CN110759986B - 一种可逆自组装蛋白的高效制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可逆自组装蛋白的高效制备方法，利用发酵罐高效发酵表达这种可逆自组装蛋白，通过对发酵过程中发酵罐的关键工艺参数，如搅拌转速、空气通量及诱导表达时间等方面进行优化，得到一组较优的发酵工艺参数，可高效表达可逆自组装蛋白，即人源重链铁蛋白；所述可逆自组装蛋白具有良好的单分散性，可以形成可逆的自组装笼形结构，可以通过调控体系的pH参数实现其组装以及解聚成单亚基。本发明操作简单，条件可控性强，其最大优势在于不仅可以高效表达一种具有可逆自组装特性的蛋白质，并且价格相对低廉特别适合工业化的大批量生产。对于开发基于蛋白质自组装的纳米载药系统以及将铁蛋白作为新型营养补充剂的研发等工作具有重要意义。

Description

一种可逆自组装蛋白的高效制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白质制备技术领域，具体涉及一种可逆自组装蛋白的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的一种重大疾病，令患者担负巨大的身心和经济负担。传统治疗方法均采用杀死肿瘤细胞的原理，有着毒副作用大、易产生耐药性等缺陷，治疗效果极为有限，探索新的肿瘤治疗法实现肿瘤治疗的创新突破一直是科学界攻关并希望取得突破的重大难题。纳米材料尤其生物纳米颗粒具有很多独特的物化和生物特性，如良好的生物相容性、尺寸效应、表面效应、易修饰增添新功能等使其显示出超越传统分子材料的生物学效应和生物医学功能，其被认为是药物领域发展的潜力物质，纳米材料尤其生物纳米颗粒在肿瘤治疗上的应用是肿瘤治疗领域的一个重要创新点。由于纳米材料所具有的一系列优良特性使得纳米材料研究逐渐成为热点，尤其在生物和医药学领域，其中最引人注目的是纳米递药系统。纳米颗粒能够实现靶向输送、控制释放、保护和稳定被输送物质以及通过血脑屏障、不易被机体网状内皮细胞清除、有效避免脾滤过效应、通过增加渗透和滞留效应、增强靶组织累积等优势。目前，国内外已经开发并上市了许多纳米制剂，以提高药物的口服生物利用度、降低药物不良反应和提高治疗指数等。与此同时，纳米生物技术研究领域也面临许多未知和挑战，如纳米材料控制、修饰和毒性等。所以，全世界范围内均在努力寻找和开发可以作为潜在纳米包埋剂的物质。

目前，可以作为纳米包埋载药的物质主要是壳聚糖，脂质体，叶酸等一系列可以形成特定结构的物质。生物界有些蛋白质分子在不同体系中表现出不同的聚集和解离行为，形成一定大小的纳米颗粒，这种性质恰恰符合作为纳米载药物质的基本特性。其中具有可逆自组装活性的蛋白质，这逐渐成为国内外的研究热点。

铁蛋白(Ferritin，Fn)是一种广泛存在于生物体内具有储铁和调节铁平衡功能的蛋白，可作为吸收利用率极高的生物补铁源，因此具有良好的生物相容性和极高的生物安全性；在长期的生物进化过程中，铁蛋白始终具有保守的结构以维持其相同的功能，即由24个亚基组成432高度点对称的球形纳米笼状结构，内部空腔为水合氧化铁的磁性纳米颗粒，蛋白笼外径12nm，内径8nm，具有高度对称性和良好的热稳定性(>70℃)等优良特性；铁蛋白能够简单通过调节体系pH(<2或者>11)实现自我可逆解聚与重组装，为治疗药物的包封和纳米载药系统的建立提供了条件；不同的Fn受体大量存在于人体内的各种器官及屏障组织，如脾脏、肝脏等，使Fn-药物复合纳米颗粒的运送、靶向识别及胞内释放成为可能，因此这种具有可逆自组装特性的蛋白质(Fn)可以作为一种运载药物的纳米运送颗粒。大量分离纯化高纯度的铁蛋白是纳米载药系统及其他研究的前提和基础。

然而目前铁蛋白的开发中存在一定的瓶颈。第一个是铁蛋白的多数以多种亚基分子的混合形式存在，在自组装成纳米颗粒时往往存在分子自组装活性不均一，自组装亚基数量不同，颗粒大小不均一等缺陷。第二个是目前还没有成熟的关于这种具有可逆自组装蛋白的高效制备技术，严重限制了它的应用。研究人员多利用基因工程等方式获得特定的重组或改造基因，借原核表达体系表达目的基因对应的用于特定研究目的的蛋白质。目前，采用摇瓶的方式于恒温摇床上发酵培养含铁蛋白基因的工程菌株使其大量表达铁蛋白的方法已有报道，而且是一种被普遍采用的实验室制备方法，虽表达效率高但经纯化后获得的铁蛋白纯品量仍然有限。因此，探究发酵罐大批量发酵含铁蛋白基因的工程菌株培养液的较优培养参数及条件，并且有效控制或者减少包涵体的表达，大量表达具有活性的目的蛋白，从而得到一种可工业化大量表达纯化具有可逆自组装特性的铁蛋白的方法，具有重要的科学意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的是解决现有缺少在发酵罐中进行基因原核表达铁蛋白的较优工艺条件的问题，为解决现有的瓶颈问题，本专利思考采用原核表达系统表达外源目的基因，进而优化确定大量表达目的蛋白的工艺参数，然后采用多技术组合的方法分离纯化获得具有可逆自组装特性的铁蛋白纯品。即构建由24个人源铁蛋白H亚基组成的更稳定的均聚铁蛋白基因序列以表达获得更适合作为纳米包埋载体的生物大分子。本发明提供了一种利用发酵罐高效制备可逆自组装蛋白的方法。本发明对于开发新型营养补充剂和基于可逆自组装蛋白的纳米载药系统的研究及开发等研究工作具有重要意义。

为了达到上述目的，本发明提供一种可逆自组装蛋白的高效制备方法，包括步骤：

S1、构建可逆自组装蛋白rHuHF即人源重链铁蛋白rHuHF原核表达BL21-pET3a-rHuHF工程菌株，包括如下步骤：

S11、人源重链铁蛋白RNA提取：以人口腔内壁表皮细胞为原料，提取mRNA；

S12、人源重链铁蛋白rHuHF基因构建和扩增：以所述mRNA为模板，反转录成cDNA；以所述cDNA为模板，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4为引物，扩增rHuHF DNA；

S13、表达质粒pET3a的构建和扩增：使用Nde I、EcoR I分别对质粒pET3a和rHuHFDNA进行双酶切，使用T4 DNA Ligase将酶切后的pET3a和酶切后的rHuHF DNA片段相连接，得到重组质粒pET3a-rHuHF；将所述重组质粒pET3a-rHuHF热激转化到克隆菌株JM109中；

S14、原核表达系统BL21-pET3a-rHuHF的构建：将重组质粒pET3a-rHuHF提取并转化到工程菌株BL21(DE3)中，得工程菌株BL21-pET3a-rHuHF，制备成甘油菌保，-80℃储藏；

所述人源重链铁蛋白(rHuHF)的mRNA序列如SEQ ID NO.1所示，其中，本发明中所述可逆自组装蛋白(rHuHF)的基因指上述SEQ ID No.1所述的mRNA序列，或者在SEQ IDNo.1所示序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生产的突变或等位基因或衍生物，且这些序列是与SEQ ID No.1所示的序列具有编码相同功能蛋白的序列；

所述人源重链铁蛋白(rHuHF)(NP_002023.2)氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示，共183个氨基酸组成，分子量为504kDa；其中，本发明所述可逆自组装蛋白(rHuHF)的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或者在SEQ ID No.2所述氨基酸序列中经突变或者同义氨基酸取代后的序列，且这些序列与SEQ ID No.2所示的序列有相同的功能，即实现可逆自组装蛋白(rHuHF)的表达；

S2、培养种子液：取出-80℃保藏的基因工程菌株BL21-pET3a-rHuHF(含有可逆自组装蛋白rHuHF基因)甘油菌保，按3％～5％的接种体积接种于含有氨苄青霉素50μg/mLAMP的LB液体培养基中，置于36～37℃、150～250rpm震荡培养5～10h，得种子液；

S3、发酵罐灭菌：将装有LB液体培养基的发酵罐121℃灭菌15～30min，维持发酵罐内灭菌后LB培养基的温度为30～42℃；

S4、发酵罐培养及诱导表达：将步骤S2所述种子液按培养基体积的1‰～5‰接种于步骤S2所述灭菌后LB液体培养基中，并加入AMP使其终浓度为0.04～0.06mg/ml，搅拌转速150～250rpm、通气量0.8～1.6L/min，培养温度36～37℃，培养至菌液OD₆₀₀为0.6～1.0，向菌液中加入IPTG至终浓度为0.1～1mM，搅拌转速150～250rpm、通气量0.8～1.6L/min、温度36～37℃，培养8～10h，进行诱导表达，得发酵菌液A；

S5、提取粗蛋白：收集步骤S4所述发酵菌液A，8000～15000rpm、0～4℃离心2～10min，取菌体沉淀；将所述菌体沉淀加入其1～10倍重量、pH7.0～8.0、20～50mM Tris-HCl重悬得菌液B，用300～400W功率超声所述菌液B，破碎菌体，每超声2～3s停止3～5s，总时长15～20min(包括停止时间)，得菌体破碎液；所述菌体破碎液8000～10000rpm、0～4℃离心5～10min，取上清液A置于60～70℃热处理10～20min，8000～10000rpm、0～4℃离心5～10min，取上清液B；将所述上清液B加入60％饱和度的硫酸铵，0～4℃、240～480rpm搅拌20～40min、静置6～10h，8000～10000rpm、0～4℃离心5～10min，取沉淀；使用1～5倍沉淀重量的pH7～8、20～50mM Tris-HCl重悬所述沉淀，得溶液A；使用分子量3500Da的透析袋对所述溶液A进行透析，除去硫酸铵得rHuHF粗蛋白溶液A，使用0.22～0.45μm的水系滤膜过滤rHuHF粗蛋白溶液A，得rHuHF粗蛋白溶液B；

S6、分离纯化：将步骤S4所述rHuHF粗蛋白溶液B使用DEAE弱阴离子交换层析柱进行纯化；以pH8.0、50mM Tris-HCl为流动相溶液洗脱不与DEAE柱子吸附的杂蛋白，流动相流速1～2mL/min；用含1M NaCl的pH8.0、50mM Tris-HCl进行梯度洗脱吸附在DEAE柱子上的rHuHF蛋白，紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长为260nm和280nm；收集180mL时出现的洗脱峰(柱体积为24mL)，即为rHuHF蛋白峰溶液，获得电泳纯的rHuHF蛋白溶液；使用Superdex 200分子筛层析纯化所述电泳纯的rHuHF蛋白溶液，以pH8.0、50mM Tris-HCl为缓冲液平衡Superdex 200分子筛并洗脱，所述缓冲液流速0.2～1mL/min，紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长为260nm和280nm，分子筛层析分离了单体和多聚体rHuHF，收集保留体积约为41.18mL处的洗脱峰(柱体积为84mL)，获得单体rHuHF蛋白溶液，超滤浓缩脱盐，电泳鉴定及检验纯度，真空冷冻干燥，获得固体蛋白粉末即为可逆自组装蛋白rHuHF。

优选方式下，步骤S3所述LB液体培养基的体积为所述发酵罐体积的50％～70％。

优选方式下，步骤S5所述透析具体为：使用分子量3500Da的透析袋、以100倍体积、pH7～8、20～50mM Tris-HCl对所述溶液A进行透析，每6h换一次透析液，透析3次，除去硫酸铵得rHuHF粗蛋白溶液A。

优选方式下，步骤S5所述菌液B置于冰浴中进行超声，超声探头插入菌液B液面以下总高度1/3处。

优选方式下，步骤S6所述真空冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃预冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段时间进行抽真空，所述第二段至第七段的真空度在15～25Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃；所述超滤浓缩脱盐具体为：使用分子量10kDa的超滤离心管3000～5000rpm、5～10min超滤离心所述rHuHF溶液，向超滤离心管的内层套管中补入纯净水至离心前的体积；3000～5000rpm、超滤离心5～10min，向超滤离心管的内层套管中补入纯净水至离心前的体积；3000～5000rpm、超滤离心5～10min，得脱盐的rHuHF蛋白溶液；所述电泳鉴定及检验纯度是以BCA测定蛋白浓度为依据，电泳时以0.5mg/mL的rHuHF蛋白浓度上样10μL，待染色、脱色后检验条带位置及纯度。

S2所述种子液培养具体为：将步骤S1所述工程菌BL21-pET3a-rHuHF甘油菌保以4％的接种体积接种于含有0.05mg/ml AMP的LB液体培养基中，置于37℃，摇床转速200rpm，培养10h，获得种子液。

优选方式下，步骤S3所述发酵罐灭菌具体为：将装有3.5L LB液体培养基的5L发酵罐进行121℃高温灭菌30min，控制LB液体培养基温度维持37℃。

优选方式下，步骤S4所述发酵罐发酵及诱导表达具体为将步骤S2所述种子液以17.5mL的接种体积种入步骤S3所述发酵罐的LB液体培养液中，并加入AMP使其终浓度为0.05mg/ml，控制搅拌转速200rpm、空气通量1.6L/min、温度37℃进行发酵培养，发酵过程中每隔一小时取样检测菌液OD值及菌液pH变化，当培养到罐内菌液浓度OD₆₀₀值为1时，加入IPTG溶液至终浓度0.1mM，200rpm、通气量1.6L/min、温度37℃，继续培养9h，得发酵菌液A。

优选方式下，步骤S5所述提取粗蛋白具体为：收集步骤S4所述的发酵菌液A，以8000rpm 4℃条件离心10min，取菌体沉淀，将所述菌体沉淀用相等重量的、50mM pH7.5Tris-HCl重悬，得菌液B；将所述菌液B置于冰浴中进行超声细胞破碎，超声探头插入菌液B液面以下总高度1/3处，超声功率300W，每超声3s停4s，总时长15min，得菌体破碎液；将所述菌体破碎液以10000rpm 4℃条件离心10min，取上清液A，60℃水浴加热10min，以10000rpm4℃离心10min，取上清液B；向所述的上清液B中加60％饱和度的(NH₄)₂SO₄，于4℃、300rpm搅拌40min，然后4℃静置6h，以10000rpm 4℃离心10min，取沉淀；用所述沉淀相等重量的50mMpH7.5 Tris-HCl重悬所述沉淀，得溶液A；采用截留分子量3500Da的透析袋，以100倍所述溶液A体积的50mM pH7.5 Tris-HCl为缓冲液对溶液A进行透析，每6h换一次缓冲液，重复3次，得rHuHF粗蛋白溶液A，使用一次性注射器外接0.45μm滤膜过滤所述rHuHF粗蛋白溶液A，得rHuHF粗蛋白溶液B。

优选方式下，步骤S6所述分离纯化具体为：将步骤S5所述rHuHF粗蛋白溶液B进行DEAE弱阴离子交换层析-分子筛层析，柱体积为24mL，以50mM pH8.0 Tris-HCl为流动相A溶液洗脱不与柱子吸附的杂蛋白，流动相流速2mL/min，以含1M NaCl的50mM pH 8.0Tris-HCl的流动相B进行梯度洗脱吸附在DEAE柱子上的蛋白，上样后紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长280nm，收集180mL时出现的洗脱峰，即为rHuHF蛋白峰溶液；将所述电泳纯rHuHF溶液进行Superdex 200分子筛层析，所用柱子体积为84mL，以50mM、pH8.0Tris-HCl为缓冲液平衡分子筛并洗脱，缓冲液流速1mL/min，紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长为260nm和280nm，收集保留体积约为41.18mL处的洗脱峰，为单体rHuHF蛋白溶液；将所述单体rHuHF蛋白溶液采用截留分子量10kDa的超滤离心管4000rpm、10min进行超滤，向超滤管内层套管补入纯净水至离心前的体积；4000rpm超滤离心10min；向超滤管内层套管再次补入纯净水至离心前的体积；4000rpm、超滤离心10min得到脱盐rHuHF溶液；于真空冷冻干燥机中冻干得到黄色rHuHF固体絮状粉末；所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥2小时，第六段：20℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时，在第二段时间进行抽真空，所述第二阶段至第七阶段的真空度在20Pa，真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。

本发明表达得到的可逆自组装蛋白的应用是开发铁蛋白作为新型营养补充剂和将具有可逆自组装活性的蛋白质发展为理想的药物运载生物载体的纳米载药系统等。本发明所述的采用发酵罐高效制备可逆自组装蛋白的方法，通过将活化的含rHuHF基因的大肠杆菌工程菌株接种于发酵罐进行大批量发酵表达及条件优化，依次采用粗提纯和过柱进一步分离纯化并鉴定的操作步骤最终探究出发酵罐发酵rHuHF的较优工艺条件，获得了较高量的rHuHF。

与现有技术相比，本发明利用发酵罐方式高效制备可逆自组装蛋白的方法包含以下有益效果：

1、本发明中利用发酵罐高效发酵表达rHuHF，其中发酵罐内搅拌转速、空气通量及诱导表达时间三个因素为影响rHuHF表达量的较为关键参数，通过对发酵过程中上述三项参数的优化，得到一组较优的发酵工艺参数，可高效表达rHuHF，发酵罐内搅拌转速为200rpm，空气通量为1.6L/min，加入诱导剂后诱导表达时间为9h，发酵罐内培养体系始终维持37℃。经过弱阴离子交换层析-分子筛层析后收集rHuHF约占上柱纯化前的96％(w/w)，平均每升发酵液可得最高约290mg可逆自组装蛋白rHuHF，即步骤S6所述真空冻干获得的固体蛋白粉末rHuHF。采用摇床培养表达目的蛋白的平均得量约为190mg/mL，相比之下，发酵罐发酵表达目的蛋白的得率显著提高，具有较高的表达效率。所述可逆自组装蛋白具有良好的单分散性，可形成可逆的自组装笼形结构，可以通过调控体系的pH参数实现其组装以及解聚成单亚基。

2、由于发酵罐内的表达环境比摇床上锥形瓶内更加稳定，且条件可控性强，用发酵罐表达完成后菌株内目的蛋白形成的包涵体数量明显少于摇瓶表达产生的包涵体量，如图5和图6所示，且发酵表达所得单体目标蛋白粒径均一，如图12所示。图11所示单分散的完好可逆自组装笼形结构以及SDS、Native电泳显示其单亚基和完整结构的正确分子量证明其蛋白活性良好。

3、用大肠杆菌工程菌株表达系统来表达及纯化出一定量高纯度的rHuHF蛋白，如图9、10所示，操作简单，条件可控性强，其最大优势在于不仅可以高效表达蛋白质，并且价格相对低廉特别适合工业化的大批量生产。对于开发铁蛋白作为新型营养补充剂和铁蛋白纳米载药系统的研究及开发等工作具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例1发酵罐发酵过程中菌液的吸光值变化，其中图例1～9分别代表九次发酵过程得到的吸光值测定数据折线。

图2是本发明实施例1发酵罐发酵过程中菌液的pH值变化，其中图例1～9分别代表九次发酵过程得到的菌液pH值测定数据折线。

图3是本发明实施例1步骤S5所述rHuHF蛋白溶液B的SDS-PAGE图。图中的第1和第9泳道为Marker条带，自上至下分子量大小分别为250、150、100、75、50、37、25、20、15、10kDa，中间7条泳道均为实施例1步骤S5所述粗提rHuHF蛋白溶液B的条带，其中分子量20kDa附近最深的条带为rHuHF蛋白单亚基。

图4是本发明实施例1步骤S5所述rHuHF蛋白溶液B的Native-PAGE图。图中最左侧泳道为Marker条带，自上至下分子量大小分别为669、440、232、140、66kDa，其余7条泳道均为实施例1步骤S5所述粗提rHuHF蛋白溶液B的条带，其中分子量440kDa附近较深条带为rHuHF蛋白。

图5是本发明实施例1步骤S5提取粗蛋白过程中鉴定目标蛋白表达位置的SDS-PAGE图，图中第一泳道为Marker条带；第二泳道为未转入目的蛋白基因的大肠杆菌BL21(对照菌株)培养液条带；第三泳道为BL21-pET3a-rHuHF工程菌株培养液条带；第四泳道为对照菌株菌体条带；第五泳道为BL21-pET3a-rHuHF工程菌株菌体以50mM Tris-HCI(pH 7.5)悬浮，加入1％染色剂、2％巯基乙醇，再经煮沸处理5min，取离心上清液进行电泳上样后的条带(经过此步骤处理，如果有铁蛋白在电泳中显现，将是原本以不可溶的包涵体形式存在的铁蛋白)；第六泳道为对照菌株菌体破碎沉淀条带；第七泳道为BL21-pET3a-rHuHF工程菌株菌体破碎沉淀条带；第八泳道为对照菌株菌体破碎上清液条带；第九泳道为BL21-pET3a-rHuHF工程菌株菌体破碎上清液条带，其中分子量20.1kDa附近较深的条带为rHuHF蛋白单亚基，8个样品的总蛋白浓度为1mg/mL，上样量均为5μL。该图证明了发酵罐发酵表达的目标蛋白几乎全在菌体胞内可溶物部分。

图6是同本发明实施例1步骤S5过程一致的摇瓶法(差异为发酵罐搅拌转速200rpm和通气量1.6L/min转变为摇床上锥形瓶晃动速度200rpm)提取粗蛋白过程中的菌体破碎上清和菌体破碎不溶物电泳分析图。图中第一泳道为SDS-PAGE marker条带，第三泳道为菌体破碎上清液条带，第四泳道为菌体破碎不溶物以50mM Tris-HCI(pH 7.5)悬浮，加入1％染色剂、2％巯基乙醇，再经煮沸处理5min，取离心上清液进行电泳上样后的条带(经过此步骤处理，如果有铁蛋白在电泳中显现，将是原本以不可溶的包涵体形式存在的铁蛋白)；其中靠近分子量17kDa偏上位置的较深条带为目标蛋白条带。该图证明了摇瓶法表达的目标蛋白分布在菌体胞内可溶部分和菌体胞内不溶物部分。

图7是本发明实施例1步骤S6所述rHuHF粗蛋白溶液B进行DEAE弱阴离子交换层析图。

图8是本发明实施例1步骤S6所述电泳纯rHuHF溶液进行Superdex 200分子筛层析图。

图9是本发明实施例1步骤S6中DEAE弱阴离子交换层析后所得脱盐rHuHF溶液的SDS-PAGE图，图中第一泳道为SDS-PAGE的marker条带，2～7泳道分别为不同次进样收集获得的目标蛋白液条带，其中分子量20kDa附近最深的条带为rHuHF蛋白单亚基。该图证明了纯化出的目标蛋白达到了电泳纯度。

图10是本发明实施例1步骤S6中DEAE弱阴离子交换层析后所得脱盐rHuHF溶液的Native-PAGE图，图中第一泳道为Native-PAGE的marker条带，2～10泳道分别为不同次进样收集获得的目标蛋白液条带，其中分子量440kDa附近较深条带为rHuHF蛋白，另外分子量更大的条带为其多聚体。该图证明了纯化出的目标蛋白纯度达到了电泳纯度。

图11是本发明实施例1表达所得单体rHuHF蛋白(即该可逆自组装蛋白)的透射电子显微镜(TEM)负染图。

图12是本发明实施例1表达所得单体rHuHF蛋白(即该可逆自组装蛋白)的动态光散射(DLS)拟合粒径图。图中经拟合得出的目标蛋白粒径约为11.23nm，且粒径较均一，与报道的铁蛋白外径12nm基本相符合。

图13是本发明实施例1表达所得单体rHuHF蛋白(即该可逆自组装蛋白)在所在溶液pH为2时的动态光散射(DLS)拟合粒径图。图中经拟合得出的目标蛋白解离亚基水动力半径约为2.73nm，粒径较均一，说明大分子rHuHF蛋白纳米笼已经解离。

具体实施方式

本发明涉及一种可逆自组装蛋白的制备方法，具体涉及以含人源重链铁蛋白基因质粒的工程菌株于发酵罐内高效表达获得可逆自组装蛋白的方法及应用。

具体实施方式一：本实施方式采用发酵罐高效制备可逆自组装蛋白的方法按以下步骤实现：

一、人源重链铁蛋白原核表达系统(工程菌株)BL21-pET3a-rHuHF的构建方法，包括如下步骤：

(1)、重组克隆载体pET3a-rHuHF的构建及扩增，包括步骤：

以富含人源重链铁蛋白的组织或器官或发酵收集含有人源重链铁蛋白基因的工程菌株作为提取可逆自组装蛋白的原料，人源重链铁蛋白(rHuHF)的制备参考Masuda(2001)的方法进行。根据GenBank数据库中公布的rHuHF(NM_002032.3)mRNA序列设计引物，并以上述制得人源重链铁蛋白(rHuHF)为模板进行常规PCR扩增rHuHF基因，采用分子生物学原理和基因工程手段将PCR扩增的rHuHF基因产物与克隆载体pET3a相连接，得到重组克隆载体pET3a-rHuHF。将重组质粒pET3a-rHuHF热激转化到克隆菌株JM109中，经有氨苄青霉素的琼脂平板筛选后进行菌液PCR验证，进行琼脂糖凝胶水平电泳验证扩增结果，判断重组质粒构建成功，将含有构建成功的重组质粒的菌液进行测序，测序结果与NCBI网站GenBank比对。进行单酶切和双酶切验证重组质粒成功构建，并进行琼脂糖凝胶电泳验证。

(2)、原核表达系统BL21-pET3a-rHuHF的构建，包括步骤：

将重组质粒pET3a-rHuHF提取并转化到工程菌株BL21(DE3)中，摇菌培养并做电泳条带验证，得到转化成功的工程菌株BL21-pET3a-rHuHF，将其与甘油混合进行菌保，-80℃储藏。

所述人源重链铁蛋白(rHuHF)的mRNA序列如SEQ ID NO.1所示，其中，本发明中所述人源重链铁蛋白(rHuHF)的基因指上述SEQ ID No.1所述的mRNA序列，或者在SEQ IDNo.1所示序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生产的突变或等位基因或衍生物，且这些序列是与SEQ ID No.1所示的序列具有编码相同功能蛋白的序列；

所述人源重链铁蛋白(rHuHF)(NP_002023.2)氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示，共183个氨基酸组成，分子量为504kDa；其中，本发明所述可逆自组装蛋白(rHuHF)的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或者在SEQ ID No.2所述氨基酸序列中经突变或者同义氨基酸取代后的序列，且这些序列与SEQ ID No.2所示的序列有相同的功能，即实现可逆自组装蛋白(rHuHF)的表达；

二、配制足够的LB培养基用于大肠杆菌工程菌株的生长繁殖，配制适量100～300mg/mL的氨苄青霉素青霉素钠溶液(AMP)、链霉素等抑菌剂用于抑制培养基中杂菌的生长(工程菌株中含rHuHF基因的质粒上存在抗AMP基因)，配制适量0.05～1M浓度范围内的异丙基硫代半乳糖苷溶液(IPTG)、乳糖溶液等诱导剂用于诱导表达rHuHF，配制好的AMP溶液和IPTG溶液可分装冻存于-20～-30℃防止活性丧失，即用即取。

三、将-80℃保存的15％～25％的种子液在含有AMP的培养基中进行活化培养，将装有3.5L培养基的发酵罐进行121℃高温灭菌15～30min，调节并维持罐内培养基温度30～42℃。

四、将活化好的菌液以1‰～5‰的量接入发酵罐内，同时在培养基体系中加入AMP溶液使其达工作浓度50μg/mL，控制搅拌转速150～250rpm，控制空气通量0.8～1.6L/min，发酵罐内温度维持在37℃左右，培养至菌液浓度达到OD值0.6～1.0，加入IPTG溶液至其在培养体系中的浓度为0.1～1.0mM，诱导工程菌株表达目标rHuHF。

五、收集到的菌液离心分离菌液菌体，将菌体进行细胞破碎，超声细胞破碎条件为以300～400W功率超声2～3s、停3～5s、循环15～20min。离心得到菌体上清进行60～70℃热处理10～20min沉淀非耐热蛋白，在分离得到的上清液中加入60％硫酸铵沉淀rHuHF，8000～10000rpm离心5～10min分离沉淀并用20～50mM Tris-HCl(pH 7～8)的缓冲液重悬rHuHF，透析去除硫酸铵后得粗蛋白溶液，使用0.22～0.45μm的水系滤膜过滤rHuHF粗样品。

六、粗蛋白溶液过滤膜后依次进行弱阴离子交换层析和分子筛层析作进一步分离纯化。弱阴离子交换层析以50mM Tris-HCl(pH 8.0)为流动相溶液洗脱不与柱子吸附的杂蛋白，流动相流速1～2mL/min，以1～30mL的样品体积上样后用含1M NaCl的50mM Tris-HCl(pH 8.0)进行梯度洗脱吸附在DEAE柱子上的蛋白，紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长为260nm和280nm。收集弱阴离子交换层析后的目标rHuHF峰溶液即获得电泳纯的rHuHF，分子筛层析分离了单体和多聚体rHuHF，收集的rHuHF溶液浓缩，脱盐，电泳鉴定及检验纯度，真空冻干24～72h获得黄色固体蛋白粉末。

其中步骤六所述的浓缩及脱盐采用的是截留分子量10kDa的超滤，离心后以纯水补足体积，超滤3次脱盐。

其中步骤六所述的电泳鉴定及检验纯度是以BCA测定蛋白浓度为依据，电泳时以0.5mg/mL的样品浓度上样10μL，待染色、脱色后检验条带位置及纯度。

本实施方式通过调节发酵罐内搅拌转速、发酵罐空气通量及诱导表达时间三个主要因素使较短时间内工程菌株表达的铁蛋白量尽可能多：

1、通过采用合适的发酵温度(37℃)、调节培养液搅拌转速(150～250rpm)、控制合理的空气通量(0.8～1.6L/min)等工艺参数控制发酵过程；

2、发酵过程中每隔1h检测菌液浓度及体系pH变化情况观察工程菌株生长状况，绘制不同发酵参数下每批发酵的菌株生长曲线，对比得到适合菌体快速生长及表达蛋白的最佳工艺条件。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二所述的工程菌株为含可逆自组装蛋白的表达菌株。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤二所述的异丙基硫代半乳糖苷溶液(IPTG)可进行分装冻存、即用即取或者现用现配，使用时其存在体系内浓度范围为0.1～1.0mM。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤三所述的发酵罐内培养基体积尽量保持在罐总体积的三分之二及以下，留有足够的空间以防止气泡接触发酵罐顶部增加染菌几率，还可以添加合适的消泡剂防止发酵过程中产气泡过多。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤三所述的发酵罐应在保持清洁的情况下装入现配的未灭菌LB培养基，发酵罐灭菌完成时应立即保持内部密封性防止污染杂菌。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤四所述的活化菌液接入量为1‰～5‰，搅拌转速为150～250rpm，空气通量为0.8～1.6L/min。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤五所述的诱导工程菌株表达rHuHF时间为8～10h。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤五所述的离心分离菌液菌体条件为8000rpm，4℃，5～10min。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤五所述的超声细胞破碎过程需要将样品进行冰浴，防止超声过程中产热升温使蛋白变性，超声条件为超声3s，停4s，循环15min，超声功率为300～400W，超声探头插入液面以下总高度三分之一处。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤五所述的热处理温度为60～70℃，时间为10～20min。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是步骤五所述加入硫酸铵沉淀蛋白的浓度为60％左右(0～4℃条件下)。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是步骤五所述的透析过程采用透析袋的截留分子量是3500Da，使用前需用配制的煮液煮沸清洗，透析缓冲液为100倍体积的50mM Tris-HCl(pH 7～8)，每6h换一次透析液，透析3次，透析袋避免直接与手接触。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是步骤六所述的弱阴离子交换层析采用的是DEAE交换柱，流动相为50mM Tris-HCl(pH 8.0)，流速为2mL/min，用含1M NaCl的50mM Tris-HCl(pH 8.0)进行梯度洗脱。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是步骤五所述的分子筛层析填料采用Superdex 200，缓冲液为50mM Tris-HCl(pH 8.0)，流速为0.2～1.0mL/min。

以质量分数1％胰蛋白胨、1％氯化钠、0.5％酵母浸粉加去离子水稀释配制LB培养基用作发酵罐和种子液的培养基，配制100mg/mL的氨苄青霉素青霉素钠溶液(AMP)用于抑制培养基中杂菌的生长(工程菌株BL21中含rHuHF基因的质粒上存在抗AMP基因)，配制0.1M的异丙基硫代半乳糖苷溶液(IPTG)。

实施例1：

S1、构建人源重链铁蛋白原核表达系统(工程菌株)BL21-pET3a-rHuHF

S11、人源重链铁蛋白mRNA提取：

用棉签刮取人口腔内壁表皮细胞，蘸入1.5mL离心管内1mL超纯水中，4℃下以10000×g离心10min，取沉淀作为mRNA提取原料，向沉淀中加入1mL Trizol，室温放置1min后，4℃下以12000g离心10min，取上清液至新的1.5mL离心管中，向上清液中加入0.2mL预冷的氯仿，漩涡混合器剧烈振动15s，室温放置10min后，4℃，12000g离心10min，取最上层清液于新的1.5mL离心管中。向最上层清液中加入0.5mL预冷的异丙醇，轻轻摇匀至出现乳白色絮凝，室温放置10min后，4℃下以12000g离心10min，弃去清液，留下片状沉淀。加入1mL的体积分数70％乙醇洗涤片状沉淀，4℃下以7500g离心10min，弃去清液。将洗涤操作进行2～3次重复，将片状沉淀自然晾干。向沉淀中加入100μL超纯水，用微量光吸收酶标仪测A260/A280和提取的mRNA浓度(即模板mRNA)。根据琼脂糖凝胶水平电泳仪操作方法电泳，进行28s，18s，5s条带验证。

S12、人源重链铁蛋白rHuHF基因构建和扩增：

S121、RNA反转录合成cDNA：采用试剂盒PrimeScript^TM1st Strand cDNASynthesis Kit(6110A)，宝日医Takara进行反转录过程。Oligo(dT)Primer取2μL，dNTPMixture取1μL，模板mRNA取2μL(所取绝对量为1μg)，用ddH₂O补全10μL后混匀，65℃保温5min后冰上迅速冷却。根据NCBI网站查看目的基因序列(NM 002032.3)，设计引物序列(F：SEQ ID NO.3；R:SEQ ID NO.4)，进行PCR扩增，扩增体系中除模板外均来源于PCR试剂盒：宝日医公司Takara LA

PCR试剂盒(RR002A)，琼脂糖凝胶水平电泳验证扩增结果。

引物名称	SEQ ID	序列
			rHuHF-F	3	catatgacgaccgcgtccacctcg
rHuHF-R	4	gaattcttagctttcattatcactgtc

PCR扩增反应体系：

体系	体积/μL
		La Taq Buffer，10×	2
模板RNA	1
		dNTP	2
引物rHuHF-F	1
		引物rHuHF-R	1
La Taq酶	0.2
		ddH<sub>2</sub>O	12.8
总体积	20

反应条件：BIO-RAD PCR仪中，95℃预变性10min后进入循环，95℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸1min，此循环进行35次，最后72℃延伸10min。

S122、DNA胶回收：按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行DNA胶回收，用微量光吸收酶标仪测胶回收产物浓度。

S123、目的基因连接pMD18-T载体：按照宝生物pMD18-T载体PCR产物快速连接试剂盒说明书操作，得重组质粒pMD18-rHuHF。

S124、重组质粒热激转化到大肠杆菌JM109：取10μL步骤S123所述重组质粒，加入到100μL的大肠杆菌JM109感受态细胞中，冰浴30min，42℃加热45s，再冰浴1min，加入890μLLB液体培养基，37℃振荡培养1h，在含有氨苄青霉素(工作浓度50μg/mL)的LB琼脂平板上涂100μL菌液37℃培养12～14h；

S125、菌液PCR验证：挑单菌落到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～14h，得菌液；进行PCR验证条带大小，扩增体系中除模板外均来源于PCR试剂盒：宝日医公司Takara LA

PCR试剂盒(RR002A)，琼脂糖凝胶水平电泳验证扩增结果，判断重组质粒pMD18-rHuHF是否构建成功，采用通用引物序列如下(M13-47：SEQ ID NO.5；RV-M：SEQ ID NO.6)，将正确条带对应的菌液与40％甘油按体积比1：1混合于-80℃冻存。

引物名称	SEQ ID	序列
			M13-47	5	agggttttcccagtcacg
RV-M	6	gagcggataacaatttcacac

PCR反应体系：

体系	体积/μL
		Taq Buffer，10×	2
菌液模板	1
		dNTP	2
引物M13-47	1
		引物RV-M	1
Taq酶	0.2
		ddH<sub>2</sub>O	12.8
总体积	20

反应条件：BIO-RAD PCR仪中，95℃预变性10min后进入循环，95℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸1min，此循环进行35次，最后72℃延伸10min。

S126、测序：将含有构建成功的重组质粒的菌液送去测序。测序结果与NCBI网站GenBank比对。(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

S13、表达质粒pET3a的构建和扩增：

S131、扩大培养质粒pET3a：将质粒pET3a转化到大肠杆菌JM109中，涂平板后挑单菌落摇菌培养。

S132、提质粒pET3a：实验时按照质粒小提试剂盒的说明书步骤操作。

S133、对质粒pET3a和目的基因rHuHF进行双酶切，按普通DNA产物纯化试剂盒说明书操作纯化双酶切产物，用微量光吸收酶标仪测胶回收产物浓度。

酶切体系如下：

酶切条件：37℃20min，80℃5min。

其中，酶切体系中的“质粒载体”为步骤S132所述表达质粒pET3a，所取绝对量为500ng；“目的基因rHuHF”为步骤S122所述胶回收产物，所取绝对量为500ng。

S134、用宝生物T4 Ligation试剂盒连接载体质粒pET3a和目的基因rHuHF，得重组质粒pET3a-rHuHF；以热激转化法将重组质粒pET3a-rHuHF转化到大肠杆菌JM109中，在有氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃恒温培养12～14h，挑单菌落37℃，使用LB液体培养基、37℃摇菌培养12～14h；取菌液PCR扩增验证条带大小，采用通用引物序列如下(T7：SEQ IDNO.7；T7-ter：SEQ ID NO.8)，扩增体系中除模板外均来源于PCR试剂盒：宝日医公司TakaraLA

PCR试剂盒(RR002A)，琼脂糖凝胶水平电泳验证扩增结果，进行基因测序并比对结果并进行单酶切和双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳条带验证。

连接体系如下：

体系	体积/μL
		pET3a载体片段	3
目的基因rHuHF片段	1
		T4 DNA Ligase	1
Ligation Buffer，10×	2
		ddH<sub>2</sub>O	13
总体积	20

连接条件：16℃连接过夜。

引物名称	SEQ ID	序列
			T7-ter	7	taatacgactcactataggg
T7	8	tgctagttattgctcagggg

PCR验证体系和反应条件如下：

体系	体积/μL
		ex PCR Buffer	2
菌液模板	1
		dNTP	2
引物T7-ter	1
		引物T7	1
ex Taq酶	0.2
		ddH<sub>2</sub>O	12.8
总体积	20

反应条件：95℃预变性10min后进入循环，95℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min,以上循环进行35次，最后72℃延伸10min。

其中，菌液模板为步骤S134所述挑取琼脂平板单菌落摇菌培养所得菌液。

单酶切和双酶切验证体系及反应条件如下：

体系	体积/μL
		模板pET3a-rHuHF	1
Nde l	1
		Buffer	2
ddH<sub>2</sub>O	16
		总体积	20

反应条件：37℃20min，80℃5min。

体系	体积/μL
		模板pET3a-rHuHF	1
Nde l	1
		EcoR I	1
Buffer	2
		ddH<sub>2</sub>O	15
总体积	20

反应条件：37℃20min，80℃5min。

S14、BL21-pET3a-rHuHF原核表达体系的构建：

提取重组质粒pET3a-rHuHF，将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中，在有氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃恒温培养筛选阳性菌株，传代培养两代，直至菌株生长稳定，PCR验证构建成功，即为BL21-pET3a-rHuHF工程菌；使用LB培养基37℃、摇菌培养24h，制备成甘油菌保，-80℃储藏准备后续发酵培养及诱导表达。

S2、种子液培养：将工程菌BL21-pET3a-rHuHF甘油菌保以4％的接种体积接种于含有0.05mg/ml AMP的LB液体培养基中，置于37℃，摇床转速200rpm，培养10h，获得种子液。

S3、发酵罐灭菌：将装有3.5L LB液体培养基的5L发酵罐进行121℃高温灭菌30min，灭菌完成后连接好发酵罐冷却水通路、空气通路及温感器并控制LB液体培养基温度维持37℃。

S4、发酵罐发酵及诱导表达：将步骤S2所述种子液以17.5mL的接种体积接种入步骤S3所述发酵罐的LB液体培养液中，并加入AMP使其终浓度为0.05mg/ml控制搅拌转速200rpm、空气通量1.6L/min、温度37℃进行发酵培养，发酵过程中每隔一小时取样检测菌液浓度(OD值)及菌液pH变化。当培养到罐内菌液浓度接近OD₆₀₀值为1时，加入IPTG溶液至终浓度0.1mM，200rpm、通气量1.6L/min、温度37℃，继续培养并每小时取样检测菌液浓度及pH变化情况至9h结束，得发酵菌液A。

S5、提取粗蛋白：收集步骤S4所述的发酵菌液A，以8000rpm 4℃条件离心10min，取菌体沉淀，将所述菌体沉淀用相等重量的、50mM Tris-HCl(pH 7.5)重悬，得菌液B。所得菌液B置于冰浴中进行超声细胞破碎，超声探头插入菌液B液面以下总高度1/3处，超声功率300W，每超声3s停4s总时长15min，得菌体破碎液；将所述菌体破碎液以10000rpm 4℃条件离心10min，取上清液A进行60℃水浴加热10min沉淀非耐热杂蛋白，以10000rpm 4℃条件离心10min分离rHuHF粗上清液与杂蛋白沉淀，取上清液B；向所述的上清液B中加60％饱和度的(NH₄)₂SO₄，于4℃、300rpm搅拌40min，然后4℃静置6h，以10000rpm 4℃条件离心10min，取沉淀；用相等的所述沉淀重量的50mM Tris-HCl(pH 7.5)重悬所述沉淀，得溶液A；采用截留分子量3500Da的透析袋，以100倍所述溶液A体积的50mM Tris-HCl(pH 7.5)为缓冲液对溶液A进行透析，每6h换一次缓冲液，重复3次，充分透析掉(NH₄)₂SO₄，得rHuHF粗蛋白溶液A，使用一次性注射器外接0.45μm滤膜过滤所述rHuHF粗蛋白溶液A，得rHuHF粗蛋白溶液B，暂存于4℃，采用SDS-PAGE和Native-PAGE电泳检验粗提情况及蛋白纯度。

S6、分离纯化：将步骤S5所述的rHuHF粗蛋白溶液B进行DEAE弱阴离子交换层析-分子筛层析；弱阴离子交换层析以50mM Tris-HCl(pH 8.0)为流动相A溶液洗脱不与柱子吸附的杂蛋白，流动相流速2mL/min，以含1M NaCl的50mM Tris-HCl(pH 8.0)的流动相B进行梯度洗脱吸附在DEAE柱子上的蛋白，上样后紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长280nm，rHuHF被洗脱时流动相B占总流动相比例为20％，在上样后的保留体积为180mL左右时出现峰高较高的目标rHuHF洗脱峰(柱体积为24mL)，整个过程经历10个柱体积，洗脱下的rHuHF约占上柱前总蛋白的96％，已经接近电泳纯；收集的rHuHF溶液进行SDS-PAGE验证为电泳纯rHuHF溶液，采用截留分子量10kDa的超滤离心管以4000rpm离心10min浓缩电泳纯rHuHF溶液以便分子筛上样；之后将所述电泳纯rHuHF溶液进行Superdex 200分子筛层析，所用柱子体积为84mL，以50mM Tris-HCl(pH 8.0)为缓冲液平衡分子筛并洗脱，缓冲液流速1mL/min，紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长为260nm和280nm，分离单体和多聚体rHuHF，取单体rHuHF蛋白溶液(图6中保留体积约为41.18mL处峰)；将所述单体rHuHF蛋白溶液采用截留分子量10kDa的超滤离心管浓缩并除盐，4000rpm、10min进行超滤，向超滤管内层套管补入纯净水至离心前的体积；4000rpm超滤离心10min，向超滤管内层套管补入纯净水至离心前的体积；4000rpm、超滤离心10min得到脱盐rHuHF溶液；电泳鉴定及检验纯度。于真空冷冻干燥机中冻干得到黄色rHuHF固体絮状粉末；所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥2小时，第六段：20℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时，在第二段时间进行抽真空，所述第二阶段至第七阶段的真空度在20Pa，真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。

本实施例每小时取样检测步骤S4所述菌液浓度及pH变化得到的菌生长情况曲线如图1和图2所示，其中图例1～9分别代表九次发酵过程的测定数据折线；步骤S5所述rHuHF粗蛋白溶液B SDS-PAGE和Native-PAGE电泳图如图3和图4所示；步骤S6对步骤S5所述的粗蛋白溶液B进行DEAE弱阴离子交换层析如图5所示，收集保留体积约180mL处峰为目标rHuHF洗脱峰；Superdex200分子筛层析如图6所示，收集保留体积约41mL处峰为目标rHuHF洗脱峰；步骤S6所述电泳鉴定及检验纯度是以BCA测定蛋白浓度为依据，电泳时以0.5mg/mL浓度的步骤S6所述的DEAE弱阴离子交换层析收集峰溶液上样10μL，待染色、脱色后检验条带位置及纯度。对步骤S6所述DEAE弱阴离子交换层析的目标rHuHF洗脱峰进行的SDS-PAGE检测，如图7所示；本实施例得到的可逆自组装蛋白为黄色rHuHF固体絮状粉末，纯度为电泳纯，如图8所示，单分散的完好可逆自组装笼形结构以及SDS、Native电泳显示其单亚基和完整结构的正确分子量证明其蛋白活性良好。

本发明为采用发酵罐大批量发酵表达rHuHF及其他重组蛋白提供了技术参考，为开发铁蛋白作为新型营养补充剂和铁蛋白纳米载药系统的研究及开发等工作奠定了一定的基础。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，包括步骤：

S1、构建可逆自组装蛋白rHuHF原核表达BL21-pET3a-rHuHF工程菌株，包括如下步骤：

其中所述可逆自组装蛋白rHuHF为人源重链铁蛋白rHuHF；所述可逆自组装蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述可逆自组装蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示，共183个氨基酸组成，分子量为504kDa；

S11、人源重链铁蛋白RNA提取：以人口腔内壁表皮细胞为原料，提取mRNA；

S12、人源重链铁蛋白rHuHF基因构建和扩增：以步骤S11所述mRNA为模板，反转录成cDNA；以所述cDNA为模板，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所述序列为引物，扩增rHuHF DNA；

S13、表达质粒pET3a的构建和扩增：使用Nde I、EcoR I分别对质粒pET3a和rHuHF DNA进行双酶切，使用T4 DNA Ligase将酶切后的pET3a和酶切后的rHuHF DNA片段相连接，得到重组质粒pET3a-rHuHF；将所述重组质粒pET3a-rHuHF热激转化到克隆菌株JM109中；

S14、原核表达系统BL21-pET3a-rHuHF的构建：提取所述重组质粒pET3a-rHuHF，转化到工程菌株BL21(DE3)中，得工程菌株BL21-pET3a-rHuHF，制备成工程菌株BL21-pET3a-rHuHF甘油菌保；

S2、培养种子液：将基因工程菌株BL21-pET3a-rHuHF甘油菌保按3％～5％的接种体积接种于含有氨苄青霉素50μg/mL的LB液体培养基中，36～37℃、150～250rpm震荡培养5～10h，得种子液；

S3、发酵罐灭菌：将装有LB液体培养基的发酵罐121℃灭菌15～30min，维持发酵罐内灭菌后LB培养基的温度为30～42℃；

S4、发酵罐培养及诱导表达：将步骤S2所述种子液按培养基体积的1‰～5‰接种于步骤S3所述灭菌后LB液体培养基中，并加入AMP使其终浓度为0.04～0.06mg/ml，搅拌转速150～250rpm、通气量0.8～1.6L/min，培养温度36～37℃，培养至菌液OD₆₀₀为0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为0.1～1mM，搅拌转速150～250rpm、通气量0.8～1.6L/min、温度36～37℃，培养8～10h，得发酵菌液A；

S5、提取粗蛋白：收集步骤S4所述发酵菌液A，8000～15000rpm、0～4℃离心2～10min，取菌体沉淀；将所述菌体沉淀加入其1～10倍重量、pH7.0～8.0、20～50mM Tris-HCl重悬得菌液B，用300～400W功率超声所述菌液B，每超声2～3s停止3～5s，总时长15～20min，得菌体破碎液；将所述菌体破碎液8000～10000rpm、0～4℃离心5～10min，取上清液A，置于60～70℃热处理10～20min，8000～10000rpm、0～4℃离心5～10min，取上清液B；将所述上清液B加入60％饱和度的硫酸铵，0～4℃、240～480rpm搅拌20～40min、静置6～10h，8000～10000rpm、0～4℃离心5～10min，取沉淀；使用1～5倍沉淀重量的pH7～8、20～50mM Tris-HCl重悬所述沉淀，得溶液A；使用分子量3500Da的透析袋对所述溶液A进行透析，得rHuHF粗蛋白溶液A；使用0.22～0.45μm的水系滤膜过滤rHuHF粗蛋白溶液A，得rHuHF粗蛋白溶液B；

S6、分离纯化：将步骤S5所述rHuHF粗蛋白溶液B使用柱体积24mL的DEAE弱阴离子交换层析柱进行纯化；以pH8.0、50mM Tris-HCl为流动相溶液洗脱不与DEAE柱子吸附的杂蛋白，流动相流速1～2mL/min；用含1M NaCl的pH8.0、50mM Tris-HCl进行梯度洗脱吸附在DEAE柱子上的rHuHF蛋白，紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长为260nm和280nm；收集180mL时出现的洗脱峰，即为rHuHF蛋白峰溶液，获得电泳纯的rHuHF蛋白溶液；使用柱体积84mL的Superdex200分子筛层析纯化所述电泳纯的rHuHF蛋白溶液，以pH8.0、50mM Tris-HCl为缓冲液平衡Superdex 200分子筛并洗脱，所述缓冲液流速0.2～1mL/min，紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长为260nm和280nm，收集保留体积约为41.18mL处的洗脱峰，获得单体rHuHF蛋白溶液，超滤浓缩脱盐，真空冷冻干燥，获得固体蛋白粉末即为可逆自组装蛋白rHuHF。

2.根据权利要求1所述可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤S3所述LB液体培养基的体积为所述发酵罐体积的50％～70％。

3.根据权利要求1所述可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤S5所述菌液B置于冰浴中进行超声，超声探头插入菌液B液面以下总高度1/3处。

4.根据权利要求1所述可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤S5所述透析具体为：使用分子量3500Da的透析袋、以100倍体积、pH7～8、20～50mM Tris-HCl对所述溶液A进行透析，每6h换一次透析液，透析3次，除去硫酸铵得rHuHF粗蛋白溶液A。

5.根据权利要求1所述可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤S6所述真空冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃预冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段抽真空，所述第二段至第七段的真空度15～25Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。

6.根据权利要求1所述可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤S6所述超滤浓缩脱盐具体为：使用分子量10kDa的超滤离心管3000～5000rpm、5～10min超滤离心所述rHuHF溶液；向超滤离心管的内层套管中补入纯净水至离心前的体积，3000～5000rpm、超滤离心5～10min；再次向超滤离心管的内层套管中补入纯净水至离心前的体积；3000～5000rpm、超滤离心5～10min，得脱盐的rHuHF蛋白溶液。

7.根据权利要求1所述可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤S3所述发酵罐灭菌具体为：将装有3.5L LB液体培养基的5L发酵罐进行121℃高温灭菌30min，控制LB液体培养基温度维持37℃。

8.根据权利要求1所述可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤S4所述发酵罐发酵及诱导表达具体为将步骤S2所述种子液以17.5mL的接种体积接种入步骤S3所述发酵罐的LB液体培养液中，并加入AMP使其终浓度为0.05mg/ml，控制搅拌转速200rpm、空气通量1.6L/min、温度37℃进行发酵培养，发酵过程中每隔一小时取样检测菌液OD值及菌液pH变化，当培养到罐内菌液浓度OD₆₀₀值为1时，加入IPTG溶液至终浓度0.1mM，200rpm、通气量1.6L/min、温度37℃，继续培养9h，得发酵菌液A；其中，所述发酵罐为5L发酵罐，装有3.5LLB液体培养基。

9.根据权利要求1所述可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤S5所述提取粗蛋白具体为：收集步骤S4所述的发酵菌液A，以8000rpm 4℃条件离心10min，取菌体沉淀，将所述菌体沉淀用相等重量的、50mM pH7.5Tris-HCl重悬，得菌液B；将所述菌液B置于冰浴中进行超声细胞破碎，超声探头插入菌液B液面以下总高度1/3处，超声功率300W，每超声3s停4s，总时长15min，得菌体破碎液；将所述菌体破碎液以10000rpm 4℃条件离心10min，取上清液A，60℃水浴加热10min，以10000rpm 4℃离心10min，取上清液B；向所述的上清液B中加60％饱和度的(NH₄)₂SO₄，于4℃、300rpm搅拌40min，然后4℃静置6h，以10000rpm 4℃离心10min，取沉淀；用所述沉淀相等重量的50mM pH7.5 Tris-HCl重悬所述沉淀，得溶液A；采用截留分子量3500Da的透析袋，以100倍所述溶液A体积的50mM pH7.5 Tris-HCl为缓冲液对溶液A进行透析，每6h换一次缓冲液，重复3次，得rHuHF粗蛋白溶液A，使用一次性注射器外接0.45μm滤膜过滤所述rHuHF粗蛋白溶液A，得rHuHF粗蛋白溶液B。

10.根据权利要求1所述可逆自组装蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤S6所述分离纯化具体为：将步骤S5所述rHuHF粗蛋白溶液B进行DEAE弱阴离子交换层析-分子筛层析，柱体积为24mL，以50mM pH8.0 Tris-HCl为流动相A溶液洗脱不与柱子吸附的杂蛋白，流动相流速2mL/min，以含1M NaCl的50mM pH 8.0 Tris-HCl的流动相B进行梯度洗脱吸附在DEAE柱子上的蛋白，上样后紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长280nm，收集180mL时出现的洗脱峰，即为rHuHF蛋白峰溶液；将所述电泳纯rHuHF溶液进行Superdex 200分子筛层析，所用柱子体积为84mL，以50mM、pH8.0Tris-HCl为缓冲液平衡分子筛并洗脱，缓冲液流速1mL/min，紫外检测蛋白质洗脱峰，检测波长为260nm和280nm，收集保留体积约为41.18mL处的洗脱峰，为单体rHuHF蛋白溶液；将所述单体rHuHF蛋白溶液采用截留分子量10kDa的超滤离心管4000rpm、10min进行超滤，向超滤管内层套管补入纯净水至离心前的体积；4000rpm超滤离心10min；向超滤管内层套管再次补入纯净水至离心前的体积；4000rpm、超滤离心10min得到脱盐rHuHF溶液；于真空冷冻干燥机中冻干，得到固体粉末即为可逆自组装蛋白rHuHF；所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥2小时，第六段：20℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时，在第二段时间进行抽真空，所述第二阶段至第七阶段的真空度在20Pa，真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。

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