CN101045037A - 阳离子脂质体、其腺病毒复合物及制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因治疗药物制剂领域,具体是涉及到一种阳离子脂质体、其腺病毒复合物以及它们的制备方法和用途。本发明阳离子脂质体是由1重量份DOPE、1重量份DOTMA和0.08~0.5重量份胆固醇制备而成。本发明阳离子脂质体可将待包封物质包封后形成复合物以制备药物组合物,既可以包封一般的药物活性成分,也可以包封装载基因的载体。本发明脂质体的稳定性和包封腺病毒载体后的转染效率均同时得到了提高,体内外转染率高,体内清除率大为降低,携带抗肿瘤活性基因重组人内皮抑素腺病毒—阳离子脂质体复合物在体内可有效地抑制肿瘤的生长,剂量大大低于单独的腺病毒剂型,非常适于临床使用,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因治疗药物制剂领域,具体涉及一种阳离子脂质体、其腺病毒复合物以及它们的制备方法和用途。
背景技术
腺病毒载体是基因治疗中目前最具潜力的病毒载体之一,具有①靶细胞种类广泛,具有高效感染分裂细胞和非分裂细胞的能力,导入效率高,这是逆转录病毒载体所不具备的;②易制备及纯化,滴度高,容量大,超离心可以制得高滴度(1013PFU/ml)的病毒载体;③携带的外源基因不整合到宿主染色体中,避免了插入突变的危险;④可携带大容量的外源片段(至多可达到36kb),远高于逆转录病毒;⑤同时,腺病毒能够高效地在ex vivo和in vivo途径进行基因转移,且操作方法简单;⑥到目前为止还未发现腺病毒与人类恶性肿瘤之间有任何直接关系等诸多优点,因而在临床基因治疗领域,也越来越受到重视,目前已广泛用于in vivo的基因转移。1993年,第一例应用腺病毒载体进行基因治疗的临床方案得到美国NIH的DNA咨询委员会(RAC)批准。自此,腺病毒载体成为继逆转录病毒载体之后被广泛应用的病毒基因转移系统。
虽然目前的腺病毒载体还未完全解决一过性表达的缺陷,但由于其转基因效率高等优点,在临床上已得到越来越多的应用。截至2007年1月为止,在全世界范围内开展的1283项基因治疗临床方案中,以腺病毒为载体的方案占了其中的25%(324项),呈明显的上升趋势。在针对肿瘤的基因治疗中,腺病毒载体转染细胞广泛和高滴度使其应用于in vivo转移抑癌基因、HSV-tk基因等方案中应用具有较大的优势。
腺病毒载体具有很多其他病毒载体无法比拟的优势,但也有些缺点限制了腺病毒的应用。尤其是腺病毒会引起人的免疫反应:一方面,病毒蛋白的渗漏表达或靶基因的表达可能造成较强的细胞免疫反应,转染腺病毒的细胞很快被清除,外源基因表达时间短暂;另一方面,机体产生针对腺病毒外壳蛋白的中和抗体,导致下次注射的腺病毒未到达靶细胞就已经被中和,降低作用效果。由此,为了减少第一方面的腺病毒造成的细胞免疫反应,研究者从免疫原性最强的第一代腺病毒载体一直开发到第三代腺病毒载体,从逐步剔除与免疫相关的腺病毒蛋白到把整个腺病毒基因组全部剔除(第三代腺病毒载体,gutless adenoviral vector),降低腺病毒的毒性和细胞免疫反应,部分解决了该问题;但是,减少腺病毒的中和抗体产生,提高第二次注射时腺病毒的作用效果,这些改造并没起到相应的作用。而且,第二、三代腺病毒的产量明显低于第一代腺病毒,生产难度较大,难以量产及规模化应用。
虽然第一代腺病毒载体存在以上缺点,但因包装细胞可产生高滴度的病毒颗粒、制备工艺相对简单、适合大规模制备等优点,它仍然是目前临床上应用最为广泛的腺病毒载体。
另一方面,作为载体常用的2型和5型腺病毒(Ad2和Ad5)对细胞的感染是由病毒颗粒表面突起的纤维蛋白(fiber蛋白)与其受体——柯萨奇-腺病毒受体(coxsackie-adenovirus receptor,CAR)结合而介导的,腺病毒对组织的感染主要取决于靶细胞表面CAR的表达水平。在人体中,CAR广泛表达于各种上皮组织,而在许多肿瘤组织中存在CAR不同程度的下调或缺失,如,人卵巢癌细胞CAR低表达,因此,传统使用的腺病毒作为载体往往被截留在正常上皮细胞,尤其是肝细胞中,而感染肿瘤的病毒量则大大减少,增加了可能的毒副作用和机体对腺病毒的免疫反应。目前,也有许多研究者通过改造腺病毒载体,将纤维蛋白改造,将Ad5和Ad35亚型的纤维蛋白重组成嵌合蛋白,或选择多数细胞均有的受体,如整合素(integrin)的结合序列——RGD motif等,提高腺病毒在CAR表达低的细胞的转染效率。但大多数研究仍处于实验室水平,离实际大量应用为时尚早。
目前,本领域已有试图使用脂质体包封腺病毒来克服上述问题的报道,并在体外试验中观测到了部分正向的效果,但是仍然难以获得体内疗效。而要使脂质体包封的腺病毒取得好的效果,需要在脂质体的配方,腺病毒和脂质体的配比等方面进行大量的探索,而可以制备脂质体的原料种类繁多,非常难以确定好的脂质体。因此,本领域目前急需开发出一种能投入实用的,真正具有好的体内功效的脂质体以用于包封腺病毒投入到基因治疗中去。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种阳离子脂质体。该阳离子脂质体是由1重量份二油酰磷脂酰乙醇胺、1重量份N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵和0.08~0.5重量份胆固醇制备而成。优选的,上述阳离子脂质体是由1重量份DOPE、1重量份DOTMA和0.1重量份胆固醇制备而成。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了上述阳离子脂质体在制备药物组合物中的应用。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一种阳离子脂质体复合物。该阳离子脂质体复合物是以上述的阳离子脂质体为包封层。
其中,上述的阳离子脂质体包封有基因载体。
进一步的,上述的基因载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和质粒载体中的至少一种。
优选的,上述的腺病毒为2型或5型腺病毒。
更优选的,上述的腺病毒为复制缺陷型腺病毒。
其中,上述的阳离子脂质体复合物中平均每1μg脂质体包封的腺病毒载体数量为5×108~1×1010VP(VP,virus particle,病毒颗粒数)。
优选的,上述的阳离子脂质体复合物中平均每1μg脂质体包封的腺病毒载体数量为1×109~5×109VP。
特别的,上述的真核表达载体装载有人内皮抑素基因、p53基因、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因及白细胞介素基因等基因中的至少一种并能在体内表达。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供了一种药物制剂。该药物制剂是由上述的阳离子脂质体复合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。
进一步的,上述的药物制剂为注射剂。更进一步的,上述的注射剂为注射液或冻干剂。
本发明所要解决的第五个技术问题是提供了上述的阳离子脂质体复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
进一步的,上述的抗肿瘤药物组合物的剂型为注射剂。
更进一步的,上述的注射剂为注射液或冻干剂。
本发明所要解决的第六个技术问题是提供了一种制备上述的阳离子脂质体的方法。该方法包括以下步骤:
a、按配比取DOPE、DOTMA、胆固醇,并溶解于三氯甲烷和甲醇组成的溶剂中;
b、将步骤a得到的溶液拌匀,在不超过40℃的温度下蒸发溶剂,再真空干燥;
c、向步骤b干燥后产物加入灭菌水,在氮气保护下,超声破碎即得。
上述方法步骤b中的蒸发方式优选为旋转蒸发,三氯甲烷和甲醇组成的溶剂的体积配比为3∶1左右,其用量以既能充分溶解溶质,又便于蒸发干燥为宜,且蒸发溶剂和真空干燥时温度不应超过40℃。
本发明所要解决的第七个技术问题是提供了一种制备上述的阳离子脂质体复合物的方法,其特征在于包括以下步骤:在容器中加入极性溶剂和待包封物质,然后加入脂质体,温和振荡5~10次,混匀后室温放置10至30分钟,即得。其中的极性溶剂的种类应根据待包封物质的种类选用生理相容性好的极性溶剂。常用的是重蒸水,生理盐水等;在包封重组噬菌体、质粒、腺病毒等基因载体时,可使用常用的培养基溶液作为溶剂,比如DMEM培养基溶液。
特别需要说明的是,以上生产和操作本发明公开的重组载体、脂质体和抗肿瘤注射剂的具体技术方法可以按本领域技术人员已知的现有技术完成。
本发明脂质体配方独特,通过在阳离子脂质中添加适当比例的胆固醇,很好地提高了脂质体的稳定性;并且出人意料的是与常用的阳离子脂质体(DOPE/DOTAP)相比,其稳定性和包封腺病毒载体后的转染效率均同时得到了提高。
本发明中的待包封物质是指脂质体复合物中被脂质体所包封的部分。本发明阳离子脂质体复合物是将上述阳离子脂质体作为包封材料,将待包封物质包封后形成复合物,还可同时添加药学上可接受的辅料并按照本领域公知制剂方法制备药物组合物。本发明阳离子脂质体既可以包封一般的药物活性成分制成常见的脂质体制剂。也可以包封装载基因的载体,如质粒载体、噬菌体载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体等。而这些基因载体是本领域已公知的,经加工后可以含有并能在真核细胞中表达所需表达的各种基因的载体,如:重组质粒载体、噬菌体载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体等。同时,本发明还提供包封这些基因载体时阳离子脂质体和基因载体的优选比例。
本发明的阳离子脂质体的制备方法,不仅改进了所用原料及用量,并优化了制备参数,还便于操作,适用于大规模连续生产。该方法能得到较窄的粒径分布的脂质体,且具有较好的稳定性,容易与药物成分或基因载体组成复合物,包封率高,并能延长其在体内的循环时间,尤其是提高基因药物的生物效应。
用本发明阳离子脂质体包封腺病毒形成复合物,能显著提高其对无腺病毒受体CAR细胞的转染效率,还能避免体内免疫系统对腺病毒的清除,提高其作用效果,降低用药剂量,同时也可降低腺病毒的副作用。如本发明实施例中制备的重组人内皮抑素腺病毒-阳离子脂质体复合物用本发明阳离子脂质体包封腺病毒克服了腺病毒在基因治疗中的一些缺陷,并具有以下优势:在体内外实验中均可提高腺病毒的转染效率;在体内在小鼠的肿瘤动物模型中,本发明阳离子脂质体包封腺病毒的剂型可有效地抑制肿瘤的生长,低于10倍剂量的重组人内皮抑素腺病毒-阳离子脂质体复合物(3×109VP/只)(VP,virus particle,病毒颗粒数)即可达到甚至超过重组人内皮抑素腺病毒(3×1010VP/只)的作用效果,剂量大大低于单独的腺病毒剂型;在应用时,阳离子脂质体包封腺病毒的剂型可用于静脉输注,治疗肺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等未暴露于体表的肿瘤,而目前的腺病毒局限于暴露于体表的头颈部肿瘤,可提高适应症的应用范围。
总的说来,本发明脂质体的稳定性和包封腺病毒载体后的转染效率均同时得到了提高,具有很好的药理特性。本发明腺病毒-阳离子脂质体复合物体内外转染率高,体内清除率大为降低,携带抗肿瘤活性基因重组人内皮抑素腺病毒-阳离子脂质体复合物在体内可有效地抑制肿瘤的生长,剂量大大低于单独的腺病毒剂型,并可用于静脉输注以治疗肺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等未暴露于体表的肿瘤,而目前的腺病毒治疗只能局限于暴露于体表的头颈部肿瘤等,大大增加适应症的应用范围,非常适于临床使用。本发明制备方法简单高效,适于大规模连续生产,具有很好的应用前景。
附图说明
图1本发明阳离子脂质体透射电镜的照片图
图2本发明阳离子脂质体粒度曲线分布示意图
图3本发明阳离子脂质体zeta电位曲线分布示意图
图4本发明重组人内皮抑素腺病毒构建过程的流程图
图5不同浓度阳离子脂质体包封Ad-GFP感染293、A549、SKOV3细胞感染效率曲线图
图6各组肿瘤生长曲线比较图
图7各组平均瘤重柱状图
图8各组腺病毒中和抗体产生情况图
以下结合附图通过对具体实施方式的描述进一步说明但不限制本发明,本领域技术人员根据本发明的基本思想,可以作出各种变型或改进,只要不脱离本发明的基本思想,均在本发明的范围之内。
具体实施方式
实施例一本发明阳离子脂质体配方和制备工艺的优选
选择阳离子脂质体作为目标脂质体类型,初步筛选试验后,选择二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、胆固醇(CHOL)作为基本成分,然后进行配方的优化。
本发明脂质体的制备方法所用原料及用量按初筛得到的范围进行优选(见表1)、工艺参数及主要工艺确定如下:
按表1取DOPE 20-50克,DOTMA 20-50克,胆固醇5-15克,以上原料均为固态;用三氯甲烷和甲醇的有机溶液溶解,不超过40℃温度下,旋转蒸发,再真空干燥2小时,加入灭菌水,在氮气保护下,超声破碎即得阳离子脂质体。
DOPE与DOTMA的相变温度为0℃下,在磷脂膜中加入胆固醇可改变其磷脂膜的相变温度,相变温度可影响脂质薄膜的成形,进而影响脂质体颗粒的大小和均匀,此温度可通过旋转蒸发时恒温水浴温度来调控。本发明中制备阳离子脂质体时,加入DOPE、DOTMA与胆固醇后,制备薄膜时的允许温度为0~50℃,优选温度为30℃。而胆固醇对脂质膜的流动性产生调节功能,增加膜的流动性,能提高脂质体的稳定性。
而DOPE、DOTMA与胆固醇的质量比对脂质体粒径大小和表面电荷有影响,经过对制备得到的不同配比的脂质体进行了颗粒大小(nm)和Zeta电位(mv)的检测结果(见表1)可知,DOPE、DOTMA与胆固醇的质量比为1∶1∶0.1和1∶1∶0.5时脂质体颗粒的均匀性较好,但当质量比为1∶1∶0.1时,阳离子脂质体的表面电荷更稳定,因此DOPE、DOTMA与胆固醇的质量比优选为1∶1∶0.1。
表1 阳离子脂质体配方比例优选实验
DOPE/DOTMA/CHOL(质量比,毫克或克) | 颗粒大小(nm) | Zeta电位(mv) |
1∶1∶0.1 | 73±15 | 37.5 |
2∶1∶0.1 | 103±25 | 17.7 |
4∶1∶0.1 | 123±40 | 7.8 |
1∶1∶0.5 | 85±41 | 26.4 |
实施例二本发明阳离子脂质体的制备
将60mg DOPE,60mg DOTMA与6mg胆固醇,溶解于三氯甲烷和甲醇的100ml有机溶剂中(体积比为3∶1,V/V),温度不超过40℃,旋转蒸发,真空干燥2小时,加入灭菌水,在氮气保护下,超声破碎即得阳离子脂质体。分装后,置于4℃-8℃条件下保存备用。
制备好的阳离子脂质体的透射电镜照片见图1,可见由该种方法制备的阳离子脂质体呈现粒径在一定范围内的多层囊状结构。制备好的阳离子脂质体用马尔文粒度仪检测,其粒度曲线分布示意图见图2,可见该种阳离子脂质体的粒径在100nm左右,分布均匀,呈正态性,跨距小;其zeta电位曲线分布示意图见图3,可见该种阳离子脂质体的zeta电位在40mV左右,分布均匀,呈正态性,跨距小。
实施例三重组人内皮抑素腺病毒的构建及制备
重组人内皮抑素腺病毒的构建流程图见图4(构建过程及所涉及的基因序列,载体,仪器、试剂均参见已经公开的中国专利申请:200510021720一种重组人内皮抑素腺病毒及其制备方法和用途),过程如下:
a、将人内皮抑素编码序列和克隆载体pUC18构建成pUC18-endo;
b、以pUC18-endo为模板,用步骤a合成的PCR引物扩增含IL-2基因信号肽的重组人内皮抑素基因。
c、将步骤b所得重组人内皮抑素基因构建入pAdenoVator-CMV5穿梭载体;
d、将步骤c所得载体与包含腺病毒基因组的质粒pAdenoVatorΔE1E3共转化大肠杆菌,筛选出重组子;
e、将d步骤所得重组子再转染293细胞,扩增制备重组腺病毒。
得到重组人内皮抑素腺病毒后,经空斑筛选得到腺病毒单克隆,通过感染293细胞大量扩增重组腺病毒。采用常规两步CsCl密度梯度超离心法纯化重组人内皮抑素腺病毒,第一步采用不连续CsCl梯度去除大部分的细胞碎片以及缺陷的病毒颗粒(即不具备感染活性的病毒颗粒),第二步采用连续CsCl密度梯度彻底将具备感染活性的病毒颗粒与缺陷的病毒颗粒区分开,最后再通过透析脱盐,去除CsCl,得到重组人内皮抑素腺病毒-Ad-E。
实施例四 包封重组腺病毒的本发明阳离子脂质体复合物的制备及比例的优选
不同重组腺病毒的病毒外壳一致,只是包裹的腺病毒基因组有所差别。因绿色荧光蛋白易于随时通过荧光显微镜进行表达情况的监测,本实施例中采用表达重组绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)等同为Ad-E进行腺病毒与阳离子脂质体制备比例的优选。表达重组绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)的制备方法同实施例三。
取聚苯乙烯管6个,各管加入100μl DMEM培养基和Ad-GFP 5×1010VP(Virus Particles,病毒颗粒数),第一管为阴性对照,其余各管依次加入1,5,10,20,50,100,500,1000μg阳离子脂质体,温和振荡5-10次,混匀后室温放置10至30分钟,即可得到阳离子脂质体与腺病毒复合物。
不同比率的阳离子脂质体与腺病毒复合物分别对柯萨奇-腺病毒受体(CAR)高表达的293细胞(MOI=1,MOI即multiplicity of infection,感染复数)、CAR表达量中等的人肺癌细胞株A549(MOI=50)和CAR低表达的SKOV3细胞(MOI=500)进行感染(荧光强度的检测结果表明其中CAR在293细胞上表达最高,A549细胞其次,而SKOV3细胞表面几乎没有表达),24小时后荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光出现,收获细胞用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度,不同细胞的感染效率见表2,曲线比较图见图5。
表2.不同比例腺病毒-阳离子脂质体复合物的转染效率
结果表明:在三种CAR表达不同的细胞株中,腺病毒病毒颗粒数与阳离子脂质体的比例不同对腺病毒的转染效率均有影响,阳离子脂质体的比例过高或过低对腺病毒的转染没有促进效果,反而会抑制腺病毒的转染;病毒颗粒数与阳离子脂质体的比例只有在一定范围内(5×108~1×1010VP/μg阳离子脂质体)才能促进腺病毒的转染。在CAR表达高、中的293细胞及A549细胞中,阳离子脂质体对腺病毒转染效率的促进效果并不明显;而在CAR表达很低的SKOV3细胞中,阳离子脂质体对腺病毒转染效率的促进效果非常明显,转染效率可从5.7%提高到71.9%。
本研究得出,重组腺病毒:阳离子脂质体的比例范围为:5×108~1×1010VP/μg阳离子脂质体,最佳比例为2.5×109VP重组腺病毒/μg阳离子脂质体。
实施例五包被重组腺病毒的本发明阳离子脂质体复合物对不同细胞感染活性的鉴定
在实施例四确定的重组腺病毒与阳离子脂质体比例条件下,按同样的方法制备重组人内皮抑素腺病毒-阳离子脂质体复合物,以不同的MOI值:0,10,50,500分别感染CAR表达量差异较大的不同细胞株,包括CAR高表达的293细胞、CAR表达量中等的人肺癌细胞株A549和CAR低表达的SKOV3细胞,培养48小时后,取上清液用试剂盒(购自Chemicon)检测内皮抑素的表达情况,结果见表3。
表3 不同细胞感染Ad-E及Ad-E-阳离子脂质体复合物的内皮抑素表达情况
结果表明,在低MOI值(MOI=10)感染情况下,阳离子脂质体可以提高CAR不同表达水平的细胞的腺病毒转染效率;当MOI值提高(MOI=50~500)时,阳离子脂质体提高腺病毒转染效果的作用在中、高度表达CAR的细胞株中并不明显,而对CAR低表达水平的细胞株作用显著。重组人内皮抑素腺病毒-阳离子脂质体复合物与单纯的重组腺病毒相比,在以后临床的应用上具有显著的优势,适用于多种CAR表达下调肿瘤的(如人卵巢癌细胞、前列腺癌细胞等)治疗。而且,用本发明阳离子脂质体包封Ad-E的复合物在较低的MOI值时可提高内皮抑素的表达水平,临床应用时可降低腺病毒的用量,减少腺病毒的毒副作用,这也是本发明的优点之一所在。
实施例六外加抗腺病毒抗体后对不同细胞感染活性的比较在实施例四确定的重组腺病毒与阳离子脂质体比例条件下,制备重组人内皮抑素腺病毒-阳离子脂质体复合物,在与不同浓度的抗腺病毒中和抗体(anti-AdenovirusAntibody)37℃孵育90分钟后,以MOI值为50分别感染293细胞、A549细胞和SKOV3细胞,培养48小时后,取上清液用试剂盒(购自Chemicon)检测内皮抑素的表达情况,结果见表4。
表4 不同细胞感染与腺病毒中和抗体孵育的Ad-E及Ad-E-阳离子脂质体复合物的内皮抑素表达情况
结果表明,阳离子脂质体可以有效地保护腺病毒不被中和抗体作用,仍然维持其感染活性。这在CAR表达程度不同(高、中、低)的三种细胞株中都得到了证实,加入不同浓度(10~50μg/ml)的腺病毒中和抗体均不能降低Ad-E-阳离子脂质体复合物的感染效果。临床应用时,因腺病毒中和抗体的产生会导致再次使用腺病毒的效果下降。腺病毒-阳离子脂质体复合物为这个问题的解决提供了一个良好的方案。
实施例七包被重组腺病毒的本发明阳离子脂质体复合物抗肿瘤注射剂的制备
在无菌条件下取500ml注射用水,加入实施例三所得的重组人内皮抑素腺病毒Ad-E(5×1014VP)、Tris 0.484g、MgCl2 0.076g、蔗糖16g,混合均匀,再加注射用水至总体积1000ml,同时用HCl调节pH值至8.0。无菌过滤后分装成1ml/支的重组腺病毒Ad-E注射剂,于-20℃保存。
同时,取实施例二制备阳离子脂质体,溶于无菌水,分装成1ml/支的阳离子脂质体注射剂,于4℃保存。
临用前,将重组腺病毒Ad-E注射剂加于阳离子脂质体注射剂中,缓慢上下颠倒5-10次,温和混匀,室温放置30分钟,即得。透射电镜观察表明制备得到的重组人内皮抑素腺病毒-阳离子脂质体复合物的大小均匀,包封率高。
以下通过试验例的方式对本发明的有益效果做进一步详述。
试验例一.包被重组人内皮抑素腺病毒的本发明脂质体复合物体内活性试验
通过测定抑制肿瘤的生长及转移情况来表明本发明包被重组人内皮抑素腺病毒的本发明脂质体复合物的体内活性。
1、实验方法
本实验采用卵巢癌动物模型对实施例七制备的重组人内皮抑素腺病毒-阳离子脂质体复合物抗肿瘤注射剂抑制肿瘤生长及转移的效果进行测定。
取22只6-8周龄雌性BALB/C裸鼠(购自四川大学华西实验动物中心)接种SKOV3细胞,每只皮下接种1×107SKOV3细胞/100μl。7天后可扪及肿瘤结节,14天后肿瘤结节长至4mm左右时,将裸鼠随机分为5组(即Ad-E+lipo-H组(3×1010VP)5只,Ad-E+lipo-L组(3×109VP)5只,Ad-E组(3×1010VP)4只,lipo组4只,NS组4只),尾静脉注射不同制剂进行实验。并每隔6天用游标卡尺测量肿瘤长、宽径,动态监测体积变化,肿瘤体积按以下方法计算:体积(mm3)=0.52×长(length)×宽2(width2)。肿瘤生长抑制用方差分析,P<0.05则认为有统计学意义。
2、实验结果
实验期间各组均未观察到明显的毒副反应。
治疗组肿瘤生长缓慢甚至缩小,而对照组肿瘤生长较快,各组肿瘤体积生长曲线比较图见图6。观察49天后处死全部裸鼠,肿瘤瘤重柱状图见图7。结果表明,Ad-E+lipo-H组、Ad-E+lipo-L和Ad-E组与NS组相比,抑瘤率分别为54.74%、70.65%(P<0.05)和39.81%,Ad-E-阳离子脂质体复合物的两个剂量组的抑瘤效果均超过单独腺病毒组,且低剂量Ad-E+lipo-L组与Ad-E组相比P<0.05,具有显著性差异。
以上结果表明,在人卵巢癌模型中Ad-E-阳离子脂质体复合物能有效抑制肿瘤的生长,而且,低剂量组的抑瘤效果明显高于高剂量组。这提示我们,在以后的临床应用中,可以大大降低重组腺病毒-阳离子脂质体复合物的使用剂量,提高治疗效果,降低毒副作用。
试验例二.重组人内皮抑素腺病毒-脂质体复合物抑制机体抗腺病毒抗体的产生
于实验例一进行的动物试验中,分别在动物注射药物前一天和注射后7天采集小鼠血清,1∶100稀释后ELISA检测血清中抗腺病毒抗体的产生情况,结果如图8所示。结果表明,腺病毒-阳离子脂质体复合物组能有效地降低抗腺病毒抗体的产生,且高剂量组的抗体水平与低剂量组相当,这说明阳离子脂质体对腺病毒的保护作用并不随着剂量的升高而降低。这在实际应用中,为避免被抗体中和而降低药效重复注射腺病毒制剂而提供了理论基础。
综上,由本发明提供的重组人内皮抑素腺病毒-阳离子脂质体复合物在体外实验中能提高腺病毒的转染效率,尤其是CAR低表达水平细胞的转染效率可以大大提高;在体内,阳离子脂质体包封腺病毒后,可以避免腺病毒被抗体识别,免被清除,可提高腺病毒的作用效果,降低用药剂量,同时也可降低腺病毒的副作用;在小鼠的肿瘤动物模型中,阳离子脂质体包封腺病毒的剂型可有效地抑制肿瘤的生长,且剂量大大低于单独的腺病毒剂型;在应用时,阳离子脂质体包封腺病毒的剂型可用于静脉输注,治疗肺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等未暴露于体表的肿瘤,而目前的腺病毒局限于暴露于体表的头颈部肿瘤,可提高适应症的应用范围。同时由本领域常识可知,若有不同的要求,本发明的抗肿瘤注射剂中重组腺病毒的用量可以在一个较大范围内变动。本领域技术人员可以根据一些已知的因素,诸如疾病的种类,病情严重程度,病人体重,剂型,所选用药途径等很容易地加以确定。
以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明,但并非对本发明范围的限制,本领域技术人员根据本发明的基本思想,可以作出各种变型或改进,只要不脱离本发明的基本思想,均在本发明的发明构思及所附上的权利要求书定义的范围之内。
Claims (16)
1、一种阳离子脂质体,其特征在于它是由1重量份DOPE、1重量份DOTMA和0.08~0.5重量份胆固醇制备而成。
2、根据权利要求1所述的阳离子脂质体,其特征在于它是由1重量份DOPE、1重量份DOTMA和0.1重量份胆固醇制备而成。
3、权利要求1或2所述的阳离子脂质体在制备药物组合物中的应用。
4、一种阳离子脂质体复合物,其特征在于以权利要求1或2所述的阳离子脂质体为包封层。
5、根据权利要求4所述的阳离子脂质体复合物,其特征在于所述的包封层内包封有基因载体。
6、根据权利要求5所述的阳离子脂质体复合物,其特征在于所述的基因载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、质粒载体或噬菌体载体中的至少一种。
7、根据权利要求6所述的阳离子脂质体复合物,其特征在于所述的腺病毒载体为2型或5型腺病毒载体。
8、根据权利要求6或7所述的阳离子脂质体复合物,其特征在于所述的腺病毒载体为复制缺陷型腺病毒。
9、根据权利要求6~8任一项所述的阳离子脂质体复合物,其特征在于平均每1μg脂质体包封的腺病毒载体数量为5×108~1×1010VP。
10、根据权利要求9所述的阳离子脂质体复合物,其特征在于平均每1μg脂质体包封的腺病毒载体数量为1×109~5×109VP。
11、根据权利要求7~10任一项所述的阳离子脂质体复合物,其特征在于所述的基因载体装载有人内皮抑素基因、p53基因、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因或白细胞介素基因中的至少一种并能表达。
12、一种药物制剂,是由权利要求4~11任一项所述的阳离子脂质体复合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。
13、根据权利要求12所述的药物制剂,其特征在于所述的药物制剂为注射剂。
14、权利要求4~11任一项所述的阳离子脂质体复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
15、一种制备权利要求1或2所述的阳离子脂质体的方法,其特征在于包括以下步骤:
a、按配比取DOPE、DOTMA、胆固醇,并溶解于体积比为3∶1的三氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂中;
b、将步骤a得到的溶液拌匀,在不超过40℃的温度下蒸发溶剂、真空干燥;
c、向步骤b干燥后产物加入灭菌水,在氮气保护下,超声破碎即得。
16、一种制备权利要求4~11任一项所述的阳离子脂质体复合物的方法,其特征在于包括以下步骤:在容器中加入极性溶液和待包封物质,然后加入脂质体,温和振荡5~10次,混匀后室温放置10至30分钟,即得。
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