CN114732915B - 用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒及制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒及制备方法、应用，本发明采用靶向血小板源生长因子受体β(PDGFRβ)的亲和体蛋白ZPDGFRβ与疏水性药物一甲基澳瑞他汀E(MMAE)通过简单的化学偶联反应在溶液中自组装形成纳米颗粒。该纳米粒子制备方法简单且该纳米粒子明显提高MMAE药物的载量，已超过临床使用的靶向药物ADC的MMAE载药量；蛋白亲和体赋予纳米粒子在体内的特异性靶向作用，使得药物在肿瘤部位作用时间延长，安全性高，有效克服MMAE药物本身毒性高、体内生物利用度低等问题，为结肠癌的治疗提供新的思路。

Description

用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒及制备方法、应用
技术领域
本发明属于生物和纳米医药技术领域，尤其涉及一种用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒及制备方法、应用。
背景技术
结肠癌是一种常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠和乙状结肠交界处。在2020年世界癌症调查中，结肠癌的病发率和死亡率均处于前三位；在2020年，因为结肠癌而死亡的人数达到90万人；预计在2035年，新发病例将达到250万人次。近年来，我国结肠癌病发率呈逐渐上涨趋势，严重威胁人民的生命健康，治疗结肠癌成为亟待解决的问题。
目前，在结直肠癌治疗中主要采用的治疗手段包括手术治疗和化疗手段。在临床实践中，最为广泛应用的是手术为主化疗为辅的治疗方法。外科手术手段可以切除大部分的肿瘤组织，但切除后约半数患者在两年内复发或转移，导致死亡。结肠癌临床治疗中化疗首选以5-氟尿嘧啶，奥沙利铂，伊立替康及卡培他滨等药物为主的用药方案。然而，传统的小分子化疗药物在机体内缺乏肿瘤靶向性致使药物对机体存在较大的系统毒性，且长时间用药机体易产生多药耐药性问题。
靶向治疗为传统癌症提供新的治疗策略。当前，已有多种被FDA批准抗体靶向药物用于治疗进行性结肠癌，如西妥昔单抗，贝伐单抗等，这些抗肿瘤药物主要针对的结肠癌中的靶点主要为结肠癌中过表达的表皮生长因子受体(EGF)和血管内皮生长因子受体(VEGF)，可延长患者生存期。此类靶向药物用药成本高昂且存在一定的副作用，很大程度上限制了该类药物的使用。因此，开发新靶点，研制新型药物，制备高效低毒的抗肿瘤治疗药物对治疗结肠癌仍然具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒及制备方法、应用，该纳米颗粒有效提高抗肿瘤药物的靶向性及抗肿瘤效果。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒，所述纳米颗粒是由亲和体蛋白和疏水性抗肿瘤药物偶联自组装得到的；
所述亲和体蛋白为识别血小板源生长因子受体PDGFRβ的亲和体蛋白ZPDGFRβ；
所述疏水性抗肿瘤药物为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
所述纳米颗粒的平均粒径为130.2±0.52nm左右。
上述的用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1：将亲和体蛋白溶于溶剂A中，得到A溶液，所述溶液A的浓度为3.0mg/mL；
S2：将含有疏水性药物的中间体mc-vc-PAB-MMAE溶于溶剂B中，得到溶液B，所述溶液B的浓度为8mg/mL；
S3：将预设体积的溶液B，滴入所述溶液A中，在20-20℃下震荡反应24h后透析，可得到所述的纳米粒子水溶液。
所述亲和体蛋白与所述疏水性药物的物质的量比例为1:1-1.5。
所述溶剂A为水或PBS中的一种。
所述溶剂B为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种。
所述亲和体蛋白是通过基因工程方法表达纯化识别的，其中的蛋白表达系统为大肠杆菌诱导表达系统。
上述的用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒或上述制备方法制得的所述纳米颗粒在制备用于结肠癌主动靶向治疗药物中的应用。
本发明由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：
(1)本发明的主动靶向纳米颗粒通过简单的化学反应采用自组装技术形成纳米粒子，制备方法简单；
(2)本发明的主动靶向纳米颗粒的MMAE载药量约为6.7％，与目前临床使用的ADC药物的MMAE载量相比，载药量具有显著的提升；
(3)本发明的主动靶向纳米颗粒在PDGFRβ过表达的结肠癌肿瘤体系中具有明显的特异性靶向作用，其肿瘤组织部位的具有明显的富集作用，并且在肿瘤部位的滞留时间明显增长，有利于提高MMAE的生物活性；
(4)本发明的无载体纳米靶向颗粒结肠癌体内靶向治疗中显示出优异的抗肿瘤性能，其肿瘤抑制率高达99.0％；
(5)本发明的主动靶向纳米颗粒在结肠癌体内靶向治疗中对大型肿瘤(500mm3)依然具有很好的治疗效果，在治疗结束后肿瘤体积<30mm3，且小鼠的生存率及生存时间都有明显改善；
(6)本发明的主动靶向纳米颗粒明显提高了MMAE在体内的生物利用度和生物安全性，在癌症治疗中具有重大意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中亲和体蛋白ZPDGFRβ纯化过程的SDS-PAGE分析；
图2为本发明实施例1中亲和体蛋白ZPDGFRβ的MALDI-TOF-MS质谱图；
图3为本发明实施例1中ZPDGFRβ-MMAE纳米颗粒的MALDI-TOF-MS质谱图；
图4为本发明实施例1中ZPDGFRβ-MMAE纳米颗粒的动态光散射粒径分布图；
图5为本发明实施例1中ZPDGFRβ-MMAE纳米颗粒的透射电镜图片；
图6为本发明实施例2中ZPDGFRβ-MMAE纳米颗粒的COLO 205荷瘤小鼠的体内分布；
图7为本发明实施例3中ZPDGFRβ-MMAE纳米颗粒对结肠癌细胞体外的细胞毒性；
图8为本发明实施例4中ZPDGFRβ-MMAE纳米颗粒在COLO 205结肠癌的体内抗肿瘤治疗过程中体积曲线图；
图9为本发明实施例5中ZPDGFRβ-MMAE纳米颗粒在COLO 205结肠癌大瘤中的体内抗肿瘤治疗过程中体积曲线图；
图10为本发明实施例5中COLO 205大瘤组小鼠在开始给药ZPDGFRβ-MMAE NPs时的照片及给药结束并观察一个月后的裸鼠照片；
图11为本发明实施例4中小鼠在治疗过程中的体重曲线图；
图12为本发明实施例5中小鼠在治疗过程中的体重曲线图；
图13为本发明实施例5治疗结束后各组小鼠的主要器官的H&E组织染色结果；
图14为本发明实施例5治疗结束后各组小鼠的主要器官的血液生化分析结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒及制备方法、应用作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。
本发明提供一种用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒，所述纳米颗粒是由亲和体蛋白ZPDGFRβ和疏水性抗肿瘤药物(MMAE)偶联自组装得到的。
其中，血小板源生长因子受体β(PDGFRβ)是由间质细胞相关的成纤维细胞和周细胞表达的一种受体，同属酪氨酸激酶受体家族成员，与细胞的增殖分化及转移密切相关，是一种肿瘤靶向的潜在标记物。PDGFRβ在不同类型的肿瘤中均存在过表达现象，包括淋巴瘤(50％)、卵巢癌(58％)、结肠癌(80％)、肺癌(74％)及前列腺癌(39％)。基于此，PDGFRβ在结肠癌的靶向治疗中是一个具有潜在应用价值的靶点。通过筛选得到的具有识别PDGFRβ的靶标的物质包括核酸适配体、蛋白亲和体及一些短肽分子。其中，识别PDGFRβ的亲和体ZPDGFRβ蛋白的亲和能力达到0.4-0.6nM，而核酸适配体的识别能力为微摩尔级别。
该蛋白亲和体由三个α螺旋结构组成，其主体结构共有58个氨基酸分子量较小，且无免疫原性。相较于大分子的蛋白抗体(150kDa)更容易制备合成并且避免免疫原性造成的副作用。并且亲和体具有良好的水溶性，通过偶联疏水性抗肿瘤药物不仅能够提高药物的溶解性，并且能够赋予传统化疗药物不具备的靶向作用，以提高药物在体内的生物利用度及生物活性。
因此本发明尝试将血小板源生长因子受体PDGFRβ作为标记物，寻找与其能够结合的结肠癌抗肿瘤药物，通过发明人的努力将血小板源生长因子受体PDGFRβ与结肠癌抗肿瘤药物一甲基澳瑞他汀(MMAE)结合，通过自组装技术制备靶向治疗结肠癌的纳米颗粒。
下面将通过具体实施例详细描述本发明的纳米颗粒的制备、结构以及抗肿瘤性能。
实施例1
首先，亲和体蛋白ZPDGFRβ的分子设计及克隆构建
ZPDGFRβ亲和体蛋白由59个氨基酸组成，其序列如下：
AENKFNKELIEAAAEIDALPNLNRRQWNAFIKSLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKC(SEQ IDNO.1)，为了便于药物偶联，在亲和体氨基酸序列的C端添加半胱氨酸，用于后续反应。
根据亲和体蛋白ZPDGFRβ的氨基酸序列其初始编码基因，再经过核酸软件分析并对密码子进行优化，由金唯智公司合成的上述基因片段，并且在基因片段的5`端添加有NdeI酶切位点，3`端添加有XhoI位点。将合成的基因片段通过NdeI和XhoI位点连接构建于质粒载体pET19b，获得携带PDGFRβ核苷酸序列的质粒pET19b-PDGFRβ。
其次，亲和体蛋白ZPDGFRβ的表达及分离纯化
将测序正确的pET19b-PDGFRβ质粒转入大肠杆菌BL21菌株，经过100μg/mL氨苄(Amp)抗性平板筛选后，从平板中挑取单克隆菌株接入含有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
取1mL过夜培养物转接入含Amp的100mL LB培养基的小摇瓶中，37℃振荡培养4h至OD 600约为3-4。取80mL 10×TB盐，加入到720mL TB培养基中，再加入Amp至终浓度为100μg/mL，混匀待用。将摇瓶中的菌液转接到800mL TB培养基中，37℃、220rpm培养6h，至OD600约为8时，加入IPTG至终浓度1mM，16℃诱导培养12-16h。诱导结束后，8000g离心收集菌体。称取菌体10g，采用100mL Lysis buffer(20mM Tris-HCl(pH＝8.0),5mM咪唑，150mM NaCl)重悬后，高压匀浆加压至800PSI破碎菌体。当菌液由粘稠至澄清均一状态，停止破菌。然后4℃11000rpm离心20min，收集上清。将上述的破菌后上清采用0.45μm滤膜过滤，去除溶液中残留的碎片避免堵塞Ni-NTA(购自Qiangen)亲和柱。将过膜后的上清进行上样，上样结束后用Ni-NTA洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM Iminazole，150mM NaCl)冲柱，洗脱杂蛋白，最后，采用Ni-NTA洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM咪唑，150mM NaCl)洗脱目的蛋白，并分管收集目标产物洗脱液。纯化后的蛋白经SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS对其进行分析。结果显示，在SDS-PAGE中，显示目标蛋白为单一条带(图1)；质谱结果中其分子量为9310.4与理论分子量(9320.3)相近(图2)，表明我们成功制备ZPDGFRβ蛋白亲和体。纯化后的蛋白亲和体采用纯水透析(MW 3000Da)，每隔4-6h换一次透析液，并采用电导仪检测当电导率小于1sum，即认为透析完成。透析后的蛋白采用冻干机冻干，放置于干燥器中保存备用。
最后，主动靶向治疗的纳米颗粒ZPDGFRβ-MMAE NPs的制备与表征
将上述所纯化得到的蛋白亲和体ZPDGFRβ(3mg)溶于1mL PBS或水溶液中，首先加入10eq.TCEP还原剂室温还原处理30min，pH＝7.4～8.0，以充分释放蛋白中的自由巯基，随后将含有中间体mc-vc-PAB-MMAE(0.63mg，购自南京康满林生物医药科技有限公司)溶于78μL二甲基亚砜的溶液缓慢地逐滴加入前述的蛋白溶液中，室温振荡反应24小时。反应结束后将反应液置于水中采用分子量为15kDa的透析袋透析，以去除有机溶剂和未反应完的原料，透析完成后，即可得到组装体ZPDGFRβ-MMAE NPs溶液。
本实施例制得的纳米粒子组分采用MALDI-TOF-MS进行测定，结果如图3所示，该纳米粒中蛋白与药物成功偶联，其分子量约10620.2。且本实施例纳米粒子的结构采用动态光散射(DLS)和透射电镜技术(TEM)对其进行表征分析。在DLS测定中，其水合动力学直径约为130.2nm，粒径分布PDI为0.28(图4)；TEM测试结果显示，该组装体呈球形结构，直径约120nm左右(图5)。
实施例2 ZPDGFRβ-MMAE NPs的体内靶向性及体内分布
在本申请中涉及动物的研究方案均由上海交通大学动物伦理委员会批准。所有动物实验均按照上海交通大学动物保护与使用委员会的指导方针进行。SPF级雌性BALB/c裸鼠(4～6周)购自上海灵畅生物科技有限公司，由上海交通大学动物中心饲养。自适应饲养一周后，取对数生长期COLO 205细胞以PBS配制为细胞密度为1×106/mL的细胞悬液，接种于裸鼠右侧皮下位置，每只裸鼠接种量为200μL。当皮下异植瘤体积达到250～500mm3时即可进行体内生物成像。
利用小动物近红外活体成像技术来研究ZPDGFRβ-MMAE纳米粒子的体内靶向性。首先，采用亲水性荧光素Cy5.5 NHS酯对亲和体蛋白进行氨基标记，然后再与mc-vc-PAB-MMAE反应自组装形成纳米粒子Cy5.5-ZPDGFRβ-MMAE NPs，通过标准曲线进行定量纳米粒子中Cy5.5的含量。当皮下异植瘤达到250～500mm3时，将小鼠随机分为两组，分别尾静脉注射200μLCy5.5-ZPDGFRβ、Cy5.5-ZPDGFRβ-MMAE NPs(10μg/mL)。使用近红外波长(λex＝675nm，λem＝694nm)的活体成像系统在0.5h、1h、2h、3h、4h、5h和6h，采用IVIS Lumina成像系统(RS2000)进行成像。
实验结果如图6所示，当Cy5.5-ZPDGFRβ亲和体蛋白注射入小鼠体内后，荧光物质快速分散至全身并且在肿瘤部位富集。Cy5.5-ZPDGFRβ亲和体组，肿瘤部位的荧光强度在3h时达到最大，随后随时间的增长，肿瘤部位的荧光强度开始慢慢下降，这说明ZPDGFRβ亲和体可以实现在肿瘤部位的特异性聚集，而ZPDGFRβ蛋白在肿瘤部位的滞留时间比较短，这可能与蛋白的分子量较小有关。相比单独的亲和体蛋白，ZPDGFRβ-MMAE NPs在体内肿瘤部位缓慢富集，并且在肿瘤部位富集时间较长。当尾静脉注射6h后，ZPDGFRβ-MMAE NPs在肿瘤部位的荧光强度明显高于ZPDGFRβ蛋白的荧光强度。这可能是因为ZPDGFR蛋白偶联MMAE药物形成纳米组装体可以靶向递送到肿瘤部位并且纳米结构有利于其在肿瘤细胞内部滞留。上述结果说明在ZPDGFRβ-MMAE NPs在体内具有很好的靶向性，在肿瘤部位具有明显的富集作用。
实施例3 ZPDGFRβ-MMAE纳米粒子在体外结肠癌细胞的细胞毒性评价
结肠癌细胞COLO 205，HCT-116及LS174T细胞铺板，每孔8000-10000个/孔，待细胞完全贴壁后将培养基替换为200μL含有不同浓度的MMAE和ZPDGFRβ-MMAE NPs的药物培养基。37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养48h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)孵育4h后，小心移除上层培养基，加入200μL DMSO溶解底层的紫色结晶，室温避光震荡20min充分溶解后，采用多功能酶标仪检测490nm处的紫外吸收。根据公式：Cell viability(％)＝(ODSample-ODblank)/(ODControl-ODblank)×100％计算体外细胞毒性及IC50。
本实施例中采用相同浓度的MMAE作为对照，考察ZPDGFRβ-MMAE NPs在体外结肠癌细胞中的细胞毒性。从图7中可以看出，三种细胞的存活率随着MMAE和ZPDGFRβ-MMAE NPs浓度的提高逐渐降低。通过计算，MMAE对三种细胞的IC50值在2-5nM范围内，ZPDGFRβ-MMAE NPs对三种细胞的IC50值在13nM-18nM范围内。相比于MMAE，ZPDGFRβ-MMAE NPs的IC50有所增高，这可能是因为ZPDGFRβ-MMAE NPs是由药物与蛋白偶联形成，药物的释放过程存在时间依赖性，因此造成ZPDGFRβ-MMAE NPs对肿瘤细胞的IC50升高。但是，ZPDGFRβ-MMAE NPs的IC50值依然处于很低的级别，具有非常大的体内应用潜力。
实施例4 ZPDGFRβ-MMAE纳米粒子的结肠癌COLO 205的抗肿瘤性能
COLO 205裸鼠肿瘤模型的建立与实施例2中方法相同。我们设置ZPDGFRβ-MMAE NPs两组不同剂量的给药浓度梯度(MMAE eq.0.6mg/kg，MMAE eq.1.0mg/kg)考察药物在体内的抗肿瘤性能。分别设置PBS组和原料药MMAE组(0.6mg/kg)为对照组，考察ZPDGFRβ-MMAE NPs药物在COLO 205结肠癌肿瘤中的抗肿瘤性能。当COLO 205肿瘤体积约为150-200mm3时，荷瘤小鼠被随机分为四组，每组五只。按照预定的剂量开始给药，每六天给一次药，共给药五次。每次给药之前，对小鼠的体重及肿瘤体积和生长状态进行记录。如图8所示，COLO 205肿瘤在给药之前其肿瘤平均体积为150mm3，在给药两次之后，其肿瘤体积有明显的缩小。低剂量组和高剂量组的ZPDGFRβ-MMAE NPs均获得很好的治疗效果。在治疗结束后，通过计算得到ZPDGFRβ-MMAE NPs的肿瘤增长抑制率分别达到95.5％和99.0％。并且在治疗结束后，高剂量组ZPDGFRβ-MMAE NPs小鼠中部分小鼠的肿瘤已经消除。并且在治疗结束后对其观察20天，肿瘤没有明显增长的现象。以上结果说明ZPDGFRβ-MMAE NPs在对COLO 205荷瘤小鼠治疗中获得优异的抗肿瘤性能。
实施例5 ZPDGFRβ-MMAE纳米粒子的结肠癌COLO 205大肿瘤的抗肿瘤性
COLO205大瘤模型的建立与实施例2中方法相同。
在临床肿瘤治疗中，对于较大的肿瘤的治疗仍然是个很大的挑战，并且生存率极低。为了更深入地考察ZPDGFRβ-MMAE NPs在结肠癌中的抗肿瘤效果，我们采用体积更大的移植瘤模型，来考察其治疗效果。采用COLO205结肠癌移植瘤小鼠，当肿瘤体积增长到500mm3时，随机分为两组，每组五只，分别为PBS组和ZPDGFRβ-MMAE NPs 1.0mg/kg组。通过尾静脉注射，每六天给药一次共给药七次，在给药结束后，对小鼠状态进行连续一个月的观察记录其生存状况。结果如图9所示，在连续给药之后，肿瘤体积明显缩小，在给药七次之后肿瘤基本消失。而且，在停止给药一个月后，小鼠肿瘤部位没有明显的增大并且小鼠全部生存状态良好，其生存时间>90天，小鼠的生存率为100％(图10)。该结果说明ZPDGFRβ-MMAE NPs对临床上治疗比较困难的大肿瘤依然有很好的抗肿瘤作用，有利于延长小鼠的生存时间，提高小鼠的存活率。
ZPDGFRβ-MMAE纳米粒子的生物安全性评价
为了测定ZPDGFRβ-MMAE体内体内的生物安全性，我们分别对实施例4、5，抗肿瘤治疗过程中各给药组小鼠体重变化进行记录。并对实施例5治疗结束后的各组小鼠心肝脾肺肾进行收集，4％多聚甲醛固定处理后，采用苏木精伊红染色进行病理分析。并对其血液上清进行血液生化分析检测。
首先对小鼠在治疗过程中的体重进行考察，其结果分别如图11、12所示。ZPDGFRβ-MMAE NPs组与PBS组小鼠的体重无明显差别。相反，MMAE组小鼠的体重在给药后迅速下降，最大下降幅度超过20％，结果说明MMAE药物在体内具有很强的毒副作用。而ZPDGFRβ-MMAENPs无论是低剂量组还是高剂量组在治疗过程中小鼠体重无明显变化，说明ZPDGFRβ-MMAENPs对小鼠的毒性很弱。
进一步地对实施例5结束治疗后的小鼠主要器官进行H&E染色，进行免疫组化分析图13。相比于正常的组织结构，ZPDGFRβ-MMAE NPs(1.0mg/kg)组的主要器官没有明显的组织病变，说明药物对组织没有明显的病理损伤和破坏。血液生化分析也对小鼠的肝功能和肾功能进行检测。结果如图14所示，给药组ZPDGFRβ-MMAE NPs的血液指标与正常小鼠的血液指标之间没有显著性差异，进一步地说明ZPDGFRβ-MMAE NPs在体内具有非常好的生物安全性。
综上，本发明成功制备了一种结肠癌主动靶向作用的ZPDGFRβ-MMAE纳米颗粒，该纳米颗粒在小鼠体内的具有明显的特异性靶向作用；在结肠癌治疗中，具有优异的抗肿瘤性能，同时生物安全性较高，极大降低MMAE的毒性，本发明的ZPDGFRβ-MMAE NPs在癌症靶向治疗中具有优异的应用潜力。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明做出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒是由亲和体蛋白和疏水性抗肿瘤药物偶联自组装得到的；
所述亲和体蛋白为识别血小板源生长因子受体PDGFRβ的亲和体蛋白ZPDGFRβ，所述亲和体蛋白ZPDGFRβ的序列为：AENKFNKELIEAAAEIDALPNLNRRQWNAFIKSLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKC；
所述疏水性抗肿瘤药物为一甲基澳瑞他汀E；
所述纳米颗粒的平均粒径为130.2±0.52nm。
2.一种如权利要求1所述的用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将亲和体蛋白ZPDGFRβ溶于溶剂A中，得到A溶液，所述溶液A的浓度为3.0mg/mL；
S2：将含有疏水性药物的中间体mc-vc-PAB-MMAE溶于溶剂B中，得到溶液B，所述溶液B的浓度为8mg/mL；
S3：将预设体积的溶液B，滴入所述溶液A中，在20-25℃下震荡反应24h后透析，可得到所述的纳米粒子水溶液。
3.根据权利要求2所述的用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述亲和体蛋白与所述疏水性药物的物质的量比例为1:1-1.5。
4.根据权利要求2所述的用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述溶剂A为水或PBS中的一种。
5.根据权利要求2所述的用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述溶剂B为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种。
6.根据权利要求2所述的用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述亲和体蛋白是通过基因工程方法表达纯化识别PDGFRβ的，其中的蛋白表达系统为大肠杆菌诱导表达系统。
7.一种如权利要求1所述的用于结肠癌的主动靶向治疗的纳米颗粒或如权利要求2-6任一项所述的制备方法制得的所述纳米颗粒在制备用于结肠癌主动靶向治疗药物中的应用。
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