CN115998708A - 一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法 - Google Patents
一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法,属于基因工程、生物材料制备技术领域。本发明利用体系中pH 2.8~10.6范围内笼形二十四聚体蛋白的可逆解离和重组,实现对脂溶性或水溶性活性分子(如番茄红素、β‑胡萝卜素、阿霉素以及AIE材料等)的有效包埋,操作简单,条件可控性强,应用范围广。本发明为重组牡蛎铁蛋白及其他重组蛋白包埋活性分子提供了技术参考,为开发铁蛋白作为新型营养补充剂和铁蛋白纳米载药系统的研究等工作奠定了一定的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法,属于基因工程、生物材料制备技术领域。
背景技术
生物纳米技术的发展为改善人类健康和抗击疾病的威胁开辟了新途径,用于预防、诊断和治疗疾病的功能性生物纳米颗粒已被视为纳米材料和生物医药领域的一项重要创新。生物纳米颗粒由于来源于生物体,通常具有良好的物理化学特性、生物相容性、渗透效应和生物安全性,不会激活炎症或免疫反应,其部分活性基团易于进行改性和修饰以实现新功能或增强选择性,例如载药纳米颗粒在人体内的定向药物递送、缓慢释放与靶组织积累,而传统纳米粒子不仅在制备过程中需要大量的有机溶剂,而且很难表现出足够的生物相容性,因此生物纳米颗粒具有明显的开发优势与潜力。
理想的生物纳米递送载体需能靶向特定的细胞并携带高剂量的起效物质,还应表现出最佳的物化性质和生物相容性。其中,具有可逆自组装特性的天然笼形铁蛋白,作为生物纳米载体已广泛用于包载生物活性营养素或治疗药物。铁蛋白与其他递送载体相比具有明显优势,如粒径均一和组织渗透性、较强的耐热性和稳定性、简单pH值调控下的可逆自组装性、界面易修饰增强功能性、体内受体靶向性等。正是由于人铁蛋白受体在肿瘤细胞上过表达,铁蛋白常被用于包埋抗癌药物提供疾病诊断、治疗及预后方面的信息,比如铁蛋白载阿霉素对肿瘤细胞的靶向治疗以及穿过血脑屏障治疗脑胶质瘤等。由于目前用于营养素开发及药物提送体系研究的主要是重组人源铁蛋白,因此开发海洋生物中的铁蛋白对于丰富铁蛋白资源、寻找活性更好的铁蛋白类型以及探索铁蛋白新功能等方面具有特殊意义。
牡蛎源铁蛋白在稳定性等方面可能具备比人源铁蛋白更优越的特性,例如pH 2.0~2.8或10.6~11.0范围内可逆解离和重组过程中蛋白变性损失少,而以牡蛎源铁蛋白作为纳米递送载体包埋生物活性分子的方法在国内外还未见报道。
发明内容
本发明提供了一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法,通过采用体系中一定pH范围内笼形二十四聚体蛋白的可逆解离和重组,实现对脂溶性或水溶性活性分子的包埋,使活性分子的水溶性和稳定性得到显著提升,操作简单且应用性强。
本发明提供了一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法,是将牡蛎铁蛋白在pH<6或pH>8的溶液环境中与活性分子混合,再用酸碱调节剂将pH逐渐调节至6.8~7.5之间自组装;所述牡蛎铁蛋白与活性分子的摩尔比为1:(10~1000)。
在一种实施方式中,所述活性分子包括但不限于番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素或阿霉素。
在一种实施方式中,所述酸碱调节剂包括但不限于盐酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种。
在一种实施方式中,所述牡蛎铁蛋白是由重组微生物发酵获得。
在一种实施方式中,所述重组微生物是以大肠杆菌为宿主,表达SEQ ID NO.2所示的GF1蛋白。
在一种实施方式中,所述重组微生物是以大肠杆菌BL21为宿主,以pET21a为表达载体,表达SEQ ID NO.1所示的GF1基因。
在一种实施方式中,所述重组微生物发酵获得的牡蛎铁蛋白经过纯化。
在一种实施方式中,所述纯化是将GF1粗蛋白溶液通过DEAE弱阴离子交换层析-分子筛层析进行纯化。
在一种实施方式中,所述方法是将活性分子溶解于适当的溶剂中,与牡蛎铁蛋白溶液以活性分子:牡蛎铁蛋白为1:(100~1000)的摩尔比混合,在pH 7.0~7.5自组装20-30min。
在一种实施方式中,所述方法是将活性分子与牡蛎铁蛋白在pH≥10的环境中以1:(100~1000)的摩尔比混合,将混合溶液的pH由≥10调整至7.0~7.5。
在一种实施方式中,所述方法是将活性分子与牡蛎铁蛋白在pH≤2的环境中以1:(100~1000)的摩尔比混合,将混合溶液的pH由≤2调整至7.0~7.5。
在一种实施方式中,所述发酵是在37℃、180~200rpm培养一定时间,再于28℃用终浓度0.4mM IPTG诱导8h。
在一种实施方式中,所述活性分子包括但不限于番茄红素(Lycopene,简写为LYC)、β-胡萝卜素、虾青素、阿霉素或上述任一种的组合物。
本发明还要求保护应用所述方法制备获得的由GF1蛋白包埋活性分子的复合物。
有益效果:
本发明首先实现GF1蛋白将LYC分子包埋在其空腔内部,平均1个GF1蛋白笼可包埋约51个LYC分子,并能够使水体系下LYC的溶解性、稳定性和抗氧化性得到显著提升;其次,本发明所述的包埋方法操作快速简单,条件可控性强,应用范围广;为重组牡蛎铁蛋白及其他重组蛋白包埋活性分子提供了技术参考,为开发铁蛋白作为新型营养补充剂和铁蛋白纳米载药系统的研究等工作奠定了一定的基础。
附图说明
图1是本发明实施例2所述电泳纯GF1溶液的SDS-PAGE(a)和Native-PAGE(b)电泳鉴定结果。
图2是本发明实施例3所述GF1-LYC溶液相较GF1溶液的透射电镜结果及粒径分布统计结果。
图3是本发明实施例3所述GF1-LYC溶液相较GF1溶液的水动力半径拟合结果及强度相关函数。
图4是本发明实施例3所述GF1-LYC溶液相较LYC和GF1的紫外-可见全波长扫描结果。
图5是本发明实施例3所述GF1-LYC溶液相较游离LYC溶液和GF1的荧光图谱。
图6是本发明实施例4所述GF1-LYC溶液相较游离LYC溶液在37℃的降解动力学曲线。
图7是本发明实施例5所述GF1-LYC溶液相较游离LYC溶液的DPPH清除能力比较结果。
具体实施方式
本发明涉及一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法,具体涉及利用体系中一定pH范围内笼形二十四聚体蛋白的可逆解离和重组来实现对脂溶性或水溶性活性分子的高效包埋的方法及应用。
以下结合实施例对本发明进行说明,对未特别注明的工艺参数可参照常规技术进行。
实施例1表达牡蛎铁蛋白GF1的重组菌株的构建
(1)牡蛎铁蛋白GF1的基因构建和扩增
首先以牡蛎铁蛋白GF1序列(Genbank登录号NM_001305338.1)为模板,设计引物序列(GF1-F:atggccgaatcccaatgtcg;GF1-R:ttacgagtcgaggcggcgat),进行PCR扩增,扩增体系中除模板外均来源于PCR试剂盒:宝日医公司Takara LAPCR试剂盒(RR002A),琼脂糖凝胶水平电泳验证扩增结果。
表1PCR扩增反应体系
体系 | 体积/μL |
10×La Taq Buffer | 2 |
cDNA模板 | 1 |
dNTP | 2 |
引物GF1-F | 1 |
引物GF1-R | 1 |
La Taq酶 | 0.2 |
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 12.8 |
总体积 | 20 |
反应条件:BIO-RAD PCR仪中,95℃预变性10min后进入循环,95℃变性30s,52℃退火40s,72℃延伸1min,此循环进行35次,最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶水平电泳验证扩增结果。按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行DNA胶回收,用微量光吸收酶标仪测胶回收产物浓度。
(2)BL21-pET21a-GF1原核表达体系的构建
将步骤(1)扩增后的目的基因和pET21a载体相连接:按照宝生物pET21a载体PCR产物快速连接试剂盒说明书操作,通过BamH I和EcoR I对GF1DNA和pET21a质粒进行双酶切,用T4 DNA Ligase将pET21a和GF1DNA的片段相连接,得重组质粒pET21a-GF1。
将重组质粒pET21a-GF1热激转化到大肠杆菌JM109中,具体步骤为:取10μL重组质粒pET21a-GF1,加入到100μL的大肠杆菌JM109感受态细胞中,冰浴30min,42℃加热45s,再冰浴1min,加入890μL LB液体培养基,37℃振荡培养1h,在含有氨苄(AMP,工作浓度50μg/mL)的LB琼脂平板上涂布100μL菌液,于37℃培养12~14h。挑单菌落到含AMP的LB液体培养基中,于37℃振荡培养12~14h,收集菌液,提取质粒并通过PCR验证条带大小,扩增体系中除模板外均来源于PCR试剂盒:宝日医公司Takara LAPCR试剂盒(RR002A),琼脂糖凝胶水平电泳验证扩增结果,并测序验证重组质粒pET21a-GF1是否构建成功,将验证正确的重组质粒pET21a-GF1转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃培养得到重组菌株BL21-pET21a-GF1,并做电泳条带验证。以甘油菌保,-80℃冻存。
实施例2牡蛎铁蛋白GF1的表达和纯化
(1)牡蛎铁蛋白GF1的表达
将实施例1构建的重组菌BL21-pET21a-GF1接种于含AMP的LB液体培养基中,置于37℃,180~200rpm培养6~10h,获得OD为0.8~1的种子液。
将LB培养基进行121℃高温灭菌30min,灭菌完成后控制LB液体培养基温度维持37℃。将种子液以0.5%的接种体积接种入灭菌的含AMP(工作浓度50μg/mL)的LB液体培养液中,控制搅拌转速180~200rpm、温度37℃进行发酵培养,每隔1h取样检测菌液浓度(OD值)。当培养到菌液浓度接近OD600值为1时,加入IPTG溶液至终浓度0.4mM,于28℃诱导8h,得含GF1的工程菌液。
(2)牡蛎铁蛋白GF1的纯化
将表达完成的工程菌液以10000rpm 4℃条件离心15min,所得菌体沉淀用5倍体积的50mM Tris-HCl(pH 7.5)重悬,冰浴超声进行细胞破碎,超声探头插入液面以下总高度1/3处,超声功率300W,每超声3s,停5s,总时长15min,得菌体破碎液。将所述菌体破碎液以10000rpm 4℃条件离心15min,将上清液进行70℃水浴加热10min沉淀非耐热杂蛋白,以10000rpm(4℃)离心10min分离GF1上清液与杂蛋白沉淀。向所述的GF1上清液中加60%饱和度的(NH4)2SO4,于4℃下300rpm搅拌40min,然后4℃静置8h,以10000rpm(4℃)离心10min得GF1沉淀。用50mM Tris-HCl(pH 7.5)重悬所述GF1沉淀,转入截留分子量3500Da的透析袋进行透析,每6h更换缓冲液,重复3次,充分透析掉(NH4)2SO4,得GF1粗蛋白溶液,进行0.45μm滤膜过滤,暂存于4℃,采用SDS-PAGE和Native-PAGE电泳检验蛋白存在情况。
将所述过滤后的GF1粗蛋白溶液通过DEAE弱阴离子交换层析-分子筛层析进一步纯化得电泳纯的GF1溶液。弱阴离子交换层析以50mM Tris-HCl(pH 7.5~8.0)为流动相A洗脱不与柱子吸附的杂蛋白,流动相流速2mL/min,以含1M NaCl的50mM Tris-HCl的流动相B进行梯度洗脱吸附在柱上的GF1蛋白。在紫外波长280nm处检测蛋白洗脱峰,收集蛋白洗脱峰并采用截留分子量100kDa的超滤管浓缩除盐,以纯净水补充内管溶液体积,重复3次得到浓缩除盐的GF1溶液,以SDS-PAGE检验浓缩除盐的GF1蛋白。将浓缩除盐的GF1溶液进行Superdex 200分子筛层析,以50mM Tris-HCl(pH 7.5~8.0)为缓冲液平衡分子筛并洗脱,缓冲液流速1mL/min,紫外检测蛋白质洗脱峰,检测波长为260nm和280nm,分离单体和多聚体rHuHF,收集蛋白洗脱峰并采用截留分子量100kDa的超滤管浓缩除盐,以纯净水补充内管溶液体积,重复3次得到浓缩除盐的GF1溶液。SDS-PAGE和Native-PAGE电泳鉴定纯度得电泳纯GF1溶液。如图1所示,纯化的GF1其亚基分子量接近20kDa,GF1分子量在440kDa以上,约为480kDa。
实施例3牡蛎铁蛋白GF1纳米笼经可逆解离和重组包埋番茄红素分子
按如下步骤制备:
(1)准确称取一定量的番茄红素(LYC)纯品,溶解于DMSO中,终浓度为20mM,4℃避光备用。
(2)向4.95mL 2μM的电泳纯GF1溶液(50mM Tris-HCI buffer,pH 7.5)中缓慢加入2M NaOH至pH 10.6,搅拌30min。
(3)缓慢加入50μL LYC溶液(终浓度为200μM),使GF1:LYC的分子摩尔比为1:100,搅拌30min。
(4)以2M HCI调整溶液pH降至7.5,4℃避光陈化2h。
(5)将步骤(4)所得的溶液置于20kDa透析袋中,以含0.15M NaCI的Tris-HCI缓冲液(50mM,pH 7.5)4℃避光透析3次,每次6h,得到GF1-LYC溶液。
如图2所示,GF1为外径约10nm的笼形结构蛋白,蛋白笼充当着活性分子的保护屏障,同时活性分子与GF1内腔形成一定的相互作用,不仅稳定了活性分子,而且同游离态相比,其热稳定性和抗氧化性得到增强。通过包埋前后溶液的紫外-可见全波长扫描或复合物解离后对活性分子的HPLC检测对活性分子进行定量并计算GF1分子包埋率。通过计算得出,平均1个GF1蛋白笼包埋了约51个LYC分子,包埋率为54.51%。透射电镜结果和粒径统计结果显示,包埋后GF1-LYC的粒径比包埋前GF1的10nm粒径略大。
GF1-LYC溶液的水动力半径通过动态光散射仪扫描测得并拟合,如图3所示,表明GF1经过解离和重聚合的包埋过程后仍能恢复直径约10nm的笼形结构,结果与透射电镜显示的粒径相一致;步骤(5)构建的GF1-LYC溶液相较LYC和GF1的紫外-可见全波长扫描结果如图4所示,LYC的特征吸收峰存在于GF1-LYC吸收曲线,表明GF1-LYC构建成功;步骤(5)构建的GF1-LYC相较LYC和GF1的荧光图谱如图5所示,同浓度的GF1-LYC与GF1的荧光强度对比表明GF1-LYC构建成功。
实施例4 GF1-LYC复合物的稳定性验证
将实施例3构建的GF1-LYC复合物与游离LYC在37℃下水浴7h,每隔1h在OD380nm下检测体系中剩余LYC含量,GF1蛋白在OD380nm下几乎无吸收,结果如图6所示,拟合得到的热降解动力学一级反应模型如式(1)所示,回归系数(R2)分别为0.9558(对照组)和0.9983(GF1-LYC组),表明LYC降解余量与反应时间之间存在较好的相关性。其中,对照组的LYC含量在加热1小时内迅速下降到85.8%,而GF1-LYC组的含量为99.5%,这得益于耐热GF1的保护。同时,当降解速率在7h减慢时,GF1-LYC组的LYC含量基本稳定在原始水平的85%左右,而空白组的LYC含量仅为78%,说明GF1的包埋对LYC的热保护是有效的,结果表明GF1-LYC中LYC的降解速率比游离的LYC减慢。
根据y=a-b×ln(x+c),建立游离LYC和GF1-LYC的拟合公式;式中y表示剩余LYC浓度百分比(%),x表示各组处理时间(h)。
游离LYC组的拟合公式:
y=76.43537-4.243×ln x
GF1-LYC组的拟合公式:
y=87.57137-1.75768×ln(x-0.98493)
实施例5 GF1-LYC复合物的DPPH清除能力验证
研究表明,LYC的降解很大程度上归因于它的氧化。铁蛋白纳米笼除了作为外部氧化剂隔离的物理屏障外,其本身也具有一定的清除自由基和螯合过渡金属的作用,因其半胱氨酸残基或其他活性基团具有抗氧化剂的作用。此外,铁蛋白可能通过疏水作用和范德华力作用对LYC进行重组,这有利于LYC的稳定性。将实施例3构建的GF1-LYC与LYC分别按照如下方法验证DPPH清除能力:分别将每100μL 0.06mM的DPPH乙醇溶液添加到100μL GF1-LYC或LYC(等量)溶液中,在OD520nm每隔15min以酶标仪测定DPPH含量,以100μL的DPPH乙醇溶液为对照,样品均在避光条件反应,数值均为3次平均,以平均值±标准差(SD)表示。采用以下公式进行定量计算:
AB:空白对照的OD520nm;AE:样品的OD520nm。
LYC被GF1包埋后抗氧化活性的变化如图7所示,GF1-LYC组和游离LYC组在反应进行到60min时DPPH清除率有明显差异(P<0.05),当反应时间超过60min时,GF1-LYC组对DPPH的抑制作用显著增强,反应到90min时的清除率达到19.13%,远远超过对照组游离
LYC分子对DPPH的清除率(13.71%)。结果充分说明,由于壳状铁蛋白纳米笼的保护,包裹在GF1纳米笼中的LYC的抗氧化能力随时间的推移保持良好。
实施例7牡蛎铁蛋白GF1重组包埋番茄红素分子
具体实施方式同实施例3,区别在于,将步骤(2)的GF1溶液pH用NaOH缓慢调节pH至接近10,步骤(4)将pH调整至接近7.0。
结果显示,可制备获得具有笼形二十四聚体蛋白包埋番茄红素的复合物。
实施例8牡蛎铁蛋白GF1重组包埋番茄红素分子
具体实施方式同实施例3,区别在于,将步骤(2)的GF1溶液pH用HCl调整至接近3,步骤(4)用NaOH调整溶液pH至接近7.0。结果显示,可制备获得具有笼形二十四聚体蛋白包埋番茄红素的复合物。
实施例8牡蛎铁蛋白GF1重组包埋活性分子
(1)准确称取一定量的活性分子纯品,溶解于DMSO中,终浓度为2~200mM,4℃避光备用;所述活性分子包括但不限于β-胡萝卜素、虾青素或阿霉素;
(2)向4.95mL 2μM的电泳纯GF1溶液(50mM Tris-HCI buffer,pH 7.5)中缓慢加入2M NaOH至pH>8,或用2M HCI调整pH至<6,搅拌30min;
(3)缓慢加入50μL终浓度为2~200mΜ的活性分子溶液,使GF1:活性分子的分子摩尔比为1:(10~1000),搅拌30min;
(4)以酸碱调节剂调整溶液pH降至7.0~7.5,4℃避光陈化2h;
(5)将步骤(4)所得的溶液置于20kDa透析袋中,以含0.15M NaCI的Tris-HCI缓冲液(50mM,pH 7.5)4℃避光透析3次,每次6h,得到GF1-活性分子溶液。
结果显示,可制备获得具有笼形二十四聚体蛋白包埋活性分子的复合物。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法,其特征在于,将牡蛎铁蛋白在pH<6或pH>8的溶液环境中与活性分子混合,再用酸碱调节剂将pH逐渐调节至6.8~7.5之间使牡蛎铁蛋白与活性分子自组装;所述牡蛎铁蛋白与活性分子的摩尔比为1:(10~1000)。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述活性分子包括但不限于番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素或阿霉素。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述酸碱调节剂包括但不限于盐酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种。
4.根据权利要求1~3任一所述的方法,其特征在于,所述牡蛎铁蛋白是由重组微生物发酵获得。
5.根据权利要求1~4任一所述的方法,其特征在于,所述方法是将活性分子与牡蛎铁蛋白以1:(10~1000)的摩尔比混合,再将混合溶液的pH由9~10.5调整至7.0~7.5。
6.根据权利要求1~4任一所述的方法,其特征在于,所述方法是将活性分子与牡蛎铁蛋白以1:(10~1000)的摩尔比混合,再将混合溶液的pH由2~3调整至7.0~7.5。
7.根据权利要求1~6任一所述的方法,其特征在于,所述重组微生物发酵获得的牡蛎铁蛋白经过纯化。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述纯化是将牡蛎铁蛋白的粗蛋白溶液通过DEAE弱阴离子交换层析-分子筛层析进行纯化。
9.应用权利要求1~8任一所述方法制备获得的由牡蛎铁蛋白包埋活性分子的复合物。
10.应用权利要求1~8任一所述方法制备获得的由牡蛎铁蛋白包埋番茄红素的复合物。
Priority Applications (1)
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2022
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