac" Savant AES1010, según las
instrucciones del fabricante. Las muestras secas se utilizaron
inmediatamente o se almacenaron a -70ºC. Para la reconstitución de
la formulación de vacuna de influenza liofilizada, se añadió un
volumen de agua igual al volumen antes de la liofilización a los
DIRIV secos. Los DIRIV vacíos se almacenaron a 4ºC.
Claims (38)
1. Composición biológicamente activa que
comprende, como mínimo, virosoma de influenza reconstituido
inmunopotenciador (IRIV) y un derivado de colesterol catiónico para
la liofilización y reconstitución eficaz del virosoma, en la que
dicho derivado de colesterol catiónico para la liofilización y
reconstitución eficaz del virosoma está presente en la membrana del
virosoma.
2. Composición, según la reivindicación 1, en la
que dicho derivado de colesterol tiene un sustituyente cargado
positivamente en la posición 3 del colesterol y se representa
mediante la fórmula:
- en la que R se selecciona del grupo que comprende R'; R'-(C=O)-; R'-O-(C=O)-; R'-NH-(C=O)-; R'-O-(C=O)-R''-(C=O)-; R'-NH-(C=O)-R''-(C=O)-,
- en la que R' es un alquilo C_{1}-C_{6} que está sustituido, como mínimo, por un grupo cargado positivamente, preferentemente un grupo que contiene N de fórmula R_{1}R_{2}R_{3}N^{+}- y el contraión respectivo es X^{-};
- en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan cada uno independientemente del grupo que comprende hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{6};
- en la que X se selecciona del grupo que comprende halógeno, hidrógeno sulfato, sulfonato, dihidrogeno fosfato, acetato, trihaloacetato e hidrógeno carbonato; y
- en la que R'' es alquileno C_{1}-C_{6}.
3. Composición, según la reivindicación 2, en la
que dicho derivado de colesterol se representa mediante la fórmula
siguiente:
- en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan cada uno independientemente del grupo que comprende hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{6}, y
- en la que X^{-} es un anión de halógeno.
4. Composición, según la reivindicación 3, en la
que R_{1} y R_{2} son metilo y R_{3} es hidrógeno.
5. Composición, según la reivindicación 3, en la
que R_{1}, R_{2} y R_{3} son metilo.
6. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en la que el contenido de
lípido catiónico está entre 1,9 y 37% molar del contenido total de
lípidos de la membrana.
7. Composición, según la reivindicación 6, en la
que el contenido de lípido catiónico está entre 1,9 y 16% molar del
contenido total de lípidos de la membrana.
8. Composición, según la reivindicación 6 ó 7,
en la que el contenido de lípido residual de la membrana virosomal
consiste en fosfolípidos.
9. Composición, según la reivindicación 8, en la
que los fosfolípidos son fosfatidilcolina y
fosfatidiletanolamina.
10. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende un
lioprotector.
11. Composición, según la reivindicación 10, en
la que el lioprotector se selecciona del grupo que comprende
sacarosa, trealosa, dextrosa, lactosa, manosa, xilosa y
manitol.
12. Composición, según la reivindicación 11, en
la que el lioprotector está presente en una proporción de 0,1 a 5%
(p/v) en la solución antes de la liofilización.
13. Composición, según las reivindicaciones 10 a
12, que comprende adicionalmente un adyuvante o un sistema
adyuvante.
14. Composición, según las reivindicaciones 1 a
9 ó 10 a 13, que comprende adicionalmente una sustancia
biológicamente activa seleccionada entre un agente farmacéutico o
una molécula antigénica.
15. Composición, según la reivindicación 14, en
la que dicha sustancia biológicamente activa está unida a la
superficie del virosoma y/o en el interior del virosoma.
16. Procedimiento para la liofilización de
virosomas que utiliza las composiciones según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, que comprende las etapas de:
- a)
- congelación de dicha composición,
- b)
- secado primario de dicha composición congelada a una primera presión reducida, y
- c)
- secado secundario de dicha composición congelada a una segunda presión reducida,
- en el que dicho secado primario se lleva a cabo a una presión mayor que dicha segunda presión reducida.
17. Procedimiento para la liofilización de
virosomas que utiliza las composiciones según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15, que comprende las etapas de:
- a)
- congelación de dicha composición que comprende dicha sustancia biológicamente activa seleccionada entre un agente farmacéutico y una molécula antigénica,
- b)
- secado primario de dicha composición congelada a una primera presión reducida, y
- c)
- secado secundario de dicha composición congelada a una segunda presión reducida,
- en el que dicho secado primario se lleva a cabo a una presión mayor que dicha segunda presión reducida.
18. Liofilizado de virosomas obtenible mediante
el procedimiento de la reivindicación 16.
19. Liofilizado de virosomas obtenible mediante
el procedimiento de la reivindicación 17.
20. Procedimiento para la reconstitución de un
liofilizado de virosomas según la reivindicación 18, que comprende
la etapa de solubilizar el liofilizado de virosomas en un disolvente
de reconstitución.
21. Procedimiento, según la reivindicación 20,
en el que el disolvente de reconstitución comprende dicha sustancia
biológicamente activa seleccionada entre un agente farmacéutico y
una molécula antigénica.
22. Procedimiento para la reconstitución de un
liofilizado de virosomas según la reivindicación 19, que comprende
la etapa de solubilizar el liofilizado de virosomas en un disolvente
de reconstitución.
23. Uso de cualquiera de las composiciones según
las reivindicaciones 1 a 15 para la fabricación de un producto
farmacéutico para inocular con ella a un sujeto.
24. Uso, según la reivindicación 23, en el que
el sujeto es un humano.
25. Kit que comprende un recipiente que contiene
el liofilizado de la reivindicación 18.
26. Kit, según la reivindicación 25, que
comprende además un segundo recipiente que contiene un disolvente de
reconstitución y dicha sustancia biológicamente activa seleccionada
entre un agente farmacéutico y una molécula antigénica.
27. Kit que comprende un recipiente que contiene
el liofilizado de la reivindicación 19.
28. Kit, según la reivindicación 27, que
comprende además un segundo recipiente que contiene un disolvente de
reconstitución.
29. Uso de un derivado de colesterol catiónico
para mejorar la reconstitución de un virosoma después de la
liofilización, comprendiendo dicho virosoma, en su estado
reconstituido, una sustancia biológicamente activa seleccionada
entre un agente farmacéutico y una molécula antigénica, en el que
dicho virosoma es un virosoma de influenza reconstituido
inmunopotenciador (IRIV).
30. Uso, según la reivindicación 29, en el que
dicho derivado de colesterol catiónico tiene un sustituyente cargado
positivamente en la posición 3 del colesterol y se representa
mediante la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
- en la que R se selecciona del grupo que comprende R'; R'-(C=O)-; R'-O-(C=O)-; R'-NH-(C=O)-; R'-O-(C=O)-R''-(C=O)-; R'-NH-(C=O)-R''-(C=O)-,
- en la que R' es un alquilo C_{1}-C_{6} que está sustituido, como mínimo, por un grupo cargado positivamente, preferentemente un grupo que contiene N de la fórmula R_{1}R_{2}R_{3}N^{+}- y el contraión respectivo es X^{-};
- en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan cada uno independientemente del grupo que comprende hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{6};
- en la que X^{-} se selecciona del grupo que comprende halógeno, hidrógeno sulfato, sulfonato, dihidrogeno fosfato, acetato, trihaloacetato e hidrógeno carbonato; y
- en la que R'' es alquileno C_{1}-C_{6}.
31. Uso, según la reivindicación 30, en el que
dicho derivado de colesterol se representa mediante la fórmula:
- en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan cada uno independientemente del grupo que comprende hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{6}, y
- en la que X'' es un anión de halógeno.
32. Uso, según la reivindicación 31, en el que
R_{1} y R_{2} son metilo y R_{3} es hidrógeno.
33. Uso, según la reivindicación 31, en el que
R_{1}, R_{2} y R_{3} son metilo.
34. Uso, según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 33, en el que el contenido de lípido catiónico
en la membrana virosomal está entre 1,9 y 37% molar del contenido
total de lípidos de la membrana.
35. Uso, según la reivindicación 34, en el que
el contenido de lípido catiónico en la membrana virosomal está
entre 1,9 y 16% molar del contenido total de lípidos de la
membrana.
36. Uso, según la reivindicación 34 ó 35, en el
que el contenido de lípido residual de la membrana virosomal
consiste en fosfolípidos.
37. Uso, según la reivindicación 36, en el que
los fosfolípidos son fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina.
38. Uso, según cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 37, que adicionalmente comprende un adyuvante
o un sistema adyuvante.
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