KR20180118475A - 줄기세포-나노 복합체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 기존의 줄기세포 부작용 및 나노 항암제의 표적 한계성을 극복하고 항암제효과도 매우 우수한 줄기세포 표면에 탄소 나노튜브(CNT) 및 금(Au) 나노입자 기반의 항암제가 적재된 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법을 제공한다.

Description

줄기세포-나노 복합체의 제조방법{Manufacture method for stem cell-nano complex}
본 발명은 나노 항암제 복합체의 제조방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 줄기세포-나노항암제 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
현재, 암을 치료하기 위한 방법으로는 수술을 통한 치료, 방사선 치료 그리고 항암제 투여를 통한 치료 등이 있으나 이는 부작용이 수반되거나, 암의 진행 정도에 따라 시술이 제한적으로 적용되고 특히, 항암제는 거듭된 연구결과 양적인 측면에서는 그 종류가 늘었지만, 질적인 측면에서는 큰 변화가 없었다. 그 이유는 항암제 대부분이 분열이 왕성한 세포의 세포주기를 멈추게 하고 사멸케 하는 메커니즘으로 작동하기 때문이고, 이로 인해 암세포 이외에도 정상적으로 분열하는 세포를 공격해서 항암제의 대표적 부작용인 탈모, 식욕부진 및 백혈구 감소로 인한 면역력 저하 등을 유발하기 때문이다. 이러한 항암제의 부작용을 최소화하기 위해 표적항암제의 개발이 활발히 일어나고 있으며, 현재까지 18종 이상의 표적항암제가 개발되어 임상에 적용되고 있고, 200여종 이상이 임상실험 중이다. 하지만 이러한 표적항암제는 같은 종류의 암이라도 특정 표적인자가 나타난 환자에게 효과가 있다는 한계가 있으며, 표적치료제는 장기간에 걸쳐서 투여해야하기 때문에 내성을 유발하는 문제가 있어 이를 보완하기 위해 표적치료제를 기존의 강력한 항암제와 병합하는 칵테일 요법과 여러 표적인자를 동시에 공격함으로써, 단 시간에 암을 제거하는 단일항암제를 사용하는 방법 등이 있는데, 이것 또한 심각한 부작용을 유발할 위험성을 내포하고 있다. 따라서 부작용이 적으면서도 효율적으로 암을 치료할 수 있는 표적치료제로 금나노 물질(Gold Nanoparticle), 생분해성 폴리머류(Biodegradable polymers) 및 탄소 나노튜브(carbon nanotubes)를 이용한 항암제의 연구가 활발히 진행중이다. 특히 나노입자들은 기계적, 시각적, 화학적 특성으로 인하여, 이미징(imaging), 암 치료 등을 포함한 다양한 생물의학 분야에서 적용이 가능하다. 항암제 전달체(drug carrier)로서 탄소 나노튜브는 세포내 이입(endocytosis)을 통하여 생체 분자를 세포 내로 효과적으로 전달하는 방법에 관한 연구가 주로 진행되어 왔으며, 탄소 나노튜브의 표면을 PEG(polyethylene glycol)로 처리하여, 항암제를 적재(loading)하는 방법이 연구되고 있다. 또한, 금 입자를 나노 크기로 제어하면 원재료에서 볼 수 없는 새로운 물리ㅇ화학적 성질이 나타내는데 이것은 결정의 크기가 작아지면 전체 원자에 대한 표면 원자의 비가 크게 증가하며 이러한 결과는 물질의 열역학적 성질에 큰 변화를 일으킨다. 일반적으로 고체 물질의 표면 원자들은 내부 원자들에 비해 자유 에너지에 큰 기여를 하는데 표면원자의 증가는 나노 결정의 녹는점 내림이나 상전이 같은 열역학적 성질을 변화시키고 전자기적, 광학적, 기계적, 열적 특성을 나타내기 때문에 트랜지스터, 발광소자, 센서, 태양전지 등 다양한 나노소자의 기초 물질이 되고 이를 이용하여 항암제 치료 효율이 향상된 항암제 제조에 사용되고 있다. 예컨대 금 나노 입자에 관능기를 만들고 독소루비신이나 파클리탁셀과 같은 항암제를 금 나노 입자 표면에 적재한 금 나노 입자 기반의 항암제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
보다 효율적인 항암제치료를 위해 개발되어 온 기존의 나노 항암제들의 경우 제형에 사용되어 온 생분해성 폴리머가 산성 pH 및 혈액조건에서 항암제가 나노 물질로부터 쉽게 해리되어 표적 부위로의 항암제 전달에 한계가 있어 왔고 실리카, 자성입자, 탄소계 나노입자 등의 비분해성 나노입자는 독성 극복 항암제 용량에서 효능에 대한 검증이 안 되어 세망내피계(reticular endothelial system; RES) 기관에 축적되는 등의 단점을 가지고 있는 등, 종래의 나노 항암제들은 아직 해결해야 할 난제를 가지고 있다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1711127호는 암 표적화된 항암제 결합 산화철 나노입자 복합체, 그 제조방법, 및 그의 용도에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 낮은 암 표적능으로 인해 항암제의 효과가 감소되는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래의 나노 항암제의 표적 한계성을 극복하고 항암제의 효능을 극대화한 새로운 형태의 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 나노입자 표면에 카르복실기(-COOH)를 도입하는 카르복실화 단계; 카르복실화된 나노입자에 EDC{1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide} 링커를 결합시키는 EDC 링커 결합단계: EDC 링커가 결합된 나노입자에 아민기를 갖는 항암 화합물 및 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 항체 유사체(antibody mimetics)를 공유결합시키는 항암 화합물 및 항체 결합단계; 및 상기 항암 화합물 및 항체가 결합된 나노입자와 줄기세포를 결합시키는 줄기세포 결합단계를 포함하는 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 항암제의 효능을 극대화하고 종래 나노 항암제의 표적능이 향상된 새로운 형태의 줄기세포-나노항암제 복합체의 제조방법을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 중간엽 줄기세포(MSC)의 표면에 탄소 나노튜브(CNT) 기반 및 금(Au) 나노 기반 항암제가 적재된 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조를 개략적으로 도시한 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-탄소 나노튜브 기반 나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)(A)와 줄기세포-금 나노입자 기반 나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-Au-DOX)(B)를 제조 후 공초점 형광현미경을 이용하여 줄기세포 표면에 독소루비신 결합 mwCNT 및 Au가 제대로 부착되어 있음을 확인한 그림과 현미경 사진이다.
도 3은 줄기세포 표지 단백질 CD90에 결합하는 항체를 이용하여 결합한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 세포 당 항암제 적재 정도를 분석한 그래프이다.
도 4는 줄기세포 표지 단백질 CD90 또는 CD73에 결합하는 항체를 이용하여 결합한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 세포 당 항암제 적재 정도 변화를 분석한 그래프이다.
도 5는 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 시간에 따른 항암제 결합지속 정도를 분석한 그래프이다.
도 6은 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 줄기세포의 세포 생존률 변화를 분석한 그래프이다.
도 7은 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX) 결합 후의 시간별 줄기세포의 생존률 변화를 분석한 그래프이다.
도 8은 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 세포 내 칼슘 농도 변화를 분석한 그래프이다.
도 9는 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 MSC 세포 데미지(damage)를 표지단백질(E-cadherin) 발현변화를 통해 확인한 공초점 현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 제조 후 세포 표면과 결합된 나노항암제를 확인한 공초점 현미경 사진과 결합 후 암세포 표적 능력 변화를 분석하여 줄기세포-나노항암제 복합체의 기능성을 분석한 그래프이다.
도 11은 줄기세포내로 나노 항암제를 적재하거나 줄기세포 막 단백질과 결합시킨 줄기세포-나노항암제 복합체의 독소루비신 항암제의 농도를 분석한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 줄기세포-나노 항암제 복합체의 독소루비신 항암제의 적재 정도를 분석한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 줄기세포-나노 항암제 복합체의 비소세포 폐암세포주(A549 및 H1975)로의 표적 능력을 분석한 그래프이다.
도 14는 MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군 및 MSC conjugation CNT-DOX 실험군의 줄기세포간의 자체 독성을 비교분석한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 MSC 배지 처리군, MSC 처리군, MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군, MSC conjugation CNT-DOX 실험군 및 대조군의 장시간에서의 시간별 폐암세포(H1975) 사멸능력을 비교분석한 유세포 분석 데이터이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 MSC 배지 처리군, MSC 처리군, MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군, MSC conjugation CNT-DOX 실험군 및 대조군의 장시간에서의 시간별 폐암세포(H1975) 사멸능력을 분석한 그래프이다.
도 17은 MSC 배지 처리군, MSC 처리군, MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군, MSC conjugation CNT-DOX 실험군 및 대조군의 줄기세포 자체의 사멸능을 분석한 그래프이다.
도 18은 MSC 배지 처리군, MSC 처리군, MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군, MSC conjugation CNT-DOX 실험군 및 대조군에 240 시간 동안 폐암세포주에 처리한 후 암세포 표지 단백질(CD 31, 34)을 이용하여 줄기세포의 암세포로의 역분화를 분석한 그래프이다.
도 19는 줄기세포 내로 나노 항암제를 적재하거나 줄기세포 막 단백질과 결합시킨 줄기세포-나노 항암제 복합체 및 MSC 대조군의 세포 내 칼슘 신호전달 변화를 분석한 그래프이다.
도 20은 줄기세포내로 나노 항암제를 적재하거나 줄기세포 막 단백질과 결합시킨 줄기세포-나노 항암제 복합체 및 MSC 대조군을 폐암세포주(H1975)에 처리한 후 각각 세포간의 칼슘 신호전달 변화를 분석한 그래프이다.
도 21은 줄기세포내로 나노 항암제를 적재하거나 줄기세포 막 단백질과 결합시킨 줄기세포-나노 항암제 복합체 및 MSC 대조군을 폐암세포주(H1975)에 처리한 후 각각 세포간의 칼슘 신호전달 변화를 분석한 그래프이다.
도 22는 누드마우스에 luciferase-RFP 형광을 발광하는 종양세포 주입 후 폐종양 모델을 성립과 확인 과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 23은 폐종양 모델 마우스에 종양세포 주입 후 형광 이미징 장비(IVIS in vivo imaging system)와 폐조직 염색을 통하여 확인한 사진이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여로 형광 발광 폐종양의 생성 여부를 형광이미지 장비로 관찰한 사진이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여 후 관찰된 형광 발광의 세기를 분석한 그래프이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여로 폐종양의 생성이 억제되었음을 H&E 조직화학염색법으로 관찰한 사진이다.
도 27은 특정 암에 선택적으로 표적하는 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD90-Au-DOX)의 적용과정을 개략적으로 나타내는 그림이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)"는 성체 줄기세포 중 성체 중간엽 줄기세포(Adult mesenchymal stem cells; MSCs)를 의미하며 골수나 제대혈, 지방세포에서 유래되며 다분화능을 가진 것이 특징이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "탄소 나노튜브(carbon nanotube, CNT)"는 지구상에 다량으로 존재하는 탄소로 이루어진 탄소동소체로서 하나의 탄소가 다른 탄소원자와 육각형 벌집무늬로 결합되어 튜브형태를 이루고 있는 물질이며, 튜브의 직경이 나노미터(nm=10 억분의 1 미터) 수준으로 극히 작은 영역의 물질을 의미한다.
상기 탄소 나노튜브는 우수한 기계적 특성, 전기적 선택성, 뛰어난 전계방출 특성, 고효율의 수소저장매체 특성 등을 지니며 현존하는 물질 중 결함이 거의 없는 완벽한 신소재로 알려져 있고, 고도의 합성기술에 의해 제조되며, 합성방법으로는 전기방전법, 열분해법, 레이저 증착법, 플라즈마 화학 기상 증착법, 열화학기상증착법, 전기분해방법, Flame 합성방법 등이 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "금 나노 입자(AuNP)"는 금의 입자 크기가 nanometer scale에 있는 것으로 1-9m 정도의 입자로 완전한 구 모양이 아니라 불규칙한 모양으로 되어있으며 각각의 모양과 크기에 따라 states가 다르고 색깔이 다르다. 상기 states에 따라 어떤 영역에 해당하는 파장을 어느 정도 반사하고 흡수하는 지에 따라 색깔이 결정된다. 이를 통해 energy gap을 추측할 수 있고 크기가 클수록 짧은 파장의 색을 내는데 항암제를 부착시켜 입자를 약 운반제로 이용하거나, 특정 항체를 부착시켜 세포 표면에서 항원을 검출하는데 이용될 수 있다. 또한, 류마티스 관절염의 치료제로도 사용될 수 있으며, 의료부분 뿐만 아니라 다양한 분야에 사용될 수 있는 차세대 신 물질이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "나노 항암제 복합체"는 항암제의 방출, 흡수를 제어 하거나, 체내의 특정부위에 항암제를 표적화(targeting)하여 전달하기 위한 것으로, 항암제의 부작용을 줄이면서 효능을 극대화 시켜 필요한 양의 항암제를 표적부위에 일정시간 동안 효과적으로 머무를 수 있도록 조절하기 위한 것으로 나노기술을 이용한 항암제 전달 시스템을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항암제가 적재된 탄소나노튜브(CNT) 또는 급(Au) 나노입자"는 의미는 탄소 나노튜브 또는 금 나노입자에 카르복실기(-COOH)와 같은 관능기(functional group)를 도입하고 독소루비신이나 파클리탁셀과 같은 항암제 또는 트라츠맙(Trastuzumab), 아달리무맙(Adalimumab), 및 인플릭시맙(Infliximab) 등과 같은 항암제치료용 항체를 금 나노 입자 표면에 부착시킨 항암제 나노입자를 의미한다. 탄소나노튜브의 관능기 도입은 산 처리에 의해 수행될 수 있고, 금 입자 자체에는 관능기가 없으므로 정전기적으로 안정화시키기 위해서 카르복실기로 치환된 PEG 또는 PLGA와 같은 폴리에스테르 계열 생적합성 중합체를 코팅시킨 후 아민기(-NH2)를 가진 독소루비신과 같은 항암제 또는 항체를 결합하여 제조할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체의 기능성 단편"은 항체의 항원 결합부위의 기능이 보존되어 항원 결합능을 보유한 항체의 단편을 의미한다. 이러한 항체의 기능성 단편에는 항체를 파파인이나 펩신과 같은 단백질 분해효소로 절단하여 생성된 Fab, Fab' 및 F(ab')2와 같은 단백질 분해효소 절단편 및 Fv, scFv, diabody, triabody, 및 sdAb과 같이 유전자 재조합에 의해 생성된 재조합 항체단편도 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigen-binding)으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편으로 VH-CH1 및 VL-CL,의 두 펩타이드의 이량체로, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystalisable)라 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원 결합 부위를 포함하는 단편으로 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab'"는 상기 Fab와 유사한 구소를 갖는 항체단편으로서 상기 F(ab')2를 환원시켜 생성되며, Fab에 비해 중쇄 부분의 길이가 약간 더 길다.
본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable)로서 항체의 Fab 중 가변영역(VH 및 VL)을 링커를 이용하여 단일쇄로 제조한 재조합 항체 단편을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single doamain antibody)"는 나노바디(nanobody)라고 지칭되며, 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다.
본문서에서 사용되는 용어 "VHH"는 낙타류에서 발견된 중쇄의 이량체로만 구성된 IgG의 중쇄의 가변영역 단편으로서 항원에 대한 특이적 결합을 하는 항체 단편 중 가장 작은 크기(~15 kD)을 가지고 있으며, Ablynix사에 의해 Nanobody??라는 상표명으로 개발된 바 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fv(fragment variable)"는 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영영(VH 및 VL)만으로 구성된 이량체성 항체 단편으로 크기가 상기 sdAb와 Fab의 중간 정도(약 ~ 25 kD)로서 항체를 특별한 조건에서 단백질 가수분해시켜 생성하거나 VH 및 VL을 암호화하는 유전자를 하나의 발현벡터에 삽입하여 발현시킴으로써 제조한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "다이아바디(diabody)"는 scFv의 VH 및 VL 사이의 링커 길이를 짧게하여(5 a.a) 두 개의 scFv가 서로 이량체를 형성하도록 제조된 이가성(divalent)의 이중특이성(bispesific)을 갖는 재조합 항체 단편으로 통상의 scFv 보다 항원 특이성이 더 높은 것으로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "트라이아바디(triabody)"는 세 개의 scFv가 서로 삼량체(trimer)를 형성하도록 제조된 삼가성(trivalent)의 재조합 항체 단편을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체 유사체(antibody mimetics)"는 항체와 유사하게 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일쇄 기반의 단백질로서, 기본이 되는 스캐폴드 단백질의 항원인식부위에 대한 무작위 돌연변이 도입 후 패닝(panning)을 통해 선별된다. 이러한 항체 유사체에는 아피린(affilins; Ebersbach, H. et al. J. Mol. Biol., 372: 172-185, 2007), 아피머(affimers; Johnson, A. et al. Anal. Chem., 84(15): 6553-6560, 2012), 아피틴(affitins; Krehenbrink, M. et al., J. Mol. Biol., 383: 1058-1068, 2008), 안티칼린(anticalins; Skerra, A. et al., FEBS J., 275: 2677-2683, 2008), 아비머(avimers; Silverman, J. et al. Nat. Biotechnol., 23: 1556-1561, 2005), DARPin(Stumpp, M.T. et al., Drug Discov. Today 13(15-16): 695-701, 2008), 피노머(Fynomers, Grabulovski, D. et al., J. Biol. Chem. 282(5): 3196-3204, 2007), 모노바디(monobodies; Koide, A. et al., Methods Mol. Biol., 352: 95-109, 2007), VLR(variable lymphocyte receptor; Boehm, T. et al., Annu. Rev. Immunol. 30: 203-220, 2012), 리피바디(repebodies, Lee, S.-C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(9): 3299-3304, 2012) 등이 포함된다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 관점에 따르면, 나노입자 표면에 카르복실기(-COOH)를 도입하는 카르복실화 단계; 카르복실화된 나노입자에 EDC{1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide} 링커를 결합시키는 EDC 링커 결합단계: EDC 링커가 결합된 나노입자에 아민기를 갖는 항암 화합물 및 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편 또는 항체 유사체(antibody mimetics)를 공유결합시키는 항암 화합물 및 항체 결합단계; 및 상기 항암 화합물 및 항체가 결합된 나노입자와 줄기세포를 결합시키는 줄기세포 결합단계를 포함하는 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법이 제공된다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 나노입자는 탄소 나노튜브일 수 있고 상기 탄소 나노튜브는 다중벽 탄소 나노튜브일 수 있으며 상기 다중벽 탄소 나노튜브는 5 내지 50 nm의 직경을 가질 수 있다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 카르복실화 단계는 상기 탄소 나노튜브를 산(acid)처리하는 산처리 공정에 의해 수행될 수 있고 산처리된 탄소 나노튜브를 초음파(ultrasonic wave) 처리하는 초음파 처리 공정을 추가로 포함할 수 있다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자일 수 있고 상기 카르복실화 단계는 상기 금 나노입자에 카르복실기를 포함하는 중합체(polymer)를 코팅하는 폴리머 코팅공정에 의해 수행될 수 있으며 상기 카르복실기를 포함하는 중합체는 카르복실화 PEG(polyethylene glycol), 히알루론산(hyaluronic acid), PHA(polyhydroxyalkanoates), PLGA{poly(lactic-co-glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)} 또는 PGA{poly(glycolic acid)}일 수 있다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 CD90, CD73 또는 CD105일 수 있고 상기 나노입자 및 항암 화합물의 중량비가 1:1 내지 1:3일 수 있다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 항암 화합물은 독소루비신, 파클리탁셀, ABT737, 5-플루오로우라실, BCNU, CCNU, 6-메르캅토퓨린, 나이트로젠 머스타드, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시스플라틴, 메소트렉세이트, 시타라빈 싸이오테파, 부설판 또는 프로카바진일 수 있고 상기 줄기세포는 지방 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 역분화 줄기세포, 또는 중간엽 줄기세포(MSC)일 수 있다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, Fv, VHH(variable domain of camelid heavy chain), sdAb, diabody 또는 triabody일 수 있고 상기 항체 유사체는 Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, VLR(variable lymphocyte receptor), VHH(variable domain of camelid antibody heavy chain) 또는 repebody일 수 있다.
기존의 나노 항암제들의 경우 제형에 사용되어 온 생분해성 폴리머가 산성 pH 및 혈액조건에서 항암제가 나노 물질로부터 쉽게 해리되어 표적 부위로의 항암제 전달에 한계가 있어 왔고, 종래 실리카, 자성입자, 탄소계 나노입자 등의 비분해성 나노입자는 독성 극복 항암제 용량에서 효능에 대한 검증이 안되고 세망내피계(reticular endothelial system; RES) 기관에 축적되는 등의 해결해야 할 난제를 가지고 있다. 이러한 종래 항암제의 효능을 극대화하고자 탄소 나노튜브 기반의 항암제에 대한 연구가 계속되고 있는데 탄소 나노튜브(carbon nanotubes, CNT)는 탄소를 기본으로 형성된 물질들로 구성되어, Graphite, Carbon tube, Fullerene, Graphene, Diamond 등으로 기계적, 시각적, 화학적 특성으로 인해 이미징(imaging), 암 치료 등을 포함한 다양한 생물의학 분야에서 적용되고 있다(Bae, S., et al., Nat. Nanotechnol. 5, 574, 2010). 최근, 탄소 나노튜브는 무게, 농도 대비 표면적이 가장 넓은 특성, 바이오물질과의 결합이 용이한 특징등으로 바이오 분야에서 항암제 전달체, 의료영상 Agent, DNA 결합체, Biosensor, biochip 등으로 활용 연구 개발되고 있다(Yang, W., et al., Nanotechnol., 18, 412-421, 2007).
또한, 금(Au)은 지각을 구성하고 있는 물질 중 대략 1% 미만을 차지하고 있어 인류가 사용하고 있는 금속 중에 가장 최초로 사용된 금속 중의 하나로서 잘 알려져 있고 오랫동안 금화용, 장식용, 치과ㅇ의료용으로 사용되고 있을 뿐만 아니라 최근에는 전자, 인공위성, 핵발전소 산업 등에서 미세전선, 도금, 전기접점 등 특수용도로서 다양한 합금형태로 사용되고 있으며, 다양한 방법을 통해 나노 입자로 제조된다. 금 나노 입자를 제조하는 방법은 화학적 합성방법, 기계적 제조방법, 전기적 제조방법이 있다. 기계적인 힘을 이용하여 분쇄하는 기계적 제조방법은 공정상 불순물의 혼입으로 고순도의 입자를 합성하기 어렵고 나노 크기의 균일한 입자의 형성이 불가능하다. 실제적인 방법으로서 레이저 어블레이션(laser ablation)법, 오븐빔(oven beam)법, 고에너지 볼 밀링(high energy ball milling)법 등이 사용되고 있는데 레이저 어블레이션 법은 진공에서 원재료에 레이저빔을 인가하여 발생되는 원자 또는 분자의 증기를 응축하여 나노입자를 제조하며 비교적 고가이고 열효율이 낮은 레이저를 이용하므로 생산량에 비해 생산비가 너무 큰 문제점이 있었고, 또한 진공 하에서 끊는 점이 낮은 물질을 녹여 발생되는 증기를 응축시켜 나노입자를 제조하는 오븐빔 법과 기계적으로 갈아내어 나노입자를 만드는 고에너지 볼 밀링법은 고도의 기술이 요구되고 제조과정이 매우 어려우며, 고가의 제조설비가 요구되는 문제점이 있다. 또 전기분해에 의한 전기적 제조방법의 경우 제조시간이 길고, 농도가 낮아 효율이 낮다는 단점이 있다. 화학적 합성법에는 크게 기상법과 액상법(colloid법)이 있는데, 플라즈마나 기체 증발법을 사용하는 기상법의 경우 고가의 장비가 요구되며 과정이 복잡하여 효율이 떨어지는 단점 때문에 저비용과 간단한 제조 공정으로 균일한 입자의 합성이 가능한 액상법이 주로 사용되고 있다. 상기 액상법에 의한 금 나노 입자의 제조방법은 액상에서 화합물을 해리 시킨 후 환원제나 계면활성제를 사용하여 히드로졸(hydrosol) 형태의 금 나노입자를 제조하는 방법이 있다. 최근에는 염화금산(HAuCl4)염 상태의 무기화합물을 환원제를 이용하여 콜로이드 상태로 합성하는 액상환원법을 통해 금 나노 입자를 제조하고 이에 항암제를 적재하여 암세포로의 표적능력이 향상된 항암제 복합체에 대한 연구 개발이 활발히 진행되고 있다.
본 발명자들은 종래 나노 항암제의 표적 한계성을 극복하고 항암제의 효능을 극대화하고자 예의노력한 결과, 암세포로의 표적능력이 매우 우수한 중간엽 줄기세포(MSC)의 표면에 탄소 나노튜브(CNT) 및 금(Au) 나노입자에 항암제효과가 검증된 항암제가 적재된 줄기세포의 암표적(homing) 및 세포 사멸기능(apoptosis)을 갖는 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법을 개발하였다(도 1).
이하, 실시예를 통해 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전히 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 탄소 나노튜브의 제조(mwCNT)
본 발명의 일 실시예에 따라 암세포로의 표적능력이 매우 우수한 중간엽 줄기세포(MSC) 표면에 나노 항암제가 적재된 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조에 사용될 탄소 나노튜브를 제조하였다.
구체적으로, 탄소 나노튜브는 반더발스인력(van der Waals attraction)에 의하여 쉽게 응집되는 특성이 있고, 분산시키기 어려운 문제가 있어 탄소 나노튜브의 말단 및 결함부위(defect sites)의 탄소 원자를 산화시키기 위하여 산(acid)을 이용하였다. 산 용매를 이용하여 산소를 함유하는 작용기를 탄소 나노튜브의 표면에 산화시킴으로써, 카복실기(carboxylic group)와 같은 작용기를 도입할 수 있다. 상기와 같이 카복실기가 표면에 도입되어, 표면 기능화(surface functionalization)된 탄소 나노튜브를 하기와 같이 제조하였다. 상기 다중벽 탄소 나노튜브의 표면에 카복실기를 도입하는 방법은 (a) 강산 용매에 탄소 나노튜브를 혼입하여, 산소를 함유하는 작용기를 탄소 나노튜브의 표면에 화학적으로 산화시켜 도입하는 단계, 및 (b) 상기 산 용매 중에서 초음파 처리하는 단계를 통하여 수행되었다. 다중벽 탄소 나노튜브(multi-wall canbon nanotube, MWCNT)는 직경이 10-30 nm 범위인 SES research 제품(lot NT-0140, catalog # 900-1260, Inc USA) 20 mg을 H2SO4(98%) 9 ㎖과 HNO3(65%) 3 ㎖을 3:1의 부피비율로 혼합한 후, 30분 동안 초음파처리(sonicate)하였다. 이때, 초음파 처리는 20~25 KHz 주파수 범위에서 80분 내지 120분 동안 처리하였다. 주파수 범위는 20~22 KHz일 수 있으며, 이때에는 90분 내지 110분 동안 초음파 처리할 수 있다. 이러한 과정에 의하여 응집된 나노튜브 구조가 절단되고 길이가 짧은 다발의 구조로 되었으며, 초음파 처리 시 발생하는 충격파(shockwave)는 부유 상태의 고체 입자를 더욱 분산된 상태로 만들었다. 그 후, 상기 용액에 50℃에서 24시간동안 열을 가하면서, 마그네틱 바(magnetic bar)를 이용하여 300 rpm의 속도로 교반하였다. 상기의 산 용매와 반응하는 단계와 초음파 처리 단계를 1회 반복하였다. 상기 단계를 통하여 화학적으로 기능화된 MWCNT(MWCNT-COOH)는 10 μm 직경의 필터 멤브레인(membrane)(Millipore, lot: ROBA95509)을 이용하여 여과시킨 후, 상기 필터 멤브레인을 16~20시간 동안 60℃에서 진공상태로 건조시켰다. 그 후, 상기 화학적으로 기능화된 MWCNT-COOH를 스테인레스 철 재질의 의료용 스크레이브(scrape)를 이용하여 상기 필터 멤브레인에서 긁어냈다. 상기 실험 단계를 통하여 나노튜브의 표면의 결함 위치(defect site)에 카복실 잔기(-COOH)가 생성되었다. 탄소 나노튜브의 결함부위를 카복실화시키는 변형은 물 또는 유기용매 내에서 탄소 나노튜브의 용해성을 증가시킨다.
실시예 2: 금 나노입자의 제조(AuNP)
본 발명의 일 실시예에 따라 암세포로의 표적능력이 매우 우수한 중간엽 줄기세포(MSC) 표면에 나노 항암제가 적재된 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조에 사용될 금(Au) 나노입자를 제조하였다.
구체적으로, 금 나노입자의 합성은 염화금산(HAuCl4)염 상태의 무기화합물을 환원제를 이용하여 콜로이드 상태로 합성하였다(Turkevich method를 이용). Sigma Aldrich 제품(catalog # S4614)의 300 ㎖의 시트르산나트륨 2.2 mM을 100℃ 까지 가열한 뒤 25 mM의 Sigma Aldrich 제품(catalog # 520918)의 염화금산염을 2 ㎖ 첨가 후 300 RPM에서 금 나노입자를 환원시켰다. 상기 환원 반응중인 용액은 투명한 색에서 회색 그리고 붉은색을 거치며, 15분 이내로 반응이 진행되고 합성된 금 나노입자는 상온에서 30분 이상 식혀주며 안정화 시켰다. 위의 반응은 모두 3차 증류수를 용매로 하여 이뤄졌다. 상기 합성된 금 나노입자는 구연산염 이온(citrate ion)에 의해 평형 상태를 이루고 있으나, 염(salt)이나 동결건조에 의해 평형상태를 잃고 입자 사이의 반데르발스인력(van der Waals attraction)에 의하여 쉽게 응집되는 특성이 있다. 이러한 결점을 보완하기 위해, 폴리머(α-Mercapto-ω-carboxy-PEG) 1 mg/mL를 이용해 2 mg/mL의 금 나노입자와 24시간 반응시켜 표면에 자가조립단층(self assembled monolayer)을 형성하여 입체적(steric) 안정성을 높여줌과 동시에 폴리머의 Carboxylate 음전하에 의한 정전기적(electrostatic) 안전성도 향상되었다. 상기 제조된 폴리머 코팅이 이뤄진 카르복실화 금 나노입자(AuNP-COOH)는 원심분리기를 이용하여 16000 g의 속도에서 용매로부터 분리시키고 3차 증류수를 이용하여 재부유한 후 현탁하여 사용하였다.
실시예 3: EDC 링커의 연결
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 실시예 1에서 제조한 탄소 나노튜브와 실시예 2에서 제조한 금 나노입자에 단백질 결합의 안정성을 위하여 EDC 링커를 결합하였다.
구체적으로, 탄소 나노튜브(MWCNT-COOH) 및 금 나노입자(AuNP-COOH)에 EDC 링커를 결합시키는 반응은 약 산성을 띠는 MES 버퍼(2-morpholinoethanesulfonic acid)내에서 수행하였고 MES 버퍼(low moisture content≥99%, sigma-aldrich CAT: M3671)는 용액의 pH를 조절하기 위하여 사용하였다. 우선, 10 mg의 AuNP-COOH 및 3.2 mg의 MWCNT-COOH를 각각 1.6 ㎖의 MES 버퍼(50 mM, pH 5.5)에 넣은 후, 팁 소니케이터(tip sonicator)(company: Misonix sonicators, Product: sonicator 4000)를 이용하여 3초 on/3초 off의 주기로 5분 동안 분산시켰다. 그 후, MES 버퍼(50 mM, pH 5.5)에 1.6 ㎖ NHS(400 mM)(N-hydroxysuccinimide, Cas: 06066-82-6)를 혼합한 용액을 상기 초음파 분쇄된 용액에 첨가한 후, 30분 동안 Rocker를 사용하여 혼합하였다. 그 후, EDC 10 ㎖ 용액(20 mM)(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N- ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma, Lot No.: 040M17411V)을 상기 초음파 처리 용액에 첨가하고 30분 동안 Rocker로 혼합시켜, EDC 링커가 연결된 탄소 나노튜브(EDC-MWCNT-COOH) 및 금 나노입자(EDC-AuNP-COOH)를 각각 제조하였다.
상기 혼합액은 4 센트리콘 YM-50 필터 튜브(Amicon ultra-15, 50K device-50000 NMWL, TM millpore, USA)에 넣고 2,000 rpm의 속도로 원심분리한 후, MES 버퍼(50 mM)로 3회 또는 그 이상 세척하였으며, 이때 1회에 20분 동안 원심분리를 수행하였다. 그리고 상기 MWCNT-COOH 5 mg을 PBS(phosphate buffered saline) 5 ㎖에서 팁 소니케이터를 이용하여 3초 on/3초 off의 조건으로 5분 동안 초음파 분쇄를 더 수행하였으며, 이 상태를 하기 항암제를 적재한 탄소 나노튜브 기반의 항암제에 대한 대조군으로 이용하였다.
실시예 4: 탄소 나노튜브 기반의 항암제의 제조
4-1: 공유결합에 의해 항암제가 적재된 mwCNT 제조
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소 나노튜브 기반의 항암제는 종래의 공유결합을 이용한 항암제에 비하여 항암제의 결합율이 증가되었다. 종래의 기술에 비하여 항암제의 결합율을 증가시키기 위하여, EDC 링커 결합과 항암제 결합시의 pH를 조절하였다. EDC 링커가 가장 잘 붙는 조건인 pH 4-6 범위 가운데, pH 5.5를 선택하여 EDC 링커의 최대 결합을 유도하였고, 항암제를 결합시킬 때에는 pH 6으로 상향시켜 항암제 적재 최대화 조건인 pH 7-8을 충족하진 못하여도 EDC의 가수분해(hydrolysis)를 억제할 수 있는 pH 범위로 조절하였다. 상기 2 번에 걸친 pH(pH 5.5 및 6)의 변화는 EDC 링커 결합을 안정적으로 유지하는 동시에 항암제의 적재를 최대화함으로서 강력한 공유결합을 유도하였다.
그 후, 상기 제조한 EDC-mwCNT 용액을 암세포 핵분열 억제 항암제인 독소루비신(Doxorubicin, DOX, Sigma-aldrich, Cat#D1515)을 결합시켰다. 이때, EDC-mwCNT와 항암제는 1:1의 농도 비율로 혼합시키고, 플랫폼 교반기(platform shaker)에서 14~18시간 동안 4℃에서 교반시킨 후, 항암제가 적재된 EDC-mwCNT 용액은 센트리콘 YM-50 필터 튜브를 이용하여 2,000 rpm에서 원심분리를 수행하였으며, 상층액을 제거함으로써 결합하지 못한 잔여 독소루비신을 제거하였다. 그 후, 독소루비신이 적재된 mwCNT(mwCNT-DOX)는 PBS 5 ㎖에 녹여서, 하기 실험에 사용하였다.
4-2: 공유결합에 의해 항암제가 적재된 AuNP 제조
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노입자 기반의 항암제는, EDC/NHS 교차결합 화학물질을 이용하여 결합을 진행하였다. pH의 안정화에 용이한 MES buffer를 용매로 하여 금 나노입자와 항암제의 안정적인 결합반응을 유도하였으며 EDC의 가수분해 효율을 줄일 수 있는 pH 6에서 반응을 진행시켜 금 나노입자 표면위에 NHS-ester 유도체를 형성한다.
구체적으로, 상기 제조한 AuNP-NHS ester 용액을 암세포 핵분열 억제 항암제인 독소루비신(Doxorubicin, DOX, Sigma-aldrich, Cat#D1515)과 결합시켰다. 이때, 4 nM 농도의 AuNP-NHS ester와 0.17 mM 농도의 항암제를 혼합하여 자석교반기(magnetic stirrer)를 이용하여 20~24시간 동안 4℃에서 교반시킨 후, 항암제가 적재된 AuNP-NHS ester 용액은 원심분리기를 이용하여 10000 g에서 원심분리를 수행하였으며, 상층액을 제거함으로써 결합하지 못한 잔여 독소루비신을 제거하였다. 그 후, 독소루비신이 적재된 AuNP(AuNP-DOX)는 PBS 1 ㎖에 녹여서, 하기 실험에 사용하였다.
실시예 5: MSC-나노 항암제 결합
본 발명의 일 실시예에 따라 주변 정상세포에는 비표적 및 무독성을 나타내지만 비소폐암 및 소폐암주에서는 추적능력 및 사멸능력이 확인된 MSC의 표면에 표지 단백질인 CD90를 특이적으로 인식하는 항체를 20 μg/ml의 농도로 상기 실시예 3에서 제조한 EDC-mwCNT 및 AuNP-NHS ester 용액과 30분 반응시킨 후, 독소루비신을 결합시켜 플랫폼 교반기(platform shaker)에서 14~18시간 동안 4℃에서 교반시켰다. 이어서, 항암제가 적재된 EDC-mwCNT 및 AuNP-NHS ester 용액은 센트리콘 YM-50 필터 튜브를 이용하여 4,000 rpm에서 원심분리를 수행하였으며, 상층액을 제거함으로써 결합하지 못한 잔여 독소루비신 및 항체를 제거하였다. 상기 실시예 3에서 제조된 CD90 항체-독소루비신-mwCNT 복합체(CD90-mwCNT-DOX) 및 CD90 항체-독소루비신-AuNP 복합체(CD90-AuNP-DOX)를 1 μg/ml 농도로 줄기세포에 반응시킨 후, 결합되지 않은 CD90-mwCNT-DOX 및 CD90-AuNP-DOX를 제거하고, 형광 마이크로 플레이트 리더기(VICTOR X3, PerkinElmer)를 이용하여, 결합된 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD90-AuNP-DOX)의 DOX 형광 파장을 측정하였다. hMSC-CD90-mwCNT-DOX의 경우 1X105 줄기세포당 72 ng/ml의 독소루비신 나노 항암제가 탑재된 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)를 제조하였고, 공초점 형광현미경을 이용하여 줄기세포 표면에 독소루비신 결합 mwCNT 및 AuNP가 제대로 부착되어 있음을 확인하였다(도 2).
실시예 6: 줄기세포에 나노항암제 결합의 최적화 확인
본 발명의 일 실시예에 따라 줄기세포 표지 단백질 CD90 또는 CD73 에 결합하는 항체를 이용하여 결합한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 세포 당 항암제 적재 정도와 CD 항체에 따른 세포 당 항암제 적재 변화, hMSC-CD90-mwCNT-DOX의 시간에 따른 항암제 지속 정도, 시간별 나노 항암제 결합 후의 줄기세포의 세포 생존률 변화를 확인하였다.
구체적으로 MSC의 표지단백질과 나노 항암제의 농도에 따른 독소루비신 적재정도를 확인하기 위해 MSC에 CD90-mwCNT-DOX를 농도별(1, 2 μg/ml)로 2시간 처리하고 1X PBS로 3번 씻어낸 후 결합한 나노 독소루비신 항암제의 양을 형광 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 측정하였다(도 3). 또한, MSC에 각 CD 항체와 결합한 줄기세포-나노 항암제 복합체(CD90-mwCNT-DOX, CD73-mwCNT-DOX, CD90-CD73-mwCNT-DOX)를 1 μg/ml의 농도로 2시간 처리하고 1X PBS로 씻어낸 후 MSC에 결합한 나노 독소루비신 항암제의 형광 파장을 형광 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 결합 CD 항체에 따른 세포당 결합된 독소루비신 항암제 양의 변화를 측정하였다(도 4). 또한 MSC에 결합한 나노 항암제가 얼마나 잘 유지되고 있는지 MSC에 mwCNT-CD90-DOX를 결합시킨 후, 24, 48, 72, 144 시간 후 나노-독소루비신 항암제 유지 정도를 유세포분석기(FACS, flow cytometry)를 이용하여 분석하였다. MSC 5×103 cells을 96 well 플레이트에 파종(seeding)하고 18시간 배양 후에 mwCNT-CD90-DOX를 농도별(1, 2, 5 및 10 μg/ml) 및 시간별 (24, 48, 72 및 144 시간) 처리 후 1 mg/㎖ 농도의 MTT 시약(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)을 각 웰당 100 ㎕씩 첨가하고, 37℃에서 2시간 더 배양하였다. 이어서, DMSO 용액을 웰당 100 ㎕씩 첨가한 후, 마이크로플레이트 판독기(UVM340, ASYS)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 MSC의 생존률을 확인하였다.
그 결과, CD90-CD73 항체 두 가지를 같이 결합하게 되면 CD73, CD90 항체 각각을 이용했을 때 보다 나노 항암제의 결합이 훨씬 높아짐을 확인하였고, hMSC-CD90-mwCNT-DOX 결합 후 96시간까지 나노 항암제가 높게 유지되는 것으로 나타났다(도 5). 또한 mwCNT-CD90-DOX를 10 μg/ml까지 결합시켜도 MSC 자체의 독성은 없었으며, 144 시간까지 MSC 생존률이 60% 이상을 유지하고 있음을 확인하였다(도 6).
실험예 1: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 표지 단백질에 따른 MSC 독성 검증
본 발명의 일 실시예에 따라 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조시 줄기세포에 결합될 수 있는 표지 단백질 항체는 CD90, CD73 및 CD105 등이 있다. 표지 단백질에 다르게 결합할 수 있도록 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)를 단기간(72 시간) 및 장기간(240 시간) 폐암 세포(H1975)에 처리한 후 줄기세포-나노 항암제 복합체의 사멸을 분석하였다.
구체적으로, 폐암 세포주(H1975)를 100π 배양 플레이트에 웰당 4×105 세포의 비율로 파종한 후, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다. 표지 단백질에 다르게 결합할 수 있도록 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들을 4×105 세포의 비율로 단기간(72 시간) 및 장기간(240 시간) 폐암 세포(H1975)에 처리한 후 줄기세포 특이적 마커(CD90, CD73)와 형광 세포 사멸 마커(Annexin V) 염색 후 MSC의 사멸과 다른 표지 단백질의 변화를 FACS를 이용하여 분석하였다.
그 결과, MSC-CD73-mwCNT-DOX 실험군과 비교하여 MSC-CD90-mwCNT-DOX 실험군이 MSC 자체 독성을 보이지 않았으며, MSC-CD73-mwCNT-DOX 실험군은 장기간 처리시 ROS 증가에 따른 독성으로 인해 줄기세포 자체적으로 사멸되는 것을 확인하였으므로 MSC-CD90-mwCNT-DOX 실험군인 줄기세포 나노-항암제 복합체가 실험에 더 적합한 것으로 나타났다(도 7).
실험예 2: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 표지 단백질에 따른 MSC 세포내 칼슘 신호전달 변화 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들을 폐암 세포(H1975)와 반응시킨 후 줄기세포-나노 항암제 복합체의 MSC 세포내 칼슘 신호전달을 분석하였다.
구체적으로 폐암 세포(H1975)와 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들을 4×105 세포의 비율로 48 시간동안 커버슬립 위에서 공배양 시킨 다음 4 μM of Fura-2가 함유된 0.05% Pluronic F-127을 생리식염수에 첨가 후 어두운 실온에서 15분간 함께 반응시켰다. 그 후, 형광 현미경을 이용하여 여기/방출 340/510 nm 형광 파장에서 표지 단백질 항체에 따른 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들의 MSC 세포내 칼슘 신호전달 변화를 확인하였으며, MetaFluor 시스템을 이용하여 변화를 분석하였다.
그 결과, MSC-CD90-mwCNT-DOX 실험군에 비하여 MSC-CD73-mwCNT-DOX 실험군에서 MSC 칼슘 신호전달 변화가 가장 높게 나타났고(도 8) MSC-CD73-mwCNT-DOX 실험군에서 MSC 세포 손상(damage)이 가장 많이 발생하는 것으로 나타났다(도 9).
실험예 3: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포 표적 능력 및 기능성 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)제조 후의 암세포 표적 능력 변화 분석을 통하여 줄기세포-나노 항암제 복합체 기능성을 확인하였다.
구체적으로, 실험세포주는 NHFB(human fibroblast, 정상세포주), A549(비소세포 폐암주), MDA-MB-231(유방암 세포주) 및 U87MG(신경교모세포종)을 사용하였다. 상기 선별을 위한 이동분석은 8 μm 다공을 가지는 폴리카보네이트 막을 이용하여 24-웰의 트란스웰에서 수행 하였다. 상기 MSC는 5 × 104 cells/ml 200 μl 매질(α-최소 필수 매질 + 0.5% 우태혈청)의 밀도에서 트란스웰 부속의 상부 챔버에 위치하게 하였다. 하부 챔버는 NHFB(human fibroblast, 정상세포주), A549(비소세포 폐암주), MDA-MB-231(유방암 세포주) 및 U87MG(신경교모세포종)을 배양중인 매질 500 μl를 함유하였다. 37℃에서 5% CO2하에서 5 시간 동안 배양한 후, 막의 상부 표면의 후 비-이동 세포를 제거하고 인산완충식염수로 세척하였다. 그 후, 상기 막은 100% 메탄올에서 1분 동안 고정하고 세포핵 염색 시약인 1% DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)로 30분 동안 염색하였다. 상기 이동 세포수는 x 200 배율의 현미경하에서 웰 당 열개의 무작위 부분을 카운트함으로써 결정하였고 비교를 위하여 CD90, CD73 항체를 함께 줄기세포에 결합시킨 줄기세포-나노항암제 복합체(MSC-CD90-CD73-CNT-DOX)와 나노항암제를 흡수(uptake)시킨 줄기세포도 분석하였다.
그 결과, 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX) 제조 후에도 순수한 MSC와 비교하여 암 표적능력은 거의 유사한 것으로 나타났다(도 10).
실험예 4: 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 줄기세포-나노 항암제 복합체의 나노 항암제 탑재 효율 및 폐암 표적 기능성 비교
본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 줄기세포-나노 항암제 복합체의 독소루비신 항암제 적재 효율과 폐암세포 표적 능력 변화를 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교를 통하여 분석하였다.
구체적으로, 폐암 세포(H1975)와 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)를 4×105 세포의 비율로 48 시간동안 커버슬립 위에서 공배양 시킨 다음 Fura-2 4 μM가 함유된 0.05% Pluronic F-127을 생리식염수에 첨가하여 어두운 실온에서 15분간 함께 반응시켰다. 그 후, 형광 현미경을 이용하여 여기(excitation)/방출(emission) 340/510 nm 형광 파장에서 표지 단백질 항체에 따른 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들의 MSC 세포내 칼슘 신호전달 변화를 확인하였으며, MetaFluor 시스템을 이용하여 변화를 분석하였다.
그 결과, 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)가 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교했을 때, 독소루비신 항암제 탑재 효율(도 11 및 12) 및 폐암 표적능력이 더 우수하게 나타남을 확인하였다(도 13).
실험예 5: 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조 후 MSC의 세포사멸(apoptosis) 검증
본 발명의 일 실시예에 따라 기능성이 최적화된 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조 후 MSC 줄기세포 자체 독성을 나노항암제를 적재시킨 줄기세포군과 비교하여 분석하였다.
구체적으로, MSC 5×105 cells에 나노항암제를 1 μg/ml의 농도로 2 시간 동안 흡수시키거나 결합(conjugation)시킨 후, 배지를 교체해 준 후 폐암세포와 24 시간 까지 배양하면서 줄기세포 자체의 사멸 정도를 줄기세포 특이적 마커(CD90)와 형광 세포 사멸 마커(Annexin V) 염색 후 FACS를 이용하여 분석하였다.
그 결과 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 줄기세포-나노 항암제 복합체 실험군에서 MSC 독성이 더 낮게 나타남을 확인하였다(도 14).
실험예 6: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 증폭된 암세포 사멸능력 검증
본 발명의 일 실시예에 따라 기능성이 최적화된 줄기세포-나노 항암제 복합체를 암세포에 주입하여 사멸능력을 비교분석하였다.
구체적으로, 본 발명의 줄기세포-나노 항암제 복합체가 유리 MSC(BM-MSC) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 암세포 사멸이 증폭이 되는지 비교하기 위해 폐암 세포주(H1975)를 100π 배양 플레이트에 웰당 5×105 세포의 비율로 파종한 후, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다. 이때, 배양기는 CO2 5% 조건에서 37℃의 온도로 습기가 있는 상태로 유지하였다. 기능이 최적화된 줄기세포-나노 항암제 복합체, 유리 MSC(BM-MSC) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군을 5×105 cells로 처리한 후 240시간까지 관찰하였다. 폐암세포(CD54)및 줄기세포 특이적 마커(CD90)와 형광 세포 사멸 마커(Annexin V) 염색 후 유세포분석기(FACS, flow cytometry)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 유리 MSC(BM-MSC) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 줄기세포-나노 항암제 복합체가 장시간(240 시간)시간까지 높은 폐암세포 사멸능력을 나타내었으며(도 15 및 16) 72시간 이후 240 시간까지 사멸이 크게 늘어나는 것을 관찰하였다(도 17).
실험예 7: 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군 및 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포 간의 칼슘 신호전달 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 기능성이 최적화된 줄기세포-나노 항암제 복합체를 암세포에 처리한 후 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 폐암 세포(H1975)의 세포내 칼슘 신호전달 변화를 비교분석하였다.
구체적으로, 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군에 폐암 세포(H1975, 4×105)를 처리하고 48 시간동안 커버슬립 위에서 공배양 시킨 다음 4 μM of Fura-2가 함유된 0.05% Pluronic F-127을 생리식염수 속에서 어두운 실온에서 15분간 함께 반응시키고 형광 현미경을 이용하여 여기/방출 340/510 nm 형광 파장에서 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX)와 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군을 처리한 후의 폐암세포 내 칼슘 신호전달 변화를 확인하였으며, MetaFluor 시스템을 이용하여 변화를 분석하였다.
그 결과, 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX)를 처리한 후 폐암세포의 세포내 칼슘 신호전달 변화가 가장 높은 것으로 나타났고 이는 폐암세포 사멸에 가장 높은 영향을 나타냄을 알 수 있었다(도 19 내지 21).
실험예 8: MSC의 역분화 가능성 검증
본 발명의 일 실시예에 따라 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포 사멸 후 잔존한 MSC가 암으로의 역분화(tumorigenesis) 가능성을 검증하였다. 구체적으로, 4×105 세포의 비율로 유리 MSC(BM-MSC) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군 및 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX)를 장기간(240 시간) 4×105 폐암 세포(H1975)과 공배양한 후 암세포 특이적 마커(CD31, 34) 염색 후 FACS를 이용하여 발현정도를 분석하여 MSC의 역분화 가능성을 조사하였다.
그 결과, 장기간 처리되어 암세포 사멸 후에도 잔존한 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX)는 암으로 역분화 하지는 않는 것을 확인하였다(도 18).
실험예 9: 종양 동물모델의 제조 및 확인
본 발명의 일 실시예에 따라 in vivo 동물모델에서 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포의 사멸효능을 루시퍼레이즈(luciferase) 활성을 통한 발광분석법으로 확인하기 위하여 안정적으로 형광/발광되는 A549 비소폐암세포주(A549-Luc-RFP)를 제작하여 종양 마우스 모델을 확립하였다.
구체적으로, 형광/발광세포의 제작을 위해 2×103개의 A549 폐암세포 당 2×104 IU의 렌티바이러스를 도입한 후 24시간 동안 형질도입을 진행하였고 배양 후 2-3일 뒤 공초점 형광현미경을 통해 형광발현을 체크한 다음 퓨로마이신(puromycin) 항생제가 포함된 배지에서 약 2-3주간 키워서 최종적으로 안정적 세포주를 선별하였다. 상기 형광/발광 세포주는 안정적으로 루시퍼레이즈를 발현하기 때문에 기질인 루시페린을 쥐에 정맥주사를 통하여 주입하게 되면 루시퍼레이즈 활성에 따른 생물발광을 IVIS 이미징 장비를 통하여 암세포의 크기변화를 빠르게 측정할 수 있다. 이어서, 암컷(n=20) BALB/c 누드 마우스(20 g, 가천대학교 이길여암당뇨연구원 실험동물실)는 온도가 조절되며, 명주기(6:00-18:00), 자유식이 조건에서 사육하였다. 한편, 종양 동물모델을 제조하기 위하여, 비소세포 폐암주(A549) 암세포 및 루시퍼레이즈-RFP 형광을 발현하는 비소세포 폐암주 (A549-luciferase-RFP)를 IV(정맥 투여)로 BALB/c 마우스(2Ｘ106 cells)에 주입하여 폐종양을 생성하였고 1, 2, 3주후 동물 형광 이미징 장비(IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, Perkinelmer)를 이용하여 폐암생성 여부를 확인하였으며, 6주후 상기 마우스를 희생시켜 상기 폐조직을 채취하여 파라핀 조직 슬라이드 제작 후, 면역화학염색(immunohistochemistry) 통하여 폐암 생성 여부를 확인하였다(도 22).
그 결과, 상기 종양 동물모델에 폐암 세포주 투여 2주 이후 폐종양이 생성되었음을 확인하였다(도 23).
실험예 10: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 폐종양 억제효능 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 in vivo 동물모델에서 줄기세포-나노 항암제 복합체의 항종양 효능을 분석하였다.
구체적으로, in vivo 형광 이미징을 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포의 사멸효능을 형광/발광되는 A549-luciferase-RFP 종양 마우스 모델에서 IVIS 동물 형광 이미지 시스템을 이용하여 확인하였다. 먼저, 누드마우스에 luciferase-RFP 형광을 발광하는 폐암세포(H1975, A549) 주입하고 2주후 독소루비신 항암제(5 mg/kg), free MSC(2Ｘ106 cells) 및 줄기세포-나노 항암제 복합체(2Ｘ106 cells, 0.06 mg/kg)를 5일 간격으로 2회 정맥주사 하였고 측정 1시간 전 루시페린 150 mg/kg IV 주사하여 루시퍼레이즈를 활성화 시킨 후, 형광 이미징 장비를 이용하여 시간별로 폐암세포(H1975) 형광의 변화를 분석하였다.
또한, 조직면역화학은 폐종양 누드마우스에 종양세포 주입하고 4주후 독소루비신 항암제(저농도: 0.02 mg/kg, 고농도: 5 mg/kg), 카본 나노항암제(저농도: 0.02 mg/kg), 자유 MSC(1Ｘ106 cells) 및 줄기세포-나노 항암제 복합체(저농도: 1Ｘ106 cells, 0.02 mg/kg; 고농도: 3Ｘ106 cells, 0.06 mg/kg)를 5일 간격으로 4회 정맥주사 후 상기 마우스를 희생시켜 폐조직을 재취하여 파라핀 조직 슬라이드 제작 후, 면역화학조직분석을 수행하여 줄기세포-나노 항암제 복합체의 효과를 확인하였다
그 결과, 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여가 luciferase-RFP 형광을 발광하는 폐종양의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났고(도 24, 도 25), 조직면역화학을 수행한 결과, 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여가 폐종양의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 26).
결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)는 암세포로의 이동능력이 우수한 MSC의 표면에 더 낮은 농도에서 항암제효과를 나타내는 나노 항암제를 적재함으로써 항암제 효능을 극대화하고 독성 등 부작용을 최소화할 수 있는 항암제로 사용될 수 있으며, 암 종류별 특이적 줄기세포를 선별하여 다양한 암에 항암제 효능을 극대화한 줄기세포-나노 항암제로 적용될 수 있다(도 27).
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 나노입자 표면에 카르복실기(-COOH)를 도입하는 카르복실화 단계;
    카르복실화된 나노입자에 EDC{1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide} 링커를 결합시키는 EDC 링커 결합단계:
    EDC 링커가 결합된 나노입자에 아민기를 갖는 항암 화합물 및 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편 또는 항체 유사체(antibody mimetics)를 공유결합시키는 항암 화합물 및 항체 결합단계; 및
    상기 항암 화합물 및 항체가 결합된 나노입자와 줄기세포를 결합시키는 줄기세포 결합단계를 포함하는 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 탄소 나노튜브인, 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 탄소 나노튜브는 다중벽 탄소 나노튜브인, 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 다중벽 탄소 나노튜브는 5 내지 50 nm의 직경을 갖는, 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 카르복실화 단계는 상기 탄소 나노튜브를 산(acid)처리하는 산처리 공정에 의해 수행되는, 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    산처리된 탄소 나노튜브를 초음파(ultrasonic wave) 처리하는 초음파 처리 공정을 추가로 포함하는, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 금 나노입자인, 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 카르복실화 단계는 상기 금 나노입자에 카르복실기를 포함하는 중합체(polymer)를 코팅하는 폴리머 코팅공정에 의해 수행되는, 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 카르복실기를 포함하는 중합체는 카르복실화 PEG(polyethylene glycol), 히알루론산(hyaluronic acid), PHA(polyhydroxyalkanoates), PLGA{poly(lactic-co-glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)} 또는 PGA{poly(glycolic acid)}인, 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 CD90, CD73 또는 CD105인, 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자 및 항암 화합물의 중량비가 1:1 내지 1:3인, 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 항암 화합물은 독소루비신, 파클리탁셀, ABT737, 5-플루오로우라실, BCNU, CCNU, 6-메르캅토퓨린, 나이트로젠 머스타드, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시스플라틴, 메소트렉세이트, 시타라빈 싸이오테파, 부설판 또는 프로카바진인, 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 역분화 줄기세포, 또는 중간엽 줄기세포(MSC)인, 제조방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, Fv, VHH(variable domain of camelid heavy chain), sdAb, diabody 또는 triabody인 제조방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 항체 유사체는 Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, VLR(variable lymphocyte receptor) 또는 repebody인, 제조방법.
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