CN114657147B - 一种生物材料的保护剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物材料的保护剂及其应用，属于生物制品技术领域。针对现有技术生物制品保护剂采用聚合物时，用量较大时有潜在的安全性风险；而采用糖类时，单一糖类难起到全面的保护作用；采用无机盐类、醇类、氨基酸、蛋白或明胶等，动物源性或人源性物质存在安全性隐患，且需根据病毒或蛋白质特性来确定特定缓冲剂等技术问题。本申请提供一种生物材料的保护剂，包含阳离子脂质或纳米级阳离子脂质体。本方案的保护剂毒性小、适配多种糖类和缓冲剂，且适用于各种生物制品，如病毒或蛋白等。本申请还提供了一种生物材料保护剂的应用，当应用于病毒或蛋白时，适用范围广，且当保存温度为低温、常温或高温时，均具有保护作用。

Description

一种生物材料的保护剂及其应用
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体地，涉及一种生物材料的保护剂及其应用。
背景技术
保护剂作为生物制品中抗原物质以外的添加物，是为保护病毒等微生物的生物活性与抗原性，在冻结或冷冻干燥过程及其在保存中不受损害，不发生变化的一类物质。好的保护剂需具备如下特性：无免疫原性，无毒性；冷冻升华时不起泡；冻干后易溶解；在冷冻或冻干保存过程中有保护作用；有利于生物活性的保持；与样品不发生化学反应，不影响冻干制品的检测；对于应用于人体的药品，所用保护剂必须对人体无害，是监管部门所允许使用的。保护剂的配方因不同的制品而异，常用保护剂组分的化学类别有复合物、糖类、无机盐类、醇类、氨基酸类、聚合物、表面活剂、抗氧化剂。
糖是最常见、使用最广的一类冻干保护剂，虽然糖类是研究最多、也是公认最有效的保护剂，但一种保护剂很难起到全面的保护作用，需与其他赋型剂、填充剂等结合才会发挥较好效果。聚合物中，聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶等常作为蛋白质及微生物的冷冻干燥保护剂。而当使用无机盐类、醇类或氨基酸类时，由于许多病毒或病毒表面蛋白质结构可耐受的pH值范围均较窄，在制剂过程中加入合适的pH缓冲液尤为必要。常见的用于冻干保护剂配方中缓冲液有：磷酸盐、柠檬酸盐、Tris盐酸、醋酸盐、甘氨酸、组氨酸等。不是所有缓冲剂均可在任何配方中使用，应根据合适的pH范围及特定病毒或蛋白质特性来确定缓冲剂。
聚合物一般和其他种类的保护剂联用，其稳定作用取决于聚合物的多重性质。中国专利申请公布号CN102892427A，发明名称为“用于稳定病毒颗粒、多肽或生物材料的赋形剂”，公开的方法利用一种无菌药用水性溶液，该溶液是以密封的容器提供的，并且包括：药用水性溶剂；病毒颗粒或生理活性多肽；选自聚乙烯亚胺、化学式(I)的化合物或其生理学可接受的盐或酯；或化学式(II)的化合物或其生理学可接受的盐或酯的赋形剂；以及可选地，一种或多种糖类。该方案介绍到一种或多种糖类、聚乙烯亚胺和病毒颗粒的水性溶液以形成包含病毒颗粒的非晶固体基体，从而可以保存病毒。但使用聚合物，作为转染试剂在体外使用较多，人体内应用少，如将聚乙烯亚胺(PEI)，或者甘氨酸及其衍生物作为生物制品的冻干保护剂，当用量相对较大时，可能有潜在的安全性风险，当将其应用于人源性或动物源性生物制品，因存在着上述安全性隐患，针对其制备的生物制品的监管要求越来越严格，其针对不同生物制品的有效性也待考证。
发明内容
1、要解决的问题
针对现有技术生物制品保护剂采用聚合物时，用量较大时有潜在的安全性风险；而采用糖类时，单一糖类难起到全面的保护作用；往往需要添加无机盐类、醇类、氨基酸、蛋白、明胶等，其中动物源性和人源性物质存在安全性隐患，无法满足监管要求，且需根据病毒或蛋白质特性来确定特定缓冲剂等技术问题。本申请提供一种生物材料的保护剂，其保护剂毒性小，已被证明安全性风险较低，适配多种糖类和缓冲剂，且适用于各种生物制品，如病毒或蛋白等。本申请还提供了一种生物材料保护剂的应用，当应用于病毒或蛋白时，适用范围广，且当保存温度为低温、常温或高温时，均具有保护作用。
2、技术方案
本申请的一种生物材料的保护剂，包含阳离子脂质或纳米级阳离子脂质体。
优选的，所述纳米级阳离子脂质体粒径为1～2000nm。常见的阳离子脂质体一般由阳性两亲性脂质和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇等辅助脂质组成，可含有单磷脂酰酯、霉菌酸酯和鲨烯等免疫调节物。阳离子脂质体的毒副作用较少，主要表现为：细胞萎缩，有丝分裂减少，细胞质液泡化以及蛋白酶C受到抑制，其毒性主要与脂质的亲水头部结构有关，季铵盐的毒性大于叔胺，含有咪唑或吡啶等杂环的亲水头部往往具有较低的毒性，但是阳离子脂质体总体而言是相对安全的。阳离子脂质由4部分组成，即一个或多个阳离子头部(head)、连接链(spacer)、连接键(linker bond)和疏水烃尾(hydrophobic tail)。现有技术中常用阳离子脂质体作为核酸转染试剂或递送系统，本申请将阳离子脂质及其纳米级的阳离子脂质体用于生物材料的保护剂，毒性小、适配多种糖类和缓冲剂，且适用于各种生物制品，如病毒或蛋白等。
优选的，纳米级阳离子脂质体的获得，可以按照如下方法制备：取阳离子脂体将其溶解于相应的可溶有机溶剂中，可以是一种或多种混合物，如氯仿或/和甲醇中；为了获得具有更小尺寸的均匀纳米颗粒脂质体，可以使用旋转蒸发器制成脂质膜，水化后进行超声(探针模式)或者微射流均质匀浆，或者使用脂质体挤出器制备；也可以使用微流控注射泵制备后置换缓冲液并纯化获得。也可以是购买的商品化的阳离子脂质体，如Lipofectin(DOTMA/DOPE＝1:1，GIBCO BRL)、DOTAP(DOTAP，Boehringer、Mannheim)、Transfect ACEDDAB/DOPE＝1:3，GIBCO BRL)、Lipofect AMINE(DOSPA/DOPE＝1:1，GIBCO BRL)、Transfectam(DOGS，Promega)、TfxTM-50(TfxTM-50/DOPE，Promega)、DC-Chol(DC-Chol/DOPE＝1:1，Sigma)。
进一步地，还包含糖类和缓冲系统。
进一步地，所述阳离子脂质包括单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、阳离子胆固醇衍生物或可电离的阳离子脂质。
进一步地，所述阳离子脂质或纳米级阳离子脂质体包括双十烷基二甲基卤化铵或(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺。
优选的，所述阳离子脂质或纳米级阳离子脂质体为氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DORI)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE)、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HP)、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HB)、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HPc)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵(DPRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵(DSRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵(DMRIE)、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺(DOGS)、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、脂质多聚-L-赖氨酸(LPLL)、硬脂胺(SA)或Dlin-MC3-DMA中的至少一种。
进一步地，所述糖类可以是单糖、二糖、三糖、多糖或聚糖中的一种或几种。
进一步地，所述糖类包括蔗糖、海藻糖、麦芽糖或右旋糖苷中的一种或几种。
优选的，所述糖类为蔗糖、海藻糖、麦芽糖与右旋糖苷的组合物。
优选的，包括还原糖，如葡萄糖、果糖、甘油醛、乳糖、阿拉伯糖和麦芽糖。
优选的，包括非还原糖，如蔗糖和棉子糖。
优选的，所述糖可以是：单糖，如半乳糖和甘露糖；二糖，如蔗糖、乳糖和麦芽糖；三糖，如棉子糖；四糖，如水苏糖。海藻糖、伞形糖、毛蕊花糖、异麦芽糖、纤维二糖、麦芽酮糖、松二糖、松三糖、蜜二糖、葡聚糖和右旋糖苷也适用。
进一步地，所述缓冲系统为磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸盐、醋酸盐、甘氨酸或组氨酸。缓冲液主要作用为调整pH以及渗透压等。
优选的，所述缓冲系统为磷酸盐缓冲液，浓度1/15mol/L，pH值4.92～8.18。阳离子脂质体表面带正电荷，与磷酸根结合后会改变其表面电位，从而可能会影响阳离子脂质体与生物材料的相互作用。本方案中，令人意外的是，使用含有磷酸盐缓冲液的保护剂可以起到增强保护的作用。
进一步地，所述阳离子脂质或纳米级阳离子脂质体的浓度为1～2000nM；所述糖类在保护剂中的质量浓度为2～15％。
进一步地，还包括稳定剂。
进一步地，所述稳定剂为辅助脂质。
进一步地，所述稳定剂为酰基甘油酯、磷脂、糖脂、固醇类或衍生脂质中的一种或几种。
优选的，所述辅助脂质为二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇，或者是DPPE-PEG2000，DMG-PEG2000、海藻糖衍生物、单分枝酰基甘油。
优选的，所述海藻糖衍生物为山榆酸海藻糖。
稳定剂的添加，能够保护脂质体结构，维持脂质体分散、不发生聚集，有利于脂质体的长期保存。但是结果表明，无论阳离子脂质体是否含有稳定剂，两者的对生物材料的保护效果无显著差异。
一种生物材料保护剂的应用，将所述的保护剂应用于病毒或病毒载体的保护剂中。
进一步地，所述病毒为腺病毒、疱疹病毒；所述病毒载体为腺病毒载体或疱疹病毒载体。
一种生物材料保护剂的应用，将所述的保护剂应用于蛋白的保护剂中。
优选的，所述蛋白为可溶性蛋白。
3、有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
(1)本申请的一种生物材料的保护剂，包含阳离子脂质或纳米级阳离子脂质体，毒性小、适配多种糖类和缓冲剂，且适用于各种生物制品，如病毒或蛋白等。
糖类是研究最多、也是公认最有效的保护剂，但一种保护剂很难起到全面的保护作用，而与其他赋型剂、填充剂等结合则会发挥较好效果，需要添加无机盐、糖类、蛋白、氨基酸、醇类、明胶等。其中动物源性和人源性物质存在安全性隐患，无法满足越来越严格的监管要求。且现有的保护剂效果有限、保存期短或保存的温度要求严苛，往往需要-80℃或-20℃，至少也需要在2～8℃条件下。
本申请发现使用较高浓度(如：2000nM)的阳离子脂质，可作为病毒或蛋白的保护剂，用于实验室或动物临床研究；如果用于人体临床，可能有潜在的安全性风险，阳离子脂质体的细胞毒性与类脂结构有关，高浓度的阳离子脂质体一般认为有毒性，但阳离子脂质体在转染剂领域应用广泛，低浓度的阳离子脂质体一般是安全的。本发明同时发现将阳离子脂质制备成纳米级脂质体保护剂组合物，该组合物含有对人体安全的低浓度脂质体，可以在低温2～8℃、常温或37℃针对生物材料产生保护作用，且优于单一糖类保护剂。
另外，本申请还记载了保护剂组合物使用的缓冲系统。阳离子脂质体表面带正电荷，与磷酸根结合后会改变其表面电位，从而可能会影响阳离子脂质体与生物材料的相互作用。令人意外的是，本发明中使用含有磷酸盐缓冲液的保护剂可以起到增强保护的作用。磷酸盐是最常用的缓冲体系之一，成分和明确，缓冲能力强，人体注射不会产生不适反应。
(2)本申请的一种生物材料的保护剂的应用，当应用于病毒或蛋白时，适用范围广，且当保存温度为低温2～8℃、常温或37℃时，均具有保护作用。该保护剂解决了病毒或蛋白液体制剂保存时容易失活或降解的问题，可延长病毒保存时间，低温例如2～8℃条件下可稳定保存，即使在37℃条件下病毒或蛋白的保存时间也显著延长。另外，该保护剂组合物可直接制备成为冻干制剂，便于材料制品的长期保存。采用该保护剂制成的冻干制剂也提高了病毒和蛋白对温度变化的抗逆性，使其不易因温度变化而造成活性损失；该保护剂组合物不含明胶、人源或动物源性蛋白成分，对降低副作用有重要意义。
本申请所提供的解决方案，应用范围更广，可采用肌肉注射、皮下注射、鼻喷、口服等免疫方式，使用方便。
附图说明
图1实施例1中DDA脂质体与DDA直接溶解后腺病毒滴度值；
图2实施例2中DDA脂质体与DDA直接溶解后放37℃加速0天与7天腺病毒滴度值；
图3实施例3中不同缓冲液体系和不同浓度DDA脂质体在37℃加速第0天和第7天的腺病毒滴度值；
图4实施例4中不同保护剂配制下的腺病毒在37℃条件下的滴度值；
图5实施例5中不同保护剂配制下的腺病毒在2～8℃条件下的滴度值；
图6实施例6中不同保护剂配制下的腺病毒在56℃条件下的滴度值；
图7实施例7中不同浓度DDA脂质体保护剂配制下的疱疹病毒在37℃条件下的滴度值；
图8实施例8中不同浓度DDA脂质体保护剂配制下的疱疹病毒在2～8℃条件下的滴度值；
图9实施例8中VZV病毒在2～8℃第28天条件下的不同浓度DDA脂质体保护剂与PBS组滴度值的差值；
图10实施例9中不同浓度DDA脂质体保护剂配制下的VZV病毒在-20℃条件下的滴度值；
图11实施例9中疱疹病毒在-20℃第28天条件下的不同浓度DDA脂质体保护剂与PBS组滴度值的差值；
图12实施例10中37℃条件下腺病毒在不同糖类相同DDA脂质体浓度下的滴度值；
图13实施例11中腺病毒在不同糖类相同DDA脂质体浓度下冻干前后的滴度值；
图14实施例12中腺病毒在不同糖类不同DDA脂质体浓度下37℃条件下的滴度值；
图15实施例13中腺病毒在不同浓度DDA脂质体中是否含有稳定剂2～8℃条件下的滴度值；
图16实施例13中腺病毒在不同浓度DDA脂质体中是否含有稳定剂TDB 37℃条件下的滴度值；
图17实施例14中腺病毒在不同浓度DOTAP脂质体中是否含有稳定剂DOPE的滴度值；
图18实施例15中腺病毒在不同浓度DOTAP脂质体中37℃条件下的滴度值；
图19实施例16中腺病毒在不同浓度DOTAP脂质体中2～8℃条件下的滴度值；
图20实施例17中疱疹病毒在不同浓度DOTAP-DOPE脂质体中2～8℃条件下的滴度值；
图21实施例18中疱疹病毒在不同糖类相同DOTAP-DOPE脂质体浓度下37℃条件下的滴度值；
图22实施例19中腺病毒在不同糖类相同DOTAP脂质体浓度下冻干前后的滴度值；
图23实施例20中腺病毒在不同糖类不同DOTAP-DOPE脂质体浓度下37℃条件下的滴度值；
图24实施例22中疱疹病毒糖蛋白E在不同DDA浓度保护剂中，2～8℃条件下0天、7天、14天蛋白变化。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。本实施方式中双十烷基二甲基卤化铵(DDA)购自Avanti公司；山榆酸海藻糖购自Avanti公司；荧光蛋白标记的重组血清5型腺病毒(EGFP-rAd5)为本公司自制；疱疹病毒(VZV)为自制；HEK 293细胞购自ATCC；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)购自麦克林公司；(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)购自百灵威公司。
实施例1
纳米级阳离子脂质体保护剂的制备：将双十烷基二甲基卤化铵(DDA)纳米级阳离子脂质体颗粒与蔗糖溶液等量混合，得到不同浓度纳米级阳离子脂质体保护剂，分别记为保护剂1、2、3和4。将EGFP-rAd5加入保护剂中混匀，蔗糖终浓度为10％(g/v)，DDA纳米级阳离子脂质体颗粒终浓度分别为100、50、25、5nM，分别记为G1、G2、G3和G4组。缓冲液为PBS缓冲液。
双十烷基二甲基卤化铵(DDA)溶液的制备：称取DDA溶解于预热后的PBS溶液，可加入适量乙醇助溶。取充分溶解后的DDA溶液与蔗糖溶液混匀，得到不同浓度DDA溶液保护剂。将EGFP-rAd5加入DDA溶液保护剂中混匀，使得蔗糖终浓度为10％(g/v)，得到不同浓度(2000、100、50、25、5nM)DDA溶液，分别记为G5、G6、G7、G8和G9组。
同时设蔗糖和PBS溶液组作为对照，分别记为G10和G11组。上述11组混匀后立即取样，按照如下方法检测病毒滴度。
病毒滴度(TCID50)检测：
通过用表达绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒感染细胞计算病毒滴定度。用HEK 293细胞以每毫升105个细胞(每孔100μL)接种96-孔平底细胞培养皿，并保持在37℃和5％的CO2下。在达到90％汇合之后，使用含5％胎牛血清(FBS)的Dulbecco's Modified EagleMedium(DMEM)培养基按照1:10进行稀释。然后将100μL得到的经稀释的病毒加入至平板的第一排中，并沿着平板进行1:2稀释。重复该过程。在24小时之后，利用荧光显微镜法计数每个孔中表达GFP的细胞的数量。由稀释液倍增的表达GFP的细胞的数量计算TCID50。
结果显示，与对照组(G10和G11)相比较，保护剂，(DDA)纳米级阳离子脂质体与DDA直接溶解对腺病毒滴度的保护效果是差异不显著。与对照组相比较，无论是否含有保护剂，各组病毒滴度无显著差异。一般来说，阳离子脂质体能够作为良好的转染试剂，促进核酸类(DNA、RNA等)物质进入细胞内。但是该实施例说明，在本组合物下，纳米级阳离子脂质体及其组合物对病毒并无显著的促进转染作用。结果见图1。
实施例2
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例1，所不同的是：
将11组置于37℃条件下，分别在0和7天取样检测接其病毒滴度。
结果如图2所示。结果显示，与空白对照组(G10和G11)相比较，含有DDA纳米级阳离子脂质体保护剂组合物的G1～G4的病毒滴度无显著差异，且病毒滴度随着保护剂中DDA浓度升高呈先上升再下降的趋势。而含有DDA溶液保护剂组合物在高浓度(2000nM)时也有保护效果，但在低浓度G6～G9组的病毒滴度很快下降至不加保护剂的PBS组水平。
实施例3
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例1，所不同的是：考察缓冲液体系对保护剂的影响。
按照实施例1制备样品，分别选择磷酸盐缓冲系统(PBS)(G1～G4)和Tris溶液缓冲系(G5～G8)统配制样品，得到不同缓冲系统和含有不同浓度的纳米级阳离子脂质体保护剂。将EGFP-rAd5加入保护剂中混匀，蔗糖终浓度为10％(g/v)，DDA终浓度分别为100、50、25、5nM；同时设蔗糖、PBS溶液和Tris溶液组作为对照，分别记为G9、G10和G11、G12组。
将上述12组置于37℃条件下，分别在0和7天取样检测病毒滴度。结果如图3所示。
结果显示，37℃条件下，含有PBS缓冲系统的保护剂的G1～G4组的病毒滴度下降趋势与第0天相比，G1～G4病毒滴度下降无显著差异，而含有Tris缓冲系统的G5～G8组的病毒滴度同对照组G9～G12一样，病毒滴度下降趋势差异显著至无法检出。
实施例4
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例1，所不同的是：37℃下考察腺病毒在不同保护剂中保存的稳定性。
甘氨酸保护剂组：称取甘氨酸溶解于PBS溶液，与蔗糖溶液混合，得到不同浓度(100、20、4、0.8mM)的甘氨酸溶液。将EGFP-rAd5加入保护剂中混匀，分别记为G1～G4组。
二甲基甘氨酸(DMG)保护剂组：称取甘氨酸溶解于PBS溶液，与蔗糖溶液混合，得到不同浓度(100、20、4、0.8mM)DMG溶液。将EGFP-rAd5加入保护剂中混匀，分别记为G5～G8组。
聚乙烯亚胺(PEI)保护剂组：称取PEI溶解于PBS溶液，与蔗糖溶液混合，得到不同浓度(100、50、25、5、1nM)的PEI溶液。将EGFP-rAd5加入保护剂中混匀，分别记为G9～G13组。
DDA纳米级阳离子脂质体颗粒保护剂组：按照实施例3制备以PBS缓冲系统为基础的样品，含有不同浓度(100、50、25、5、1nM)DDA纳米脂质体颗粒的保护剂组合物。将EGFP-rAd5加入保护剂中混匀，分别记为G14～G18组。
同时设置PBS溶液作为对照组G19。
将上述19组置于37℃条件下，分别在0、7、14和21天取样检测接其病毒滴度。
结果显示，在未置于37℃条件之前，这19组的病毒滴度差异不显著，但是在37℃放置21天之后，可以看出DDA纳米级阳离子脂质体组(G14～G18)优于含甘氨酸和DMG组(G1～G8)，而与PEI组(G9～G13)相当。结果见图4所示。
实施例5
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例4，所不同的是：考察腺病毒在2～8℃下保存的稳定性。
按照实施例3制备样品，将上述19组置于2～8℃条件下，分别在0、1、2和3月取样检测EGFP-rAd5病毒滴度。
结果显示，在未置于2～8℃条件之前，这19组的病毒滴度差异不显著，但是在2～8℃放置3个月之后，DDA纳米级阳离子脂质体组(G14～G18)优于含甘氨酸和DMG组(G1～G8)，而与PEI组(G9～G13)相当。结果见图5所示。
实施例6
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例4，所不同的是：考察腺病毒在56℃下保存的稳定性。
按照实施例3制备样品，将上述19组置于56℃条件下，分别在0和3天取样检测EGFP-rAd5病毒滴度，结果见图6所示。
结果显示，所有组均未检测到病毒滴度，说明在56℃时蛋白极其容易变性失活。
实施例7
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例1，所不同的是：将EGFP-rAd5替换为疱疹病毒(VZV)，考察纳米级阳离子脂质体保护剂对疱疹病毒的影响。
样品中蔗糖终浓度为10％(g/v)，DDA纳米级阳离子脂质体终浓度分别为1000、200、40和8nM，分别记为G1～G4组；同时设蔗糖和PBS溶液组作为对照，分别记为G5和G6组。上述6组混匀后置于37℃条件下，分别在0、1和3天取样，按照如下方法检测病毒滴度。
空斑试验：
材料：MEM，Gibco公司；碳酸氢钠，湖南九典宏阳制药有限公司；丙酮酸钠，Sigma公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；乙酸，国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝，AMRESCO。
步骤：
1.将细胞按1.5×105/孔接种至6孔细胞培养板，培养3～4天，至细胞长满单层；
2.将收获的第3代病毒液稀释10倍，分别取原倍和稀释10倍的病毒液100μL接入长满单层细胞的6孔板中，每个浓度都设置复孔，置37℃、5％CO2培养箱吸附1小时后，补加病毒培养液3mL，继续培养7～10天；
3.将细胞培养液倒掉，每孔加入1mL PBS洗涤，倒掉PBS，每孔加入1mL染色液，染色10分钟，流水冲掉残留的染色液；
4.计数每孔内的空斑，计算公式为：PFU/mL＝PFU/孔*稀释倍数*10，以l gPFU/mL表示病毒滴度。
结果显示，在未置于37℃条件之前，这6组的病毒滴度差异不显著，而在37℃放置3天后，DDA纳米级阳离子脂质体组(G2～G4)的病毒仍有滴度，而蔗糖和PBS组无法检测出病毒滴度，说明DDA纳米级阳离子脂质体组(G1～G4)优于对照组G5和G6。结果见图7所示。
实施例8
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例7，所不同的是：考察疱疹病毒在2～8℃下保存的稳定性。
按照实施例7制备样品，将上述6组置于2～8℃条件下，分别在0、14、21和28天取样检测病毒滴度(空斑试验)。
结果显示，在未置于2～8℃条件之前，这6组的病毒滴度差异不显著，而在2～8℃放置28天后，DDA纳米级阳离子脂质体组(G1～G4)的病毒仍有滴度，而PBS组无法检测出病毒滴度，说明DDA纳米级阳离子脂质体组(G1～G4)优于对照组G5和G6。结果见图8和图9所示。
施例9
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例7，所不同的是：考察疱疹病毒在-20℃下保存的稳定性。
按照实施例7制备样品，将上述6组置于-20℃条件下，分别在0、14和28天取样检测病毒滴度(空斑试验)。
结果显示，在未置于-20℃条件之前，这6组的病毒滴度差异不显著，而在-20℃放置28天后，DDA纳米级阳离子脂质体组(G1～G4)的病毒仍有滴度，而PBS组无法检测出病毒滴度，说明DDA纳米级阳离子脂质体组(G1～G4)优于对照组G5和G6。见图10和图11所示。
实施例10
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例1，所不同的是：考察不同糖类在保护剂中的效果。
按照实施例1制备EGFP-rAd5样品，其保护剂中糖类和脂质体含量如下。
G1：包含10％蔗糖和100nM DDA脂质体；
G2：包含2％蔗糖和100nM DDA脂质体；
G3：包含10％海藻糖和100nM DDA脂质体
G4：包含2％海藻糖和100nM DDA脂质体；
G5：包含10％麦芽糖和100nM DDA脂质体；
G6：包含2％麦芽糖和100nM DDA脂质体；
G7：包含4％蔗糖和4％右旋糖苷和100nM DDA脂质体；
G8：包含4％海藻糖和4％右旋糖苷和100nM DDA脂质体；
G9：包含4％麦芽糖和4％右旋糖苷和100nM DDA脂质体；
G10设PBS和EGFP-rAd5组作为对照。
将上述10组置于37℃条件下，分别在0和7天取样检测EGFP-rAd5病毒滴度。
结果显示，不同的糖类、糖类组合物与DDA纳米级阳离子脂质体配伍后均可以有效的保护腺病毒活性，结果见图12所示。
实施例11
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例10，按照实施例10制备样品G1～G10，按照如下步骤冻干样品。
冻干步骤：
通过东富龙冷冻干燥机，使用在下表中示出的干燥循环冷冻干燥样品，持续约3天。在整个过程中调节搁板温度和真空，使得冷凝器保持在-80℃，并保持一定的真空度，直至样品轧塞。样品在-40℃下预冷冻4小时。在一次干燥阶段中，搁板温度降低至-45℃。二次干燥阶段增加温度可达30℃，直至完成干燥。同时探测记录的搁板温度和冷凝器温度，见表1。
表1搁板温度、真空度和保温时间
将上述10组冻干前后以及37℃放置7天后，分别取样取样检测EGFP-rAd5病毒滴度。
结果显示，除PBS组无法成型且滴度下降显著外，其余组含不同的糖类、糖类组合物与DDA纳米级阳离子脂质体配伍，冻干后有轻微波动，37℃放置7天未见明显下降，整体上病毒滴度(TCID50)下降不到1log。结果如图13所示。
实施例12
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例1，考察保护剂的最佳浓度范围。
按照实施例1制备EGFP-rAd5样品，其保护剂中糖类和纳米级阳离子脂质体含量如下。
G1：包含10％蔗糖和2000nM DDA脂质体；
G2：包含10％蔗糖和100nM DDA脂质体；
G3：包含10％蔗糖和50nM DDA脂质体；
G4：包含10％蔗糖和25nM DDA脂质体；
G5：包含10％蔗糖和5nM DDA脂质体；
G6：包含10％蔗糖和1nM DDA脂质体；
G7：包含10％海藻糖和2000nM DDA脂质体；
G8：包含10％海藻糖和100nM DDA脂质体；
G9：包含10％海藻糖和10nM DDA脂质体；
G10：包含10％海藻糖和1nM DDA脂质体；
G11：包含10％麦芽糖和2000nM DDA脂质体；
G12：包含10％麦芽糖和100nM DDA脂质体；
G13：包含10％麦芽糖和10nM DDA脂质体；
G14：包含10％麦芽糖和1nM DDA脂质体；
G15：包含4％右旋糖苷和2000nM DDA脂质体；
G16：包含4％右旋糖苷和100nM DDA脂质体；
G17：包含4％右旋糖苷和10nM DDA脂质体；
G18：包含4％右旋糖苷和1nM DDA脂质体；
G19：对照组：PBS。
将上述19组置于37℃条件下，分别在0和7天取样检测EGFP-rAd5病毒滴度。
结果显示，与第0天相比，这19组保护剂配方在37℃放置7天后，除对照组G19组外，不同的糖类、糖类组合物与DDA纳米级阳离子脂质体配伍后均可以有效的保护腺病毒活性。结果见图14所示。
实施例13
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例1，本实施例添加稳定剂。
按照实施例1制备EGFP-rAd5样品，其中纳米级DDA纳米级阳离子脂质体含量分别为100、50、25和2.5nM，分组记为G1～G4。
参照文献(专利：JP4987704B2)制备含有稳定剂的DDA纳米级阳离子脂质体，其中加入海藻糖衍生物(山榆酸海藻糖，TDB)用以稳定DDA纳米级阳离子脂质体，DDA纳米级阳离子脂质体含量分别为100、50、25和2.5nM。加入EGFP-rAd5制备样品，分组记为G5～G8。设10％蔗糖和PBS组分别作为对照。
参照文献(Steel JC,Cavanagh HM,Burton MA,et al.Increased tumorlocalization and reduced immune response to adenoviral vector formulated withthe liposome DDAB/DOPE.Eur JPharm Sci.2007；30(5):398-405.)制备DDA-DOPE纳米级阳离子脂质体，加入EGFP-rAd5制备样品，分组记为G9～G10。
设10％蔗糖+EGFP-rAd5和PBS+EGFP-rAd5量组分别作为对照G11和G12。
将上述10组分别置于2～8℃和37℃条件下，分别在0、7、14和21天取样检测EGFP-rAd5病毒滴度。
结果与讨论：DDA制备的脂质体不稳定，加入稳定剂后可以很好的保护脂质体结构，能够维持脂质体分散、不发生聚集。但是结果表明，无论DDA脂质体是否含有稳定剂，两者对腺病毒滴度的保护效果无显著差异。结果见图15和图16所示。
实施例14
本实施例的一种生物材料的保护剂，将含有稳定剂DOPE的DOTAP纳米级阳离子脂质体颗粒(DOTAP-DOPE)与蔗糖溶液等量混合，得到不同浓度纳米级阳离子脂质体颗粒保护剂，分别记为保护剂1、2、3、4。将EGFP-rAd5加入保护剂中混匀，蔗糖终浓度为10％(g/v)，DOTAP纳米级阳离子脂质体颗粒终浓度分别为500、125、25和5nM，分别记为组G1～G4。
DOTAP溶液的制备：称取DOTAP溶解于预热后的PBS溶液，可加入适量乙醇助溶。取充分溶解后的DOTAP溶液与蔗糖溶液混匀，得到不同浓度DOTAP溶液保护剂。将EGFP-rAd5加入DOTAP溶液保护剂中混匀，使得蔗糖终浓度为10％(g/v)，得到不同浓度(500、125、25和5nM)DOTAP溶液，分别记为组G5～G8。
同时设蔗糖和PBS溶液组作为对照，分别记为组G9和G10。上述10组混匀后分装，取样，参照实施例1方法检测病毒滴度(TCID50)。
结果见图17。结果显示，与空白对照组(G9和G10)相比较，无论是否含有保护剂，各组病毒滴度无显著差异。说明DOTAP纳米级阳离子脂质体及其组合物对病毒并无显著的促进转染作用。
实施例15
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例13，考察腺病毒在37℃下保存的稳定性。
按照实施例13制备以PBS缓冲系统为基础的EGFP-rAd5样品，含有不同浓度DOTAP(500、125、25和5nM)的DOTAP-DOPE纳米级阳离子脂质体颗粒保护剂组合物。分别记为G1～G4。同时设置蔗糖和EGFP-rAd5，PBS溶液和EGFP-rAd5作为对照组G5和G6。
将上述组别置于37℃条件下，分别在0和7天取样检测接其病毒滴度。结果见图18所示。
结果显示，试验开始前，这6组的病毒滴度差异不显著；但在37℃条件下放置7天后，DOTAP阳离子纳米脂质体颗粒组(G1～G4)的病毒滴度优于蔗糖和PBS组G5和G6。
实施例16
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例13，考察腺病毒在2～8℃下保存的稳定性。
按照实施例13制备以PBS缓冲系统为基础的EGFP-rAd5样品，含有不同浓度DOTAP(500、125、25和5nM)的DOTAP-DOPE纳米级阳离子脂质体颗粒的保护剂组合物。分别记为G1～G4。同时设蔗糖和PBS溶液组作为对照，分别记为G5和G6。
将上述6组置于2～8℃条件下，分别在0、1和2个月取样检测接其病毒滴度。结果见图19所示。
结果显示，在未置于2～8℃条件之前，这6组的病毒滴度差异不显著，但是在2～8℃放置2个月后，DOTAP-DOPE纳米级阳离子脂质体组(G1～G4)的病毒高于对照组(G5和G6)的病毒滴度，说明DOTAP纳米级阳离子脂质体颗粒组(G1～G4)优于蔗糖和PBS组(G5和G6)。
实施例17
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例3，考察疱疹病毒在2～8℃下保存的稳定性。
DOTAP-DOPE纳米级阳离子脂质体颗粒保护剂组：按照实施例3制备以PBS缓冲系统为基础的VZV病毒样品，含有不同浓度DOTAP(1000、500、100和10nM)的纳米脂质体颗粒的保护剂组合物。分别记为G1～G4，同时设蔗糖和VZV病毒，PBS和疱疹病毒VZV作为对照，记为G5和G6.
上述6组混匀后分装置于2～8℃条件下，分别在0、15和30天分别取样按示例6检测其病毒滴度。结果见图20所示。
结果显示，在未置于2～8℃条件之前，这6组的病毒滴度差异不显著，但是在2～8℃放置30天后，DOTAP-DOPE纳米级阳离子脂质体组(G1～G4)的病毒高于对照组(G5和G6)的病毒滴度，说明DOTAP纳米级阳离子脂质体组(G1～G4)优于蔗糖和PBS组(G5和G6)。
实施例18
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例3，考察不同糖类的影响。
按照实施例13制备EGFP-rAd5样品，其保护剂中糖类和纳米级阳离子脂质体含量如下。
G1：包含10％蔗糖和100nM DOTAP-DOPE脂质体；
G2：包含2％蔗糖和100nM DOTAP-DOPE脂质体；
G3：包含10％海藻糖和100nM DOTAP-DOPE脂质体；
G4：包含2％海藻糖和100nM DOTAP-DOPE脂质体；
G5：包含10％麦芽糖和100nM DOTAP-DOPE脂质体；
G6：包含2％麦芽糖和100nM DOTAP-DOPE脂质体；
G7：包含4％蔗糖和4％右旋糖苷和100nM DOTAP-DOPE脂质体；
G8：包含4％海藻糖和4％右旋糖苷和100nM DOTAP-DOPE脂质体；
G9：包含4％麦芽糖和4％右旋糖苷和100nM DOTAP-DOPE脂质体；
G10：设PBS组作为对照。
将上述10组置于37℃条件下，分别在0和7天取样检测EGFP-rAd5病毒滴度。
结果显示，不同的糖类、糖类组合物与DOTAP阳离子脂质体与第0天相比，这10组保护剂配方在37℃放置7天后，除对照组G10组外，不同的糖类、糖类组合物与DOTAP级阳离子脂质体配伍后均可以有效的保护腺病毒活性。结果见图21所示。
实施例19
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例18，按照如下步骤冻干样品。
冻干步骤：
通过东富龙冷冻干燥机，使用在下表中示出的干燥循环冷冻干燥样品，持续约3天。在整个过程中调节搁板温度和真空，使得冷凝器保持在-80℃，并保持一定的真空度，直至样品轧塞。样品在-40℃下预冷冻4小时。在一次干燥阶段中，搁板温度降低至-45℃。二次干燥阶段增加温度可达30℃，直至完成干燥。同时探测记录的搁板温度和冷凝器温度，见表2。
表2搁板温度、真空度和保温时间
将上述10组冻干前后分别取样取样检测EGFP-rAd5病毒滴度。
可见：不同的糖类、糖类组合物与DOTAP纳米级阳离子脂质体配伍，冻干后有轻微波动，但未见显著差异。除PBS组无法成型且滴度下降显著外，其余组均可以作为有效的冻干保护剂，结果见图22所示。
实施例20
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例13，其保护剂中糖类和脂质体含量如下。
G1：包含10％蔗糖和1000nM DOTAP-DOPE脂质体；
G2：包含10％蔗糖和200nM DOTAP-DOPE脂质体；
G3：包含10％蔗糖和50nM DOTAP-DOPE脂质体；
G4：包含10％蔗糖和10nM DOTAP-DOPE脂质体；
G5：包含10％蔗糖和2nM DOTAP-DOPE脂质体；
G6：包含10％海藻糖和1000nM DOTAP-DOPE脂质体；
G7：包含10％海藻糖和200nM DOTAP-DOPE脂质体；
G8：包含10％海藻糖和50nM DOTAP-DOPE脂质体；
G9：包含10％海藻糖和10nM DOTAP-DOPE脂质体；
G10：包含10％麦芽糖和1000nM DOTAP-DOPE脂质体；
G11：包含10％麦芽糖和200nM DOTAP-DOPE脂质体；
G12：包含10％麦芽糖和50nM DOTAP-DOPE脂质体；
G13：包含10％麦芽糖和10nM DOTAP-DOPE脂质体；
G14：包含4％右旋糖苷和1000nM DOTAP-DOPE脂质体；
G15：包含4％右旋糖苷和200nM DOTAP-DOPE脂质体；
G16：包含4％右旋糖苷和50nM DOTAP-DOPE脂质体；
G17：包含4％右旋糖苷和10nM DOTAP-DOPE脂质体；
对照组：PBS(G18)。
将上述18组置于37℃条件下，分别在0和7天取样检测EGFP-rAd5病毒滴度。
结果显示，不同的糖类、糖类组合物与DDA脂质体配伍后均可以有效的保护腺病毒活性，DOTAP含量在2～1000nM之间均有一定的保护作用。结果见图23所示。
实施例21
本实施例的一种生物材料的保护剂，其所含有的阳离子脂质体的制备方法如下。
取阳离子脂质，或阳离子脂质和稳定剂，将其溶解于氯仿或/和甲醇或/和乙醇中，然后使用旋转蒸发器制成脂质膜；真空抽滤2h后，缓冲液水化后进行超声(探针模式)或者均质匀浆，或者使用脂质体挤出器制备。也可取阳离子脂质，或阳离子脂质和稳定剂，将其溶解于氯仿或/和甲醇或/和乙醇中，使用微流控注射泵制备。从而获得具有小尺寸粒径的均匀纳米颗粒脂质体。本实施例以DDA、DOTAP等为例，制备后取样检测纳米颗粒大小及Zeta电位。
脂质体的结构很大程度上取决于制备方式。脂质体的粒径分布可以通过挤压、超声和均质等制造方法进行控制，最近，微流控方法已成功用于LNPs制造和粒径控制。结果显示，制备的脂质体颗粒大小可控制在80～1000nm之间。Zeta电位在3～80mV之间，如下表3所示。
表3脂质体及其Zeta电位
脂质体的表面电荷通常由脂质头部基团决定，它可以带正电或负电或两性离子。取决于表面电荷密度的表面电位控制着颗粒之间的相互作用和抗衡离子的吸附，从而控制着纳米颗粒的稳定性。不带电颗粒或低电荷密度的颗粒会随着时间的推移而聚集，而荷一定电荷的颗粒会相互排斥，从而阻止聚集。上述组别在室温下放置3天后，观察外观并检测粒径大小，可见，未加入稳定剂的脂质体颗粒组(DDA组)很快聚集沉淀，且粒径变化较大，往往增加数倍；而加入稳定剂的脂质体粒径变化较小，且聚集轻微容易摇散。
实施例22
本实施例的一种生物材料的保护剂，基本同实施例1，
按照实施例1制备样品，将其中EGFP-rAd5替换为疱疹病毒糖蛋白E。样品中蔗糖终浓度为10％(g/v)，DDA终浓度分别为1000、500、100、25nM，分别记为G1～G4；同时设蔗糖和PBS溶液组作为对照，分别记为G5和G6组。上述6组混匀后置于2～8℃条件下，分别在0、7、14天取样，ELISA检测蛋白变化。
ELISA结果如图24显示，与对照组相比，DDA终浓度分别为1000、500、100、25nM对疱疹病毒糖蛋白E均具有保护作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种生物材料的保护剂的应用，其特征在于：将所述保护剂应用于病毒、病毒载体或蛋白在-20~37℃中稳定保存；
所述保护剂包含纳米级阳离子脂质体，还包含糖类和缓冲系统；
所述纳米级阳离子脂质体为双十烷基二甲基卤化铵或(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺；
所述糖类选自蔗糖、海藻糖、麦芽糖或右旋糖苷中的至少一种；
所述缓冲系统为磷酸盐缓冲液；
所述纳米级阳离子脂质体的浓度为1~2000 nM；所述糖类在保护剂中的质量浓度为2~15 %。
2.根据权利要求1所述的一种生物材料的保护剂的应用，其特征在于：还包括稳定剂TDB或DOPE。
3.根据权利要求1所述的一种生物材料的保护剂的应用，其特征在于：所述病毒为腺病毒、疱疹病毒；所述病毒载体为腺病毒载体或疱疹病毒载体。
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