ES2315880T3 - Composiciones y procedimientos para estabilizar formulaciones adyuvantes con base lipidica usando glucolipidos. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de estabilizar liposomas catiónicos en formulaciones acuosas mediante la incorporación de glucolípidos en los liposomas.

Description

Composiciones y procedimientos para estabilizar formulaciones adyuvantes con base lipídica usando glucolípidos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formaciones de liposomas que son físicamente estables. En particular, la presente invención se refiere a la estabilización estérica de liposomas catiónicos mediante un procedimiento de película único por el que los glucolípidos se incorporan a los liposomas. Los liposomas estabilizados pueden usarse o bien como adyuvante para los componentes antigénicos o como sistema de administración de fármacos. En particular la invención se refiere a vacunas con adyuvantes en medios acuosos para la inmunización, en las que el producto final es
estable.

Antecedentes de la invención

Las primeras vacunas que se usaron en seres humanos para producir inmunidad frente a enfermedades infecciosas estaban constituidas por patógenos vivos atenuados. Las formas atenuadas eran o bien organismos naturales muy similares o se obtenían mediante pases seriados en cultivo. Un ejemplo es la tuberculosis que se combate vacunando con cepas atenuadas pero vivas de Mycobacterium bovis (vacuna BCG). Sin embargo, la eficacia de este procedimiento no siempre proporciona una resistencia satisfactoria a la tuberculosis humana en todas las poblaciones. Existe por lo tanto una necesidad de formas novedosas y eficaces de producir inmunidad contra la tuberculosis y otras enfermedades infecciosas. Una estrategia prometedora particular ha sido aislar y usar formas recombinantes de antígenos inmunodominantes tales como la diana antigénica de secreción temprana (ESAT-6) y el antígeno 85 (Ag85) como vacuna. Estas vacunas están bien definidas y las reacciones secundarias están minimizadas. Por desgracia, muchas sustancias muy purificadas, por ejemplo las proteínas recombinantes purificadas, no son muy inmunógenas y no producen una respuesta inmunitaria eficaz que proteja contra la enfermedad infecciosa real. Este hecho es muy conocido y se han realizado muchos intentos de aumentar las propiedades inmunógenas combinando la sustancia en cuestión con los denominados adyuvantes. Dependiendo del patógeno, la protección puede requerir que predomine una respuesta humoral o mediada por células. El desarrollo de un tipo específico de respuesta inmunitaria (humoral o mediada por células) puede determinarse mediante la elección del adyuvante.

La inmunidad protectora contra un patógeno intracelular como M. tuberculosis requiere una respuesta inmunitaria mediada por células, y un adyuvante adecuado para una vacuna con subunidades dirigida contra TB debería potenciar una respuesta Th1 (Lindblad y cols, 1997). Generalmente se cree que los anticuerpos no desempeñan un papel importante en la inmunidad contra la TB sino que la liberación de IFN-gamma (interferón gamma) mediada por células es la citocina más importante implicada en la protección (Collins & Kaufmann, 2001).

Se ha sugerido un gran número de adyuvantes que inducen una respuesta inmunitaria mediada por células pero, en general, sin que sean ideales en todos los aspectos.

Un tipo de adyuvante eficaz particular que promueve una respuesta inmunitaria mediada por células son los compuestos de amonio cuaternario, tales como dimetildioctadecilamonio (DDA) (Hilgers y Snippe, 1992). El DDA es un anfófilo sintético que comprende un grupo de dimetilamonio con carga positiva e hidrófilo en la cabeza y dos cadenas alquílicas hidrófobas largas. En un entorno acuoso el DDA se autoensambla formando bicapas vesiculares similares a los liposomas formados con fosfolípidos naturales. Se han descrito combinaciones de DDA y otros agentes inmunomoduladores. La administración de Arquad 2HT, que comprende DDA, en los seres humanos era prometedora y no inducía efectos secundarios claros (Stanfield y cols., 1973). Una vacuna experimental basada en el cultivo de proteínas filtradas de M. tuberculosis y DDA generó una respuesta inmunitaria protectora contra TB en ratones (Andersen, 1994). La vacunación de ratones con una proteína de fusión de proteínas ESAT-6 y Ag85B de M. tuberculosis, y DDA/MPL como adyuvante, proporciona una protección similar a la obtenida mediante la vacunación con BCG (Olsen y cols, 2001). Estos estudios demuestran que, al contrario que por ejemplo con el alumbre, los adyuvantes con base de DDA pueden inducir una respuesta inmunitaria protectora contra TB en ratones. Además, se ha usado DDA como adyuvante para una vacuna de ADN contra el virus de la seudorrabia que provocaba respuestas de linfocitos T potenciadas e inmunidad antiviral (van Rooij y cols, 2002).

La adición de emulsiones en aceite de TDM (6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trehalosa) a soluciones de DDA fue investigada por Woodard y cols (1980) como adyuvantes para las vacunas de Brucella abortus basadas en bacterias termoinactivadas. Ni DDA solo ni las mezclas de DDA y TDM fueron capaces de inducir protección. En otro estudio de una vacuna con subunidades de Brucella abortus basada en un extracto de proteínas solubles, también se usó una combinación de DDA y TDM como adyuvante (Dzata y cols, 1991), y se encontró que la mezcla potenciaba las respuestas inmunitarias (niveles de anticuerpos, respuesta en la prueba cutánea y niveles de IL-2) observadas comparadas con DDA solo. Holten-Andersen y cols (2004) estudiaron una combinación de liposomas de DDA y una suspensión de TDB (6,6'-dibehenato de alfa,alfa'-trehalosa), y se encontró que la administración del antígeno ESAT-6 con esta mezcla de adyuvantes inducía una potente respuesta inmunitaria protectora contra la tuberculosis que era significativamente mayor que cuando el ESAT-6 se administraba en liposomas de DDA.

Desgraciadamente, las suspensiones de compuestos de amonio cuaternario anfifílicos tales como DDA solo o mezclas de DDA y MPL, TDM o TDB tal como se describe anteriormente son físicamente inestables y no es posible almacenarlas durante periodos prolongados a 4ºC sin que aparezca agregación y precipitados. Dado que la precipitación evitará el uso clínico de la formulación, la falta de estabilidad de las formulaciones de DDA hasta la fecha ha sido un obstáculo principal para la aplicación en seres humanos.

En la patente del Reino Unido n.º. 2147263-A, Takahashi y Tsujii describen la estabilización de vesículas formadas por compuestos de amonio cuaternario mezclando dos compuestos de amonio cuaternario o añadiendo diversos detergentes al compuesto de amonio cuaternario.

En la patente de Estados Unidos n.º. 5.026.546, Hilgers y Weststrate describen la estabilización de una suspensión adyuvante de DDA con un polímero de ácido acrílico reticulado con polialilsacarosa.

La liofilización de complejos catiónicos de lípido-protamina-ADN para la transfección de células fue descrita por Li y cols (2000). Se evaluó el efecto de la adición de crioprotectores tradicionales tales como monosacáridos y disacáridos, y se encontró que los disacáridos conservaban el tamaño de la partícula mejor que los monosacáridos. También los complejos de lípidos no liofilizados-protamina-ADN estabilizados con sacarosa al 10% mantenían un tamaño de partícula estable después de 8 semanas de almacenamiento a 4ºC, pero la eficacia de transfección fue superior en las muestras liofilizadas que en las no liofilizadas.

La patente de Estados Unidos n.º 5922350 describe un procedimiento para prolongar el almacenamiento de liposomas por ejemplo con base fosfolipídica mediante la adición de azúcares tales como trehalosa y sacarosa antes de la deshidratación de los liposomas. Además, la patente describe que es posible una carga retardada de los liposomas preformados y almacenados mediante una combinación de gradientes de concentración y el proceso de deshidratación y rehidratación.

En el documento WO 96/10392 se describen liposomas de fosfolípidos para la administración de fármacos (liposomas fusógenos) estabilizados con un derivado de polietilenglicol. Otra formulación para la administración de fármacos que se describe en el documento WO 02/03959 especifica una formulación que comprende liposomas catiónicos y liposomas neutros en los que cada grupo de liposomas porta el mismo o diferentes agentes terapéuticos.

Los procedimientos preferidos para fabricar preparaciones de liposomas son descritos por Bangham (Bangham y cols., 1965). Esta preparación implica disolver los fosfolípidos en un disolvente orgánico que después se evapora a sequedad dejando una película fina en el interior del tubo de ensayo. La película de lípidos seca después se hidrata en una cantidad apropiada de fase acuosa y la mezcla se calienta a una temperatura superior a la de transición de fase de los lípidos y se deja que se "hinchen". Los liposomas resultantes que están constituidos por vesículas multilaminares (MLV) se dispersan agitando el tubo de ensayo. Los lípidos que constituyen las membranas bicapa vesiculares se organizan de tal forma que las "colas" de hidrocarburo hidrófobas estén orientadas hacia el centro de la bicapa mientras que las "cabezas" hidrófilas se orientan hacia las fases acuosas interna y externa, respectivamente. Esta preparación proporciona la base para la producción de vesículas unilaminares (UV) mediante procedimientos tales como ultrasonidos (Papahadjopoulos y cols., 1967) o extrusión tal como describen Cullis y cols. en la patente de Estados Unidos n.º. 5.008.050.

Otras técnicas que se usan para preparar vesículas son la evaporación de fase inversa introducida por Szoka y Papahadjopoulos (Szoka y Papahadjopoulos, 1978; patente de Estados Unidos n.º. 4.235.871). Esta técnica consiste en formar una emulsión de lípidos de agua en aceite en un disolvente orgánico y una solución de tampón acuoso que contiene una sustancia a encapsular. La eliminación del disolvente orgánico a presión reducida produce un gel viscoso. Cuando este gel se colapsa, se forma una suspensión acuosa de vesículas lipídicas.

Otro procedimiento que describen Carmona-Ribeiro y Chaimovich (Carmona-Ribeiro y Chaimovich, 1983) supone inyectar una solución orgánica por ejemplo en cloroformo, metanol, etanol, de los lípidos deseados en un tampón acuoso en el que los lípidos forman liposomas de forma espontánea al evaporar el disolvente.

Los liposomas también pueden prepararse mediante el procedimiento de calentamiento en sistema acuoso descrito para el DDA por Holten-Andersen y cols (2004) por el que una suspensión del compuesto que forma liposomas en tampón acuoso se calienta por ejemplo a 80ºC mediante agitación intermitente durante 20 minutos seguido de enfriamiento a temperatura ambiente.

El "procedimiento de calentamiento en sistema acuoso" mencionado anteriormente, que usaron y describieron Woodard y cols (1980), Dzata y cols. (1991) y Holten-Andersen y cols (2004) no estabiliza las soluciones de DDA y TDB.

En un procedimiento preferido particular, los antígenos proteínicos se atrapan en vesículas preformadas mediante el procedimiento de deshidratación y rehidratación (Kirby y Gregoriadis, 1984) en el que un oligonucleótido, péptido o proteína presentes en la fase acuosa se atrapan mediante liofilización seguida de rehidratación de los liposomas liofilizados.

De forma alternativa, el antígeno se incorpora usando la técnica de congelación y descongelación descrita por Pick (Pick, 1981) y por Bally y cols. en la patente de Estados Unidos n.º. 4.975.282. En esta técnica, las vesículas se mezclan con el antígeno proteínico y repetidamente se congelan de forma ultrarrápida en nitrógeno líquido y se calientan a temperaturas superiores a la temperatura de transición de fases de los lípidos relevantes. Las vesículas pueden procesarse posteriormente para eliminar los antígenos no atrapados por ejemplo mediante lavado y centrifugado.

Se ha demostrado que los glucósidos acilados tales como TDB y el factor cordón aislado de la pared celular de micobacterias, TDM, inhibe la fusión entre las vesículas de fosfolípidos (Spargo y cols., 1991 y Crowe y cols. 1994). El resto de trehalosa hidrófilo probablemente se inmoviliza sobre la superficie de las vesículas, aumentando así la fuerza de hidratación que es una importante barrera primaria contra la fusión. De forma alternativa, el resto de trehalosa inmovilizado puede actuar como una barrera estérica contra la fusión (Spargo y cols., 1991).

Los liposomas de fosfolípidos (sin TDB) se usan actualmente de forma experimental como adyuvantes por ejemplo en la vacuna contra la gripe (Ben-Yehuda y cols., 2003). Otros ejemplo es la vacuna liposómica IMUXEN^{TM} contra la gripe (Lipoxen Technologies Ltd.; Gregoriadis y cols., 1999).

Dado que los compuestos de amonio cuaternario y en especial el DDA es un candidato muy prometedor como adyuvante eficaz para las vacunas pero tiene la desventaja principal de ser físicamente inestable en solución acuosa porque forma agregados y precipitados durante el almacenamiento, es muy necesario estabilizar las vesículas formadas. La presente invención describe un procedimiento novedoso de estabilizar las formulaciones de adyuvantes compuestas por lípidos catiónicos tales como DDA. Además, mediante este procedimiento se potencia el efecto adyuvante de la formulación.

Sumario de la invención

La presente invención describe composiciones y procedimientos para estabilizar suspensiones de liposomas catiónicos mediante la incorporación de glucolípidos por ejemplo glucósidos acilados tales como 6,6'-dibehenato de alfa,alfa'-trehalosa (TDB) o 6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trehalosa (TDM) en bicapas liposómicas de compuestos de amonio cuaternario anfifílicos tales como DDA, DODA, DOTAP, DODAP o DOTMA. Los grupos de azúcar de la cabeza de los glucolípidos que son muy hidratados aumentan la hidratación global de las bicapas liposómicas, lo que evita la deshidratación de los grupos de amonio cuaternario de la cabeza y la agregación provocada por una menor repulsión entre las cargas de las vesículas catiónicas. Esta estabilización del DDA no se obtiene únicamente añadiendo el azúcar por ejemplo trehalosa o sacarosa o simplemente mezclando los compuestos de amonio cuaternario y los glucolípidos. La presente invención también describe el uso de estos liposomas estabilizados como adyuvantes de vacunas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe un nuevo procedimiento de estabilizar liposomas catiónicos en formulaciones acuosas con glucolípidos. Los liposomas catiónicos preparados por ejemplo a partir de compuestos de amonio cuaternario anfifílicos se estabilizan mediante la incorporación de glucolípidos a las membranas liposómicas.

Una realización preferida de la invención es cuando el compuesto de amonio cuaternario es la sal bromuro, cloruro, sulfato, fosfato o acetato de compuestos de dimetildioctadecilamonio (DDA) o dimetildioctadecenilamonio (DODA).

Otros compuestos de amonio cuaternario preferidos son 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-distearoil-3-trimetilamonio-propano y dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP) y N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA).

El glucolípido para estabilizar los liposomas es preferiblemente 6,6'-dibehenato de alfa,alfa'-trehalosa (TDB) o 6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trehalosa (TDM). El porcentaje molar del glucolípido en la formulación puede ser de 0,5 a 95 moles % pero preferiblemente de 2,5 a aproximadamente 20 moles % y más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 18 moles %.

La invención también presenta el uso de estos liposomas estabilizados como adyuvante por ejemplo para usar en composiciones de vacunas. En particular, la invención se refiere a vacunas con adyuvantes en medios acuosos para la inmunización, en las que el producto final es estable.

La presente invención también describe un producto liposómico estabilizado mediante el procedimiento descrito anteriormente para usar como adyuvante de vacuna donde la vacuna puede ser contra cualquier enfermedad por ejemplo tuberculosis, malaria, clamidia etc.

Los "liposomas" se definen como estructuras vesiculares cerradas formadas por una o más bicapas lipídicas de rodean un núcleo acuoso. Cada bicapa lipídica está compuesta por dos monocapas lipídicas, cada una de las cuales tiene una región de "cola" hidrófila y una región de "cabeza" hidrófila. En la bicapa, las "colas" hidrófobas de las monocapas lipídicas se orientan hacia el interior de la bicapa, mientras que las "cabezas" hidrófilas se orientan hacia el exterior de la bicapa. Los liposomas pueden tener una variedad de propiedades fisicoquímicas tales como tamaño, composición lipídica, carga superficial, fluidez y número de membranas bicapa. De acuerdo con el número de bicapas lipídicas, los liposomas pueden clasificarse como vesículas unilaminares (UV) que comprenden una única bicapa lipídica o vesículas multilaminares (MLV) que comprenden dos o más bicapas concéntricas cada una separada de la siguiente por una capa de agua. Los compuestos solubles en agua se atrapan en las fases acuosas/núcleo de los liposomas al contrario que los compuestos lipófilos que quedan atrapados en el núcleo de las membranas de las bicapas lipídicas.

Las "micelas" se definen como un agregado coloidal de moléculas anfifílicas, que existen a una concentración bien definida conocida como la concentración micelar crítica (CMC). El número típico de moléculas agregadas en una micela (número de agregación) es de 50 a 100. Las micelas pueden ser esféricas, y estar compuestas por moléculas de tensioactivo orientadas de forma que las colas de hidrocarburo se orienten hacia el centro y las porciones de las cabezas polares se orienten hacia el entorno acuoso externo. Otras estructuras posibles incluyen las micelas invertidas y las micelas cilíndricas.

El término "lípido catiónico" se pretende que incluya cualquier lípido anfifílico, incluidos los lípidos sintéticos y los análogos lipídicos, que tienen restos de grupos de cabeza hidrófobos y polares, una carga positiva neta a pH fisiológico y que, por sí solos, pueden formar vesículas o micelas bicapa en agua de forma espontánea.

Un tipo de lípidos catiónicos particulares preferidos que se usa en esta invención son los compuestos de amonio cuaternario que tienen la fórmula general NR^{1}R^{2}R^{3}R^{4}-X, en la que R^{1} y R^{2} de forma independiente son cada uno un grupo alquílico de cadena corta de 1 a 3 átomos de carbono, R^{3} es de forma independiente hidrógeno o un grupo metilo o un grupo alquilo que contiene de 12 a 20 átomos de carbono, preferiblemente de 14 a 18 átomos de carbono, y R^{4} es de forma independiente un grupo hidrocarburo que contiene de 12 a 20 átomos de carbono, preferiblemente de 14 a 18 átomos de carbono. X es un anión farmacéuticamente aceptable, que en sí mismo no es tóxico.

Los ejemplos de dichos aniones son aniones haluro, cloruro, bromuro y yoduro. También pueden usarse aniones inorgánicos tales como sulfato y fosfato o los aniones orgánicos derivados de ácidos orgánicos simples tales como ácido acético. Los grupos R^{1} y R^{2} pueden ser metilo, etilo, propilo e isopropilo, mientras que R^{3} puede ser grupos hidrógeno, metilo o dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo y eicocilo y R^{4} puede ser grupos dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo y eicocilo. Sin embargo, también son posibles otros grupos hidrocarburo C_{12}-C_{20} porque aunque los grupos R^{3} y R^{4} preferiblemente son saturados sin cadenas laterales ramificadas, pueden estar ramificadas en un grado menor portando por ejemplo cadenas laterales metilo y etilo. R^{3} y R^{4} también pueden tener un grado menor de insaturación conteniendo, por ejemplo, 1 - 3 enlaces dobles cada uno, pero preferiblemente son grupos alquilo saturados. El lípido catiónico lo más preferiblemente es bromuro o cloruro de dimetildioctadecilamonio (DDA-B o DDA-C) o su sal sulfato, fosfato o acetato (DDA-X), o bromuro o cloruro de dimetildioctadecenilamonio (DODA-B o DODAC) o el compuesto sulfato, fosfato o acetato (DODA-X). Otros tipos de lípidos catiónicos preferidos que se usan en esta invención incluyen pero sin limitación 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-distearoil-3-trimetilamonio-propano y dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP) y N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA).

Los liposomas catiónicos se estabilizan mediante la incorporación de glucolípidos a las membranas liposómicas. Por incorporar se quiere decir procedimientos para embeber la región hidrófoba y la región hidrófila de una molécula en una región o resto hidrófobo e hidrófilo correspondiente de una membrana, micela, liposoma o bicapa. Los procedimientos para incorporar glucolípidos a los liposomas pueden ser "el procedimiento de película fina", "el procedimiento de evaporación de fase inversa" y "el procedimiento de inyección de solución orgánica" y procedimientos futuros, desconocidos en la actualidad, que tengan el mismo efecto de incorporar glucolípidos a las membranas liposómicas. Todos los procedimientos actualmente conocidos se mencionan en el capítulo de antecedentes de la invención. El procedimiento más preferido para esta invención es el procedimiento de película fina.

Un glucolípido se define como cualquier compuesto que contiene uno o más restos monosacárido unido mediante un enlace glucosídico a un resto hidrófobo tal como un ácido graso de cadena larga, un esfingoide, una ceramida o un fosfato de prenilo. Los glucolípidos de esta invención pueden ser sintéticos, de origen vegetal o microbiano por ejemplo de micobacterias.

Una clase de glucolípidos que se usan en esta invención son los glucósidos acilados (o alquilados), que están constituidos por uno o dos restos glucídicos esterificados en uno, dos o incluso tres ácidos grasos. Los ácidos grasos pueden ser de cadena lineal, que incluye ácidos grasos saturados, por ejemplo ácido mirístico C14:0, ácido pentadecanoico C:15, ácido palmítico C16:0, ácido heptadecanoico C17:0, ácido estérico C18:0, ácido nonadecanoico C:19, ácido araquídico C:20, ácido heneicosanoico C21:0, ácido behénico C:22 y ácidos grasos insaturados por ejemplo ácido oleico C18:1n-9, ácido linoleico 18:2n-6, o ácidos grasos ramificados complejos tales como ácido micólico, ácidos metoximicólicos, ácidos cetomicólicos, ácido epoximicólico y ácido corynomicólico. Los restos de azúcares pueden ser monosacáridos simples por ejemplo glucosa y fructosa o disacáridos que comprenden dos monosacáridos enlazados covalentemente por ejemplo sacarosa constituida por glucosa y fructosa y trehalosa en la que dos unidades de glucosa se unen mediante un enlace glucosídico. Un tipo de glucolípidos que se usa en esta invención son los glucolípidos de pared aislados de micobacterias, que están constituidos por un disacárido esterificado en uno, dos o tres ácidos grasos normales como ácido palmítico, C16:0; ácido oleico, C18:1n-9; ácido linoleico, 18:2n-6 o complejos ramificados con hidroxi, es decir, restos de ácido micólico cuya longitud varía de 60 a 90 átomos de carbono. Otros glucolípidos bacterianos que se usan en esta invención tienen cadenas de ácidos grasos más cortas por ejemplo ácido corinomicólico (22-36 carbonos) o nocardomicólico (44-60 carbonos) aislados de la Corinobacteria, Nocardia. Un glucolípido micobacteriano preferido es 6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trehalosa (TDM) a menudo denominado factor cordón, que es uno de los componentes inmunomoduladores más importantes de la pared celular de las micobacterias. En una realización preferida particular, el glucolípido está constituido por el disacárido alfa,alfa'-trehalosa esterificado con dos ácidos grasos docosanoicos (ácido behénico) por ejemplo 6,6'-dibehenato de alfa,alfa'-trehalosa (TDB), que es un análogo sintético puro de TDM.

Otras clases de glucolípidos que se usan en esta invención incluyen pero sin limitación: glucolípidos con base de glicerol: estos lípidos están formados por un resto monosacárido u oligosacárido unido glucosídicamente al grupo hidroxilo del glicerol que puede estar acilado (o alquilado) con uno o dos ácidos grasos. Además, estos glucolípidos pueden no tener carga y, por lo tanto, a menudo se denominan glucoglicerolípidos neutros, o pueden contener un grupo sulfato o fosfato.

Glucolípidos con base de ceramidas: los glucoesfingolípidos se han dividido en base a la estructura del resto carbohidrato en glucoesfingolípidos neutros que contienen un grupo glicosilo no sustituido y glucoesfingolípidos ácidos que contienen un grupo glicosilo con un grupo carboxilo, sulfato o fosfato ácido.

Lipopolisacáridos (LPS): estos compuestos complejos son los antígenos endotóxicos que se encuentran en las paredes celulares de las bacterias Gram-negativas (S-lipopolisacáridos). La parte lipídica (lípido A) forma un complejo con un polisacárido a través de un enlace glucosídico. El lípido A está constituido por un esqueleto de b-1,6-glucosaminil-glucosamina con dos grupos fosfoéster en la posición 1 de glucosamina I y en la posición 4 de glucosamina II. La posición 3 de glucosamina II forma el enlace glucosídico lábil a ácidos con el polisacárido de cadena larga. Los otros grupos están sustituidos (en Escherichia) con ácidos grasos hidroxilados tales como hidroximiristato (dos enlazados con éster y dos enlazados con aminas) y ácidos grasos normales (laurato). Un lipopolisacárido particular preferido de esta invención son los derivados monofosforilo de lípido A (MPL), que no son tóxicos y presentan excelentes propiedades como adyuvantes.

Glucósidos de esteroles: esta familia está formada por una unidad de carbohidrato unida al grupo hidroxilo de una molécula de esterol. Se determinó que el resto de esterol está compuesto por diversos esteroles: colesterol, campesterol, estigmasterol, sitosterol, brasicasterol y dihidrositosterol. El resto de azúcar está compuesto por glucosa, xilosa e incluso arabinosa.

Glucósidos de ácidos grasos o alcoholes: en las bacterias, levaduras y otros organismos inferiores (esponjas) se encuentra un gran número de glucolípidos simples. Estos compuestos están formados por un resto glucosilo (de una o varias unidades) ligado a un grupo hidroxilo de un alcohol graso o un hidroxi de ácido graso o un grupo carboxilo de un ácido graso (enlace éster). Estos compuestos con frecuencia poseen interesantes propiedades físicas o biológicas. Algunos de ellos se producen a nivel industrial debido a sus propiedades como detergentes (glucósidos de alquilo).

Una cadena alquilo se refiere a una cadena de hidrocarburo alifática que puede ser lineal o ramificada. La cadena puede ser saturada o puede contener uno o más enlaces dobles por ejemplo que sean insaturados.

Una cadena de acilo se refiere a un grupo alquil-OC(O), en el que el grupo alquilo es tal como se ha descrito anteriormente.

Cadena de ácido graso se refiere a una cadena de hidrocarburo saturada o insaturada ramificada o no ramificada de grupos alquilo o acilo.

El término farmacéuticamente aceptable se refiere a una sustancia que no interfiera con la eficacia o la actividad biológica de los principios activos y que no sea tóxica para el huésped o para el paciente.

La temperatura de transición de fases o Tm es la temperatura a la que la bicapa liposómica pasa de una fase de gel a temperatura menor, caracterizada por cadenas de ácidos grasos ordenadas (una fase sólida ordenada) a una fase fluida a temperatura elevada en la que las cadenas de ácidos grasos tienen un alto grado de desorden en su conformación (una fase líquida desordenada), medida mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC).

Por estabilidad de una formulación farmacéutica se quiere decir la capacidad de la formulación de permanecer dentro de unos límites definidos durante la vida útil en depósito del producto. Las dispersiones liposómicas muestran características de estabilidad tanto química como física.

La estabilidad química está relacionada con la degradación química, mientras que la estabilidad física se refiere a la estabilidad coloidal del sistema.

La estabilidad física de las dispersiones liposómicas viene determinada por las interacciones intervesiculares, que dependen del equilibrio entre las fuerzas de atracción y de repulsión. Los sistemas coloidales se estabilizan mediante fuerzas de repulsión, es decir, de repulsión electroestática y de repulsión estérica debido a diferencias en el potencial químico entre el agua en general y en la región de interacción.

Un adyuvante se define como una sustancia que de forma no selectiva potencia la respuesta inmunitaria a un antígeno. Dependiendo de la naturaleza del adyuvante puede promover una respuesta inmunitaria mediada por células, una respuesta inmunitaria humoral o una mezcla de las dos. Dado que la potenciación de la respuesta inmunitaria no es específica, es bien sabido en el campo que el mismo adyuvante puede usarse con diferentes antígenos para promover respuestas contra diferentes dianas por ejemplo con un antígeno de M. tuberculosis para promover la inmunidad contra M. tuberculosis o con un antígeno derivado de un tumor, para promover la inmunidad contra tumores de ese tipo específico.

Los compuestos de amonio cuaternario por ejemplo bromuro, cloruro de dimetildioctadecilamonio u otras sales orgánicas o inorgánicas del mismo (DDA-B, DDA-C o DDA-X), cloruro, bromuro de dimetildioctadecenilamonio u otras sales orgánicas o inorgánicas del mismo (DODA-C, DODA-B o DODA-X), o 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-distearoil-3-trimetilamonio-propano y dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP) y N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) tienen la capacidad de formar agregados lipídicos tales como bicapas lipídicas, liposomas de todos los tipos tanto unilaminares como multilaminares, micelas y similares cuando se dispersan en un medio acuoso. Las membranas lipídicas de estas estructuras proporcionan una matriz excelente para la inclusión de otros compuestos anfifílicos tales como glucolípidos que se demuestra que estabilizan las dispersiones de vesículas de esta invención.

Además, los glucolípidos por ejemplo TDB y TDM tienen propiedades inmunoestimuladoras en sí mismos, y pueden actuar de forma sinérgica con los compuestos de amonio cuaternario para potenciar la respuesta inmunitaria. Además, las macromoléculas por ejemplo los antígenos oligonucleotídicos, peptídicos o proteínicos pueden atraparse en la fase acuosa tanto de los liposomas unilaminares como multilaminares.

Es de esperar que las cadenas de acilo hidrófobas de, por ejemplo, TDB queden embebidas en la región hidrófoba de las bicapas lipídicas formadas por los compuestos de amonio cuaternario de esta invención, inmovilizando así los grupos de trehalosa hidrófilos de la cabeza en la interfase entre la región hidrófoba y la región de agua en general. Los grupos glucídicos de la cabeza muy hidratados aumentan la hidratación global de la interfase provocando un aumento potencial de las fuerzas de hidratación que evitan un contacto íntimo entre las bicapas que son necesarias para la agregación o la fusión de las vesículas. Además, como consecuencia de la hidratación de la interfase, puede aumentar la fluidez de la bicapa lo que también tiende a estabilizar las vesículas.

Los medios de dispersión que se usan en las formulaciones de esta invención pueden estar en cualquier disolvente acuoso adecuado. Sin embargo, la estabilidad de las formulaciones liposómicas parece ser sensible a los aniones, como los iones fosfato y sulfato. Así, se prefiere que las composiciones adyuvantes de la invención se formen en ausencia o con niveles bajos de dichos iones.

Cuando se usa como adyuvante de vacuna, se añade un componente antigénico a la solución de adyuvante posiblemente junto con otros inmunomoduladores tales como MPL (monofosforil lípido A) o sus derivados, ácido poliinosínico policitidílico (poly-IC), muramil dipéptido (MDP) o sus análogos, zymosan, ARN bicatenario (dsRNA), DC-Chol, oligodesoxinucleótidos CpG, y tamoxífeno. Un componente o sustancia antigénicos es una molécula, que reacciona con un anticuerpo preformado y/o los receptores específicos de los linfocitos T y B. En el contexto de la vacunación, una molécula que puede estimular el desarrollo de linfocitos T o B específicos, que provoca la formación de una población de memoria de células inmunitarias que promoverá una respuesta de "memoria" más rápida si las células inmunitarias encuentran el antígeno por segunda vez. Dado que las poblaciones de memoria raramente son clonales, en la práctica esto significa que un antígeno es cualquier molécula o colección de moléculas, que puede estimular un aumento en las respuestas inmunitarias cuando las células inmunitarias de un individuo que anteriormente se ha visto expuesto a ellas vuelven a encontrarlas.

El componente o sustancia antigénicos puede ser un polipéptido o una parte del polipéptido, que provoca una respuesta inmunitaria en un animal o un ser humano y/o en una muestra biológica determinada mediante cualquiera de los ensayos biológicos que se describen en el presente documento. La porción inmunógena de un polipéptido puede ser un epítopo de linfocito T o un epítopo de linfocito B. Para identificar epítopos relevantes de los linfocitos T que se reconocen durante una respuesta inmunitaria, puede usarse un procedimiento de "fuerza bruta": dado que los epítopos de los linfocitos T son lineales, los mutantes por deleción del polipéptido, si se construyen sistemáticamente, revelarán qué regiones del polipéptido son esenciales para el reconocimiento inmunitario, por ejemplo al someter a estos mutantes por deleción por ejemplo al ensayo de IFN-gamma que se describe en el presente documento. Otro procedimiento utiliza oligopéptidos superpuestos (preferiblemente sintéticos que tienen una longitud de por ejemplo 20 restos aminoacídicos) que se derivan del polipéptido. Estos péptidos pueden analizarse en ensayos biológicos (por ejemplo el ensayo de IFN-gamma tal como se describe en el presente documento) y algunos de estos darán una respuesta positiva (y por lo tanto serán inmunógenos) como indicio de la presencia de un epítopo de linfocito T en el péptido. Los epítopos de linfocitos B pueden determinarse analizando el reconocimiento de los linfocitos B de péptidos superpuestos que cubren el polipéptido de interés tal como se describe por ejemplo en Harboe y cols,
1998.

Aunque se ha demostrado que la longitud mínima de un epítopo de linfocito T es de al menos 6 aminoácidos, es normal que dichos epítopos estén constituidos por tramos de aminoácidos más largos. Por lo tanto, se prefiere que el fragmento polipeptídico de la invención tenga una longitud de al menos 7 restos aminoacídicos, tales como al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 22, al menos 24, y al menos 30 restos aminoacídicos. Por lo tanto, en realizaciones importantes del procedimiento de la invención, se prefiere que el fragmento polipeptídico tenga una longitud de como máximo 50 restos aminoacídicos, por ejemplo como máximo 40, 35, 30, 25, y 20 restos aminoacídicos. Es de esperar que los péptidos que tienen una longitud de entre 10 y 20 restos aminoacídicos demuestren ser los más eficaces como herramientas de diagnóstico y, por lo tanto, sean longitudes especialmente preferidas del fragmento polipeptídico que se usa en el procedimiento de la invención son 18, tal como 15, 14, 13, 12 e incluso 11 aminoácidos.

Una vacuna se define como una suspensión de microorganismos muertos, atenuados o modificados de otro modo (bacterias, virus, o rickettsias) o partes de los mismos para ser inoculados para producir inmunidad contra una enfermedad. La vacuna puede administrarse bien de forma profiláctica para prevenir la enfermedad o como vacuna terapéutica para combatir enfermedades ya existentes tales como cáncer o enfermedades infecciosas latentes pero también relacionada con enfermedades alérgicas y autoinmunitarias. La vacuna puede emulsionarse en un adyuvante adecuado para potenciar la respuesta inmunitaria.

Las vacunas se administran de un modo compatible con la formulación, y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz e inmunógena. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, que incluye, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo de organizar una respuesta inmunitaria, y del grado de protección que se desee. Los intervalos de dosis adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de principio activo por vacunación con un intervalo preferido de aproximadamente 0,1 \mug a 1000 \mug, tal como en el intervalo de aproximadamente 1 \mug a 300 \mug, y en especial en el intervalo de aproximadamente 10 \mug a 50 \mug. Los regímenes adecuados para las inyecciones de administración inicial y de refuerzo son también variables pero típicamente es una administración inicial seguida de inoculaciones posteriores u otras administraciones.

La forma de aplicación puede variar mucho. Pueden aplicarse cualquiera de los procedimientos para la administración de una vacuna. Estos se cree que incluyen la aplicación oral o a la mucosa en una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral, mediante inyección o similares. La dosis de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo con la edad de la persona a vacunar y, en menor grado, del tamaño de la persona a vacunar.

Las vacunas se administran convencionalmente por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales o para las mucosas. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferiblemente 1-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes que se emplean normalmente tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación mantenida o polvos y ventajosamente contienen 10-95% de principio activo, preferiblemente 25-70%.

La vacuna elegida por ejemplo puede ser:

Vacuna proteínica: Una composición de vacuna que comprende un polipéptido (o al menos una porción inmunógena del mismo) o polipéptido de fusión.

Vacunas recombinantes vivas: la expresión del antígeno relevante de una vacuna en un microorganismo o virus no patógeno. Los ejemplos notorios de dichos microorganismos son Mycobacterium bovis BCG, Salmonella y Pseudomonas y los ejemplos de virus son Vaccinia Virus y Adenovirus.

Para todas estas construcciones de vacunas, la adición de un adyuvante adecuado ha producido una mejora en las eficacias de las vacunas (Brandt y cols., 2000; van Rooij y cols., 2001; Wang y cols., 2002; Eriksson, 2003).

Todavía otra realización de la invención es un sistema de administración que comprende el adyuvante. Los liposomas se han usado como sistemas de administración en farmacología y medicina como inmunoadyuvantes, para el tratamiento de enfermedades infecciosas e inflamaciones, en el tratamiento contra el cáncer, y en genoterapia (Gregoriadis, 1995). Los factores que pueden influir sobre el efecto adyuvante de los liposomas son el tamaño del liposoma, la composición lipídica y la carga superficial. Además, la ubicación del antígeno (por ejemplo, si es absorbido o está acoplado covalentemente a la superficie del liposoma o encapsulado en compartimentos acuosos liposómicos) también puede ser importante. Las células dendríticas pueden usarse como vehículos para la administración de antígenos. La carga de los antígenos en las células presentadoras de antígeno, tales como las células dendríticas, ha demostrado ser un procedimiento eficaz para generar linfocitos T activos con un papel en la inmunidad antitumoral.

Los liposomas de esta invención pueden prepararse mediante una variedad de procedimientos notorios en la técnica.

Preferiblemente, el lípido catiónico es un compuesto de amonio cuaternario que tiene un grupo de dimetilamonio en la cabeza y dos largas cadenas alquílicas hidrófobas que comprenden de 12 a 20 átomos de C, por ejemplo bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), cloruro de dimetildioctadecenilamonio (DODA-C). Otros tipos de lípidos catiónicos preferidos incluyen pero sin limitación 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-distearoil-3-trimetilamonio-propano y dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP) e incluso N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA).

El glucolípido es preferiblemente un glucósido acilado formado por de uno a tres ácidos grasos que acilan uno o dos restos glucídicos. Los ácidos grasos son ácidos grasos o bien saturados o bien insaturados de cadena lineal o ramificados complejos. El azúcar puede ser monosacáridos o disacáridos simples que comprenden dos monosacáridos unidos covalentemente. En una realización particular preferida, los glucolípidos están formados por trehalosa con uno o dos cadenas de ácidos grasos unidas mediante glucósido que comprenden de 14 a 90 átomos de C por ejemplo 6, 6'-dibehenato de alfa,alfa'-trehalosa (TDB) y 6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trehalosa (TDM).

En una realización, los liposomas de la presente invención comprenden un lípido catiónico que forma una bicapa, que preferiblemente tiene un grupo de amonio cuaternario en la cabeza y dos largas cadenas alquílicas hidrófobas. En una realización particular preferida el grupo de la cabeza es dimetilamonio y las cadenas hidrófobas son cadenas de hexadecilo, octadecilo u octadecenilo. Los lípidos catiónicos de la invención pueden usarse solos o en cualquier combinación. Además, los lípidos catiónicos o sus mezclas pueden usarse combinados con cualesquiera fosfolípidos neutros tales como fosfaditilcolina (PC) y fosfatidilglicerol (PG) o cualesquiera otros lípidos electroestáticamente neutros naturales o sintéticos que formen bicapas.

Los liposomas catiónicos se estabilizan mediante la incorporación de glucolípidos a las membranas liposómicas usando un procedimiento de película. Por el contrario, no se obtendrá este efecto estabilizante mezclando soluciones preformadas de DDA y TDB que son las formulaciones descritas anteriormente (Woodard y cols, 1980, Dzata y cols, 1991, Holten-Andersen y cols, 2004). El glucolípido debe estar incorporado de forma estable en las bicapas lipídicas con su resto hidrófobo embebido en la región hidrófoba de la membrana de la bicapa, y su resto de grupo polar de la cabeza orientado hacia la superficie hidrófila de las membranas. Las proporciones molares de glucolípido añadidas a los liposomas catiónicos dependen de las propiedades de los glucolípidos así como de los excipientes potenciales que se usan en la formulación. El porcentaje molar de un glucolípido particular puede ser de 0,5 a aproximadamente 95 moles %, preferiblemente de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 20 moles % y más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 18 moles %.

En una realización particular preferida de la invención, el compuesto de amonio cuaternario/lípido catiónico es DDA-B y el glucolípido es TDB. Los liposomas se preparan disolviendo las cantidades pesadas de DDA-B y TDB en un disolvente orgánico adecuado en un porcentaje molar de 5 moles % o 10 moles % o 15 moles % a una concentración lipídica total de aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM o incluso 10 mM. El disolvente se evapora dejando una película lipídica fina en el interior del tubo de ensayo. La película lipídica seca después se hidrata en un tampón farmacéuticamente aceptable sin sal o con una concentración baja de sal. La formación de estructuras de liposomas estables parece ser sensible a la presencia de iones, en particular de aniones tales como fosfato y sulfato. Es preferible un tampón orgánico por ejemplo 2aAmino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Trometamolum o simplemente Tris) o 2-Bis(2-hidroxietil)amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Bis-Tris) con pH 6,0 a 8,0 y más preferiblemente con pH 6,5 a 7,5, preparado disolviendo la base de Tris o Bis-Tris en agua MilliQ y después ajustando el pH mediante la adición de HCl. El tampón no está limitado a Tris o Bis-Tris sino que puede ser cualquier tampón farmacéuticamente aceptable o incluso agua pura sin sustancia tamponadora añadida. La mezcla se calienta a una temperatura superior a la temperatura de transición de fases de la mezcla lipídica, durante 20 minutos y se agita vigorosamente cada 5 minutos. La formulación adyuvante resultante está constituida por MLV caracterizado porque tiene una estabilidad física significativamente mejorada comparada con los liposomas catiónicos ordinarios.

Se añade una sustancia antigénica es decir una proteína o un péptido y se mezcla con las formulaciones de adyuvante. Lo más preferiblemente, la sustancia antigénica se une a las vesículas mediante fuerzas electróstaticas de atracción o mediante interacciones hidrófobas. En una realización particular preferida de esta invención se prepara una vacuna final contra la tuberculosis mezclando una formulación de adyuvante que contiene liposomas de DDA estabilizados mediante TDB con una solución de la proteína de fusión Ag85B-ESAT-6. El adyuvante se prepara de acuerdo con esta invención que comprende 2,50 mg de DDA por ml (4 mM) y 0,25 mg de TDB por ml (0,25 mM) que corresponde a una concentración de TDB de aproximadamente 5 moles % en un tampón de tris 10 mM con pH de 7,4. Se mezclan aproximadamente 4,5 ml de esta formulación de adyuvante con 0,5 ml de solución de tampón Tris a 1,0 mg/ml de Ag85B-ESAT-6 para obtener una concentración de 100 microgramos/ml de la proteína de fusión en la vacuna final lista para usar.

En otra realización preferida, la sustancia antigénica se encapsula en las vesículas usando el procedimiento de deshidratación y rehidratación o de forma alternativa el antígeno se incorpora usando la técnica de congelación y descongelación.

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Leyendas de las figuras

Fig. 1. Esta figura muestra las estructuras de algunos de los lípidos catiónicos que se usan en esta invención.

Fig. 2. Fotografía digital de formulaciones de DDA mM después de 2 meses de almacenamiento a 4ºC. (Muestra 02) contiene 16 moles % de TDB, (Muestra 03) contiene 12,5 moles % de TDB, (Muestra 04) contiene 6 moles % de TDB, (Muestra 05) contiene 2,5 moles % de TDB, (Muestra 06) contiene 0,5 moles % de TDB, y una muestra de referencia que contiene solo DDA. Queda claro a partir de esta ilustración que la suspensión que contiene TDB es más homogénea y sin precipitados.

Fig. 3. Termogramas por DSC de liposomas multilaminares compuestos por DDA-B con concentraciones crecientes de TDB (de arriba a abajo), obtenidas con una velocidad de barrido de 30ºC/h. Los liposomas se dispersaron en tampón Tris 10 mM con pH 7,4. Los termogramas ilustran claramente que TDB está insertado en las membranas liposómicas de DDA.

Fig. 4. Termogramas por DSC de liposomas multilaminares compuestos por DDA-B y TDB con concentraciones crecientes del antígeno Ag85B-ESAT-6 (de arriba a abajo), obtenidas con una velocidad de barrido de 30ºC/h. Los liposomas se dispersaron en tampón Tris 10 mM con pH 7,4. Los termogramas ilustran claramente que la temperatura de transición de fases no cambia al incorporar un antígeno en los liposomas.

Fig. 5. Desarrollo en función del tiempo del tamaño de partícula medio de liposomas de DDA que contienen 0% molar (-\boxempty-), 6% molar (-P-), 11% molar (-Z-) y 20% molar (-n-) de TDB. Los liposomas se dispersaron en tampón Tris 10 mM ajustado a pH 7,4. Se observa un aumento significativo para los liposomas de DDA sin TDB después de 14 días.

Fig. 6.A. Desarrollo en función del tiempo del tamaño de partícula medio de liposomas de DDA (-\boxempty-) y liposomas de DDA que contenían 11% molar de TDB preparados mediante el procedimiento de calentamiento en sistema acuoso (-P-), 11% molar de TDB preparados mediante el procedimiento de película (-n-). Los liposomas se dispersaron en tampón Tris 10 mM ajustado a pH 7,4. Se observó un aumento significativo para los liposomas de DDA y para los liposomas de DDA/TDB preparados mediante el procedimiento de calentamiento en sistema acuoso después de 14 días.

Fig. 7.A. Desarrollo en función del tiempo del tamaño de partícula medio de liposomas de DDA que contienen 11% molar de TDB (-n-), 10% (p/v) de trehalosa (-l-) y 10% (p/v) de sacarosa (-X-). Los liposomas se dispersaron en tampón Tris 10 mM ajustado a pH 7,4. Los liposomas de DDA que contienen trehalosa y sacarosa se agregaron hasta un grado que hacía imposible realizar más mediciones mediante PCS después de 14 días.

Fig. 7.B. Fotografía digital de formulaciones de DDA 10 mM, que contenían 10% (p/v) de trehalosa y 11% molar de TDB respectivamente, después de 14 días de almacenamiento a 4ºC. Se observó una agregación grave en la formulación que contenía trehalosa.

Fig. 8. Se realizó un análisis por SDS-PAGE del sobrenadante y del sedimento resuspendido de Ag85B-ESAT-6 ultracentrifugado de vacunas finales listas para usar vacunas para visualizar la adsorción de antígenos sobre los liposomas catiónicos.

Fig. 9. Liberación de IFN-gamma por los linfocitos en sangre aislados de ratones C57Bl/6j inmunizados con Ag85BESAT-6/DDA/TDB preparados tal como se describe en el ejemplo 1 de esta invención o Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB preparados tal como describen Holten-Andersen y cols (2004). Los linfocitos se aislaron 1 semana después de la tercera inmunización, y se estimularon con Ag85B-ESAT-6 a 5 \mug/ml.

Fig. 10. Liberación de IFN-gamma e IL-5 por los linfocitos en sangre aislados de ratones C57Bl/6j inmunizados con 2 \mug de Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB o Ag85B-ESAT-6 en 500 \mug de alumbre. Los linfocitos en sangre se aislaron 1 semana después de la tercera inmunización, y se volvieron a estimular con 5 \mug/ml de Ag85B-ESAT-6.

Fig. 11.A. Liberación de IFN-gamma por esplenocitos aislados en ratones BALB/C inmunizados con 2 \mug de Ag85-BESAT-6 o bien en 250 \mug de DDA/50 \mug de TDB, 100 \mug de poli IC, o 250 \mug de DDA/50 \mug de TDB/100 \mug de poli IC. Los esplenocitos se aislaron tres semanas después de la tercera inmunización y se volvieron a estimular in vitro con 5 \mug/ml de Ag85B-ESAT-6.

Fig. 11.B. Liberación de IFN-gamma por los linfocitos en sangre aislados en ratones BALB/C inmunizados con 2 \mug de Ag85-BESAT-6 o bien en 250 \mug de DDA/50 \mug de TDB, 25 \mug de MDP, o 250 \mug de DDA/50 \mug de TDB/25 \mug de MDP. Las células hemáticas se aislaron tres semanas después de la tercera inmunización y se volvieron a estimular in vitro con 5 \mug/ml de Ag85B-ESAT-6.

Fig. 12. Desarrollo en función del tiempo del tamaño de partícula medio de liposomas de DDA (-\blacklozenge-) y liposomas de DDA que contienen 11% molar de TDB (-\medbullet-), 11% molar de lactocil ceramida (-*-) y 11% molar de \alpha-galactosil ceramida (-X-). Los liposomas se dispersaron en tampón Tris 10 mM ajustado a pH 7,4. Se observó un aumento significativo para los liposomas de DDA sin glucolípido después de 14 días. Lo que indica que otros glucolípidos distintos de TDB pueden estabilizar el DDA.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de vesículas de DDA que contienen concentraciones crecientes de TDB

Se prepararon vesículas de DDA que contenían TDB usando el procedimiento de película lipídica fina. Se disolvió bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA-B, Pm = 630,97) y 6,6'-dibehenato de D-(+)-trehalosa (TDB, Pm = 987,5) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Al) por separado en cloroformo metanol (9:1) a una concentración de 10 mg/ml. Los volúmenes especificados de cada compuesto individual se mezclaron en tubo de ensayos de cristal. El disolvente se evaporó usando una corriente suave de N_{2} y las películas lipídicas se secaron toda la noche a presión reducida para eliminar cantidades traza de disolvente. Las películas lipídicas secas se hidrataron en tampón Tris (10 mM, pH = 7,4) a las concentraciones que se especifican en la Tabla 1, y se introdujeron en un baño de agua a 70ºC durante 20 min., las muestras se agitaron vigorosamente cada 5 minutos.

TABLA 1 Listado de una variedad de formulaciones de adyuvante preparadas de acuerdo con la presente invención

1

Ejemplo 2

El TDB aumenta la estabilidad a largo plazo de las formulaciones de DDA

Se almacenaron vesículas con formulaciones de DDA-B que contenían cantidades concentraciones de TDB a 4ºC y se evaluó el aspecto visual de las diferentes formulaciones después de un día y de nuevo después de dos meses (Tabla 2 y fig. 2). La evaluación demuestra claramente que TDB estabiliza las vesículas de DDA. Las suspensiones de DDA en tampón acuoso sin TDB precipitaron después de un día, mientras que en las suspensiones de DDA que contenían más de 10 moles % de TDB no se formaron partículas. En las suspensiones con una concentración de TDB desde 6% sólo se formaron cantidades muy pequeñas de precipitados que pueden volverse a suspender fácilmente mediante agitación suave.

TABLA 2 Describe la estabilidad a 2 meses de una variedad de formulaciones de adyuvantes diferentes

2

Para estimular un almacenamiento prolongado, las suspensiones se centrifugaron durante 30 minutos a 3000 g. Las suspensiones DDA-B que contenían más de 2,5 moles % de TDB únicamente formaron muy poco precipitado, que podría resuspenderse agitando.

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Ejemplo 3

TDB se incorpora a la bicapa lipídica de las vesículas de DDA

Las bicapas lipídicas formadas a partir de dialquildimetilamonio sintético sufren una transición de fase vítrea principal de gel a líquido a una temperatura de transición de fases característica Tm. La transición de fases implica la fusión de las cadenas de dialquilo de las bicapas vesiculares y la organización de las cadenas cambia de un estado caracterizado por un alto grado de orden de conformación a un estado con un mayor grado de desorden. Una entalpía de transición elevada está asociada al proceso de fusión de las cadenas.. Este cambio en la entalpía se detecta en forma de un pico en la curva de capacidad térmica con un máximo a la temperatura de transición, Tm. La temperatura de transición así como la forma de la curva de capacidad térmica depende de la naturaleza del grupo polar de la cabeza, el contraión y la longitud de las cadenas dialquílicas. De forma general, los valores de Tm disminuyen al disminuir la longitud de las cadenas y al aumentar la asimetría de las cadenas alquílicas. El efecto de un segundo tensioactivo dialquílico sobre el comportamiento de la fase termotrópica puede proporcionar información útil sobre la interacción entre los dos componentes.

Las curvas de capacidad térmica se obtuvieron usando un microcalorímetro de barrido diferencial VP-DSC (Calorimetry Sciences Corp., Provo) del tipo de compensación de la energía, con un volumen de cubeta de 0,34 ml. Se realizaron tres barridos crecientes consecutivos de una muestra de 0,34 ml a 30ºC/h. Las muestras se equilibraron durante 50 minutos a la temperatura inicial.

Los termogramas por DSC del sistema de dos componentes constituido por DDA-B y TDB que se muestran en la Fig. 3 demuestran una notable influencia del aumento de la concentración molar de TDB sobre la termodinámica de la membrana lipídica. La inserción en la membrana de TDB en las bicapas de los liposomas de DDA se demuestra por la reducción de la principal temperatura de transición de fases Tm. La transición de gel a fluido de los liposomas de DDA-B fluidos se caracteriza por un pico de capacidad térmica estrecho y bien definido a 48ºC. Al aumentar la concentración de TDB se produce una coexistencia de las fases de gel a fluido más amplia, en la que existen al mismo tiempo tanto la fase de gel como la de fluido.

La temperatura de transición de fases de los liposomas de DDA-B que contienen 20 moles % de TDB se desplaza hacia abajo aproximadamente 5ºC por debajo de la del DDA-B puro. La inserción de TDB en las membranas de los liposomas de DDA-B tiende a provocar que el pico de transición de fases se divida en dos. Muy probablemente, esto se debe a una separación de fases de la composición a pequeña escala en las membranas lipídicas durante el proceso de transición de gel a fluido. Los parámetros termodinámicos se muestran en la tabla 3.

El efecto de estabilización del TDB muy probablemente está provocado por los grupos de la cabeza de trehalosa muy hidratada de TDB, anclados en la membrana liposómica de DDA-B, que evitan la deshidratación y la fusión de las bicapas vesiculares.

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TABLA 3 Parámetros termodinámicos para los liposomas de DDA-B que contienen concentraciones crecientes de TDB obtenidos usando calorimetría de barrido diferencia (DSC) a una velocidad de barrido de 30ºC/h. Los liposomas se dispersaron en tampón Tris 10 mM con pH 7,4 y la concentración lipídica total era de 5 mM

3

Para evaluar si el estado de transición se veía influido por la adición de un antígeno proteínico, a liposomas compuestos por DDA y TDB y se añadieron concentraciones crecientes de la proteína de fusión micobacteriana Ag85B-ESAT-6 y se analizaron las formulaciones mediante calorimetría de barrido diferencial. Tal como se ilustra en la Fig. 4, la temperatura de transición de fases no cambia por la incorporación de una proteína.

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Ejemplo 4

Tamaño de partículas de los liposomas de DDA que contienen TDB

Ejemplo 4A

La estabilidad de DDA-B mejora mediante la incorporación de TDB

La estabilidad de las partículas de DDA-B que contenían concentraciones crecientes de TDB y preparadas mediante el procedimiento de película, se midió mediante mediciones de difracción de luz dinámicas usando un Malvern ZetaSizer 4 (Malvern Instruments Ltd. Reino Unido). Las formulaciones de partículas de DDA-B con 0, 6, 11 y 20% molar de TDB incorporado se dispersaron en tampón Tris 10 mM con pH 7,4 el día 0. Las mediciones se realizaron los días 0, 14, 28, 42, 56 y 105 después de la preparación (fig. 5). La comparación de la estabilidad del tamaño de las partículas en función del tiempo muestra que la incorporación de TDB estabiliza las partículas de DDA-B y evita que se agreguen. Por el contrario, la formulación con DDA solo se agregó después de unos pocos días de almacenamiento a 4ºC y después del día 42 no fue posible realizar más mediciones del tamaño de las partículas debido a la agregación. Estos datos apoyan la impresión visual de las formulaciones de DDA y DDA/TDB que se meustran en la
fig. 2.

Ejemplo 4B

La estabilidad de las partículas de DDA-B mejora de forma eficaz mediante la incorporación de TDB en lugar de mezclar los dos componentes mediante el procedimiento de calentamiento en sistema acuoso o mediante la adición de la parte de azúcar que es trehalosa

La necesidad de la incorporación de TDB en las partículas de DDA-B para que sean estables se investigó mediante mediciones de difracción de luz dinámicas usando un Malvern ZetaSizer 4 (Malvern Instruments Ltd. Reino Unido). El tamaño de partícula de las partículas de DDA-B que contenían 11% molar de TDB preparadas mediante el procedimiento de película se comparó con el de las partículas de DDA-B mezcladas con 11% molar de TDB (el procedimiento de calentamiento en sistema acuoso previamente descrito por Holten-Andersen). Ambas formulaciones se dispersaron en tampón Tris 10 mM con pH 7,4. Las mediciones se realizaron los días 0, 14 y 28 después de la preparación (fig. 6). La comparación de la estabilidad del tamaño de partícula en función del tiempo muestra que la incorporación de TDB estabiliza las partículas de DDA-B comparada con la mezcla de los dos componentes que evita que se agreguen. Para investigar si la parte lipídica de TDB es necesaria para estabilizar las partículas de DDA-B, se comparó el tamaño de partícula de las partículas de DDA-B que contenían 11% molar de TDB preparadas mediante el procedimiento de película con las partículas de DDA-B que contenían 10% (p/v) de sacarosa y trehalosa respectivamente. Todas las formulaciones se dispersaron en tampón Tris 10 mM con pH 7,4. Las mediciones se realizaron los días 0, 14 y 28 después de la preparación (fig. 7A). La comparación de la estabilidad del tamaño de partícula en función del tiempo muestra que la parte lipídica de TDB es esencial para la estabilización de los liposomas de DDA-B. El TDB pero no la trehalosa y la sacarosa evitan que los liposomas de DDA-TDB se agreguen (Fig. 7B).

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Ejemplo 5

El antígeno se adsorbido sobre las vesículas de DDA que contienen TDB

Se realizó un análisis por SDS-PAGE del sobrenadante y del sedimento resuspendido de Ag85B-ESAT-6 ultracentrifugado de vacunas finales listas para usar vacunas para visualizar la adsorción de antígenos sobre los liposomas catiónicos. El adyuvante comprendía liposomas catiónicos compuestos por DDA estabilizado mediante la incorporación de 15 moles % del glucolípido TDB. La concentración de Ag85B-ESAT-6 (Pm 45 KDa) en la vacuna final era de 40, 80, 160, y 200 microgramos/ml y las concentraciones de DDA y TDB era 10 y 0,6 mM, respectivamente. Las vacunas se ultracentrifugaron (100.000 g) durante 30 min y se realizó un análisis por SDS-PAGE del sobrenadante y del sedimento resuspendido en el volumen original de tampón Tris (fig. 8). Se cargó una muestra de referencia que contenía 50 microgramos de Ag85B-ESAT-6 por ml en el carril 1 y un marcador de peso molecular se cargó en el carril 2. Las bandas de proteína se visualizaron mediante tinción con coomassie. No se observaron bandas visibles en los carriles cargados con los sobrenadantes, mientras que se observaron bandas transparentes a un peso molecular aproximado de 45 kDa en los carriles cargados con los sedimentos resuspendidos, lo que indica que todo o casi todo el antígeno está adsorbido sobre los liposomas catiónicos.

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Ejemplo 6

DDA combinado con TDB promueve una respuesta inmunitaria eficaz contra Ag85B-ESAT-6

De forma general se acepta que los adyuvantes tienen alguna selectividad para la inducción de una cierta clase de respuesta inmunitaria. Dado que se ha demostrado la importancia de una liberación de citocinas Th1 basada en la producción de IFN-\gamma es esencial en la resistencia contra TB (Flynn y cols.,1993; Cooper y cols., 1993), se prepararon liposomas de DDA-B que contenían 20 moles % de TDB tal como se describe en el ejemplo 1 de esta invención y se mezclaron con una solución de tampón Tris de Ag85B-ESAT-6 produciendo una vacuna final. La concentración en la vacuna final era de 250 \mug de DDA, 100 \mug de TDB y 2 \mug de Ag85B-ESAT-6. Para comparar, se incluyó otra vacuna, que estaba compuesta por las mismas cantidades de DDA y TDB, pero preparada como se describe anteriormente en DMSO (Holten-Andersen y cols, 2004), es decir sin incorporar TDB a los liposomas mediante el procedimiento de película. Se inmunizó a los ratones tres veces y una semana después de la 3ª vacunación, se investigó las respuestas inmunitarias específicas de las células hemáticas (Fig. 9). Se observó una respuesta mucho mayor después de inmunizar con DDA/TDB preparados mediante el procedimiento de película que con el procedimiento descrito anteriormente, lo que demuestra que la preparación de DDA/TDB mediante el procedimiento de película potencia el efecto de adyuvante comparada con la de la mezcla simple de DDA/TDB.

De forma similar, se comparó la respuesta inmunitaria de DDA/TDB preparados mediante el procedimiento de película con la de un adyuvante con base de aluminio, Alhidrogel, ya autorizado para uso clínico. Tal como se muestra en la Fig. 10, la inmunización con DDA/TDB produce un nivel elevado de IFN-\gamma y niveles reducidos de IL-5 mientras que los ratones inmunizados con Alhidrogel mostraron un patrón opuesto con una secreción insignificante de IFN-\gamma y niveles más elevados de IL-5.

Se investigó la capacidad de DDA/TDB de generar una respuesta humoral controlando la respuesta de anticuerpos IgG específicos contra Ag85B-ESAT-6 cinco semanas después de la primera inmunización. La concentración en la vacuna final era de 250 \mug de DDA, 100 \mug de TDB y 2 \mug de Ag85B-ESAT-6. Un grupo de ratones recibió Ag85B-ESAT-6 en Alhidrogel como comparación. Tal como se muestra en la tabla 5, había presentes valores elevados de IgG específica en el suero de los ratones vacunados con Ag85B-ESAT-6 en DDA/TDB. Comparados con los valores obtenidos después de inmunizar con Ag85B-ESAT-6/Alhidrogel, la formulación de adyuvante que comprendía DDA/TDB indujo un mayor nivel de anticuerpos específicos.

TABLA 5 Valores medios de anticuerpos específicos de antígeno en el suero de ratones inmunizados con Ag85B-ESAT-6

4

Ejemplo 6A

Potenciación de las respuestas inmunitarias mediante la incorporación de un tercer componente a la combinación de DDA/TDB

Recientemente, se ha considerado que los receptores de tipo Toll (TLR) son dianas atractivas para la inclusión de formulaciones de adyuvantes novedosas. Para investigar el efecto de la incorporación de otros componentes inmunoestimuladores es decir ligandos de TLR a la formulación de DDA/TDB, se inmunizó a los ratones con 2 \mug de Ag85B-ESAT-6 en 250 \mug de DDA/50 \mug de TDB e inmunomoduladores seleccionados. Estos incluían 100 \mug de poli IC (ácido poliinosínico-policitidílico, Sigma Aldrich) añadidos a los liposomas de DDA-TDB preformados que se sabe que son ligandos para TLR3 así como 25 \mug de muramil dipéptido (MDP) que confería activación de TLR2/TLR4. El MDP se incluyó en la película lipídica de DDA-TDB antes de la hidratación.

Tres semanas después de la última inmunización, se purificaron esplenocitos o células hemáticas (tal como se indica en la leyenda de la figura) de ratones individuales y se midió el nivel de la liberación de IFN-\gamma después de reestimular in vitro con 5 \mug/ml de Ag85B-ESAT-6. Comparada con la respuesta inmunitaria generada con DDA/TDB solos o con los terceros componentes (poli IC y TDM) solos, las formulaciones que comprendían los tres componentes dieron lugar a una respuesta inmunitaria potenciada que mostraba la sinergía entre DDA/TDB y los inmunomoduladores (fig. 11a y b).

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Ejemplo 7

La estabilidad de las partículas de DDA-B mejora de forma eficaz mediante la incorporación de otros glucolípidos distintos de TDB

Para ejemplificar que las partículas de DDA-B pueden estabilizarse mediante otros glucolípidos distintos de TDB, se emplearon respectivamente \beta-D-Lactosil Ceramida (\beta-LacCer) 11% molar, \beta-Galactosil Ceramida (\beta-GalCer) 11% molar y gangliósidos G(M1) 44 peso/% en peso. Las formulaciones se prepararon mediante el procedimiento de película y se dispersaron en tampón Tris 10 mM con pH 7,4 el día 0. El tamaño de las partículas se midió mediante mediciones de difracción de luz dinámicas usando un Malvern Zeta-Sizer 4 (Malvern Instruments Ltd., Reino Unido). Las mediciones se realizaron los días 0, 14 y 28 después de la preparación (fig. 12). La comparación de la estabilidad del tamaño de las partículas en función del tiempo muestra que la incorporación de glucolípidos estabiliza las partículas de DDA.

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Claims (20)

1. Un procedimiento de estabilizar liposomas catiónicos en formulaciones acuosas mediante la incorporación de glucolípidos en los liposomas.

2. Un procedimiento de estabilizar liposomas catiónicos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el lípido catiónico es un compuesto de amonio cuaternario anfifílico.

3. Un procedimiento de estabilizar liposomas de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el compuesto de amonio cuaternario anfifílico tiene una o dos cadenas alifáticas.

4. Un procedimiento de estabilizar liposomas de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en el que las cadenas alifáticas comprenden cada una 12-20 átomos de C.

5. Un procedimiento de estabilizar liposomas de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el compuesto de amonio cuaternario anfifílico es DDA-B, DDA-C, DDA-X, DODA-B, DODA-C, DODA-X, DOTAP, DODAP o DOTMA.

6. Un procedimiento de estabilizar liposomas de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, en el que el glucolípido es un glucósido acilado formado por de una hasta tres cadenas de hidrocarburo alifáticas unidas a uno o dos restos de azúcar.

7. Un procedimiento de estabilizar liposomas de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el glucolípido es un disacárido con dos cadenas de acilo.

8. Un procedimiento de estabilizar liposomas de acuerdo con las reivindicaciones 6-7, en el que las cadenas de acilo comprenden 15 - 90 átomos de C.

9. Un procedimiento de estabilizar liposomas de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el glucolípido es 6,6'-dibehenato de alfa,alfa'-trehalosa (TDB) o 6,6'-dimicolato de alfa,alfa'-trehalosa (TDM).

10. Un procedimiento de estabilizar liposomas de acuerdo con cualesquiera reivindicaciones precedentes, en el que el porcentaje molar del glucolípido particular es de 0,5 a aproximadamente 95% molar, preferiblemente de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 20% molar y más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 18% molar

11. Un producto liposómico estabilizado mediante el procedimiento de las reivindicaciones 1-10.

12. Un producto liposómico de acuerdo con la reivindicación 11, en el que un compuesto antigénico se encapsula en los liposomas

13. Un producto liposómico de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 para usar en la administración de fármacos.

14. Un producto liposómico de acuerdo con la reivindicación 12 para usar como adyuvante.

15. Un adyuvante de vacuna que comprende el producto liposómico de acuerdo con la reivindicación 11.

16. El adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho adyuvante comprende además otros inmunomoduladores tales como monofosforil lípido A (MPL), derivados de monofosforil lípido A (MPL), ácido poliinosínico policitidílico (poly-IC), muramil dipéptido (MDP), análogos de muramil dipéptido (MDP), zymosan, ARN bicatenario (dsRNA), DC-Chol, oligodesoxinucleótidos CpG y tamoxífeno.

17. El adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho adyuvante de vacuna comprende además muramil dipéptido (MDP) y ácido poliinosínico policitidílico (poly-IC).

18. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación 15 para usar en una vacuna contra clamidia, malaria o tuberculosis.

19. Una vacuna contra clamidia, malaria o tuberculosis que comprende el adyuvante de acuerdo con la reivindicación 15.

20. Un sistema de administración que comprende un producto liposómico de acuerdo con la reivindicación 11.