CN111939273A - 一种以铁蛋白为载体肿瘤纳米探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种以铁蛋白为载体制备具有肿瘤靶向作用荧光探针的方法，所述铁蛋白载体包含人重链铁蛋白。将笼状结构的人重链铁蛋白解聚为单体状态；向解聚的人重链铁蛋白中加入具有荧光性质的香豆素‑6使其与铁蛋白结合；将结合有香豆素‑6的所述解聚人重链铁蛋白重新聚合为纳米颗粒。本发明所制备的纳米探针具有生物相容性好，可特异性地在过表达转铁蛋白受体1(TfR1)的肿瘤细胞表面富集，利用香豆素‑6的荧光特性为给药系统的体内示踪提供一种高效的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有靶向肿瘤细胞的荧光探针的制备方法，通过在铁蛋白内部装载荧光染料香豆素-6制备具有肿瘤靶向的荧光探针，用于肿瘤细胞或活体的肿瘤靶向荧光成像等检测。
背景技术
为了实现药物的高效利用和体内示踪，并且减少其对人体各个组织的副作用伤害，荧光标记法以追踪药物的吸收和运转情况已成为一种重要的方法。研究者们希望能够找到合适的载体和合适的控释方法，使其在特定时间、特定地点进行释放。不但要求载体有良好的靶向性，还要求其有良好的生物相容性，以及较大的载物量。以无机非金属纳米探针、金属纳米探针、高分子材料、脂质体、生物膜等作为载体的纳米给药系统，能够有效穿透脑屏障、网状内皮组织等，但这些载体靶向性差，为了提高载体的靶向性，最常见的方法是通过共价化学修饰，将靶向分子与载体骨架相结合，制备一种具有靶向的纳米药物给药系统。但化学修饰相对复杂，易灭活包载物和破坏纳米药物给药系统。包载物的释放方法则常常使用温度、磁场、光、pH、特定分子、受体、特异性蛋白等刺激信号使药物定向释放。
铁蛋白(ferritin)，普遍存在于生物体内的一种高效贮铁蛋白质，是蛋白质笼纳米载体中非常重要的一种，它是由24个亚基自组装形成的八面体高度对称的笼状空间结构，外径约12nm，内径约8nm。人重链铁蛋白(HFtn)作为理想的肿瘤治疗药物载体，其具有诸多天然优势，如水溶性和稳定性好，在人体中自然存在，尺寸均一，与肿瘤表面过表达的转铁蛋白受体(TfR1)特异性结合。TfR1在大部分恶性肿瘤中都高度表达，包括乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤等，因此HFtn具有广泛的肿瘤细胞识别能力。
香豆素-6(Coumarin-6，COU)常常被用做荧光染料。它是一种量子产率高、细胞穿透性好、性能比较稳定的脂溶性荧光染料，但由于香豆素-6的溶解性极差，几乎不溶于水，使其应用受到一定的局限。因此，将其包埋于可溶性的纳米载体是提高其应用范围的一条有效途径。
因此，以铁蛋白作为载体包裹香豆素-6所制备的荧光探针，不仅能在富含TfR1受体的肿瘤细胞表面富集，且能通过荧光信号检测靶向效果，应用于靶向给药的体内示踪。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种靶向肿瘤的纳米荧光探针的制备方法。为了实现药物的高效利用和体内示踪，以铁蛋白为载体，装载香豆素-6荧光染料，铁蛋白-香豆素-6(HFtn-COU)荧光探针能够富集在TfR1高表达的肿瘤细胞表面，用于纳米载药系统的体内示踪。
技术方案：为实现上述目的，本发明所述的以铁蛋白为载体装载香豆素-6的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：铁蛋白的获得；将香豆素-6装载于铁蛋白中；对装载后的铁蛋白与香豆素-6的混合溶液进行透析和浓缩。
其中，所述铁蛋白来源于大肠杆菌。
所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)铁蛋白的分离纯化方法为：将表达目的蛋白的大肠杆菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃恒温下、210r/min振荡培养，OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导剂诱导目的蛋白表达，将菌液8000r/min离心5min后收集菌体，将收集的菌体溶于裂解缓冲液进行重悬。将悬液以5s为间隔破碎15min后，8000r/min离心5min收集上清，将上清水浴热处理后再次离心，利用亲和层析法洗脱后得到粗样品铁蛋白，使用体积排阻色谱纯化得到铁蛋白溶液。
(2)香豆素-6的装载具体方法为：称取香豆素-6，按香豆素-6与无水乙醇的摩尔比1∶200超声溶解于无水乙醇溶液中。溶解的香豆素-6溶液与铁蛋白在4℃下混合搅拌5min，对混合后的溶液通过调节pH使铁蛋白纳米笼解聚/重组，完成香豆素-6的装载。
(3)透析和浓缩的具体方法为：将混合溶液在pH＝7.4的PBS中，置于4℃下透析5-12h，以除去未被包埋的香豆素-6。将透析后的溶液经5000r/min离心10min后去除变性蛋白，得到HFtn-COU纳米探针溶液。
优选的，在步骤(1)中所述IPTG诱导的过程，IPTG诱导剂加入菌液的终浓度为0.5mmol/L，将菌液在30℃，180r/min诱导培养6-8h。
优选的，在步骤(1)中所述上清与镍柱结合前还经过60℃水浴热处理10min，8000r/min离心30min，收集上清与镍柱结合。
优选的，在步骤(1)中所述洗脱过程依次利用2-7.5mM咪唑、3.5-11.5mM裂解缓冲液、210-274mM咪唑进行洗脱得到粗样品铁蛋白。优选的，依次利用5mM咪唑、10mM咪唑、250mM咪唑进行洗脱，可提高洗脱效率。
优选的，在步骤(2)中使香豆素与无水乙醇的摩尔比为1∶200。
优选的，在步骤(2)中所述调整pH的过程，可使用的HCl溶液将香豆素-6溶液与铁蛋白的混合溶液的pH值调整至2.0-2.6，在4℃下混合搅拌均匀使蛋铁蛋白解聚。将搅拌后的溶液使用的NaOH溶液将pH值调至7.2-8.1，在4℃下混合搅拌使解聚的铁蛋白重新组装成笼状结构。
优选的，在步骤(3)中所述透析时间为8-12h。
本发明所述的以铁蛋白为载体装载香豆素-6的纳米探针用作靶向转铁蛋白受体1高表达的肿瘤细胞的药物载体的应用。
本发明使用的铁蛋白是一种粒径小且均一，生物相容性好，且对肿瘤细胞表面TfR1受体有较好的靶向性。香豆素-6是一种荧光量子利用率高，性能比较稳定的脂溶性荧光染料。本发明将将具有荧光特性的香豆素-6分子装载在铁蛋白壳中，所制备的纳米探针具有生物相容性好，可以特异性地在转铁蛋白受体1(TfR1)的肿瘤细胞表面富集。
有益效果：本发明制备方法得到的HFtn-COU纳米颗粒的优点在于：
(1)本发明所制备的纳米粒能特异性靶向TfR1受体高表达的肿瘤细胞；
(2)本发明中香豆素-6(COU)的荧光特性可应用于靶向给药系统的体内示踪，为抗肿瘤药物提供了一种理想的荧光成像检测方法。
附图说明
图1为本发明的实施例2中铁蛋白装载香豆素-6前和后的溶液对比图；
图2为本发明的实施例3中HFtn-COU和COU与人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞A549孵育24小时后的荧光强度柱状图。
具体实施方式
下面对本发明的的具体实施方式进一步详细描述，但应理解，所给出的实施例只作为举例说明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明所述的HFtn-COU纳米探针是将具有荧光效应的香豆素-6装载于铁蛋白纳米笼中，得到HFtn-COU，其中HFtn为24个亚基组成的铁蛋白纳米笼；COU为香豆素-6。所选肿瘤细胞株人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人肺癌细胞A549均可大量表达TfR1受体，HFtn-COU可以特异性与其靶向结合。
实施例1：
将表达目的蛋白的大肠杆菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，37℃恒温、210r/min振荡培养，培养至OD600在0.6～0.8之间，向培养物加IPTG至终浓度0.5mM，培养物在30℃、180r/min继续诱导培养6-8h。将菌液8000r/min离心5min后收集菌体，将菌体溶于lysis buffer(50mM NaH2PO4，200mM NaCl，10mM咪唑，pH＝7.9)进行悬重。悬液以5s为间隔破碎15min后，8000r/min离心5min收集上清液，上清液在水浴锅中60℃进行热处理10min。将热处理过的粗蛋白以8000r/min离心30min收集上清，上清与镍柱结合6-12h，经过5mM、10mM、250mM咪唑洗脱后得到粗样品铁蛋白，使用FPLC纯化得到较为纯的HFtn。
实施例2：
按比例1∶200(摩尔比)称取香豆素-6超声溶解于无水乙醇溶液中。将溶解的香豆素-6溶液与铁蛋白在4℃下混合搅拌5min，使其充分混合。混合溶液使用6M的HCl溶液将蛋白溶液的pH值调整至2.5，在4℃下混合搅拌30min，使解聚的铁蛋白亚基与香豆素-6充分接触。混合完全的溶液使用6M的NaOH溶液将pH值调至7.2，在4℃混合搅拌2h，使解聚的铁蛋白重新组装成笼状结构。
将蛋白溶液使用pH＝7.4的PBS缓冲液在4℃透析8-12h，以除去未被包埋的香豆素-6。将透析过的溶液以5000r/min离心10min，以去除变性蛋白，便得到COU-HFtn纳米探针溶液。
本实施例得到的HFtn-COU纳米探针，其中香豆素-6与铁蛋白的含量比为1∶200(摩尔质量比)
实施例3：
HFtn-COU纳米颗粒的荧光强度分析
(1)将所需数量的癌细胞MDA-MB-231或A549用胰蛋白酶消化计数后以1×104个细胞每孔的浓度分别接种于24孔板，每孔100μL；在37℃、5％CO2培养箱中培养24h使细胞贴壁。
(2)将含0.5μg/mL的COU和HFtn-COU的培养基分别每孔加入100μL，每个需设3个孔的重复，所有溶液加入后继续在37℃、5％CO2培养箱中培养孵育24h。
(3)24h孵育完成后小心吸去孔中所有上清液，使用PBS缓冲液冲洗三次，洗去残留的培养基。使用胰蛋白酶将细胞消化，离心后得沉淀溶解于200μL DMSO溶液中超声破碎。
(4)使用酶标仪在激发波长456nm、发射波长504nm处检测各孔荧光强度，记录数据，并以药物名称为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制曲线，结果如图2所示。与游离的COU孵育的相比较，HFtn-COU孵育的荧光强度具有显著的提高。
结果显示使用HFtn装载COU明显提高了肿瘤细胞的荧光强度。
Claims (3)
1.本发明公开一种以铁蛋白为载体制备具有肿瘤靶向作用的荧光探针的方法，其中所述铁蛋白载体包含人重链铁蛋白，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将人重链铁蛋白解聚，将香豆素-6加入至解聚的铁蛋白中，将结合有香豆素-6的所述解聚人重链铁蛋白重新聚合为纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的以铁蛋白为载体装载香豆素-6的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)铁蛋白的获得：将含有人重链铁蛋白基因(HFtn)的表达质粒pET20b-HFtn转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，37℃恒温下、210r/min振荡培养，待OD600值达0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导蛋白表达，将菌液8000r/min离心5min后收集菌体，超声破碎后，以10000r/min离心20min收集上清，将上清于60℃水浴热处理后再以10000r/min离心20min，收集上清，然后将上清与镍柱结合，利用含有2.0-7.5mM咪唑、3.5-11.5mM裂解缓冲液、210-274mM咪唑进行洗脱得到粗样品铁蛋白，浓缩后将蛋白样品用分子筛Superdex 20010/300GL纯化获得笼状铁蛋白。
(2)将香豆素-6装载于铁蛋白中：称取香豆素-6，按香豆素-6与无水乙醇的摩尔比1∶200，将香豆素-6超声溶解于无水乙醇中，溶解的香豆素-6溶液与铁蛋白在4℃下混合搅拌5min，使用HCl溶液将香豆素-6溶液与铁蛋白的混合溶液的pH值调整至2.0-2.6，使蛋白质笼解聚，在4℃下混合搅拌15min，使用的NaOH溶液将pH值调至7.2-8.1，在4℃下混合搅拌使解聚的蛋白质重组为笼状结构。
(3)透析浓缩：将混合溶液在pH＝7.4的PBS缓冲液中，置于4℃下使用截流分子量为10kD的透析袋透析8-12h，以除去未被包埋的香豆素-6，将透析后的溶液经5000r/min离心10min后去除变性蛋白，得到装载香豆素-6的铁蛋白纳米探针溶液。
3.根据权利要求1所述的以铁蛋白为载体制备具有靶向作用的荧光探针中的用途。
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