PT1833465E - Liofilização de virossomas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "LIOFILIZAÇÃO DE VIROSSOMAS"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a composições e métodos para a liofilização eficaz e reconstituição de virossomas.

Antecedentes da invenção

Liofilização ou "secagem em congelação" é um processo técnico para a remoção de água. Neste, a solução aquosa é arrefecida abaixo do seu ponto eutéctico, até estar completamente congelada. Depois, a pressão barométrica é reduzida até ao vácuo, de modo que a água sublima e é drenada da solução. 0 agente solubilizado permanece como um sólido poroso, que pode, mais tarde, ser de novo dissolvido em água. A secagem em congelação produz sólidos com uma grande área de superfície, resultando em elevada solubilidade em água. A liofilização é vastamente utilizada em aplicações farmacêuticas, uma vez que a maior parte dos fármacos possui um tempo de armazenamento limitado em solução. 0 seu tempo de vida pode ser significativamente aumentado através da produção de liofilizados que são dissolvidos imediatamente antes da utilização, num solvente adequado. Embora tenha sido provado que a liofilização é uma técnica de conservação superior largamente 1 utilizada actualmente, apresenta desvantagens inerentes. Estas estão maioritariamente acopladas aos processos de congelamento e reconstituição, que são, frequentemente, prejudiciais para os agentes bioactivos ou composições. Para preservar a funcionalidade e actividade, evoluíram diferentes técnicas, especialmente a utilização de crioprotectores incluindo, por exemplo, açúcares como sacarose ou trealose.

Os lipossomas e virossomas possuem propriedades excelentes como veículos de distribuição de fármacos. Enquanto os lipossomas são vesículas esféricas de lípido, os virossomas são envelopes de vírus que não contêm o material genético infeccioso do vírus original. A diferença entre lipossomas e virossomas é que os virossomas contêm proteínas adicionais na sua superfície tornando-as partículas activas na fusão, enquanto os lipossomas são veículos inactivos.

Deste modo, os virossomas são sistemas adjuvante/veículo altamente eficazes na vacinação moderna, possuindo propriedades excelentes como veículos de distribuição de antigénio e um potencial imunogénico forte enquanto, concomitantemente, minimizando o risco de efeitos secundários.

Até à data, os virossomas foram eficazmente utilizados numa variedade de vacinas. Por exemplo, vacinas comercialmente disponíveis contra a hepatite A e influenza utilizam virossomas como adjuvantes e como veículos seguros de distribuição de antigénios. Os anticorpos estimulados através da inoculação com antigénios reconstituídos em virossomas mostraram uma elevada afinidade para os antigénios contra os quais são produzidos. 2

Os virossomas unilamelares contendo 30 mol% de Dodac e complexados com plasmídeo são conhecidos de P. Schoen et al., Gene Therapy (1999) 6, 823-832. A liofilização de lipossomas pode evitar hidrólise dos fosfolipidos e degradação física das vesículas durante o armazenamento. Adicionalmente, pode ajudar a estabilizar a substância que é incorporada nos lipossomas. A liofilização de uma formulação de lipossoma resulta num bolo seco, que pode ser reconstituído em segundos para obter a dispersão original, ou seja, se os excipientes apropriados forem utilizados e se as condições adequadas de secagem em congelação forem aplicadas. Por outro lado, o próprio processo de liofilização pode induzir alterações físicas dos lipossomas, tais como perda do agente encapsulado e alterações no tamanho das vesículas. A ocorrência de tal dano não é surpreendente, porque a interacção entre os grupos das cabeças hidrofílicas dos fosfolipidos e moléculas de água desempenha um papel chave na formação de bicamadas lipossomais. Deste modo, a remoção da água dos lipossomas através da liofilização representa um desafio excitante. Além disso, a liofilização é um processo consumidor de tempo e energia que, certamente, necessita de alguma experiência de modo a evitar os seus problemas específicos. Felizmente, foram identificados excipientes, tais como dissacarídeos, que protegem os lipossomas durante o processo de congelamento (lioprotectores) e a técnica de liofilização foi extensamente descrita na literatura (Pikal et al., 1990, Int. J. Pharm. Sei. 60, 203; Pikal, 1990, Biopharm 10, 18; Essig et al., 1993, "Liofilization", Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft,

Estugarda; Jenning, 1999, "Liofilization: Introduction and basic principies", Interpharm Press, Englewood, CO). 3

Os lioprotectores protegem os lipossomas através de (1) prevenção da fusão de lipossomas, (2) prevenção da ruptura das bicamadas por cristais de gelo, e (3) manutenção da integridade das bicamadas na ausência de água. Para fazer isto, os lioprotectores devem formar uma matriz amorfa vítrea no interior e em redor dos lipossomas. A interacção entre o lioprotector e os grupos de cabeça de fosfolípido é considerada especialmente importante para prevenir o derrame durante a re-hidratação dos lipossomas que possuem uma bicamada líquida-cristalina no estado hidratado a temperaturas ambiente. É possível distinguir diferentes tipos de formulações de lipossomas em relação à liofilização: (1) lipossomas vazios, que são reconstituídos com uma solução do composto a ser encapsulado, (2) lipossomas carregados com um composto que está fortemente associado com a bicamada, e (3) lipossomas que contêm um composto solúvel em água que não interage com a bicamada. 0 terceiro representa o maior desafio, na medida em que são necessários a prevenção da fuga de solutos encapsulados e a preservação do tamanho do lipossoma. A composição de bicamada é um factor altamente significativo quando se determina a resistência dos lipossomas ao stresse da liofilização mas, até à data, tem sido difícil extrair regras gerais a partir da literatura, na medida em que estão envolvidos outros parâmetros, incluindo as condições do processo de liofilização, a escolha dos lioprotectores e o tamanho da vesícula.

Como apresentado acima, a liofilização dos lipossomas demonstrou ser, no máximo, exigente, mas a liofilização de virossomas enfrenta problemas ainda maiores. Isto é, em comparação como os lipossomas, devido às proteínas adicionais no 4 envelope, responsáveis pela actividade de fusão do virossoma. Como proteínas, são altamente susceptíveis ao stresse induzido pela liofilização, provocando significativa perda de actividade.

Assim, há uma necessidade de composições e métodos que ultrapassem os problemas acoplados à liofilização eficaz e à reconstituição de moléculas activas na fusão, nomeadamente virossomas.

Sumário da invenção A presente invenção proporciona composições biologicamente activas e métodos para a preparação de liofilizados virossomais hidratáveis, altamente resistentes ao stresse da liofilização e métodos para a sua reconstituição. De acordo com a invenção, as composições biologicamente activas referem-se a composições imunogénicas ou composições farmacêuticas compreendendo virossomas e um lípido catiónico para a liofilização eficaz e reconstituição do virossoma e, em particular, a uma composição imunogénica ou uma composição farmacêutica, em que um lípido catiónico para liofilização eficaz e reconstituição do virossoma está presente na membrana do virossoma.

Utilizando os ensinamentos da invenção, podem ser obtidos os virossomas que possuem propriedades de liofilização e reconstituição excelentes e que são particularmente úteis para distribuir antigénios, fármacos e outras substâncias farmaceuticamente activas incluindo ADN, ARN ou siARN nas células. Após a liofilização, eles são, ainda, capazes de distribuir as referidas substâncias a células distintas através 5 de um sistema de direccionamento, que reconhece marcadores de superfície de tipos de células específicos e, desse modo, são especificamente superiores a outros veículos de distribuição conhecidos.

Os lípidos catiónicos utilizados são derivados catiónicos de colesterilo.

Noutra forma de realização da invenção, os referidos derivados de colesterol são representados pela seguinte fórmula:

em que R é seleccionado do grupo consistindo em R'; R'-(C=0)-; R'-0-(C=0)R'-NH-(C=0)-; R'-0-(C=0)-R"-(C=0)-; R'-NH-(C=0)- R''-(C=0)-, em que R' é alquilo-Ci-C6 sendo substituído com, pelo menos, um grupo carregado positivamente, de um modo preferido um grupo contendo N da fórmula RiR2R3N+- e o respectivo contra-ião é X ; em que Ri, R2 e R3 são, independentemente uns dos outros, seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio e alquilo-Ci-C6; 6 em que X“ é seleccionado do grupo consistindo em halogéneo, hidrogenossulfato, sulfonato, di-hidrogenofosfato, acetato, tri-haloacetato e hidrogenocarbonato; e em que R'' é alquileno Ci-Cê.

De acordo com a invenção, R'' sendo alquileno-Ci-C6 significa uma parte alquileno Ci-C6 saturada que pode ser -CH2-, — (CH2) 2—, etc., que pode, também, estar presente como uma cadeia ramificada, tal como -CH(CH3) - (CH2) 2- etc.

Numa outra forma de realização, os derivados de colesterol são representados pela fórmula II:

(II) em que Ri, R2 e R3 são, independentemente uns dos outros, seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio e alquilo-Ci-C6 e em que X” é um anião de halogéneo.

Noutra forma de realização, o lípido catiónico é representado pela fórmula II, em que Ri e R2 são metilo, R3 é hidrogéneo e X~ é um anião de halogénio, de um modo preferido, 7 cloro, i. e., cloreto de 3β[N-(Ν',Ν'-dimetilamonioetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol). Noutra forma de realização muito preferida o lípido catiónico é representado pela fórmula II, R3, R2 e R3 são metilo e X“ é um anião de halogéneo, de um modo preferido, cloro, i. e., cloreto 3β[N-(N',N',N'-trimetilamonioetano)-carbamoil]colesterol (TC- Chol).

Os virossomas são veículos activos na fusão que distribuem uma substância biologicamente activa seleccionada de um agente farmacêutico e uma molécula antigénica a uma célula. Os virossomas são veículos de distribuição de antigénio, capazes de induzir uma resposta imunitária contra um antigénio alvo ou veículos de distribuição farmacêutica, distribuindo um produto farmacêutico a uma célula e, devido à sua composição de membrana, adequados para liofilização. Os virossomas são virossomas de influenza reconstituídos imunopotenciadores (IRIV).

As composições de membrana virossomal da presente invenção compreendem, de um modo preferido, entre 1,9 e 37 mol% DC-Chol ou TC-Chol, relativamente o conteúdo lipídico total da membrana virossomal. Numa forma de realização altamente preferida, o conteúdo de DC-Chol ou TC-Chol na membrana está entre 1,9 e 16 mol% do conteúdo lipídico total da membrana virossomal. 0 conteúdo lipídico residual da membrana consiste, de um modo preferido, em fosfolípidos, de um modo muito preferido fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina numa proporção de 4:1. Adicionalmente, a membrana virossomal pode conter uma quantidade de hemaglutinina, suficiente para garantir actividade do virossoma na fusão.

Numa forma de realização da invenção, a composição pode conter, adicionalmente, uma substância biologicamente activa desejada, seleccionada de um agente farmacêutico e uma molécula antigénica, na solução antes da liofilização. Noutra forma de realização, o agente farmacêutico ou antigénio da escolha pode ser adicionado ao liofilizado antes do processo de reconstituição ou adicionado após liofilização no processo de reconstituição, em combinação com o solvente fluido, i. e., ai solubilizado.

Noutras formas de realização, as composições da invenção podem ainda compreender lioprotectores, tal como sacarose, ou um adjuvante ou sistema de adjuvante. A invenção também compreende métodos de liofilização e reconstituição das composições virossomais acima mencionadas e o assim liofilizado obtido.

Adicionalmente, a utilização das composições da invenção para o fabrico de um produto farmacêutico para a vacinação e imunização do indivíduo também se pretende que faça parte da invenção. De um modo muito preferido, o indivíduo é um humano.

Adicionalmente, a presente invenção também compreende um kit contendo os liofilizados que se podem obter utilizando o método de liofilização da presente invenção. Além disso, o kit pode compreender, adicionalmente, um solvente de reconstituição e a referida substância biologicamente activa seleccionada de um agente farmacêutico e uma molécula antigénica, desde que a referida substância biologicamente activa não seja já parte da composição ou liofilizado. Numa forma de realização, o agente 9 farmacêutico ou molécula antigénica deve ser dissolvido no solvente de reconstituição antes da reconstituição do liofilizado do virossoma. 0 kit proporciona meios para preparar facilmente uma composição imunogénica com um antigénio alvo de escolha, e. g., para vacinação, e, ao mesmo tempo, proporciona uma prolongada estabilidade em armazenamento e excelentes propriedades de armazenamento e manuseamento.

Adicionalmente, a utilização de um lípido catiónico, como descrito acima para aumentar a imunogenicidade de um virossoma, é também parte da invenção.

Breve descrição das figuras A Figura 1 apresenta a actividade de fusão de IRIV com diferentes composições de membrana, antes e após a liofilização, medida por um ensaio FRET (ver Exemplo 9) . Comparados são IRIV sem um lípido adicional (A), com DC-Chol (B), DOTAP (C) e DHAB (D) . A Figura 2 apresenta uma ELISA (ver Exemplo 21) de soros de murganhos imunizados com IRIV DC-Chol contendo o péptido AMA49-CPE na superfície virossomal. São comparados AMA49-IRIV-DC-Chol antes da liofilização, AMA49-IRIV-DC-Chol após a liofilização e reconstituição com água, IRIV-DC-Chol após liofilização e reconstituição com o péptido AMA49-CPE e soro de controlo de AMA49-IRIV. 10 A Figura 3 apresenta um ensaio de CTL (ver Exemplo 20) de murganhos imunizados com IRIV-DC-Chol contendo o péptido de ligação a HLA no virossoma. São comparados DC-Chol-IRIV reconstituídos com água, 200 pg/mL e 650 pg/mL de péptido de ligação a HLA.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção divulga composições biologicamente activas e métodos para a liofilização e reconstituição de virossomas. Para alcançar a preservação da actividade de fusão dos virossomas da presente invenção, são aqui divulgadas composições de membrana especiais. Estas composições são parte integral da invenção e compreendem, juntamente com fosfolípidos e a hemaglutinina da proteína virai, lípidos catiónicos, para proporcionar resistência superior ao stresse da liofilização para os virossomas da invenção. Lípidos catiónicos A presente invenção refere-se a uma composição imunogénica compreendendo virossomas e um lípido catiónico para a liofilização eficaz e reconstituição do virossoma e, em particular, a uma composição imunogénica em que um lípido catiónico, para liofilização eficaz e reconstituição do virossoma está presente na membrana do virossoma. Os lípidos catiónicos utilizados como componentes de membrana integral são derivados de colesterilo. 11

Os derivados de colesterol preferidos são representados pela seguinte fórmula:

em que R é seleccionado do grupo consistindo em R'; R'-(C=0)-; R'_0-(C=0)-; R'-NH-(C=0)-; r'-0-(C=0)-R"-(C=0)R'-NH-(C=0)-R''- (C=0) em que R' é alquilo-Ci-C6 sendo substituído com, pelo menos, um grupo carregado positivamente, de um modo preferido, um grupo contendo N, da fórmula RiR2R3N+- e o respectivo contra-ião é X”; em que Ri, R2 e R3 são, independentemente uns dos outros, seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio e alquilo-Ci-C6; em que X“ é seleccionado do grupo consistindo em halogéneo, hidrogenossulfato, sulfonato, di-hidrogenofosfato, acetato, tri-haloacetato e hidrogenocarbonato; e em que R'' é alquileno-Ci-C6. 12

De acordo com a invenção, R' ' sendo alquileno-Ci-C6 significa uma unidade de alquileno-Ci-C6 saturado que pode ser -CH2-, -(CH2) 2-, etc., que pode, também, estar presente como cadeia ramificada, tal como -CH(CH3) - (CH2) 2-, etc.

Numa forma de realização ainda mais preferida, os derivados de colesterol são representados pela fórmula II: R*

R3

(II) em que Ri, R2 e R3 são, independentemente uns dos outros, seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio e alquilo-Ci-C6 e em que X“ é um anião de halogéneo.

Na forma de realização mais preferida, o lípido catiónico é representado pela fórmula II, Ri e R2 são metilo, R3 é hidrogénio e x” é um anião de halogéneo, de um modo preferido cloro, para produzir cloreto de 3β[N-(Ν',N'-dimetilamonioetano)-carbamoil] colesterol (DC-Chol).

Noutra forma de realização muito preferida, o lípido catiónico é representado pela fórmula II, R3, R2 e R3 são metilo e X~ é um anião de halogéneo, de um modo preferido cloro, para produzir cloreto de 3β[N-(Ν',N',N'-trimetilamonioetano)- 13 carbamoil] colesterol (TC-Chol). Verificou-se que ambos, DC-Chol e TC-Chol, proporcionam propriedades superiores na conservação da actividade de fusão virossomal após liofilização e reconstituição.

Virossomas

Os virossomas são envelopes de vírus e não contêm o material genético infeccioso do vírus original. Como os lipossomas, os virossomas podem ser utilizados para distribuir substâncias terapêuticas a uma vasta variedade de células e tecidos, mas contrariamente aos lipossomas, os virossomas oferecem a vantagem de entrada eficiente nas células, seguida pela libertação intracelular do conteúdo virossomal desencadeado pela proteína de fusão virai. Além disso, devido à incorporação das proteínas de fusão virai activa nas suas membranas, os virossomas libertam os seus conteúdos no citoplasma imediatamente após terem sido incorporados pela célula, prevenindo desse modo a degradação da substância terapêutica no ambiente acídico do endossoma. Os virossomas podem, ainda, ser carregados simultaneamente com vários epitopos de células B e células T diferentes (Poltl-Frank et al., 1999, Clin. Exp. Immunol. 117:496; Moreno et al., 1993, J. Immunol. 151: 489) incluindo epitopos universais de células "T-helper" (Kumar et al., 1992, J. Immunol. 148: 1499-1505) e outros conhecidos dos especialistas na técnica. Assim, os virossomas são adjuvantes altamente eficazes na vacinação moderna, possuindo propriedades superiores como veículos de distribuição de antigénio e um forte potencial imunogénico enquanto se minimiza concomitantemente o risco de efeitos colaterais. 14

Na presente invenção, são divulgadas composições biologicamente activas que compreendem uma substância biologicamente activa seleccionada a partir de um agente farmacêutico e uma molécula antigénica incorporada em virossomas esféricos sintéticos denominados Virossomas de Influenza Reconstituídos Imunopotenciais (IRIV). Os IRIV são vesículas esféricas, unilamelares com um diâmetro médio de 150 nm e compreendem uma dupla membrana lipídica, consistindo essencialmente de fosfolípidos, de um modo preferido Fosfatidilcolinas (PC) e Fosfatidiletanolaminas (PE). Em contraste com os lipossomas, os IRIV contêm as glicoproteínas de envelope virai funcionais, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) intercalada na membrana de bicamada de fosfolípidos. A HA biologicamente activa não apenas confere estabilidade estrutural e homogeneidade com formulações virossomais, mas também contribui significativamente para as propriedades imunológicas mantendo a actividade de fusão de um vírus.

De acordo com a invenção, as referidas composições biologicamente activas são capazes de distribuir substâncias biologicamente activas a um compartimento celular de um organismo. A referida substância biologicamente activa é seleccionada de agentes farmacêuticos e moléculas antigénicas, que é, de um modo preferido, seleccionada do grupo consistindo em ADN, ARN, siARN, proteínas, péptidos, aminoácidos, fármacos, pró-fármacos e substâncias farmacêuticas activas ou seus derivados. De um modo preferido, a substância biologicamente activa é um fármaco farmacêutico, um antigénio ou uma sua mistura. 15

Exemplos para os agentes farmacêuticos são seleccionados do grupo compreendendo anestésicos, inibidores de angiogénese, preparações antiacne, anti-alérgicos, antibióticos e guimioterapêuticos para utilização tópica, anti-histamínicos, anti-inflamatórios/anti-infecciosos, agentes antineoplásicos, antigénios, antiprotozoários, anti-reumáticos, vacinas antivirais, antivirais, anti-apoptóticos, vacinas bacterianas, quimioterapêuticos, citostáticos, agentes imunossupressores, laxantes e psicoléticos. Exemplos preferidos para o fármaco farmacêutico ou substância imuno-activa são doxorrubicina, vinblastina, cisplatina, metotrexato, ciclosporina e ibuprofeno. 0 termo "molécula antigénica" refere-se a uma molécula contra a qual é desejável uma resposta imunitária - Esta molécula pode ser seleccionada de um grupo incluindo, mas não limitado a péptidos, proteínas, lípidos, mono-, oligo- e polissacáridos, glicopéptidos, carboidratos, lipopéptidos, patogénios e toxinas bacterianos ou virais, outras moléculas imunogénicas pequenas e ADN/ARN codificando para essas moléculas. "Imunogénico" refere-se à capacidade de uma molécula para induzir uma resposta imunitária num organismo com ela inoculado. Exemplos para moléculas antigénicas são antigénios de células T à base de péptidos e antigénios de células B. Exemplos preferidos para moléculas antigénicas são antigénios de células T à base de HCV, antigénios associados a tumores, toxina de pertussis, toxóide da cólera e malária, RSV e antigénios peptídicos de Alzheimer (em particular a beta-amilóide).

Para aplicações de terapêutica de cancro da presente invenção, qualquer fármaco quimioterapêutico pode ser adequado para a encapsulação pelos virossomas. Os métodos e composições 16 da presente invenção são ainda adaptáveis a qualquer aplicação terapeuticamente relevante que beneficia da distribuição direccionada de substâncias para células e tecidos específicos. Essas aplicações podem incluir a distribuição direccionada de fármacos anticancro a células cancerosas, fármacos antivirais para células e tecidos infectados, fármacos antimicrobianos e anti-inflamatórios ao tecido afectado, assim como a distribuição de agentes terapêuticos a apenas aqueles órgãos e tecidos que são afectados por uma doença particular, aumentando desse modo o índice terapêutico do fármaco terapêutico e evitando toxicidade sistémica. Por exemplo, na terapia tumoral, a doxorrubicina, um antibiótico anti-tumoral da classe da antraciclina, pode ser distribuída pelos métodos e composições da presente invenção. As antraciclinas possuem um espectro alargado de actividade anti-tumoral e exercer efeitos pleiotrópicos na célula. Embora eles sejam agentes intercalantes de ADN clássicos, pensa-se que o seu mecanismo de citotoxicidade esteja relacionado com a interacção com a enzima topoisomerase II, produção de quebras de ADN de cadeia dupla e possivelmente para a criação de radicais livres intracelulares que são altamente citotóxicos. Assim, os virossomas conjugados podem ser carregados com doxorrubicina, de modo a inibir selectivamente e eficientemente a progressão tumoral de tumores da mama estabelecidos sobre-expressando rNeu.

Até à data, os virossomas têm sido utilizados eficazmente numa variedade de vacinas. Por exemplo, vacinas comercialmente disponíveis contra a hepatite A e o vírus influenza. Os virossomas demonstraram ser sistemas excelentes e seguros de adjuvante/veículos. Os anticorpos induzidos pela inoculação com antigénios reconstituídos em virossomas apresentaram uma 17 afinidade elevada para os antigénios contra os quais são criados.

Injectados isoladamente, a maioria dos antigénios peptídicos apresentam uma imunogenicidade relativamente baixa. Mas, numa forma combinada de antigénios e virossomas, podem ser produzidos títulos mensuráveis de anticorpos altamente específicos contra o antigénio. Os péptidos antigénicos podem ser distribuídos através de virossomas seja na superfície virossomal ou encapsulados no virossoma. A diferença reside no tipo de resposta imunitária. Quando os virossomas se fundem com os endossomas após endocitose, o seu conteúdo, incluindo um antigénio encapsulado, é libertado no citoplasma celular. No citoplasma, o referido conteúdo é processado e apresentado no complexo com moléculas de MHC classe I na superfície celular, espoletando a resposta imunitária citotóxica, mediada por células CD8+ celular. Em contraste com este mecanismo, é reconhecido um antigénio de superfície e sujeito a endocitose por células B que o apresentam num complexo com moléculas de MHC classe II e, desse modo, induzir a resposta imunitária humoral e a produção de anticorpos específicos.

Para aumentar a taxa de incorporação de substâncias biológicas activas nos virossomas, o manuseamento e para permitir períodos de armazenamento mais prolongados, a presente invenção divulga métodos e composições para a liofilização eficaz dos virossomas da invenção. Quando se tenta desenvolver um liofilizado de virossoma eficaz, a composição da bicamada é um factor crucial, que tem que ser cuidadosamente considerado. Neste contexto ''liofilizado" refere-se à composição liofilizada antes da reconstituição com um solvente de escolha. A 18 "reconstituição" refere-se ao processo de solubilização do liofilizado com um solvente apropriado. Por isso, a presente invenção aborda experimentalmente a eficiência de diferentes composições de membrana compreendendo lípidos catiónicos, com carga neutra e lípidos não carregados para preservar o tamanho do a funcionalidade virossomal após liofilização e reconstituição. Como resultado, a presente invenção proporciona composições de membrana virossomal que permite a liofilização e reconstituição de virossomas sem perda de função.

Com base nestes resultados experimentais, a presente invenção proporciona liofilizados virossomais hidratáveis, altamente resistentes ao stresse provocado pela liofilização, compreendendo derivados catiónicos de colesterilo, em particular DC-Chol ou TC-Chol como componentes de membrana integral.

Opcionalmente, esse liofilizado virossomal compreende adicionalmente, uma substância biologicamente activa seleccionada de agentes farmacêuticos e/ou moléculas antigénicas. Estas substâncias biologicamente activas são ligadas à superfície virossomal ou são aí encapsuladas antes da liofilização.

Noutra forma de realização, o agente farmacêutico e/ou molécula antigénica é adicionado juntamente com o solvente de reconstituição ao liofilizado virossomal. Este agente farmacêutico e/ou molécula antigénica ficam ligados à superfície virossomal formada de novo. De um modo preferido, o agente farmacêutico e/ou molécula antigénica são conjugados com lípidos de modo a ficarem ligados à membrana virossomal através de lípido. Noutra forma de realização, a presente invenção divulga 19 métodos e composições para encapsular eficientemente agentes farmacêuticos e/ou moléculas antigénicas no lúmen do virossomas formados de novo.

Numa forma de realização preferida, a composição da presente invenção compreende 1,9 até 37 mol% do conteúdo lipídico total da membrana virossomal DC-Chol ou TC-Chol.

Numa forma de realização muito preferida, a concentração de DC-Chol ou TC-Chol é entre 1,9 e 16 mol% do conteúdo lipídico total da membrana virossomal. 0 conteúdo lipídico residual da membrana virossomal consiste em fosfolípidos, de um modo preferido, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina. Numa forma de realização altamente preferida, a proporção de fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina contida na membrana virossomal é 4:1.

Todas as composições acima descritas compreendem uma quantidade funcional de hemaglutinina virai. Neste contexto, "quantidade funcional" refere-se a uma quantidade suficiente para garantir partículas de virossoma activas na fusão.

Uma molécula antigénica escolhida pode ser adicionada directamente a uma das composições descritas acima numa quantidade suficiente para induzir uma resposta imunitária ou, dissolvida no tampão de reconstituição, adicionada ao liofilizado de uma das composições acima descritas durante o processo de reconstituição. Assim, a presente invenção também compreende composições adequadas para liofilização compreendendo adicionalmente um antigénio alvo seleccionado. 20 0 composto farmacêutico seleccionado pode ser adicionado directamente a uma das composições acima descritas numa quantidade suficiente para apresentar actividade biológica ou, dissolvido no tampão de reconstituição, adicionado ao liofilizado de uma das composições acima descritas durante o processo de reconstituição. Assim, a presente invenção também compreende composições adequadas para liofilização compreendendo, adicionalmente, um antigénio alvo seleccionado.

As composições da presente invenção podem, ainda, compreender ingredientes auxiliares, que apoiam o processo de liofilização. Estes ingredientes auxiliares incluem, mas não estão limitados a, lioprotectores como sacarose, trealose, dextrose, lactose, manose, xilose e manitol. Esses compostos da classe dos açúcares são particularmente úteis numa proporção de 0,1 para 5% na solução antes da liofilização. O termo "lioprotectores" refere-se a uma classe de compostos úteis como ingredientes auxiliares durante o processo de liofilização que são capazes de reduzir o stresse da liofilização para o virossoma. É também parte da presente invenção o método de liofilizar uma composição da invenção basicamente baseada nos passos de congelação, secagem primária e secagem secundária e o processo de reconstituição seguinte com um solvente ou tampão que pode conter, opcionalmente, o antigénio alvo desejado. A utilização das composições divulgadas para o fabrico de um produto farmacêutico para vacinar ou inocular um indivíduo com 21 este é também parte da presente invenção. De um modo preferido, o referido indivíduo é um humano. É também parte da invenção um kit contendo virossomas da presente invenção que já estão liofilizados. Cada kit pode, adicionalmente ao virossoma liofilizado, compreender ainda um solvente de reconstituição. Desde que a molécula antigénica não seja já parte dos virossomas liofilizados, o referido kit pode, adicionalmente, compreender um antigénio alvo. Numa forma de realização da invenção, o kit contém uma molécula antigénica que pode ser dissolvida no solvente de reconstituição antes de utilizar o referido solvente de reconstituição para solubilizar os virossomas liofilizados.

Adicionalmente, a presente invenção divulga a utilização do lípido catiónico acima descrito para aumentar ainda mais a imunogenicidade do virossoma. A este respeito, a requerente verificou que as propriedades imunogénicas do próprio IRIV podem ser ainda mais aumentadas através da utilização de um lípido catiónico, de um modo preferido, um dos derivados de colesterol descritos, como um componente virossomal de membrana. Neste contexto, o termo "imunogenicidade" refere-se à capacidade de induzir uma resposta imunitária.

Adjuvantes

As composições da presente invenção podem ser ainda suplementadas através da combinação de qualquer uma das composições acima mencionadas, com um outro composto que potência resposta imunitária. Os compostos que potenciam 22 respostas imunitárias são classificados como adjuvantes ou citocinas. Adjuvantes adicionais podem, ainda, aumentar a resposta imunológica proporcionando um reservatório de antigénios (extracelularmente ou nos macrófagos) , activando os macrófagos e estimulando conjuntos específicos de linfócitos. São conhecidos na técnica adjuvantes de muitos tipos; exemplos específicos incluem adjuvante de Freund (completo e incompleto) , micobactérias, tais como BCG, M. Vaccae ou Lípido A ou Corynebacterium parvum, misturas de quil-saponina, tais como QS-21 (SmithKline Beecham), MF59 (Chiron) e várias emulsões óleo/água (e. g. , IDEC-AF) . Outros adjuvantes que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a: sais minerais ou géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio; derivados de LPS, saponinas, substâncias activas de superfície, tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos ou fragmentos de proteína, hemocianinas de lapa e dinitrofenol; moléculas imunoestimuladoras, tais como saponinas, derivados de dipéptidos e tripéptidos de muramilo, dinucleótidos CpG, oligonucleótidos CpG, monofosforil-Lípido A e polifosfazenos; adjuvantes de particulato e microparticulato, tais como emulsões, lipossomas, virossomas, cocleatos; ou adjuvantes de mucosa complexos estimuladores imunitários. As citocinas são também úteis em protocolos de vacinação como resultado das propriedades estimuladoras de linfócitos. Muitas citocinas úteis para esses objectivos serão conhecidas de um especialista na técnica, incluindo interleucina-2 (IL-2), IL-12, GM-CSF e muitas outras. 23

Administração

Quando administradas, as composições terapêuticas da presente invenção são administradas em preparações farmaceuticamente aceitáveis. Essas preparações podem conter, de rotina, concentrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes tamponantes, conservantes, veículos compatíveis, agentes de potenciação imunitária suplementares, tais como adjuvantes e citocinas e outros agentes opcionalmente terapêuticos. As preparações da invenção são administradas em quantidades eficazes. De um modo geral, doses de imunogénios que variam desde 1 nanograma/quilograma até 100 miligramas/quilograma, dependendo do modo de administração, são consideradas eficazes. Crê-se que o intervalo preferido está entre 500 nanogramas e 500 microgramas por quilograma. A quantidade absoluta irá depender de uma variedade de factores, incluindo a composição seleccionada para a administração, quer a administração seja uma dose única ou múltipla e parâmetros do doente individual, incluindo a idade, estado físico, tamanho, peso e o estado da doença. Estes factores são bem conhecidos do especialista na técnica e podem ser avaliados apenas com experimentação de rotina.

Exemplos A presente invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos. 24

Materiais e Métodos

Produtos Químicos: Octaetilenoglicol-mono-(n-dodecil)éter (OEG, Ci2Es) , ácido trifluoroacético (TFA) , brometo de di-hexadecildimetilamónio (DHAB), L-A-Fosfatidil-L-Serina de cérebro de bovino (PS), 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DPPE) , 1,2-Dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), colesterol de lanolina, l-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (Lyso-PC), cloreto de palmitoil-DL-carnitina e cloreto de Colesteril N-(trimetilamonioetil)carbamato (TC-Chol) foram de Fluka ou Sigma (Buchs, Suiça). A fosfatidilcolina de ovo (PC) foi obtida de Lipoid (Cham, Suiça) . 0 sal de sódio de 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-S-fosfo-rac-(1-glicerol) (DPPG), cloridrato de 3β-[N-(N',N'-Dimetilaminoetano)-carbamoil]

Colesterol (DC-Chol), Sal monossódico de 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfato (DPPA) e 1,2-Dipalmitoiletilenoglicol (DPEG) foi adquirido de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EUA). l-Palmitoil-3-oleoil-sn-glicero-2-fosforil-etanolamina (PE) foi obtido de R. Berchtold (Biochemical Laboratory, Universidade de Berna, Suiça). Bio-beads SM2 e Bio-Gel A-15m foram de Bio-Rad Laboratories (Glattbrugg, Suiça). Lissamine™ rodamina B 1,2-di-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal de trietilamónio (Rh-DHPE) , N-(4,4-difluoro-5,7-difenil-4-bora-3a, 4a-diaza-s- indaceno-3-propionil)-1,2-di-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Bodipy 530/550-DHPE) foram de Molecular Probes Europe (Leiden, Holanda). Cloreto de N-[l-(2,3-

Dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamónio (DOTAP) foi adquirido de Roche Applied Science (Rotkreuz, Suiça). Doxorrubicina HC1 está disponível em Fluka (Buchs, Suiça). 25 Vírus: o Vírus influenza da estirpe X-31 e da estripe A/Sing (A/Singapore/6/86), propagada na cavidade alantóica de ovos embrionados (Gerhard, J. Exp. Med. 144:985-995, 1976), foram obtidos de Berna Biotech AG (Bern, Suiça). Péptidos: 0 péptido de ligaçao a HLA do vírus da hepatite C de ligação a HLA-A2.1 (HCV) (DLMGYIPLV, aa 132-140) (Cerny et al., J. Clin. Invest. 95 (2): 521-30, 1995) assim como um péptido de controlo de ligação a HLA-A2.1 e o mimético de malária AMA49-CPE ((1,3-Dipalmitoil-glicero-2-fosfoetanolamino)-Suc- GGCYKDEIKKEIERESKRIKLNDNDDEGNKKIIAPRIFISDDKDSLKCG (ligação persulfureto)) (Moreno et al., Chembiochem 2:838-43, 2001) foram obtidos de Bachem AG (Bubendorf, Suiça).

Murganhos: as experiências de imunização foram realizadas duas vezes em laboratórios independentes em murganhos transgénicos HHD para a molécula de monocadeia de histocompatibilidade de classe 1 de HLA-A2.1 (A0201) e deficientes para ambas H-2Db e β2-microglobulina de murino (Pascolo et al., J. Exp. Med. 185 (12): 2043-51, 1997). Os murganhos foram mantidos em instalações de biotérios animais apropriados e manuseados de acordo com a regulamentação internacional.

Exemplo 1

Preparação de virossomas de influenza reconstituídos imunopotenciadores (IRIV): Os virossomas foram preparados pelo 26 método previamente descrito (Bron et al.r Methods Enzymol. 220:313- 331, 1993; Zurbriggen et al., Prog Lipid Res 39(1) : 3-18, 2000). Resumidamente, 32 mg (41,7 pmol) de PC de ovo e 8 mg (11,1 pmol) de PE foram dissolvidos em 2 mL de PBS, 100 mM de OEG (PBS/OEG). Foram centrifugados 4 mg de HA de virus influenza a 100000 x g durante 1 h a 4 °C e o sedimento foi dissolvido em 2 mL de PBS/OEG. Os fosfolipidos solubilizados com detergente e os virus foram misturados e sonicados durante 1 min. Esta mistura foi centrifugada a 100000 x g durante 1 h a 20 °C e o sobrenadante foi esterilizado por filtração (0,22 pm). Os virossomas foram, então, formados por remoção do detergente, utilizando 180 mg de SM2 Bio-Beads húmidas, durante 1 h à temperatura ambiente, com agitação e três vezes durante 30 min com 90 mg de SM2 Bio-Beads cada. As concentrações finais dos lipidos foram 8 mg/mL (10,4 pmol/mL) PC e 2 mg/mL (2,7 pmol/mL) PE. A proporção de hemaglutinina/fosfolípido foi determinada através da determinação de fosfolípido de acordo com Bõttcher (Bõttcher et al., Anal. Chim. Acta 24:202-203, 1961) e quantificação de HA através de SDS-PAGE com o método de extracção de Coomassie de acordo com Bali (Bali, Anal. Biochem. 155:23-27, 1986) .

Exemplo 2

Preparação de virossomas de influenza reconstituídos imunopotenciadores contendo DC-Chol (DIRIV): Os virossomas foram preparados pelo método descrito anteriormente (Bron et al., Methods Enzymol. 220:313-331, 1993; Zurbriggen et al., Prog. 27

Lipid Res. 39(1):3-18, 2000). Resumidamente, foram dissolvidos 32 mg (41,7 μιηοΐ) de PC de ovo, 8 mg (11,1 μιηοΐ) de PE e 0,3-5 mg (0,6-10 μιηοΐ) de DC-Chol em 2 mL de PBS, 100 mM de OEG (OEG-PBS). Foram centrifugados 4 mg de HA de virus influenzaa 100000 x g durante 1 h a 4 °C e o sedimento foi dissolvido em 1 mL de PBS/OEG. Os fosfolipidos solubilizados com detergente e os virus e 1 mL de 20% (p/v) de sacarose foram misturados para um volume final de 4 mL e sonicados durante 1 min. Esta mistura foi centrifugada a 100000 x g durante 1 h a 20 °C e o sobrenadante foi esterilizado por filtração (0,22 μιη) . Os virossomas foram então formados pela remoção de detergente utilizando 180 mg de SM2 Bio-Beads húmidos durante 1 h à temperatura ambiente com agitação e três vezes durante 30 min com 90 mg de SM2 Bio-Beads cada. As concentrações finais de lipidos foram 8 mg/mL (10,4 pmol/mL) PC, 2 mg/mL (2,7 pmol/mL) PE e 0,075-1,25 mg/mL (0,12-2,5 pmol/mL) DC-Chol. A proporção hemaglutinina/fosfolípido foi determinada por determinação de fosfolipido após Bõttcher (Bõttcher et al., Anal. Chim. Acta 24:202-203, 1961) e a quantificação de HÁ foi realizada através de SDS-PAGE com o método de extracção de Coomassie após Bali (Bali, Anal. Biochem. 155:23-27, 1986).

Exemplo 3

Preparação de AMA49-DIRIV: Método de construção de DIRIV com antigénio de ligação ao lípido: A preparação de virossomas em que os antigénios estão ligados à superfície do virossoma. Para a preparação de PE-mimético-IRIV, foi centrifugada uma solução de hemaglutinina de Influenza A/Singapore purificada (4 mg) em 28 solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 30 min a 100000 g e o sedimento foi dissolvido em PBS (1,33 mL) contendo 100 mM de octaetilenoglicolmonodeciléter (PBS-OEG). Os conjugados de AMA49-PE (4 mg), fosfatidilcolina (32 mg; Lipoid, Ludwigshafen, Alemanha) e fosfatidiletanolamina (6 mg) foram dissolvidos num volume total de 2,66 mL de PBS-OEG. As soluções de fosfolipido e de hemaglutinina foram misturadas e sonicadas durante 1 min. Esta solução foi então centrifugada durante 1 hora a 100000 g e o sobrenadante foi filtrado (0,22 pm) em condições de esterilidade. Os virossomas foram então formados através da remoção do detergente utilizando BioRad SM BioBeads (BioRad, Glattbrugg, Suiça). Os DIRIV foram armazenados em fracções a - 70 °C antes da liofilização.

Exemplo 4

Método de construção de DIRIV com ligando direccionado e espaçador: Este exemplo demonstra a conjugação dirigida ao sitio do fragmento Fab' com o braço espaçador flexível concebido para manter o sítio de ligação ao antigénio disponível para ligação à célula alvo. De modo a colocar as moléculas Fab' numa posição que permite que a sua potencial ligação bivalente permaneça disponível, os fragmentos Fab' são conjugados com o braço espaçador flexível por conjugação dirigida ao sítio. 100 mg de NHS-PEG-MAL contendo uma longo braço espaçador de polietilenoglicol (PEG) são dissolvidos em 3 mL de metanol anidro contendo 10 pL de trietilamina. Depois, 45 mg de dioleoilfosfatidiletanolamina dissolvidos em 4 mL de clorofórmio e metanol (l:3;v/v) são adicionados à solução. A reacção é efectuada sob azoto, durante 3h, a temperatura ambiente (RT) . O 29 metanol/clorofórmio é removido sob pressão decrescente e os produtos são redissolvidos em clorofórmio. A solução é extraída com 1% de NaCl para remover o material que não reagiu e os produtos colaterais solúveis em água. 0 PE-PEG-MAL é ainda purificado por cromatografia de ácido sílico como descrito por Martin et al., (1982), com algumas modificações: a coluna de gel de sílica possui um diâmetro de 1,5 cm e é carregado com gel de sílica 14 (Kieselgel 60, Fluka 60752). A eluição é efectuada com o seguinte gradiente: Clorofórmio:metanol 29:1, 28:2, 27:3, 26:4

(ml) etc. São recolhidas fracções de 6 mL. O PEG-PEG-MAL é obtido nas fracções 13-31. As fracções e pureza de PE-PEG-MAL são analisadas por TLC em silicone cos em tampão Tris-HCl (100 mM, pH 7,6) contendo 10 mg/150 pL de octaetilenoglicol- monododeciléter (C^Eg) . A esta solução os fragmentos Fab' são adicionados com uma proporção de Fab'/PE-PEG-MAL de 1:10. A solução é agitada a TA durante 2 h sob azoto. Além disso, C12ES é adicionada para obter uma solução a 1%-Ci2E8- e a mistura de reacção é agitada durante a noite a 4 °C. O PE-PEG-MAL que não reagiu é removido através da adição de 400 pL da Thiopropyl

Sepharose 6B lavada, húmida. Após uma incubação de 3-horas, o gel é removido por centrifugação. A solução de PE-PEG-Fab1 (3,6 mL) é esterilizada pela passagem através de um filtro de 0,2-pm e armazenada como uma solução de detergente a 0,01 M de Ci2Es.

Exemplo 5 Método para Produção de FAB' DIRIV: este exemplo demonstra a preparação de virossomas conjugados direccionados para células específicas. A hemaglutinina (HA) da estirpe A/Singapore/6/86 do vírus influenza é isolada como descrito em Waelti e Glueck, Int. 30 J. Câncer 77: 728-733, 1998. 0 sobrenadante contendo HA trímero solubilizado (2,5 mg/mL) em 0,01 M de solução de detergente Ci2Eg é utilizado para a produção de virossomas. A fosfatidilcolina (38 mg) em clorofórmio é adicionada a um frasco de fundo redondo e o clorofórmio evaporado através de um evaporador rotatório para obter um filme fino de PC (fosfatidilcolina) na parede do vidro. O sobrenadante (4 mL contendo 10 mg de HA) e 3,6 mL de PE-PEG-Fab1 (contendo 4 mg de fragmentos Fab') do Exemplo 3 são adicionados a este frasco. Sob agitação suave, o filme de PC que cobre a parede de vidro do frasco é solubilizado pela mistura contendo o detergente C12E8. O detergente da solução resultante é removido por extracção com Biobeads SM-2 estéreis. O recipiente é agitado durante 1 h através de um agitador REAX2 (Heidolph, Kelheim, Alemanha). Para remover o detergente completamente, este procedimento é repetido três vezes com 0,58 mg de Biobeads, após o que é obtida uma solução levemente transparente de Fab'-Virossomas. A análise quantitativa revela que 1 mL de Fab'-Virossomas contém 1,3 mg de HA, 5 mg de PC e 0,53 mg de fragmentos Fab'. As concentrações de Fab' são determinadas por um imunoensaio das fracções recolhidas a partir da filtração em gel na coluna High Load Superdex 200 como descrito em Antibodies, A Laboratory Manual. O processo para a produção de virossomas sem Fab' é o mesmo excepto que não é adicionado PE-PEG-Fab'.

Preparação de virossomas influenza imunopotenciadores reconstituídos contendo DC-Chol (DIRIV) e portadores de PE-PEG-Fab': Os virossomas foram preparados pelo método descrito anteriormente (Bron et al., Methods Enzymol. 220:313-331, 1993;

Zurbriggen et al. , Prog. Lipid Res. 39 (1):3-18, 2000).

Resumidamente, 32 mg (41,7 pmol) de PC do ovo, 8 mg (11,1 pmol) 31 de PE e 0,3-5 mg (0,6-10 μιηοΐ) de DC-Chol e os PE-PEG-Fab'anteriormente formados foram dissolvidos em 2 mL de PBS, 100 mM de OEG (OEG-PBS). Foram centrifugados 4 mg de HA do vírus influenza a 100000 x g durante 1 h a 4 °C e o precipitado foi dissolvido em 1 mL de PBS/OEG. O detergente solubilizou os fosfolípidos e os vírus e 1 mL de 20% (p/v) de sacarose foram misturados para um volume final de 4 mL e sonicados durante 1 min. Esta mistura foi centrifugada a 100 000 x g durante lha 20 °C e o sobrenadante foi filtrado em esterilidade (0,22 pm) . Os virossomas foram então formados por remoção de detergente utilizando 180 mg de SM2 Bio-Beads molhadas, durante 1 h, à temperatura ambiente com agitação e três vezes, durante 30 min, com 90 mg de SM2 Bio-Beads cada um. As concentrações finais de lípidos foram 8 mg/mL (10,4 pmol/mL) de PC, 2 mg/mL (2,7 pmol/mL) de PE e 0,075-1,25 mg/mL (0,12-2,5 pmol/mL) de DC-Chol. A proporção de hemaglutinina/fosfolípido foi determinada por determinação de fosfolípido após Bottcher (Bõttcher et al., Anal. Chim. Acta 24:202-203, 1961) e quantificação de HA após SDS-PAGE com o método de extracção de Coomassie após Bali (Bali, Anal. Biochem. 155:23-27, 1986).

Exemplo 6

Incorporação de DIRIV com uma composição farmacêutica de interesse: Doxorrubicina é incorporada nos virossomas através de um gradiente de protões produzido por sulfato de amónio capturado por virossomas, como descrito por Gabizon et al., J. Natl. Câncer Inst. 81: 1484-1488, 1989. para carregar os 32 virossomas com sulfato de amónio, é adicionada uma solução de sulfato de amónio (4,17 g/mL) à solução de DIRIV (7,5 ml), sonicada durante 1 min e dialisada (Spectra/Por 2.1, Biotech DispoDialyzers, MWCO: 15 '000, Spectrum Medicai Industries,

Houston, TX, USA) contra 1 litro de PBS contendo 5% de glucose durante 24 horas a 4 °C. Após 24 horas, o tampão de diálise é alterado e a solução de virossoma dialisada durante mais de 24 horas. Para preparar a solução de aplicação de doxorrubicina, 10 mg de doxorrubicina são dissolvidos em 3 mL de água e esterilizados através de um filtro de 0,2 μιη, depois, são adicionados 750 pL de PBS estéril 5X concentrado e 5% de glucose. A solução de virossoma e a solução de aplicação de doxorrubicina são aquecidos a 33° C e, depois 2 volumes de solução de virossoma são misturados com 1 volume de solução de aplicação de doxorrubicina. A mistura é incubada durante 10 h a 33 °C e, depois, incubada durante a noite a 28 °C. A doxorrubicina não encapsulada é separada dos virossomas por filtração em gel numa coluna High Load Superdex 200 (Pharmacia, Uppsala, Suécia), equilibrada com PBS estéril, 5% de glucose. As fracções do volume vazio contendo Fab'-virossomas com doxorrubicina encapsulada são eluídas com 5% de glucose em PBS e recolhidas.

Exemplo 7

Liofilização de DIRIV: Os DIRIV foram armazenados em fracções a -70 °C antes da liofilização. A liofilização foi efectuada num Savant AES1010 speedvac de acordo com as 33 instruções do fabricante. As amostras secas foram utilizadas imediatamente ou armazenadas a -70 °C. Para a reconstituição de liofilizados DIRIV, foi adicionado um volume de água igual ao volume antes da liofilização ao DIRIV seco. Os DIRIV vazios reconstituídos foram armazenados a 4 °C.

Exemplo 8

Preparação de Péptido de ligação a HLA-DIRIV: os DIRIV foram armazenados em fracções, a -70 °C, antes da liofilização. A liofilização foi efectuada num secador a vácuo Savant AES1010 de acordo com as instruções do fabricante. As amostras secas foram utilizadas imediatamente ou armazenadas a -70 °C. Para a reconstituição de DIRIV liofilizados, um volume de péptido de ligação a HLA dissolvido em água igual ao volume antes da liofilização foi adicionado aos DIRIV secos. Os Péptido de ligação a HLA-DIRIVs reconstituídos foram armazenados a 4 °C. A determinação da concentração de péptido encapsulado foi efectuada por RP-HPLC.

Exemplo 9

Os DIRIV foram armazenados em fracções, a -70 °C, antes da liofilização. A liofilização foi efectuada num secador a vácuo Savant AES1010 de acordo com as instruções do fabricante. As amostras secas foram utilizadas imediatamente ou armazenadas a --70 °C. Para a reconstituição de liofilizados DIRIV, foi

adicionado um volume de AMA49-CPE dissolvidos em água igual ao volume antes da liofilização aos DIRIV secos. Os AMA49-DIRIVS 34 reconstituídos foram armazenados a 4 °C. A determinação da concentração de péptido incorporado foi efectuada por RP-HPLC.

Exemplo 10

Preparação de DOXRUBICINA-DIRIV: os DIRIV foram armazenados em fracções, a -70 °C, antes da liofilização. A liofilização foi efectuada num secador a vácuo Savant AES1010 de acordo com as instruções do fabricante. As amostras secas foram utilizadas imediatamente ou armazenados a -70° °C. Para preparar a solução de aplicação de doxorrubicina, 10 mg de doxorrubicina são dissolvidos em 3 mL de água e esterilizados através de um filtro foi adicionado um volume de DOXRUBICINA igual ao volume antes da liofilização ao DIRIV seco. Os DOXRUBICINA-DIRIV reconstituídos foram armazenados a 4 °C.

Exemplo 11 A determinação de DOXRUBICINA incorporada: A quantidade de fármaco encapsulado, neste caso, doxorrubicina, é determinada por absorvência a 480 nm. As preparações de DIRIV contêm, em média, 150 pg/mL de doxorrubicina. O diâmetro médio dos virossomas é determinado por espectroscopia de correlação de fotões (PCS) com um Coulter N4Plus Sub-Micron-Particle Size Analyzer (Miami, FL, EUA) . A expressão apropriada de actividade fusogénica virai dos virossomas é medida como anteriormente descrito por Hoekstra et al., Biochemistry 23: 5675-5681, 1984, através de um ensaio com base no decaimento de fluorescência de octadecilrrodamina (R18). 35

Exemplo 12

Preparação de virossomas influenza reconstituídos imunopotenciadores contendo outros lípidos: Os virossomas foram preparados como descrito no exemplo 3 com a diferença única de que os DC-Chol foram substituídos por uma das seguintes substâncias: DHAB, DOTAP, PS, colesterol, DPPE, DLPC, Lyso-PC, palmitoil-DL-carnitina, DPEG ou TC-Chol. As concentrações finais de lípidos foram de 8 mg/mL (10,4 pmol/mL) de PC, 2 mg/mL (2,7 pmol/mL) de PE e 0,125 mg/mL (0,22 pmol/mL) de DHAB ou 0,125 mg/mL (0,18 pmol/mL) de DOTAP ou 2-8 mg/mL (2,8-11,3 pmol/mL) de PS, ou 0,125 mg/mL (0,32 pmol/mL) de colesterol, ou 0,125 mg/mL (0,18 pmol/mL) de DPPE ou 0,125 mg/mL (0,19 pmol/mL) de DLPC, ou 0,125 mg/mL (0,27 pmol/mL) de Lyso-PC ou 0,125 mg/mL (0,29 pmol/mL) palmitoil-DL-carnitina ou 0,135 mg/mL (0,25 pmol/mL) de DPEG ou 0,125 mg/mL (0,23 pmol/mL) de TC-Chol, respectivamente. Os IRIV modificados foram armazenados em fracções, a -70 °C, antes da liofilização. A liofilização foi efectuada num secador a vácuo Savant AES1010 de acordo com as instruções do fabricante. As amostras secas foram utilizadas imediatamente ou armazenadas a -70 °C. Para a reconstituição de virossomas liofilizados, um volume de água ou Péptido de ligação a HLA PBS em água, igual ao volume antes da liofilização, foi adicionado ao virossoma seco. Os virossomas reconstituídos foram armazenados a 4 °C. 36

Exemplo 13

Quantificação de péptido de ligação a HLA: A quantificação do péptido foi efectuada por HPLC num Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, Suiça) utilizando uma coluna CC 125/4.6 Nucleosil 100-5 C8 de fase reversa (Macherey-Nagel, Suiça) (RP-HPLC). Foram utilizados os eluentes seguintes: tampão A, 10 mM de TEAP em água; tampão B, 100% de acetonitrilo. Programa de HPLC: caudal 1,3 mL/min; temperatura do tampão e coluna 25 °C; concentração inicial de tampão: 25% de B; 0-7 min: aumento do tampão B para 38%; 7-12,4 min: aumento do tampão B para 100%; 12,4-16,4 min: 100% de tampão B. Para a quantificação de péptido encapsulado, uma fracção (5-30 pL) de virossomas foi aplicada em colunas de centrifugação de 1 mL Sephadex G50 Coarse de filtração em gel preparadas de fresco, equilibradas com PBS. As vesículas com péptido encapsulado foram apenas obtidas após centrifugação da coluna de centrifugação a 300 x g durante 2 min, uma vez que o péptido não encapsulado foi retardado na coluna.

Exemplo 14

Quantificação do péptido AMA49-CPE: A quantificação do péptido foi efectuada por HPLC num Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, Suiça) utilizando uma coluna ZORBAX Eclipse XDB-C8 de fase reversa (Agilent Technologies, Suiça) (RP-HPLC). Foram utilizados os seguintes eluentes: tampão A, 0,1% de TFA em água; tampão B, 0,1% de TFA em metanol. Programa de HPLC: caudal 1,0 mL/min; temperatura do tampão e da coluna a 6 °C; concentração inicial de tampão: 60% de B; 0-15 min: aumento do 37 tampão B para 100%; 15-20 min: 100% de tampão B. Para a quantificação do péptido encapsulado, uma fracção (5-30 pL) de virossomas foi aplicada em colunas de centrifugação de 1 mL Sephadex G50 Coarse de filtração gel, preparadas de fresco, equilibradas com PBS. As vesículas com péptido encapsulado apenas foram obtidas após centrifugação da coluna de centrifugação a 300 x g durante 2 min, uma vez que o péptido não encapsulado foi retardado na coluna.

Exemplo 15

Ensaio FRET: Para as medições de fusão in vitro por transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) (Struck et al., Biochemistry 20 (14):4093-99, 1981; Loyter et al., Methods Biochem. Anal. 33:129-64, 1988), foi desenvolvido o seguinte ensaio: 0,75 mol% de Bodipy 530/550-DHPE e 0,25 mol% de N-Rh-DHPE foram incorporados em lipossomas consistindo em PC/DPPG (70:30). As medições de fluorescência foram efectuadas a temperaturas discretas entre 4 °C e 42 °C em 5 mM de tampão de fosfato de sódio pH 7,5, 100 mM de NaCl, num volume final de 0,8 mL em 2,5 mL de PMMA micro-cuvetes (VWR, Suíça) sob agitação contínua. Tipicamente, 1 pL de lipossomas marcados (0,3 nmol de fosfolípido) foram misturados com 5-20 pL de virossomas (0,1-0,4 nmol de fosfolípido) e a fusão foi desencadeada pela adição de 3,75-7 pL de 1 M de HC1, resultando num pH de 4,5. O aumento na fluorescência foi registado em cada 5 segundos a comprimentos de onda de excitação e emissão de 538 nm e 558 nm, respectivamente, com uma fenda de excitação de 2,5 nm e uma fenda de emissão de 15,0 ran. As medições foram efectuadas com um espectrofotómetro LS 55 38

Luminescence (Perkin Elmer Instruments, USA) equipado com um suporte de cuvete termoestatizada e um dispositivo de agitação magnética. A fluorescência máxima com a diluição de sonda infinita foi atingida após a adição de Triton X-100 (0,5% v/v de concentração final). Para a calibração da escala de fluorescência a fluorescência inicial residual dos lipossomas foi marcada para zero e a fluorescência para a diluição de sonda infinita a 100%.

Exemplo 16 A determinação do tamanho de partícula foi efectuada por varrimento de luz utilizando um instrumento Zetasizer 1000HS (Malvern Instruments, UK) em cuvetes de 2 mL PMMA (Sarstedt AG, Suiça). Foram diluídos 5-20 pL de virossomas ou lipossomas, respectivamente, em PBS filtrado (0,22 pm) e medidos três vezes durante 300 s a 25 °C e 633 nm de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 17

Preparação de lipossomas contendo DC-Chol (lipossomas DC) : 32 mg (41,7 pmol) de PC, 8 mg (11,1 pmol) de PE e 0,8-5 mg (1,6-10 pmol) de DC-Chol foram dissolvidos em 4 mL de PBS, 100 mM de OEG, 5% (p/v) de sacarose (OEG-PBS), depois misturados e sonicados durante 1 min. Esta mistura foi filtrado em esterilidade (0,22 pm) e os lipossomas foram, então, formados por remoção de detergente utilizando 180 mg de SM2 Bio-Beads húmidas durante 1 h à temperatura ambiente com agitação e três 39

vezes durante 30 min com 90 mg de SM2 Bio-Beads cada um. As concentrações finais de lípidos foram 8 mg/mL de PC (10,4 pmol/mL) , 2 mg/mL de PE (2,7 pmol/mL) e 0,2-1,25 mg/mL DC-Chol (0,4-2,5 pmol/mL). Os lipossomas foram armazenados em fracções a -70 °C antes da liofilização. A liofilização foi efectuada num Savant AES1010 speedvac de acordo com as instruções do fabricante. As amostras secas foram utilizadas imediatamente ou armazenadas a -70 °C. Para a reconstituição de lipossomas DC liofilizados, foi adicionada água ou péptido de ligação a HLA dissolvido em água, respectivamente, aos lipossomas DC secos. Os lipossomas DC com péptido de ligação a HLA reconstituídos foram armazenados a 4 °C.

Exemplo 18

Preparação de lipossomas: 78 mg (101,6 pmol) de PC (dissolvidos em metanol) e 32,68 mg (43,56 pmol) de DPPG (dissolvidos em metanol/clorofórmio (1:1)) (proporção molar 70:30) foram misturados e o solvente foi removido utilizando um evaporador rotativo (Rotavapor R-205, Buchi Labortechnik, Suiça) , a 40 °C, com um vácuo gradual de 30-10 kPa. O filme de lípido seco foi re-hidratado com 1,5 mL de 5% (p/v) de sacarose em água. Os lipossomas foram armazenados em fracções a -70 °C antes da liofilização. A liofilização foi efectuada num Savant AES1010 speedvac de acordo com as instruções do fabricante. As amostras secas foram utilizadas imediatamente ou armazenadas a -70 °C. Para a reconstituição de liofilizados de lipossomas, foi adicionado PBS ou péptido de ligação a HLA dissolvido em PBS, respectivamente, aos lipossomas secos. Os lipossomas com Péptido de ligação a HLA reconstituídos foram armazenados a 4 °C. 40

Exemplo 19

Preparação de lipossomas contendo DC-Chol (lipossomas DC): 66,8-75,2 mg (87,1-98 pmol) de PC (dissolvidos em metanol) e 32,68 mg (43,56 pmol) de DPPG (dissolvidos em metanol/clorof órmio (1:1)) e 1, 82-7,26 mg (3,6-14,5 μιηοΐ) de DC-Chol (dissolvidos em metanol) (proporção molar 60-67,5:30:2,5-10) foram misturados em conjunto e o solvente foi removido utilizando um evaporador rotativo (Rotavapor R-205, Buchi Labortechnik, Suiça) a 40 °C com um vácuo gradual de 30-10 kPa. O filme de lípido seco foi re-hidratado com 1,0 mL de 5% (p/v) de sacarose em água. Os lipossomas foram armazenados em fracções, a -70, °C antes da liofilização. A liofilização foi efectuada num Savant AES1010 speedvac de acordo com as instruções do fabricante. As amostras secas foram utilizadas imediatamente ou armazenadas a -70 °C. Para a reconstituição de liofilizados de lipossomas DC, foi adicionado PBS ou lipossomas com péptido de ligação a HLA de HCV dissolvido em PBS, respectivamente, aos DC secos. Os lipossomas DC com Péptido de ligação a HLA reconstituídos foram armazenados a 4 °C.

Exemplo 20

Ensaio de imunização e citotoxicidade: murganhos HLA-2.1 tg foram imunizados subcutaneamente {sc.) na base da cauda com 100 pL da correspondente formulação de virossoma. Os murganhos receberam 2 injecções com um intervalo de 3 semanas e a resposta foi analisada 2 semanas após a última injecção. As células do 41 baço (4 x 106/poço) de murganhos imunizados foram re-estimuladas durante 5 dias em placas de cultura de tecidos de 24 poços com 2 x 106 células de baço irradiadas (1500 rad) que tinham sido pulsadas com 10 pg/mL de péptido, em meio RPMI completo (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) contendo 2 mM de L-Glutamina, 100 U de penicilina, 100 pg/mL de Estreptomicina (Sigma Aldrich), 5 mM de Hepes, 10% de FCS (Gibco BRL, Basileia, Suiça) e 5 x 10“5 M de 2-mercaptoetanol a 37 °C e 5% de CO2. No dia 2, foram adicionados 5 U/mL de IL-2 (EuroCetus B.V., Amsterdão, Holanda). A actividade citolitica especifica foi testada num ensaio convencional de libertação de 51Cr contra células alvo EL-4S3“-Rob HHD pulsadas com 10 pg/mL dos péptidos seleccionados ou meio de controlo. Após 4 h de incubação, a libertação de 51Cr foi medida utilizando um contador γ. A libertação espontânea e máxima foi determinada a partir dos poços contendo apenas meio ou após lise com 1 M de HC1, respectivamente. A lise foi calculada através da fórmula: (libertação no ensaio - libertação espontânea)/(libertação máxima - libertação espontânea) x 100. A lise especifica para o péptido foi determinada como a percentagem de lise obtida na presença ou na ausência de péptido. A libertação espontânea foi sempre inferior a 15% da libertação máxima.

Exemplo 21

Ensaio ELISA imunoabsorvente ligado a enzima contra AMA49-CPE: as placas de microtitulação por ELISA (PolySorb,

Nunc, VWR International AG, Suiça) foram revestidas a 4 °C durante a noite com 100 pL/poço de 10 pg/mL AMA49-CPE em PBS. Os poços foram lavados três vezes com 300 pL/poço de PBS contendo 42 0,05% de Tween-20 antes de terem sido bloqueadas com 5% de leite em pó em PBS durante 2 h a 37 °C. Os poços foram lavados três vezes com 300 pL/poço de PBS contendo 0,05% de Tween-20. As placas foram então incubadas com diluições 0,05% de Tween-20 e 0,5% de leite em pó (100 pL/poço) durante 2 h a 37 °C. Após lavagem, as placas foram incubadas com um anticorpo anti-IgG de murganho de cabra conjugado com fosfatase alcalina (especifico para a cadeia γ) (Sigma, St. Louis, MO, USA) durante 1 h a 37 °C e depois lavada três vezes. Foi adicionado substrato de fosfatase (1 mg/mL de p-nitrofenilfosfato (Sigma) em 0,14% (p/v) de Na2C03, 0,3% (p/v) de NaHC03, 0, 02% (p/v) de MgCl2, pH 9,6) e incubado à temperatura ambiente no escuro. Após um tempo apropriado a reacção foi interrompida através da adição de 100 pL/poço de 1 M de ácido sulfúrico. A densidade óptica (OD) do produto de reacção foi registada a 405 nm com um leitor de microplacas (Spectra MAX plus, Molecular Devices, Bucher Biotech AG, Suiça).

Exemplo 22

Preparaçao de uma formulação de vacina de influenza contendo DC-Chol:

Três lotes de virossomas de influenza foram preparados pelo método descrito anteriormente (Bron et al., Methods Enzymol. 220:313-331, 1993; Zurbriggen et al., Prog. Lipid Res. 39(1):3- 18, 2000). Resumidamente, 32 mg (41,7 pmol) de PC de ovo e 0,3 - 5 mg (0,6-10 pmol) de DC-Chol foram dissolvidos em 2 mL de PBS, 100 mM de OEG (OEG-PBS) . Foram centrifugados 4 mg de HA de vírus influenza (1° lote A/New Caledonia/20/99 (H1N1); 2 lote 43 A/Fujian/411/2002 (H3N2), 3o lote B/Shanghai/361/2002,) a 100000 x g durante 1 h a 4 °C e o precipitado foi dissolvido em 1 mL de PBS/OEG. O detergente solubilizou os fosfolípidos e o virus e 1 mL de 20% (p/v) de sacarose foram misturados para um

volume final de 4 mL e sonicado durante 1 min. Esta mistura foi centrifugada a 100000 x g durante 1 h a 20 °C e o sobrenadante foi filtrado em esterilidade (0,22 μιη) . Os três diferentes lotes de virossomas foram então formados por remoção de detergente utilizando 180 mg de SM2 Bio-Beads húmidas durante 1 h à temperatura ambiente com agitação e três vezes durante 30 min com 90 mg de SM2 Bio-Beads cada um. As concentrações finais de lipidos foram de 8 mg/mL (10,4 pmol/mL) de PC, 2 mg/mL (2,7 pmol/mL) de PE e 0,075-1,25 mg/mL (0,12-2,5 pmol/mL) de DC-Chol.

Após quantificação de HA os três lotes foram misturados e liofilizados. A liofilização foi efectuada num Savant AES1010 speedvac de acordo com as instruções do fabricante. As amostras secas foram utilizadas imediatamente ou armazenadas a -70 °C.

Para a reconstituição da formulação liofilizada da vacina de influenza, foi adicionado um volume de água igual ao volume antes da liofilização à DIRIV secos. Os DIRIV secos reconstituídos foram armazenados a 4 °C.

Lisboa, 29 de Março de 2010 44

Claims (38)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição biologicamente activa compreendendo, pelo menos, um virossoma influenza imunopotenciador reconstituído (IRIV) e um derivado de colesterol catiónico para liofilização eficaz e reconstituição do virossoma, em que o referido derivado de colesterol catiónico para liofilização eficaz e reconstituição do virossoma está presente na membrana do virossoma.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido derivado de colesterol possui um substituinte carregado positivamente na posição 3 do colesterol e é representado pela seguinte fórmula:

   em que R é seleccionado do grupo consistindo em R'; R'_(c=0)R'-0- (C=0)R'-NH-(C=0)R' - 0-(C=0)-R"-(C=0)-; R'-NH-(C=0)-R''— (C=0)-, 1 em que R' é alquilo Ci-Cô sendo substituído com, pelo menos, um grupo positivamente carregado, um grupo contendo N de fórmula RiR2R3N+- e o respectivo contra-ião é X“; em que Ri, R2 e R3 são, independentemente uns dos outros, seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio e alquilo-Ci-C6; em que X~ é seleccionado a partir do grupo consistindo em halogéneo, hidrogenossulfato, sulfonato, sulfato de di-hidrogénio, acetato, tri-haloacetato e hidrogenocarbonato; e em que R'' é alquileno C1-C6.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que o referido derivado de colesterol é representado pela seguinte fórmula:

   (II) em que Ri, R2 e R3 sao independentemente uns dos outros seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio e alquilo Ci-C6, 2 e em que X é um aniao halogéneo.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que Ri e R2 são metilo e R3 é hidrogénio.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que Ri, R2 e R3 são metilo.
6. 6. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o conteúdo do lípido catiónico está entre 1,9 e 37 mol% do conteúdo de lípido total da membrana.
7. 7. Composição da reivindicação 6, em que o conteúdo do lípido catiónico está entre 1,9 e 16 mol% do conteúdo de lípido total da membrana.
8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o conteúdo de lípido residual da membrana virossómica consiste em fosfolípidos.
9. 9. A composição de acordo com a reivindicação 8, em que os fosfolípidos são fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina.
10. 10. Composição de acordo com qualquer das reivindicações anteriores compreendendo adicionalmente um lioprotector.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 10, em que o lioprotector é seleccionado do grupo consistindo em sacarose, trealose, dextrose, lactose, manose, xilose e manitol. 3
12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que o lioprotector está presente numa proporção de 0,1 a 5% (p/v) na solução antes da liofilização.
13. 13. Composição de qualquer das reivindicações 10 a 12, compreendendo, adicionalmente, um adjuvante ou sistema de adjuvante.
14. 14. Composição de de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9 ou 10 a 13, compreendendo, adicionalmente, uma substância biologicamente activa seleccionada de um agente farmacêutico ou uma molécula antigénica.
15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que a referida substância biologicamente activa é ligada à superfície do virossoma e/ou encapsulada no virossoma.
16. 16. Método para a liofilização de virossomas utilizando as composições de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, incluindo os passos de: (a) congelação da referida composição, (b) secagem primária da referida composição congelada a uma primeira pressão reduzida, e (c) secagem secundária da referida composição congelada a uma segunda pressão reduzida, em que a referida secagem primária é efectuada a uma pressão mais elevada do que a referida segunda pressão reduzida. 4
17. 17. Método para a liofilização de virossomas utilizando as composições de acordo com qualquer das reivindicações 14 ou 15, incluindo os passos de: (a) congelação da referida composição compreendendo a referida substância biologicamente activa seleccionada de um agente farmacêutico e uma molécula antigénica, (b) secagem primária da referida composição congelada a uma primeira pressão reduzida, e (c) secagem da referida composição congelada a uma segunda pressão reduzida, em que a referida secagem primária é efectuada a uma pressão mais elevada do que a referida segunda pressão reduzida.
18. 18. Liofilizado de virossoma obtenível pelo método da reivindicação 16.
19. 19. Liofilizado de virossoma obtenível pelo método da reivindicação 17.
20. 20 . Método para a reconstituição de um liofilizado de virossoma de acordo com a reivindicação 18 incluindo o passo de solubilizar o liofilizado de virossoma num solvente de reconstituição.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o solvente de reconstituição compreende a referida substância 5 biologicamente activa seleccionada de um agente farmacêutico e de uma molécula antigénica.
22. 22. Método para a reconstituição de um liofilizado de virossoma da reivindicação 19, incluindo o passo de solubilizar o liofilizado de virossoma num solvente de reconstituição.
23. 23. Utilização de qualquer das composições de acordo com as reivindicações 1 a 15, para a preparação de um produto farmacêutico para inocular num indivíduo.
24. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 23, em que o indivíduo é um humano.
25. 25. Kit compreendendo um recipiente contendo o liofilizado da reivindicação 18.
26. 26. Kit de acordo com a reivindicação 25, compreendendo ainda um segundo recipiente contendo um solvente de reconstituição e a referida substância biologicamente activa, seleccionada de um agente farmacêutico e uma de molécula antigénica.
27. 27. Kit compreendendo um recipiente contendo o liofilizado da reivindicação 19.
28. 28. Kit de acordo com a reivindicação 27, compreendendo ainda um segundo recipiente contendo um solvente de reconstituição. 6
29. 29. Utilização de um derivado de colesterilo catiónico para estimular a reconstituição de um virossoma após liofilização, compreendendo o referido virossoma, no seu estado reconstituído, uma substância biologicamente activa seleccionada de um agente farmacêutico ou de uma molécula antigénica em que o referido visossoma é um virossoma influenza reconstituído imunopotenciadora.
30. 30. Utilização de acordo com a reivindicação 29, em que o referido derivado de colesterol possui um substituinte carregado positivamente na posição 3 do colesterol e é representado pela seguinte fórmula:

    em que R é seleccionado do grupo consistindo em R'; R' - (C=0)-; R'-0-(C=0)-; R'-NH-(C=0)R'-0-(C=0)-R"-(C=0) R'-NH- (C=0) -r”-(C=0)-, em que R' é alquilo Ci-C6 sendo substituído com, pelo menos, um grupo carregado positivamente, de um modo preferido, um grupo contendo N da fórmula RiR2R3N+- e o respectivo contra-ião é X~; 7 em que R2, R2 e R3 sao, independentemente uns dos outros, seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio e alquilo C1-C6; em que X~ é seleccionado a partir do grupo consistindo em halogéneo, hidrogenossulfato, sulfonato, sulfato de di-hidrogénio, acetato, tri-haloacetato e hidrogenocarbonato; e em que R'' é alquileno C1-C6.
31. 31. Utilização de acordo com a reivindicação 30, em que o referido derivado de colesterol é representado pela seguinte fórmula: R*

    Rj

    (II) em que Ri, R2 e R3 são, independentemente uns dos outros, seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio e alquilo C1-C6 e em que X~ é um anião halogéneo.
32. 32. Utilização de acordo com a reivindicação 31, em que Ri e R2 são metilo e R3 é hidrogénio.
33. 33. Utilização de acordo com a reivindicação 31, em que Ri, R2 e R3 são metilo.
34. 34. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 29 a 33, em que o conteúdo do lípido catiónico na membrana virossomal está entre 1,9 e 37 mol% do conteúdo de lípido total da membrana.
35. 35. Utilização de acordo com a reivindicação 34, em que o conteúdo do lípido catiónico na membrana virossomal está entre 1,9 e 16 mol% do conteúdo de lípido total da membrana.
36. 36. Utilização de acordo com a reivindicação 34 ou 35, em que o conteúdo de lípido residual da membrana virossomal consiste em fosfolípidos.
37. 37. Utilização de acordo com a reivindicação 36, em que os fosfolípidos são fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina.
38. 38. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 30 37, compreendendo, adicionalmente, um adjuvante ou sistema de adjuvante. Lisboa, 29 de Março de 2010 9