CN112521491B

CN112521491B - 一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN112521491B
Application number: CN202011491036.6A
Authority: CN
Inventors: 王玠; 许菲; 曹俊
Original assignee: Jiangnan University; Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Current assignee: Jiangnan University; Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2040-12-17
Also published as: CN112521491A

Abstract

本发明涉及一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法，设计了含有生物活性结构GFPGER区域的胶原蛋白序列，并在胶原蛋白序列的若干位点引入具有氧化交联特性的半胱氨酸，通过大肠杆菌异源表达获得四种纯度较高的含半胱氨酸胶原蛋白。采用双氧水为交联剂对胶原蛋白进行交联制备得到水凝胶。本发明制备得到的胶原蛋白具有较好的温敏性，在氧化环境中能够形成稳定的水凝胶构筑，并对细胞无毒性，为药物控释载体的应用提供了较好的基础。

Description

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

胶原蛋白是一类重要的生物高分子材料，为动物结缔组织的主要成分，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的30％左右。胶原蛋白具有良好的生物相容性、低免疫原性和组织可降解吸收性，在创面止血、愈合，缺损组织的填充、修复及重建，对生物体进行诊断、治疗、修复以及药物载体和组织工程等方面有广泛应用，是理想的医用生物材料。

天然胶原蛋白来源广泛，主要存在与动物的肌腱、骨、皮肤、韧带等组织中，是胶原蛋白原料的主要来源。提取胶原蛋白的方法有酸法、碱法、盐法、酶法。然而，在提取中存在蛋白变性、结构破坏、蛋白得率低等问题，并可能产生致病和免疫不良反应及批次间的差异性问题。人工重组合成胶原蛋白成为一种新的途径。重组类人胶原蛋白是采用生物基因工程技术将胶原蛋白的基因片段，借助工具酶拼接到适合的载体然后转移到宿主细胞中诱导表达得到，具有质量可控、加工性强、水溶性好、周期性短、较低排斥反应等优点，常见的宿主表达系统有大肠杆菌、酵母菌等。然而，与人工化学合成的高分子蛋白相比，胶原蛋白在力学特性方面仍然存在缺陷，其无法进行自组装或被加工成纳米颗粒、水凝胶等多种材料形式，在药物控释、药物传输及组织工程等领域的应用前景还有待进一步挖掘。存在成胶所需蛋白浓度高、成胶时间等缺点，限制了其在药物传输及组织工程的应用。

水凝胶材料由于其质地柔软，可模拟天然细胞外基质，具备应用于体内生理环境的天然特性等，正受到广泛关注。目前已报道的有人工合成类丝弹性蛋白水凝胶，其主要基于丝蛋白肽段单元间的物理交联形成凝胶网络，可快速温和氧化成胶，并赋予该水凝胶以氧化还原响应性及可调的力学性能，使其潜在应用于可控的药物传输及组织工程，但此类水凝胶与细胞之间的粘附作用差，不适合进行体内应用。

发明内容

本发明是为了解决上述提出的问题，提供了一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法。

本发明采用如下技术方案：

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S，其序列为SEQ ID No.1所示。

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S1，其序列为SEQ ID No.2所示。

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S2，其序列为SEQ ID No.3所示。

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S3，其序列为SEQ ID No.4所示。

所述胶原蛋白的制备方法，将带有胶原蛋白基因的pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆进行摇瓶发酵生产，收集菌体，得到重组蛋白；将重组蛋白分离纯化后最终得到目标胶原蛋白。

进一步地，具体步骤如下：

(1)设计胶原蛋白序列，将该基因片段连接至pET-28a质粒上，并设计双酶切位点，以验证携带的基因片段；

(2)采用已经验证片段的pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)；挑取单克隆进行蛋白表达测试，验证其转化结果；

(3)挑取单克隆依次进行摇瓶发酵生产、分离纯化，最后得到目标胶原蛋白。

进一步地，所述步骤(1)中在基因两端设计了限制性内切酶Nco I和Bam HI位点，通过酶切验证其基因长度。

所述胶原蛋白的应用，将其应用于制备水凝胶。

进一步地，所述胶原蛋白的应用，以质量浓度为3％-4％胶原蛋白为原料，质量浓度为0.05％-0.1％的双氧水为交联剂进行交联，使原料分子间通过二硫键交联形成水凝胶，并通过微流变实验证实S-VCL-C可以形成凝胶。

所述胶原蛋白制备的水凝胶的应用，将其应用于缓释亲水性药物，并且具有氧化还原响应性，能够响应H₂O₂氧化发生分子相变。

所述胶原蛋白制备的水凝胶的应用，将其作为细胞支架材料，能够有效支持细胞的粘附和增殖。

本发明的有益效果：本发明设计了含有生物活性结构GFPGER区域的胶原蛋白序列，并在胶原蛋白序列的若干位点引入具有氧化交联特性的半胱氨酸，通过大肠杆菌异源表达获得纯度较高的目标蛋白样品，具有较好的温敏性和自组装性，能够发生自组装形成较大的颗粒结构，有助于水凝胶的构筑，并为水凝胶作为药物控释载体的应用提供了较好的基础，提高了水凝胶的力学性能。

附图说明

图1是本发明胶原蛋白序列设计构建示意图。

图2是本发明实施例1中pET-28a载体质粒提取酶切验证结果；

M：Marker；1：S-VCL-S；2：S-VCL-S1；3：S-VCL-S2；4：S-VCL-S3；5：pET-28a空质粒。

图3是实施例2中转化子的蛋白表达测试结果。

图4是实施例2中蛋白纯化和浓缩结果示意图。

图5是实施例3中S-VCL-S胶原蛋白水凝胶的SEM图

图6是实施例4中S-VCL-S胶原蛋白水凝胶的微流变图

图7是应用实施例1中水凝胶包裹药物在还原和非还原条件下的释放行为。

图8是应用实施例2中hMSC细胞系在水凝胶材料表面接种1-6h后的粘附情况。

图9是应用实施例2中hMSC细胞系在水凝胶材料内部的增殖情况。

具体实施方式

以下实施例所述大肠杆菌BL21(DE3)购自北京百奥莱博科技有限公司。

实施例1载体质粒的合成

根据表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏好设计对照蛋白序列VCL，其具体序列如SEQ ID No.5所示。随后根据图1所示设计机理依次设计序列S-VCL-S，S-VCL-S1，S-VCL-S2，S-VCL-S3，由苏州金唯智生物科技公司合成，并连接至pET-28a载体质粒中。

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S，其序列为SEQ ID No.1所示，两端分别连接半胱氨酸；

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S1，其序列为SEQ ID No.2所示，除两端连接半胱氨酸，序列中同时插入了半胱氨酸。

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S2，其序列为SEQ ID No.3所示，除两端连接半胱氨酸，序列中同时插入了两个半胱氨酸。

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S3，其序列为SEQ ID No.4所示，除两端连接半胱氨酸，序列中同时插入了三个半胱氨酸。

实施例2胶原蛋白的制备

设计的序列中包含Nco I酶切位点和Bam HI酶切位点，通过双酶切筛选验证得到含有目标长度的聚合物基因的重组质粒pET-28a，验证结果如图2所示，证明其成功连接了目标基因序列。

(1)取大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞于冰上解冻，将重组质粒20μL全部加入到100μL感受态细胞中，轻轻吹打均匀，冰上放置30min。冰浴结束后，将感受态细胞置于42℃水浴中热激90s，取出后迅速置于冰上冷却2min。然后，向试管中加入无抗生素新鲜LB培养基500μL，37℃恒温摇床培养1h后，将菌液涂布到含有卡那抗性的LB平板上，按每块板200μL进行，37℃静止倒置过夜培养。

(2)蛋白表达测试：挑取步骤(1)所得单克隆于4mL含有卡那抗生素的LB培养基试管中，37℃过夜培养。将过夜培养菌液按1:100转接入含卡那抗生素新鲜LB培养基中，37℃摇床培养至OD600～0.4-0.6时加入IPTG至终浓度为1mM，37℃诱导培养4h。收集菌液，测量OD600。取400/OD600体积的诱导培养菌液于新的离心管中，12000rpm离心1min，弃上清，用20μL20mM pH＝8.0Tris-HCl缓冲液重悬菌体，加入5μL 5×SDS PAGE上样缓冲液，沸水中加热10min。12000rpm离心5min，取5μL上清进行SDS-PAGE检测。表达结果如图3所示，证明均成功进行了蛋白表达。

(3)重组蛋白摇瓶发酵生产：挑取单克隆于10mL含有卡那抗生素(100μg/mL)的LB培养基试管中，37℃过夜培养。取1mL过夜培养物转接入含Kana的100mL LB培养基中，37℃振荡培养4h至OD600约为3-4。取80mL 10×TB盐，加入到720mL TB培养基中，再加入Kana至终浓度为100μg/mL，混匀待用。将摇瓶中的菌液转接到800mLTB培养基中，37℃、220rpm培养6h，至OD600约为8时，加入IPTG至终浓度1mM，25℃过夜培养。8000rpm，10℃收集菌体，-20℃冻存备用；

(4)重组蛋白分离纯化：称取菌体10g，100mL Lysis buffer重悬后，900PSI高压匀浆破碎。破碎后菌液10℃10000rpm离心20min，收集上清过Ni-NTA亲和柱。缓冲液A进行柱平衡后，蛋白液上清在重力作用下缓慢过柱，缓冲液B用于漂洗非特异性结合蛋白，缓冲液D用于洗脱目标蛋白，收集洗脱液，加入DTT至10mM。取每步的流出液20μL，备用SDS-PAGE检测，检测结果如图4所示；蛋白在脱盐之后，浓度仅为0.065mg/mL，0.192mg/mL与0.085mg/mL。

(5)重组蛋白浓缩：向含有目标蛋白的250mM咪唑洗脱液中加入10mM DTT，室温放置12h使蛋白处理中形成的二硫键充分被还原。4℃低温条件下透析24h，经超滤管低温浓缩，最终分别得到S-VCL-S，S-VCL-S1，S-VCL-S2，S-VCL-S3四种蛋白胶体。

实施例3胶原蛋白水凝胶的制备

取90μL 4.5％w/v四种胶原蛋白溶液之一于玻璃管底，向其中加入10μL质量浓度为0.1％H₂O₂轻轻混匀；置于37℃水浴锅中孵育30min。不含半光氨酸的VCL蛋白作为对照组，同样加入0.1％H₂O₂，37℃孵育30min。孵育完成后，取出玻璃管，倒置放置。若聚合物分子间交联形成水凝胶，则其流动性受到限制，仍存在于玻璃管底部；反之，则会顺管壁流下，以此为据可检测凝胶的形成与否。

结果显示，VCL不能够成功形成水凝胶，而S-VCL-S，S-VCL-S1，S-VCL-S2，S-VCL-S3四者均能够成功制备水凝胶。

图5为S-VCL-S胶原蛋白水凝胶的SEM图，由图可知，水凝胶表现为独特的三维网状结构，网孔的结构和大小不仅会影响水凝胶力学性能，也会影响实际应用中营养物质的运输和扩散。从图中可以看出S-VCL-C蛋白聚合物水凝胶显示了典型的网孔状结构特征，而VCL蛋白则形成紧致片层状特征。VCL水凝胶形成大小约为20-35μm的致密片层结构，而S-VCL-C水凝胶的孔隙结构则相对松散，其孔径平均大小约为40-80μm的网孔状结构。为后续水凝胶的药物释放提供了理论基础。

实施例4胶原蛋白的微流变实验

为了确认和量化水凝胶的强度，使用微流变学来测量不同浓度下水凝胶的储能模量和损耗模量。将直径为1.0米的荧光聚苯乙烯珠悬浮液，加入以2％和5％蛋白浓度添加到胶原样品中。倒置显微镜用于检查珠子的荧光，珠子具有大约30个粒子/视场的适当分布密度。嵌入样品中的1.0微米荧光聚苯乙烯珠的轨迹被录像和分析，并使用电荷耦合器件照相机对荧光珠的轨迹进行成像。用IDL图像分析软件分析由大约250个轨迹图像组成的电影，以确定特定珠子的位置变化。均方位移(MSD)被确定为滞后时间的函数，而G'和G”由遵循梅森等人的广义斯托克斯爱因斯坦关系确定。

图6VCL在低浓度(2％)和高浓度(5％)下均无法形成水凝胶溶液。对于S-VCL-C，高浓度(5％)时能诱导凝胶形成。在3.682拉德/秒的频率下，重力“超过重力”，表明形成了软凝胶。“G”和“G”曲线的交叉表明S-VCL-C形成了软凝胶。这些观察结果与小瓶倒置实验相一致，表明S-VCL-C可以形成凝胶。

应用实施例1S-VCL-S胶原蛋白水凝胶药物释放实验

罗丹明B是一种强极性的亲水性荧光染料，被作为模式药物广泛应用于药物控释研究。本实施例中罗丹明B被包裹在凝胶内部，还原性物质二硫苏糖醇会还原二硫键引起凝胶解体，罗丹明被释放到溶液中。

具体过程简述如下：

(1)取5μL罗丹明B溶液(1mg mL^-1)加入到90μL质量浓度为4.5％的蛋白聚合物溶中，轻轻混匀。

(2)向混合溶液中加入5μL 0.1％H₂O₂，混匀后迅速加入到96孔板中，37℃放置30min。

(3)向孔板中加入200μL PBS(实验组含10mM DTT)开始罗丹明B的释放，此时记为0h，分别在0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72h取样检测溶液中罗丹明B含量。

取样及检测过程：每个时间点分别吸取10μL溶液，并补充等量的PBS。用新鲜PBS将待测液稀释20倍，于SpectraMax M5多功能酶标仪上检测荧光信号(检测条件：激发波长553nm，发射波长627nm)。

研究初期，疏水性模式分子尼罗红和亲水性模式分子罗丹明B被作为模式分子，但发现疏水性的尼罗红极难释放，可能原因在于疏水药物在极性溶液中溶解度较低，不容易扩散，因此目前来说该类疏水性药物的传输一般是通过亲水性的递送载体实现。这也表明了该类凝胶不适合疏水性药物分子的释放，因而后续药物释放的研究主要围绕亲水性的罗丹明B展开。罗丹明B是一类常见的荧光分子，因其能够释放出强荧光信号，所以被广泛应用于药物控制释放研究，本实施例中采用10mM二硫苏糖醇(DTT)模拟体内温和的还原环境。

如图7所示，本实施例检测了胶原凝胶在还原和非还原条件下的罗丹明B的累积释放效率。水凝胶中罗丹明B浓度为50μg/mL，蛋白浓度为4.05％(w/v)，双氧水浓度为0.05％(w/v)。结果显示水凝胶包裹的模式分子均可以被缓慢释放到溶液中，早期(t＝0.5h)都存在爆发释放，这可能与残留在凝胶表面的模式药物快速进入到溶液中有关。在后续释放阶段(t>0.5h)，还原组与非还原组的释放速率表现出明显差异，在t＝72h时，非还原条件下VCL和S-VCL-S二组水凝胶的罗丹明B累计释放率分别28.9％±1.74％和70.96％±4.47％。

而在还原条件下，相同时间内水凝胶的药物释放率分别达到44.49％±4.19％和94.38％±3.64％，这提示着还原环境能够促进凝胶解体提高模式分子的释放效率，说明构建的凝胶系统具有一定的还原环境响应性。上述结果显示，构建的半胱氨酸系列类丝弹性蛋白聚合物不仅能够响应氧化环境形成凝胶网络，同时基于其二硫键连接的共价交联网络能够响应还原环境，发生凝胶解体，促进包裹药物释放。此外，本实施例也观察到水凝胶在药物释放行为上也存在较大差异，表现在水凝胶VCL组药物累积释放量要显著低于S-VCL-S组，采用扫描电镜对构建水凝胶的微结构进行分析。

VCL水凝胶形成大小约为20-35μm的致密片层结构，而S-VCL-S水凝胶显示出网孔状结构特征，孔隙结构则相对松散，其孔径平均大小约为40-80μm。水凝胶的孔径越大，药物释放的速率越快，这与检测的水凝胶药物释放结果一致。

应用实施例2S-VCL-S胶原蛋白水凝胶用于细胞三维培养

本实施例所用细胞来自人间充质干细胞hMSC，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

将细胞接种于水凝胶表面，检测细胞的粘附以及增殖情况。在96孔板中制作1mm厚的凝胶材料，培养基漂洗掉表面残留H₂O₂，采用商业化聚苯乙烯涂层的细胞培养板作为对照。钙黄绿素(Calcein AM)的毒性极低，被活细胞内酯酶水解后能够发出绿色荧光信号，可以用于活细胞形态观察。

如图8所示，在细胞接种1-6h后，对细胞进行Calcein AM染色，荧光显微镜观察，可以发现对照组细胞和氧化交联胶原水凝胶组中细胞已伸展并贴附于培养板表面，表明细胞与材料之间发生作用，这提示着所构建的凝胶材料可以用于细胞粘附，对细胞没有毒性。

细胞接种于材料表面3天后，通过MTT法测量得到在S-VCL-S和VCL蛋白水凝胶表面的细胞数量达到对照TCP组的～70％和～45％(图9)，提示着3天的培养时间内细胞的增殖虽然受到抑制，但大部分细胞仍可在材料表面存活。

序列表

<110> 王玠

许菲

曹俊

<120> 用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 992

<212> DNA

<213> 胶原蛋白(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

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<213> 胶原蛋白(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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<213> 对比蛋白(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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aacgcgagca agctgaaaac agctggcgca aacgtctgct gaaaggtatt caagatcacg 240

ctttagatct ggtgccgcgt ggcagtggtc aagatggccg caatggtgaa cgtggtgaac 300

aaggtcctac cggtccgact ggtcccgctg gtcctcgtgg tctgcaaggt ttacaaggtc 360

tgcaaggtga acgcggcgaa caaggtccga ctggtcccgc tggtccccgt ggtttacaag 420

gcgagcgcgg tgaacaaggt ccgactggtc tggctggtaa agctggtgaa gctggtgcca 480

aaggcgaaac cggccccgct ggtcctcaag gtcctcgcgg tgagcaaggt ccgcaaggtt 540

taccgggtaa agatggtgag gctggtgcac aaggccccgc tggtccgatg ggtttcccgg 600

gtgaacgtgg cgaaaaaggt gaaccgggta cccaaggtgc caaaggtgat cgcggtgaaa 660

ctggtccggt gggtccccgc ggcgaacgcg gtgaagccgg tcccgctggc aaagacggtg 720

agcgtggtcc ggttggcccg gctggtaaag acggccagaa tggccaagat ggtctgcccg 780

gtaaggacgg caaggacggc cagaacggca aggatggctt acccggtaaa gacggcaaag 840

atggtcagaa tggcaaggac ggtttacccg gcaaggacgg taaggacggc caagatggca 900

aagatggttt accgggtaaa gacggcaagg atggcttacc gggcaaggat ggtaaggatg 960

gtcagcccgg taaaccgtaa ggatcc 986

Claims

1.一种采用胶原蛋白S-VCL-S制备水凝胶的方法，其特征在于：以质量浓度为3%-4%胶原蛋白S-VCL-S为原料，质量浓度为0.05%-0.1%的双氧水为交联剂进行交联，使原料分子间通过二硫键交联形成水凝胶，所述胶原蛋白S-VCL-S核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述采用胶原蛋白S-VCL-S制备水凝胶的方法，其特征在于：所述胶原蛋白S-VCL-S的制备方法为：将带有目标胶原蛋白基因的pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单克隆进行摇瓶发酵生产，收集菌体，得到重组蛋白；将重组蛋白分离纯化后最终得到目标胶原蛋白。

3.权利要求1所述采用胶原蛋白S-VCL-S制备水凝胶的方法，其特征在于：胶原蛋白S-VCL-S制备的具体步骤如下：

（1）设计胶原蛋白序列，将设计好的基因片段连接至pET-28a质粒上，并设计双酶切位点，以验证携带的基因片段；

（2）采用已经验证片段的pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单克隆进行蛋白表达测试，验证其转化结果；

（3）挑取单克隆依次进行摇瓶发酵生产、分离纯化，最后得到目标胶原蛋白。

4.权利要求1所述方法制备所得水凝胶的应用，其特征是：将其应用于制备缓释亲水性药物的载体，并且具有氧化还原响应性，能够响应H₂O₂氧化发生分子相变。

5.权利要求1所述方法制备所得水凝胶的应用，其特征是：将其应用于制备细胞支架材料，能够支持细胞的粘附和增殖。